WO2009118778A1 - 魚類未成熟生殖細胞表面特異的タンパク質を利用した、魚類未成熟生殖細胞の分離方法 - Google Patents
魚類未成熟生殖細胞表面特異的タンパク質を利用した、魚類未成熟生殖細胞の分離方法 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to an antibody that can be used for separation of immature fish germ cells used in a method for growing fish by surrogate parent fish culture technique, a method for separating immature fish germ cells using the antibody, and the like.
- the individual seedlings need to have genetic diversity. Considering that, it is desirable to collect eggs and sperm from a large number of parent fish, but it has been a long time for maturation of eggs and sperm such as fish species that reach several hundred kg, such as bluefin tuna. In fish species that require the moon, it has been extremely difficult technically and costly to grow a large number of parent fish under artificial control and collect eggs and sperm.
- the present inventors In order to solve the above-mentioned problems related to the collection of eggs and sperm, the present inventors, for the first time in the world, produced surrogate parent fish for producing useful fish species such as eggs and sperm to related species that are quickly matured and easy to breed. Established technology.
- primordial germ cells which are germline stem cells such as eggs and sperm, are extracted from rainbow trout (donor) hatched fry, and pre- and hatched yamame trout (recipe) whose immune system is immature and transplant cell rejection does not occur
- donor hatched fry
- pre- and hatched yamame trout recipe
- the donor rainbow trout A technology for producing eggs and sperm derived from cells has been established (for example, see Patent Document 1).
- eggs and sperm obtained by maturing primordial germ cells derived from this genetically modified rainbow trout are those into which GFP genes have been introduced, and juvenile fish produced using these eggs and sperm are Since it is a recombinant fish, it could not be used as an edible fish or a seedling for release, and there was an insufficient point in practical use.
- Patent Document 2 describes an antibody specific for human primordial germ cell surface-specific antigen and identifying human primordial germ cells using this antibody.
- Non-Patent Document 1 describes that a monoclonal antibody that reacts with the gene product of Vasa gene that is specifically expressed in primordial germ cells at a specific developmental stage of Xenopus laevis is described.
- the present inventors aim to improve the above-mentioned insufficient points of the genetically modified fish in surrogate parent fish aquaculture technology, without introducing a marker gene such as a GFP gene, from a primordial germ cell from a donor fish. Attempts have been made to search for methods for isolating immature germ cells such as spermatozoa and spermatogonia. Specifically, rainbow trout has been used to search for genes that are specifically expressed in immature germ cells (see Non-Patent Document 2).
- An object of the present invention is to provide a gene, polynucleotide, polypeptide, an antibody that specifically binds to the polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells of fish, and by using the antibody,
- An object of the present invention is to provide a method for separating immature germ cells from donor fish without introducing a marker gene such as a GFP gene, and a method for identifying immature germ cells derived from fish.
- the present inventor conducted intensive research to solve the above problems, identified a cell surface antigen specifically expressed in rainbow trout spermatogonia, and prepared an antibody against this antigen. Specifically, by comprehensively analyzing mRNA expressed in rainbow trout spermatogonia (transcriptome analysis) and searching for genes encoding cell membrane surface proteins from the expressed genes A clone was obtained that was specifically expressed in immature germ cells such as rainbow trout spermatogonia and could be used as a marker in situ and the like. When cDNA was identified from this clone and homology search was performed, it was suggested that it was a CD205 gene encoding a complete transmembrane glycoprotein of 199 kDa.
- the present invention relates to (1) a polynucleotide represented by the following (A), (B) or (C); (A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 79 to 5193 in SEQ ID NO: 1: B) An immature germ cell derived from a fish, comprising a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 79 to 5193 in SEQ ID NO: 1, wherein one or several nucleotides are substituted, deleted, inserted, or added.
- a polypeptide specifically expressed in immature germ cells derived from fish (C) from an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2 And a polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells derived from fish: or (3) (1) or A gene encoding a polypeptide comprising the polynucleotide according to (2) and specifically expressed in immature germ cells derived from fish, or (4) the polynucleotide according to (1) or (2) above
- the present invention relates to a recombinant vector containing
- the present invention also provides (5) a polypeptide represented by the following (A), (B) or (C); (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2: B) An immature germ cell derived from a fish comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2 and having one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions.
- an immature germ cell derived from fish comprising (C) an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2
- the present invention relates to (8) an antibody that specifically binds to the polypeptide described in (5) above, (9) the amino acid sequence represented by amino acid numbers 833 to 1107 in SEQ ID NO: 2, and amino acid numbers 1118 to 1395
- the present invention provides (10) a method for identifying immature germ cells derived from fish using the antibody according to (8) or (9) above, or (11) step (a): the labeled ( 8) or (9) a step of bringing the sample into contact with a sample; and a step (b): a step of confirming whether the antibody specifically binds to the sample;
- the present invention relates to a method for identifying immature germ cells derived therefrom.
- the present invention is (12) separating immature germ cells derived from fish from a sample containing immature germ cells derived from fish, using the antibody according to (8) or (9) above.
- a sample containing immature germ cells derived from fish a sample containing cells selected from the cells of embryonic growth of hatched embryos of fish, cells of gonads of fish, and cells of testis of fish is used. (12) or (13) Of it relates to a method of separating immature germ cells derived from fish.
- the present invention also relates to (15) immature germ cells (separated immature germ cells) derived from donor fish separated from donor fish by the separation methods (12) to (14) above as early embryos of recipient fish.
- the differentiation inducing method according to (15) or (16) above, wherein a fish having a triploid chromosome is used as a recipient fish, or (18) an early embryo of the recipient fish The differentiation inducing method according to any one of the above (15) to (17), wherein the transplantation is transplantation of the recipient fish in the developmental stage before and after hatching to the back side of the peritoneal mesentery, ) Separation Primordial germ cells or spermatogonia are used as mature germ cells, the differentiation induction method according to any one of (15) to (18) above,
- the term “immature germ cell” refers to the lineage from primordial germ cells to spermatogonia, spermatocytes, sperm cells, sperm, primordial germ cells to oocytes, early oocytes, oocytes It means a cell selected from a primordial germ cell, a spermatogonia cell, an oocyte cell, and an early oocyte among germ cell lines consisting of a cell and an egg.
- a probe corresponding to clone # 4017 was used. It is a figure which shows the result of the in-situ hybridization with respect to the ovary sample of vasa-GFP introduction
- a probe corresponding to clone # 4017 was used. It is a figure which shows the alignment (amino acid sequence) of the preservation
- the polynucleotide of the present invention includes one or several nucleotides in the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 79-5193 in SEQ ID NO: 1, or the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 79-5193 in SEQ ID NO: 1 Or a polynucleotide encoding a polypeptide specifically expressed in immature germ cells derived from fish, or nucleotide numbers 79-5193 in SEQ ID NO: 1
- the gene of the invention includes the polynucleotide of the present invention, and fish
- the gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding a polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells derived from the polypeptide.
- the polypeptide of the present invention is represented by amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2. Consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions are made in the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 1-1705 in SEQ ID No.
- a polypeptide specifically expressed in immature germ cells derived from fish, or an amino acid sequence having at least 85% homology with the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2, and derived from fish A polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells, and the gene of the present invention,
- the polypeptide is not particularly limited as long as it is a polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells derived from fish.
- the polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells derived from fish is any of A polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells derived from fish and is located at least partially outside or on the surface of the immature germ cells.
- amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. It means an amino acid sequence in which any number of amino acids are deleted, substituted or added.
- nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1. Means a nucleotide sequence in which any number of ⁇ 5 nucleotides has been deleted, substituted or added.
- a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, or added can be any of those known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, and mutagenesis. It can also be produced by this method.
- a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 79 to 5193 in SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 79 to 5193 in SEQ ID NO: 1 is obtained by introducing a mutation into these polynucleotides using a method of contacting with a mutagen agent, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering technique, etc. can do.
- Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering methods, is useful because it is a method that can introduce a specific mutation at a specific position
- Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001. (hereinafter abbreviated as “Molecular Cloning 3rd Edition” ⁇ ), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. be able to.
- Molecular Cloning 3rd Edition Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997), etc.
- polynucleotide hybridizing under stringent conditions uses a polynucleotide such as DNA or RNA as a probe, and uses a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. Specifically, using a filter on which a polynucleotide derived from a colony or plaque or a fragment thereof is immobilized, the polynucleotide is obtained at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl. After hybridization, the filter is washed under conditions of 65 ° C.
- stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
- polynucleotides having a homology of 50 to 70% or more are hybridized and polynucleotides having lower homology (especially DNA) are not hybridized with each other, or are washing conditions for normal Southern hybridization at 65 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS Or a condition of hybridizing at a salt concentration corresponding to 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS.
- the polynucleotide that can hybridize under stringent conditions can include a polynucleotide having a certain homology with the base sequence of the polynucleotide used as a probe, for example, 60% or more, preferably Is preferably a polynucleotide having a homology of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more. It can be illustrated.
- the method for obtaining and preparing the polynucleotide of the present invention, such as DNA is not particularly limited.
- the nucleotide sequence information in the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 disclosed in the present specification and the sequence shown in SEQ ID NO: 2 are shown.
- DNA can be illustrated suitably.
- the gene of the present invention is a gene that contains the polynucleotide of the present invention and encodes a polypeptide that is specifically expressed in immature germ cells derived from fish.
- the nucleotide number in SEQ ID NO: 1 Preferable examples include a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by 79 to 5349 and a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by amino acid numbers 1 to 1757 in SEQ ID NO: 2.
- the fish in the present invention is not particularly limited as long as the immature germ cell is a fish that specifically expresses the polypeptide of the present invention, bluefin tuna, mahata, yellowtail, nibe, Japanese flounder, Japanese mackerel, red sea bream, eel, Examples include saltwater fish such as coelacanth and freshwater fish such as rainbow trout.
- the method for obtaining and preparing the polypeptide of the present invention is not particularly limited, and may be a naturally derived polypeptide, a chemically synthesized polypeptide, or a recombinant polypeptide produced by a gene recombination technique.
- the polypeptide of the present invention can be obtained by appropriately combining the methods for isolating and purifying the polypeptide from cells or tissues expressing such a polypeptide.
- the polypeptide of the present invention is synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). be able to.
- the polypeptide of the present invention can be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
- a polypeptide is prepared by a gene recombination technique
- the polypeptide of the present invention can be prepared by introducing a polynucleotide such as DNA consisting of a base sequence encoding the polypeptide into a suitable expression system. .
