KR101825697B1

KR101825697B1 - 감소된 양의 스쿠알렌을 포함하는 인플루엔자 백신

Info

Publication number: KR101825697B1
Application number: KR1020117020864A
Authority: KR
Inventors: 마리오 콘토르니; 데렉 오하간; 니콜라 그로스
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2009-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2018-02-05
Also published as: EA023662B1; AU2016203830B2; ES2608841T3; US11246921B2; CA2751379C; EA201171033A1; AU2016203830A1; JP5642712B2; US20160235835A1; JP2012517417A; CN102307590A; DK2396032T3; AU2018202029A1; PL2396032T3; EA201500910A1; US9278126B2; EP3173097A2; EP3173097A3; KR20110117701A; JP2014133763A

Abstract

인플루엔자 백신은 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌을 포함한다. 또한, 그들은 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하의 오일 액적을 갖는 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤마글루티닌 농도는 주 당 ≥12 ㎍/㎖이다. 일부 구체예에서, 스쿠알렌 농도는 ≤19 ㎎/㎖이다. 일부 구체예에서, 백신은 무-수은이다. 일부 구체예에서, 백신은 0.2-0.3 ㎖ 사이의 단위 투여량 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 스쿠알렌 농도는 9.75 ㎎/㎖ 또는 4.88 ㎎/㎖이다. 일부 구체예에서, 백신은 두 가지 인플루엔자 A 바이러스 및 두 가지 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 항원을 포함한다.

Description

감소된 양의 스쿠알렌을 포함하는 인플루엔자 백신{INFLUENZA VACCINES WITH REDUCED AMOUNTS OF SQUALENE}

본 발명은 2009년 2월 10일에 출원된 미합중국 가특허출원 61/207,385의 우선권을 주장하고, 상기 출원의 모든 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 백신, 특히, 시판되는 백신에 비하여 감소된 양의 스쿠알렌을 포함하는 백신의 기술 분야이다.

인플루엔자 백신은 일반적으로 PREPANDRIX™ 제품(GlaxoSmithKline) 및 FLUAD™ 제품(Novartis Vaccines)을 제외하고 아주번트를 포함하지 않는다.

1가 전-유행성 계절 PREPANDRIX™ 백신에서의 아주번트는 수중유 에멀젼이다. 항원 및 에멀젼 아주번트는 1:1 부피비로 사용하는 시점에 혼합하기 위하여 별개의 10-투여량(dose) 바이알들로 공급된다. 제품 데이터시트는 각각의 투여량이 0.5 ㎖의 부피를 갖고, 3.75 ㎍의 HA를 10.68 ㎎의 스쿠알렌 및 4.85 ㎎의 폴리소르베이트 80과 함께 함유하는 것을 보여준다.

3가 계절 FLUAD™ 백신에서의 아주번트는 수중유 에멀젼이다. 항원 및 에멀젼 아주번트는 미리 채워진 시린지로 미리-혼합된 형태로 공급된다. 제품 데이터시트는 각각의 투여량이 0.5 ㎖의 부피를 갖고, 주(株) 당 15 ㎍의 헤마글루티닌(HA)을 9.75 ㎎의 스쿠알렌 및 1.175 ㎎의 폴리소르베이트 80과 함께 함유하는 것을 보여준다. 참고문헌 1에서 개시된 바와 같이, 백신은 최종 용액에 에멀젼 및 항원 모두를 1× 농도로 제공하기 위하여 2× 항원 용액과 2× 에멀젼을 1:1의 용적 측정비로 혼합하여 만들어진다. 이 1:1 혼합비는 나아가 참고문헌 75의 챕터 10에서 더 설명한다. 이 혼합의 변형이 참고문헌 2에서 개시된다.

FLUAD™ 제품과 비교하여, 참고문헌 3은 더 낮은 양의 HA(3×5 ㎍ HA/투여량) 및 더 낮은 양의 스쿠알렌(5.35 ㎎/투여량)을 갖는 3가 인플루엔자 백신을 개시한다. 백신은 티오머살 방부제를 포함하고, 0.5 ㎖의 투여량으로서 인간에게 투여되었다.

아주번트화 인플루엔자 백신, 및 특히 계절 인플루엔자 백신의 더 개선된 조제물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

한 구체예에서, 본 발명은: (i) 헤마글루티닌 농도가 주 당 ≥12 ㎍/㎖인, 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하(submicron) 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공하고, 상기 스쿠알렌 농도는 ≤19 ㎎/㎖이다.

다른 구체예에서, 본 발명은: (i) 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하는 무-수은 인플루엔자 바이러스 백신을 제공하고, 상기 스쿠알렌 농도는 ≤19 ㎎/㎖이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 0.2-0.3 ㎖ 사이의 단위 투여량 부피를 갖는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공하고, 여기서 백신은: (i) 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하고, 상기 스쿠알렌 농도는 ≤19 ㎎/㎖이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 (i) 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공하고, 상기 스쿠알렌 농도는 9.75 ㎎/㎖ 또는 4.88 ㎎/㎖이다.

다른 구체예에서, 본 발명은: (i) 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하고, 0.2-0.3 ㎖ 사이의 단위 투여량 부피를 갖는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공하고, 상기 스쿠알렌 농도는 19.5 ㎎/㎖, 9.75 ㎎/㎖ 또는 4.88 ㎎/㎖이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 (i) 적어도 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신을 제공하고, 상기 스쿠알렌 농도는 ≤19 ㎎/㎖이다.

백신 제조

인플루엔자 바이러스 백신의 다양한 형태가 현재 사용가능하고, 백신은 보통 살아있는 바이러스 또는 불활성화 바이러스 중 어느 하나에 기초한다. 불활성화 백신은 전체 비리온, 분해 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기초할 수 있다. 또한, 인플루엔자 항원은 비로솜의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 이들 백신의 어떤 형태로도 사용될 수 있지만, 전형적으로 불활성화 백신으로 사용될 것이다.

불활성화 바이러스가 사용될 때, 백신은 전체 비리온, 분해 비리온, 또는 정제된 표면 항원을 포함할 수 있다(헤마글루티닌을 포함하고, 보통 뉴라미다아제도 포함함). 바이러스를 불활성화시키기 위한 화학적 수단은 하기 제제: 세제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60), 2원체 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이들의 조합 중 한 가지 이상의 유효량으로 처리하는 것을 포함한다. 예컨대 UV 광선 또는 감마선 조사와 같은 바이러스 불활성화의 비-화학적 방법이 당업계에 알려져 있다.

비리온은 다양한 방법에 의해 바이러스-함유 유체로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 정제 과정은 비리온을 파괴하기 위하여 세제를 포함하는 선형 수크로오스 기울기 용액을 사용한 띠 원심분리를 포함할 수 있다. 이후 항원은 선택적인 희석 후에 투석여과에 의해 정제될 수 있다.

분해(split) 비리온은 'Tween-에테르' 분해 과정을 포함하는 서브비리온 표본을 생산하기 위해 세제(예컨대 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 디옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, 트리톤 X-100, 트리톤 N1O1, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 테르기톨 NP9, 등)로 정제된 비리온을 처리하는 것에 의해 얻을 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 분해하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 예컨대 참고문헌 4-9, 등을 참조하라. 바이러스를 분해하는 것은 전형적으로 분해제(splitting agent)의 붕괴 농도에서 감염성이건 비-감염성이건 전체 바이러스를 붕괴 또는 분해하는 것에 의해 수행된다. 붕괴는 바이러스의 완전성을 변화시키는, 바이러스 단백질의 전부 또는 일부 가용화를 야기한다. 바람직한 분해제는 비-이온성 및 이온성(예컨대 양이온성) 계면활성제, 예컨대 알킬글루코사이드, 알킬티오글루코사이드, 아실 당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그, 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타브론, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 {예컨대 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101과 같은 트리톤 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리에틸렌 에스테르, 등이다. 하나의 유용한 분해 과정은 소듐 디옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속적인 효과를 사용하고, 분해는 초기 비리온 정제(예컨대 수크로오스 밀도 기울기 용액에서) 동안 일어날 수 있다. 따라서 분해 과정은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수득한 비리온의 농축(예컨대, 흡착과 같은 흡착 방법을 사용하여), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 기울기 원심분리 단계에서 분해제를 사용한 비리온의 분해(예컨대 소듐 디옥시콜레이트와 같은 분해제를 함유하는 수크로오스 기울기를 사용하여), 및 원하지 않는 물질을 제거하기 위한 이후의 여과를 포함할 수 있다. 분해 비리온은 소듐 포스페이트-버퍼 등장 염화나트륨 용액에서 유용하게 재현탁시킬 수 있다. PREPANDRIX™, BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품이 분해 백신이다.

정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 헤마글루티닌, 그리고 전형적으로 또한 뉴라미다아제를 포함한다. 정제된 형태로 이들 단백질을 제조하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, FLUAD™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품이 예시이다.

