NO331814B1 - Renset eller isolert nukleinsyre, isolert polypeptid, klonings- og/eller ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyren, vertscelle, differensiert ES-celle, dyr omfattende cellene, anvendelse av nukleinsyren for pavisning og/eller amplifisering av nukleinsyresekvenser, som sens- eller antisensoligonukleotid, og fremstilling av rekombinant polypeptid, monoklonalt eller polyklonalt antistoff som selektivt binder polypeptidet, fremgangsmate for pavisning av polypeptidet, analysesett til bruk i fremgangsmaten, fremgangsmate for pavisning av pluripotent natur for ES-fuglecelle, fremgangsmate for klassifisering av fugl, DNA-chip, proteinchip, fremgangsmate for pavisning av polypeptidet i matprove, fremgangsmate for analyse av om forbindelse eller medium kan indusere differensiering av pluripotent celle, eller gjenopprette pluripotent natur, og anvendelse av nukleinsyren som promoter for gen for uttrykking av genet i pluripotent fuglecelle. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen angår modifiserte fjærfe ES-celler, spesielt uttrykkende et eksogent gen når de har en pluripotent karakter. Oppfinnelsen angår også en nukleinsyre og et polypeptid som spesifikt uttrykkes i pluripotente fjærfeceller og fremgangsmåter for å påvise den pluripotente karakteren til celler ved anvendelse av nevnte nukleinsyre og polypeptid.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår modifiserte fjørfe ES-celler som spesifikt uttrykker et eksogent gen når de naturlig er pluripotente. Oppfinnelsen angår også en nukleinsyre og et polypeptid som uttrykkes spesifikt i pluripotente fjørfeceller og fremgangsmåter for å påvise den pluripotente naturen til celler ved anvendelse av denne nukleinsyren og dette polypeptidet.

ES-celler er pluripotente celler isolert fra et svært tidlig embryo som er i stand til å delta i morfogenesen av alt vev, inkludert germinalt vev, etter at de har blitt transplantert inn i vertsembryoer. Disse cellene ble først av alt isolert i mus hvor de er mye brukt for å danne mutante dyr i sitt genom som bærer svært målrettede modifikasjoner. ES-celler har blitt isolert ogkarakteriserti fugler (Pain et al., 1996). Disse cellene kan anvendes for å modifisere den genetiske arven til kyllinger (Etches et al., 1996, Pain et al., 1999). Et kulturmedium som gjør det mulig å opprettholde den pluripotente naturen til disse fjærfecellene er gjenstand for patentsøknad WO 96/12793.

Vanskelighetene som alle som ønsker å isolere ES-celler i kultur møter, angår den raske identifiseringen av disse cellene og deres pluripotente natur. Flere cellulære markører har blitt anvendt, slik som ekspresjonen av alkalisk fosfataseaktivitet (Strickland et al., 1980), ekspresjonen av antigene epitoper (Kemler et al., 1981, Solter og Knowles 1978), ekspresjonen av spesifikke proteiner slik som OCT-3 (Rosner et al., 1990) eller ekspresjonen av telomeraseaktivitet (Prowse og Greider 1995). OCT-3-, REX-1- og UTF-1-proteinene har blant annet inntil nylig kun blitt identifisert i mus. Maksimal bekreftelse på den pluripotente naturen er basert på analyser av disse cellenes morfogenetiske muligheter etter at de er blitt transplantert inn i vertsembryoer som representerer en svært arbeidsom test.

En annen vanskelighet ved dyrking av ES-celler omfatter oppnåelsen av cellepopulasjoner med en lav og tilfredsstillende grad av heterogenisitet og problemet med å kontrollere veksten av ikke-pluripotente celler i kultur. Et spesifikt problem er faktisk assosiert med den kontinuerlige tilstedeværelsen av visse differensierte celletyper som er celler som er i stand til å eliminere ES-cellene fra kulturen ved å indusere differensiering derav eller programmert celledød derav.

Den foreliggende oppfinnelsen foreslår å forenkle identifiseringen av den pluripotente naturen til fjørfeceller i kultur ved å bringe for dagen en nukleinsyresekvens ( ens- 1- gen) som uttrykkes spesifikt og selektivt av de pluripotente cellene.

Et formål ved den foreliggende oppfinnelsen er således en nukleinsyrekarakterisertved at den omfatter en nukleinsyresekvens valgt fra gruppen av følgende sekvenser:

a) SEQ. ID .Nr. 1, eller nukleotidfragment 1409-2878 i SEKV. ID NO:l; b) nukleotidfragment 3111-3670 i SEKV. ID NO: 1; c) nukleinsyresekvens med en prosentvis identitet på i det minste 80 % etter den optimale sammenstillingen med en sekvens som definert i a) eller b), og som er en markør for den pluripotente naturen til embryo stamceller fra fugl tilhørende Galliformordenen, og hvori nevnte nukleinsyresekvens har samme biologiske aktivitet og teknisk effekt som SEKV. IDNO:l; d) komplementære sekvens eller RNA-sekvens svarende til en sekvens som definert i a), b) eller c).

Fortrinnsvis er basen presentert ved 2773 i SEQ.ID .NO. 1 en "t", hvor det korresponderende kodon da koder for en treonin.

Nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen som definert i c) har en prosentvis identitet på i det minste 80 % etter optimal tilpasning med en sekvens som definert i

a) eller b) ovenfor, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 %. Sekvensen som definert i c), d) eller e) sammenlignes fortrinnsvis med en av sekvensene som

definert i a).

Uttrykkene "nukleinsyre", "nukleinsyresekvens", "polynukleotid", "oligonukleotid", "polynukleotidsekvens" og "nukleotidsekvens", uttrykk som vil bli anvendt likt i den foreliggende beskrivelse, er ment å angi en presis nukleotidtråd som kan eller ikke kan være modifisert, hvilket gjør det mulig å definere et fragment eller en region av en nukleinsyre som kan eller ikke kan omfatte unaturlige nukleotider og som kan svare likt til et dobbelttrådet DNA, et enkelttrådet DNA og transkripsjonsprodukter av nevnte DNA. Nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen omfatter følgelig også PNA'er (peptidnukleinsyrer) eller lignende.

Det bør forstås at den foreliggende oppfinnelsen ikke angår nukleotidsekvensene i deres naturlige, kromosomale miljø, det vil si i den naturlige tilstanden. De er sekvenser som er blitt isolert og/eller renset, det vil si at de er blitt oppnådd direkte eller indirekte, for eksempel ved hjelp av kopiering, og deres miljø er blitt i det minste delvis modifisert. Nukleinsyrene oppnådd ved hjelp av kjemisk syntese er følgelig også ment å være omfattet.

For formålet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, angir uttrykket "prosentvis identitet" mellom to nukleinsyre- eller aminosyresekvenser at en prosent av nukleotidene eller aminosyrerestene som er identiske mellom de to sekvensene som sammenlignes, oppnådd etter den beste tilpasningen, og hvor denne prosenten er rent statistisk og forskjellene mellom de to sekvensene er fordelt tilfeldig og over hele den totale lengden. Uttrykket "beste tilpasning" eller "optimal tilpasning" er ment å angi den tilpasningen hvor den påviste prosentvise identiteten bestemt som nedenfor er høyest. Sekvenssammenligninger mellom to nukleinsyre- eller aminosyresekvenser utføres konvensjonelt ved å sammenligne disse sekvensene etter å ha tilpasset dem optimalt, nevnte sammenligning utføres ved hjelp av segment eller ved "sammenligningsvindu" for så å identifiseres og sammenligne lokale regioner med sekvenslikhet. Den optimale tilpasningen av sekvensen for sammenligningen kan utføres, ved siden av manuelt, ved hjelp av den lokale homologialgoritmen til Smith og Waterman (1981), ved hjelp av den lokale homologialgoritmen til Neddleman og Wunsch (1970), ved hjelp av likhetssøkefremgangsmåten til Pearson og Lipman (1988), ved hjelp av dataprogramvare ved anvendelse av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). For å oppnå den optimale tilpasningen, anvendes fortrinnsvis BLAST-programmet med BLOSUM 62-matrisen. PAM- eller PAM250-matrisen kan også anvendes.

Prosentvis identitet mellom to nukleinsyre- eller aminosyresekvenser bestemmes ved sammenligning av disse to sekvensene som er tilpasset optimalt, nukleinsyre-eller aminosyresekvenser som skal sammenlignes omfatter muligens addisjoner eller delesjoner i forhold til referansesekvensen for optimal tilpasning mellom de to sekvensene. Den prosentvise identiteten beregnes ved å bestemme antallet identiske nukleotid- eller aminosyrerestposisjoner som er identisk mellom de to sekvensene, dele antallet identiske posisjoner med det totale antallet posisjoner som er sammenlignet og multiplisere det oppnådde resultatet med 100 for så å oppnå den prosentvise identiteten mellom de to sekvensene.

Uttrykket "nukleinsyresekvens med en prosentvis identitet på minst 80 %, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 %, etter optimal tilpasning med referansesekvensen" er ment å angi nukleinsyresekvensen som sammenlignet med referansesekvensen har visse modifikasjoner, slik som spesielt en delesjon, en trunkering, en forlengelse, en kimær fusjon og/eller en substitusjon spesielt av punkttypen, og nukleinsyresekvensen som utøver i det minste 80 %, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 % identitet etter optimal tilpasning med referansenukleinsyresekvensen. De er fortrinnsvis sekvensen hvis komplementære sekvenser er i stand til å hybridisere spesifikt med sekvensen SEKV. ID NO:l ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis vil de spesifikke eller høystringens hybridiseringsbetingelsene være slik at de sikrer i det minste 80 %, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 % identitet etter optimal tilpasning mellom en av de to sekvensene og sekvenssammenligningen til den andre.

Hybridisering under høye stringensbetingelser betyr at temperatur- og ionestyrkebetingelsene er valgt slik at de tillater at hybridisering mellom to komplementære DNA-fragmenter kan opprettholdes. For å illustrere dette er høystringensbetingelser for hybridiseringstrinnet for formålet å definere polynukleotidfragmenter beskrevet ovenfor fordelaktig som følger.

DNA-DNA- eller DNA-RNA-hybridiseringen utføres i to trinn: (1) prehybridisering ved 42°C i 3 timer i fosfatbuffer (20 raM, pH 7,5) inneholdende 5 X SSC (1 X SSC svarer til en løsning av 0,15 M NaCl + 0,015 M natriumcitrat), 50 % formamid, 7 % natriumdodecylsulfat (SDS), 10 X Denhardfs, 5 % av dekstransulfat og 1 % laksesperm-DNA; (2) hybridisering per se i 20 timer ved en temperatur som avhenger av probens lengde (det vil si 42°C for en probe > 100 nukleotider lang, etterfulgt av 2 vaskinger på 20 minutter ved 20°C i 2 X SSC + 2% SDS og 1 vasking i 20 minutter ved 20°C i 0,1 X SSC + 0,1% SDS. Den siste vaskingen utføres i 0,1 X SSC + 0,1 % SDS i 30 minutter ved 60 °C for en probe > 100 nukleotider. De stringenshybridiseringsbetingelsene beskrevet ovenfor for et polynukleotid med definert lengde kan justeres av fagfolk på området for lengre eller kortere oligonukleotider i henhold til læren av Sambrook et al., 1989.

Blant nukleinsyresekvensene med en prosentvis identitet på minst 80 %, fortrinnsvis 90 % og mer foretrukket 98 % etter optimal tilpasning med sekvensen ifølge oppfinnelsen, gir også preferanser til nukleinsyresekvensen som er varianter av SEKV. ID NO:l eller fragmenter derav, det vil si alle nukleinsyresekvensene svarende til alleliske varianter som så å si er individuelle variasjoner av sekvensen SEKV. ID NO:l. Disse naturlig muterte sekvensene svarende til polymorfismen som er til stede i fugler, spesielt i galliformfugler. Fortrinnsvis angår den foreliggende oppfinnelsen variantnukleinsyresekvensene hvori mutasjonene medfører en modifikasjon i aminosyresekvensen til polypeptidet eller fragmenter derav som kodes av den normale sekvensen med SEKV. TD NO:l.

Uttrykket "variantnukleinsyresekvens" er også ment å angi ethvert RNA eller cDNA som er et resultat av en mutasjon og/eller variasjon i et spleisesete i den genomiske nukleinsyresekvensen, hvis cDNA har sekvensen SEKV. ID NO:l.

Oppfinnelsen angår fortrinnsvis en renset eller isolert nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelsen,karakterisert vedat den omfatter eller består av sekvensen SEKV. ID NO:l, sekvensen komplementær dertil eller RNA-sekvensen svarende til SEKV. ID NO:l.