- preparation by a gene recombination technique that can be prepared in a large amount by a relatively easy operation is preferable.
- polypeptide of the present invention when preparing the polypeptide of the present invention by genetic recombination techniques, to recover and purify the polypeptide from cell culture, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose
- Known methods including chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography are used.
- a column used for affinity chromatography for example, a column in which an antibody such as a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention is bound, or when a normal peptide tag is added to the polypeptide of the present invention, this peptide tag A purified product of these polypeptides can be obtained by using a column to which a substance having an affinity for is bound.
- a purified sample can be obtained by carrying out the above purification treatment after allowing the cell membrane degrading enzyme to act.
- polypeptide that is specifically expressed can be obtained by those skilled in the art based on the nucleotide sequence information represented by nucleotide numbers 79 to 5193 in SEQ ID NO: 1 encoding the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-1705 in SEQ ID NO: 2. It can be prepared or obtained as appropriate.
- the recombinant vector of the present invention is a recombinant vector comprising the polynucleotide of the present invention and capable of expressing a polypeptide specifically expressed in immature germ cells derived from fish in vivo.
- the recombinant vector of the present invention can be constructed by appropriately integrating the polynucleotide of the present invention into an expression vector.
- the expression vector is preferably one that can replicate autonomously in the host cell, or one that can be integrated into the chromosome of the host cell.
- a promoter, enhancer, terminator, etc. can be placed at a position where the polynucleotide of the present invention can be expressed.
- Those containing a control sequence can be preferably used.
- the expression vector is preferably a recombinant vector using an expression vector for animal cells, particularly an expression vector for fish cells, and the procedure and method for constructing an expression vector that can be used in the present invention are commonly used in the field of genetic engineering. Can be used.
- control sequence examples include a constitutive promoter, an inducible or regulatory promoter, a tissue-specific promoter, or a promoter derived from a gene of an expressed antigen.
- a constitutive promoter examples include a promoter sequence derived from cytomegalovirus (CMV), or Rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV-40), muscle ⁇ -actin promoter, or herpes simplex virus (HSV).
- CMV cytomegalovirus
- RSV-40 Rous sarcoma virus
- SV-40 Rous sarcoma virus
- muscle ⁇ -actin promoter a gene of an expressed antigen.
- HSV herpes simplex virus
- strong promoters examples include strong promoters.
- tissue-specific promoter examples include a thymidine kinase promoter.
- inducible or regulatable promoters include growth hormone regulatable promoters, promoters under the control of the lac operon sequence, or zinc inducible metallothionein promoters.
- the transcriptional regulatory sequence can be operably linked to a nucleotide sequence encoding an immunogenic polypeptide (ie, so that expression of the nucleotide sequence can be regulated).
- the control sequence can include an expression control sequence including a promoter (eg, the inducible or constitutive promoter) DNA sequence, optionally further comprising an enhancer element, transcription or polyadenylation signal [eg, simian virus-40 One or more copies of an intron sequence for splicing (derived from (SV-40) or bovine growth hormone), or an immunostimulatory DNA sequence known as a CpG motif may be included.
- a promoter eg, the inducible or constitutive promoter
- an enhancer element eg, transcription or polyadenylation signal
- transcription or polyadenylation signal eg, simian virus-40
- an immunostimulatory DNA sequence known as a CpG motif may be included.
- the expression vector may be selected, for example, from bacterial replication origin sequences, or an antibiotic resistance (eg, kanamycin) gene or non-antibiotic resistance gene (eg, ⁇ -galactosidase gene) for selection.
- antibiotic resistance eg, kanamycin
- non-antibiotic resistance gene eg, ⁇ -galactosidase gene
- the fusion polypeptide of the present invention comprises a fusion polypeptide in which the polypeptide of the present invention is bound to a marker polypeptide and / or a peptide tag.
- the marker polypeptide include GFP, luciferase protein, and LacZ protein.
- the peptide tag include Myc tag, His tag, FLAG tag, and GST tag.
- the fusion peptide of the present invention can be prepared by using known genetic engineering using the polypeptide of the present invention, a marker polypeptide, or a peptide tag.
- the antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention, but the amino acid sequence represented by amino acid numbers 833 to 1107 in SEQ ID NO: 2, An antibody that specifically binds to an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1118 to 1395 or a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1407 to 1697 is preferable.
- Specific examples of the antibodies of the present invention include immunospecific antibodies such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, humanized antibodies, and the like. Can be prepared by a conventional method using an antibody as an antigen.
- a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity.
- Such an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention is useful for, for example, separating and quantifying the polypeptide of the present invention and clarifying the molecular mechanism of the polypeptide of the present invention.
- the antibody against the polypeptide of the present invention can be obtained by administering a fragment containing the polypeptide or an epitope thereof or a cell expressing the polypeptide on the membrane surface to an animal (preferably other than human) using a conventional protocol.
- an animal preferably other than human
- a conventional protocol for example, for the preparation of monoclonal antibodies, the hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), trioma method, human B cell hybridoma method (Immunology Today 4), which results in antibodies produced by continuous cell line cultures. , 72, 1983) and EBV-hybridoma method (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
- Examples of the monoclonal antibody of the present invention include fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, radioisotopes such as 125I, 32P, 14C, 35S or 3H, alkaline phosphatase, peroxidase,
- fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate
- radioisotopes such as 125I, 32P, 14C, 35S or 3H
- alkaline phosphatase alkaline phosphatase
- peroxidase peroxidase
- a fusion polypeptide in which a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP) is fused to an antibody labeled with an enzyme such as ⁇ -galactosidase or phycoerythrin, or the antibody of the present invention
- Functional analysis can be performed.
- the immunological measurement method include
- the method for identifying immature germ cells derived from fish of the present invention is not particularly limited as long as it is a method using the antibody of the present invention, but a method having the following steps (a) and (b) is preferably exemplified. be able to. Step (a): contacting the labeled antibody of the present invention with a sample; Step (b): confirming whether the antibody specifically binds to the sample;
- the aforementioned fluorescent substances and enzymes can be used as the antibody label in the above step (a).
- the contact between the antibody and the sample in the step (a) can be performed in an appropriate solvent. Whether or not the antibody and the sample are specifically bound in the step (b) can be confirmed by a known immunoassay method such as ELISA or RIA.
- the sample specifically bound to the antibody or the substance in the sample can be identified as a fish-derived immature germ cell, while the antibody did not bind specifically.
- the sample or material in the sample can be identified as not being immature germ cells from fish.
- the method for separating immature germ cells derived from fish of the present invention is a method for separating immature germ cells derived from fish from a sample containing immature germ cells derived from fish using the antibody of the present invention.
- the method which has the following processes (A) and (B) can be illustrated suitably. Step (A): contacting the sample containing immature germ cells derived from fish with the labeled antibody of the present invention; Step (B) separating immature germ cells derived from fish to which the antibody specifically binds;
- the sample used in the above step (A) is not particularly limited as long as it is a sample containing immature fish cells of fish, but a sample containing reproductive ridges of fish embryos and fish gonads and testis cells is preferably used.
- a sample obtained by dissociating the above-mentioned genital ridges, gonads and testes until they are separated into cells by proteolytic enzymes and dispersing them in a suitable solvent can be more preferably exemplified.
- the aforementioned fluorescent substances and enzymes can be used for labeling the antibody in the step (A).
- the contact between the antibody and the sample in the step (A) can be performed in an appropriate solvent.
- Separation in the step (B) is performed by a method using a cell beader or the like, a method using a secondary antibody recognizing the antibody of the present invention labeled with magnetic beads (magnetic bead labeled secondary antibody), and the like. Only immature germ cells bound with the antibody of the present invention can be easily separated.
- the use of a magnetic bead-labeled secondary antibody is preferable in that the separation in the step (B) can be performed quickly and easily by using a magnet.
- immature germ cells derived from the donor fish separated by the above-described separation method of the present invention are transplanted into the early embryos of the recipient fish. Made up of. Transplantation of the isolated immature germ cells into the early embryo of the recipient fish can be performed by transplanting the recipient fish into the peritoneal lining of the peritoneal mesentery at an early developmental stage.
- the transplanted immature germ cells are spontaneously reciped. It moves into the gonads of ent fish, where it can induce differentiation into oocytes or spermatocytes, and further induce differentiation into eggs or sperm.
- immature germ cells immature germ cells isolated from embryos before and after hatching, preferably primordial germ cells and spermatogonia can be used, and as an early embryo of the recipient fish to be transplanted It is preferable to use recipient fish in the developmental stage before and after hatching.
- eggs and / or sperm derived from the recipient fish are hardly formed, and in eggs and / or sperm derived from the donor fish, particularly in females. Most preferred is that eggs derived from donors are specifically formed.
- Recipient fish having triploid chromosomes can be easily prepared by the method described in JP-A-2006-101845. Specifically, artificial insemination is performed in a normal manner using eggs from a diploid fish female parent and sperm from a normal diploid fish male parent, and under flowing water at 10 ° C. In addition to the method of starting development and immersing in warm water at 28 ° C. after 15 minutes after fertilization and then becoming normal eggs with flowing water at 10 ° C., eggs from normal females of diploid fish After normal insemination using spermatozoa from diploid fish male parents, the egg chromosomes were triploidized by blocking the second polar body by pressure treatment.
- the second polar body is prevented from being released by pressure stimulation or temperature stimulation to make a diploid) or first Splitting method (When the second polar body is released at the stage of development and the development begins only in the female pronucleus, a physicochemical stimulus is applied, and the first cleavage is blocked to produce a diploid.
- testosterone testosterone
- the types of recipient fish and donor fish in the differentiation induction method of the present invention may be the same, but different types of fish can also be used.
- the different species of fish include the same species of different species and different species of fish.
- the donor fish is a rainbow trout
- the same species of different species of recipient fish are yamame trout
- the different species of recipient fish are brown trout
- the char can be specifically exemplified, and when the donor fish is bluefin tuna, as the recipient fish of the same genus and different species, bigeye tuna, albacore tuna, yellowfin tuna, bigeye tuna and the like are specifically exemplified as the different species recipient fish
- examples of the recipient fish of different genera include horse mackerel and nibs.
- the donor fish are groupers or eels, it is possible to use dissimilar fish that are easily reared.
