ES2370937T3 - Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina. - Google Patents

Abstract

Un método para fabricar la proteína de fusión de hemaglutinina, método que comprende infectar células de insecto cultivadas con un vector que contiene las siguientes secuencias en orden 5' -> 3': un promotor de polihedro procedente de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, una secuencia que codifica para un péptido señal de quitinasa, la secuencia que codifica para hemaglutinina procedente de una cepa de gripe A y una cepa de gripe B, una secuencia que codifica para la segunda proteína, un codón de terminación de la traducción, y una señal de poliadenilación de ARN de polihedro; y cultivar las células en un medio nutriente, en el que el péptido señal de quitinasa comprende los aminoácidos TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA, o la secuencia que codifica el péptido señal de quitinasa comprende los nucleótidos TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG.

Description

Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina.

Antecedentes de la invención

La presente invención se sitúa de manera general en el área de las vacunas recombinantes de la gripe.

La gripe epidémica se produce anualmente y es causa de una morbilidad y una mortalidad significativas en todo el mundo. Los menores son los que presentan la mayor tasa de ataque, y son los principales responsables de la transmisión de los virus de la gripe en la sociedad. Los mayores y las personas que padecen problemas de salud presentan un riesgo incrementado de padecer complicaciones y necesitar hospitalización tras una infección de gripe. Sólo en los Estados Unidos, se produjeron más de 10.000 muertes durante cada una de las siete temporadas de gripe en el periodo 1956-1988 debido a neumonía y gripe, y más de 40.000 muertes en cada una de dos temporadas (Actualización: Influenza Activity – United States and Worlwide, y Composition of the 1992-1993 Influenza Vaccine, Morbidity and Mortality Weekly Report. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 41/Nº

18: 315-323, 1992). Los virus de la gripe son partículas altamente pleomórficas compuestas por dos glicoproteínas superficiales, la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). La HA media en la unión del virus a la célula hospedante y en la fusión virus-membrana celular durante la penetración del virus en la célula. El genoma del virus de la gripe consta de ocho segmentos de ARN de sentido negativo de cadena sencilla, de los cuales el cuarto segmento en tamaño codifica el gen de HA. Los virus de la gripe se dividen en los tipos A, B y C, en base a diferencias antigénicas. Los virus de la gripe A se describen mediante una nomenclatura que incluye el subtipo o tipo, el origen geográfico, el número de cepa y el año de aislamiento, por ejemplo, A/Pekín/353/89. Existen al menos 13 subtipos de HA (H1-H13) y nueve subtipos de NA (N1-N9). Todos los subtipos se encuentran en aves, pero sólo los H1-H3 y los N1-N2 se dan en humanos, cerdos y caballos (Murphy y Webster, “Orthomyxoviruses”, en Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanock, R.M., 1091-1152 (Raven Press, Nueva York, (1990)).

Los anticuerpos de HA neutralizan el virus y forman la base de la inmunidad natural frente a la infección de gripe (Clements, “Influenza Vaccines”, en Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, páginas 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992)). La variación antigénica de la molécula de HA es la responsable de los brotes frecuentes de gripe y del limitado control de la infección mediante inmunización.

La estructura tridimensional de la HA y la interacción con su receptor celular, el ácido siálico, ha sido ampliamente estudiada (Wilson y col., “Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3Aº resolution”, Nature 289: 366-378 (1981); Weis y col., “Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid”, Nature, 333: 426-431 (1988); Murphy y Webster, 1990). La molécula de HA está presente en el virión en forma de trímero. Cada monómero existe en forma de dos cadenas, HA1 y HA2, unidas mediante un único enlace de disulfuro. Las células hospedantes infectadas producen un polipéptido precursor glicosilado (HAO) con un peso molecular de aproximadamente 85.000, que posteriormente se divide en HA1 y HA2.

La presencia de anticuerpo IgG e IgA neutralizante específico de la gripe está asociada a resistencia a la infección y a la enfermedad (Clements, 1992). Las vacunas de la gripe de virus entero desactivado o parcialmente purificado (subunidad de separación) están estandarizadas a la cantidad de HA de cada cepa. Las vacunas de la gripe habitualmente incluyen de 7 a 25 microgramos de HA de cada una de tres cepas de gripe.

El papel de la otra glicoproteína principal, la NA, en la inmunidad protectora de respuestas de anticuerpo o de células T contra la gripe no ha sido definido. La neuraminidasa es muy lábil al proceso de purificación y almacenamiento (Murphy y Webster, 1990) y la cantidad de NA en la vacuna previene la enfermedad en animales expuestos a la gripe (Johansson y col., “Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection”, J. Virology, 63: 1239-1246 (1989)). Una vacuna experimental basada en antígeno de neuraminidasa no resultó protectora en un ensayo con humanos (Orga y col., J. Infect. Dis. 135: 499-506 (1977)).

Las vacunas contra la gripe licenciadas consisten en preparaciones enteras desactivadas con formalina o de subunidades separadas químicamente de virus de dos subtipos de gripe A (H1N1 y H3N2) y de un subtipo de gripe

B. Antes de cada temporada de gripe, el U.S. Food and Drug Administration’s Vaccines and Related Biologicals Advisory Committe recomienda la composición de una vacuna trivalente contra la gripe para la nueva temporada. La vacuna de 1992-93 contenía los virus H1N1 tipo A/Texas/36/91, H3N2 tipo A/Pekín/353/89 y B/Panamá/45/90. La FDA ha aconsejado que la vacuna contra la gripe de 1993-94 debería contener las mismas cepas de Texas y Panamá y una nueva cepa de gripe A de Pekín (A/Pekín/32/92).

La vacunación de personas con riesgo elevado cada año antes de la temporada de gripe es la medida más eficaz para reducir el impacto de la gripe. Las limitaciones de las vacunas disponibles actualmente incluyen tasas de utilización bajas; baja eficacia en personas mayores y en niños pequeños; producción en huevos; variación antigénica y reacciones adversas.

El Centro para el Control de Enfermedad (“Center for Disease Control”, CDC) estima que menos del 30% de los

individuos de alto riesgo frente a la gripe son vacunados cada año (MMWR, 1992). Las vacunas desactivadas actuales alcanzan una elevada tasa de protección contra la enfermedad entre adultos sanos normales cuando los antígenos de la vacuna y los de la gripe en circulación están estrechamente relacionados. Entre los mayores, la tasa de protección contra la enfermedad es mucho menor, especialmente para aquellos que están institucionalizados (Clements, 1992). En un estudio reciente de Powers y Belshe, J. Inf. Dis. 167: 584-592 (1993), se observaron respuestas de anticuerpo significativas a una vacuna contra la gripe de subvirión trivalente en menos del 30 por ciento de los sujetos de 65 años o más.

Los virus de simiente para las vacunas de gripe A y B son cepas naturales que se replican con altos valores en la cavidad alantoica de huevos de pollos. Alternativamente, la cepa para el componente de gripe A es un virus reordenante con los genes antígenos superficiales correctos. Un virus reordenante es aquel que, debido a la segmentación del genoma vírico, tiene las características de cada cepa original. Cuando más de una cepa vírica de gripe infectan a una célula, estos segmentos víricos se mezclan para crear un virión de progenie que contiene varias clasificaciones de genes de ambos origines.

La protección con las vacunas actuales contra la gripe, totales o de división, es de vida corta y decae según se produce la deriva antigénica en las cepas epidémicas de gripe. Los virus de la gripe sufren una deriva antigénica como resultado de la selección inmune de virus con cambios en la secuencia de aminoácidos en la molécula de hemaglutinina. Idealmente, las cepas de la vacuna coinciden con las cepas del virus de la gripe que provoca la enfermedad. El proceso actual de fabricación de vacunas de la gripe, sin embargo, está limitado por la propagación del virus en huevos de pollo embrionado. No todas las cepas de virus de la gripe se replican bien en huevos; por tanto los virus deben adaptarse o se deben construir reordenamientos víricos. En la hemaglutinina de los virus cultivados en huevo se produce una heterogeneicidad extensiva, en comparación con los elementos aislados primarios de los individuos infectados cultivados en células de mamífero (Wang y col., Virol. 171: 275-279 (1989); Rajakumar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4154-4158 (1990)). Los cambios en la HA durante la selección y fabricación de vacunas de la gripe puede dar como resultado una mezcla de subpoblaciones antigénicamente distintas del virus. Los virus de la vacuna pueden, por lo tanto, diferir de las variantes presentes en las cepas epidémicas, dando como resultado niveles de protección no óptimos.

En personas que tengan una alergia grave al huevo se pueden producir reacciones inmediatas de hipersensibilidad debido a la presencia de proteína de huevo residual en la vacuna. La vacuna contra la gripe porcina de 1976 se asoció a un aumento de la frecuencia del síndrome de Guillain-Barré. De momento, no se ha observado que las vacunas posteriores preparadas a partir de otras cepas de gripe hayan aumentado la probabilidad de padecer esta enfermedad rara.

Un método para producir una vacuna contra la gripe que no requiere la propagación en huevos daría como resultado un producto más puro que tendría menos probabilidad de causar una reacción inmune adversa. Adicionalmente, una preparación de vacuna más pura no requeriría la desactivación del virus o una extracción orgánica de los componentes de la membrana vírica, evitando con ello la desnaturalización de epítopos antigénicos y preocupaciones de seguridad debidas a productos químicos residuales presentes en la vacuna.

Además, una vacuna contra la gripe producida en ausencia de propagación en huevo evitaría la heterogeneicidad genética que se produce durante la adaptación y el paso a través de los huevos. Esto daría como resultado una vacuna que se ajusta mejor a las cepas de gripe epidémicas, dando como resultado una mejor eficacia.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir una vacuna contra la gripe que no requiera de replicación en huevos.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método de producción de una vacuna contra la gripe que sea rápida y económica, altamente purificada y que permita la producción de vacunas a partir de fuentes primarias de gripe.

El artículo Virus Research (1986) 5: 43-59 describe la expresión en la superficie celular de hemaglutinina de virus de la gripe en células de insecto usando un vector de baculovirus. El artículo J. Gen. Virol. (1987) 68: 1233-1250 describe el uso de vectores de baculovirus para la expresión del gen de hemaglutinina de gripe A en células de Spodoptera frugiperda. El artículo EMBO J. (1986) 5: 1359-1366 describe la expresión de hemaglutinina de virus de la gripe (plaga aviar) en células de S. frugiperda mediante un vector de baculovirus, y la inmunización de pollos con células de S. frugiperda que expresan la hemaglutinina. El documento EP0546787 describe la expresión en un sistema de baculovirus en células Sf9 de una secuencia de hemaglutinina de 1,75 kb o de una proteína quimérica que comprende epítopos de VIH insertados en el gen de hemaglutinina. El artículo Virology (1994) 202: 586-605 describe la secuencia de ADN completa del virus de polihedrosis nuclear de baculovirus de Autographa califórnica (AcNPV).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para fabricar una proteína de fusión de hemaglutinina, un método para fabricar un vector, una proteína recombinante de fusión de hemaglutinina de la gripe y una composición de vacuna

tal como se define en las reivindicaciones anexas.

Se proporciona un método para preparar una proteína recombinante de hemaglutinina de gripe mediante expresión en células de insecto usando un sistema de expresión de baculovirus. La proteína resultante es útil para fabricar una vacuna multivalente contra la gripe basada en una mezcla de antígenos recombinantes de hemaglutinina clonados de virus de la gripe que tienen potencial epidémico. Las proteínas recombinantes de hemaglutinina son glicoproteínas no divididas (HA0), de longitud completa, que incluyen ambas subunidades HA1 y HA2 (HAO) purificadas en condiciones no desnaturalizantes hasta una pureza de un 95% o superior, preferiblemente una pureza del 99%.

También se describe un proceso para clonar genes de hemaglutinina de gripe procedentes de virus de la gripe A y B usando sondas de oligonucleótido diseñadas específicamente y metodología de reacción en cadena de polimerasa (PCR). En la realización preferida, los genes de HA clonados se modifican mediante eliminación de los nucleótidos que codifican las secuencias de péptido señal hidrofóbico natural, y sustitución con un nuevo péptido señal de baculovirus, para producir una secuencia que codifica el péptido señal que corta inmediatamente la hemaglutinina. Estos genes quiméricos se introducen en vectores de expresión de baculovirus de tal modo que el promotor de polihedrina de baculovirus dirige la expresión de proteínas recombinantes HA en células de insecto infectadas. El péptido señal de baculovirus de 18 aminoácidos dirige la traducción de rHA en el mecanismo de glicosilación de la célula de insecto y no está presente en la glicoproteína rHA madura. En la realización preferida, se diseña un vector que no codifica ningún aminoácido interviniente entre el péptido señal y la proteína de hemaglutinina.

Se puede extender esta metodología a todos los tipos de virus de la gripe, incluyendo, aunque sin limitación, el subtipo prevalente A (H1N1), el subtipo A(H3N2) y el tipo B que infecta humanos, así como los virus de la gripe que infectan otras especies de mamíferos y de aves.

Se describe una estrategia general para la extracción y la purificación eficientes de proteína HA recombinante producida en células de insecto, para la purificación de proteínas rHA procedentes de virus de la gripe de los subtipos A y del tipo B. La vacuna recombinante puede desarrollarse a partir de fuentes primarias de gripe, por ejemplo, secreciones nasales de individuos infectados, más que de virus adaptados y cultivados en huevos de pollos. Esto permite un rápido desarrollo de la vacuna directamente a partir de las cepas epidémicas de gripe, y evita los problemas que surgen de la adaptación del virus para su cultivo en huevos, así como la reacción del paciente frente a contaminación de huevo en la vacuna resultante.

Los ejemplos demuestran la formulación y la eficacia clínica de la vacuna en una forma de dosis de inmunización que incluye antígenos de rHA purificados procedentes de tres cepas de virus de la gripe recomendadas por la FDA para las temporadas epidémicas 1993/1994 y 1994/1995. Se midió la inmunidad funcional usando ensayos que cuantifican anticuerpos que se unen a hemaglutinina de gripe, que bloquean la capacidad del virus de la gripe para aglutinar células sanguíneas rojas, o que neutralizan el virus de la gripe. Se midieron las respuestas inmunes protectoras con vacunas de rHA en animales que son susceptibles a la infección de gripe, o en estudios de exposición de humanos.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 es un esquema de la clonación de genes HA de cepas de gripe A procedentes de preparaciones de ARN víricas purificadas, de la purificación de rHA expresada y de la caracterización biológica de rHA. Abreviaturas: FDA, Administración de Alimentos y Fármacos o “Food and Drug Administration”; MDCK, riñón canino Madin Darby o “Madin Darby Canine Kidney”; TPCK, tosilfenilalanil clorometilcetona; ARN, ácido ribonucleico; ADNc, ácido desoxirribonucleico complementario; HA, hemaglutinina; FBS, suero fetal bovino; PCR, Reacción en cadena de polimerasa; y BV, Baculovirus.