Fortrinnsvis er fragmentene som hybridiserer til nukleinsyren ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller som er homolog til nevnte nukleinsyresekvens ikke definert ved nukleotidene 2308-2927 eller 3094-3753 i SEKV. ID NO:l, som tilnærmingsvis svarer til EST'er (GenBank nr. AJ397754 og AJ393785) som har blitt oppnådd ved systematisk sekvensering og hvortil det ikke er tilveiebrakt noen data, spesielt funksjonelle data. Av denne grunn bør disse avsløringene bli betraktet som tilfeldige avsløringer.

Anvendelsen av en sekvens av en nukleinsyre ifølge den foreliggende oppfinnelsen som probe eller primer er også en del av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelsen angår følgelig primere eller prober ifølge den foreliggende oppfinnelsen som kan gjøre det mulig spesielt å demonstrere eller skille variantnukleinsyresekvenser eller å identifisere den genomiske sekvensen til genet hvortil cDNA representeres av SEKV. ID NO:l, spesielt ved anvendelse av en amplifiseringsmetode slik som PCR-metoden eller en beslektet metode.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av en nukleinsyresekvens ifølge den foreliggende oppfinnelsen som en probe eller primer for å påvise, identifisere, analysere og/eller amplifisere nukleinsyresekvenser.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av en nukleinsyresekvens ifølge den foreliggende oppfinnelsen som et sens- eller antisensoligonukleotid.

Ifølge oppfinnelsen er polynukleotidene som kan anvendes som en probe eller som en primer i fremgangsmåtene for påvisning, identifisering, analysering eller amplifisering av en nukleinsyresekvens minimum på 15 baser, fortrinnsvis 20 baser eller enda bedre 25 til 30 baser.

Probene og primerne ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være merket direkte eller indirekte med en radioaktiv eller ikke-radioaktiv forbindelse ved anvendelse av fremgangsmåter velkjente for fagfolk på området for å oppnå et detekterbart og/eller kvantifiserbart signal.

Polynukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen som er umerkede, kan anvendes direkte som en probe eller primer.

Sekvensene er vanligvis merket for å oppnå sekvenser som kan anvendes for mange anvendelsesområder. Primerne eller probene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er merket med radioaktive elementer eller med ikke-radioaktive molekyler.

Blant de radioaktive isotopene som anvendes, kan nevnes 32p 32p 35g<3>H ^ 125L De ikke-radioaktive enhetene er valgt fra ligander slik som biotiner, avidiner, streptavidiner eller dioksygeniner, haptener, fargestoffer og luminescerende midler så som radioluminescerende-, kjemiluminescerende-, bioluminescerende-, fluorescerende- eller fosforiserende midler.

Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan derved benytte som en primer og/eller probe i fremgangsmåter, spesielt ved anvendelse av PCR (polymerasekjedereaksjon)

-teknikken (Rolfs et al., 1991). Denne teknikken krever utvelgelse av oligonukleotidprimerpar som omgir fragmentet som skal amplifiseres. Som referanse kan det for eksempel vises til teknikkene beskrevet i US patent nr. 4,683,202. De amplifiserte fragmentene kan identifiseres for eksempel etter

agarose- eller polyakrylamidgelelektroforese eller etter en kromatografisk teknikk som gelfiltrering eller ionebyttekromatografi og deretter sekvenseres. Det amplifiserte produktets spesifisitet kan kontrolleres ved anvendelse nukleotidsekvensen til polynukleotidene ifølge oppfinnelsen som primere, og som matrise plasmider inneholdende disse sekvensene eller ellers de utledede amplifiserte produktene. De amplifiserte nukleotidfragmentene kan anvendes som reagenser i hybridiseringsreaksjoner for å påvise nærværet av en målnukleotidsekvens som er komplementær til det nevnte amplifiserte nukleotidfragmentet i en biologisk prøve.

Oppfinnelsen er også rettet mot nukleinsyresekvenser som kan oppnås ved hjelp av amplifisering ved anvendelse av primere ifølge oppfinnelsen.

Andre teknikker for amplifisering av målnukleinsyren kan fordelaktig anvendes som et alternativ til PCR (PCR-lignende) ved å bruke nukleotidsekvensprimerpar ifølge oppfinnelsen. Uttrykket "PCR-lignende" er ment å angi alle fremgangsmåter som anvender direkte eller indirekte reproduksjon av nukleinsyresekvenser eller ellers hvori merkesystemene har blitt amplifisert; disse teknikkene er selvfølgelig kjente. Vanligvis involverer de amplifisering av DNA med en polymerase; når den opprinnelige prøven er et RNA, bør en revers transkripsjon utføres på forhånd. Et større antall fremgangsmåter eksisterer for tiden for denne amplifiseringen, slik som for eksempel SDA ("strand displacement amplification") -teknikken (Walker et al., 1992), TAS (transkripsjonsbasert amplifiseringssystem) -teknikken beskrevet av Kwoh et al. (1989), 3SR ("self-sustained sequence replication") -teknikken beskrevet av Guatelli et al. (1990), NASBA (nukleinsyresekvensbasert amplifisering) -teknikken beskrevet av Kievitis et al. (1991), TMA (transkripsjonsmediert amplifisering) -teknikken, LCR (ligasekjedereaksjon) -teknikken beskrevet av Landegren et al. (1988), RCR (reparasjonskjedereaksjon) -teknikken beskrevet av Segev (1992), CPR ("cycling probe reaction") -teknikken beskrevet av Duck et al. (1990), og Q-beta-replikaseamplifiseringsteknikken beskrevet av Miele et al. (1983). Enkelte av disse teknikkene har siden blitt forbedret.

Når målpolynukleotidet som skal påvises er en mRNA, anvendes fortrinnsvis et enzym av revers transkriptasetypen, forut for utførelsen av amplifiseringsreaksjonen ved anvendelse av primerne ifølge oppfinnelsen eller å utføre en fremgangsmåte for påvisning ved anvendelse av probene ifølge oppfinnelsen for å oppnå et cDNA fra mRNA i den biologiske prøven. Det oppnådde cDNA vil deretter tjene som et mål for primerne eller probene som anvendes i amplifiseringen eller deteksjonsmetoden ifølge oppfinnelsen.

Probehybridiseringsteknikken kan utføres på mange måter (Matthews et al., 1988). De vanligste metodene består av immobilisering av nukleinsyren ekstrahert fra cellene fra forskjellige typer vev eller fra celler i kultur på en støtte (slik som nitrocellulose, nylon eller polystyren), og innkubere den immobiliserte målnukleinsyren med en probe under veldefinerte betingelser. Etter hybridisering fjernes overskudd av proben og de dannede hybridmolekylene påvises ved anvendelse av passende fremgangsmåter (måling av radioaktivitet, fluorescens eller enzymatisk aktivitet bundet til proben).

Ifølge en annen utførelsesform av nukleinsyreprobene ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan sistnevnte anvendes som "capture probe". I dette tilfellet immobiliseres en probe, angitt som "capture probe", på en støtte og anvendes for å ved hjelp av spesifikk hybridisering å fange målnukleinsyren oppnådd fra den biologiske prøven som skal testes og målnukleinsyren synliggjøres deretter ved anvendelse av en andre probe, angitt som "deteksjonsprobe", merket med et lett detekterbart element.

Blant de fordelaktige nukleinsyrefragmentene bør spesielt nevntes antisensoligonukleotider, det vil si oligonukleotider hvis struktur sikrer ekspresjonsinhibering av det korresponderende produktet ved hjelp av hybridisering med målsekvensen. Det bør også nevnes at sensoligonukleotider som ved å virke sammen med proteiner som er involvert i reguleringen av ekspresjonen av det korresponderende proteinet, vil indusere enten inhibering eller aktivering av denne ekspresjonen.

I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen, koder nukleinsyren ifølge oppfinnelsen for et polypeptid som har et kontinuerlig fragment på i det minste 200 aminosyrer av proteinet SEKV. ID NO:2, fortrinnsvis 300 aminosyrer og mest foretrukket koder for proteinet SEKV. ID NO:2. Dette polypeptidet er også en gjenstand for oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelsen angår faktisk også et isolert polypeptid,karakterisertved at det omfatter et polypeptid valgt fra: a) et polypeptid svarende til SEKV. ID NO:2; b) et polypeptid som er homologt til et polypeptid som definert i a), omfattende i det minste 80 % sekvensidentitet med nevnte polypeptid i a) og hvori nevnte polypeptid har samme biologiske aktivitet og teknisk effekt som polypeptidet svarende til SEKV. ID NO:2; c) et biologisk aktivt fragment av et polypeptid som definert i a) eller b).

Fortrinnsvis er aminosyren ved posisjon 455 et treonin.

For formålet ved den foreliggende oppfinnelsen, er uttrykket "polypeptid" ment å angi proteiner eller peptider.

Uttrykket "biologisk aktivt fragment" er ment å bety et fragment med den samme biologiske aktiviteten som peptidfragmentet som det er utledet fra, fortrinnsvis innen den samme størrelsesorden (innen en faktor på 10). Et biologisk aktivt fragment av ENS-1-proteinet omfatter derfor et polypeptid utledet fra SEKV. ID NO:2 som også kan spille en rolle for pluripotensgenskapenetil ES-celler.

Fortrinnsvis er et polypeptid ifølge oppfinnelsen et polypeptid bestående av sekvensen SEKV. ID NO:2 (svarende til proteinet kodet av ew.s-7-genet) eller av en sekvens med i det minst 80 % identitet med SEKV. ID NO:2 etter optimal tilpasning.

Polypeptidets sekvens har en prosentvis identitet på i det minste 80 % etter optimal tilpasning med sekvensen SEKV. ID NO:2, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 %.

Uttrykket "polypeptid med en aminosyresekvens som har en prosentvis identitet på i det minste 80 %, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 % etter optimal tilpasning med en referansesekvens" er ment å bety polypeptidene med visse modifikasjoner sammenlignet med referansepolypeptidet, slik som spesielt en eller flere delesjoner og/eller trunkeringer, en forlengelse, en kimær fusjon og/eller en eller flere substitusjoner.

Blant polypeptidene med aminosyresekvensen med en prosentvis identitet på i det minste 80 %, fortrinnsvis 90 %, mer foretrukket 98 % etter optimal tilpasning med sekvensen SEKV. ID NO:2 eller med et fragment derav i henhold til oppfinnelsen, gis preferens til variantpolypeptidene kodet for av variantnukleinsyresekvensene som definert tidligere, spesielt polypeptider med aminosyresekvensen som har i det minste en mutasjon spesielt svarende til en trunkering, delesjon, substitusjon og/eller addisjon av i det minste en aminosyrerest sammenlignet med sekvensen SEKV. ID NO:2 eller med et fragment derav, mer foretrukket variantpolypeptider med en mutasjon assosiert med et tap av pluripotent natur i cellene som inneholder dem.

Den foreliggende oppfinnelsen angår også klonings- og/eller ekspresjonsvektorer omfattende en nukleinsyre eller som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. En slik vektor kan også inneholde elementene som kreves for ekspresjonen og eventuelt sekresjonen av polypeptidet i en vertscelle. En slik vertscelle er også et formål ved oppfinnelsen.

Vektorenekarakterisert vedat de omfatter en promotor- og/eller regulatorsekvens ifølge oppfinnelsen, er også en del av oppfinnelsen.

Nevnte vektorer omfatter fortrinnsvis en promotor, translasjonsinitierings- og termineringssignaler, og også regioner egnet for regulering av transkripsjon. Det må være mulig for dem å bli opprettholdt stabilt i cellen og de kan eventuelt inneholde bestemte signaler som spesifiserer sekresjon av det translaterte proteinet.

Disse ulike kontrollsignalene velges som en funksjon av den cellulære verten som anvendes. For å få til dette, kan nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen settes inn i vektorer som replikerer autonomt i den valgte verten eller vektorer som integreres i den valgte verten.

Blant systemene som replikerer autonomt, kan systemer av plasmid- eller virustypen, hvor de virale vektorene for eksempel kan være adenovirus (Perricaudet et al., 1992), retrovirus, lentivirus, poxvirus eller herpesvirus (Epstein et al., 1992) fortrinnsvis anvendes avhengig av vertscellen. Fagfolk på området er kjent med teknologien som kan anvendes for hvert av disse systemene.

Når det er ønskelig at sekvensen integreres i vertscellens kromosomer, kan for eksempel systemer av plasmid- eller virustypen, slike virus er for eksempel retrovirus (Temin, 1986) eller AAVer (Carter, 1993), anvendes.

Blant de ikke-virale vektorene er nakne polynukleotider slik som nakent DNA eller nakent RNA i henhold til teknologien utviklet av selskapet VICAL, bakterielle kunstige kromosomer ("bacterial artificial chromosomes") (BAC), kunstige gjærkromosomer (YAC) for ekspresjon i gjær, kunstige musekromosomer (MAC) for ekspresjon i museceller og fortrinnsvis humane kunstige kromosomer (HAC) for ekspresjon i humane celler foretrukket.