- immature germ cells derived from donor fish use immature germ cells of fish that are relatively expensive and labor-intensive to grow up to adult fish (for example, larger fish than recipient fish).
- fish that are relatively low cost and low labor to grow up to adult fish for example, smaller fish than donor fish
- the recipient fish eggs are grown by growing the recipient fish after transplantation. It is possible to induce differentiation of sperm and sperm at a relatively low cost and with low labor, for example, using a relatively small water tank.
- Examples of preferred combinations of donor fish and recipient fish to enjoy this merit include combinations of bluefin tuna (donor) and chub mackerel (recipient), and combinations of rainbow trout (donor) and yamame trout (recipient). it can.
- the method for growing fish of the present invention comprises forming eggs and / or sperm derived from donor fish by the method for inducing differentiation of isolated immature germ cells of the present invention. More specifically, for example, donor-derived eggs and sperm are collected from recipient fish after transplantation, fertilized eggs are produced using these eggs and sperm, and hatched to obtain donor fry, This can be bred to create a new individual of the donor fish and to grow the donor fish in large quantities.
- the differentiation induction method of the present invention for fish propagation methods include the following.
- various useful strains and varieties are produced by techniques such as gene transfer in the future, it is possible to maintain these without the need for breeding, and transplantation to recipient embryos when necessary. It becomes possible to change to an individual.
- 5206 clones were randomly selected from the cDNAs contained in this library, and the 5 ′ terminal nucleotide sequence was determined. Furthermore, using a membrane protein prediction program in silico, 82 clones having characteristics as membrane proteins were identified from these 5206 clones. Although these 82 clones are clearly expressed in type A spermatogonia, their expression is specific to type A spermatogonia (immature germ cells) or not germ cells It was unknown whether it was also expressed in gonadal somatic cells. Therefore, in order to identify clones that are specifically expressed in immature germ cells among the obtained 82 clones, primers for each clone were designed and RT-PCR analysis was performed according to a conventional method.
- cDNA derived from the above-mentioned type A spermatogonia isolated by flow cytometry and cDNA derived from somatic cells of the gonad were used.
- 20 clones out of 82 clones were found to be expressed specifically or at a particularly high level in immature germ cells.
- the expression level of a polypeptide that is specifically expressed in immature fish germ cells is advantageous when the polypeptide is used as a target for the fractionation of fish immature germ cells using an antibody. desired.
- the RT-PCR since the RT-PCR has extremely high sensitivity, it cannot be said to be optimal for screening those 20 clones having higher expression levels.
- a vasa with immature testis -Testis sample of GFP transgenic rainbow trout (12 months of age) (Fig. 3)
- vasa- with sperm testis The same in situ hybridization was performed using a testis sample of a GFP-transfected rainbow trout (FIG. 5) or a vasa-GFP-introduced rainbow trout ovary sample (FIG. 6) having an immature ovary.
- the antisense probe (sequence number 3) with respect to clone # 4017 used in the said Example 1 was used.
- clone # 4017 was specifically expressed in primordial germ cells, spermatogonia, oocytes and early oocytes. From the above experiments, it was shown that clone # 4017 is suitable as a marker molecule for immature germ cells such as primordial germ cells, spermatogonia, oocytes and early oocytes.
- this clone may be a homologue of CD205. Therefore, in order to confirm whether CD205 homologues exist in fish other than rainbow trout, we investigated zebrafish, bluefin tuna, grasshopper, chub mackerel, yellowtail, Japanese flounder, red sea bream, red sea bream, mahata, nibe. Was isolated. By analyzing these CD205 homologues and searching for regions conserved among the respective fish species from the deduced amino acid sequences, the amino acid sequence shown in FIG. 7 (amino acid numbers 1222-1260 in SEQ ID NO: 2 and In the region shown in FIG.
- FIG. 8A (comparison with the corresponding amino acid sequence) and in FIG. 8A (comparison between the nucleotide sequence shown in nucleotide numbers 3742-3858 in SEQ ID NO: 1 and the corresponding nucleotide sequence in the CD205 homolog), It was found that the homology was extremely high. In another region shown in FIG. 8B, the amino acid sequences of CD205 homologues of bluefin tuna, rainbow trout and zebrafish were found to be quite homologous.
- FIG. 10 was divided into six regions (FIG. 10), and the corresponding cDNA sequences were expressed in the expression vector pCold I (TaKaRa). And the obtained vector was transformed into Escherichia coli BL21 Star, and the transformant was cultured to produce the aforementioned 6 regions of the polypeptide. Affinity purification using a His tag was attempted for the polypeptides in these 6 regions, and the obtained sample was confirmed by SDS-PAGE. As a result, 4 regions (region 2, region 4, region 5, region 6) of 6 regions were identified. Only the polypeptide could be purified (FIG. 11). These four regions of polypeptide were immunized to different rabbits, and antiserum was collected from each rabbit.
- FIG. 12 shows the results of whole mount immunostaining of one type of antiserum (hereinafter also referred to as “# 4017 antibody”) among the four types of antisera obtained.
- the upper row is an image detected with the # 4017 antibody
- the middle row is an image of detecting GFP produced by germ cells
- the lower row is an image obtained by superimposing the upper and middle images. From this result, it was shown that # 4017 antibody specifically recognizes immature germ cells (spermatogonia). Similar images were obtained when the other three types of antisera were used.
- triploid yamame a hatched fry of a triploid yamame trout (hereinafter also referred to as “triploid yamame” or “3n yamame”) according to the method described in JP-A-2006-101845 is prepared. did.
- This method utilizes the fact that salmon fish such as yamame trout can easily and reliably prevent the release of the second polar body when a fertilized egg that has passed 15 minutes after fertilization is immersed in warm water at 27 ° C. for 15 minutes. Since triploid individuals become infertile, when transplanted with donor immature germ cells, recipients can produce only donor-derived eggs and sperm without mixing with recipient's own eggs and sperm. Preferred as fish.
- Transplanting type A spermatogonia of diploid vasa-GFP transgenic rainbow trout (donor) having fertility into the peritoneal cavity of a triploid yamame hatchling (recipient) obtained by the above method did. Thereafter, the recipient individual after transplantation was bred continuously, and testis was collected from a male individual (transplanted 3n yamame trout) immediately before the spawning season. The collected testicular tissue was sectioned and the tissue morphology was observed by hematoxylin and eosin staining.
- testicular tissue of a male individual immediately before the spawning period of a triploid yamame trout that had not been transplanted with donor cells (non-transplanted 3n yamame trout) or a male individual immediately before the spawning period of a wild type diploid yamame trout was also observed.
- the non-transplanted 3n yamame had only spermatogonia in the somatic division phase, whereas immature germ cells of diploid donor rainbow trout (type A spermatozoa In the transplanted 3n yamame trout transplanted with the cells), the testicular tissue filled with mature sperm could be confirmed as in the wild type 2n yamame trout.
- immature germ cells derived from fish can be easily separated or identified.
- immature germ cells can be isolated from donor fish without using genetic recombination techniques such as GFP, so that they can be used as food fish or seedlings for release.
- Parent fish farming techniques can be realized with high efficiency.
- fish that are relatively expensive and labor-intensive to grow up to adult fish are donor fish, and fish that is relatively inexpensive and labor-intensive to grow up to adult fish are recipient fish.
- transplanting immature germ cells derived from donor fish into recipient fish and growing them to adult fish differentiation can be induced into donor fish germ cells at a relatively low cost and effort. By using cells, it is possible to grow donor fish with relatively low cost and low labor.