La Figura 2 es un esquema más detallado del método de la Figura 1 aplicado a la clonación y la expresión del gen de HA de la cepa de gripe A/Texas/36/91. El gen de HA de gripe se obtuvo a partir de ARN purificado procedente de células MDCK infectadas con gripe A/Texas/36/91 usando transcriptasa inversa y un cebador universal (SEC ID Nº: 1) seguido de dos rondas de amplificación mediante PCR y clonación. Tal como se muestra, en la primera ronda de reacciones PCR se usaron el cebador de extremo 5’ SEC ID Nº: 2 y el cebador de extremo 3’ SEC ID Nº: 3. En la segunda ronda de reacciones PCR, se usaron el cebador de extremo 5’ SEC ID Nº: 4 y el cebador de extremo 3’ SEC ID Nº: 5. Se construyó un vector de recombinación de baculovirus que contenía el promotor de polihedrina y una secuencia de péptido señal procedente del gen de baculovirus de 61K (un gen de baculovirus que codifica un péptido señal que tiene un peso molecular de aproximadamente 61.000), seguido de las secuencias de codificación completas para la proteína HA madura. Este vector de recombinación se usó a continuación para fabricar un vector de expresión de baculovirus que produce HA a partir de esta cepa del virus.

La Figura 3 es un gráfico de la respuesta inmune anti-HA en ratones, día 42, n=5, que representa el título de anticuerpos para rHA0-puro; vacuna Fluzone® y rHA0-alum, a dosis de 0,5 μg (barras oscuras), 0,1 μg (barras sombreadas), 0,02 μg (barras punteadas) y 0,004 μg (barras huecas).

Las Figuras 4a, 4b y 4c son gráficos de la respuesta inmune anti-Ha en ratones inmunizados con rHA o con vacuna

trivalente licenciada, fórmula de 1994-1995, semanas después de la vacunación frente a título de HIA, para HAI A/Texas/36/91 (Figura 4a), HAI A/Shangdong/9/93 (Figura 4b), y HAI B/Panamá/45/90 (Figura 4c), rHA (diamantes) y vacuna FLUVIRON® atenuada cultivada en huevos (cuadrados).

Descripción detallada de la invención

Se describe un método para preparar una vacuna recombinante contra la gripe. Se produce un antígeno de hemaglutinina sin dividir (HA0) de longitud completa a partir de un virus de la gripe con vectores de expresión de baculovirus en células de insecto cultivadas y se purifica en condiciones no desnaturalizantes. Se mezclan dos o más antígenos de hemaglutinina purificados procedentes de cepas de gripe A y/o B para producir una vacuna multivalente contra la gripe. Los antígenos recombinantes pueden combinarse con un vehículo adyuvante para aumentar la eficacia.

El uso de tecnología de ADN recombinante para producir vacunas contra la gripe ofrece varias ventajas: una vacuna contra la gripe de ADN recombinante puede producirse en condiciones más seguras y más controlables; no se requiere la propagación con gripe infecciosa en huevos; la proteína recombinante HA puede purificarse más eficazmente, eliminando de forma virtual los efectos secundarios debidos a la presencia de proteínas contaminantes; los procedimientos de purificación para HA recombinante no tienen que incluir la desactivación del virus o la extracción orgánica de componentes de la membrana vírica, evitando con ello la desnaturalización de antígenos y otras preocupaciones de seguridad debidas a la presencia de productos químicos residuales en la vacuna; la producción de HA mediante tecnología de ADN recombinante proporciona una oportunidad para evitar la heterogeneicidad genética que se produce durante la adaptación y el paso a través de los huevos, lo que debería posibilitar un mejor ajuste de las cepas de la vacuna a las cepas epidémicas de gripe, dando como resultado una mejora de la eficacia; y una estrategia recombinante también puede permitir la selección de la cepa más tarde en el calendario, permitiendo con ello tiempo para realizar selecciones en base a datos epidemiológicos más fiables.

Sistema de expresión de baculovirus

Los baculovirus son virus de ADN de la familia Baculoviridae. Se sabe que estos virus tienen un espectro de hospedante estrecho que se limita principalmente a especies Lepidópteras de insectos (mariposas y polillas). El baculovirus Virus de Polihedrosis Nuclear de Autographa californica (AcNPV), que se ha convertido en el prototipo de baculovirus, se replica de manera eficiente en células susceptibles de insecto cultivadas. El AcNPV tiene un genoma de ADN circular cerrado de doble cadena de aproximadamente 130.000 pares base y está bien caracterizado en cuanto a espectro de hospedantes, biología molecular y genética.

Muchos baculovirus, incluyendo el AcNPV, forman grandes oclusiones cristalinas de proteínas dentro del núcleo de las células infectadas. Un único polipéptido, denominado polihedrina, constituye aproximadamente el 95% de la masa proteica de estos cuerpos de oclusión. El gen para la polihedrina está presente como una copia sencilla en el genoma vírico del AcNPV. Debido a que el gen de polihedrina no es esencial para la replicación del virus en las células cultivadas, puede modificarse fácilmente para expresar genes externos. La secuencia del gen externo es insertada en el gen de AcNPV justo en posición 3’ respecto a la secuencia promotora de polihedrina, de tal modo que se encuentra bajo el control transcripcional del promotor de polihedrina.

Los baculovirus recombinantes que expresan genes externos se construyen mediante recombinación homóloga entre ADN de baculovirus y plásmidos quiméricos que contienen la secuencia génica de interés. Los virus recombinantes se pueden detectar en virtud de su morfología de plaqueta distinta y se pueden purificar mediante plaqueta hasta homogeneidad.

Los baculovirus son particularmente adecuados para uso como vectores de clonación y de expresión eucarióticos. Generalmente son seguros debido a su estrecho espectro de hospedantes, que se restringe a los artrópodos. La Agencia de Protección Ambiental de EE.UU. (EPA) ha aprobado el uso de tres especies de baculovirus para el control de plagas de insectos. El AcNPV se ha aplicado a cultivos durante muchos años bajo Permisos de Uso Experimental de la EPA.

Los virus de AcNPV naturales y recombinantes se replican en una variedad de células de insecto, que incluyen líneas celulares continuas derivadas del gusano soldado otoñal, Spodoptera frugiperda (Lepidóptera; Noctuidae). Las células de S. frugiperda tienen un tiempo de doblado de población de 18 a 24 horas y pueden propagarse en cultivos de monocapa o de suspensión libre.

Las proteínas HA recombinantes pueden producirse, aunque sin limitación, en células derivadas de la especie Lepidóptera Spodoptera frugiperda. También se podrían usar otras células de insecto que pueden ser infectadas por baculovirus, tales como las de las especies Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni o Lamanthria dispar, como sustrato adecuado para producir proteínas HA recombinantes.

La línea celular hospedante preferida para la producción de baculovirus recombinantes es la Sf900+. Otra línea celular hospedante para la producción de proteína a partir de baculovirus recombinantes es la Sf9. La Sf900+ y Sf9 son líneas celulares continuas no transformadas no tumorogénicas derivadas del gusano soldado otoñal,

Spodoptera frugiperda (Lepidóptero; Noctuidae). Las células Sf900+ y Sf9 se propagan a 28±2ºC sin suplemento de dióxido de carbono. El medio de cultivo usado para las células Sf9 es TNMFH, una mezcla simple de sales, vitaminas, azúcares y aminoácidos, suplementada con suero fetal bovino al 10%. Aparte del suero fetal bovino, en la propagación celular no se usa ningún otro producto derivado de animal (es decir, tripsina, etc.). También se puede usar medio de cultivo libre de suero (disponible como medio de cultivo de Sf900, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) para cultivar células Sf9, y es preferible para la propagación de células de Sf900+.

Las células Sf9 tienen un tiempo de duplicado de población de 18-24 horas y se pueden propagar en cultivos monocapa o de suspensión libre. No hay datos que indiquen que las células de S. frugiperda apoyen la replicación de cualquier virus de mamífero conocido.

Los especialistas en la técnica entenderán que el vector de expresión no está limitado a un sistema de expresión de baculovirus. Las proteínas HA recombinantes también pueden expresarse en otros vectores de expresión tales como los virus Entomopox (virus de la viruela de insectos), virus de polihedrosis citoplásmica (CPV) y transformación de células de insecto con expresión constitutiva del gen o genes de HA recombinante.

Aislamiento de cepas de gripe

Se aíslan una o más cepas de gripe a partir de individuos infectados con la enfermedad. Preferiblemente, las cepas de gripe son aquellas identificadas por la FDA o por el CDC con potencial epidémico para la siguiente temporada de gripe. Una ventaja del método descrito en la presente memoria es que se pueden usar muestras clínicas, tales como secreciones nasales de pacientes infectados con gripe, como fuente directa de virus. Alternativamente, se pueden obtener de la FDA o del CDC.

Propagación de cepas de gripe.

Las cepas se propagan a continuación en células que producen títulos elevados de virus, tal como células de riñón canino Madin Darby (MDCK) (disponibles en la American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC CCL34). Por ejemplo, se infectan células MDCK en presencia de concentraciones de tosilfenilalanil clorometilcetona (TPCK), tripsina parcialmente desactivada y suero fetal bovino optimizadas para producir los mayores títulos de virus de primer pasaje. Las células MDCK se infectan con las cepas de gripe con una baja multiplicidad de infección (de 0,1 a 0,5) tal como se determina mediante un ensayo de HA estándar (Rosen, “Hemagglutination with Animal Viruses” en Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel y N.P. Salzman, páginas 276-28 (Academic Press, Nueva York 1969). Las células infectadas se incuban a 33ºC durante 48 horas, y los medios son evaluados para la producción de virus usando el ensayo de actividad de hemaglutinación. A continuación, se usan las condiciones que producen la mayor actividad de HA para preparar grandes cantidades de virus de la gripe.

Purificación del virus

Las partículas víricas producidas a partir del primer pasaje son purificadas del medio usando un método de purificación conocido tal como la centrifugación de gradiente de densidad de sacarosa. Por ejemplo, el virus se cosecha 24-48 horas después de la infección mediante medio de centrifugación de células MDCK infectadas con gripe. La partícula vírica resultante se vuelve a suspender en tampón y se centrifuga a través de un gradiente de sacarosa tamponado. La banda de virus de la gripe se recolecta de la región del 40-45% de sacarosa del gradiente, se diluye con tampón y se convierte en partícula mediante centrifugación a 100.000 x g. La partícula de virus purificada se vuelve a suspender en tampón y se almacena a -70ºC.

Clonación de genes de hemaglutinina de gripe

En la Figura 1 se proporciona una visión general de los métodos para la clonación de genes de HA. Básicamente, las células son infectadas con la cepa de gripe que se va a clonar. El virus es recolectado del medio celular y se aísla el ARN vírico, para las cepas de gripe a, o el ARNm, para las cepas de gripe B. El ARN vírico (-ARN) es extraído de viriones purificados y se analiza en geles de agarosa de formaldehido usando procedimientos estandarizados. El ADNc se sintetiza usando un sistema de cebadores universal para el ARN vírico para las cepas de gripe A, o cebadores aleatorios para el ARNm de cepas de gripe B. Se prepara más ADN complementario (ADNc) estándar usando un cebador de oligonucleótido universal (5’-AGCAAAAGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 1)) que es homólogo a todos los segmentos de ARN de hemaglutinina en los virus de gripe A y B (Davis y col., “Construction and characterization of a bacterial clone containing the hemaglutinin gene of the WSN strain (H0N1) of influenza virus” Gene, 10: 205-218 (1980)). Los cebadores se diseñan homólogos a regiones conservadas en los extremos 5’ y 3’ de los genes de hemaglutinina de gripe. Ambos cebadores 5’ y 3’ también presentan sitios enzimáticos de restricción en los extremos que no se dan en los genes de hemaglutinina.

Se mezclan los cebadores de gripe A o B y el ADNc de gripe apropiados y se amplifican los segmentos de gen de hemaglutinina usando procedimientos de PCR estándares. Los fragmentos de ADN de cadena doble resultantes contienen secuencias codificadoras de hemaglutinina madura completas. Se usa la reacción en cadena de polimerasa (“PCR”) para amplificar el gen de HA total, que a continuación es clonado en un hospedante bacteriano adecuado tal como E. coli. Los extremos 5’ son secuenciados para identificar el péptido señal de los genes de HA, a

continuación se usa PCR para amplificar los genes de HA menos el péptido señal. A continuación éste es subclonado en un vector de transferencia de plásmido que contiene el promotor de polihedrina AcNPV. Los vectores de transferencia resultantes contienen las siguientes secuencias 5’ -> 3’: promotor de polihedrina del baculovirus A. califórnica NPV, un codón de inició de la traducción ATG, un péptido señal de baculovirus de 61K, las secuencias codificadoras para la hemaglutinina madura, el codón de terminación de la traducción de hemaglutinina natural, la señal de poliadenilación de ARN de polihedrina y ADN flanqueante de baculovirus.

Entonces se mezcla un ADN de plásmido de transferencia quimérico purificado que contiene un gen de hemaglutinina con ADN de AcNPV natural, se co-precipita con calcio y se transfecta en células de S. frugiperda. Se seleccionan baculovirus recombinantes en base a la morfología de placa y se purifican mediante rondas adicionales de purificación de placa. Los baculovirus recombinantes clonados son escrutados en relación a la expresión de hemaglutinina y se selecciona un vector de expresión de baculovirus único para producir un Banco de Virus Maestro.

Cepas de gripe A:

Los genes de HA procedente de cepas de gripe A son clonados a partir de preparaciones de ARN vírico purificadas. El ARN vírico se extrae de 100-200 microlitros de viriones de gripe A purificados que contienen 1.000-2.000 unidades de hemaglutinina (UHA) de gripe. Una UHA es la cantidad de virus que aglutina el 50% de las células sanguíneas rojas en el ensayo estándar de aglutinación (Rosen, 1969). Los viriones son tratados con proteinasa K para digerir la proteína, a continuación el ARN vírico es extraído con volúmenes iguales de fenol y cloroformo, y es precipitado con etanol en presencia de vehículo de ARNt. El ARN vírico se vuelve a suspender en tampón y se digiere con ADNasa libre de ARNasa para eliminar cualquier ADN contaminante, después se repiten las etapas de extracción y precipitación. A continuación se analiza el ARN vírico (ARNv) usando geles de agarosa de formaldehido, tal como se describe en Maniatis y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” pág. 86-96 y 366367 (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring, N.Y. 1982).

Cepas de gripe B:

Los genes de HA procedentes de cepas de gripe B son clonados a partir de ARN mensajero (ARNm) total extraído de células infectadas con la cepa de gripe B. A continuación el ARN total es extraído de las células infectadas. Las células recolectadas son lisadas en presencia de tiocianato de guanidinio y el ARN celular total es purificado usando, por ejemplo, el kit de extracción de ARN de Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ). El ARNm total es extraído a partir de ARN celular usando columnas de giro de oligo-(dT)-celulosa usando, por ejemplo, el kit de purificación de ARNm de Pharmacia Biotech Inc.

Expresión y procesado de hemaglutinina recombinante en células de insecto

Los antígenos de hemaglutinina recombinante se expresan en niveles elevados en células de S. frugiperda infectadas con vectores de hemaglutinina de AcNPV. El producto génico primario es hemaglutinina (rHA0) de longitud completa sin procesar y no es secretado, sino que permanece asociado a membranas periféricas de células infectadas. Este HA0 recombinante es una proteína con un peso molecular de 68.000 que está glicosilada con glicanos de tipo manosa superior ligados mediante N distintos de los glicanos producidos por la expresión de las proteínas víricas en células de mamífero o de ave. Existen evidencias de que la rHA0 forma trímeros post-traducción que se acumulan en las membranas citoplásmicas.