I fugleceller kan retrovirus, fugleadenovirus, poxvirus eller annet DNA anvendes som en ekspresjonsvektor og introduseres ved hjelp av transfeksjon eller elektroporering.

Slike vektorer fremstilles ifølge fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk på området og de resulterende klonene kan introduseres i en egnet vert ved anvendelse av standardmetoder slik som for eksempel lipofeksjon, elektroporering, varmesjokk, transformering etter kjemisk permeabilisering av membranen eller cellefusjon.

Oppfinnelsen omfatter også vertsceller, spesielt de eukaryote og prokaryote cellene, transformert med vektorene ifølge oppfinnelsen og også transgene dyr, fortrinnsvis fugler eller pattedyr bortsett fra mennesker, omfattende en av de nevnte transformerte cellene ifølge oppfinnelsen. Spesielt omfatter oppfinnelsen dyrene som omfatter ens- 1 -genet med en genetisk markør satt inn i dette genet.

Blant cellene som kan anvendes for formålet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan bakterielle celler (Olins og Lee, 1993), men også gjærceller (Buckholz, 1993), og også animalske celler spesielt pattedyrcellekulturer (Edwards og Aruffo, 1993) og spesielt eggstokkceller fra kinesiske hamstere (CHO) nevnes. Insektceller hvori det er mulig å anvende fremgangsmåter som anvender for eksempel baculovirus

(Luckow, 1993) kan også nevnes. En foretrukket cellulær vert for ekspresjon av proteinene ifølge oppfinnelsen utgjøres av COS-celler.

Blant fuglecellene som kan anvendes, kan LMH-kyllinghematomceller, CT6 udødeliggjorte vaktelceller og primære eller udødeliggjorte kylling-, vaktel- eller andefibroblaster nevntes.

Oppfinnelsen angår også en vertscelle inneholdende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen,karakterisert vedat det er en fugle ES-celle som også er modifisert ved å introdusere et eksogent gen, hvor nevnte eksogene gen kun og spesifikt uttrykkes når nevnte celle opprettholdes i det pluripotente stadiet. Nevnte eksogene gen er fortrinnsvis et markørgen valgt fra lacZ, GFP, luciferase, ROSA-(3-geo og et gen for antibiotikaresistens, spesielt genet for neomycin-, hygromycin-, phleomycin- eller puromycinresistens.

Disse cellene ifølge oppfinnelsen er svært anvendelige for screening av forbindelser som gjør det mulig å indusere differensiering av de pluripotente cellene eller for mediet for å dyrke celler hvor de samtidig opprettholder sin pluripotente natur.

En annen vertscelle av interesse ifølge den foreliggende oppfinnelsen består av en fuglecelle inneholdende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen som også er modifisert ved introdusering av en eksogen nukleinsyre, hvor nevnte eksogene nukleinsyre er integrert inn i nevnte nukleinsyre ifølge oppfinnelsen. Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er nevnte eksogene nukleinsyre et gen av terapeutisk interesse, eventuelt med spatio-temporale promotor- og/eller terminatorsekvenser. I en annen utførelsesform er nevnte eksogene nukleinsyre en genmarkør som kan velges fra lacZ, GFP, alkalisk fosfatase, tymidinkinase og gener for antibiotikaresistens. (Blant disse er neomycin, hygromycin, phleomycin og puromycin).

Fuglevertscellene beskrevet ovenfor er fortrinnsviskarakterisert vedat fuglen tilhører ordenen Galliformes og spesielt er en kylling eller en vaktel.

I dette tilfellet er nevnte rapportgen integrert under kontrollen av promotoren til ens- 1 -genet og/eller nevnte eksogene nukleinsyre (gen av terapeutisk interesse og/eller genetisk markør) integrert inn i ens- 1 -genet.

Det er på denne måten mulig å anvende promotoren identifisert i den foreliggende søknaden svarende til nukleotidene 3111-3670 av SEKV. ID NO: 1. Det er også mulig å modifisere denne promotoren ved å redusere antallet nukleotider eller ved å introdusere ytterligere nukleotider eller selv ved å utføre mutasjoner på visse nukleotider. Fagfolk på området er kjent med protokollene for å utføre nevnte modifikasjoner og også for å teste promotoren som er oppnådd på denne måten for ekspresjon i pluripotente stamceller. Det har følgelig spesifikt blitt vist at det er mulig å sette inn et guanin ved posisjon 3654 i SEKV. ID N0:1 uten å tape promotoraktiviteten til fragmentene som er modifisert på denne måten.

Oppfinnelsen angår følgelig også anvendelsen av en nukleinsyre svarende til nukleotidene 3111-3670 i SEKV. ID NO:l som en promotor for et gen av interesse for spesifikk ekspresjon av nevnte gen av interesse i pluripotente fugleceller. Et gen av interesse er enten et markørgen (luciferase, GFP, P-galaktosidase osv) eller det kan være et gen som koder for et protein slik som en vekstfaktor, et cytokin, et protein involvert i immungjenkjenning, et protein med terapeutisk verdi osv. Det er interessant å merke seg at "TATA-boksen" også har blitt identifisert ved nukleotidene 3645-3651 i SEKV. ID NO: l og den er en gjenstand for oppfinnelsen.

En foretrukket celle ifølge oppfinnelsen er en 9N2.5-celle, deponert ved "Collection Nationale de Culture des Microorganismes [National Collection of Cultures and Microorganisms], 11. mai 2000 under identifikasjonsnummer 1-2477.

Cellene ifølge oppfinnelsen er foretrukket pluripotente ES-celler, men det bør forstås at oppfinnelsen også angår differensierte fugleceller som er utledet fra en ES-celle ifølge oppfinnelsen. Disse cellene kan spesielt differensieres ved anvendelse av retinsyre ifølge læren i patentsøknad WO 96/12793.

Oppfinnelsen angår også de transgene dyrene som inneholder en celle ifølge oppfinnelsen. Blant dyrene ifølge oppfinnelsen gis preferens til fugler, spesifikt medlemmer av ordenen Galliformes. Disse transgene fuglene vil være spesielt fordelaktige for å studere modifikasjoner i ens- l- genet eller i dets promotor.

Det er også mulig å introdusere en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i fugler og andre dyr slik som gnagere, spesielt mus, rotter eller kaniner, for å uttrykke et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Disse transgene dyrene oppnås for eksempel ved hjelp av homolog rekombinasjon på embryostamceller, overføre disse stamcellene til embryoer, velge ut kimærene som er påvirket i den reproduktive linjen og dyrke nevnte kimærer. De kan også oppnås ved hjelp av mikroinjeksjon av nakent DNA inn i den befruktede oocytten.

De transgene dyrene ifølge oppfinnelsen kan på denne måten overuttrykke genet som koder for proteinet ifølge oppfinnelsen eller deres homologe gener hvori det er blitt introdusert en mutasjon eller ellers uttrykke et transgen omfattende deler av ens- 1 -genet assosiert med kodende sekvenser i den hensikt å produsere et protein.

Alternativt kan de transgene fuglene ifølge oppfinnelsen lages slik at genet som

koder for polypeptidet med sekvens SEKV. ID NO:2 eller et homologt gen mangler ved inaktivering ved anvendelse av LOXP/CRE rekombineringssystemet (Rohlmann et al., 1996) eller ethvert annet system for ekspresjonsinaktivering av disse genene.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen for syntetisering av rekombinante polypeptider.

Fremgangsmåten for fremstilling av et polypeptid ifølge oppfinnelsen i rekombinant form som i seg selv er inkludert i den foreliggende oppfinnelsen, erkarakterisertved at de transformerte cellene, spesielt cellene eller pattedyrene ifølge oppfinnelsen, dyrkes under betingelser som tillater ekspresjonen av et rekombinant polypeptid som er kodet av nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen og hvor nevnte rekombinante polypeptid gjenvinnes.

De oppnådde, rekombinante polypeptidene som nevnt ovenfor, kan foreligge i både glykosylert og ikke-glykosylert form og kan ha eller ikke ha den naturlige tertiære strukturen.

Sekvensen til de rekombinante polypeptidene kan også være modifisert for å forbedre deres løselighet, spesielt i vandige løsningsmidler.

Slike modifikasjoner er kjent for fagfolk på området, slik som for eksempel delesjon av hydrofobe domener eller substitusjon av hydrofobe aminosyrer med hydrofile aminosyrer.

Disse polypeptidene kan fremstilles ved anvendelse av nukleinsyresekvensene definert ovenfor i henhold til teknikker for fremstilling av rekombinante polypeptider kjent for fagfolk på området. I dette tilfellet plasseres den anvendte nukleinsyren under kontrollen av signaler som tillater dens ekspresjon i en cellulær vert.

Et effektivt system for fremstillingen av et rekombinant polypeptid krever en vektor og en vertscelle ifølge oppfinnelsen.

Disse cellene kan oppnås ved å introdusere en nukleotidsekvens innsatt i en vektor som definert ovenfor inn i en vertscelle og deretter dyrke nevnte celler under betingelser som tillater replikasjonen og/eller ekspresjonen av den transfekterte nukleotidsekvensen.

Fremgangsmåtene anvendt for å rense et rekombinant polypeptid er kjent for fagfolk på området. Det rekombinante polypeptidet kan renses fra cellelysater og ekstrakter eller fra kulturmediumsupernatanten ved hjelp av fremgangsmåter som anvendes individuelt eller i kombinasjon, slik som fraksjonering, kromatografimetoder, immunaffinitetsteknikker ved anvendelse av spesifikke monoklonale eller polyklonale antistoffer osv.

Polypeptidene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også oppnås ved hjelp av kjemisk syntese ved anvendelse av en av de mange kjente formene for peptidsyntese, for eksempel teknikker ved anvendelse av faste faser (se spesielt Stewart et al., 1984) eller teknikker som anvender delvis faste faser, ved hjelp av fragmentkondensering eller ved konvensjonell syntese i løsning.

Polypeptidene oppnådd ved hjelp av kjemisk syntese og som kan omfatte korresponderende unaturlige aminosyrer, er også inkludert i oppfinnelsen.

De mono- eller polyklonale antistoffene eller fragmenter derav, kimære antistoffer eller immunkonjugaterkarakterisert vedat de er i stand til spesifikt å gjenkjenne et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, er en del av oppfinnelsen.

Spesifikke polyklonale antistoffer kan oppnås fra serumet til et dyr immunisert mot polypeptider ifølge oppfinnelsen, spesielt produsert for genetisk rekombinasjon eller ved hjelp av peptidsyntese ifølge de vanlige fremgangsmåtene.

Fordelene ved antistoffer som spesifikt gjenkjenner bestemte polypeptider, varianter eller immunogene fragmenter derav ifølge oppfinnelsen bemerkes derfor spesielt.

De mono- eller polyklonale antistoffene eller fragmenter derav, kimære antistoffer eller immunokonjugaterkarakterisert vedat de er i stand til spesifikt å gjenkjenne polypeptider med sekvens SEKV. ID NO:2 er spesielt foretrukne.

Spesifikke monoklonale antistoffer kan oppnås ifølge de vanlige fremgangsmåtene ved hybridomkulturer beskrevet av Kohler og Milstein (1975).

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er for eksempel kimære antistoffer, humaniserte antistoffer eller Fab- eller F(ab')2-fragmenter. De kan også være i form av immunkonjugater eller merkede antistoffer for å oppnå et detekterbart og/eller kvantifiserbart signal.

Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for å påvise og/eller rense et polypeptid ifølge oppfinnelsenkarakterisert vedat fremgangsmåtene anvender et antistoff ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også rensede polypeptiderkarakterisert vedat de oppnås ved anvendelse av en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen.

Ved siden av deres anvendelse for rensing av polypeptider, kan antistoffene ifølge oppfinnelsen også anvendes for å påvise disse polypeptidene i en biologisk prøve, spesielt de monoklonale antistoffene.

De utgjør på denne måten et middel for den immuncytokjemiske- eller immunhistokjemiske analysen av ekspresjonen av polypeptidene ifølge oppfinnelsen, spesielt polypeptidene med sekvens SEKV. ID NO:2 eller en variant derav, på spesifikke vevsbiter for eksempel ved anvendelse av immunfluorescens, gullmerking og/eller enzymatisk immunkonjugater.

De kan spesifikt gjøre det mulig å påvise ekspresjonen av disse polypeptidene i vevs- eller biologiske prøver.

Mer generelt kan antistoffene ifølge oppfinnelsen fordelaktig anvendes under enhver omstendighet hvor ekspresjonen av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, normalt eller mutert, må observeres.