불활성화 인플루엔자 항원의 다른 형태는 INFLEXAL V™ 및 INVA VAC™ 제품에서와 같은 비로솜[10](무핵산 바이러스-유사 리포좀 입자)이다. 비로솜은 세제를 사용한 인플루엔자 바이러스의 가용화에 이은 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 당단백질을 함유하는 막의 재구성에 의해 제조될 수 있다. 비로솜을 제조하는 대안적인 방법은 리포좀의 막에 바이러스 단백질을 갖는 리포좀을 제공하기 위하여 인지질의 과다량에 바이러스 막 당단백질을 첨가하는 것을 포함한다.

주 선별

본 발명의 백신은 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌을 포함한다. 다른 주는 전형적으로 분리되어 자랄 것이고, 이후 바이러스가 회수되고 항원이 제조된 다음에 혼합될 것이다. 따라서 본 발명의 과정은 하나 이상의 인플루엔자 주로부터 나온 항원을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용한 주는 야생형 바이러스에서 발견되는 천연 HA 또는 변형된 HA를 가질 수 있다. 예를 들면, 조류 종에서 바이러스가 고병원성이도록 야기하는 경쟁자(예컨대 HA1/HA2 절단 부위 주변의 고-염기성 영역)를 제거하기 위해 HA를 변형시키는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 사용된 인플루엔자 B 바이러스의 헤마글루티닌은 아미노산 197에서 글루코실화 부위를 제공하는 Asn을 갖는 것이 바람직하다[11].

본 발명에서 사용한 인플루엔자 바이러스는 외피잡종(reassortant) 주일 수 있고, 역유전학적 기술에 의해 얻은 것일 수 있다. 역유전학적 기술[예컨대 12-16]은 플라스미드 또는 다른 인공적 벡터를 사용하여 시험관 내에서 원하는 게놈 단편을 갖는 인플루엔자 바이러스가 제조되는 것을 허용한다. 전형적으로, 그것은 (a) 예컨대 polⅠ 프로모터 또는 박테리오파지 RNA 중합효소 프로모터로부터 원하는 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자, 및 (b) 예컨대 polⅡ 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 발현하는 것을 포함하여, 세포에서의 두 가지 타입의 DNA의 발현이 완전하고 손상되지 않은 감염성 비리온의 조립으로 이어지도록 한다. DNA는 바람직하게는 바이러스 RNA 및 단백질의 전체를 제공하지만, 또한 일부 RNA 및 단백질을 제공하기 위하여 헬퍼 바이러스를 사용하는 것이 가능하다. 각각의 바이러스 RNA를 생산하기 위해 별도의 플라스미드-기반 방법을 사용할 수 있고[17-19], 또한 이들 방법은 바이러스 단백질의 전부 또는 일부(예컨대 단지 PBl, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현시키기 위한 플라스미드의 사용을 포함할 것이고, 어떤 방법에서는 12개까지의 플라스미드가 사용된다. 필요한 플라스미드의 수를 줄이기 위하여, 하나의 접근법[20]은 동일한 플라스미드 위의 다수의 RNA 중합효소 Ⅰ 전사 카세트(바이러스 RNA 합성을 위한 것)(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모든 8개 인플루엔자 A vRNA 단편을 암호화하는 서열) 및 다른 플라스미드 위의 RNA 중합효소 II 프로모터가 있는 다수의 단백질-암호화 영역(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모든 8개 인플루엔자 A mRNA 전사체를 암호화하는 서열)을 조합한다. 참고문헌 20 방법의 바람직한 측면은: (a) 단일 플라스미드 위에 PB1, PB2 및 PA mRNA-암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 위에 모든 8개 vRNA-암호화 단편을 포함한다. 한 플라스미드 위에 NA 및 HA 단편, 다른 플라스미드 위에 6개의 다른 단편을 포함하는 것도 문제를 용이하게 할 수 있다.

바이러스 RNA 단편을 암호화하기 위하여 polⅠ 프로모터를 사용하는 것에 대한 대안으로서, 박테리오 파지 중합효소 프로모터를 사용하는 것이 가능하다[21]. 예로써, SP6, T3 또는 T7 중합효소에 대한 프로모터를 편리하게 사용할 수 있다. polⅠ 프로모터의 종-특이성 때문에, 세포가 외부유래의 중합효소를 암호화하는 플라스미드도 함께 형질도입 되어야만 함에도 불구하고, 박테리오파지 중합효소 프로모터가 많은 세포 타입(예컨대 MDCK)에 대하여 편리하게 사용될 수 있다.

다른 기술에서, 단일 주형으로부터 바이러스 RNA 및 발현가능한 mRNA를 동시에 암호화하기 위해 이중 polⅠ 및 polⅡ 프로모터를 사용하는 것이 가능하다[22,23].

따라서, 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34 바이러스(전형적으로 백신 주에서 나온 HA 및 N 단편과 A/PR/8/34에서 나온 6개의 단편, 즉 6:2 외피잡종)로부터 나온 하나 이상의 RNA 단편을 포함할 수 있다. 또한 A/WSN/33 바이러스로부터 또는 백신 제조를 위한 외피 잡종 바이러스를 생성하는데 유용한 임의의 다른 바이러스 주로부터 나온 하나 이상의 RNA 단편을 포함할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 AA/6/60 인플루엔자(A/Ann Arbor/6/60)으로부터 나온 6개 미만(즉, 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 바이러스 단편을 포함할 수 있다. 인플루엔자 B 바이러스는 AA/1/66 인플루엔자 바이러스(B/Ann Arbor/1/60)에서 나온 6개 미만(즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 바이러스 단편을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명은 인간-대-인간 전달이 가능한 주에 대하여 보호되고, 그래서 주의 게놈은 보통 포유동물(예컨대 인간) 인플루엔자 바이러스에서 유래한 적어도 하나의 RNA 단편을 포함할 것이다. 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래한 NS 단편을 포함할 수 있다.

항원을 조성물에 포함할 수 있는 주는 저항성 유행성 주를 포함하여 항바이러스 치료에 대하여 저항성일 수 있다(예컨대 오셀타미비르[24] 및/또는 자나미비르에 대한 저항성)[25].

특히 유용한 주는 환자로부터의 분리 및 세포배양 시스템에서의 복제 사이에 포함되는 임의의 단계에서 난을 통해 통과하지 않는 것들이다. MDCK 세포는 분리로부터 바이러스 복제까지의 모든 단계에 대하여 독점적으로 사용할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명에서 사용한 주는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 갖는 올리고당에 대하여 결합 선호도를 갖는 헤마글루티닌을 갖는다. 인간 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당(갈락토오스에 대하여 α-2,6에 결합된 시알산)을 갖는 수용체 올리고당에 결합하지만, 난 및 Vero 세포는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 갖는 수용체 올리고당을 갖는다. MDCK와 같은 세포에서의 인간 인플루엔자 바이러스의 성장은 난을 통과하는 것과는 다르게 천연 Sia(α2,6)Gal 결합을 유지하기 위한 헤마글루티닌에 대한 선별압을 제공한다.

바이러스가 Sia(α2,3)Gal 말단 이당을 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당을 갖는 올리고당에 대하여 결합 선호도를 갖는지 결정하기 위하여, 다양한 분석이 사용될 수 있다. 예로써, 참고문헌 26은 민감하고 정량적인 친화도 상수의 측정을 제공하는 인플루엔자 바이러스 수용체-결합 활성에 대한 고체상 효소-결합 분석을 기술한다. 참고문헌 27은 두 개의 다른 시알릴당단백질에 대한 바이러스의 결합을 평가한 고체상 분석을 사용하였고(Sia(α2,3)Gal 결정자를 갖는 오보뮤코이드; 및 Sia(α2,6)Gal 결정자를 갖는 돼지 α2-마이크로글로불린), 또한 바이러스의 결합이 두 개의 수용체 유사체: 자유 시알산(Neu5Ac) 및 3'-시알릴락토오스(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc)에 대하여 평가된 분석을 기술한다. 참고문헌 28은 α2,3 또는 α2,6 연결에 대한 수용체 선호도를 명백히 구별 지을 수 있었던 글리칸 어레이를 사용한 분석을 보고한다. 참고문헌 29는 Sia(α2,6)Gal 또는 Sia(α2,3)Gal 중 어느 하나를 함유하는 효소학적으로 변형된 인간 적혈구의 유착에 기초한 분석을 보고한다. 분석의 타입에 따라, 바이러스 자체로 직접적으로 수행될 수도 있고, 바이러스로부터 정제된 헤마글루티닌으로 간접적으로 수행할 수도 있다.

일부 구체예에서 본 발명에서 사용한 인플루엔자 주는 난-유래 바이러스와 다른 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질(헤마글루티닌 포함)을 갖는다. 따라서 당단박질은 난에서 보이지 않는 당형태를 포함할 것이다.

인플루엔자 A 바이러스는 최근에 16개의 HA 서브타입: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1O, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16을 나타낸다. 본 발명은 하나 이상의 이들 서브타입에 대하여 보호할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대하여 보호할 수 있다. 본원의 백신은 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 주로부터 나온 항원을 포함하고, 전형적으로 적어도 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 주 예컨대 2개 또는 3개의 인플루엔자 A 바이러스 주로부터 나온 항원을 포함할 것이다. 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 주가 포함되었을 때, 이들은 보통 H1 주 및 H3 주일 것이다. 3개의 인플루엔자 A 바이러스 주가 포함되었을 때, 이들은 보통 H1 주, H3 주 및 유행병-연관 주일 것이다. 일부 구체예에서 H3 주는 A/moscow/10/99와 교차-반응하고; 다른 구체예에서 H3 주는 A/Fujian/411/2002와 교차-반응한다. 참고문헌 30은 A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1 및 B 항원을 포함하는 백신을 개시한다.