Vectores para la expresión de HA0 y otras proteínas

La HA0 es una vacuna mejor debido a su estabilidad superior en comparación con el complejo HA1/HA2, y mantiene un plegamiento correcto durante la purificación y el almacenamiento. La estabilidad superior es particularmente evidente en las cepas B, dando como resultado títulos que son aproximadamente cinco veces más altos que los obtenidos con cepas B atenuadas disponibles comercialmente.

Tal como se describe más adelante en los ejemplos, cuando los genes de HA fueron clonados en pMGS12 a través de sitios de restricción, el péptido señal maduro de HA fue eliminado y reemplazado con el péptido señal de quinitasa de baculovirus, denominado péptido señal de 61 kD. Puesto que el gen de HA está conectado al péptido señal a través de un sitio de ruptura, existen entre tres y cinco aminoácidos, dependiendo del sitio de restricción seleccionado, entre la proteína HA0 madura y el péptido señal de 61 kD. Aunque no es un problema con las cepas A de la gripe, la cepa B HA0 expresada con los aminoácidos adicionales no se pliega de la forma apropiada.

Se desarrollaron dos vías para solventar este problema. La primera es el uso de un nuevo vector, pMGS3, que no codifica el péptido señal de 61 kD. La HA0 con su péptido señal nativo es clonada en el vector y es expresada. Una vez caracterizada mediante SDS-PAGE, la HA0 de cepa B expresada en dicho vector muestra una mejor glicosilación y un mejor procesado que cuando se expresa en pMGS12. La HA0 se plegó tan bien que puede convertirse cuantitativamente en HA1/HA2. Desafortunadamente, según se determinó mediante análisis de transferencia Western, el rendimiento no es muy elevado. El segundo método aumenta el rendimiento usando el péptido señal de 61 kD en pMGS12 para guiar la expresión donde el gen de HA0 fue insertado sin el uso de enzimas de restricción. El nuevo vector, que incluye el péptido señal de 61 kD y el gen de HA0, sin aminoácidos intervinientes

extraños que codifiquen una secuencia, recibe la designación pMGS27.

El pMGS27 puede usarse para clonación y expresión de cualquier gen en un sistema de expresión de baculovirus. El gen diana, en lugar de ser clonado en el vector mediante restricción y ligación, es clonado en el vector mediante maduración. Los reactivos se encuentran disponibles en Clontech en su sistema de clonación PCR-direct. El pMGS27 fue diseñado de tal modo que se puede linealizar en el extremo de la región codificadora de péptido señal de quitinasa, y se pueden crear dos colas de cadena sencilla largas mediante tratamiento del pMGS27 linealizado con ADN polimerasa T4 más dATP.

El gen diana es amplificado usando reacción en cadena de polimerasa (“PCR”) o PCR de transcriptasa inversa (“RT-PCR”) con un par de oligonucleótidos diseñados para crear colas de cadena sencilla que sean complementarias a las colas del pMGS27 tratado, después de que el fragmento de PCR haya sido tratado con ADN polimerasa T4 y dTTP. A continuación una simple maduración puede combinar las dos moléculas en un plásmido circular que está preparado para transformar el hospedante. Además de ser más rápido y sencillo que el método tradicional de restricción-ligación para la clonación de un gen de HA en pMGS12, el pMGS27 presenta la importante ventaja de que no produce aminoácidos extra codificados por los sitios de restricción creados entre el péptido señal de quitinasa y la proteína HA madura. Estos aminoácidos extra a veces pueden originar dificultades tales como que la peptidasa señal no se pliegue correctamente, como en el caso de la HA de cepa B.

Purificación de HA0 recombinante

Varios días después de la infección la rHA0 se puede extraer selectivamente de las membranas periféricas de células infectadas con hemaglutinina de AcNPV empleando un detergente no iónico no desnaturalizante u otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica para la purificación de proteínas recombinantes procedentes de células de insecto, que incluyen, aunque sin limitación, cromatografía de afinidad o de gel y unión de anticuerpos. La rHA0 soluble en detergente puede ser purificada adicionalmente usando intercambio iónico de DEAE y cromatografía de afinidad de lentil lecitina, u otros métodos equivalentes conocidos por los especialistas en la técnica.

En una realización preferida, la rHA0 se purifica usando un procedimiento que es más suave y que da como resultado una mayor producción de rHA0 a partir de cepas B de gripe. Este procedimiento generalmente es como se indica a continuación:

La proteína HA0 que forma una parte integral de la membrana de las células de insecto es separada de las proteínas solubles, de las proteínas de membrana periférica y de la mayoría del ADN y ARN mediante extracción de las células en una disolución alcalina relativamente viscosa, en donde un pH alcalino se define para un valor entre 9,5 y 10,5. La viscosidad aumenta a través de la inclusión de sacarosa en una concentración aproximadamente 250 mM. Se incluye un agente reductor de disulfuro, por ejemplo �-mercaptoetanol, en una concentración eficaz para prevenir enlaces de disulfuro entre las proteínas de la mezcla. Las células se vuelven a suspender en el tampón de extracción, se homogeneízan y a continuación se centrifugan. La partícula se lava mediante homogeneización en un tampón de baja fuerza iónica que contenga un agente reductor de disulfuro a un pH alcalino (la conductividad generalmente es inferior a 1 mS, pH 10,5) y la partícula se centrifuga. Entonces se extrae la HA0 de la partícula en un tampón que contiene entre 0,3 y 1,5% de un detergente tal como Triton, una cantidad de agente de desagregación para prevenir la formación de complejos por interacciones de carga, tal como entre 0,3 y 1,0 M de betaína o paurina, a un pH alcalino (9,5 es el preferido). La HA0 del sobrenadante es purificada a continuación mediante cromatografía de intercambio aniónico, seguida de cromatografía de intercambio catiónico. La HA0 se aplica a la columna de intercambio aniónico, por ejemplo, DEAE o Q-Sepharose® (una columna de esferas de agarosa con grupos amino cuaternarios), en el mismo tampón de la extracción pero diluido al menos 1:2 con tampón adicional, tras equilibrar la columna en tampón que contiene aproximadamente 1/10º de la concentración de detergente y agente reductor de disulfuro. A continuación la HA0 es eluída disminuyendo el pH hasta aproximadamente 8,5. La HA0 eluída se aplica a una columna de intercambio catiónico en esencialmente el mismo tampón. Los contaminantes son eluídos disminuyendo el pH hasta aproximadamente 7,4, eluyendo después la HA0 mediante un aumento de la concentración salina hasta 0,15 M de NaCl.

Este método preferido para la purificación se describe en detalle como se indica a continuación.

Preparación de la fracción de membrana que contiene HA recombinante. Se suspenden células que expresan HA recombinante (6,2 g de células procedentes de 0,34 L de cultivo) a una concentración de 100 mg/mL en una disolución enfriada en hielo de pirofosfato sódico 100 mM, cloruro sódico 100 mM, sacarosa 250 mM, 0,1% de �mercaptoetanol, pH 10,5. Las células son alteradas mediante disrupción en un homogeneizador Polytron® (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY) fijado en 4 durante 2 minutos. Se necesita un pH alcalino del medio de homogeneización para aumentar la solubilidad de las proteínas contaminantes y para aumentar la pureza de la preparación de membrana. El homogenato se centrifuga durante 30 minutos a 9.200 g. El sobrenadante se descarta y se recolecta la partícula. La preparación de la fracción de membrana viene seguida de una etapa de lavado de baja fuerza iónica. Se vuelve a suspender la partícula hasta el volumen original en la disolución enfriada en hielo de

�-mercaptoetanol al 0,1%, 10,5, y se homogeneíza usando un homogeneizador Polytron® fijado en 4 durante 2 minutos. El homogenato se centrifuga durante 30 minutos a 9.200 g. El sobrenadante se descarta y la partícula es

recolectada. El lavado de baja fuerza iónica elimina la porción adicional de proteínas de membrana periférica. La preparación de la fracción de membrana da como resultado un considerable enriquecimiento en HA recombinante, y de la eliminación de ácidos nucleicos contaminantes.

Extracción de la HA recombinante. La HA recombinante se extrae entonces de forma selectiva de la partícula de membrana en unas condiciones que no desnaturalicen el antígeno. La partícula de membrana se homogeneíza en 41 mL de una disolución enfriada en hielo de etanolamina 10 mM, pH 9,5, Triton N101 al 1%, �-mercaptoetanol al 0,1%, NaCl 25 mM, betaína 400 mM usando un homogeneizador Polytron fijado en 4 durante 2 minutos. Tras una incubación de 40 minutos a 23ºC la mezcla se centrifuga durante 30 minutos a 9.200 g. El sobrenadante que contiene HA recombinante se decanta y se diluye a la mitad con el mismo tampón.

Se analizan las proteínas mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. Las muestras son sometidas a disrupción en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS) al 2% y un 5% de �-mercaptoetanol, a continuación se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de un 0,1% de SDS, y entonces se tiñen con azul de Coomassie.

Purificación cromatográfica. La purificación cromatográfica de la HA recombinante se simplificó y se eliminó la cara cromatografía de afinidad sobre Lentil Lectina Sepharose del proceso, sustituyéndola por un proceso de purificación cromatográfica en dos etapas que da como resultado un antígeno de HA recombinante altamente purificado que no está desnaturalizado y que es adecuado como componente de una vacuna contra la gripe de uso humano. Las matrices de gel de cromatografía usadas son Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow® y CM-Sepharose Fast Flow®.

Cromatografía de intercambio aniónico. Todas las cromatografías se llevan a cabo a temperatura ambiente. El extracto que contiene HA recombinante preparado como se ha descrito anteriormente es aplicado con un caudal de 1 mL/min a Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow® (5 mL en una columna Pharmacia C10/10) equilibrada con etanolamina 10 mM pH 9,5, Triton® N101 al 0,1%, �-mercaptoetanol al 0,01%, NaCl 25 mM y betaína 400 mM. A continuación la columna se lava con el tampón de equilibrado hasta que la absorbancia de UV del efluente vuelve a la línea base. En estas condiciones la HA recombinante se une a la columna a la vez que parte de los contaminantes son arrastrados. A continuación la HA recombinante parcialmente purificada es eluída con dietanolamina 30 mM pH 8,5, Triton® N101 al 0,1%, �-mercaptoetanol al 0,01%, NaCl 25 mM y betaína 400 mM.

Cromatografía de intercambio catiónico. El eluato de Q-Sepharose (23 mL) se diluye a la mitad con dietanolamina 30 mM pH 8,5, Triton® N101 al 0,1%, �-mercaptoetanol al 0,01%, NaCl 10 mM y betaína 400 mM. Entonces la columna es lavada con 35 mL de fosfato sódico 10 mM pH 7,4, Triton® N101 al 0,1%, �-mercaptoetanol al 0,01%, NaCl 10 mM y betaína 400 mM. Este tratamiento eluye los contaminantes de la columna a la vez que la HA recombinante permanece ligada a la CM Sepharose. A continuación se elimina el detergente mediante lavado de la columna con fosfato sódico 10 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, hasta que la absorbancia de UV del efluente retorna a la línea base. La HA recombinante purificada es eluída con disolución salina de tampón de fosfato, pH 7,5 (PBS).

La rHA0 purificada se vuelve a suspender en una disolución tamponada isotónica. Después de la eliminación del detergente, la rHA0 purificada aglutinará de forma eficiente células sanguíneas rojas.

Propiedades estructurales y biológicas de la HA0 recombinante

La rHA0 se purifica hasta al menos un 95% de pureza, más preferiblemente un 99% de pureza. Ésta migra predominantemente como un único polipéptido principal de 68.000 de peso molecular en gel de poliacrilamida-SDS. La estructura cuaternaria del antígeno de HA0 recombinante purificado se examinó mediante microscopía electrónica, resistencia a tripsina, análisis de sedimentación de densidad y capacidad para aglutinar células sanguíneas rojas. Estos datos demuestran que la HA0 recombinante forma trímeros, que se unen en rosetas.

La rHA0 purificada no aglutina células antes de la eliminación del detergente, lo que sugiere que el antígeno debe de formar complejos (rosetas) con el objetivo de reticular células sanguíneas rojas de pollo. La capacidad cuantitativa de la rHA0 purificada para aglutinar células se usa como medida de la consistencia del antígeno lote-a-lote. Se define una unidad de hemaglutinina como la cantidad de antígeno requerida para alcanzar un 50% de aglutinación en un ensayo estándar de hemaglutinina con células sanguíneas rojas de pollo. Los datos comparativos muestran que los antígenos de rHA0 purificada aglutinan células sanguíneas rojas con una eficacia comparable a la observada en los viriones de gripe completos.

La HA0 recombinante puede ser separada en el enlace de disulfuro, causando un cambio conformacional que da como resultado la formación de dos cadenas, HA1 y HA2, tal como describen Carr, C.M. y Kim, P.S., “A Springloaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza Hemagglutin”, Cell 73: 823-832 (1993). La separación de HA0 recombinante se describe con más detalle a continuación en el Ejemplo 6. Se cree que tras la separación de HA0 natural en HA1 y HA2, las cadenas se vuelven infecciosas adquiriendo la capacidad de fusionarse con una célula, creando con ello una respuesta inmune mejorada. El procesado de antígenos tales como la hemaglutina de gripe se produce mediante la unión de péptidos antigénicos a moléculas de histocompatibilidad primarias (MHC). El complejo antígeno/MHC es reconocido por células T para iniciar una respuesta inmune, tal como se describe en la

revisión de Harding y Geuze, Current Opinion in Cell Biology 5: 596-605 (1993), que es incorporada a la presente memoria a modo de referencia. La rHA0 producida en un baculovirus, sin embargo, es altamente estable e inmunogénica como la molécula intacta. La comparación de las moléculas de azúcar con la HA0 expresada en células de insecto muestra que los glicanos son diferentes de los que se dan cuando la HA0 se expresa en células de mamífero o de ave.

Producción de proteínas de fusión

Se pueden preparar proteínas de fusión que consisten en la HA0 fusionada a una segunda proteína antigénica, en donde la antigenicidad de la segunda proteína es baja o existen ventajas para estimular una respuesta inmunogénica a antígenos múltiples. Un ejemplo de un segundo antígeno preferido es la neuraminidasa producida por la gripe. El antígeno puede consistir en una proteína celular, vírica o bacteriana, o una porción antigénica de la misma que incluye al menos de cinco a ocho aminoácidos. Otros antígenos incluyen el antígeno de la hepatitis B, antígenos del VIH y antígeno carcinoembriónico. Una “respuesta inmune”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una respuesta humoral, medida mediante la producción de anticuerpos del antígeno, o a una respuesta celular, medida mediante la estimulación de una respuesta mediada por células T al antígeno. En algunos casos se puede insertar un “ligando” de aminoácidos no antigénicos entre la HA y el antígeno, para potenciar aún más la antigenicidad del antígeno con respecto a la HA. El proceso implica construir un plásmido de ADN para fusionar genes antígenos diana al gen de longitud completa de HA de virus de la gripe, o a fragmentos del mismo, usando metodología de sondas de oligonucleótido y de reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Los genes de fusión de antígeno diana-HA son modificados para obtener una expresión apropiada en células de insecto mediante la eliminación de la secuencia natural de péptido señal hidrofóbico y sustitución con un nuevo péptido señal de baculovirus. El gen de fusión se introduce en un vector de expresión de baculovirus de tal modo que el promotor de polihedro de baculovirus dirige la transcripción de las proteínas de fusión en células de insecto infectadas. El péptido señal de baculovirus de 18 aminoácidos dirige la traducción del polipéptido de fusión de antígeno diana-HA en el mecanismo de glicosilación de célula de insecto, y no está presente en la proteína de fusión madura.