En fremgangsmåte for å påvise et polypeptid ifølge oppfinnelsen i en biologisk

prøve omfattende trinnet å bringe den biologiske prøven i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen og påvise antigen-antistoffkomplekset som dannes, samt et sett for å utføre en slik fremgangsmåte, er følgelig også et formål ved oppfinnelsen. Et slikt sett inneholder spesielt:

a) et monoklonalt eller polyklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen; b) eventuelt reagenser for å lage et medium egnet for immunreaksjonen; c) reagensene for å påvise antigen-antistoffkomplekset som dannes gjennom

immunreaksjonen.

Disse antistoffene kan oppnås direkte fra humant serum eller kan oppnås fra dyr immunisert med polypeptider ifølge oppfinnelsen og deretter "humaniseres".

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er svært anvendelige for påvisning av nærværet av polypeptidet med SEKV. ID NO:2 og gjør det dermed mulig å bestemme den pluripotente naturen til en ES fuglecelle.

En fremgangsmåte for å påvise den pluripotente naturen til en ES fuglecelle,karakterisert vedat et ekspresjonsprodukt av genet svarende til SEKV. ID NO:l eller mRNA til SEKV. ID NO:l påvises, er også en gjenstand for oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter faktisk sekvensen til ens- 1 -genet som spesifikt uttrykkes i ES fugleceller, spesielt ES-celler fra galliformer, når disse cellene er pluripotente. Fremgangsmåtene for å påvise ekspresjon av et gen, anvendt for dette genet, gjør det derfor mulig å raskt påvise naturen til de studerte cellene.

Spesielt, som beskrevet ovenfor, kan ekspresjonsproduktet av genet påvises ved anvendelse av for eksempel antistoffer ifølge oppfinnelsen ved hjelp av Western blotting eller andre fremgangsmåter som beskrevet tidligere.

Det er også mulig å påvise mRNA med SEKV. ID NO:l ved hjelp av Northern blotting eller ved hjelp av RT-PCR ved anvendelse av en probe eller primer ifølge oppfinnelsen.

Deteksjon av ekspresjonen av dette genet kan også utføres ved anvendelse av en DNA-chip eller en proteinchip som inneholder henholdsvis en nukleinsyre eller et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Slike chips er også gjenstand for oppfinnelsen.

En proteinchip ifølge oppfinnelsen gjør det også mulig å studere interaksjonene mellom polypeptidene ifølge oppfinnelsen og andre proteiner og kjemiske forbindelser og kan følgelig være anvendelige for screening av forbindelser som virker sammen med polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Søkeren har vist at ens-i-genet kun finnes i fugler av galliformfamilien. Følgelig angår også oppfinnelsen en fremgangsmåte for å klassifisere en fugl som tilhører denne galliformordenenkarakterisert vedat nærværet av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, spesielt nærværet av SEKV. ID NO:l, påvises i nevnte fugls gener.

Denne egenskapen at ens- 1 -genet kun finnes i galliformfugler, gjør det mulig å definere en fremgangsmåte for å bestemme nærværet av en prøve som stammer fra en fugl av galliformordenen i en matprøve,karakterisert vedat nærværet av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, spesielt i nærværet av SEKV. ID NO:l, påvises i nevnte prøve.

Nærværet av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i en biologisk prøve eller matprøve eller i en fugls genom, kan påvises på mange måter. Spesielt er det mulig å definere en fremgangsmåte for å påvise og/eller analysere en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i en biologisk prøve eller matprøve,karakterisert vedat den omfatter de følgende

trinn:

a) bringe nevnte prøve i kontakt med et polynukleotid som krevd i ett av kravene l til 2 som er merket; b) påvise og/eller analysere det dannede hybridet mellom nevnte polynukleotid og nukleinsyren i nevnte prøve.

Det er også mulig å påvise og/eller analysere en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i en biologisk prøve eller i en matprøve ved å utføre et trinn med amplifisering av nukleinsyrene i nevnte prøve ved anvendelse av primere valgt fra nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen.

Som demonstrert i eksemplene, uttrykkes nukleinsyren ifølge oppfinnelsen kun i ES fugleceller når cellene er pluripotente av natur. Videre kan ES-cellene modifisert ifølge oppfinnelsen, med et rapportørgen som uttrykkes spesifikt når cellene er pluripotente, og spesielt i 9N2.5-cellene anvendes for screening av forbindelser av interesse.

Spesielt kan de anvendes i en fremgangsmåte for screening av en forbindelse eller et medium som er i stand til å indusere differensiering av pluripotente celler,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: a) oppbevare ES-celler ifølge oppfinnelsen i et kulturmedium som gjør det mulig å opprettholde den pluripotente fenotypen; b) tilsette nevnte forbindelse til nevnte kulturmedium eller erstatte nevnte kulturmedium med mediet som skal testes; c) bestemme differensieringsinduksjonen ved fraværet av ekspresjon av proteinet SEKV. ID NO:2 eller av det eksogene genet.

Denne fremgangsmåten utføres fortrinnsvis med ES-celler modifisert ved å sette inn et rapportgen under kontrollen av promotoren til ens- 1 -genet og fraværet av ekspresjon av nevnte rapportgen påvises. Fortrinnsvis anvendes 9N2.5-celler og fraværet av ekspresjon av (3-galaktosidase påvises.

Det er også mulig å anvende cellene ifølge oppfinnelsen for screening av forbindelser som er i stand til å gjenopprette den pluripotente naturen til differensierte celler ved anvendelse av en fremgangsmåte omfattende de følgende trinn: a) opprettholde differensierte celler i et egnet kulturmedium; b) erstatte nevnte kulturmedium med et medium som gjør det mulig å opprettholde en pluripotent fenotype og som inneholder nevnte

forbindelser som skal testes;

c) bestemme gjenopprettelsen av den pluripotente naturen til nevnte celler ved ekspresjonen av proteinet med SEKV. ID NO:2 eller av det eksogene

genet i nevnte celler.

I denne fremgangsmåten er det igjen fordelaktig å anvende differensierte celler i henhold til oppfinnelsen modifisert ved å sette inn et rapportgen i ens- 1 -genet eller under kontroll av støttegenets promotor. Fortrinnsvis anvendes differensierte 9N2.5-celler som tillater deteksjon av (i-galaktosidaseekspresjon.

Fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, samt medier eller forbindelser oppnådd ved nevnte fremgangsmåter, er også gjenstander ved oppfinnelsen.

En slik forbindelse ifølge oppfinnelsen kan være en forbindelse med en kjemisk struktur (av den lille organiske molekyltypen), et lipid, et sukker, et protein, et peptid, et proteinlipid, proteinsukker, peptidlipid- eller

peptidsukkerhybridforbindelse, eller et protein eller peptid hvortil det er tilført en kjemisk forgrening.

Blant de kjemiske forbindelsene man ser for seg, kan de inneholde en eller flere ringer som kan eller ikke kan være aromatiske, og også flere rester av ethvert slag (spesielt lavere alkyl, det vil si som har mellom 1 og 6 karbonatomer).

Det er ekstremt viktig å påvise genene som er involvert i

pluripotensitetskarakteristikken til ES-celler eller å dra fordel av å ha en markør for nevnte karakteristikk. Som følge av disse cellenes kapasitet til å bidra til morfogenesen av alt vev, gjør faktisk en genetisk modifikasjon av disse cellene det mulig å sikre at den søkte karakteristikken vil bli funnet i alt vevet i det dannede dyret. Introduksjonen av eksogene gener i ews-i-genlokuset under kontroll av ulike promotorer med patiotemporal spesifitet, gjør det videre mulig å oppnå transgene dyr som uttrykker nevnte gener i gitt vev eller ved et gitt utviklingstrinn. Ettersom spesifiteten til ens- 1 -genet er at det kun uttrykkes dersom vertscellen er pluripotent av natur, burde faktisk introduksjonen av en eksogen nukleinsyre i dette lokuset ikke forringe utviklingen av embryoet.

Det er derfor mulig å introdusere gener av terapeutisk interesse, for eksempel som koder for terapeutiske hormoner (hormoner, vekstfaktorer, lymfokiner) for så å være i stand til å fremstille disse proteinene gjennom utviklingen av embryoet. Det kan faktisk være svært fordelaktig å fremstille terapeutiske proteiner i eggene, ettersom skallet vil sikre et sterilt miljø.

Det er også mulig å anvende pluripotente celler ifølge oppfinnelsen til å kolonisere det germinale vevet til dyrene, spesielt fugler, mer foretrukket av galliformordenen, slik at bestemte genetiske karakteristika kan overføres til deres avkom. Dette gjør det mulig å forbedre industrielle kylling-, kalkun-, vaktelraser og lignende på en måte som er spesielt fordelaktig av økonomiske hensyn.

Det er også mulig å anvende forbindelsene valgt fra

a) en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen; b) et polypeptid ifølge oppfinnelsen; c) en vektor ifølge oppfinnelsen; d) en celle ifølge oppfinnelsen; e) et antistoff ifølge oppfinnelsen;

som et medisinsk produkt for å om ønskelig å tillate gjenopprettelse av den

pluripotente naturen til fugleceller eller på den annen side å indusere differensiering av ES-celler.

Den foreliggende oppfinnelsen åpner derfor opp for en bedre karakterisering av den pluripotente naturen til ES-celler ved å tilveiebringe sekvensen av en markør for disse cellene. Det gjenstår imidlertid å bestemme hvorvidt disse genene er en faktor som er essensiell for denne egenskapen. Introduksjonen av ens- 1 -genet inn i differensierte celler, for eksempel med et plasmid under kontrollen av en egnet promotor og studier av den mulige gjenopprettelsen av den pluripotente naturen til cellene, gjør det derfor mulig å svare på dette spørsmålet. Blant egnede promotorer vil en induserbar promotor, for eksempel en promotor induserbar med et sukker, bli valgt og den pluripotente naturen til cellene blir påvist når ekspresjonsinduksjonen av genet på plasmidet stoppes. Det er også mulig å konstruere et plasmid som medfører fjerning av ens-i-genet etter et visst tidsrom (for eksempel ved å erstatte det mellom to loxP-sekvenser og introdusere et andre plasmid kodende for Cre-rekombinase). For å bestemme den pluripotente naturen til celler kan det være fordelaktig å anvende 9N2.5-celler ifølge oppfinnelsen og å lete etter ekspresjon av (5-galaktosidase etter introduksjon av plasmidet som koder for ens- 1.

Dersom det er mulig å bestemme at ens- 1 -genet er en induser for den pluripotente naturen til celler, kan en fremgangsmåte for å gjenopprette nevnte natur (også en gjenstand ved oppfinnelsen) utføreskarakterisert vedat ens-7-genet uttrykkes i differensierte celler. Fremgangsmåtene beskrevet ovenfor kan anvendes for introduksjon av visse forbedringer deri kjent for fagfolk på området.

Dermed gjelder foreliggende oppfinnelse oppsummert for det første en renset eller isolert nukleinsyre som omfatter en nukleinsyresekvens valgt fra gruppen av bestående av: a) SEQ. ID.Nr. 1, eller nukleotidfragment 1409-2878 i SEKV. ID NO: 1; b) nukleotidfragment 3111-3670 i SEKV. ID NO:l; c) nukleinsyresekvens med en prosentvis identitet på i det minste 80 % etter den optimale sammenstillingen med en sekvens som definert i a) eller b), og som er en markør for den pluripotente naturen til embryostamceller fra fugl tilhørende Galliformordenen, og hvori nevnte nukleinsyresekvens har samme biologiske aktivitet og teknisk effekt som SEKV. ID NO:l; d) komplementære sekvens eller RNA-sekvens svarende til en sekvens som definert i a), b) eller c).

Oppfinnelsen gjelder også et isolert polypeptid som omfatter et polypeptid valgt fra: a) et polypeptid svarende til SEKV. ID NO:2; b) et polypeptid som er homologt til et polypeptid som definert i a),

omfattende i det minste 80% sekvensidentitet med nevnte polypeptid i a)

og hvori nevnte polypeptid har samme biologiske aktivitet og teknisk effekt som polypeptidet svarende til SEKV. ID NO:2; c) et biologisk aktivt fragment av et polypeptid som definert i a) eller b). Dernest gjelder oppfinnelsen en klonings- og/eller ekspresjonsvektor som omfatter en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen eller kodende for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Også gjenstand for oppfinnelsen er en vertscelle, forutsatt at vertcellen ikke er en human embryonal stamcelle, der vertscellen er valg fra gruppen bestående av - en vertcelle transformert med en vektor ifølge oppfinnelsen; - en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, hvori nevnte vertscelle er en ES-fuglecelle som også er modifisert ved introdusering av et eksogent gen, hvori nevnte eksogene gen kun og spesifikt uttrykkes når nevnte celle opprettholdes i det pluripotente stadiet; eller - en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen, hvori nevnte vertscelle er en fuglecelle som også er modifisert ved introduksjon av en eksogen nukleinsyre, hvori nevnte eksogene nukleinsyre er integrert inn i nevnte nukleinsyre ifølge oppfinnelsen

I tillegg gjelder oppfinnelsen en differensiert fuglecelle som er utledet fra en ES-celle ifølge oppfinnelsen.