유행병-연관 인플루엔자 주의 특징은 : (a) 백신 수여자 및 보통 인간 집단이 주의 헤마글루티닌에 대하여 면역학적으로 경험이 없도록, 현재 돌고 있는 인간 주와 비교하여 새로운 헤마글루티닌을 함유하는 것, 즉 10년이 넘는 동안 인간 집단에서 증명되지 않았거나(예컨대 H2), 인간 집단에서 이전에 전혀 보이지 않았던 것(예컨대 오직 새 집단에서만 일반적으로 발견되었던 H5, H6 또는 H9); (b) 인간 집단에서 수평적으로 전달될 수 있는 것; 및 (c) 인간에 대하여 병원성인 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 유행병-연관 인플루엔자 바이러스 주는 전형적으로 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입, 예컨대 H5N1, H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 또는 H7N7을 가질 것이다. H5N1 주가 바람직하다. 유행성 주는 H1 서브타입(예컨대 H1N1)을 가질 수 있고; 예를 들면, HA는 A/California/04/09 주와 면역학적으로 교차-반응할 수 있다.

현재 인플루엔자 B 바이러스는 다른 HA 서브타입을 나타내지 않지만, 인플루엔자 B 바이러스 주는 두 개의 독특한 계통으로 나뉘어진다. 이들 계통은 1980년대 말에 드러났고, 서로 항원적으로 및/또는 유전학적으로 구별할 수 있는 HA를 갖는다[31]. 현재의 인플루엔자 B 바이러스 주는 B/Victoria/2/87-유사 또는 B/Yamagata/16/88-유사 중 어느 하나이다. 이들 주는 보통 항원적으로 구별되지만, 아미노산 서열에서의 차이가 또한 두 계통을 구분하는 것에 대하여 기술되었고, 예컨대 B/Yamagata/16/88-유사 주는 종종(하지만 항상은 아님) 'Lee40' HA 서열에 관하여 번호가 매겨진 아미노산 잔기 164에서 결실이 있는 HA 단백질을 갖는다[32].

일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단일 인플루엔자 B 바이러스 주로부터 나온 항원을 포함하고, 이 주는 B/Victoria/2/87-유사 또는 B/Yamagata/16/88-유사일 수 있다. 그러나 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 주로부터 나온 항원을 포함하고, 이들은 전형적으로 B/Victoria/2/87-유사 주 및 B/Yamagata/16/88-유사 주를 포함할 것이다.

본 발명의 바람직한 백신은 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 주("ABBA" 백신)으로부터 나온 항원을 포함한다. 따라서 본 발명의 바람직한 ABBA 백신은: (i) H1N1 주; (ii) H3N2 주; (iii) B/Victoria/2/87-유사 주; 및 (iv) B/Yamagata/16/88-유사 주로부터 나온 헤마글루티닌을 포함할 것이다.

일부 ABBA 구체예에서, 인플루엔자 B 바이러스 주의 적어도 두 개는 별개의 헤마글루티닌, 하지만 관련된 뉴라미다아제를 가질 수 있다. 예로써, 그들은 B/Victoria/2/87-유사 뉴라미다아제의 모두를 가질 수 있거나[33], B/Yamagata/16/88-유사 뉴라미다아제의 모두를 가질 수 있다. 예로써, 두 개의 B/Victoria/2/87-유사 뉴라미다아제는 모두 하기 서열의 하나 이상의 특징을 가질 수 있다: (1) 잔기 27에서 세린은 아니지만, 바람직하게는 루신; (2) 잔기 44에서 글루타메이트는 아니지만, 바람직하게는 리신; (3) 잔기 46에서 트레오닌은 아니지만, 바람직하게는 이소루신; (4) 잔기 51에서 프롤린은 아니지만, 바람직하게는 세린; (5) 잔기 65에서 아르기닌은 아니지만, 바람직하게는 히스티딘; (6) 잔기 70에서 글리신은 아니지만, 바람직하게는 글루타메이트; (7) 잔기 73에서 루신은 아니지만, 바람직하게는 페닐알라닌; 및/또는 (8) 잔기 88에서 프롤린은 아니지만, 바람직하게는 글루타민. 유사하게, 일부 구체예에서 뉴라미다아제는 잔기 43에서 결실을 가질 수 있거나, 트레오닌을 가질 수 있고; 최근의 주가 Thr-43을 다시 얻었음에도 불구하고[33], NA 유전자에서 트리뉴클레오티드 결실로부터 유발된 잔기 43에서의 결실은 B/Victoria/2/87-유사 주의 특징으로서 보고되었다. 거꾸로, 물론, 반대의 특징 예컨대 S27, E44, T46, P51, R65, G70, L73, 및/또는 P88도 두 개의 B/Yamagata/16/88-유사 뉴라미다아제에 의해 공유될 수 있다. 이들 아미노산을 'Lee40' 뉴라미다아제 서열에 대하여 번호매겼다[34]. 따라서 ABBA 백신은 HA에 대하여 항원적으로는 구별되지만(하나는 B/Yamagata/16/88-유사, 하나는 B/Victoria/2/87-유사), NA에 대하여는 연관된(둘 다 B/Yamagata/16/88-유사, 또는 둘 다 B/Victoria/2/87-유사), 두 개의 B 주를 사용할 수 있다.

본 발명은 3-가 및 4-가 백신에 제한되지 않지만, 5-가, 6-가, 7-가, 등의 백신을 포함한다. 예시적 5-가 백신은 세 개의 인플루엔자 A 주(예컨대 상술한 바와 같이 하나의 H1 주 및 두 개의 H3 주)와 두 개의 인플루엔자 B 주를 포함할 수 있다. 예를 들면, A-A-A-B-B 백신은: (i) H1N1 주; (ii) A/moscow/lO/99-유사 H3N2 주; (iii) A/Fujian/411/2002-유사 H3N2 주; (iv) B/Victoria/2/87-유사 주; 및 (v) B/Yamagata/16/88-유사 주에서 나온 헤마글루티닌을 포함할 수 있다. 다른 A-A-A-B-B 백신은: (i) H1N1 주; (ii) H3N2 주; (iii) H5N1 주와 같은 H5 인플루엔자 A 바이러스 주; (iv) B/Victoria/2/87-유사 주; 및 (v) B/Yamagata/16/88-유사 주에서 나온 헤마글루티닌을 포함할 수 있다. A-A-A-A-B 백신은: (i) H1N1 주; (ii) A/moscow/ 10/99-유사 H3N2 주; (iii) A/Fujian/411/2002-유사 H3N2 주; (iv) H5N1 주와 같은 H5 인플루엔자 A 바이러스 주; 및 (v) 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌을 포함할 수 있다. A-A-A-A-B-B 백신은: (i) H1N1 주; (ii) A/moscow/10/99-유사 H3N2 주; (iii) A/Fujian/411/2002-유사 H3N2 주; (iv) H5N1 주와 같은 H5 인플루엔자 A 바이러스 주; (v) B/Victoria/2/87-유사 주; 및 (vi) B/Yamagata/16/88-유사 주에서 나온 헤마글루티닌을 포함할 수 있다.

헤마글루티닌 투여

헤마글루티닌(HA)은 현재의 불활성화 인플루엔자 백신에서 주요 면역원이고, 백신 투여량은 전형적으로 SRID에 의해 측정된 HA 수준에 대한 참고문헌에 의해 평준화된다. 현행의 백신은 전형적으로 0.5 ㎖ 투여량에서 주 당 약 15 ㎍의 HA를 함유하기는 하지만, 예컨대 어린이에 대하여(전형적으로 동일한 HA 농도에서 0.25 mkL 투여량), 또는 유행병 상황에서, 또는 아주번트를 사용할 때, 더 낮은 투여량이 사용될 수 있다. ½(즉 주 당 7.5 ㎍ HA), ¼및 ⅛과 같은 소량의 투여량이 더 높은 투여량(예컨대 3× 또는 9× 투여량[35,36])으로 사용할 수 있다.

일반적으로, 투여량 당 HA의 양은 주 당 0.1 및 150 ㎍의 범위, 바람직하게는 0.1 및 50 ㎍ 사이, 예컨대 0.1 -20 ㎍, 0.1 -15 ㎍, 0.1-10 ㎍, 0.1 -7.5 ㎍, 0.5-5 ㎍, 등에 있을 수 있다. 특정 투여량은 주 당 예컨대 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5 ㎍ 등을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 조성물에서 주 당 HA의 농도는 적어도 12 ㎍/㎖이다(즉 참고문헌 3에서 사용한 농도보다 더 높은 0.5 ㎖ 부피에서 주 당 적어도 6 ㎍). 보통 농도는 ≥15 ㎍/㎖ 예컨대 ≥20 ㎍/㎖, ≥25 ㎍/㎖, ≥30 ㎍/㎖ 또는 그 이상일 것이다. 주 당 15 ㎍/㎖ 또는 주 당 30 ㎍/㎖의 농도가 전형적이다.