Por ejemplo, el Plásmido pA9440, que contiene el gen de HA de la cepa A/Pekín/32/92 en el plásmido de transferencia de baculovirus pMGS12 descrito más adelante, se usó como plantilla para la amplificación del gen de HA mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando el protocolo recomendado por el suministrador (kit de clonación Gene Amp PCR, Perkin Elmer Cetus). La mezcla de reacción de PCR (100 μL) contenía 20 pmol de cebadores diseñados para madurarse con porciones del gen de HA. Los cebadores 5’ y 3’ fueron diseñados con sitios de endonucleasa de restricción en los extremos, que no se encuentran en el gen de HA. El cebador de PCR 5’ (0-567) para los fragmentos HA0 y HA1 comienza 52 pares base por debajo del extremo 5’ de las secuencias codificadoras de gen de HA naturales, eliminando la secuencia de péptido señal natural y añadiendo un sitio SmaI inmediatamente en dirección 5’ respecto a las secuencias codificadoras de HA. El cebador de PCR 5’ (0-651) para el fragmento HA2 comienza en el nucleótido 1108 del gen de HA natural, inmediatamente después del codón que codifica el residuo de arginina que es eliminado durante la separación de HA0 en HA1 y HA2. El cebador PCR 3’ (0680) para los fragmentos HA0 y HA2 se diseñó para añadir un sitio KpnI inmediatamente después de las secuencias codificadoras de HA, eliminando el codón de parada natural. El cebador PCR 3’ para HA1 (0-679) trunca el gen inmediatamente antes del residuo de arginina eliminado durante la separación de HA0. La amplificación del fragmento de gen de HA se llevó a cabo durante 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC para la desnaturalización, 2 minutos a 55ºC para la maduración con los cebadores, y 2 minutos a 72ºC para la extensión. Los fragmentos de gen de HA amplificado resultantes se sometieron a electroforesis sobre geles de agarosa, se purificaron a partir del gel usando un kit GeneClean (Bio 101, Inc.), y se ligaron en un plásmido diseñado para aceptar fragmentos generados por PCR (pCRII; Invitrogen). De este modo se obtuvieron los plásmidos pB142, pB144 y pB330, que contienen los fragmentos génicos de HA0, HA1 o HA2, respectivamente.

Los fragmentos génicos de HA se eliminaron de los plásmidos pB142, pB144 y pB330 con enzimas de restricción SmaI y KpnI y a continuación se subclonaron mediante técnicas de ADN recombinante estándares (Sambrook y col., 1989) en el plásmido de transferencia de AcNPV pMGS12. El plásmido pMGS12 contiene, de 5’ a 3’, el promotor de polihedro de AcNPV, un codón de inicio ATG, la secuencia para un péptido señal de separación procedente de una glicoproteína de baculovirus con un peso molecular de 61.000 (61K), sitios de clonación de enzima de restricción SmaI y KpnI, y una secuencia de codón de parada universal TAA. Flanqueando estas regiones reguladoras está el ADN procedente del fragmento de EcoRI I procedente del genoma de AcNPV (Summers y Smith, “A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures”. Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº 1555 (1987). Los fragmentos de PCR de HA clonada fueron escindidos del vector de clonación pCRII con SmaI y KpnI, purificados mediante electroforesis de gel de agarosa y el kit GeneClean, y ligados en pMGS12 que también había sido digerido con SmaI y KpnI. Los plásmidos de transferencia de AcNPV resultantes, pB879, pB1201 y pB1205 contenían las regiones codificadoras para HA0, HA1 o HA2, respectivamente, ligados en estructura con el péptido señal de baculovirus separable procedente del gen de 61K y el promotor de polihedro. Los plásmidos de transferencia de AcNPV pB879, pB1201 y pB1205 pueden usarse para fusionar HA0, HA1 o HA2 a cualquier gen de interés.

La segunda etapa de la construcción de plásmidos de transferencia de gen de fusión HA-CEA fue insertar las secuencias codificadoras de CEA en las construcciones que codifican HA. Los sitios de reconocimiento/separación de endonucleasa de restricción para SmaI y KpnI fueron colocados a ambos extremos del gen CEA mediante amplificación PCR del plásmido pA9080. El cebador PCR 5’, 0-649, comienza a 82 pares base del extremo 5’ del gen, eliminando la secuencia de péptido señal natural de CEA. El cebador PCR 3’, 0-650, se diseñó para eliminar los últimos 72 pares base del extremo 3’ del gen que codifica para la secuencia de región C-terminal hidrofóbica. La amplificación del fragmento génico CEA se llevó a cabo durante 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC para la desnaturalización, 2 minutos a 55ºC para la re-maduración y 2 minutos a 72ºC para la extensión. El fragmento génico de CEA amplificado resultante se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa, se purificó con el procedimiento GeneClean y se ligó en pCRII (Invitrogen) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. El plásmido resultante, pB806, contiene el gen CEA sin su péptido señal natural, dominio hidrofóbico C-terminal o codón de parada, pero con ambos sitios SmaI y KpnI en ambos extremos del gen.

Se llevó a cabo una preparación de plásmido a gran escala con el plásmido pB806, y se digirió el ADN con SmaI o con KpnI. Los fragmentos codificadores de CEA se purificaron mediante electroforesis de gel de agarosa y el kit GeneClean, y los fragmentos purificados fueron ligados en cada una de las tres construcciones que codifican HA (pB879, pB1201 o pB1205) digeridas con la misma enzima de restricción. Por ejemplo, los fragmentos que codifican CEA con extremos cortados con SmaI fueron ligados en las construcciones que codifican HA0, HA1 y HA2 (pB879, pB1201 y pB1205, respectivamente) cortadas con SmaI para crear los plásmidos pB1250, pB1555 y pB1584, respectivamente. Los fragmentos que codifican CEA con extremos cortados con KpnI fueron ligados en construcciones que codifican HA0, HA1 y HA2 cortadas con KpnI para crear pB1264, pB1564 y pB1593. La inserción del gen CEA en el sitio SmaI ubicó las secuencias codificadoras de CEA por debajo de las secuencias codificadoras de HA. Para todas las construcciones, el cebador PCR se diseñó de tal modo que el gen EA se insertó en estructura con HA, y la traducción génica de fusión terminaría en la señal de terminación de la traducción universal (TAATTAATTAA) (Secuencia ID Nº: 4) en las secuencias de vector pMGS12 por debajo del sitio KpnI.

Esta construcción puede mejorarse mediante la eliminación de aminoácidos intervinientes, tanto entre el péptido señal y HA0, tal como se describe más adelante, como entre la HA0 y el gen de fusión, para potenciar el plegamiento y la inmunogenicidad.

Formulación y empaquetamiento de vacunas

La rHA se puede formular y empaquetar sola o en combinación con otros antígenos de la gripe, usando métodos y materiales conocidos por los especialistas en la técnica para las vacunas contra la gripe. En una realización preferida, se combinan las proteínas HA procedentes de dos cepas A y de una cepa B para formar una vacuna multivalente.

En una realización particularmente preferida, las Has se combinan con un adyuvante, en una cantidad efectiva para potenciar la respuesta inmunogénica contra las proteínas HA. Actualmente, el único adyuvante usado ampliamente en humanos ha sido el alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio). La saponina y su componente purificado Quil A, el adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes usados en investigación y aplicaciones veterinarias presentan toxicidades que limitan su uso potencial en vacunas para humanos. Sin embargo, nuevas preparaciones definidas químicamente tales como el dipéptido de muramilo, el monofosforil lípido A, conjugados de fosfolípidos tales como los descritos por Goodman-Snitkoff y col., J. Immunol. 147: 410-415 (1991), la encapsulación de la proteína dentro de un proteoliposoma tal como describen Miller y col., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992), y la encapsulación de la proteína en vesículas de lípidos tales como las vesículas lipídicas NovasomeTM (Micro Vesicular Systems, Inc., Nashua, NH) también deberían ser útiles.

En la realización preferida la vacuna se empaqueta en una única dosis para inmunización mediante administración parenteral (es decir, intramuscular, intradermal o subcutánea) o administración nasofaríngea (es decir, intranasal). La dosis efectiva se determina tal como se describe en los siguientes ejemplos. El vehículo normalmente es agua o una disolución salina tamponada, con o sin un conservante. El antígeno puede presentarse liofilizado para resuspensión en el momento de la administración o en disolución.

El vehículo también puede ser un sistema polimérico de liberación retardada. Los polímeros sintéticos son particularmente útiles en la formulación de una vacuna para efectuar la liberación controlada de antígenos. Un ejemplo previo de esto fue la polimerización de metil metacrilato en esferas con diámetros inferiores a una micra para formar las denominadas nanopartículas, publicada por Kreuter, J., Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow (Ed.). CRC Press, páginas 125-148. La respuesta de anticuerpos, así como la protección contra la infección, con el virus de la gripe resultó ser significativamente mejor que cuando el antígeno se administra en combinación con hidróxido de aluminio. Experimentos con otras partículas han demostrado que el efecto de adyuvante de estos polímeros depende del tamaño de partícula y de la hidrofobicidad.

Se ha aplicado la microencapsulación a la inyección de productos farmacéuticos microencapsulados para proporcionar una liberación controlada. Una serie de factores contribuyen a la selección de un polímero concreto para la microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis del polímero y del proceso de microencapsulación, el coste de los materiales y del proceso de microencapsulación, el perfil toxicológico, los requisitos de cinética de

liberación variable y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos son todos los factores que deben considerarse. Los ejemplos de polímeros útiles son policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres y poliamidas, particularmente aquellas biodegradables.

Una elección frecuente como vehículo para productos farmacéuticos, y más recientemente para antígenos, es el poli (d,1-lactide-co-glicólido) (PLGA). Se trata de un poliéster biodegradable que tiene una larga historia de uso médico en suturas erosionables, placas óseas y otras prótesis temporales, en donde no ha mostrado ninguna toxicidad. Una amplia variedad de productos químicos, que incluyen péptidos y antígenos, han sido formulados en microcápsulas de PLGA. Se ha acumulado mucha información sobre la adaptación de PLGA para la liberación controlada de antígenos, por ejemplo, como se muestra en la revisión de Eldridge, J.H., y col., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146: 59-66. Se ha demostrado que el atrapamiento de antígenos en microesferas de PLGA de 1 a 10 micras de diámetro tiene un efecto adyuvante destacado cuando se administra oralmente. El proceso de microencapsulación en PLGA usa una separación de fases de una emulsión de agua en aceite. El compuesto de interés se prepara en forma de disolución acuosa y el PLGA se disuelve en disolventes orgánicos adecuados tales como cloruro de metileno y acetato de etilo. Estas dos disoluciones inmiscibles se emulsionan conjuntamente mediante agitación a alta velocidad. A continuación se añade un no disolvente del polímero, lo que provoca la precipitación del polímero alrededor de las gotas de fase acuosa para formar microcápsulas embriónicas. Las microcápsulas son recolectadas, y estabilizadas con uno entre una serie de agentes (alcohol polivinílico (PVA), gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), metilcelulosa) y el disolvente se elimina por secado a vacío o mediante extracción con disolvente.

Ejemplo 1: Propagación y purificación de virus de la gripe

Las siguientes cepas de vacuna contra la gripe se obtuvieron en la FDA en fluido alantoico de huevo de pollo:

Tipo A/Pekín/353/89 (H3N2) Tipo A/Pekín/32/92 (H3N2) Tipo A/Texas/36/91 (H1N1) Tipo B/Panamá/45/90

Para propagar el stock original de virus de la gripe obtenido de la FDA, se infectaron células MDCK en presencia de tripsina tratada con TPCK (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y concentraciones de suero bovino fetal optimizadas para producir los mayores títulos de virus de primer pasaje. Las células MDCK fueron infectadas con las cepas de gripe a una baja multiplicidad de infección (de 0,1 a 0,5), según se determina en un ensayo de HA estándar (Rosen, “Hemagglutination with Animal Viruses” en Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel y N.P. Salzman, páginas 276-28 (Academic Press, Nueva York, 1969)). Las células infectadas fueron incubadas a 33ºC durante 48 h y el medio se evaluó para determinar la producción de virus usando el ensayo de actividad de hemaglutinación. Se usaron las condiciones que dan lugar a la mayor actividad de HA para preparar grandes stocks de virus de la gripe. Las concentraciones óptimas de TPCK tripsina y suero fetal bovino para los anteriores virus de la gripe se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Concentración óptima de TPCK tripsina y suero fetal bovino.

A/Pekín/353/89

A/Pekín/32/92 A/Texas/36/91 A/Panamá/45/90

% Suero fetal bovino

0,25 % 0,25 % 0,25 % 5,0 %

Cantidad de tripsina tratada con TPCK

45 μg/mL 45 μg/mL 45 μg/mL 3 μg/mL

Purificación de virus de la gripe: se recolectó el virus 24-48 horas después de la infección a partir de 10 matraces de cultivo de tejido T175 clarificando el medio (1.000 x g durante 10 minutos) de células MDCK infectadas con gripe. A partir del medio se obtuvo una partícula de virus a 100.000 x g durante 1 hora. La partícula vírica resultante se volvió a suspender en 1 mL de disolución salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7,4, y se centrifugó a través de un gradiente de sacarosa en PBS de 20 mL al 20-60% (p/v). La banda de virus de la gripe se recolectó de la región de sacarosa al 40-45% del gradiente, se diluyó con PBS y se obtuvo la partícula a 100.000 x g. La partícula de virus purificada se volvió a suspender en 0,5 mL de PBS almacenado a -70ºC.

Ejemplo 2: Clonación de gen de HA de gripe A/Texas/36/91

En la Figura 2 se muestra un ejemplo específico de la etapa de clonación para uno de los genes de HA de la gripe. Se extrajo ARN vírico tal como se ha descrito anteriormente de gripe A/Texas/36/91, obtenida del CDC. Se usó el cebador universal complementario al extremo 3’ de los segmentos de ARN de gripe 5’-AGCAAAAGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 1) con transcriptasa inversa de Virus de leucemia Maloney murino (M-MuLV) para producir ADNc’s de gripe.

El ARN o ARNm vírico purificado (5 μg) se usó como plantilla para preparar ADNc utilizando transcriptasa inversa de M-MuLV suministrada en el kit First-Strand cDNA Synthesis Kit de Pharmacia Inc. El cebador usado para ADNc de ARN vírico procedente de cepas A de gripe fue un cebador de oligonucleótido sintético (5’-AGCAAAAGCAGG-3’) (SEC ID Nº: 1), que es homólogo al extremo 3’ de todos los segmentos de virión de gen de HA.