Også gjenstand for oppfinnelsen er et dyr, bortsett fra mennesker, der dyret omfatter en celle ifølge oppfinnelsen.

En anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen som en probe eller primer for påvisning og/eller amplifisering av nukleinsyresekvenser, er også omfattet av oppfinnelsen.

Også omfattet av oppfinnelsen er en anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen som et sens- eller antisensoligonukleotid.

I tillegg gjelder oppfinnelsen en anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et rekombinant polypeptid i henhold til oppfinnelsen.

Oppfinnelsen gjelder også en fremgangsmåte for å oppnå et rekombinant polypeptid, der en celle ifølge oppfinnelsen dyrkes under betingelser som tillater ekspresjonen av nevnte polypeptid og hvori nevnte rekombinante polypeptid i henhold til oppfinnelsen utvinnes.

Også gjenstand for oppfinnelsen er monoklonalt eller polyklonalt antistoff,

som selektivt binder et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å påvise et polypeptid ifølge oppfinnelsen, som omfatter de følgende trinn: a) bringe en biologisk prøve i kontakt med et antistoff ifølge krav 21;

b) påvise antigen-antistoffkomplekset som dannes.

Nok en gjenstand for oppfinnelen er et analysesett med reagenser for å utføre en

fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, som omfatter:

a) et monoklonalt eller polyklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen; b) eventuelt reagenser som utgjør et medium egnet for immunreaksjonen; c) reagensene for påvisning av antigen-antistoffkomplekset som er dannet i

løpet av immunreaksjonen.

Oppfinnelsen gjelder også en fremgangsmåte for å påvise den pluripotente naturen til ES fuglecelle, der nærværet av et ekspresjonsprodukt av genet svarende til SEKV. ID NO:l eller mRNA til SEKV. ID NO:l påvises.

I tillegg gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for å klassifisere en fugl tilhørende galliformordenen, der nærværet av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen påvises i genomet til nevnte fugl.

Nok en gjenstand for oppfinnelen er en fremgangsmåte for å påvise nærværet av en prøve med opprinnelse fra en fugl av galliformordenen i en matprøve, der nærværet av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen påvises i nevnte prøve.

Oppfinnelsen gjelder også en DNA-chip, som inneholder en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen, og en proteinchip, som inneholder et polypeptid eller et antistoff ifølge oppfinnelsen.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å påvise og/eller analysere en nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1 og 2 i en biologisk prøve eller matprøve, som omfatter de følgende trinn: a) bringe nevnte prøve i kontakt med et polynukleotid ifølge oppfinnelsen som er merket; b) påvise og/eller analysere den dannede hybriden mellom nevnte polynukleotid og nukleinsyren i nevnte prøve.

Oppfinnelen vedrører også en fremgangsmåte for å analysere om en forbindelse eller et medium er i stand til å indusere differensiering av pluripotente celler, der fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: a) opprettholde ES-celler ifølge oppfinnelen i et dyrkningsmedium som gjør det mulig å opprettholde den pluripotente fenotypen; b) tilsette nevnte forbindelse til nevnte dyrkningsmedium eller erstatte nevnte dyrkningsmedium med mediet som skal testes; c) påvise induksjonen av differensiering ved fraværet av ekspresjon av proteinet SEKV. ID NO:2 eller av det eksogene genet.

Også omfattet av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å analysere om en forbindelse er i stand til å gjenopprette den pluripotente naturen til differensierte celler, der fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: a) opprettholde differensierte celler utledet fra celler ifølge oppfinnelen i et egnet dyrkningsmedium; b) erstatte nevnte dyrkningsmedium med et medium som gjør det mulig å opprettholde en pluripotent fenotype og som inneholder nevnte forbindelse som skal testes; c) bestemme gjenopprettelsen av den pluripotente naturen til nevnte celler ved hjelp av ekspresjonen av proteinet SEKV. ID NO:2 eller av det

eksogene genet i nevnte celler.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er en forbindelse, som er valgt fra

a) en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen; b) et polypeptid ifølge oppfinnelsen; c) en vektor ifølge oppfinnelsen; d) en celle ifølge oppfinnelsen; e) et antistoff ifølge oppfinnelsen;

som et medisinsk produkt.

Til siste gjelder oppfinnelsen anvendelse av en nukleinsyre svarende til nukleotidene 3111-3670 i SEKV. ID NO:l som en promotor for et gen av interesse for spesifikk ekspresjon av nevnte gen av interesse i pluripotente fugleceller. Eksemplene nedenfor gjør det mulig å illustrere oppfinnelsen og bør ikke betraktes som begrensende for oppfinnelsen.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1: Struktur av vektoren ROSA-(3-geo anvendt for å transformere ES-cellene. Figur 2: Ekspresjonsanalyse av ROSA-p-geo-transkriptet ved hjelp av RT-PCR i 9N2.5-celler ved induksjonstidspunktet eller tidspunktet for differensiering med retinsyre (+RA), DMSO (+DMSO) eller begge samtidig (+RA+DMSO). Kontrollmediet inneholder ingen induserende faktor. Figur 3: Ekspresjonsanalyse av ROSA-P-geo-transkriptet ved hjelp av Northern blotting ved induksjonstidspunktet for differensiering med retinsyre. Blottet hybridiseres med en LacZ-probe. Figur 4: Ekspresjonsanalyse av ROSA-P-geo-transgenet ved å avsløre P-galaktosidaseaktivitet i embryoer som er kimære for 9N2.5-celler. Figur 5: PCR-analyse av nærværet av ROSA-P-geo-transgenet i de kimære embryoene. DNA ble ekstrahert enten fra 9N2.5-celler eller fra et 48 timer gammelt eller 4 dager gammelt kimært embryo som var et resultat av transplantasjon av 9N2.5-celler eller fra et 48 timer gammelt eller 4 dager gammelt kontrollembryo. Figur 6: Deteksjon ved hjelp av Southern blotting av nærværet av ROSA-p-geo-transgenet i det genomiske DNA til 9N2.5-celler etter forøyding med EcoRl (E) eller Dral (D). Figur 7: Deteksjon ved hjelp av Northern blotting av nærværet av et transkript omfattende ROSA-P-geo-transgenet ved hjelp av hybridisering med en LacZ-probe. Figur 8: A. Northern blotting-analyse av ews-Z-genekspresjonen i normal ES kyllingceller og i 9N2.5-celler etter hybridisering med probene Cl, Sl og S2.

B. Strukturen til ens- 1 -genets komplementære DNA (RS = repetert sekvens, ORF = åpen leseramme). Pilene representerer probene Cl, Sl og S2 anvendt for hybridiseringen. Figur 9: "Nothern blotting"-analyse av ews-i-transkriptekspresjonen i normale kyllingembryostamceller, i 9N2.5-celler, i kyllingembryo ved ulike utviklingstrinn og i ulike kyllingorganer. PolyA+ RNA isolert fra det totale RNA ble hybridisert på blottet med probene Cl eller Sl eller med en kontroll GAPDH-probe. Figur 10: Analyse av e/w-l-transkriptekspresjonen i kyllingembryo ved anvendelse av in situ hybridisering. Figur 11: PCR-amplifisering utført på det genomiske DNA til ulike fuglearter med ensl-primer Sl (sekv.id. nr. 14) og ensl-primer ASI (sekv.id. nr. 15). Figur 12: Diagram av organiseringen av det retrovirale LTR av den forventede organiseringen av ens-1-genet og av de to konstruktene som anvendes for å identifisere promotoren. Figur 13: Promotoraktivitet i ulike cellelinjer (S: senspromotor, AS: antisenspromotor). Figur 14: Promotor-2-aktivitet (figur 12) gjennom differensiering av ES-celler.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Konstruksjon av en ES kyllingcelle inneholdende en genetisk markør for pluripotentitet

For å identifisere et gen som spesifikt uttrykkes i pluripotente ES-celler, ble "genfelle"-strategien fulgt. Denne strategien består av å introdusere i ES-cellegenomet et markørgen som omfatter en eksogent kodende sekvens men som mangler dets egen promotor. Den tilfeldige innsettingen av denne markøren i cellens genom vil i visse tilfeller medføre at det eksogene genet blir plassert nedstrøms for en promotor som tilhører det cellulære genomet. I denne konfigurasjonen adopterer det eksogene genet en ekspresjonsregulering som er svært lik, om ikke identisk, til det genet hvori det er skutt inn. Ved å følge ekspresjonen av markørgenet i cellene modifisert på denne måten, tilveiebringes informasjon angående ekspresjonsmønsteret til det cellulære genet som er "merket" på denne måten.

Som "genfange"-system anvendte oppfinnerne det som utnytter vektoren ROSA-Ø-geo beskrevet av Friedrich og Soriano (1991). Dette systemet består av et plasmid som bærer henholdsvis de to genene LacZ og Neo<R>, satt sammen i 5'-3'-rekkefølgen. Genfusjonen koder et enkelt LacZ-Neo-protein som gir både resistens mot G418- og P-galaktosidaseaktivitet til cellene som produserer dem. Plasmidstrukturen er vist i figur 1. Dette plasmidet ble kuttet med Dral-enzymet som induserer linearisering derav. Det lineariserte plasmidet ble introdusert i ES kyllingceller ved hjelp av elektroporeringsteknikken. For dette ble en kultur av ES kyllingceller opprettholdt under betingelser som beskrevet i Pain et al. (1996) anvendt. ES-cellene ble gjenvunnet fra kulturplatene ved kontrollert behandling med pronase. Cellene i suspensjon ble vasket og suspendert i Glasgow-medium ved en konsentrasjon på 5 X IO<6>i 0,8 ml. 10 mikrogram linearisert plasmid ble tilsatt til cellesuspensjonen som ble oppbevart ved 4°C i 10 minutter. Suspensjonen ble deretter utsatt for elektroporeringsbehandling bestående av to elektriske stimuleringer under de følgende betingelser: 280 V, 500 mF i en 1 mm tykk kuvette i en BioRad elektroporator- anordning. Cellene ble deretter oppbevart ved 4°C i 10 minutter før de ble sådd i kultur ifølge fremgangsmåten beskrevet i Pain et al. (1996), som her er inkorporert ved referanse. 36 timer senere ble G418 tilsatt kulturen ved en konsentrasjon på 250fig/ml. Kulturmediet inneholdende G418 ble deretter endret hver dag i 4 dager og deretter annenhver dag. G418-resistente ES-cellekloner var tydelige etter den sjette dagen. Disse ble samlet individuelt mellom den 8. og 10. dagen etter startkulturen. Disse klonene ble sådd ut individuelt i ferskt kulturmedium inneholdende G418 for amplifisering. De ble deretter lagret i flytende nitrogen.

1 de elektroporerte cellene ble ekspresjonen av ROSA-P-geo-markøren analysert ved identifisering av p-galaktosidaseaktivitet in situ i henhold til den følgende fremgangsmåten. Cellene i suspensjonen ble fiksert ved 4°C i en periode på 30 minutter i en blanding basert på PBS inneholdende 1% formaldehyd, 0,2%

glutaraldehyd og 0,02% Nonidet P-40. Cellene ble deretter innkubert ved 37°C i en periode som kan vare i et tidsrom fra 1 til 24 timer, i PBS inneholdende 1 mg/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-D-galaktopuranosid, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCl2og 0,02% Nonidet P-40. Cellen som uttrykker p-galaktosidasemarkøren ble farget blå.

Formålet var å identifisere ES-celler hvori vektoren ROSA-P-geo ble satt inn nedstrøms for en promotor som kun ville fungere i ES-cellene når de var pluripotente. Etter karakterisering av flere kloner, ble en klon kalt 9N2.5 utvalgte, som ga en positiv reaksjon på P-galaktosidaseanalysen kun når cellene ble opprettholdt under dyrkningsbetingelser som sikret opprettholdelsen av cellenes pluripotente natur som beskrevet i Pain et al. (1996). Positiviteten av testen forsvant når 9N2.5-cellene ble introdusert for differensiering (se nedenfor).

9N2.5-klonen ble amplifisert i kultur in vitro og deretter lagret i levedyktig form ved frysing i flytende nitrogen.

Eksempel 2: Karakterisering av 9N2. 5- cellen

9N2.5-cellene ble opprettholdt under dyrkningsbetingelser beskrevet av Pain et al.

(1996) for ES kyllingceller. Under disse betingelsene ble det verifisert at 9N2.5-cellene hadde morfologien, telomeraseaktiviteten og de antigene epitopekarakteristikkene til ES kyllingceller som beskrevet av Pain et al. Cellene var også i stand til å danne embryo legemer som foreldrecellene. Elektroporeringen, seleksjonen i G418 og den påfølgende amplifiseringen av cellene hadde derfor ikke svekket ES-cellekarakteristikaene.