보통은 HA의 농도는 조성물에서 각각의 주에 대하여 동일할 것이다. 그러나 일부 구체예에서 농도는 모두 가장 낮은 농도의 정수배일 것이다. 예를 들면, 만약 특정 주에 대한 가장 낮은 HA 농도가 15 ㎍/㎖라면, 조성물에서 다른 HA 농도는 15 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 45 ㎍/㎖ 또는 60 ㎍/㎖일 것이다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 보통 불활성화 백신으로 사용될 것이다. 그러나 일부 구체예에서 살아있는 백신으로 사용될 수 있다. HA 내용물에 대하여 표준에 맞추기보다, 살아있는 백신 투여량은 중앙 조직 배양 감염 투여량(TCID₅₀)에 의해 측정될 수 있다. 주 당 10⁶ 및 10⁸ 사이의 TCID₅₀(바람직하게는 10^6.5-10^7.5 사이)이 전형적이다. 인플루엔자 바이러스는 약화될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도에 민감할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 저온-적응 변이체일 수 있다.

세포주

본 발명에서 사용하기 위한 백신의 제조는 바이러스의 성장을 위한 기질로서 SPF 난을 사용할 수 있고, 바이러스는 암탉의 난의 감염된 요막의 유체로부터 회수된다. 그러나 인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주를 대신 사용할 수 있다. 세포주는 전형적으로 포유동물로부터 유래할 것이다. 적당한 기원의 포유동물 세포는 햄스터, 소, 영장류(인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 제한 없이 포함하지만, 영장류 세포의 사용이 바람직하지는 않다. 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포, 등과 같은 다양한 세포 타입이 사용될 수 있다. 적당한 햄스터 세포의 예시는 BHK21 또는 HKCC의 명칭을 갖는 세포주이다. 적당한 원숭이 세포는 예컨대 Vero 세포주에서와 같은 신장 세포와 같은 아프리카 녹색 원숭이 세포이다[37-39]. 적당한 개 세포는 예컨대 CLDK 및 MDCK 세포주에서와 같은 신장 세포이다.

따라서 적당한 세포주는 MDCK; CHO; CLDK; HKCC; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6[40]; FRhL2; WI-38; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적당한 세포주는 예컨대 아메리칸 타입 셀 컬쳐(ATCC) 콜렉션[41], 코리엘 셀 레포지토리에[42], 또는 유럽 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC)로부터 널리 사용가능하다. 예를 들면, ATCC는 카탈로그 번호 CCL-81, CCL- 81.2, CRL-1586 및 CRL-1587하에서 다양한 다른 Vero 세포를 제공하고, 카탈로그 번호 CCL-34하에서 MDCK 세포를 제공한다. PER.C6은 기탁번호 96022940 하에서 ECACC로부터 사용가능하다.

가장 바람직한 세포주는 포유류-타입으로 글리코실화된 것들이다. 포유류 세포주에 대한 덜-바람직한 대안으로서, 바이러스는 오리(예컨대 오리 망막) 또는 암탉으로부터 유래한 세포주를 포함하는 조류 세포주에서 자랄 수 있다[예컨대 참고문헌 43-45]. 조류 세포주의 예시는 조류 배아 줄기 세포[43,46] 및 오리 망막 세포[44]를 포함한다. 적당한 조류 배아 줄기 세포는 닭 배아 줄기 세포로부터 유래한 EBx 세포주, EB45, EB14, 및 EB 14-074을 포함한다[47]. 또한, 닭 배아 섬유아세포(CEF)가 사용될 수 있다. 그러나 조류 세포를 사용하는 것 보다 포유동물 세포의 사용이 백신이 조류 DNA 및 난 단백질(오발부민 및 오보뮤코이드와 같은)이 없어서 면역원성을 감소시킬 수 있음을 의미한다.

인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위한 가장 바람직한 세포주는 Mardin Darby 개의 신장에서 유래한 MDCK 세포주이다[48-51]. 원형 MDCK 세포주는 CCL-34로서 ATCC로부터 사용가능하지만, 또한 이 세포주의 유도체 및 다른 MDCK 세포주도 사용가능하다. 예로써, 참고문헌 48은 부유 배양에서의 성장에 적응된 MDCK 세포를 개시한다(DSM ACC 2219로서 기탁된 'MDCK 33016'). 유사하게, 참고문헌 52는 무혈청 배양에서 부유하여 성장한 MDCK-유래 세포주를 개시한다(FERM BP-7449로서 기탁된 'B-702'). 참고문헌 53은 'MDCK-S'(ATCC PTA-6500), 'MDCK-SFlOl'(ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103'(PTA-6503)을 포함하는 비-발암성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 54는 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL-12042)를 포함하는, 감염에 매우 걸리기 쉬운 MDCK 세포주를 개시한다. 이들 MDCK 세포주 중 임의의 하나를 사용할 수 있다.

바이러스는 부착 배양 또는 부유 배양에 있는 세포에서 성장할 수 있다. 또한 미세담체 배양을 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 따라서 세포는 부유하여 성장하도록 적응시킬 수 있다.

세포주는 바람직하게는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장한다. 배지는 인간 또는 동물 유래의 혈청으로부터의 첨가물이 없을 때 본 발명의 문맥에서 무혈청 배지로 지칭된다. 이런 배양에서 성장하는 세포는 천연적으로 단백질 자체를 함유하지만, 무단백질 배지는 단백질, 성장인자, 다른 단백질 첨가물 및 무혈청 단백질을 배제한 상태에서 세포의 증식이 일어나는 것으로 이해되지만, 바이러스 성장에 필요할 수 있는 트립신 또는 다른 프로테아제와 같은 단백질을 선택적으로 포함할 수 있다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 바이러스 복제 동안 바람직하게는 37℃(예컨대 30-36℃, 또는 약 3O℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃) 아래에서 자란다[55].

배양된 세포에서 인플루엔자 바이러스를 번식시키는 방법은 일반적으로 자라날 주의 접종물로 세포의 배양액을 접종하는 단계, 예를 들면, 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정되는 바와 같은, 바이러스 번식에 대하여 원하는 시간 동안 감염된 세포를 배양하는 단계(예컨대 접종 후 24 및 168시간 사이), 및 번식된 바이러스를 수득하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 더욱 바람직하게는 1:50 내지 1:10의 세포에 대한 바이러스(PFU 또는 TCID₅₀에 의해 측정됨)의 비율로 접종된다. 바이러스는 세포의 부유물에 첨가되거나 세포의 단층막에 적용되고, 바이러스는 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃에서 적어도 60분, 보통 300분 미만, 바람직하게는 90 및 240분 사이 동안 흡수된다. 감염된 세포 배양액(예컨대 단층막)은 회수된 배양 상청액의 바이러스 함량을 증가시키기 위해 동결-해동 또는 효소적 반응 중 어느 하나에 의해 제거될 수 있다. 회수된 유체는 이후 불활성화되거나 동결 보관된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 2의 다중 감염("m.o.i.")으로 감염될 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 세포는 약 0.01의 m.o.i로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60시간 후에 회수될 수 있다. 바람직하게는 세포는 감염 후 34 내지 48시간에 회수된다. 더욱 더 바람직하게는 세포는 감염 후 38 내지 40시간 내에 회수된다. 프로테아제(전형적으로 트립신)는 바이러스 분비를 허용하기 위해 세포 배양 동안 일반적으로 첨가되며, 프로테아제는 접종 중의 적당한 임의의 단계에서, 예컨대 접종 전, 접종과 동시에 또는 접종 후에 첨가될 수 있다[55]. 일부 구체예에서, 특히 MDCK 세포와 함께, 세포주는 임상시험용 줄기 세포 은행으로부터 40번의 집단-배가 수준 이상으로 계대배양되지 않았다.

바이러스 접종물 및 바이러스 배양은 바람직하게는 단순 포진 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 써코바이러스, 및/또는 파보바이러스가 없는 것이 바람직하다(즉 시험을 실시하여 이에 대한 오염에 대하여 음성적인 결과를 받을 것임)[56]. 단순 포진 바이러스의 부재가 특히 바람직하다.

숙주 세포 DNA

바이러스가 세포주에서 자랐을 때, 이후 DNA의 임의의 발암적 활성을 최소화하기 위하여, 최종 백신에서 잔여 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 실행이다. 따라서 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 숙주 세포 DNA의 자취량이 존재할 수 있다 하더라도, 바람직하게는 투여량 당 잔여 숙주 세포 DNA의 10ng 미만(바람직하게는 1 ng 미만, 및 더욱 바람직하게는 1OO pg 미만)를 함유한다.

0.25 ㎖ 부피 당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신과 같이, 15 ㎍의 헤마글루티닌 당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 바람직하다. 0.5 ㎖ 부피 당 <10 ng(예컨대 <1 ng, <100 pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신과 같이, 50 ㎍의 헤마글루티닌 당 <10ng(예컨대 <1 ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 더욱 바람직하다.