La amplificación de genes de HA a partir de ADNc se realizó mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando condiciones de reacción estándares (Gene Amp kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT). La mezcla de reacción PCR (100 μL) contenía 20 pmol de cebadores específicos para los extremos 5’ y 3’ del gen de HA de gripe A (H3) ó A (H1) o de las cepas B de gripe, tal como se determina mediante secuencias de consenso encontradas en los archivos de datos de ADN del GenBank, como se muestra en la Tabla 2. La amplificación se llevó a cabo durante 30 ciclos que consistían en 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, 2 minutos a 55ºC para re-maduración y 3 minutos a 72ºC para extensión. Los productos PCR fueron analizados sobre geles de agarosa al 0,8% para obtener el tamaño correcto antes de la clonación.

En la PCR se usaron cebadores PCR desde el extremo 5’ del gen de HA: 5’-GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3’ (SEC ID Nº: 2) y desde el extremo 3’ del gen de HA: 5’-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3’ (SEC ID Nº: 3) para producir el gen de HA de longitud completa.

Se diseñó un nuevo cebador PCR 5’ a partir del extremo 5’ del gen: extremo 5’ menos la secuencia señal: 5’-GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT-3’ (SEC ID Nº: 4) y el extremo 3’ del gen: 5’-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3’ (SEC ID Nº: 5). Estos fueron usados en PCR para producir el gen de HA menos la secuencia de péptido señal. A continuación éste se insertó en el vector TA separado con KpnI. El péptido señal de 61K para la expresión de baculovirus y el promotor de polihedrina fueron insertados a continuación en el vector TA que contiene el gen de HA menos la secuencia de péptido señal de la gripe. El vector de recombinación de baculovirus resultante contiene el promotor de polihedrina, el péptido señal de baculovirus de 61K y el gen de HA correspondiente a gripe A/Texas/36/91.

Los genes de HA procedentes de las cepas de gripe B fueron clonados a partir de ARN mensajero total (ARNm) extraído de células MDCK infectadas con la cepa de gripe B B/Panamá/45/90. El ARN total se preparó a partir de 5 matraces T175 de células infectadas. Las células recolectadas fueron lisadas en presencia de tiocianato de guanidinio y el ARN celular total se purificó tal como se ha descrito anteriormente. El ARNm total se extrajo del ARN celular usando columnas de giro de oligo-(dT)-celulosa, tal como se ha descrito antes.

El cebador usado para el ARNm procedente de las cepas de gripe B fue un cebador de ADN de oligonucleótido aleatorio (Pharmacia, Inc.).

Tabla 2. Cebadores usados para la amplificación PCR.

A/Pekín/32/92

Gen de extremo 5’ (SEC ID Nº: 27)

5’ GGG GGA TCC GGT ACC AGC AAA AGC AGG GGA TAA TTC TAT 3’ BamHl Kpnl

Extremo 5’ menos péptido señal de HA (SEC ID Nº: 28)

5’ GGG GGT ACC CCC GGG GAC TTT CCA GGA AAT GAC AAC AG 3’ KpnI Smal

Extremo 3’ (SEC ID Nº: 29)

3’ TAA TTA ATT TTT GTG GGA ACA AAG ATC CTA CTA AGC CAT GGC CC 5’ KpnI

A/Texas/36/91

Gen de extremo 5’ (SEC ID Nº: 2)

5’ GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA 3’ KpnI Smal

Extremo 5’ menos péptido señal de HA (SEC ID Nº: 4)

5’ GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT 3’ KpnI Smal

Extremo 3’ (SEC ID Nº: 3)

3’ GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC 5’ KpnI

B/Panamá/45/90

Gen de extremo 5’ (SEC ID Nº: 30)

5’ GGG GAA TTC GGT ACC CCC GGG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GT 3’ EcoRI KpnI SmaI

Extremo 5’ menos péptido señal de HA (SEC ID Nº: 31)

5’ GGT ACC CCC GGG GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA 3’ KpnI SmaI

Extremo 3’ (SEC ID Nº: 32)

3’ TG TTA CAA AGA ACA/G AGG TAG ACA GAC ACT CCA TGG CCT AGG CTT AAG GGG 5’

Un ejemplo de productos de síntesis de ADNc usó ARN vírico de virus de la gripe A/Texas/36/91 como plantilla. La localización de los segmentos de ADNc que codifican para las proteínas de la gripe podría determinarse como se indica a continuación. Se combinó ARN vírico purificado en la mezcla de reacción con el cebador de ADN de cadena sencilla universal 5’-AGCAAAAGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 1). Este cebador es complementario al extremo 3’ de los segmentos de virión de la gripe, tal como se ha descrito antes. La reacción también contenía la adición de [a-32P] dCTP para visualizar los productos de ADNc que fueron separados sobre gel de hidrólisis alcalina al 1,5% (Maniatis y col., 1982) y expuestos a película X-OMAT-AR.

Ejemplo 3: Clonación de genes de HA en plásmidos bacterianos

Los genes de rHA amplificados mediante PCR fueron clonados en un vector de plásmido de tipo pUC usando el sistema TA Cloning System (Invitrogen, Inc.). La presencia de genes de HA verificó mediante análisis de digestión con enzima de restricción del ADN de plásmido purificado mediante procedimientos estándares (Maniatis y col., 1982). El extremo 5’ de los genes de rHA fue analizado a continuación mediante secuenciamiento de ADN y se diseñaron nuevos cebadores para eliminar las secuencias que codifican para los péptidos señal hidrofóbicos en el extremo N de las proteínas de HA. A continuación se usaron los cebadores de oligonucleótido 5’ y 3’ específicos incluidos en la Tabla 2 para amplificar productos de ADNc mediante PCR y se clonaron en vectores de plásmido TA de E. coli (Invitrogen, Inc.) usando métodos de clonación estándares. Los clones de ADN resultantes contenían secuencias codificadoras para las HAs maduras.

Los genes de rHA procedentes de A/Texas/36/91, A/Pekín/353/89, A/Pekín/32/92 y B/Panamá/45/90 fueron subclonados empleando procedimientos estándares (Maniatis y col., 1982) en vectores de expresión de baculovirus. Los genes de HA fueron eliminados de los plásmidos de clonación TA con las enzimas de restricción apropiadas y se insertó el fragmento de ADN de HA purificado en un plásmido de recombinación de baculovirus. Los clones bacterianos resultantes fueron sometidos a escrutinio en función de la resistencia a ampicilina y a continuación se cortaron con enzimas de restricción para liberar el gen de HA insertado para confirmar su presencia. Los plásmidos de recombinación que contienen los genes de HA fueron purificados en gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio (Maniatis y col., 1982). El extremo 5’ de los plásmidos fue secuenciado para determinar la presencia de las señales de baculovirus correctas (promotor de polihedrina de AcNPV, señal de inicio de la traducción ATG y secuencia de péptido señal de baculovirus) y de la secuencia codificadora de HA apropiada en el marco de lectura correcto. Las secuencias de ADN en el extremo 5’ de los genes de HA y que flanquean al promotor de polihedrina de AcNPV y al péptido señal de baculovirus (primeros 18 aminoácidos de cada secuencia de aminoácidos) se muestran en el LISTADO DE SECUENCIAS.

La SEC ID Nº: 6 codifica la secuencia del extremo 5’ del gen de HA para A/Pekín/32/92 (intervalo de secuencia 1481). La SEC ID Nº: 7 es la secuencia de aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio “ATG” [nucleótido 19] de la SEC ID Nº: 6). La secuencia de aminoácidos del péptido señal de 61K se establece en la SEC ID Nº: 7 como los aminoácidos 1-18.

La SEC ID Nº: 8 codifica la secuencia del extremo 5’ del gen de HA para A/Texas/36/91 (intervalo de secuencia 1481). La SEC ID Nº: 9 es la secuencia de aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio “ATG” [nucleótido 19] de la SEC ID Nº: 8). La secuencia de aminoácidos del péptido señal de 61K se establece en la SEC ID Nº: 9 como los aminoácidos 1-18.

La SEC ID Nº: 10 codifica la secuencia del extremo 5’ del gen de HA para B/Panamá/45/90 (intervalo de secuencia 1-434). La SEC ID Nº: 11 es la secuencia de aminoácidos correspondiente (que comienza en el codón de inicio “ATG” [nucleótido 21] de la SEC ID Nº: 10). La secuencia de aminoácidos del péptido señal de 61K se establece en la SEC ID Nº: 117 como los aminoácidos 1-18.

En las SEC ID Nº: 6 y 8 los nucleótidos 1-18 son el extremo 3’ del promotor de polihedrina, los nucleótidos 19-72 codifican el péptido señal de 61K, y los nucleótidos del 73 al final codifican el extremo 5’ del gen de HA.

En la SEC ID Nº: 10 los nucleótidos 1-20 son el extremo 3’ del promotor de polihedrina, los nucleótidos 21-74 codifican el péptido señal de 61K, y los nucleótidos del 75 al final codifican el extremo 5’ del gen de HA.

Ejemplo 4: Expresión de HA recombinante en células de insecto

Los plásmidos de recombinación quimérica que contienen los genes de HA clonados fueron purificados y se mezclaron 2 μg con 1 μg de ADN natural de AcNPV. Los ADNs fueron co-precipitados con calcio y transfectados en células de S. frugiperda usando procedimientos estándares (Smith, Summers y Frase, Mol. and Cell. Biol. 3: 21562165 (1983)). Los baculovirus recombinantes fueron identificados en base a la morfología de placa, a continuación se purificaron mediante rondas adicionales de purificación en placa. Los baculovirus recombinantes purificados en placa son sometidos a escrutinio en función de la expresión de rHA, y se selecciona un único vector de expresión de baculovirus para desarrollo posterior.

Las células de S. frugiperda fueron infectadas con un vector de baculovirus que contiene el gen de HA procedente de la cepa de gripe B/Panamá/45/90. A las 24, 48 y 72 horas después de la infección, se pulsaron 1 x 106 células con 25 μCi de [35S]-metionina durante 15 minutos para marcar las proteínas que están siendo sintetizadas. Las células fueron recolectadas y las proteínas separadas en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de SDS al 0,1%. Las proteínas radiomarcadas fueron detectadas mediante exposición a película X-OMAT-AR. La localización de patrones de proteínas y su tamaño en kilodaltons (kd) indicó que la proteína de HA recombinante de 85 kd es una de las proteínas principales que se sintetiza en las células a las 48 horas y a las 72 horas después de la infección.

Ejemplo 5: Producción y purificación de HA recombinante

El vector de expresión de baculovirus A8611, que contiene el gen correspondiente a gripe A/Pekín/353/89, producido esencialmente como se ha descrito anteriormente para la hemaglutinina de A/Pekín/32/92 bajo el control del promotor de polihedrina, se usó para infectar células de S. frugiperda. Las células fueron cultivadas a 27ºC hasta una densidad de 1 x 106 células/mL en medio TNMFH (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) suplementado con un 10% de suero fetal bovino, e infectadas con una multiplicidad de infección (MOI) de 1 con el baculovirus recombinante A8611. Durante la infección, la hemaglutinina de gripe A/Pekín/353/89 se produce bajo el control transcripcional del promotor de polihedrina de baculovirus. Las células se recolectan 72 horas después de la infección mediante centrifugación durante 15 minutos a 3.400 x g, y se lavan mediante re-suspensión en medio de TNMFH libre de suero seguido de centrifugación durante 30 minutos a 10.400 x g. El sobrenadante se decanta y las partículas de células infectadas se almacenan a -70ºC.

Se desarrolló un proceso en el que la HA recombinante se extrae selectivamente de las células infectadas en condiciones que no desnaturalizan el antígeno. A menos que se indique lo contario, todas las etapas de extracción se llevan a cabo a 4ºC. La partícula de células procedente de 0,5 L de cultivo (aproximadamente 5 x 108 células) se sometió a disrupción durante 2 minutos en 40 mL de una disolución enfriada en hielo de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 al 1% (v/v), 1 mg/mL de leupeptina, usando un homogeneizador Polytron® (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). El homogenato se centrifugó durante 30 minutos a 9.200 x g. El sobrenadante se descartó y se recolectó la partícula. Esta etapa elimina proteínas de membrana solubles y periféricas de las células de insecto sin extracción de proteínas de membrana integrales como la rHA. Para extraer la rHA, la partícula se homogeneizó durante 2 minutos a un valor de 4 en 40 mL de una disolución enfriada en hielo de Tris 30 mM, etanolamina 10 mM, pH 11, LiCl 25 mM, Tween-20 al 2%. Tras una incubación de 60 minutos en hielo, el pH del homogenato se ajustó a 8,4 con HCl 1 N, y se eliminó el material insoluble mediante centrifugación durante 30 minutos a 9.200 x g. El sobrenadante que contenía la rHA soluble se decantó, y se comprobó el pH y, si era necesario, se ajustó a 8,4 a temperatura ambiente. La materia insoluble se volvió a suspender en 40 mL de agua para su análisis. La proteína de membrana integral de HA se solubilizó en condiciones de pH elevado, en condiciones de detergente Tween-20 y permanece en disolución después de que el pH disminuya.

Se analizaron las proteínas mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. Las muestras fueron sometidas a disrupción en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS) al 2% y beta-mercaptoetanol al 5%, a continuación se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 11% en presencia de SDS al 0,1%, y a continuación se tiñeron con azul de Coomassie.

Se desarrolló un proceso de purificación cromatográfico para purificar la HA recombinante que dio como resultado en un antígeno de HA recombinante altamente purificado que no está desnaturalizado y que es adecuado como componente de una vacuna contra la gripe para uso humano. Se usó el siguiente procedimiento para purificar la HA de A/Pekín/353/89 procedente de células de S. frugiperda infectadas con el virus recombinante A8611.

Las matrices de gel de cromatografía usadas para purificar la HA a partir de 0,5 L de células de S. frugiperda infectadas fueron 30 mL de Pharmacia DEAE Sepharose Fast Flow (en una columna Pharmacia C16/20) y 4 mL de Pharmacia Lentil Lectina Sepharose 4B (en una columna Pharmacia C10/10). La salida de la columna de DEAE se conecta a la entrada de la columna de lentil lectina, y se aplica a las columnas acopladas el extracto celular S/N 2 preparado como se ha descrito anteriormente con un caudal de 1 mL/minuto. Las columnas fueron lavadas con Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 al 0,5%, hasta que la absorción UV a 280 nm del efluente de lentil lectina retorna a la línea base. En estas condiciones la mayoría de las proteínas contaminantes se unen a DEAE, pero la HA recombinante fluye a través de la columna. Los contaminantes restantes pasan a través de la columna de lectina y la rHA glicosilada se une a la matriz de afinidad de lentil lectina. La columna de DEAE se desconecta y la columna de lectina se lava con otros 40 mL de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, Tween-20 al 0,5%. A continuación, la columna de lectina se lava con 40 mL de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, desoxicolato (DOC) sódico al 0,4% (v/v). Esta etapa reemplaza el detergente Tween-20 con un detergente como el DOC que puede eliminarse de la proteína mediante diálisis. A continuación la HA recombinante se eluye de la columna de lectina con aproximadamente 20 mL de Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, LiCl 25 mM, desoxicolato sódico al 0,4% (v/v) que contiene aD-metil manósido 0,3 M. Los resultados se analizan mediante PAGE al 11%.