For å analysere ekspresjonen av ROSA-P-geo-markøren i differensierte celler, ble 9N2.5-cellene indusert for differensiering i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i Pain et al. Disse cellene ble dyrket i fraværet av forceller, i fraværet av LIF og cytokiner og i nærværet av enten retinsyre ved en konsentrasjon på 5 X IO"<6>M eller DMSO i en konsentrasjon på 1%. I enkelte kulturer ble retinsyre og DMSO tilsatt simultant. I ES-celledifferensieringsinduserende medium var det mulig å observere tilstedeværelsen av differensierte celler identiske til de som initielt ble beskrevet av Pain et al. (1996) under de samme betingelsene.

Etter 4 dagers dyrking i differensieringsmediet, cellene fullstendig negative for P-galaktosidaseaktivitetsananlysen. For å bekrefte mangelen på ekspresjon av ROSA-P-geo-transgenet ble ekspresjonen fulgt, hovedsakelig ved å søke etter LacZ mRNA ved hjelp av RT-PCR-teknikken. For dette formålet ble primerne SEKV. ID NO:3 og SEKV. ID NO:4 anvendt: Som vist i figur 2, endres ikke mengden RNA produsert av ROSA-P-geo-transgenet i løpet av 5 dagers dyrking av cellene i kulturmediet som opprettholder pluripotensiteten (ES-medium). På den annen side synker mengden av ROSA-P-geo mRNA svært etter 4 dagers dyrking i differensieringskulturmediet inneholdende enten retinsyre alene eller DMSO eller retinsyre og DMSO. For å bekrefte dette, ble ROSA-P-geo mRNA også analysert ved hjelp av Northern blottingsteknikken ved anvendelse av en merket probe spesifikk for LacZ-sekvensen. Som vist på figur 3, var LacZ mRNA så å si udetekterbare etter 2 dagers dyrking i nærværet av

retinsyre, mens ekspresjonen opprettholdes i kulturmediet som mangler retinsyre.

Konklusjon

De utvalgte 9N2.5-cellene uttrykte ROSA-p-geo-transgenet når ble opprettholdt i den pluripotente tilstanden. Ekspresjon av transgenet opphører svært raskt etter induksjon av differensiering av disse cellene i kultur.

Eksempel 3: Ekspresjonsanalyse av ROSA- P- geo- transgenet i 9N2. 5- celler in vivo For å analysere utviklingspotensialet til 9N2.5-cellene og ekspresjonen av ROSA-P-geo-transgenet i et embryo in vivo, ble 9N2.5-cellene transplantert inn i kyllingembryoer ved stadium X ifølge Eyal-Giladi og Kochav-skalaen (1976) (E-G & K-skala), ifølge protokollen beskrevet av Pain et al. (1996). Nærværet av etterkommere av de injiserte cellene ble undersøkt i embryoene ved ulike utviklingstrinn etter transplantering ved anvendelse av P-galaktosidaseanalysen. Som vist i figur 4, ble aggregater av celler positive for P-galaktosidase påvist i epiblasten av embryoer som hadde nådd stadium XIII i de injiserte embryoene. Disse positive cellene ble kun identifisert i epiblasten av zona pellucida. Senere i utviklingen, ved gastrulasjonsstadiet, stadium 5 ifølge Hamburger og Hamilton (H&H) -skalaen, ble positive celler kun funnet i den primitive streken og den ekstraembryonale germinale halvmånen. I den primitive streken ble cellene identifisert i et fåtall aggregater som for det meste var lokalisert i Hensen's knute. Ved stadium 13 (H&H-skala) ble positive celler kun funnet i den rhomboide sinus som svarer til den neurale platen som fortsatt er åpen i haledelen av embryoet. Senere i embryo utviklingen ble positive celler kun funnet i form av svært sjeldne isolerte celler i noe vev med opprinnelse fra nerveceller og også i gonadeforløperstadiet.

For å verifisere hvorvidt etterkommere av 9N2.5-cellene faktisk hadde kolonisert et

embryos senere vey^i antall, til tross for P-galaktosidasereaksjonens negative natur, ble nærværet av ROSA-P-geo-transgenet undersøkt ved hjelp av PCR DNA

ekstrahert fra hele 2 dager gamle eller 4 dager gamle embryoer. Som vist i figur 5, kunne et bånd karakteristisk for ROSA-p-geo-transgenet detekteres, hvilket viste at cellene som var etterkommere av de transplanterte 9N2.5-cellene var tilstede i det minste i 4 dager etter transplantasjonen.

Noen embryoer som var injisert med 9N2.5-celler ble ferdig utviklet og ga opphav til to kyllinger. Et søk etter sekvensene til ROSA-P-geo-transgenet ble gjennomført på DNA isolert fra ulike vev ved anvendelse av PCR-teknikken. I de to kyllingene som ble analysert, ble nærværet av transgenet påvist på denne måten i huden, i kråsen og i leveren. Ikke alle disse vevene utøvde P-galaktosidaseaktivitet, hvilket viser at transgenet var tilstede i differensierte celler utledet fra de transplanterte 9N2.5-cellene.

Konklusjon

9N2.5-cellene er derfor i stand til å kolonisere et vertsembryo og utvikles deri. Ekspresjonen av ROSA-P-geo-transgenet forblir imidlertid begrenset til cellen svært tidlig etter transplanteringen inn i embryo, og også til sjeldne celler tilstede i noen få vev slik som gonadene eller nervesystemet. Med observasjonen gjort på 9N2.5-cellene i kultur, er det sannsynlig å anta at ekspresjonen av ROSA-P-geo-transgenet i cellene in vivo er begrenset til cellene som ennå ikke har begynt å differensiere.

Alle disse dataene oppnådd in vitro og in vivo fra 9N2.5-cellene, medførte antagelsen om at ROSA-P-geo-transgenet er satt inn i et lokus i cellenes genom hvis transkripsjonsaktivitet er spesifikk for ES-celler i det pluripotente stadiet.

Eksempel 4: Proliferering av 9N2. 5- cellene in vivo

For å analysere hvorvidt 9N2.5-cellene var i stand til å proliferere i visse deler av embryoet, ble det tatt prøver av to injiserte embryoer etter innkubering i 7 dager. Embryoene ble vilkårlig kuttet opp i 3 deler, hode, midtdelen inkludert øvre forløpere til lemmer og halen inkludert de nedre forløperne til lemmer. Disse delene ble løst opp i pronase og cellesuspensjonen ble sådd ut i kultur i henhold til fremgangsmåten for dyrking beskrevet av Pain et al. (1996). Seleksjon med G418 ved 250 u.g/ml ble utført i 6 dager. Noen få loki med resistente celler trådte frem i alle kulturene, men frekvensen til disse loki var mye høyere i kulturene som var sådd ut fra de bakre delene av embryo. De G418-resistente cellene utledet fra denne kulturen ble dyrket igjen for amplifisering i 7 dager etter den initielle utsåingen. Noen av disse parallelle kulturene testet positivt for ekspresjonen av P-galaktosidaseaktiviteten. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å opprettholde, amplifisere og til og med fryse i levende form celler som er positive for p-galaktosidase og G418-resistente, og som har en morfologi identisk med den til de injiserte 9N2.5-cellene for en av de to testede embryoene. Cellene utledet fra det andre embryoet prolifererte kun sakte og kunne ikke amplifiseres tilstrekkelig selv om det var positivt for p-galaktosidaseaktivitet.

Konklusjon

Disse resultatene viser derfor at enkelte 9N2.5-celler er i stand til å opprettholde seg selv i ES-celleformen i visse regioner av embryoet. Disse cellene svarer sannsynligvis til de sjeldne P-galaktosidasepositive cellene identifisert på de delene av embryoene som var injisert med 9N2.5-cellene (se ovenfor). Med hensyn til deres lokalisering i de nedre delene av embryoet, kan det være mulig at enkelte av cellene som opprettholder 9N2.5-cellenes karakteristika in vivo svarer til EG-cellene som beskrevet i mus og i mennesker (Matsui et al. 1992, Shamblott et al. 1998). EG-celler er germinale forløperceller som har pluripotente egenskaper og cytologiske karakteristika som er svært nær de til ES-cellene.

Eksempel 5: Anvendelse av 9N2. 5- cellene for analysering av forbindelser 9N2.5-cellene uttrykker sterkt P-galaktosidase når de er i en udifferensiert tilstand. Denne ekspresjonen tapes når differensieringen induseres. Denne egenskapen kan utnyttes for å teste ulike differensieringsinduserende eller -promotorende molekyler eller for å teste ikke-induserende molekyler. 9N2.5-cellene kan følgelig anvendes som en teststøtte for identifisering av prøver med serum egnet for dyrking av ES-celler eller for differensiering derav. For dette formålet ble cellene sådd ut i et medium identisk med det anvendt for å opprettholde foreldrecellene. I dette mediet ble referanseserumet erstattet med de ulike sera som skulle testes, eventuelt ved ulike konsentrasjoner. Utsåingene ble utført ved svært lav tetthet (2 X IO4 celler pr 35 mm plate) og cellene ble dyrket i 4 dager. Cellene ble deretter fiksert og farget for å påvise p-galaktosidaseaktivitet og antallet positive loki ble beregnet. Antallet positive loki er direkte relatert til serumets evne til å opprettholde selvfornyelsen av ES-cellene. Dette eksempelet kan utvides for å teste ulike naturlige eller syntetiske forbindelser.

Konklusjon

9N2.5-cellene kan anvendes for å analysere forbindelser basert på deres evne til å indusere selvfornyelse eller differensiering av ES-celler i kultur.

Eksempel 6: Identifisering av integreringslokus til ROSA- p- geo- transgenet i 9N2. 5-cellene

I en første tilnærming mot identifisering av integreringslokuset til ROSA-P-geo-transgenet i 9N2.5-cellene, ble det genomiske DNA til 9N2.5-cellene analysert ved hjelp av Southern blottingsteknikken. DNA fra 9N2.5-cellen ble fordøyd med

.EcoRI-restriksjonsenzymet eller med Dral-enzymet som hver kun kutter ROSA-P-

geo-transgenet ved ett unikt sete. Etter elektroforetisk migrering med fordøyd DNA, ble filtrene hybridisert med en probe spesifikk for LacZ-fragmentet. Som vist i figur 6, ble ett enkelt bånd identifisert under disse betingelsene i hver av de utførte fordøyingene. Det ble ikke identifisert noe bånd i DNA til normale kylling ES-celler som ikke inneholdt ROSA-P-geo-transgenet. Disse resultatene viser at en enkelt kopi av ROSA-p-geo-transgenet er integrert i 9N2.5-cellene.

For det andre ble størrelsen til det transkriberte mRNA fra transgenet analysert. RNA fra 9N2.5-celler ble analysert ved hjelp av Northern blotting med en LacZ-probe. Som vist i figur 7, ble ett enkelt transkript på 4,7 kb påvist. Dette transkriptet er ikke tilstede i RNA fra normale ES-celler. Gitt den forventede lengden til sekvensen som burde være transkribert fra ROSA-P-geo-transgenet, nemlig 3,9 kb, må det antas at det påviste transkriptet i 9N2.5-cellene inneholder tilnærmingsvis 0,8 kb av sekvensene utledet fra det cellulære genet som transgenet var satt inn i. Disse cellulære sekvensene kan være lokalisert på mRNA enten i 5'-posisjonen eller i 3'-posisjonen eller være fordelt på begge sidene av den transkriberte sekvensen fra ROSA-P-geo-transgenet. For å lete etter disse i 5'-regionen, ble 5'-"RACE"-teknikken ved anvendelse av Marathon- settet fra firmaet Clontech anvendt.

En komplementær DNA-tråd ble syntetisert fra 9N2.5-celle RNA ved anvendelse av en primer spesifikk for LacZ-regionen, en primer for sekvensen SEKV. ID NO:5.

Etter syntese av den andre tråden komplementær til den første tråden, ble det dobbelttrådede komplementære DNA ligert til linkeren tilveiebrakt i Marathon-settet, hvis sekvens er SEKV. ID NO:6. Den totale fuserte sekvensen ble deretter amplifisert ved hjelp av PCR-teknikken ved anvendelse av primerne SEKV. ID NO:7 og SEKV. ID NO:8.

Amplifiseringen ble utført på en Perkin Eimer 2400-maskin under de følgende betingelser: 94°C i 30 sekunder, deretter 5 sykluser ved 94°C i 5 sekunder hver, deretter 4 minutter ved 72°C, deretter 5 sykluser ved 94°C i 5 sekunder hver, deretter 4 minutter ved 70°C, deretter 25 sykluser ved 94°C i 5 sekunder hver, deretter 4 minutter ved 68°C. Et 400 basepar langt amplifiseringsprodukt ble identifisert. Dette fragmentet, kalt Fl, ble klonet inn i et plasmid for å så bli amplifisert og deretter ble dets eksakte sekvens bestemt. Vi undersøkte deretter sekvensen lokalisert nedstrøms for Fl-sekvensen på mRNA transkribert i ES-cellene ved anvendelse av RT-PCR-teknikken. For dette formålet ble RNA fta normale ES-celler anvendt som en matrise for å syntetisere et komplementært DNA ved priming ved anvendelse av en primer P3 med sekvens SEKV. ID NO:9.