임의의 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500bp 미만 예컨대 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100bp 미만, 등이 바람직하다.

DNA의 오염은 표준 정제 과정, 예컨대 크로마토그래피, 등을 사용하여 백신 제조 동안에 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는, 예컨대 DNase를 사용함으로써 핵산분해효소 처리에 의하여 향상될 수 있다. 먼저 바이러스 성장 동안에 사용할 수 있는 DNase(예컨대, 벤조나아제), 및 그 다음 비리온 분해시 사용될 수 있는 양이온 세제(예컨대, CTAB) 사용의 두 단계 처리를 포함하는, 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 참고문헌 57 & 58에 개시되어 있다.

잔류 숙주 세포 DNA의 측정은 현재 통상적인 생물학적 조절 요건이며 당업자의 일반적인 능력의 범위 내에 존재한다. DNA 측정에 사용되는 분석은 일반적으로 입증된 분석일 것이다[59,60]. 입증된 분석의 성능 특징은 수학적 및 정량적인 용어로 기술될 수 있으며, 이들의 가능한 오차의 원인이 확인되었을 것이다. 분석은 일반적으로 정확성, 정밀도, 특이성과 같은 특징에 대하여 테스트할 것이다. 일단 분석을 조정(예컨대, 공지된 숙주 세포 DNA의 표준량에 대하여) 및 시험하면, 그 다음 정량적 DNA 측정은 통상적으로 수행될 수 있다. DNA 정량을 위해 3개의 주요 기술: 서던 블롯 또는 슬롯 블롯[61]과 같은 혼성화 방법; Threshold™ 시스템과 같은 면역분석 방법[62]; 및 정량적 PCR[63]을 사용할 수 있다. 각 방법의 정확한 특징은 대상으로 하는 숙주 세포, 예컨대 혼성화용 프로브의 선택, 증폭을 위한 프라이머 및/또는 프로브의 선택 등에 달려있지만, 이들 방법은 모두 당업자에게 익숙한 것이다. Molecular Devices의 Threshold™ 시스템은 전체 DNA의 피코그램 수준에 대한 정량적 분석법이고, 바이오제약에서 DNA 오염 수준을 모니터링하기 위하여 사용되어 왔다[62]. 전형적인 분석법은 바이오티닐화 ssDNA 결합 단백질, 우레아제-접합 항-ssDNA 항체, 및 DNA 간의 반응 복합체의 비-서열-특이적 형성을 포함한다. 모든 분석 성분은 제조사로부터 입수가능한 완전한 전체 DNA 분석 키트 내에 포함되어 있다. 다양한 상업적 제조사들, 예컨대 AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies 등들이 잔류 숙주 세포 DNA를 검출하기 위한 정량적 PCR 분석법을 제공한다. 인간 바이러스 백신의 숙주 세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 혼성화 분석법과 전체 DNA Threshold™ 시스템의 비교는 참고문헌 64에서 찾을 수 있다.

약학적 조성물

본 발명에서 사용하기 위한 백신은 보통 인플루엔자 항원에 추가한 성분을 포함하고, 예컨대 그들은 전형적으로 하나 이상의 약학적 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 이런 성분에 대한 철저한 논의는 참고문헌 65에서 이용가능하다. 또한, 많은 구체예에서, 아주번트를 또한 포함할 수 있다.

조성물은 투여 시점 전에 보통 수성형으로 있을 것이다.

조성물은 티오메살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나 일부 구체예에서 백신은 PREPANDRIX™ 제품과 다르게 수은 물질이 실질적으로 없어야 하며, 예컨대 티오메살-부재가 바람직하다[8,66]. 수은을 함유하지 않는 백신이 보다 바람직하고, α-토코페롤 숙시네이트가 수은 화합물에 대한 대안으로서 포함될 수 있다[8]. 무-보존제 백신이 특히 바람직하다.

긴장성을 조절하기 위해, 나트륨염과 같은 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다. 1 및 20 ㎎/㎖ 사이로 존재할 수 있는 염화나트륨(NaCl)이 바람직하다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트, 및/또는 염화 마그네슘 등을 포함한다. 아주번트가 항원과 분리된 용기에 있을 때, 염화나트륨은 두 용기 모두에 있을 수 있다.

조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg 사이, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있는 삼투압을 가질 수 있다.

조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수 있다. 전형적인 버퍼는: 인산염 버퍼; Tris 버퍼; 붕산염 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼(특히 수산화알루미늄 아주번트와 함께); 또는 구연산염 버퍼를 포함한다. 버퍼는 전형적으로 5-2O mM 범위로 포함될 것이다.

조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 일반적으로 6.0 내지 8.0, 예컨대 6.5 내지 7.5 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.

조성물은 멸균된 것이 바람직하다. 조성물은 바람직하게는 비-발열성이고, 예컨대 투여량 당 ≤1 EU(엔도톡신 단위, 표준 척도), 바람직하게는 투여량 당 ≤0.1 EU를 함유한다. 조성물은 바람직하게는 글루텐이 부재하다.

본 발명의 조성물은 특히 분해 또는 표면 항원 백신에 대하여 세제 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tween'으로서 알려짐), 옥톡시놀(옥톡시놀-9(트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올과 같은), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 소듐 디옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 세제는 오직 자취량(trace amount)으로 존재할 수 있다. 따라서 백신은 각각의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80의 1 ㎎/㎖ 미만을 포함할 수 있다. 자취량에서 다른 잔여 성분은 항생제일 수 있다(예컨대 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B). 아주번트가 항원과 분리된 용기에 있을 때, 이 세제는 보통 항원-함유 용기에서 존재할 것이다(예컨대 폴리소르베이트 80 및 옥톡시놀 10과 항원이 함께).

조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 다중 면역화(즉 '다중투여량' 키트)를 위한 물질을 포함할 수도 있다. 다중투여량 배열에서 보존제를 포함하는 것이 바람직하다. 다중투여량 조성물에서 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서(또는 추가로), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수 있다.

인간 인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5 ㎖의 단위 투여량 부피(unit dosate volume)로 근육 내 주사에 의해 투여된다. 그러나 본 발명의 일부 구체예에서 이 부피의 단위 투여량의 절반(즉 약 0.25 ㎖)이 사용될 수 있다. 이 감소된 투여량 부피는 특히 어린이에게 유용하다. 더 낮은 투여량(예컨대 0.1 ㎖ 또는 0.2 ㎖)도 예컨대 피내 주사에 대해 유용할 수 있다.

백신은 바람직하게는 2℃ 및 8℃ 사이에서 저장된다. 그들은 얼지 않아야 한다. 그들은 이상적으로는 직사광선에 노출되지 않아야 한다.

백신은 투여에 대한 준비가 되어 제형화되거나 투여 전에 즉석으로 혼합하기 위한 키트의 일부로서, 예컨대 분리된 항원 및 아주번트 성분으로서 제형화된 임의의 적당한 용기에서 제공될 수 있다(PREPANDRIX™ 제품에서와 같이). 적당한 용기는 바이알, 시린지(예컨대 일회용 시린지), 비강 스프레이, 등을 포함한다. 이들은 멸균되어야 한다. 조성물/성분이 바이알에 위치하는 경우, 바이알은 유리 또는 플라스틱 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바이알은 조성물이 첨가되기 전에 멸균되는 것이 바람직하다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 피하기 위하여, 바이알은 라텍스가 없는 마개로 밀봉되는 것이 바람직하며, 모든 포장 재료 내에 라텍스가 부재하는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 투여량의 백신을 포함할 수 있거나, 또는 1회 투여량 이상('다중투여량' 바이알), 예컨대 10회 투여량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 제조된다. 바이알은 시린지가 캡 안으로 삽입되기에 적합한 캡(예컨대 Luer lock)을 가질 수 있다. 바이알은 그의 구성성분의 무균 제거를 허용하는 캡을 특히 다중투여량 바이알에 대하여 가질 수 있다. 성분이 시린지 내에 포장되는 경우, 시린지는 이것에 부착된 바늘을 구비할 수 있다. 바늘이 부착되지 않았다면, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위하여 시린지와 함께 공급될 수 있다. 이런 바늘은 내장될 수 있다. 안전한 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 시린지는 기록 유지를 용이하게 하기 위해 내용물의 제품 번호, 인플루엔자 시기 및 유효 기간이 인쇄된 접착식 라벨과 함께 제공될 수 있다. 시린지에서 플런저(plunger)는 흡인 동안 플런저가 사고로 제거되는 것을 예방하기 위해 마개를 갖는 것이 바람직하다. 시린지는 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 시린지는 단일 투여량의 백신을 함유한다. 시린지는 바늘 부착 전에 팁을 밀봉하기 위하여 팁 캡(tip cap)을 구비하는 것이 일반적이며, 팁 캡은 부틸 고무로 제조되는 것이 바람직하다.

용기는 예컨대 어린이에 대한 전달을 용이하게 하기 위해 절반-투여량 부피를 보여주기 위해 표시될 수 있다. 예를 들면, 0.5㎖ 투여량를 함유하는 시린지는 0.25㎖ 부피를 나타내는 표시를 한다. 따라서 백신은 0.5 ㎖의 단위 투여량 부피로 포장될 수 있지만, 0.25 ㎖의 단위 투여량 부피로서 투여될 수 있고, 그러므로 절반 투여량이 용기의 표시에 의해 용이하게 된다.