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Abstract
本発明は、魚類の未成熟生殖細胞に特異的に発現する遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供すること、及び、前記抗体を用いることによって、ＧＦＰ遺伝子等のマーカー遺伝子の導入を行わずにドナー魚類から未成熟生殖細胞を分離する方法や、魚類由来の未成熟生殖細胞を同定する方法を提供することを目的とする。
本発明は、以下の（Ａ）、（Ｂ）等に示されるポリペプチド、又はそれをコードするポリヌクレオチド等を利用することを特徴とする。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：
Description
本発明は、代理親魚養殖技法による魚類の増殖方法に用いる魚類未成熟生殖細胞の分離に利用しうる抗体、及び該抗体を用いた魚類未成熟生殖細胞の分離方法等に関する。
近年の世界的な規模での健康意識の高まりを背景に、日本食、中でも、良質の脂質とタンパク質を含む魚類の消費は世界的に上昇している。その結果、特に需要の高いクロマグロをはじめとする大型高級魚は、生存数の減少が著しく、種類によっては絶滅が危惧される状況にまで至っている。クロマグロ等の大型高級魚資源を保護する手段の一つとして、人為的な管理の下で生産した人工種苗（稚魚）を天然海域に放流する、いわゆる栽培漁業が有効であるとされている。しかし、大型魚の放流用の人工種苗の生産に必要な卵や精子を入手するのは、技術的及びコスト的に大きな問題があった。すなわち、特定の疾患による全滅の弊害や、それらの人工種苗が成長した後に互いに交配を行った場合の弊害を避けるために、人工種苗の個体は遺伝的な多様性を保持している必要性があることを考慮すると、多数の親魚から卵や精子を採取することが望まれるが、クロマグロのように親魚が数百ｋｇにまで達する魚種や、チョウザメのように卵や精子の成熟に長い年月を要する魚種では、多数の親魚を人為的な管理の下で育成して卵や精子を採取することは技術的及びコスト的に極めて困難であった。
卵や精子の採取に関する上記の問題を解決するため、本発明者らは世界に先駆けて、有用魚種の卵や精子を、成熟が早くかつ飼育が容易な近縁種に生産させる代理親魚養殖技術を確立した。具体的には、卵や精子などの生殖細胞系列の幹細胞である始原生殖細胞をニジマス（ドナー）の孵化稚魚から取り出し、免疫系が未熟で移植細胞の拒絶が生じない孵化前後のヤマメ稚魚（レシピエント）に前述の始原生殖細胞を移植し、得られた宿主ヤマメを育成して成熟させることによって、ヤマメが元々持っている生殖細胞に由来する卵や精子だけでなく、ドナーであるニジマスの移植細胞に由来する卵や精子を生産させる技術を確立した（例えば特許文献１参照）。この代理親魚養殖技法においては、商業的な量産化に十分な移植効率を確保するために、ドナー魚類の生殖腺や精巣から始原生殖細胞等の未成熟な生殖細胞のみを分離してそれを移植に用いる必要があるため、始原生殖細胞特異的にＧＦＰ遺伝子が発現するように、始原生殖細胞特異的に発現するｖａｓａ遺伝子の調節領域にＧＦＰ遺伝子を導入した遺伝子組換えニジマスをドナーとして用いた。しかし、この遺伝子組換えニジマス由来の始原生殖細胞を成熟させて得られる卵や精子はＧＦＰ遺伝子が導入されたものであり、それらの卵や精子を利用して生産される稚魚は、ＧＦＰ遺伝子導入組換え魚であるため、食用魚や放流用種苗として利用することはできず、実用上の利用性の点で不十分な点があった。
一方、特許文献２には、ヒトの始原生殖細胞表面特異抗原に特異的な抗体、及び、この抗体を用いてヒト始原生殖細胞を同定することが記載されている。また、非特許文献１には、アフリカツメガエルの特定の発生段階の始原生殖細胞に特異的に発現するＶａｓａ遺伝子の遺伝子産物に反応するモノクローナル抗体を作製したことが記載されている。
また、本発明者らは、代理親魚養殖技術における前述の遺伝子組換え魚の不十分な点を改善することを目的として、ＧＦＰ遺伝子等のマーカー遺伝子の導入を行わずに、ドナー魚類から始原生殖細胞や精原細胞等の未成熟な生殖細胞を分離する方法の探索を試みてきた。具体的には、ニジマスを用いて、その未成熟生殖細胞に特異的に発現する遺伝子の探索を行ってきた（非特許文献２参照）。
本発明の課題は、魚類の未成熟生殖細胞に特異的に発現する遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供すること、及び、前記抗体を用いることによって、ＧＦＰ遺伝子等のマーカー遺伝子の導入を行わずにドナー魚類から未成熟生殖細胞を分離する方法や、魚類由来の未成熟生殖細胞を同定する方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究し、ニジマスの精原細胞に特異的に発現する細胞表面抗原を同定し、この抗原に対する抗体を作製した。具体的には、ニジマスの精原細胞で発現するｍＲＮＡを網羅的に解析（トランスクリプトーム解析）し、発現している遺伝子の中から細胞膜表面タンパク質をコードしている遺伝子の探索を行うことにより、ニジマスの精原細胞等の未成熟生殖細胞で特異的に発現し、かつ、in situ等でマーカーとして使用し得るクローンを得た。このクローンからｃＤＮＡを特定し、ホモロジー検索を行ったところ、１９９ｋＤａの完全膜貫通型糖タンパク質をコードするＣＤ２０５遺伝子であることが示唆された。ニジマス由来のＣＤ２０５遺伝子を、ニジマス以外の魚類（ゼブラフィッシュ、クロマグロ、ソウダガツオ、マサバ、ブリ、ヒラメ、マダイ、マハタ、ニベ）のＣＤ２０５遺伝子と比較し、各種の魚類で保存されている領域からペプチド抗原を作製し、次いで、そのペプチド抗原に対する抗体を作製した。この抗体を用いて、性分化直後のニジマスの未熟な精巣について免疫染色を行ったところ、未成熟な生殖細胞に特異的に結合することを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリヌクレオチド；（Ａ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド：（Ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：（Ｃ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：や、（２）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：や、（３）上記（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子や、（４）上記（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
また本発明は、（５）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリペプチド；（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド：（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：や、（６）上記（３）に記載の遺伝子によってコードされ、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドや、（７）上記（５）又は（６）に記載のポリペプチドと、マーカーポリペプチド及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ポリペプチドに関する。
さらに本発明は、（８）上記（５）に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体や、（９）配列番号２におけるアミノ酸番号８３３～１１０７に示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号１１１８～１３９５に示されるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号１４０７～１６９７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する上記（８）に記載の抗体に関する。
またさらに本発明は、（１０）上記（８）又は（９）に記載の抗体を用いた、魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法や、（１１）工程（ａ）：標識された上記（８）又は（９）に記載の抗体と試料とを接触させる工程；及び、工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法に関する。
さらにまた本発明は、（１２）上記（８）又は（９）に記載の抗体を用いて、魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料から、魚類由来の未成熟生殖細胞を分離することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法や、（１３）工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された上記（８）又は（９）に記載の抗体とを接触させる工程；及び、工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法や、（１４）魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料として、魚類の孵化胚の生殖隆起の細胞、魚類の生殖腺の細胞、及び、魚類の精巣の細胞から選択される細胞を含む試料を用いることを特徴とする上記（１２）又は（１３）に記載の魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法に関する。
また本発明は、（１５）ドナー魚類から上記（１２）～（１４）の分離方法により分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞（分離未成熟生殖細胞）を、レシピエント魚類の初期胚に移植することを特徴とする分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法や、（１６）レシピエント魚類として、ドナー魚類と異種の魚類を用いることを特徴とする上記（１５）に記載の分化誘導方法や、（１７）レシピエント魚類として、染色体が３倍体の魚類を用いることを特徴とする上記（１５）又は（１６）に記載の分化誘導方法や、（１８）レシピエント魚類の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にあるレシピエント魚類の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする上記（１５）～（１７）のいずれかに記載の分化誘導方法や、（１９）分離未成熟生殖細胞として、始原生殖細胞又は精原細胞を用いることを特徴とする上記（１５）～（１８）のいずれかに記載の分化誘導方法や、（２０）上記（１５）～（１９）のいずれかに記載の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子を形成せしめることを特徴とする魚類の増殖方法に関する。なお、本発明における「未成熟生殖細胞」とは、始原生殖細胞から精原細胞、精母細胞、精細胞、精子へ至る系列と、始原生殖細胞から卵原細胞、初期卵母細胞、卵母細胞、卵へと至る系列からなる生殖細胞系列のうち、始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞及び初期卵母細胞から選ばれる細胞を意味する。
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば特に制限されるものではなく、また、本発明の遺伝子としては、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のポリペプチドとしては、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドや、本発明の遺伝子によってコードされ、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドであれば特に制限されず、本発明において、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドとは、いずれかの魚類に由来する未成熟生殖細胞に特異的に発現し、かつ、少なくとも一部が前記未成熟生殖細胞の細胞外又は細胞表面に位置するポリペプチドをいう。
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個の任意の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。
例えば、これら１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（変異ポリヌクレオチド）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば配列番号１に示されるヌクレオチド配列）に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリヌクレオチドに変異を導入することにより、変異ポリヌクレオチドを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（以後"モレキュラークローニング第３版" と略す）、Current Protocols in MolecularBiology, Supplement 1～38, John Wiley & Sons (1987-1997) 等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ポリヌクレオチドを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを得ることができる。
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチド又はその断片を固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第３版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
すなわち、ストリジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０～７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