Det enkelttrådede komplementære DNA ble deretter amplifisert ved hjelp av PCR ved anvendelse av primerne SEKV. ID NO: 10 som svarer til 5'-sekvensen til fragmentet initielt amplifisert ved hjelp av 5'-RACE-teknikken og SEKV. ID NO:ll.

Et fragment kalt Cl ble amplifisert på denne måten og deretter klonet inn i et plasmid. Den eksakte sekvensen til Cl ble bestemt (sekv.id. nr. 12).

For å bekrefte at Cl-sekvensen faktisk er i mRNA som også bærer LacZ-sekvensen i 9N2.5-cellene, ble en amplifisering ved hjelp av RT-PCR utført på mRNA utledet fra disse cellene ved anvendelse av de respektive primerne P4 (sekv.id. nr. 13) som er spesifikke for fragmentet Cl og LacZ (sekv.id. nr. 8) som er spesifikt for LacZ-sekvensen.

Et 331 basepar fragment ble identifisert. Størrelsen på dette fragmentet svarer til det forventede som indikerer at Cl-sekvensen og LacZ-sekvensen faktisk er på det samme mRNA. Det ble følgelig bekreftet at Cl-sekvensen må være spesifikk for det cellulære genet som ROSA-p-geo-transgenet er satt inn i. Dette genet ble kalt ens- 1 (embryonisk normalt stamcellegen).

For å bekrefte at ens- 1 -genet faktisk fremstiller et RNA, ble RNA til normale

kylling ES-celler analysert ved hjelp av Nothern blotting-teknikken ved anvendelse av Cl-proben. Som vist i figur 8. A, identifiserer Cl-proben et RNA nær til 4,7 kb i størrelse og også to svært svakt merkede RNA på henholdsvis tilnærmelsesvis 10 kb og 2 kb.

Basert på Cl-sekvensen, ble kloningen av det fullstendige mRNA transkribert fra ens- 1 -genet utført.

For dette formålet ble et cDNA-bibliotek konstruert fra polyadenylert RNA isolert fra kylling ES-celler analysert med prober fremstilt fra fragment Cl.

Et 4,2 kpb komplementært DNA ble isolert. For å verifisere hvorvidt dette cDNA faktisk representerte mRNA transkribert fra ens- 1 -genet, ble to nukleotidprober fremstilt, henholdsvis Sl og S2, svarende til to forskjellige cDNA-fragmenter lokalisert nedstrøms for Cl-sekvensen. Disse to probene ble anvendt for å identifisere ved hjelp av Northern blotting-teknikken de korresponderende RNA isolert fra normale kylling ES-celler. Som vist i figur 8.A identifiserte disse to probene et RNA svært nær 4,5 kb i størrelse, identisk med det store RNA identifisert tidligere med Cl-proben. Som vist senere, er ekspresjonsmønsteret til dette RNA identifisert med de to probene Sl og S2 identisk med det store RNA identifisert med Cl-proben i normale ES-celler.

Alle disse data angir svært sterkt at Cl-, Sl- og S2-probene gjenkjenner det samme ens- 1 mRNA i normale ES-celler fra kylling.

Ens- 1 mRNA-sekvensen er gitt i SEKV. ID N0:1 og cDNA-strukturen er gitt i figur 8.B. Analyse av denne sekvensen avslører en svært lang leseramme som antageligvis koder for et protein på 490 aminosyrer, hvis sekvens er gitt i SEKV. ID NO:2. Det bør bemerkes at Cl-sekvensen er polymorf og at den oppnådd fra cDNA-klonen og gitt i SEKV. ID NO:l, er litt forskjellig fra den oppnådd tidligere ved hjelp av 5'-RACE (sekv.id. nr. 12).

For å verifisere hvorvidt ews-i-genet faktisk svarer til genet som ROSA-P-geo-transgenet er satt inn i 9N2.5-cellene, blir ekspresjonsmønsteret til ens- 1 -genet gjennom utvikling av kyllingembryo og i løpet av differensieringen av ES-celler fra kylling i kultur analysert ved anvendelse av Northern blotting-teknikken.

Som vist i figur 9, identifiserte Cl-proben og Sl-proben det samme 4,5 kb RNA i RNA-ekstrahert fra normale 48 timers kyllingembryoer. Signalets styrke avtar svært i RNA ekstrahert fra eldre embryoer, slik som 3 dager gamle og 4 dager gamle embryoer. Signalet forsvinner i RNA ekstrahert fra 7 dager gamle eller 8 dager gamle embryoer. Det er null i RNA ekstrahert fra ulike kyllingvev slik som leveren, muskler, kråsen, hjernen, hjertet, øye, ben eller hud.

For å bestemme ekspresjonsmønsteret til ens-i-genet mer presist gjennom det første utviklingsstadiet til kyllingembryoet, ble ens- 1 mRNA undersøkt ved anvendelse av in situ hybridiseringsteknikken på hele embryoet. Resultatene er gitt i figur 10. Et svært sterkt signal ble observert i zona pellucida i stadium X og XIII embryoer (E-G&K-skala). I stadium 2 (H&H-skala) -embryoer ble signalet funnet kun i zona pellucida med sterk dominans i den primitive strek (engelsk: streak) -regionen. Ved stadium 5 (H&H-skala) ble signalet funnet i Hensen's knute og i den rostrokaudale regionen til den primitive streken, og også i svært synlig form i den germinale halvmånen som finnes i den bakre delen på embryoet. Ved mer utviklede stadier av embryonisk utvikling, påvises intet signifikant signal. De samme ekspresjonsmønstrene ble observert med Cl- og Sl-probene.

Konklusjon

Ens- l- genet utøver en ekspresjon som er spesifikk for udifferensierte ES kyllingceller og i svært tidlige stadier av embryogenesen. Ekspresjon av genet blir svært svakt og til og med udetekterbart etter at gastrulasjonen er ferdig.

Ens- 1 -genet utgjør derfor en svært spesifikk markør for udifferensierte embryoniske celler uavhengig av om cellene er tilstede i embryoet eller opprettholdes i dette stadiet i kultur in vitro. Ens- l- genet er også spesifikt for cellene i den germinale halvmånen og derfor for forløpere av kjønnsceller.

Eksempel 7: Konservering av ews- i- genet gjennom evolusjon

For å analysere graden av konservering av ens- 1 -genet gjennom evolusjon, ble en probe spesifikk for ens- 1 -genet fra kylling anvendt for å hybridisere det genomiske DNA fra ulike dyrearter ved anvendelse av Southern blotting-teknikken (ikke vist). PCR-teknikken for nukleinsyresekvensamplifisering mellom to primere spesifikke for ens-i-genet (sekv.id. nr. 14 og SEKV. ID NO: 15) ble anvendt ved å bruke protokollen: 96°C i 3 minutter (96°C 30 s, 62°C 30 s, 72°C 30 s, 10 sykluser), (96°C 30 s, 57°C 30 s, 72°C 30 s, 10 sykluser), (96°C 30 s, 52°C 30 s, 72°C 30 s, 20 sykluser). Resultatene som er vist i figur 11 viser at homologe sekvenser kun finnes i galliformordenen (kylling, vaktel, kalkun, fasan (engelsk: pheasant), rødlegget rapphøne (engelsk: partridge), grå rapphøne). Det er å bemerke at det ikke ble funnet noen homolog for ens- 1 i pattedyr (ikke vist).

Eksempel 8: Identifisering av en transkripsjonspromotorsekvens i ens - 1 - genet, hvis aktivitet er spesifikk for embryostamceller

Ens- 1 -genet ble identifisert som et gen som spesifikt uttrykkes i embryostamceller i kylling.

En promotorregion hvis transkripsjonsaktivitet er spesifikk for udifferensierte ES kyllingceller ble identifisert i e/?s-i-genet. Anvendelsesområdene er betydelige, ettersom dette følgelig tilveiebringer et genetisk verktøy som vil gjøre det mulig å målrette ekspresjonen av et transgen spesifikt i embryoniske stamceller og muligens også i kyllingembryoer i stadier som går forut for gastrulasjon.

Nærværet av repeterte sekvenser ved ews-i-transkriptets ender antyder at disse sekvensene er relatert retrovirale LTR (lange terminale repeterende sekvenser)

-sekvenser. Retrovirale LTR er regionalisert i tre seksjoner, henholdsvis U3, R og

U5 (i 5'-3'-retningen). I det retrovirale genomet, er U3-regionen i stand til å aktivere transkripsjon noen ganger med vevsspesifikk kontroll. I retrovirale budbringer RNA finnes en kopi av R-U5-sekvensene i 5'-posisjonen og en kopi av U3-R-sekvensene finnes i 3'-posisjonen.

Ved hjelp av analogi med strukturen til retrovirale LTR, ble de regioner som muligens svarer til de retrovirale U3-, R- og U5-regionene identifisert i ens- 1-genets budbringer RNA. Sekvensen som er identifisert som repeterende ved de to endene av ens- 1 -transkriptet, svarer til R-regionen og sekvensen ville svare til U3-regionen er lokalisert mellom 3'-enden av den kodende sekvensen for ens-1 og 5'-enden til R (figur 12).

For å teste promotoraktiviteten til R- og U3-R-regionene til ens- l- genet, ble disse regionene klonet i to mulige orienteringer, sens og antisens, oppstrøms for ildflue luciferase rapportgenet for å oppnå henholdsvis vektorene kalt promotor 1 og promotor 2, henholdsvis sens (S) og antisens (AS) (figur 12). Disse konstruktene ble transfektert inn i ulike cellelinjer, inkludert kylling 9N2.5-stamcellene med vektoren pRL-CMV (Promega) inneholdende luciferasegenet til "sea pansy" Renilla under kontrollen av cytomegaloviruspromotoren som en internkontroll for transfeksjonseffektivitet.

Transfeksjon av de ulike vektorene promotor 1 og promotor 2 inn i 9N2.5-cellene og måling av luciferaseaktiviteten standardisert ved anvendelse den interne kontrollen, gjorde det mulig å identifisere transkripsjonsaktivitet for U3-regionen for promotor 2S-vektoren i kyllingembryostamceller (9N2.5-celler), mens R-regionen ikke viste noen signifikant aktivitet (figur 13). Promotoraktiviteten er på den annen side svært lav i de ulike andre cellelinjene som ble testet (Qt6 vaktelfibroblaster (engelsk: quail fibroblasts), QBr vaktelepitelceller eller humane epitelceller). I tillegg ble 2S-promotorvektoren transfektert inn i 9N2.5-embryoniske stamceller indusert for å differensiere ved hjelp av behandling med retinsyre. Måling av luciferaseaktiviteten i cellene ved ulike tidspunkter etter behandling med retinsyre, viste at transkripsjonsaktiviteten til promotoren sank i løpet av embryonisk stamcelledifferensiering mens aktiviteten til kontrollpromotoren (CMV) forble høy (figur 14).

Alle disse resultatene viser at det eksisterer en region som utøver transkripsjonspromotoraktivitet i 3' av den kodende ensl-gensekvensen og at denne transkripsjonsaktiviteten er spesifikk for udifferensierte kyllingembryoniske stamceller.

Ved anvendelse av 5'-RACE-teknikken på 2S-promotorvektoren, er det mulig å bestemme et transkripsjonsinitieringssete på sekvensen til ens- 1 cDNA (sekv.id. nr.

1) og også en sekvens av TATA-promotortypen oppstrøms for dette transkripsjonsinitieringssetet. Promotoren svarer til nukleotidene 3111-3670 i

SEKV. ID NO:l.

DEPONERING AV BIOLOGISK MATERIALE

9N2.5-cellelinjen ble deponert 11. mai 2000 ved "Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (CNCM) [National Collection of Cultures and Microorganismes], 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike i henhold til Budapestkonvensjonen under identifikasjonsnummer 1-2477 og svarende til linjen av kyllingembryoniske stamceller hvori ROSA-P-geo-transgenet linearisert med Dral ble introdusert ved hjelp av elektroporering og som ble isolert etter seleksjon med G418 basert på deres P-galaktosidaseaktivitet som beskrevet i eksempel 1.

Cellene som kan anvendes for å dyrke 9N2.5-cellene (STO musefibroblaster) ble også deponert ved CNCM den 11. mai 2000 under nummeret SH-2477.

Referanser

Buckholz, (1993), Curr. Op. Biotechnology 4, 538.