유리 용기(예컨대, 시린지 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 라임 유리보다는 규산염 유리로 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

용기는 백신의 상세, 예컨대 투여 지침서, 백신 내의 항원의 상세 등을 포함하는 인쇄물과(예컨대, 동일 박스에) 포장될 수 있다. 지침서에는 경고문, 예컨대 백신접종 후 과민성 반응의 경우 쉽게 입수가능한 아드레날린 용액을 사용하라는 등의 경고문을 포함할 수 있다.

아주번트

사용의 시점에서, 본 발명의 백신은 조성물을 받은 환자에서 유도된 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 향상시키기 위해 기능할 수 있는 아주번트를 유리하게 포함할 수 있다. 수중유 에멀젼 아주번트(특히 스쿠알렌을 포함하는 것)의 존재가 계절성[67] 및 유행성[68,69] 인플루엔자 백신에 대한 면역 반응의 주 교차-반응을 향상시키는 것을 보여주었다.

본 발명에서 사용하기 위한 수중유 에멀젼은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 생분해성(대사가능한) 및 생체적합성인 오일 및 계면활성제로 포함한다. 에멀젼에서 오일 액적은 일반적으로 직경이 5μm 미만이며, 이상적으로 미크론 이하의 직경을 가질 수도 있고, 이들 작은 크기는 마이크로플루이다이저(microfluidiser)로 달성되어 안정된 에멀젼을 제공한다. 220nm 미만 크기의 액적이 여과 멸균을 실시할 수 있어 바람직하다.

본 발명은 동물성(예로써, 어류) 또는 식물성원으로부터의 것과 같은 오일과 함게 사용할 수 있다. 식물성 오일원은 견과, 종자, 곡물을 포함한다. 가장 흔하게 이용가능한 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일은 견과 오일의 예가 된다. 호호바 오일은, 예컨대, 호호바 열매로부터 획득되어 사용될 수 있다. 종자 오일은 홍화 오일, 면실 오일, 해바라기씨오일, 참깨씨 오일 등을 포함한다. 곡물군에서, 옥수수 오일이 가장 용이하게 이용가능하지만, 또한 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프(teff), 라이밀 등과 같은 다른 곡류 곡물의 오일이 사용될 수도 있다. 종자 오일에서 자연적으로 발생하지 않는 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개의 탄소 지방산 에스테르는 견과 및 종자 오일로부터 출발하는 적합한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 젖으로부터의 지방 및 오일은 물질대사가능하며, 따라서 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 동물성원으로부터 순수한 오일을 획득하는데 필요한 분리, 정제, 사포닌화 및 다른 필요한 수단은 당업계에 공지되어 있다.

대부분의 어류는 용이하게 회수될 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 본원에서 사용될 수 있는 몇몇의 어류 오일은, 예를 들어, 대구간 오일, 상어간 오일 및 경뇌와 같은 고래 오일로 예시된다. 많은 분지쇄 오일은 5-탄소 이소프렌 단위에서 생화학적으로 합성되며, 일반적으로 테르페노이드로서 언급된다. 상어간 오일은 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로서 알려진 분지, 불포화 테르펜을 함유한다. 또한, 스쿠알렌, 스쿠알란에 대한 포화 유사체를 사용할 수 있다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 어류 오일은 시중의 공급원으로부터 용이하게 이용가능하거나 또는 당업계에 공지된 방법으로 획득될 수 있다. 스쿠알렌이 바람직하다.

스쿠알렌-함유 에멀젼은 FLUAD™ 및 PREPANDRIX™ 제품에서 이미 포함된다. FLUAD™ 백신에서 0.5 ㎖의 투여량 부피에서 HA의 전량은 45 ㎍(3×15 ㎍)이고 스쿠알렌의 전량은 9.75 ㎎이다(즉 19.5 ㎎/㎖ 스쿠알렌). PREPANDRIX™ 백신에서 또한 0.5 ㎖의 투여량 부피에서 HA의 전량은 3.75 ㎍(1가)이고, 스쿠알렌의 전량은 10.68 ㎎이다(즉 21.4 ㎎/㎖ 스쿠알렌). 본 발명의 많은 구체예에서 스쿠알렌 농도는 아주번트 효과가 여전히 유지되는 동안 19 ㎎/㎖ 미만이고, 농도는 ≤10 ㎎/㎖ 예컨대 ≤5 ㎎/㎖, ≤2.5 ㎎/㎖일 수 있다. 투여량 당 0.5 ㎎ 스쿠알렌의 최소량이 유용하다(예컨대 참고문헌 3을 참조하라). 투여량 당 양의 예시는 5.3 ㎎, 4.9 ㎎, 2.7 ㎎, 2.4 ㎎, 1.2 ㎎ 등을 포함한다.

다른 유용한 오일은 비타민 E가 이 환자 그룹에서 면역 반응에 긍정적인 영향을 가지는 것으로 보고되었기 때문에, 노령 환자(예컨대 60세 또는 그 이상의 연령)에서의 사용을 위해 백신에서 유리하게 포함되는 토코페롤이다[70]. 그들은 또한 에멀젼을 안정화하는 것을 도울 수 있는 항산화적 성질을 가진다[71]. 다양한 토코페롤이 존재하지만(α, β, γ, δ, ε 또는 ξ), α가 보통 사용된다. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이다. α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신과 양립가능하고, 수은 화합물에 대한 대안으로서 유용한 보존제인 것으로 알려져 있다[8].

오일의 혼합물은 예컨대 스쿠알렌 및 α-토코페롤을 사용할 수 있다. 2-20%(부피)의 범위의 오일 함량이 전형적이다.

계면활성제는 그들의 'HLB'(친수성/친유성 조화)에 의해 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 더욱 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(일반적으로 Tween 라고 불림), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 선형 EO/PO 블록 코폴리머와 같은 상표명 DOWFAX™으로 판매되는 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 코폴리머; 옥토시놀, 이는 반복하는 에톡시(옥시-1,2-에탄디일)그룹의 수가 다양할 수 있고, 옥토시놀-9 (트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)에 특별한 관심이 있으며; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스파티딜콜린(레시틴)과 같은 포스포리피드; Tergitol™ NP 시리즈와 같은 노닐페놀 에톡실레이트; 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30)과 같은 라우릴, 세틸 및 오레일 알코올(Brij 계면활성제로 알려진)로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방산 에테르; 및 소르비탄 트리올레이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트와 같은 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPAN로 알려짐)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 계면활성제와 함께 이용될 수 있다. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함시키기 위해 가장 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트; Tween 80)이다.

계면활성제의 혼합물, 예를 들면 Tween 80/Span 85 혼합물이 이용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및 옥토시놀의 조합이 또한 적당하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥토시놀을 포함한다.

계면활성제의 바람직한 양(중량%)은: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 80과 같은) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(Triton X-100, 또는 다른 Triton 시리즈 세제와 같은) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(라우레스 9와 같은) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10 % 및 특히 0.1 내지 1 % 또는 약 0.5%이다.

스쿠알렌-함유 수중유 에멀젼, 특히 폴리소르베이트 80을 함유하는 것들이 바람직하다. 스쿠알렌:폴리소르베이트 80의 중량 비율은 1 및 10의 사이, 예를 들면, 2 및 9, 예컨대, 약 2.2 또는 약 8.3 사이일 수 있다. 본 발명에서 유용한 특정 수중유 에멀젼 아주번트는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80, 및 소르비탄 트리올레이트의 미크론 이하 에멀젼. 상기 에멀젼의 조성은 부피로 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85가 될 수 있다. 중량으로, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85가 된다. 이 아쥬번트는 'MF59' 로 알려져 있고[72-74], 참고문헌 75의 챕터10 및 참고문헌 76의 챕터 12에 보다 자세히 기술되어있다. 상기 MF59 에멀젼은 유리하게 시트레이트 이온, 예를 들면 10mM 소듐 시트레이트 버퍼를 포함한다.

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 폴리소르베이트 80의 미크론 이하 에멀젼. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% 폴리소르베이트 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌의 중량비로: 토코페롤은 바람직하게는 ≤1 (예: 0.90) 이고 이는 더 안정한 에멀젼을 제공할 수 있다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 부피비로 약 5:2 또는 중량비로 약 11:5로 존재할 수 있다. 이러한 에멀젼 중 하나는 2% 용액을 만들기 위해 PBS에서 Tween 80을 용해하고, 90 ㎖의 이 용액을 혼합물(5g의 DL-α-토코페롤 및 5 ㎖ 스쿠알렌)과 혼합한 뒤, 혼합물을 미세 유체화함으로써 만들어질 수 있다. 상기 결과 에멀젼은 예를 들면 평균 직경 100 내지 250nm 사이, 바람직하게는 약 180nm의 미크론 이하 오일 액적을 가진다. 상기 에멀젼은 또한 3-디-O-아실레이티드 모노포스포릴 지질 A(3d-MPL)를 포함할 수 있다. 이 타입의 다른 유용한 에멀젼은, 사람 투여량 당, 0.5-10 ㎎ 스쿠알렌, 0.5-11 ㎎ 토코페롤, 및 0.1-4 ㎎ 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다[3].

● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세제 (예: Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL(아래 참고)을 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 인산염 버퍼를 포함할 수 있다.

● 폴리소르베이트(예컨대, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예컨대, Triton X-100) 및 토코페롤(예컨대, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이들 세 성분을 약 75:11:10 (예컨대 750㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 110 ㎍/㎖ Triton X-100 및 100㎍/㎖ α-토코페롤 숙시네이트)의 질량비로 포함할 수 있으며, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떤 부담분을 포함하여야 한다. 또한, 에멀젼은 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL를 포함할 수 있다(하기 참조). 수성상은 인산염 버퍼를 포함할 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 포스페이트 완충 식염수, pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드를 위한 유용한 전달 운반체이고, "SAF-1" 아주번트(0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80) 내 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다[77]. 또한 이는 "AF" 아주번트에서와 같이 Thr-MDP 없이 사용될 수 있다 [78](5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유동화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온 계면활성제(예: 폴리옥시에틸렌(12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온 계면활성제(예: 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80' 과 같은 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역성이고 및/또는 200 nm보다 작은 크기의 오일 액적으로 적어도 90%(부피로)를 가진다[79]. 에멀젼은 또한 알디톨; 항냉동제(예: 도데실말토사이드 및/또는 수크로오스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코시드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수 있다[80]. 이러한 에멀젼은 동결건조 될 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼[81]. 아쥬번트 백신에서 이들 성분의 최종농도(중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105(플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85(비스-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드)이다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고문헌 82에서 설명되는 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카디올리핀이다. 미크론 이하 액적 크기가 유리하다.

● 대사분해가능하지 않은 오일(예로써, 경광유)의 미크론 이하 수중유 에멀션 및 적어도 하나의 계면활성제(예로써, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80). QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유체 결합(예로써, 참고문헌 83에서 설명되는 GPI-0100, 글루쿠론산의 카르복실기를 통해 데스아실사포닌에 방향족 아민의 부가에 의해 제조됨), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민과 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

● 사포닌(예컨대, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)이 나선형 마이셀로 회합된 에멀젼[84].

● 미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화 지방산 알코올, 및 비-이온성 친수성 계면활성제를 포함하는 에멀젼(예컨대 에톡실화 지방산 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)[85].

● 미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화 지방산 알코올, 및 비-이온성 친유성 계면활성제를 포함하는 에멀젼(예컨대 에톡실화 지방산 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)[85].

에멀전은 백신 제조 동안 항원과 조합될 수 있거나, 전달의 시점에서 즉시 분리된 항원-함유 성분과 혼합하기 위한 분리된 성분(PREPANDRIX™ 제품에서와 같이)으로서 제공될 수 있다. 이들 두 성분이 액체일 때, 혼합을 위한 두 액체의 부피비는 다양할 수 있지만(예: 5:1 과 1:5 사이) 일반적으로는 약 1:1이다.

항원 및 아주번트가 혼합된 뒤, 헤마글루티닌 항원은 일반적으로 수용액으로 남아 있을 것이지만, 그 스스로는 오일/물 경계면 주변에 분포할 수도 있다. 일반적으로, 헤마글루티닌이 있다면 극소량이 에멀젼의 오일상으로 들어갈 것이다. 본 발명의 조성물에서 헤마글루티닌(전량)에 대한 스쿠알렌의 중량 비율은 20 내지 180, 예컨대 25-30, 50-60, 105-115의 범위에 있을 것이다.

치료 방법 및 백신의 투여

본 발명의 조성물은 인간 환자로의 투여에 적합하며, 본 발명은 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 약제로서의 용도를 위해 본 발명의 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 인플루엔자 질환에 대한 능동적 예방을 위한 조성물의 제조에서, 적어도 하나의 인플루엔자 A 바이러스 항원, 적어도 하나의 인플루엔자 B 바이러스 항원, 및 스쿠알렌(예컨대 수중유 에멀젼의 형태로)의 용도를 제공한다.

이들 방법 및 용도는 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응을 발생시키는데 사용될 것이다. 항체 반응의 평가, 중화 능력 및 인플루엔자 바이러스 백신접종 후 보호에 대한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 역가가 보호와 연관되어 있다는 것을 보여주었다(약 30-40의 혈청 시료 적혈구응집-억제 역가는 동종 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호를 제공)[86]. 항체 반응은 일반적으로 적혈구응집 억제, 미세중화법, 일원 방사 면역확산(SRID), 및/또는 일원 방사 용혈(SRH)에 의하여 측정된다. 이들 분석 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 백신접종 경로는 근육 내 주사(예컨대 팔 또는 다리)에 의한 것이나, 다른 이용가능한 경로는 피하 주사, 피내 주사[87,88], 비강내[89-91], 구강[92], 입, 설하선, 경피, 피부[93] 등을 포함한다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 어린이 및 성인 모두의 치료에 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6개월령부터 소아 및 성인 면역화에 사용되도록 제안되고 있다. 따라서, 환자는 1세 미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신 투여에 바람직한 환자는 고령(예컨대 50세 이상, 60세 이상, 및 바람직하게는 65세 이상), 유아(예컨대 5세 미만), 입원 환자, 건강관리 종사자, 군인 및 군사 요원, 임산부, 만성 환자, 면역결핍 환자, 백신 투여 전 7일 이내에 항바이러스 화합물(예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 투여한 환자, 난 알레르기가 있는 사람 및 해외여행자이다. 백신은 이들 그룹에 단독으로 적합하지는 않지만, 그러나 집단에서 보다 일반적으로 사용될 수 있다.

바람직한 본 발명의 조성물은 효능에 대한 CPMP 기준 중 1, 2 또는 3을 만족할 것이다. 성인(18-60세)에서, 이들 기준은: (1) ≥70% 혈청방어율; (2) ≥40% 혈청전환율; 및/또는 (3) GMT의 ≥2.5배 증가이다. 고령자의 경우(≥60세), 이들 기준은: (1) ≥60% 혈청방어율; (2) ≥30% 혈청전환; 및/또는 (3) GMT의 ≥2배 증가이다. 이들 기준은 적어도 50명의 환자를 대상으로 한 공개 표식 연구에 기초한다.

치료는 단일 투약 스케쥴 또는 다중 투약 스케쥴에 의할 수 있다. 다중 투여량은 프라임 면역화 스케쥴 및/또는 부스트 면역화 스케쥴에서 사용될 수 있다. 다중 투약 스케쥴에서, 다양한 투여량이 동일하거나 상이한 경로, 예컨대 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 주어질 수 있다. 한 가지 투여량 이상의 투여(전형적으로 두 가지 투여량)는 특히 면역학적으로 경험이 없는 환자, 예컨대 이전에 인플루엔자 백신을 전혀 맞아보지 않은 사람들, 또는 새로운 HA 서브타입을 포함하는 백신에 유용하다. 다중 투여량은 전형적으로 적어도 1주 간격(예컨대 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 12주, 약 16주, 등)으로 투여될 것이다.

본 발명에 의해 제조된 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시에, 예컨대 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 컨쥬게이트된 H.influenzae 타입 b 백신, 불활성화 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 컨쥬게이트 백신(예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 폐렴구균 컨쥬게이트 백신 등과 실질적으로 동시에(예컨대 동일한 의학 자문 또는 의료 전문가나 예방접종 센터에 방문시에) 환자에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 및/또는 수막구균 백신과의 실질적으로 동시에 투여하는 것이 고령 환자에서 특히 유용하다.

유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대하여 활성인 항바이러스 화합물(예컨대, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)이 실질적으로 동시에(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 방문시에) 투여될 수 있다. 이들 항바이러스는 뉴라미다아제 억제제, 예컨대 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안하이드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산 및 이들의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 이들의 염(예컨대 포스페이트 염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산, 에틸 에스테르, 포스페이트(1:1)이며, 이는 오셀타미비르 포스페이트(TAMIFLU™)로도 알려져 있다.

일반

용어 "포함하는(comprising)"은 "포함(including)" 및 "구성된(consisting)"을 포괄하며 예컨대 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 구성될 수 있거나 또는 추가적인 무엇인가를 포함할 수 있으며, 예컨대 X+Y 이다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예컨대 Y가 "실질적으로 부재한" 조성물은 Y가 완전히 부재할 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

수치 x에 관한 용어 "약"은, 예를 들어 x±10%를 의미한다.

특별한 언급이 없다면, 둘 이상의 성분이 혼합되는 단계를 포함하는 방법은 특정 혼합 순서를 요하는 것이 아니다. 따라서 성분들은 어떠한 순서로 혼합될 수도 있다. 세 성분이 존재하는 경우, 두 성분이 서로 조합될 수 있고, 그 후 조합물이 제3 성분 등과 조합될 수 있다.

동물(및 특히 소) 물질이 세포 배양에 사용되는 경우, 감염성 해면상뇌증(TSE), 및 특히 소 해면상뇌증(BSE)이 부재한 공급원으로부터 획득하여야 한다. 전체적으로, 동물-유래된 물질이 전부 부재인 배양 세포가 바람직하다.

