TWI477602B - Novel viral vector - Google Patents
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Description
本發明係提供一種新穎轉移載體、將該轉移載體與桿狀病毒(baculovirus)DNA進行同源重組之重組桿狀病毒及其等之製造方法。
再者,本發明係有關於將前述重組桿狀病毒作為有效成分之藥品(例如疫苗、瘧疾、流行性感冒病毒感染症之預防或治療藥)。
將桿狀病毒作為載體的用途係被使用昆蟲細胞之目標蛋白質工業生產方法所利用。近年來,已知桿狀病毒不僅可於昆蟲細胞中轉殖外來基因,亦可於哺乳動物中轉殖外來基因,且於發現治療用基因轉殖載體的可行性之專利文獻1中,係揭示了一種具有複數的獨立啟動子之重組桿狀病毒表現載體,其係由源自桿狀病毒早期基因之啟動子上包含編碼有病毒非構造蛋白質之基因的DNA區域及源自桿狀病毒晚期基因之啟動子上包含編碼有病毒構造蛋白質之基因的DNA區域所構成。
再者,於專利文獻2中,揭示了一種於細胞中轉殖入非哺乳動物DNA病毒而於哺乳動物細胞內使外來基因表現的方法,其中該非哺乳動物DNA病毒係含有可調控並表現分別結合於複數的獨立啟動子上之所希望的外來基因之
載體的外源性基因之啟動子。
再者,於專利文獻3中,係揭示了一種有關於藉由使用桿狀病毒之基因重組技術的蛋白質生產方法,係揭示使結合桿狀病毒之gp64基因與編碼有所希望的蛋白質之基因的融合基因表現,且將所希望的蛋白質以融合於病毒粒子之形式生產,並回收融合所希望的蛋白質之病毒粒子,再從該病毒粒子切下回收所希望的蛋白質之蛋白質生產方法。
於專利文獻4中,係關於一種桿狀病毒表現系,揭示了具有複數的獨立啟動子之重組桿狀病毒表現載體,其係包含以具有功能的形式連接於在寄主細胞中具活性而在非允許細胞中不具活性之第1啟動子上的編碼有檢測標幟(marker)之第1核酸序列,及以可發揮功能的形式連接於在非允許細胞中具有活性之第2啟動子上的含有外來核酸序列的第2核酸序列而組成。
又,於專利文獻5中,係揭示了連接在源自雞β肌動蛋白之CAG啟動子上的流行性感冒病毒血球凝集素(HA)抗原表現重組桿狀病毒表現載體因具有流行性感冒病毒感染預防效果,故作為疫苗配方十分有用。
再者,於專利文獻6中,係揭示了一種桿狀病毒載體之製造方法,該方法係包含於昆蟲細胞內共轉染(co-transfect)桿狀病毒啟動子與源自哺乳動物細胞之啟動子分別連接編碼有可在細胞表面表現的蛋白質之基因的質體,或兩組桿狀病毒啟動子分別與編碼有可在細胞表面表
現的蛋白質之基因連接的質體之共轉染步驟。
並且,於專利文獻7中,係揭示了使用於CAG啟動子上重組入流行性感冒病毒HA之cDNA的重組桿狀病毒對流行性感冒病毒感染之抗流行性感冒病毒活性的研究,且揭示了不僅是重組桿狀病毒,於野生型桿狀病毒中亦具有該活性。
如此地,近年來開發了各式各樣的重組桿狀病毒載體,並研究了以使用該等載體之重組桿狀病毒作為有效成分且針對哺乳動物之藥品的開發。
而於所屬業界中,希望能有具有新穎構造的重組桿狀病毒載體,及以對流行性感冒、瘧疾、結核等之感染症或癌症等之疾病有效的新穎重組桿狀病毒作為有效成分之藥品配方,特別是疫苗配方之開發。
【專利文獻1】特許第3366328號:多重啟動子桿狀病毒表現系及缺陷粒子產物
【專利文獻2】WO98/011243號:具有經突變之外殼蛋白之非哺乳動物DNA病毒
【專利文獻3】特開2002-253263號:蛋白質之生產方法
【專利文獻4】特開2003-284557號:新穎桿狀病毒轉移載體及用以表現外來蛋白質之重組桿狀病毒
【專利文獻5】WO02/062381號:桿狀病毒載體疫苗
【專利文獻6】WO04/029259號:桿狀病毒載體、桿狀病毒載體製造方法及基因轉殖方法
【專利文獻7】特開2005-15346號:含有桿狀病毒之抗病
毒劑
本發明之目的係提供一種新穎的重組轉移載體、該重組轉移載體與桿狀病毒DNA進行同源重組之重組桿狀病毒及其等之製造方法。又,本發明其他的目的係提供將前述重組桿狀病毒作為有效成分之藥品,特別是疫苗配方。
本發明人係發現一種具有新穎構造之轉移載體及該重組轉移載體與桿狀病毒DNA進行同源重組之重組桿狀病毒,其中該轉移載體係於昆蟲細胞內及脊椎動物(特別是哺乳類、鳥類、魚類等)細胞內之兩者中,可表現所希望的具有免疫原性之蛋白質或部分蛋白質抑或是具有免疫原性之蛋白質與細胞介素等之融合蛋白質。藉由該重組物桿狀病毒之提供,且針對有效地預防疾病的感染,及/或將具有治療效果的桿狀病毒作為有效成分之藥品反覆地全力研究,而新發現到該重組桿狀病毒具有作為所希望的藥品之效果。
然後,藉由本發明確認了具有新穎構造之轉移載體、該重組轉移載體與桿狀病毒DNA進行同源重組之重組桿狀病毒及其等之製造方法,以及確認了重組桿狀病毒本身可作為於目標細胞中表現所希望的具有免疫原性之蛋白質的藥品,於作為瘧疾、流行性感冒等之感染症之預防藥品係十分有效一事,從而於此完成了本發明。