Carter, (1993), Curr. Op. Biotechnology 3, 533.

Duck et al. (1990), Biotechniques, 9, 142.

Edwards and Aruffo (1993), Curr. Op. Biotechnology 4, 558.

Epstein (1992), Médecine/Sciences, 8, 902.

Etches et al. (1996), Science 76, 1075-1083.

Eyal-Giladi and Kovak (1976), Dev. Biol. 151, 575-585.

Freidrich and Soriano (1991). Genes & Development 5, 1513-1523.

Guatelli et al. (1990), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87: 1874.

Kemler et al. (1981). J. Embryol. Exp. Morph. 64, 45-60.

Kievitis et al. (1991), J. Virol. Methods, 35, 273.

Kohler and Milstein. (1975) Nature 256, 495.

Kwoh et al. (1989), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86, 1173.

Landegren et al. (1988) Science 241, 1077.

Luckow (1993), Curr. Op. Biotechnology 4, 564.

Matsui et al. (1992). Cell 70, 841-847.

Matthews et al. (1988), Anal. Biochem., 169, 1-25.

Miele et al. (1983), J. Mol. Biol., 171, 281.

Neddleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443.

Olins and Lee (1993), Curr. Op. Biotechnology 4: 520.

Pain et al. (1996). Development 122, 2339-2348.

Pain et al. (1999). Cells Tissues Organs 165, 212-219.

Perricaudet et al. (1992). La Recherche 23: 471.

Pearson and Lipman (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 2444

Prowse and Greider (1995). Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92, 4818-4822.

Rohlmann et al. (1996) Nature Biotech. 14: 1562.

Rolfs, A. et al. (1991), Berlin: Springer-Verlag.

Rosner et al. (1990). Nature 354, 686-692.

Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manua. 2<nd>Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.

Segev, (1992), Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New-York, 197-205.

Shamblott et al. (1998). Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95, 13726-13731.

Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math. 2: 482

Solter and Knowles (1978) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 5565-5569.

Stewart and Yound (1984), Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984).

Strickland et al. (1980). Cell 21, 347-355.

Temin, (1986) Retrovirus vectors for gene transfer. In Kucherlapati R., ed. Gene Transfer, New York, Plenum Press, 149-187.

WALKER (1992), NUCLEIC ACIDS RES. 20: 1691.

Claims (39)

1. Renset eller isolert nukleinsyre, karakterisert vedden omfatter en nukleinsyresekvens valgt fra gruppen av bestående av: a) SEQ. ID .Nr. 1, eller nukleotidfragment 1409-2878 i SEKV. ID NO:l; b) nukleotidfragment 3111-3670 i SEKV. ID NO:l; c) nukleinsyresekvens med en prosentvis identitet på i det minste 80 % etter den optimale sammenstillingen med en sekvens som definert i a) eller b), og som er en markør for den pluripotente naturen til embryostamceller fra fugl tilhørende Galliformordenen, og hvori nevnte nukleinsyresekvens har samme biologiske aktivitet og teknisk effekt som SEKV. ID NO:l; d) komplementære sekvens eller RNA-sekvens svarende til en sekvens som definert i a), b) eller c).

2. Renset eller isolert nukleinsyre ifølge krav 1, karakterisert vedat den omfatter eller består av SEKV. ID NO: 1, den komplementære sekvensen eller RNA-sekvensen svarende til en av disse sekvensene.

3. Isolert polypeptid, karakterisert vedat det omfatter et polypeptid valgt fra: a) et polypeptid svarende til SEKV. ID NO:2; b) et polypeptid som er homologt til et polypeptid som definert i a), omfattende i det minste 80 % sekvensidentitet med nevnte polypeptid i a) og hvori nevnte polypeptid har samme biologiske aktivitet og teknisk effekt som polypeptidet svarende til SEKV. ID NO:2; c) et biologisk aktivt fragment av et polypeptid som definert i a) eller b).

4. Polypeptid ifølge krav 3, karakterisert vedat det består av en sekvens valgt fra SEKV. ID NO:2 eller en sekvens med i det minste 80 % sekvensidentitet med denne sekvens etter optimal sammenstilling.

5. Klonings- og/eller ekspresjonsvektor, karakterisert vedå omfatte en nukleinsyre ifølge i ett av kravene 1 til 2 eller kodende for et polypeptid ifølge ett av kravene 3 og 4.

6. Vertscelle, forutsatt at vertcellen ikke er en human embryonal stamcelle,karakterisert vedat den er valg fra gruppen bestående av - en vertcelle transformert med en vektor ifølge krav 5; - en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvori nevnte vertscelle er en ES-fuglecelle som også er modifisert ved introdusering av et eksogent gen, hvori nevnte eksogene gen kun og spesifikt uttrykkes når nevnte celle opprettholdes i det pluripotente stadiet; eller - en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvori nevnte vertscelle er en fuglecelle som også er modifisert ved introduksjon av en eksogen nukleinsyre, hvori nevnte eksogene nukleinsyre er integrert inn i nevnte nukleinsyre ifølge ett av kravene 1 til 2.

7. Celle ifølge krav 6, karakterisert vedat det er en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvori nevnte vertscelle er en ES-fuglecelle som også er modifisert ved introdusering av et eksogent gen, hvori nevnte eksogene gen kun og spesifikt uttrykkes når nevnte celle opprettholdes i det pluripotente stadiet, og hvori nevnte eksogene gen er et rapportgen.

8. Celle ifølge krav 7, karakterisert vedat nevnte rapportgen er valgt fra lacZ, GFP, luciferase, ROSA-P-geo og et gen for antibiotikaresistens.

9. Celle ifølge krav 6, karakterisert vedat det er en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst av kravene 1 og 2, hvori nevnte vertscelle er en fuglecelle som også er modifisert ved introduksjon av en eksogen nukleinsyre, hvori nevnte eksogene nukleinsyre er integrert inn i nevnte nukleinsyre ifølge ett av kravene 1 til 2, og nevnte eksogene nukleinsyre er et gen av terapeutisk interesse, eventuelt med en spatiotemporal promotor foran og/eller med en terminatorsekvens.

10. Celle ifølge krav 6, karakterisert vedat det er en vertcelle inneholdende en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvori nevnte vertscelle er en fuglecelle som også er modifisert ved introduksjon av en eksogen nukleinsyre, hvori nevnte eksogene nukleinsyre er integrert inn i nevnte nukleinsyre ifølge ett av kravene 1 til 2, og nevnte eksogene nukleinsyre er en genetisk markør.

11. Celle ifølge ethvert av kravene 6 til 10, karakterisert vedat nevnte fugl tilhører Galliformordenen.

12. Celle ifølge krav 11, karakterisert vedat nevnte fugl er en kylling eller en vaktel.

13. Celle ifølge et hvilket som helst av kravene 11 og 12, karakterisert vedat nevnte rapportgen er integrert under kontrollen av promotoren til eAw-i-genet kodet av sekvensene svarende til nukleotidene 3111-3670 i SEKV. ID NO:l.

14. Celle ifølge et hvilket som helst av kravene 12 og 13, karakterisert vedat det er en 9N2.5-celle deponert ved Collection Nationale [lacuna] des Microorganismes den 11. mai 2000 under identifikasjonsnummer 1-2477.

15. Differensiert fuglecelle, karakterisert vedat den er utledet fra en ES-celle ifølge ethvert av kravene 6 til 14.

16. Dyr, bortsett fra mennesker, karakterisert vedat det omfatter en celle ifølge ethvert av kravene 6 til 15.

17. Anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge ethvert av kravene 1 til 2 som en probe eller primer for påvisning og/eller amplifisering av nukleinsyresekvenser.

18. Anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge ethvert av kravene 1 til 2 som et sens- eller antisensoligonukleotid.

19. Anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge ethvert av kravene 1 til 2 for fremstilling av et rekombinant polypeptid i henhold til kravene 3 og 4.

20. Fremgangsmåte for å oppnå et rekombinant polypeptid,karakterisert vedat en celle ifølge krav 6 dyrkes under betingelser som tillater ekspresjonen av nevnte polypeptid og hvori nevnte rekombinante polypeptid i henhold til kravene 3 og 4 utvinnes.

21. Monoklonalt eller polyklonalt antistoff, karakterisert vedat det selektivt binder et polypeptid ifølge ethvert av kravene 3 og 4.

22. Fremgangsmåte for å påvise et polypeptid ifølge ethvert av kravene 3 og 4,karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: a) bringe en biologisk prøve i kontakt med et antistoff ifølge krav 21; b) påvise antigen-antistoffkomplekset som dannes.

23. Analysesett med reagenser for å utføre en fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat det omfatter: a) et monoklonalt eller polyklonalt antistoff ifølge krav 21; b) eventuelt reagenser som utgjør et medium egnet for immunreaksjonen; c) reagensene for påvisning av antigen-antistoffkomplekset som er dannet i løpet av immunreaksjonen.

24. Fremgangsmåte for å påvise den pluripotente naturen til ES fuglecelle,karakterisert vedat nærværet av et ekspresjonsprodukt av genet svarende til SEKV. ID NO:l eller mRNA til SEKV. ID NO:l påvises.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert vedat mRNA til SEKV. ID NO:l påvises ved hjelp av Northern blotting eller ved hjelp av RT-PCR ved anvendelse av en probe eller primere ved anvendelsen ifølge krav 19.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert vedat nærværet av proteinet SEKV. ID NO:2 påvises, for eksempel ved anvendelse av et antistoff ifølge krav 21.

27. Fremgangsmåte for å klassifisere en fugl tilhørende galliformordenen,karakterisert vedat nærværet av en nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1 til 2 påvises i genomet til nevnte fugl.

28. Fremgangsmåte for å påvise nærværet av en prøve med opprinnelse fra en fugl av galliformordenen i en matprøve, karakterisert vedat nærværet av en nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1 til 2 påvises i nevnte prøve.

29. DNA-chip, karakterisert vedat den inneholder en nukleinsyresekvens ifølge ethvert av kravene 1 og 2.

30. Proteinchip, karakterisert vedat den inneholder et polypeptid ifølge ethvert av kravene 3 og 4 eller et antistoff ifølge krav 21.

31. Fremgangsmåte for å påvise og/eller analysere en nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1 og 2 i en biologisk prøve eller matprøve, karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: a) bringe nevnte prøve i kontakt med et polynukleotid ifølge ethvert av kravene 1 til 2 som er merket; b) påvise og/eller analysere den dannede hybriden mellom nevnte polynukleotid og nukleinsyren i nevnte prøve.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert vedat den omfatter et trinn for amplifisering av nukleinsyrene i nevnte prøve ved anvendelse av primere valgt fra nukleinsyrene ifølge ethvert av kravene 1 og 2.

33. Fremgangsmåte for å analysere om en forbindelse eller et medium er i stand til å indusere differensiering av pluripotente celler, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: a) opprettholde ES-celler ifølge ethvert av kravene 6 til 14 i et dyrkningsmedium som gjør det mulig å opprettholde den pluripotente fenotypen; b) tilsette nevnte forbindelse til nevnte dyrkningsmedium eller erstatte nevnte dyrkningsmedium med mediet som skal testes; c) påvise induksjonen av differensiering ved fraværet av ekspresjon av proteinet SEKV. ID NO:2 eller av det eksogene genet.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33 karakterisert vedat den utføres med celler ifølge ethvert av kravene 8 til 17.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 33 eller 34, karakterisert vedat 9N2.5-celler anvendes og ved at fraværet av galaktosidaseekspresjon påvises.

36. Fremgangsmåte for å analysere om en forbindelse er i stand til å gjenopprette den pluripotente naturen til differensierte celler, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: a) opprettholde differensierte celler utledet fra celler ifølge ethvert av kravene 6 til 14 i et egnet dyrkningsmedium; b) erstatte nevnte dyrkningsmedium med et medium som gjør det mulig å opprettholde en pluripotent fenotype og som inneholder nevnte forbindelse som skal testes; c) bestemme gjenopprettelsen av den pluripotente naturen til nevnte celler ved hjelp av ekspresjonen av proteinet SEKV. ID NO:2 eller av det eksogene genet i nevnte celler.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert vedat differensierte 9N2.5-celler anvendes og ved at p-galaktosidaseekspresjon påvises.

38. Forbindelse, karakterisert vedat den er valgt fra a) en nukleinsyre ifølge ethvert av kravene 1 til 2; b) et polypeptid ifølge ethvert av kravene 3 og 4; c) en vektor ifølge krav 5; d) en celle ifølge ethvert av kravene 6 til 14; e) et antistoff ifølge krav 21; som et medisinsk produkt.

39. Anvendelse av en nukleinsyre svarende til nukleotidene 3111-3670 i SEKV. ID NO:l som en promotor for et gen av interesse for spesifikk ekspresjon av nevnte gen av interesse i pluripotente fugleceller.