本発明のＤＮＡ等のポリヌクレオチドの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチド配列情報や、配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて、魚類のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＣＤ２０５遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドの種類としてはＤＮＡを好適に例示することができる。
本発明の遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子であるが、具体的には、配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５３４９に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドや、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７５７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
本発明における魚類としては、その未成熟生殖細胞が、本発明のポリペプチドを特異的に発現する魚類である限り特に制限されず、クロマグロ、マハタ、ブリ、ニベ、ヒラメ、マサバ、マダイ、ウナギ、シーラカンス等の海水魚や、ニジマス等の淡水魚を例示することができる。
本発明のポリペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のポリペプチドでも、化学合成したポリペプチドでも、遺伝子組換え技術により作製した組換えポリペプチドの何れでもよい。天然由来のポリペプチドを取得する場合には、かかるポリペプチドを発現している細胞又は組織からポリペプチドの単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のポリペプチドを取得することができる。化学合成によりポリペプチドを調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(ｔ－ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のポリペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のポリペプチドを合成することもできる。遺伝子組換え技術によりポリペプチドを調製する場合には、該ポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ等のポリヌクレオチドを好適な発現系に導入することにより本発明のポリペプチドを調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のポリペプチドを調製する場合、かかるポリペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとして、例えば、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のポリペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのポリペプチドの精製物を得ることができる。また、本発明のポリペプチドが細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
さらに、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド、又は、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドは、配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドを魚類の生体内で発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のポリヌクレオチドを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、動物細胞用発現ベクター、特に魚類細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましく、本発明に用いることのできる発現ベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明で用いることのできる制御配列としては、例えば、構成プロモーター、誘導性又は調節性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発現されている抗原の遺伝子由来のプロモーター等が挙げられるが、魚類の細胞内で発現可能である限り、特にそれらに限定されない。構成プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター配列、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス－４０（ＳＶ-４０）、筋βアクチンプロモーター、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの強力プロモーター等が挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等が挙げられる。誘導性又は調節性プロモーターとしては、例えば、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、又は亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーターを挙げることができる。前記転写調節配列は、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、操作可能に（すなわち、前記ヌクレオチド配列の発現を調節することができるように）結合させることができる。
前記制御配列は、プロモーター（例えば、前記誘導性又は構成性プロモーター）ＤＮＡ配列を含む発現制御配列を含むことができ、所望により、更に、エンハンサー要素、転写又はポリアデニル化シグナル［例えば、シミアンウイルス－４０（ＳＶ－４０）又はウシ成長ホルモン由来］のスプライシングのためのイントロン配列、又はＣｐＧモチーフとして知られている免疫刺激ＤＮＡ配列のうち、１つ若しくはそれ以上のコピーを含むことができる。
また、発現ベクターは、所望により、例えば、細菌複製起点配列、あるいは、選別させるための抗生物質耐性（例えば、カナマイシンなど）遺伝子又は非抗生物質耐性遺伝子（例えば、β－ガラクトシダーゼ遺伝子など）等の選択性マーカーを含むことができる。
本発明の融合ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと、マーカーポリペプチド及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ポリペプチドからなる。マーカーポリペプチドとしては例えばＧＦＰやルシフェラーゼタンパク質や、ＬａｃＺタンパク質等を例示することができ、ペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等を例示することができる。本発明の融合ペプチドは、本発明のポリペプチドやマーカーポリペプチドやペプチドタグを用い、公知の遺伝子工学を利用して作製することができる。
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体としては、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体である限り特に制限されないが、配列番号２におけるアミノ酸番号８３３～１１０７に示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号１１１８～１３９５に示されるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号１４０７～１６９７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体であることが好ましい。本発明の抗体の種類としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のポリペプチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの分離・定量や、本発明のポリペプチドの分子機構を明らかにする上で有用である。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ポリペプチド若しくはそのエピトープを含む断片、又は該ポリペプチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ法（MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
また上記本発明のモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、上記本発明の抗体にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合ポリペプチドを用いることによって、上記本発明のポリペプチドの機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
本発明の魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法としては、本発明の抗体を利用する方法である限り特に制限されないが、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を有する方法を好適に例示することができる。
工程（ａ）：標識された本発明の抗体と試料とを接触させる工程；
工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；
工程（ａ）：標識された本発明の抗体と試料とを接触させる工程；
工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；
上記工程（ａ）における抗体の標識としては、前述の蛍光物質や酵素を用いることができる。また、上記工程（ａ）における抗体と試料との接触は、適当な溶媒中で行うことができる。上記工程（ｂ）における前記抗体と試料とが特異的に結合しているかどうかは、ＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法等の公知の免疫学的測定法により確認することができる。
上記工程（ｂ）の結果、前記抗体が特異的に結合した試料又は試料中の物質は、魚類由来の未成熟生殖細胞と同定することができ、一方、前記抗体が特異的に結合しなかった試料又は試料中の物質は、魚類由来の未成熟生殖細胞でないと同定することができる。
本発明の魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法としては、本発明の抗体を用いて、魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料から、魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する方法である限り特に制限されないが、以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を有する方法を好適に例示することができる。
工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された本発明の抗体とを接触させる工程；
工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；
工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された本発明の抗体とを接触させる工程；
工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；
上記工程（Ａ）に用いる試料としては、魚類の未成熟生殖細胞を含む試料である限り特に制限されないが、魚類の孵化胚の生殖隆起や、魚類の生殖腺や精巣の細胞を含む試料を好適に例示することができ、前述の生殖隆起や生殖腺や精巣をタンパク質分解酵素で細胞ごとにバラバラになるまで解離し、それを適当な溶媒に分散させた試料をより好適に例示することができる。
また、上記工程（Ａ）における抗体の標識には、前述の蛍光物質や酵素を用いることができる。さらに、上記工程（Ａ）における抗体と試料との接触は、適当な溶媒中で行うことができる。上記工程（Ｂ）における分離は、セルソーター等を利用する方法の他、本発明の抗体を認識する２次抗体を磁性ビーズで標識したもの（磁性ビーズ標識２次抗体）を利用する方法などにより、本発明の抗体が結合した未成熟生殖細胞のみを容易に分離することができる。磁性ビーズ標識２次抗体を用いると、磁石を利用することによって、上記工程（Ｂ）における分離を迅速簡便に行うことができる点で好ましい。
また、上記工程（Ａ）における抗体の標識には、前述の蛍光物質や酵素を用いることができる。さらに、上記工程（Ａ）における抗体と試料との接触は、適当な溶媒中で行うことができる。上記工程（Ｂ）における分離は、セルソーター等を利用する方法の他、本発明の抗体を認識する２次抗体を磁性ビーズで標識したもの（磁性ビーズ標識２次抗体）を利用する方法などにより、本発明の抗体が結合した未成熟生殖細胞のみを容易に分離することができる。磁性ビーズ標識２次抗体を用いると、磁石を利用することによって、上記工程（Ｂ）における分離を迅速簡便に行うことができる点で好ましい。