세포 기질이 재배열 또는 역유전학 과정에 사용되는 경우, 예컨대 Ph Eur general chapter 5.2.3에서와 같이 인간 백신 생산에 사용이 승인된 것이 바람직하다.

595명의 환자(남성 & 여성 어린이, 6 내지 ≤36 개월령)를 각각 35명 씩 17 그룹으로 나눈다. 각 그룹은 3가(A/H1N1, A/H3N2, B) 또는 4가(A/H1N1, A/H3N2, B/Victoria, B/Yamagata) 인플루엔자 백신 중 어느 하나를 맞는다. 백신은 0.5 ㎖ 부피(15 ㎍/투여량/주; 전체 45 ㎍ 또는 60 ㎍) 또는 0.25 ㎖ 부피(7.5 ㎍/투여량/주; 전체 22.5 ㎍ 또는 30 ㎍) 중 어느 하나로 투여된다. 그룹 중 하나는 시판되는 3가 불활성화 백신의 소아 투여량을 맞는다. 백신은 근육 내 주사로 주어지고, 미리-채워진 시린지 또는 바이알 중 어느 하나로 공급된다. 3개의 다른 아주번트 양(희석에 의해 달성된)을 시험한다.

3가 백신은 북반구에서 2008-2009의 인플루엔자 계절에 권유되었던 인플루엔자 주: A/브리스베인/59/2007-유사, A/브리스베인/10/2007-유사 바이러스, 및 B/플로리다/4/2006-유사를 포함한다. B/플로리다/4/2006-유사 바이러스는 B/Yamagata 계통이고, 따라서 4가 백신은 추가적으로 B/Victoria 계통인 B/Malaysia/2506/2004-유사 바이러스로부터 나온 항원을 포함하였다.

개체는 1일 및 29일 째에 백신의 두 가지 투여량을 받고(1일 째에 단일 투여량을 받는 두 개의 그룹 제외), 인플루엔자-특이적 면역 반응은 28일 및 50일 째에 바셀린에서 수집된 혈액을 분석함으로써(백신 접종 전) 평가한다. 혈청 샘플은 동종 및 이종변이체 주를 포함하는 인플루엔자 주 A/H1N1, A/H3N2 및 B에 대한 주-특이적 적혈구응집 억제(HI) 분석에 의해 평가된다.

따라서 17개 그룹은 하기와 같다:

나아간 연구에서, 357명의 환자(남성 & 여성, ≥65)를 8개 그룹으로 나눈다. 각각의 그룹은 수-중-스쿠알렌 에멀젼이 있거나 없는 3가 인플루엔자 백신(A/H1N1, A/H3N2, B)을 근육 내 주사(0.5 ㎖)로 맞는다. 백신은 미리-채워진 시린지로 제공된다. 3개의 다른 아주번트 양(희석에 의해 달성된)을 시험한다.

인플루엔자 주는 북반구에서 2008-2009의 인플루엔자 계절에 권유되었던 것과 같다: A/브리스베인/59/2007-유사, A/브리스베인/10/2007-유사 바이러스, 및 B/플로리다/4/2006-유사를 포함한다.

개체는 단일 투여량을 받고, 인플루엔자-특이적 면역 반응은 7일 째(8일) 및 21일 째(22일)에 백신 접종 후 바셀린에서 수집된 혈액을 분석함으로써 평가한다. 혈청 샘플은 인플루엔자 주 A/H1N1, A/H3N2 및 B에 대한 주-특이적 적혈구응집 억제(HI) 분석에 의해 평가된다. 또한 세포-매개 면역성 분석을 실시한다.

따라서 8개 그룹은 다음과 같다:

인플루엔자 A 주 모두에 대하여, 모든 세 가지 CHMP 기준이 환자 그룹 C-H(즉 아주번트 백신)에 대하여 만족했다. 인플루엔자 B 주에 대하여, 모든 세 가지 CHMP 기준이 4.88 ㎎ 스쿠알렌 또는 9.75 ㎎ 스쿠알렌을 맞은 그룹에서 만족했다. 비아주번트 백신을 맞은 그룹에서, 오직 하나의 CHMP 기준을 만족했지만, 2.44 ㎎ 스쿠알렌을 맞은 그룹에서 세 가지 CHMP 기준 중 두 가지를 만족했다.

따라서, 백신에서 스쿠알렌의 낮은 투여량도 인플루엔자 A 및 B 주에 대한 면역보호를 증가시킬 수 있다.

본 발명은 단지 예시의 방식으로 설명되었으며, 본 발명의 범주 및 정신 내에서 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

[참고문헌]

Claims

5세 이하의 환자에게서 면역 반응을 상승시키는데 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 백신으로서, 상기 백신은
(i) 헤마글루티닌 농도가 주 당 >12 ㎍/㎖인, 적어도 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌 농도가 <19 ㎎/㎖인, 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하고, 여기서 인플루엔자 B 바이러스 주는 B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주 및 B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항에 있어서, 0.2-0.3 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항에 있어서, 0.5 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 백신.
0.2-0.3 ㎖ 사이의 단위 투여량 부피를 갖는 인플루엔자 바이러스 백신으로서, 상기 백신은
(i) 헤마글루티닌의 농도가 주 당 >12 ㎍/㎖인, 적어도 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 주 및 적어도 두 개의 인플루엔자 B 바이러스 주에서 나온 헤마글루티닌; 및 (ii) 스쿠알렌 농도가 <19 ㎎/㎖인, 스쿠알렌을 포함하는, 미크론 이하 오일 액적을 갖는 수중유 에멀젼 아주번트를 포함하고, 여기서 인플루엔자 B 바이러스 주는 B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주 및 B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신.
제 1항 또는 제 4항에 있어서, 0.25 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 헤마글루티닌은 분해 비리온 또는 정제된 표면 항원의 형태이거나, 또는 인플루엔자 바이러스 항원은 비로솜의 형태인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) (i) H1N1 인플루엔자 A 바이러스 주; (ii) H3N2 인플루엔자 A 바이러스 주; (iii) B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주; 및 (iv) B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주로부터 나온 헤마글루티닌을 포함하는;
(b) 주 당 헤마글루티닌의 농도는 적어도 25 ㎍/㎖인;
(c) 스쿠알렌의 농도는 ≤10 ㎎/㎖인; 또는
(d) 백신에서 헤마글루티닌에 대한 스쿠알렌의 중량 비율은 20 내지 180의 범위인
것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 주 당 헤마글루티닌의 농도는 30 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서
(i) 스쿠알렌 농도는 9.75 ㎎/㎖ 또는 4.88 ㎎/㎖; 또는
(ii) 투여량 당 스쿠알렌의 양이 2.7 mg, 2.4 mg, 또는 1.2 mg
인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 백신의 단위 투여량에서 헤마글루티닌의 양은 주 당 7.5 ㎍인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서
(i) 헤마글루티닌의 농도는 조성물에서 각각의 주에 대하여 동일한;
(ii) 인플루엔자 바이러스 주는 난을 통해 통과하지 않는;
(iii) 백신은 수은 물질이 없고, 백신은 티오메살-부재인; 또는
(iv) 백신은 보존제가 없는
것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
미크론 이하 수중유 에멀젼 아주번트는 (i) 폴리소르베이트 80; (ii) α 토코페롤; 또는 (iii) 폴리소르베이트 80 및 α-토코페롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항에 있어서, 백신은
(a) 주 당 30 ㎍/㎖의 헤마글루티닌 농도, 9.75 ㎎/㎖의 스쿠알렌 농도, 및 0.5 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는, A/H1N1 주, A/H3N2 주, B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주, 및 B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주에 대한 4가 불활성화 인플루엔자 백신; 또는
(b) 주 당 30 ㎍/㎖의 헤마글루티닌 농도, 4.88 ㎎/㎖의 스쿠알렌 농도, 및 0.5 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는, A/H1N1 주, A/H3N2 주, B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주, 및 B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주에 대한 4가 불활성화 인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 또는 제 4항에 있어서, 백신은
(a) 주 당 30 ㎍/㎖의 헤마글루티닌 농도, 9.75 ㎎/㎖의 스쿠알렌 농도, 및 0.25 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는, A/H1N1 주, A/H3N2 주, B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주, 및 B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주에 대한 4가 불활성화 인플루엔자 백신; 또는
(b) 주 당 30 ㎍/㎖의 헤마글루티닌 농도, 4.88 ㎎/㎖의 스쿠알렌 농도, 및 0.25 ㎖의 단위 투여량 부피를 갖는, A/H1N1 주, A/H3N2 주, B/Yamagata/16/88-유사 인플루엔자 B 바이러스 주, 및 B/Victoria/2/87-유사 인플루엔자 B 바이러스 주에 대한 4가 불활성화 인플루엔자 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
백신이 적어도 50명 환자의 집단에 투여될 때, 백신은 다음 기준 (i) ≥70% 혈청방어율; (2) 혈청전환율이 ≥40% 또는 증가; 및 (3) 기하평균역가의 ≥2.5배 증가에서 1, 2, 또는 3개를 만족하는 효능을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신.
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