Debido a la variabilidad genética de las proteínas de HA de la gripe, los detalles del anterior proceso de purificación pueden variar con cada proteína de HA recombinante única. Por ejemplo, la rHA puede unirse a la columna de intercambio iónico de DEAE en lugar de pasar con el flujo. Si esto se produce, la rHA se eliminaría de la columna de

DEAE mediante lavado de la misma con un tampón que contenga una concentración mayor de LiCl, NaCl, u otras sales.

Para eliminar el detergente DOC y otros componentes del tampón, el eluato de la columna de lectina que contiene la rHA purificada se sometió a diálisis frente a disolución salina tamponada de fosfato, pH 7,5 (PBS). La HA recombinante purificada tenía una pureza de al menos el 95%, determinada mediante análisis en geles de poliacrilamida SDS.

Ejemplo 6: Análisis de resistencia a rHA proteasa

La HA madura se agrupa en estructuras triméricas que son resistentes a una serie de proteasas, que incluyen la tripsina, que degradan los monómeros de HA (Murphy y Webster, 1990). Por lo tanto se puede usar el tratamiento de resistencia a tripsina como ensayo para la formación de trímeros funcionales. Se usó el siguiente procedimiento para estudiar la resistencia de la rHA frente al tratamiento con proteasa.

Se incubaron dos alícuotas de rHA purificada (A/Pekín/353/89) a 60 μg/mL sobre hielo durante 30 minutos en Tris-HCl 30 mM, pH 8,4, NaCl 150 mM, en presencia y en ausencia de 50 μg/mL de tripsina tratada con TPCK. La reacción se detuvo mediante la adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 57,4 mM en isopropanol hasta una concentración final de 1 mM. Se desnaturalizaron alícuotas de cada muestra hirviendo en SDS al 3% en condiciones reductoras, se sometieron a electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 11,5%, y se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa usando procedimientos de tinción Western estándares. Los polipéptidos de HA fueron detectados usando suero anti-HA de cobaya preparado contra rHA purificada y un conjugado de fosfatasa alcalina de IgG anticobaya de cabra.

La rHA no tratada migra al tamaño de la HA precursora (HA0). El tratamiento con proteasa da como resultado dos bandas principales que migran a los tamaños predichos para la hemaglutinina HA1 y HA2 de la gripe. Los resultados muestran que la tripsina separa la proteína de rHA una vez para producir dos polipéptidos que son los tamaños predichos para la HA1 y la HA2. No se produce ningún otro procesado proteolítico. Estos resultados demuestran que la rHA purificada mediante el anterior proceso es resistente a la degradación mediante proteasa. Esta propiedad es consistente con que la rHA purificada se encuentre en forma de trímeros.

Ejemplo 7: Inmunogenicidad de rHA usando el Ensayo de potencia de ratón estandarizado

Una estrategia para medir la inmunogenicidad de un antígeno es determinar la cantidad necesaria para inducir una respuesta a anticuerpo detectable en ratones (ensayo de potencia de ratón). Se usa un ensayo de potencia de ratón estandarizado para medir la inmunogenicidad de la vacuna de rHA0. Se inmunizan grupos de 5-10 ratones una vez con vacuna que contiene diluciones en serie de rHA, es decir, 0,500 μg, 0,1 μg, 0,02 μg y 0,004 μg de rHA purificada. Se recolectan los sueros 28 días después de la inmunización y se miden los anticuerpos contra antígeno de rHA en un ensayo inmunológico en fase sólida de enzima ligada estándar (ELISA) en placas de microtitulación de 96 pocillos. Un ratón se ha seroconvertido si la DO450 a una dilución 1:100 del antisuero del día 28 es superior a tres desviaciones estándar por encima de la media de la DO450 de sueros pre-inmunes de ratón. La dosis efectiva de vacuna necesaria para seroconvertir el 50% de los ratones (DE50) es una medida de la inmunogenicidad del antígeno.

Por ejemplo, se inmunizan cuatro grupos de 10 ratones una vez con 0,1 g, 0,02 μg, 0,004 μg ó 0,0008 μg (diluciones 1 a 5) de vacuna de rHA0. Los sueros se recolectan 28 días después de la inmunización y se miden contra cada antígeno de rHA0 de la vacuna para seroconversión en un ensayo ELISA. Se calcula la dosis necesaria para seroconvertir el 50% de los ratones (DE50) y se establece una DE50 mínima para cada antígeno de rHA0.

Los datos preliminares muestran que una única dosis de 0,004 μg de rHA0 seroconvertirá al menos el 50% de los ratones.

Ejemplo 8: Administración de rHA en combinación con un adyuvante y comparación con las vacunas contra la gripe disponibles

La potencia de ratón de la rHA purificada procedente de gripe A/Pekín/353/89 se evaluó con alumbre o sin alumbre (pura) y se comparó con una vacuna contra la gripe comercial, FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) que contiene la cepa A/Pekín/353/89 de la gripe. La vacuna se administró en una dosis de 0,5 μg, 0,1 μg, 0,02 μg y 0,04 μg. Los ratones fueron sometidos en el día 28 a las dosis de rHA purificada descritas antes. En el día 42 se recolectaron los sueros y se valoraron en un ensayo ELISA para anticuerpos IgG anti-HA.

Los resultados se muestran en la Figura 3. En ausencia de adyuvante sólo una dosis de 0,5 μg indujo la producción de un título de anticuerpos significativo (200.000). En presencia de adyuvante, dosis tan bajas como 0,004 μg de rHA0 produjeron anticuerpos significativos. Los animales inmunizados con rHA (pura) produjeron aproximadamente los mismos niveles de anticuerpos anti-HA que la vacuna comercial. El alumbre aumentó la inmunogenicidad de rHA, y se generaron títulos anti-HA que eran 10 veces o más superiores a cuando no había adyuvante.

En resumen, la comparación de la inmunogenicidad de rHA0s purificadas con una vacuna de virión completo de

gripe (FLUZONE®, Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA), demuestra que la rHA0 provoca una respuesta inmune similar en ratones a lo largo de un periodo de 42 días. La adsorción de la rHA0 a alumbre aumenta significativamente la inmunogenicidad de la rHA0 purificada en ratones, según se ha medido mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 7. La combinación con alumbre activa anticuerpos de hemaglutinina IgG que son superiores a las vacunas contra la gripe de Fluzone®.

Ejemplo 9: Estudios de inhibición de hemaglutinina.

Los anticuerpos de inhibición de hemaglutinina (HAI) se unen a tres de cuatro epítopos conocidos sobre la hemaglutinina, y bloquean la capacidad de la gripe para aglutinar células sanguíneas rojas (Wilson y col., “Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3Aº resolution”, Nature, 289: 366-378 (1981)). Estos determinantes antigénicos se agrupan alrededor del sitio de unión de receptor de ácido siálico sobre trímeros de hemaglutinina. Los anticuerpos contra estos sitios neutralizarán la infectividad del virus (Weis y col., “Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid”, Nature 333: 426-431 (1988)). El título y la especificidad de anticuerpos HAI son una mediad importante del potencial de que una vacuna contra la gripe proteja contra la infección de la misma y cepas similares de gripe.

Se llevaron a cabo estudios en ratones que comparan la capacidad de rHA0 purificada a partir de A/Pekín/353/89 y FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) para activar anticuerpos HAI. Se inyectó a grupos de 5 ratones en los días 0 y 28 con 0,5 μg, 0,1 μg, 0,02 μg ó 0,04 μg de rHA0, o tres veces estas cantidades de hemaglutinina de FLUZONE® de tal modo que se administraron niveles iguales de hemaglutinina de A/Pekín/353/89 recombinante o vírica. Por ejemplo, los ratones del grupo de dosis más alta fueron inmunizados con 1,5 μg de hemaglutinina de FLUZONE® (0,5 μg de hemaglutinina de cada cepa) y 0,5 μg de rHA0. La presencia de antígeno de hemaglutinina adicional en FLUZONE® procedente de otras dos cepas de gripe puede dar como resultado algunos anticuerpos que dan reacción cruzada.

Se midieron los anticuerpos anti-hemaglutinina (IgG de hemaglutinina) en un ELISA de dilución estándar contra rHA0 purificada. Se midieron los anticuerpos HAI contra 4 unidades de hemaglutinina de los siguientes antígenos: virus completo de gripe A/Pekín/353/89 (A/Pek), antígeno de A/Pekín/353/89 de rHA0 purificada, y FLUZONE®. El título de HAI es el recíproco de la mayor dilución de antisuero que inhibe la aglutinación de células sanguíneas de pollo al 50%.

La Tabla 3 resume los títulos de IgG y HAI de hemaglutinina en los ratones al 42º día. Se produjeron niveles elevados de anticuerpos de anti-hemaglutinina con la vacuna de rHA0 recombinante. Éstos fueron unas diez veces mayores que los de FLUZONE®. Lo más significativo es que la vacuna de rHA0 produjo buenos títulos de anticuerpos que bloquean la aglutinación de células sanguíneas rojas mediante el virus A/Pekín/353/89 y antígenos de rHA0. Por tanto, la vacuna de rHA0 produjo anticuerpos de HAI que reconocieron igual de bien el inmunógeno y el virus de la gripe A/Pekín. Los menores títulos de HAI frente a FLUZONE® pueden ser debidos a la incapacidad de los antisueros para bloquear la aglutinación por las otras dos cepas de hemaglutinina de la vacuna de FLUZONE®. Por el contrario, los ratones inmunizados con FLUZONE® producen elevados anticuerpos de HAI cuando se miden sólo contra sí mismos. Los títulos de HAI contra virus de la gripe A/Pekín/353/89 y el antígeno de rHA0 se vieron reducidos considerablemente. Comportamientos similares se observaron en los ratones de los grupos de dosis más bajas.

Tabla 3. Títulos de HAI frente a rHA0 y FLUZONE®.

rHA0 A/Pek (día 42)

FLUZONE® (día 42)

IgG de HA

HAI IgG de HA HAI

Ratón nº

rHA0 A/Pek rHA0 FLUZONE rHA0 A/Pek rHA0 FLUZONE

1

4.096.000 1.920 960 15 256.000 <10 <10 600

2

4.096.000 480 480 15 512.000 120 120 600

3

8.192.000 1.920 960 15 256.000 60 60 300

4

4.096.000 960 960 30 128.000 30 30 400

5

4.096.000 1.920 960 60 512.000 80 80 400

MEDIA

4.915.000 1.440 864 27 332.800 58 58 460

Estos datos también sugieren que existen diferencias genéticas entre la cepa de gripe A/Pekín/353/89 en FLUZONE® y esta misma cepa de la gripe obtenida de la FDA y pasada una vez en huevos antes de ser usada en el ensayo de HAI. El hecho de que los anticuerpos producidos en respuesta a la HA0 recombinante clonada a partir de A/Pekín/353/89 bloqueen la aglutinación de células sanguíneas rojas por esta cepa de la gripe, así como a sí mismos, es una buena evidencia de que no se han producido cambios genéticos durante el proceso de clonación que afecten al sitio de unión de receptor de ácido siálico en el antígeno de rHA0 purificada.

Ejemplo 10: Formulación y eficacia clínica de la vacuna contra la gripe de 1993/1994.

Se llevó a cabo una serie de ensayos clínicos con humanos para caracterizar la seguridad y la inmunogenicidad en humanos de una vacuna experimental contra la gripe que contenía HA recombinante, y para obtener datos preliminares relativos a la eficacia protectora de dicha vacuna frente a la infección natural durante una temporada epidémica. Los resultados demuestran que las vacunas que contienen la hemaglutinina recombinante de gripe (rHA0), producidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria, sorprendentemente causaron menos reacciones adversas locales, y proporcionaron una respuesta inmune protectora equivalente o superior en comparación con una vacuna de gripe atenuada licenciada producida en huevos y disponible comercialmente.

MATERIALES Y MÉTODOS

Vacunas. Las vacunas de HA recombinante usadas en este estudio contenían glicoproteína HA no separada de longitud completa (HA0) procedente de virus de la gripe A/Pekín/32/92 (H3N2). La HA0 recombinante (rHA0) fue producida en cultivos de células de Lepidóptero (insecto) después de exposición a un vector de baculovirus que contiene injertos de ADNc que codifican el gen de HA. La proteína expresada se purificó en condiciones no desnaturalizantes hasta >95%, tal como se determina mediante densitometría de barrido cuantitativa de la masa de antígeno sometida a electroforesis sobre geles de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico. La identidad del péptido se confirmó mediante análisis de aminoácidos, secuenciado N-terminal y análisis de transferencia Western con sueros anti-gripe A/Pekín/32/92. Las vacunas de rHA0 contenían una cantidad específica del antígeno de HA sintético disuelto en una disolución salina tamponada de fosfato o adsorbida en adyuvante de fosfato de aluminio (alumbre) en forma de una suspensión en gel. La vacuna de subvirión trivalente licenciada usada en este estudio contenía 15 μg/dosis de cada una de las HAs de virus de la gripe A/Texas/36/91 (N1N1), A/Pekín/32/92 (H3N2) y B/Panamá/45/90 (vacuna de la gripe atenuada FLUZONE® producida en huevos, Connaught Laboratories, Swiftwater, PA).

Estudios clínicos. El Institutional Review Boards de la Universidad de Saint Louis y la Universidad de Rochester aprobaron protocolos de estudio idénticos. Ambas instituciones reclutaron adultos sanos de edades entre 18 y 45 años. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente para recibir una de las siguientes cinco preparaciones de vacuna de un modo doblemente ciego: (1) 15 μg de rHA0, (2) μg de rHA0 más alumbre, (3) 90 μg de rHA0, (4) vacuna contra la gripe inactiva trivalente licenciada, ó (5) placebo salino. Las vacunas fueron administradas mediante inyección intramuscular en un volumen de 0,5 mL. Para permitir una determinación inicial de la seguridad de las tres preparaciones de vacuna que contenían rHA0, los primeros 25 sujetos en ser vacunados fueron distribuidos (es decir, 5 personas por rama de estudio) independientemente de los otros sujetos, y fueron monitorizados de cerca mediante contacto telefónico durante 48 horas después de la vacunación, antes de proceder con el resto de vacunaciones. Todos los sujetos recibieron instrucciones de rellenar una tarjeta de informe diario con las reacciones adversas, incluyendo tanto síntomas locales como sistémicos, durante los primeros 6 días después de la vacunación. Los síntomas se auto-graduaban como leves, moderados o graves en naturaleza. Si los participantes se sentían con fiebre se tomaban la temperatura oral y la registraban. Si se daba, un hinchamiento localizado o un eritema en la zona de la inyección era graduada según si el área era inferior o superior al tamaño de una moneda de 25 centavos de dólar en diámetro, respectivamente. Todas las vacunaciones se llevaron a cabo durante la última semana de noviembre y la primera de diciembre de 1993. Se obtuvieron especímenes de suero de todos los sujetos en el momento de la vacunación, 3 semanas después de la vacunación y una vez más a finales de marzo o abril de 1994, al menos 2-3 semanas después de que los virus de la gripe ya no estuvieran en circulación en las comunidades locales. Los voluntarios de cada institución recibieron instrucciones de ponerse en contacto con el centro de estudio si experimentaban una enfermedad de tipo gripe durante la temporada epidémica de gripe invernal. Se definió una enfermedad de tipo gripe como la presencia de cualquier síntoma(s) de dos días o más de duración acompañado de fiebre y/o síntomas sistémicos de mialgias o resfriado. Los sujetos que informaron de síntomas de tipo gripe eran sometidos a tomas de muestras nasales y faríngeas obtenidas para cultivo e identificación del virus. A los especímenes clínicos se les asignaron números de identificación codificados y se procesaron de un modo ciego.