本発明の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法は、上記の本発明の分離方法によって分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞（分離未成熟生殖細胞）を、レシピエント魚類の初期胚に移植することよりなる。分離未成熟生殖細胞のレシピエント魚類の初期胚への移植は、初期発生段階のレシピエント魚類の腹腔内腸管膜裏側への移植によって行うことができる。本発明の分化誘導方法により、分離未成熟生殖細胞を、例えばレシピエント魚類の孵化胚の腹腔内に、マイクロインジェクション法のような方法で移植すると、移植した未成熟生殖細胞は、自発的にレシピエント魚類の生殖腺内へと移動し、そこで卵母細胞或いは精母細胞への分化誘導、更には卵或いは精子への分化誘導を行うことができる。上記分離未成熟生殖細胞としては、孵化前後の胚から分離した未成熟生殖細胞、好ましくは始原生殖細胞や精原細胞を用いることができ、又、移植先となる上記レシピエント魚類の初期胚としては、孵化前後の発生段階にあるレシピエント魚類を用いることが好ましい。また、レシピエント魚類として、染色体が３倍体の魚類を用いると、レシピエント魚類由来の卵及び／又は精子がほとんど形成されることなく、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子、特に雌においてはほとんどドナー由来の卵が特異的に形成される点で好ましい。
上記の染色体が３倍体のレシピエント魚類は、特開２００６－１０１８４５号公報に記載された方法により容易に作製することができる。具体的には、通常２倍体魚類の雌親からの卵と、通常２倍体魚類の雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、１０℃の流水下で発生を開始させ、受精後１５分経過した後に２８℃の温水に浸漬し、その後１０℃の流水で通常卵となると同様に発生させる方法の他、通常２倍体魚類の雌親からの卵と、通常２倍体魚類の雄親からの精子を用いて、通常の方法で人工授精を施した後、圧力処理によって第二極体の放出を阻止することにより卵の染色体を三倍体化した受精卵を経て、３倍体稚魚を作出する方法や、紫外線やγ線によって不活性化した精子を卵にかけ、発生させることで雌性発生を行わせ、第二極体放出阻止法（発生の過程で、圧力刺激や温度刺激によって第二極体の放出を阻止して２倍体にする方法）又は第一卵割阻止法（発生の段階で第二極体を放出して雌性前核のみで発生を開始したところに、物理化学的な刺激を与え、第１回の卵割を阻止して２倍体とする方法）により染色体を倍加する方法や、雌魚を雄性ホルモン（テストステロン）で処理して、性転換を起こさせ雄化させ、この偽雄と普通の雌を交配する方法等を挙げることができる。３倍体のレシピエント魚類としては、殆どドナー由来の卵が特異的に形成される雌が好ましい。
また、本発明の分化誘導方法におけるレシピエント魚類とドナー魚類の種類は、同種であってもよいが、異種の魚類を用いることもできる。上記異種の魚類としては同属異種の魚類や異属の魚類を挙げることができ、例えば、ドナー魚類がニジマスの場合、同属異種のレシピエント魚類としてヤマメを、異属のレシピエント魚類としてブラウントラウト、イワナを具体的に例示することができ、ドナー魚類がクロマグロの場合、同属異種のレシピエント魚類として、メバチマグロ、ビンナガマグロ、キハダマグロ、メバチマグロ等を、異属のレシピエント魚類としてマサバを具体的に例示することができ、ドナー魚類がブリやカンパチの場合、異属のレシピエント魚類として、マアジやニベを例示することができる。また、ドナー魚類がハタ、ウナギの場合は、近縁の飼育が容易な異種の魚類を用いることができる。異種の魚類を用いる場合、例えばドナー魚類由来の未成熟生殖細胞として、成魚までの育成が比較的高コスト、高労力である魚類（例えばレシピエント魚類より大型の魚類）の未成熟生殖細胞を用い、レシピエント魚類として、成魚までの育成が比較的低コスト、低労力である魚類（例えばドナー魚類より小型の魚類）を用いると、移植後のレシピエント魚類を育成することによって、ドナー魚類の卵や精子を、例えば比較的小型の水槽を用いて、比較的低コスト、低労力で分化誘導することが可能となる。このメリットを享受するために好ましいドナー魚類とレシピエント魚類の組み合わせとしては、クロマグロ（ドナー）とマサバ（レシピエント）の組み合わせや、ニジマス（ドナー）とヤマメ（レシピエント）の組み合わせを例示することができる。
本発明の魚類の増殖方法は、本発明の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法によって、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子を形成せしめることよりなる。より具体的には、例えば、移植後のレシピエント魚類から、ドナー由来の卵や精子を採取し、この卵や精子を用いて受精卵を作製し、これを孵化させてドナーの稚魚を得、これを育成してドナー魚類の新規個体を作成し、ドナー魚類を大量に増殖させることができる。
また、本発明の分化誘導方法の、魚類の増殖方法への利用のその他の具体例としては、次のようなものがある。
（１）魚類の遺伝子資源の保存への利用：希少種、絶滅危惧種の未成熟生殖細胞を凍結保存し、必要な時に飼育が容易な近縁種のレシピエントに移植すれば、これらのレシピエントは希少種、あるいは絶滅危惧種（場合によっては既に絶滅した種）に由来する卵や精子を作出することが可能となる。また、今後遺伝子導入等の技術により様々な有用系統・品種が作出された場合、個体の経代飼育を行わなくてもこれらの維持が可能であり、必要なときにレシピエント胚への移植により個体へ改変することが可能となる。
（２）分離した未成熟生殖細胞の分子生物学的・生化学的解析への利用：分離した未成熟生殖細胞からタンパク質、核酸を抽出し解析することで、この細胞で発現している遺伝子・タンパク質の同定が可能になる。特に再生医療等で注目されている幹細胞の解析系として有用である。
（３）魚類の育種（品種改良）への利用：分離した未成熟生殖細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的改変を施した後、レシピエント個体内に移植し、卵・精子に分化させ、受精することで、効率よく、目的の遺伝的改変を行った個体を作製することができる。未成熟生殖細胞の遺伝的改変を行うには、前記したように、魚類で、既に用いられている公知の遺伝子の導入方法及び遺伝子の改変方法を用いることができる。該方法としては、例えば、魚類の遺伝子導入方法として汎用されている、マイクロインジェクション法及びエレクトロポーレーション法を挙げることができる。
（４）魚類の遺伝子機能解析への利用：未成熟生殖細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することが可能になれば、この細胞に対して遺伝子ターゲティングを行った後、上記の方法で未成熟生殖細胞を個体に変換することで、例えば、当該遺伝子の機能が破壊されたノックアウト魚や、さらには当該遺伝子の配列を改変したノックイン魚を作出することが可能となる。すなわち、マウスで利用されている胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の代用として利用することが可能であり、これにより機能が未知の新規遺伝子の役割を明らかにすることが可能となる。
（１）魚類の遺伝子資源の保存への利用：希少種、絶滅危惧種の未成熟生殖細胞を凍結保存し、必要な時に飼育が容易な近縁種のレシピエントに移植すれば、これらのレシピエントは希少種、あるいは絶滅危惧種（場合によっては既に絶滅した種）に由来する卵や精子を作出することが可能となる。また、今後遺伝子導入等の技術により様々な有用系統・品種が作出された場合、個体の経代飼育を行わなくてもこれらの維持が可能であり、必要なときにレシピエント胚への移植により個体へ改変することが可能となる。
（２）分離した未成熟生殖細胞の分子生物学的・生化学的解析への利用：分離した未成熟生殖細胞からタンパク質、核酸を抽出し解析することで、この細胞で発現している遺伝子・タンパク質の同定が可能になる。特に再生医療等で注目されている幹細胞の解析系として有用である。
（３）魚類の育種（品種改良）への利用：分離した未成熟生殖細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的改変を施した後、レシピエント個体内に移植し、卵・精子に分化させ、受精することで、効率よく、目的の遺伝的改変を行った個体を作製することができる。未成熟生殖細胞の遺伝的改変を行うには、前記したように、魚類で、既に用いられている公知の遺伝子の導入方法及び遺伝子の改変方法を用いることができる。該方法としては、例えば、魚類の遺伝子導入方法として汎用されている、マイクロインジェクション法及びエレクトロポーレーション法を挙げることができる。
（４）魚類の遺伝子機能解析への利用：未成熟生殖細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することが可能になれば、この細胞に対して遺伝子ターゲティングを行った後、上記の方法で未成熟生殖細胞を個体に変換することで、例えば、当該遺伝子の機能が破壊されたノックアウト魚や、さらには当該遺伝子の配列を改変したノックイン魚を作出することが可能となる。すなわち、マウスで利用されている胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の代用として利用することが可能であり、これにより機能が未知の新規遺伝子の役割を明らかにすることが可能となる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［魚類未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドの探索］
特開２００３－２３５５５８号公報（［００４０］）において本発明者らが作出した、ｖａｓａ遺伝子の転写調節領域により制御されるＧＦＰ遺伝子を導入したニジマス（以下、「ｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス」という。）から、ＧＦＰ蛍光を指標としたフローサイトメトリーにより、Ａ型精原細胞を１×１０７個単離した。単離したＡ型精原細胞からｍＲＮＡを抽出し、常法にしたがってｃＤＮＡライブラリーを作製した。続いて、本ライブラリーに含まれるｃＤＮＡのうち、５２０６クローンをランダムに選択し、その５’末端側の塩基配列を決定した。さらに、in silicoにて膜タンパク質予想プログラムを用いて、これら５２０６個のクローンの中から、膜タンパク質としての特徴を有している８２個のクローンを同定した。これら８２個のクローンは、Ａ型精原細胞で発現していることは明らかであるものの、その発現がＡ型精原細胞（未成熟生殖細胞）に特異的であるのか、あるいは生殖細胞ではない生殖腺体細胞においても発現しているのかは不明であった。そこで、得られた８２クローンのうち、未成熟生殖細胞で特異的に発現するクローンを同定するため、各クローンに対するプライマーをデザインし、常法にしたがってＲＴ－ＰＣＲ解析を行った。なお、このＲＴ－ＰＣＲにおける鋳型ｃＤＮＡとしては、フローサイトメトリーで単離した上記Ａ型精原細胞由来のｃＤＮＡや、生殖腺の体細胞由来のｃＤＮＡを用いた。その結果、８２クローンのうち、２０クローンが、未成熟生殖細胞で特異的、あるいは特に高レベルで発現していることが判明した。
魚類未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドの発現量は、該ポリペプチドをターゲットとして抗体によって魚類未成熟生殖細胞の分取等に利用する場合に有利であることから、より高いことが望まれる。ここで、上記ＲＴ－ＰＣＲは感度が極めて高いため、この２０クローンの中からより発現量が高いものをスクリーニングするためには最適とはいえない。そこで、これら２０クローンの各クローンをプローブとして用いて、３ヶ月齢のｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプルに対して常法にしたがってin situハイブリダイゼーションを行い、そのシグナル強度の解析を試みることとした。その結果、２０クローンのうち、２クローン（クローン＃４０１７と＃５２０６）において、３ヶ月齢精巣のＡ型精原細胞に特異的で、かつ、より強いシグナルが認められた（図１）。そこで、これら２クローンのうち、シグナルがより強かったクローン＃４０１７を用いてさらなる詳細な発現解析を行うこととした。
特開２００３－２３５５５８号公報（［００４０］）において本発明者らが作出した、ｖａｓａ遺伝子の転写調節領域により制御されるＧＦＰ遺伝子を導入したニジマス（以下、「ｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス」という。）から、ＧＦＰ蛍光を指標としたフローサイトメトリーにより、Ａ型精原細胞を１×１０７個単離した。単離したＡ型精原細胞からｍＲＮＡを抽出し、常法にしたがってｃＤＮＡライブラリーを作製した。続いて、本ライブラリーに含まれるｃＤＮＡのうち、５２０６クローンをランダムに選択し、その５’末端側の塩基配列を決定した。さらに、in silicoにて膜タンパク質予想プログラムを用いて、これら５２０６個のクローンの中から、膜タンパク質としての特徴を有している８２個のクローンを同定した。これら８２個のクローンは、Ａ型精原細胞で発現していることは明らかであるものの、その発現がＡ型精原細胞（未成熟生殖細胞）に特異的であるのか、あるいは生殖細胞ではない生殖腺体細胞においても発現しているのかは不明であった。そこで、得られた８２クローンのうち、未成熟生殖細胞で特異的に発現するクローンを同定するため、各クローンに対するプライマーをデザインし、常法にしたがってＲＴ－ＰＣＲ解析を行った。なお、このＲＴ－ＰＣＲにおける鋳型ｃＤＮＡとしては、フローサイトメトリーで単離した上記Ａ型精原細胞由来のｃＤＮＡや、生殖腺の体細胞由来のｃＤＮＡを用いた。その結果、８２クローンのうち、２０クローンが、未成熟生殖細胞で特異的、あるいは特に高レベルで発現していることが判明した。
魚類未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドの発現量は、該ポリペプチドをターゲットとして抗体によって魚類未成熟生殖細胞の分取等に利用する場合に有利であることから、より高いことが望まれる。ここで、上記ＲＴ－ＰＣＲは感度が極めて高いため、この２０クローンの中からより発現量が高いものをスクリーニングするためには最適とはいえない。そこで、これら２０クローンの各クローンをプローブとして用いて、３ヶ月齢のｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプルに対して常法にしたがってin situハイブリダイゼーションを行い、そのシグナル強度の解析を試みることとした。その結果、２０クローンのうち、２クローン（クローン＃４０１７と＃５２０６）において、３ヶ月齢精巣のＡ型精原細胞に特異的で、かつ、より強いシグナルが認められた（図１）。そこで、これら２クローンのうち、シグナルがより強かったクローン＃４０１７を用いてさらなる詳細な発現解析を行うこととした。
［クローン＃４０１７の発現解析］
未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製した場合に、その抗体の汎用性を高めるためには、そのポリペプチドが上記in situハイブリダイゼーション等に用いた３ヶ月齢のＡ型精原細胞のみならず、あらゆるステージの生殖腺において、始原生殖細胞や精原細胞等の未成熟生殖細胞を特異的に認識することが要求される。そこで、上記のin situハイブリダイゼーションで用いたサンプルに代えて、受精後３５日後の始原生殖細胞を保持するｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス初期胚の精巣サンプル（図２）、未成熟な精巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１２ヶ月）の精巣サンプル（図３）、成熟途上の精巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１８ヶ月）の精巣サンプル（図４）、排精精巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプル（図５）、又は、未成熟な卵巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ導入ニジマスの卵巣サンプル（図６）を用いて、同様のin situハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブとしては、上記実施例１で用いた、クローン＃４０１７に対するアンチセンスプローブ（配列番号３）を用いた。その結果を図２～図６に示す。その結果、すべてのサンプルにおいて、クローン＃４０１７は始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞や初期卵母細胞で特異的に発現していることが明らかとなった。
以上の実験により、クローン＃４０１７が始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞や初期卵母細胞等の未成熟生殖細胞のマーカー分子として適していることが示された。
未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製した場合に、その抗体の汎用性を高めるためには、そのポリペプチドが上記in situハイブリダイゼーション等に用いた３ヶ月齢のＡ型精原細胞のみならず、あらゆるステージの生殖腺において、始原生殖細胞や精原細胞等の未成熟生殖細胞を特異的に認識することが要求される。そこで、上記のin situハイブリダイゼーションで用いたサンプルに代えて、受精後３５日後の始原生殖細胞を保持するｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス初期胚の精巣サンプル（図２）、未成熟な精巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１２ヶ月）の精巣サンプル（図３）、成熟途上の精巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（月齢１８ヶ月）の精巣サンプル（図４）、排精精巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの精巣サンプル（図５）、又は、未成熟な卵巣を持つｖａｓａ－ＧＦＰ導入ニジマスの卵巣サンプル（図６）を用いて、同様のin situハイブリダイゼーションを行った。なお、プローブとしては、上記実施例１で用いた、クローン＃４０１７に対するアンチセンスプローブ（配列番号３）を用いた。その結果を図２～図６に示す。その結果、すべてのサンプルにおいて、クローン＃４０１７は始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞や初期卵母細胞で特異的に発現していることが明らかとなった。
以上の実験により、クローン＃４０１７が始原生殖細胞、精原細胞、卵原細胞や初期卵母細胞等の未成熟生殖細胞のマーカー分子として適していることが示された。
［クローン＃４０１７のポリヌクレオチド配列の決定］
上記実施例２の実験により、クローン＃４０１７が、未成熟生殖細胞特異的に発現し、そのマーカー分子として適していることが示された。そこで、クローン＃４０１７の全長を常法であるＲＡＣＥ－ＰＣＲ法により単離し、その全塩基配列を決定した。その結果、本クローンは１９９ｋＤのポリペプチド（配列番号２）をコードする５２７４ｂｐのオープンコード領域を含む全長６５４１ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号１）であることが明らかとなった。本クローンのポリペプチドについてホモロジー解析を行ったところ、本クローンはＣＤ２０５のホモログである可能性が示唆された。そこで、ニジマス以外の魚にも、ＣＤ２０５ホモログが存在するかを確認するために、ゼブラフィッシュ、クロマグロ、ソウダガツオ、マサバ、ブリ、ヒラメ、マダイ、マハタ、ニベについて調べたところ、すべての魚からＣＤ２０５ホモログが単離された。これらのＣＤ２０５ホモログを解析し、その演繹アミノ酸配列から各魚種間で保存されている領域を探索したところ、図７（配列番号２におけるアミノ酸番号１２２２～１２６０に示されるアミノ酸配列と、ＣＤ２０５ホモログにおいてそれに相当するアミノ酸配列との比較）及び図８Ａ（配列番号１におけるヌクレオチド番号３７４２～３８５８に示されるヌクレオチド配列と、ＣＤ２０５ホモログにおいてそれに相当するヌクレオチド配列との比較）に示される領域において、ニジマスのＣＤ２０５と極めて相同性が高いことが判明した。また、図８Ｂに示される別の領域においても、クロマグロ、ニジマス、ゼブラフィッシュのＣＤ２０５ホモログのアミノ酸配列はかなり相同性が高いことが判明した。
上記実施例２の実験により、クローン＃４０１７が、未成熟生殖細胞特異的に発現し、そのマーカー分子として適していることが示された。そこで、クローン＃４０１７の全長を常法であるＲＡＣＥ－ＰＣＲ法により単離し、その全塩基配列を決定した。その結果、本クローンは１９９ｋＤのポリペプチド（配列番号２）をコードする５２７４ｂｐのオープンコード領域を含む全長６５４１ｂｐのｃＤＮＡ（配列番号１）であることが明らかとなった。本クローンのポリペプチドについてホモロジー解析を行ったところ、本クローンはＣＤ２０５のホモログである可能性が示唆された。そこで、ニジマス以外の魚にも、ＣＤ２０５ホモログが存在するかを確認するために、ゼブラフィッシュ、クロマグロ、ソウダガツオ、マサバ、ブリ、ヒラメ、マダイ、マハタ、ニベについて調べたところ、すべての魚からＣＤ２０５ホモログが単離された。これらのＣＤ２０５ホモログを解析し、その演繹アミノ酸配列から各魚種間で保存されている領域を探索したところ、図７（配列番号２におけるアミノ酸番号１２２２～１２６０に示されるアミノ酸配列と、ＣＤ２０５ホモログにおいてそれに相当するアミノ酸配列との比較）及び図８Ａ（配列番号１におけるヌクレオチド番号３７４２～３８５８に示されるヌクレオチド配列と、ＣＤ２０５ホモログにおいてそれに相当するヌクレオチド配列との比較）に示される領域において、ニジマスのＣＤ２０５と極めて相同性が高いことが判明した。また、図８Ｂに示される別の領域においても、クロマグロ、ニジマス、ゼブラフィッシュのＣＤ２０５ホモログのアミノ酸配列はかなり相同性が高いことが判明した。
［クローン＃４０１７のポリペプチドに対する抗体の作製］
実施例３において見出されたＣＤ２０５の保存領域内（配列番号２におけるアミノ酸番号１２２２～１２６０に示されるアミノ酸配列）においてさらに抗原性が高いと予想される配列にしたがって、ニジマスＣＤ２０５由来の２種類のペプチド抗原を合成し、それぞれの抗原を２羽ずつ（計４羽）のウサギに免疫して４種類の抗血清を作製した。しかし、この４種類の抗血清を用いてウエスタンブロット法や免疫組織化学染色を行ったところ、これらの抗血清の中には、ＣＤ２０５を特異的に認識するものは含まれていなかった。そこで、次に、配列番号２のポリペプチド（ニジマスのＣＤ２０５）（図９）の細胞外領域を６つの領域に分断し（図１０）、それぞれに対応するｃＤＮＡ配列を発現ベクターpCold I（TaKaRa社製）に乗せ、得られたベクターを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒに形質転換し、この形質転換体を培養することによって、前述の６つの領域のポリペプチドを生産した。これら６領域のポリペプチドについてＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製を試み、得られたサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したところ、６領域中、４領域（領域２、領域４、領域５、領域６）のポリペプチドのみを精製することができた（図１１）。これら４領域のポリペプチドをそれぞれ別のウサギに免疫し、各ウサギから抗血清を採取した。得られた４種類のそれぞれの抗血清を用い、性分化直後のｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの未成熟な精巣に対してホールマウント免疫染色を行った。得られた４種類の抗血清のうち、１種類の抗血清（以下、「＃４０１７抗体」ともいう。）のホールマウント免疫染色の結果を図１２に示す。上段が、＃４０１７抗体で検出したイメージであり、中段が、生殖細胞が生産しているＧＦＰを検出したイメージであり、下段が、上段と中段のイメージを重ね合わせたものである。この結果から、＃４０１７抗体が未成熟生殖細胞（精原細胞）を特異的に認識することが示された。なお、他の３種類の抗血清を用いた場合も、同様のイメージが得られた。
実施例３において見出されたＣＤ２０５の保存領域内（配列番号２におけるアミノ酸番号１２２２～１２６０に示されるアミノ酸配列）においてさらに抗原性が高いと予想される配列にしたがって、ニジマスＣＤ２０５由来の２種類のペプチド抗原を合成し、それぞれの抗原を２羽ずつ（計４羽）のウサギに免疫して４種類の抗血清を作製した。しかし、この４種類の抗血清を用いてウエスタンブロット法や免疫組織化学染色を行ったところ、これらの抗血清の中には、ＣＤ２０５を特異的に認識するものは含まれていなかった。そこで、次に、配列番号２のポリペプチド（ニジマスのＣＤ２０５）（図９）の細胞外領域を６つの領域に分断し（図１０）、それぞれに対応するｃＤＮＡ配列を発現ベクターpCold I（TaKaRa社製）に乗せ、得られたベクターを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒに形質転換し、この形質転換体を培養することによって、前述の６つの領域のポリペプチドを生産した。これら６領域のポリペプチドについてＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製を試み、得られたサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認したところ、６領域中、４領域（領域２、領域４、領域５、領域６）のポリペプチドのみを精製することができた（図１１）。これら４領域のポリペプチドをそれぞれ別のウサギに免疫し、各ウサギから抗血清を採取した。得られた４種類のそれぞれの抗血清を用い、性分化直後のｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマスの未成熟な精巣に対してホールマウント免疫染色を行った。得られた４種類の抗血清のうち、１種類の抗血清（以下、「＃４０１７抗体」ともいう。）のホールマウント免疫染色の結果を図１２に示す。上段が、＃４０１７抗体で検出したイメージであり、中段が、生殖細胞が生産しているＧＦＰを検出したイメージであり、下段が、上段と中段のイメージを重ね合わせたものである。この結果から、＃４０１７抗体が未成熟生殖細胞（精原細胞）を特異的に認識することが示された。なお、他の３種類の抗血清を用いた場合も、同様のイメージが得られた。
［参考例］ニジマス未成熟生殖細胞を移植したヤマメにおけるドナーニジマス生殖細胞の分化誘導、及び、前記ヤマメを利用したドナーニジマスの増殖
ドナー魚類からＧＦＰを指標として分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞をレシピエント魚類の初期胚に移植し、得られた移植レシピエント魚類を育成することによって、ドナー由来の生殖細胞が得られるか、また、移植レシピエント魚類から得られた、ドナー魚類由来生殖細胞を利用して、ドナー魚類の稚魚が得られるかを確認するために、以下の実験を行った。
ドナー魚類からＧＦＰを指標として分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞をレシピエント魚類の初期胚に移植し、得られた移植レシピエント魚類を育成することによって、ドナー由来の生殖細胞が得られるか、また、移植レシピエント魚類から得られた、ドナー魚類由来生殖細胞を利用して、ドナー魚類の稚魚が得られるかを確認するために、以下の実験を行った。
まず、レシピエント魚類として、特開２００６－１０１８４５号公報記載の方法にしたがって、染色体が３倍体のヤマメ（以下、「３倍体ヤマメ」又は「３ｎヤマメ」ともいう。）の孵化稚魚を作製した。この方法は、ヤマメ等のサケ科魚類では受精後１５分経過した受精卵を２７℃の温水に１５分間浸漬すると、第２極体の放出を容易かつ確実に阻止できることを利用したものである。３倍体個体は、不妊になるため、ドナーの未成熟生殖細胞を移植した場合に、レシピエント自身の卵や精子と混ざることなく、ドナー由来の卵や精子のみを作製し得る点でレシピエント魚類として好ましい。
上記方法により得られた３倍体ヤマメの孵化稚魚（レシピエント）の腹腔内に、妊性を有している２倍体のｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス（ドナー）のＡ型精原細胞を移植した。移植後のレシピエント個体をその後、継続飼育し、産卵期直前の雄個体（移植３ｎヤマメ）から精巣を採取した。採取した精巣の組織を切片化し、ヘマトキシリン・エオシン染色によって組織形態を観察した。また、コントロールとして、ドナー細胞を移植しなかった３倍体ヤマメの産卵期直前の雄個体（非移植３ｎヤマメ）の精巣組織や、野生型の２倍体ヤマメの産卵期直前の雄個体（２ｎヤマメ）の精巣組織も観察した。これらの観察結果を図１３に示す。この図１３の結果から分かるように、非移植３ｎヤマメは、体細胞分裂期の精原細胞しか有していなかったのに対し、２倍体のドナーニジマスの未成熟生殖細胞（Ａ型精原細胞）を移植した移植３ｎヤマメでは、野生型の２ｎヤマメと同様に、成熟精子で充満した精巣組織を確認することができた。