Serología. Para cada tipo de ensayo serológico, todos los especímenes de ambas instituciones fueron evaluados en un lote por un único laboratorio. Los anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) para el antígeno de virus de gripe A/Pekín/32/93 (H3N2) se midieron en sueros empleando un ensayo de microtitulación estándar, seguido de la eliminación de inhibidor no específico con enzima destructora de receptor y de aglutininas frías mediante hemadsorción a 4ºC. Se definió el título como la mayor dilución de suero que previene completamente la hemaglutinación mediante 4 unidades de antígeno de virus, usando 1:4 como dilución de partida. Se midieron los anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) específicos de HA mediante ensayo inmunosorbente ligado a enzima

(ELISA), usando rHA0 purificada procedente de gripe A/Pekín/32/92 (H3N2) como antígeno de cubrición. La secuencia de reactivos desde la fase sólida hacia el exterior consistió en (1) antígeno de rHA0 purificada, (2) suero espécimen, (3) IgG anti-humano de cabra conjugado a fosfatasa alcalina, y (4) sustrato de p-nitrofenil fosfato disódico. El título ELISA se expresó como la mayor dilución a la que la densidad óptima del pocillo que contiene al antígeno fue al menos el doble del correspondiente pocillo de control sin antígeno. Se midieron los anticuerpos neutralizantes usando el ensayo de microneutralización descrito previamente por Treanor, J.J., y Betts, R.F., J. Infect. Dis. 168: 455-459 (1993). En resumen, se mezclaron diluciones en serie de sueros desactivados térmicamente con aproximadamente TCID50 de virus de la gripe A/Pekín/32/92 (H3N2) y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. A continuación, la mezcla virus-suero se adsorbió hasta obtener monocapas confluentes de células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en placas de 96 pocillos durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas para eliminar el inóculo residual, se realimentó MEM de Dulbecco libre de suero con 2 μg/mL de tripsina y se incubó en CO2 al 5% a 33ºC durante 72 h. A continuación se fijaron las células con metanol y se determinó la replicación vírica usando un panel de anticuerpos monoclonales murinos específicos para la matriz y las nucleoproteínas de virus de la gripe A (Centro de Control de Enfermedades, Atlanta, GA), seguido de IgG antiratón conjugado con fosfatasa alcalina. El título de punto final de los sueros se definió como la mayor dilución que da como resultado más del 50% de reducción de la señal en comparación con los pocillos de control no neutralizados.

Virología. Se llevaron a cabo cultivos víricos de especímenes de muestras nasofaríngeas en cada institución empleando técnicas estándares. Los especímenes fueron inoculados en células MDCK o en células de riñón de mono Rhesus y se incubaron a 33ºC durante 14 días. Se evaluó la hemadsorción de monocapas de células con eritrocitos de cobaya al 0,4%. Los virus de la gripe fueron identificados en los cultivos de hemadsorción positiva mediante HAI usando antisueros específicos de H3 (Centro para el Control de Enfermedades, CDC).

Análisis estadístico. Los títulos de HAI recíproco, de IgG de ELISA y de anticuerpos neutralizantes se transformaron logarítmicamente para realizar un análisis estadístico. Se definió una respuesta a la vacunación como significativa cuando era un aumento del título de anticuerpos de cuatro veces o más entre los especímenes de suero pre-vacunación y 3 semanas después de la vacunación. La evidencia en laboratorio de infección con virus de la gripe A (H3N2) se definió como el aislamiento del virus a partir de secreciones nasofaríngeas y/o un aumento de cuatro veces o más en el título de anticuerpos HAI en suero entre el espécimen de 3 semanas después de la vacunación (pretemporada), recolectado en diciembre, y el espécimen de post-temporada correspondiente recolectado en la siguiente primavera. Las diferencias entre grupos de vacuna se analizaron usando el ensayo exacto de Fisher para comparar las proporciones de sujetos con reacciones adversas, respuestas de anticuerpos significativas o enfermedad o infección de gripe confirmada en laboratorio, y análisis de varianza (ANOVA) para comparar la media logarítmica recíproca de los títulos de anticuerpos post-vacunación. Se aplicaron los ensayos de desigualdad de Bonferroni modificado y de Tukey-Kramer cuando fue apropiado para posibilitar comparaciones múltiples.

RESULTADOS

Reactogenicidad. Las vacunas de rHA0 usadas en este estudio fueron seguras y bien toleradas. La frecuencia de reacciones adversas no pareció estar influenciada por el cambio de dosis de antígeno de rHA0 entre 15 μg y 90 μg, pero puede haber sido incrementada ligeramente con la adición de alumbre. Los eritemas localizados, el dolor y la ternura de la zona de inyección fueron reportados de manera significativa más frecuentemente por los receptores de la vacuna de subvirión licenciada que por los receptores de 15 μg o de 90 μg de rHA0 en salino. Con la excepción de un individuo que experimentó un dolor moderadamente severo, ternura y rigidez en el brazo después de la inmunización con la vacuna licenciada, todos los síntomas fueron graduados como de naturaleza suave y generalmente tuvieron una duración de 1-2 días. El eritema localizado y/o la induración, cuando se produjeron, eran invariablemente menores en tamaño que el área de una moneda de 25 centavos de dólar.

Inmunogenicidad. Los títulos de línea base de anticuerpos HAI en suero contra virus de la gripe A/Pekín/32/92 (H3N2) fueron inferiores o iguales a 1:8 en 64 (50%) de los 127 sujetos alistados. La mayoría de los sujetos de cada uno de los cuatro grupos de vacuna presentaron respuestas serológicas específicas de HA, determinadas mediante HAI y ELISA (Tabla 4). Los títulos post-vacunación de anticuerpos HAI en suero fueron superiores o iguales a 1:32 en todos los receptores de vacuna, con las excepciones de dos personas a las que se administraron 15 μg de rHA0 y una a la que se administró la vacuna licenciada. Asimismo, la vacunación se asoció con la producción de anticuerpos neutralizantes en la mayoría de los voluntarios. Los aumentos en la media de los títulos de anticuerpos y las tasas de seroconversión tendían a ser ligeramente menores después de la inmunización con 15 μg de rHA0 que con la vacuna licenciada, aunque dichas diferencias no fueron significativas estadísticamente. La respuesta de anticuerpos a rHA0 no se vio potenciada por la adición de alumbre. Los sujetos inmunizados con 90 μg de rHA0 alcanzaron unos títulos medios de anticuerpos de HAI y de IgG de ELISA que fueron de dos a cinco veces superiores a los de cualquiera de los otros tres grupos de vacunación (las diferencias fueron estadísticamente significativas cuando se compararon los títulos de HAI en suero).

Eficacia protectora. Durante el periodo de vigilancia, se produjeron un total de 28 casos de enfermedad de tipo gripe, reportados por 26 sujetos. Cuatro de estos individuos (tres de los cuales habían recibido placebo y el otro había sido inmunizado con 15 μg de rHA0) presentaron virus de la gripe A (H3N2) aislado a partir de cultivos

nasofaríngeos. También se produjeron aumentos significativos en el título de anticuerpos HAI frente a la gripe A/Pekín/32/92 (H3N2) entre los especímenes de suero de pretemporada y los de post-temporada en tres de los cuatro casos de cultivos confirmados, pero no en ningún otro individuo que reportó enfermedad. El único receptor de rHA0 que posteriormente desarrolló enfermedad de la gripe confirmada en laboratorio dio positivo en el cultivo tomado a los 31 días después de la inmunización, y se había seroconvertido desde un título de HAI prevacunación inferior a 1:4 hasta un título de post-vacunación (pretemporada) de 1:32. Dos receptores de placebo adicionales y un voluntario inmunizado con vacuna licenciada presentaron evidencia serológica de infección con virus de la gripe A (H3N2) durante la temporada epidémica en ausencia de enfermedad clínica. En comparación con todos los sujetos vacunados (o con todos los sujetos que recibieron cualquier vacuna de rHA0) como un grupo, una proporción significativamente mayor de receptores de placebo presentaron enfermedad de gripe a (H3N2) confirmada en laboratorio (p<0,05), o infección (p<0,005).

Los anteriores descubrimientos indican que las vacunas contra la gripe que contienen antígeno de rHA0 purificada, preparadas como se ha descrito en la solicitud de patente identificada anteriormente, son bien tolerados y capaces de activar respuestas inmunes protectoras en sujetos humanos. Incluso a una dosis de 90 μg, la rHA0 evaluada en este estudio no fue más reactogénica que el placebo salino, y provocó significativamente menos reacciones adversas locales que la vacuna de subvirión trivalente licenciada que contenía la mitad (es decir, 45 μg) de antígeno de HA total.

Las respuestas de anticuerpos específicos de HA neutralizantes a la preparación de 15 μg de rHA0 fueron comparables a las provocadas por la vacuna de subvirión, y mejoraron significativamente aumentando la dosis de rHA0 hasta los 90 μg.

Las tasas globales de infección y enfermedad que resultan de la exposición natural a la cepa epidémica en circulación de virus de la gripe A (H3N2) fueron significativamente inferiores entre los sujetos vacunados que entre los receptores de placebo. Estos datos sugieren que la inmunidad protectora conferida por la rHA0, particularmente cuando se administra a dosis elevadas, es comparable o superior a la inducida por las vacunas disponibles actualmente.

Tabla 4. Respuestas de anticuerpos en suero en sujetos adultos jóvenes después de inmunización con vacunas que contienen hemaglutinina recombinante (rHA0)purificada procedente de A/Pekín/32/92 (H3N2), subvirón trivalente licenciado que contiene 15 μg de HA procedente de A/Pekín/32/92 (H3N2), o placebo salino.

Anticuerpo de HAI

Anticuerpo de HA IgG ELISA Anticuerpo neutralizante

Vacuna (Número en el grupo)

Título HAI % conaumento 4x % con 1:32 post Título ELISA % conaumento 4x Título demicroneutralización % conaumento 4x

Pre

Post Pre Post Pre Post

rHA0 15 μg (26)

3,7±0,3 9,0±0,6* 85 92 8,7±0,3 12,0±0,3 88 5,7±0,3 10,0±0,4 85

rHA0 15 μg más alumbre (26)

4,3±0,5 8,6±0,4* 88 100 9,4±0,4 11,5±0,4 76 6,4±0,4 9,3±0,2 76

rHA0 90 μg (26)

3,3±0,4 11,1±0,3 100 100 8,5±0,4 13,1±0,4 100 5,7±0,3 10,2±0,4 96

Subvirón licenciado (26)

3,7±0,4 9,3±0,5* 100 96 8,1±0,4 12,0±0,4 92 5,8±0,3 9,9±0,4 96

Placebo (24)

3,7±0,5 3,8±0,5* 0 38 9,1±0,3 9,1±0,3 0 5,3±0,4 5,4±0,4 8

HAI, inhibición de hemaglutinación; HA, hemaglutinina; ELISA, ensayo inmunosorbente ligado a enzima. Los especímenes de suero post-vacunación fueron obtenidos tres semanas después de la inmunización. Los títulos de anticuerpos se expresan como log2±SEM medias recíprocas. Las comparaciones estadísticas se realizan entre el título de HAI post-vacunación medio del grupo designado y el del grupo de vacuna de rHA0 de 90 μg mediante análisis de varianza con el ensayo de Dunnett para comparaciones múltiples. *, P<0,01; +, P<0,05; #, P<0,01.

Ejemplo 11: Método para preparar un vector de clonación de HA0 mejorado

Se diseño un vector de clonación mejorado para la expresión de HA madura en el que el gen que codifica la HA se localiza inmediatamente por debajo (en dirección 3’) de la secuencia que codifica el péptido señal de quitinasa.

Se creó pMGS27 lineal con colas de cadena sencilla

En el plásmido pMGS12 se clonó HA en sitos SmaI o KpnI inmediatamente por debajo del péptido señal de quitinasa. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos se muestran respectivamente como SEC ID Nº: 22 y SEC ID Nº 23.

5’-péptido señal de quitinasa SmaI KpnI TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACC TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR

Esta región fue cambiada mediante mutagénesis oligodirigida para crear pMGS27 (las bases cambiadas están subrayadas) (SEC ID Nº: 24):

5’-TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGT ACC PstI

El plásmido pMGS27 se linealizó mediante corte con PstI (residuos 6-35 de la SEC ID Nº: 24 mostrada):

A GTC GCC GTG TCC TGCA 5’ GGCCAGAGAGGCC T T CAG CGG CAC AGG 5’ ACGTCCGGTCTCTCCGG A

A continuación se trató el pMGS27 lineal con ADN polimerasa T4 más dATP para crear colas de cadena sencilla como se muestra a continuación (residuos 23-36 y complemento de los residuos 6-18 de la SEC ID Nº: 24):

A 5’ GGCCAGAGAGGCC T T CAG CGG CAC AGG 5’ A

El gen de HA Diana se clonó en pMGS27 Etapa 1. Se sintetizaron los cebadores PCR. Oligo hacia adelante (SEC ID Nº: 25): 5’ GTC GCC GTG TCC AAC GCG (20 bases del extremo 5’ de la HA madura) Oligo inverso (complemento de la SEC ID Nº: 26): (20 bases del extremo 3’ de la HA madura) ATT AA CCGGTCTCTCCGG 5’ PCR del gen de HA Se usó PCR del gen de HA diana con los dos oligos para obtener (SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 26): 5’ GTC GCC GTG TCC AAC GCG (HA madura)

CAG CGG CAC AGG TTG CGC (HA madura)

TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3’ ATT AACCGGTCTCTCCGG

Madurar el gen de HA en pMGS27 y transformar E. coli

Se mezcló pMGS27 lineal y el fragmento del gen de HA de PCR tratado con ADN polimerasa T4. Las dos molécula se maduran una con la otra por formar un plásmido circular que es fácil de usar para transformar E. coli. El diagrama incluye las SEC ID Nº: 25 y 26, los residuos 23-36 y 6-18 de la SEC ID Nº: 24.

GTCGCCGTGTCCAACGCG (HA madura) TAATT TTGCGC (HA madura) ATTAACCGGTCTCTCCGG

+

A

GGCCAGAGAGGCCT

TCAGCGGCACAGG

A

para

péptido señal de quitinasa

parada

GTCGCCGTGTCCAACGCG (HA madura) TAATTGGCCAGAGAGGCCT Tal como se muestra, no hay un aminoácido extra entre el péptido señal y la HA madura.

Ejemplo 12: Preparación y eficacia de los tipos trivalentes de vacuna contra la gripe A y B de 1995-1996

(A/Texas/36/92\1 (H1N1), A/Johanesburgo/33/94 (H3N2) y B/Harbin/7/94) se una subunidad no infecciosa derivada a partir de antígenos de hemaglutinina (HA) de gripe recombinante. Los genes de HA fueron clonados a partir de las cepas recomendadas por el CDC y la FDA de virus de gripe A y B, tal como se ha descrito antes, y la identidad de cada gen clonada se determinó mediante análisis de secuencia de ADN. Se usaron vectores de expresión de baculovirus que contienen los genes de HA clonados a partir de las cepas de virus de la gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburgo/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94 para producir los antígenos de HA recombinantes en células de insecto cultivadas. Las proteínas de HA recombinantes son hemaglutininas no separadas (rHA0) de longitud completa con un peso molecular de aproximadamente 69.000. Las rHA0 fueron producidas en una línea celular de Spodoptera frugiperda (Lepidóptero) mantenida en un medio de cultivo libre de suero. La vacuna trivalente está compuesta de rHA0 purificada (pura a más del 95%, más probablemente pura a más del 99%) procedente de dos cepas de gripe A y una cepa de gripe B mezcladas en proporciones iguales. La vacuna se suministra para uso clínico como proteínas de rHA0 purificadas de tipos A y B en disolución salina tamponada de fosfato sin conservantes añadidos.

Los estudios en animales con vacunas de rHA0 monovalentes, bivalentes y trivalentes han demostrado que están libres de una toxicidad significativa. No existen agentes detectables tóxicos o perjudiciales en la vacuna. Se llevaron a cabo estudios de seguridad general y de inmunogenicidad de rHA0 de A/Pekín/32/92 y A/Texas/36/91 en ratones y en cobayas. No se observaron reacciones adversas. En ratones, una única inmunización con 15 microgramos de antígenos de rHA0 sin adyuvante induce en dos-tres semanas niveles elevados de anticuerpos IgG anti-HA, anticuerpos de inhibición de hemaglutinina (HAI) y anticuerpos neutralizantes.

En un estudio, se inmunizaron grupos de diez ratones con 15 microgramos de rHA0 purificada de A/Pekín/32/92 (H3N2) preparada en células adaptadas a un medio que contiene suero bovino fetal al 10%, o rHA0 preparada en células de insecto adaptadas a un medio que contiene suero bovino fetal al 10%, o rHA0 preparada en células de insecto adaptadas a un medio libre de suero (rHA0-SF). A las dos-tres semanas después de la inyección, se tomaron muestras de sangre de los ratones y se prepararon muestras de suero. Se midieron los anticuerpos IgG anti-HA y HAI en los sueros. Los antígenos de rHA0 y de rHA0-SF provocan títulos similares de anticuerpos anti-HA y HAI. Los antígenos de rHA0 y rHA0-SF provocan títulos similares de anticuerpos anti-HA y HAI. Dos semanas después de la inmunización sencilla, la mayoría de los ratones presentaban títulos significativos de anticuerpos HAI y a la tercer semana 8/10 ratones de cada grupo presentaban títulos de HAI de 32 o más. Estos y otros estudios bioquímicos e inmunológicos demuestran que la rHA0 producida en cultivo de células de insecto libre de suero es indistinguible de la rHA0 fabricada en condiciones de fermentación que contiene suero.

Se llevó a cabo un estudio para comparar la formulación de 1994-1995 de la vacuna contra la gripe de rHA0 trivalente con una vacuna de antígeno superficial de virus purificado licenciada, Fluvirin® (una vacuna vírica de gripe atenuada producida mediante cultivo en huevos). Cada vacuna contenía 15 microgramos de rHA0 o de HA vírico por cada 0,5 mL de las cepas de gripe A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) y B/Panamá/45/90.

Tabla 5. Comparación de vacuna de rHA0 trivalente con Fluvirin®.

Vacuna contra la gripe GMT (n=10 ratones)

GMT (n=10 ratones)

rHA0 trivalente Fluvirin®

Cepa de virus usada como antígeno

IgG anti-HA IgG anti-HA

Semana 0

Semana 3 Semana 0 Semana 3

A/Texas/36/91 (H1N1)

<1000 103.000 <1000 11.200

A/Shangdong/32/92 (H3N2)

<1000 162.400 <1000 41.000

B/Panamá/45/90

<1000 164.800 <1000 26.000

Cepa de virus usada como antígeno

HAI HAI

A/Texas/36/91 (H1N1)

<8 1.522 <8 1.088

A/Shangdong/32/92 (H3N2)

<8 494 <8 435

B/Panamá/45/90

<8 174 <8 42

Cepa de virus usada como antígeno

Ab neutralizantes Ab neutralizantes

A/Texas/36/91 (H1N1)

<100 5.800 <100 2.720

A/Shangdong/32/92 (H3N2)

<100 840 <100 360

B/Panamá/45/90

<100 1.300 <100 700

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACION GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: MicroGeneSys, Inc.

(ii)

TiTULO DE LA INVENCION: METODO PARA PRODUCIR VACUNAS CONTRA LA GRIPE MULTIVALENTES DE HEMAGLUTININA

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 32

(iv)

DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:

(A)

DESTINATARIO: Patrea L. Pabst

(B)

CALLE: 2800 One Atlantic Center; 1201 West Peachtree Street

(C)

CIUDAD: Atlanta

(D)

ESTADO: GA

(E)

PAiS: EE.UU.

(F)

CODIGO POSTAL: 30309-3450

(v)

FORMATO LEGIBLE EN COMPUTADORA:

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

(B)

COMPUTADORA: IBM PC compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, versi6n 1.25

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NUMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/06750

(B)

FECHA DE PRESENTACION: 26-MAYO-1995

(C)

CLASIFICACION:

(ix)

INFORMACION DE TELECOMUNICACION:

(A) TELEFONO: (404)-873-8794

(B)

TELEFAX: (404)-873-8795

(2)

INFORMACION DE LA SEC. ID N°: 1:

(i)

CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 12 pares base

(B)

TIPO: acido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGiA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (gen6mico)

(iii) HIPOTETICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus de la gripe

(x)

INFORMACION DE PUBLICACION:

(A)

AUTOR: Davis y col.

(B)

TiTULO: Construction and Characterization of a Bacterial Clone Containing the Hemagglutinin Gene of the WSN Strain (H0N1) of Influenza Virus

(C)

REVISTA: Gene

(D)

VOLUMEN: 10

(F)

PAGINAS: 205-218

(G)

FECHA: 1980

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID N°: 1:

(2) INFORMACION DE LA SEC. ID N°: 2:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 pares base

(B)

TIPO: acido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGiA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (gen6mico)

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID N°: 2:

(2)

INFORMACION DE LA SEC. ID N°: 3:

(i)

CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 35 pares base

(B)

TIPO: acido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGiA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (gen6mico)

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID N°: 3:

(2)

INFORMACION DE LA SEC. ID N°: 4:

(i)

CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 pares base

(B)

TIPO: acido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGiA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (gen6mico)

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID N°: 4:

(2)

INFORMACION DE LA SEC. ID N°: 5:

(i)

CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 35 pares base

(B)

TIPO: acido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGiA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (gen6mico)

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID N°: 5:

(2)

INFORMACION DE LA SEC. ID N°: 6:

(i)

CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1793 pares base

(B)

TIPO: acido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGiA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (gen6mico)

(iii) HIPOTETICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Pe��n/32/92

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: ARNm l�ber de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALI�ACION: 1 a 18

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: regi6n que codifica para la secuencia de prote�na se�al de 61� de AcNPV

(B)

LOCALI�ACION: 19 a 72

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricci6n SmaI

(B)

LOCALI�ACION: 76 a 81

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: regi6n que codifica para rHA madura

(B)

LOCALI�ACION: 73 a 1728

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricci6n �pnI

(B)

LOCALI�ACION: 1771 a 1777

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricci6n BglII

(B)

LOCALI�ACION: 1776 a 1782

(ix)

CARACTERiSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: se�al universal de terminaci6n de la traducci6n

(B)

LOCALI�ACION: 1783 a 1793

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID N°: 6:

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 570 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido10 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe 5 (C) ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Pekín/32/92

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B) LOCALIZACIÓN: 19 a 552

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1766 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Texas/36/91

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: ARNm líber de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para la secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 72

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 76 a 81

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 82 a 87

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 88 a 93

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 73 a 1734

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 1744 a 1749

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción BglII

(B)

LOCALIZACIÓN: 1750 a 1755

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1756 a 1766

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 572 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido10 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe 15 (C) ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Texas/36/91

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 554

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1799 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ARN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Panamá/45/90

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: líder de ARNm de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para el péptido señal de HA

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 69

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 22 a 27

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 70 a 1773

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 1777 a 1782

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción BglII

(B)

LOCALIZACIÓN: 1783 a 1788

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1789 a 1799

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 585 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal 5 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Panamá/45/90

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido señal de HA 10 (B) LOCALIZACIÓN: 1 a 17

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 18 a 568

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1811 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Holanda/13/94

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: líder de ARNm de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para la proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 72

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 76 a 81

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 73 a 1785

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 1789 a 1794

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción BglII

(B)

LOCALIZACIÓN: 1795 a 1800

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1801 a 1811

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 589 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido10 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe 15 (C) ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Holanda/13/94

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA: 20 (A) NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B) LOCALIZACIÓN: 19 a 571

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

42

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1757 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Shandong/9/93

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: líder de ARNm de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para la proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 72

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 76 a 81

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 73 a 1728

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 1735 a 1740

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción BglII

(B)

LOCALIZACIÓN: 1741 a 1746

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1747 a 1757

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 15: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 571 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 15 (A) ORGANISMO: Virus de la gripe

(C) ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Shandong/9/93

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18 20 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 553

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1814 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe 5 (C) ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Shanhai/4/94

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: líder de ARNm de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: región que codifica para la proteína señal de 61K de AcNPV

(B) LOCALIZACIÓN: 19 a 72

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 76 a 81 15 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 82 a 87

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura 20 (B) LOCALIZACIÓN: 73 a 1794

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1804 a 1814

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 592 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO 5 (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Shanhai/4/94

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B) LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 574 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 1802 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 10 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Harbin/7/94 15 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: líder de ARNm de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para el péptido señal de HA

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 69

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 22 a 27

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura 5 (B) LOCALIZACIÓN: 70 a 1776

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 1780 a 1785

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción BglII

(B) LOCALIZACIÓN: 1786 a 1791

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1792 a 1802 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 586 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla 5 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de B/Harbin/7/94

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido señal de HA 15 (B) LOCALIZACIÓN: 1 a 17

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 18 a 569

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1757 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

ORGANISMO: Virus de la gripe

(C)

ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Johanesburgo/33/94

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: líder de ARNm de polihedrina (parcial)

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para la proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 72

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción SmaI

(B)

LOCALIZACIÓN: 76 a 81

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: región que codifica para rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 73 a 1731

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción KpnI

(B)

LOCALIZACIÓN: 1735 a 1740

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio de restricción BglII

(B)

LOCALIZACIÓN: 1741 a 1747

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal universal de terminación de la traducción

(B)

LOCALIZACIÓN: 1741 a 1757

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 571 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal 5 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Virus de la gripe

(C) ELEMENTO AISLADO INDIVIDUAL: rHA de A/Johanesburgo/33/94

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: secuencia de proteína señal de 61K de AcNPV

(B)

LOCALIZACIÓN: 1 a 18 15 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: rHA madura

(B)

LOCALIZACIÓN: 19 a 569

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 22:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 24:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 43 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 25:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 18 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 26:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 18 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 27:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 39 pares base

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 28:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 38 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 29:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 44 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 30:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 47 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 31:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 36 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

(2)

INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº: 32:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 50 bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un método para fabricar la proteína de fusión de hemaglutinina, método que comprende infectar células de insecto cultivadas con un vector que contiene las siguientes secuencias en orden 5’ -> 3’: un promotor de polihedro procedente de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, una secuencia que codifica para un péptido señal de quitinasa, la secuencia que codifica para hemaglutinina procedente de una cepa de gripe A y una cepa de gripe B, una secuencia que codifica para la segunda proteína, un codón de terminación de la traducción, y una señal de poliadenilación de ARN de polihedro; y cultivar las células en un medio nutriente, en el que el péptido señal de quitinasa comprende los aminoácidos TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA, o la secuencia que codifica el péptido señal de quitinasa comprende los nucleótidos TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG.
2. 2.-El método de la reivindicación 1 que además comprende aislar la proteína de fusión de hemaglutinina de gripe a partir de células con una pureza de al menos 95%.
3. 3.-El método de la reivindicación 2, en el que se aísla una proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura separando las proteínas ligadas a la membrana, que incluyen la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura procedente de proteínas que no son de membrana a pH alcalino, lavar las proteínas ligadas a membrana para eluir la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura, separar la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura eluída mediante una resina de intercambio aniónico con un cambio del pH, y separar la proteína de fusión de hemaglutinina glicosilada madura pasada por intercambio aniónico mediante una resina de intercambio catiónico con un cambio en la concentración salina.
4. 4.-Un método para fabricar un vector que contiene las siguientes secuencias 5’ -> 3’: un promotor de polihedrina procedente de un baculovirus, un codón de inicio de la traducción ATG, una secuencia que codifica para un péptido señal de quitinasa, las secuencias codificadoras procedentes de hemaglutinina de una cepa de gripe seleccionada del grupo que consiste en cepas de gripe A y en cepas de gripe B, un codón de terminación de la traducción, y una señal de poliadenilación de ARN de polihedro; que comprende recolectar el virus del medio celular y aislar el ARN vírico, para las cepas de gripe A, o el ARNm vírico, para las cepas de gripe B; sintetizar ADNc usando un cebador universal (5’ AGCAAAAGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 1)) para el ARN vírico de las cepas de gripe A o cebadores aleatorios para el ARNm de las cepas de gripe B, en donde los cebadores 5’ y 3’ presentan sitios de enzimas de restricción en los extremos que no se dan en los genes de hemaglutinina; amplificar los cebadores de gripe A ó B y el ADNc de gripe mezclado con los segmentos de gen de hemaglutinina para producir fragmentos de ADN de cadena doble que contengan secuencias codificadoras de hemaglutinina madura completa; identificar el péptido señal de los genes de hemaglutinina y entonces amplificar los genes de hemaglutinina menos el péptido señal; y clonar los genes de hemaglutinina menos el péptido señal en un vector que contiene el promotor de polihedro de AcNPV y la secuencia que codifica para el péptido señal de quitinasa, comprendiendo el péptido señal de quitinasa los aminoácidos TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA o la secuencia codificadora de péptido señal de quitinasa comprende los nucleótidos TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG.
5. 5.-El método de la reivindicación 4, en el que los genes de hemaglutinina son clonados en el vector usando PCR de tal modo que el vector codifica el péptido señal acoplado directamente a la hemaglutinina sin ningún aminoácido interviniente.
6. 6.-El método de la reivindicación 4, que además comprende transfectar el vector en células de insecto, y seleccionar células para la expresión de hemaglutinina.
7. 7.-Una proteína de fusión de hemaglutinina de gripe recombinante expresada en un sistema de expresión de baculovirus cultivada en células de insecto obtenible mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y purificada hasta al menos el 95%.
8. 8.-Una composición de vacuna que comprende la proteína de fusión de hemaglutinina de gripe recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.
9. 9.-La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la segunda proteína se selecciona del grupo que consiste en una proteína vírica de hepatitis B, una proteína de VIH, un antígeno carcinoembriónico y una neuraminidasa.
10. 10.-La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la cepa de gripe infecta a humanos.
11. 11.-La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que además comprende

    (i)

    un vehículo farmacéuticamente aceptable, o

    (ii)

    un adyuvante, o

    (iii) un vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante.
12. 12.-La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un sistema de administración polimérico.