上述の移植３ｎヤマメをさらに継続して飼育したところ、移植から満１年で雄個体の一部が成熟したため、そのうち１０個体の精液からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡと、ドナーニジマスの細胞に特異的なＧＦＰプライマーとを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（＃１～＃１０の「精」）をアガロースゲルで電気泳動した結果、これら１０個体（＃１～＃１０）のすべてでＧＦＰ遺伝子断片の増幅が認められた（図１４）。また、これら１０個体の精液由来のＤＮＡに代えて、体細胞由来のＤＮＡを用いて同様のＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物（＃１～＃１０の「体」）を同様に電気泳動した場合は、ＧＦＰ遺伝子断片の増幅は認められなかった。さらに、ドナーニジマス（ｖａｓａ－ＧＦＰ遺伝子導入ニジマス）（陽性対照個体）や野生型ヤマメ（陰性対照個体）や野生型ニジマス（陰性対照個体）について、それぞれ精液及び体細胞から抽出したＤＮＡを用いて同様のＰＣＲ解析を行ったところ、ドナーニジマスの精液及び体細胞においてもＧＦＰ遺伝子の発現が確認されたのに対し、野生型ヤマメや野生型ニジマスの場合は精液からも体細胞からもＧＦＰ遺伝子の発現は確認されなかった。また、内部標準として、β－アクチンを用いた。
次に、成熟した移植３ｎヤマメから得られる精液が、ドナー由来の精液として実際に機能するかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
上記の成熟した移植３ｎヤマメから採取した精液を、野生型ニジマスから採取した未受精卵に媒精したところ、得られた卵からニジマスの稚魚（以下、「ニジマスＦ１稚魚」という。）が孵化した。また、この孵化のタイミングは、野生型ニジマス由来の受精卵の場合と全く同じタイミング（受精後３２－３３日）であった。なお、ニジマスの卵とヤマメの精子の受精により生じた雑種の受精卵は、大幅に孵化が遅れ、孵化後の稚魚は接餌開始期までに全滅することを確認している。
上記のニジマスＦ１稚魚は、ドナーニジマスのマーカーであるＧＦＰ遺伝子を保持しており、生殖細胞が緑色蛍光で標識されていることが確認された。さらに、公知のＲＡＰＤ（Random Amplification DNA Fingerprinting）法によるＤＮＡ鑑定を行った結果、調査したニジマスＦ１稚魚５０個体の全てが完全にニジマス型のＤＮＡパターンを示し、ヤマメ特有のＤＮＡ断片は全く認められなかった。ニジマスＦ１稚魚５０個体のうち、２０個体についてのＲＡＰＤ法の結果を図１５に示す。また、対照として、ニジマス、ヤマメ、及び、ニジマスとヤマメの雑種（ニジヤマ）の結果も併せて示す。
以上の結果から、成熟した移植３ｎヤマメから得られる精液が、ドナーであるニジマスの精液として実際に機能することが示された。
上記の成熟した移植３ｎヤマメから採取した精液を、野生型ニジマスから採取した未受精卵に媒精したところ、得られた卵からニジマスの稚魚（以下、「ニジマスＦ１稚魚」という。）が孵化した。また、この孵化のタイミングは、野生型ニジマス由来の受精卵の場合と全く同じタイミング（受精後３２－３３日）であった。なお、ニジマスの卵とヤマメの精子の受精により生じた雑種の受精卵は、大幅に孵化が遅れ、孵化後の稚魚は接餌開始期までに全滅することを確認している。
上記のニジマスＦ１稚魚は、ドナーニジマスのマーカーであるＧＦＰ遺伝子を保持しており、生殖細胞が緑色蛍光で標識されていることが確認された。さらに、公知のＲＡＰＤ（Random Amplification DNA Fingerprinting）法によるＤＮＡ鑑定を行った結果、調査したニジマスＦ１稚魚５０個体の全てが完全にニジマス型のＤＮＡパターンを示し、ヤマメ特有のＤＮＡ断片は全く認められなかった。ニジマスＦ１稚魚５０個体のうち、２０個体についてのＲＡＰＤ法の結果を図１５に示す。また、対照として、ニジマス、ヤマメ、及び、ニジマスとヤマメの雑種（ニジヤマ）の結果も併せて示す。
以上の結果から、成熟した移植３ｎヤマメから得られる精液が、ドナーであるニジマスの精液として実際に機能することが示された。
次に、移植３ｎヤマメの雌から得られる卵が、ドナーであるニジマスの卵として実際に機能するかどうかを確認するために、以下の実験を行った。
移植後９ヶ月目の移植３ｎヤマメ（２Ｎ→３Ｎ）の雌個体を解剖して観察を行ったところ、非移植３ｎヤマメ（３Ｎ）の雌に典型的な小型卵母細胞しか保持しない糸状の卵巣の中央部に、野生型の２ｎヤマメ（２Ｎ）ヤマメが保持するような大型の卵母細胞から構成されるコロニーを観察することができた。さらに、これらの大型卵母細胞はドナーニジマスのマーカーである明瞭なＧＦＰ蛍光を発していた（図１６）。そこで、これらの雌個体を継続飼育した結果、５０尾の雌親魚のうち５尾で排卵が認められた。そこで、この５尾の雌個体から得られた卵を、前述の移植３ｎヤマメの雄個体から得られた精液で媒精した。その結果、図１６に示すように、受精した全ての卵が正常に発生し、通常のニジマスと全く同じタイミングで孵化を完了した。孵化した各稚魚の染色体のゲノムや、母性遺伝することが知られているミトコンドリアゲノムについてＤＮＡ解析を行ったところ、全ての稚魚個体が完全にニジマスであることが証明された。また、これらの稚魚はその後も正常に成育した。
以上より、移植３ｎヤマメの雄個体と雌個体を用いることにより、ドナーであるニジマスのみの稚魚を生産することが可能であることが示された。
移植後９ヶ月目の移植３ｎヤマメ（２Ｎ→３Ｎ）の雌個体を解剖して観察を行ったところ、非移植３ｎヤマメ（３Ｎ）の雌に典型的な小型卵母細胞しか保持しない糸状の卵巣の中央部に、野生型の２ｎヤマメ（２Ｎ）ヤマメが保持するような大型の卵母細胞から構成されるコロニーを観察することができた。さらに、これらの大型卵母細胞はドナーニジマスのマーカーである明瞭なＧＦＰ蛍光を発していた（図１６）。そこで、これらの雌個体を継続飼育した結果、５０尾の雌親魚のうち５尾で排卵が認められた。そこで、この５尾の雌個体から得られた卵を、前述の移植３ｎヤマメの雄個体から得られた精液で媒精した。その結果、図１６に示すように、受精した全ての卵が正常に発生し、通常のニジマスと全く同じタイミングで孵化を完了した。孵化した各稚魚の染色体のゲノムや、母性遺伝することが知られているミトコンドリアゲノムについてＤＮＡ解析を行ったところ、全ての稚魚個体が完全にニジマスであることが証明された。また、これらの稚魚はその後も正常に成育した。
以上より、移植３ｎヤマメの雄個体と雌個体を用いることにより、ドナーであるニジマスのみの稚魚を生産することが可能であることが示された。
本発明のポリヌクレオチドや遺伝子やポリペプチドを指標とすることによって、魚類由来の未成熟生殖細胞を容易に分離又は同定することが可能となる。
また、本発明を利用すれば、ＧＦＰ等の遺伝子組換え技術を利用することなく、ドナー魚類から未成熟生殖細胞のみを単離することができるため、食用魚や放流用種苗としても利用可能な代理親魚養殖技法が高効率で実現可能となる。
また、この代理親魚養殖技法において、成魚までの育成が比較的高コスト、高労力である魚類をドナー魚類とし、成魚までの育成が比較的低コスト、低労力である魚類をレシピエント魚類とすると、ドナー魚類由来の未成熟生殖細胞をレシピエント魚類に移植し、それを成魚まで育成することによって、比較的低コスト、低労力でドナー魚類の生殖細胞へと分化誘導することができ、その生殖細胞を用いることによって、ドナー魚類を比較的低コスト、低労力で増殖させることができる。
また、本発明を利用すれば、ＧＦＰ等の遺伝子組換え技術を利用することなく、ドナー魚類から未成熟生殖細胞のみを単離することができるため、食用魚や放流用種苗としても利用可能な代理親魚養殖技法が高効率で実現可能となる。
また、この代理親魚養殖技法において、成魚までの育成が比較的高コスト、高労力である魚類をドナー魚類とし、成魚までの育成が比較的低コスト、低労力である魚類をレシピエント魚類とすると、ドナー魚類由来の未成熟生殖細胞をレシピエント魚類に移植し、それを成魚まで育成することによって、比較的低コスト、低労力でドナー魚類の生殖細胞へと分化誘導することができ、その生殖細胞を用いることによって、ドナー魚類を比較的低コスト、低労力で増殖させることができる。
Claims (20)
- 以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド：
（Ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（Ｃ）配列番号１におけるヌクレオチド番号７９～５１９３に示されるヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド： - 以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド：
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：
（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド： - 請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含み、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチドをコードする遺伝子。
- 請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるポリペプチド。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド：
（Ｂ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド：
（Ｃ）配列番号２におけるアミノ酸番号１～１７０５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド： - 請求項３に記載の遺伝子によってコードされ、かつ、魚類由来の未成熟生殖細胞に特異的に発現するポリペプチド。
- 請求項５又は６に記載のポリペプチドと、マーカーポリペプチド及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ポリペプチド。
- 請求項５に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 配列番号２におけるアミノ酸番号８３３～１１０７に示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号１１１８～１３９５に示されるアミノ酸配列、又は、アミノ酸番号１４０７～１６９７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する請求項８に記載の抗体。
- 請求項８又は９に記載の抗体を用いた、魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法。
- 工程（ａ）：標識された請求項８又は９に記載の抗体と試料とを接触させる工程；及び
工程（ｂ）：前記抗体が試料と特異的に結合するかどうかを確認する工程；
を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の同定方法。 - 請求項８又は９に記載の抗体を用いて、魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料から、魚類由来の未成熟生殖細胞を分離することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法。
- 工程（Ａ）：魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料と、標識された請求項８又は９に記載の抗体とを接触させる工程；及び
工程（Ｂ）前記抗体が特異的に結合した魚類由来の未成熟生殖細胞を分離する工程；
を有することを特徴とする魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法。 - 魚類由来の未成熟生殖細胞を含む試料として、魚類の孵化胚の生殖隆起の細胞、魚類の生殖腺の細胞、及び、魚類の精巣の細胞から選択される細胞を含む試料を用いることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の魚類由来の未成熟生殖細胞の分離方法。
- ドナー魚類から請求項１２～１４の分離方法により分離されたドナー魚類由来の未成熟生殖細胞（分離未成熟生殖細胞）を、レシピエント魚類の初期胚に移植することを特徴とする分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法。
- レシピエント魚類として、ドナー魚類と異種の魚類を用いることを特徴とする請求項１５に記載の分化誘導方法。
- レシピエント魚類として、染色体が３倍体の魚類を用いることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の分化誘導方法。
- レシピエント魚類の初期胚への移植が、孵化前後の発生段階にあるレシピエント魚類の腹腔内腸管膜裏側への移植であることを特徴とする請求項１５～１７のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 分離未成熟生殖細胞として、始原生殖細胞又は精原細胞を用いることを特徴とする請求項１５～１８のいずれかに記載の分化誘導方法。
- 請求項１５～１９のいずれかに記載の分離未成熟生殖細胞の分化誘導方法により、ドナー魚類由来の卵及び／又は精子を形成せしめることを特徴とする魚類の増殖方法。
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Ref document number: 2010505024 Country of ref document: JP |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
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| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
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