本發明係提供下列1-31項所示的發明。
第1項. 一種轉移載體的製造方法,該轉移載體係包含有重組入雙啟動子(dual promoter)及融合基因之結構,該方法係於一側連接可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子且另一側連接桿狀病毒啟動子之雙啟動子的下游處,連接含有至少一個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因及至少一個免疫原性外來基因之融合基因。
第2項. 如第1項所記載之方法,其中前述可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子係可在哺乳動物中發揮作用的哺乳動物啟動子者。
第3項. 如第1或2項所記載之方法,其中前述至少一個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因係桿狀病毒gp64基因、水泡性口炎病毒醣蛋白基因、第一型人類免疫缺乏病毒醣蛋白基因、人類呼吸道融合病毒膜醣蛋白基因、A型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質基因、B型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質基因、單純性疱疹病毒醣蛋白基因、小鼠肝炎病毒S蛋白質基因之任一者。
第4項. 如第2項所記載之方法,其中前述可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子係選自於巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子、反轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延長因子1α啟動子、肌動蛋白啟動子、泛蛋白啟動子、白蛋白啟動子、MHC第II類啟動子任一者。
第5項. 如第1至4項中任一項所記載之方法,其中
前述桿狀病毒之啟動子係選自於多角體蛋白啟動子、p10啟動子、IE1啟動子、IE2啟動子、p35啟動子、p39啟動子、gp64啟動子任一者。
第6項. 如第1至5項中任一項所記載之方法,其中前述免疫原性外來基因係選自於瘧疾抗原、流行性感冒病毒抗原、結核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲(leishmania)抗原、錐蟲抗原、住血白冠病孢子蟲(leucocytozoon)抗原單獨、或選自於該等抗原基因中至少1種與細胞介素之融合抗原中的任一者。
第7項. 如第1至6項中任一項所記載之方法,其中前述轉移載體係pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP119
-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64及pCP-H1N1/HA1-vp39之任一者。
第8項. 一種重組桿狀病毒製造方法,係包含:一製造轉移載體的步驟,該轉移載體係包含有重
組入於一側連接可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子且另一側連接桿狀病毒啟動子之雙啟動子的下游處,連接有包含至少一個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因及至少一個免疫原性外來基因之融合基因的結構者;一將該轉移載體與桿狀病毒DNA共轉染昆蟲宿主細胞的步驟;及一分離重組桿狀病毒的步驟。
第9項. 如第8項所記載之方法,其中前述至少一個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因係桿狀病毒gp64基因、水泡性口炎病毒醣蛋白基因、第一型人類免疫缺乏病毒醣蛋白基因、人類呼吸道融合病毒膜醣蛋白基因、A型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質基因、B型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質基因、單純性疱疹病毒醣蛋白基因、小鼠肝炎病毒S蛋白質基因之任一者。
第10項. 如第9項所記載之方法,其中前述可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子係選自於巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子、反轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延長因子1α啟動子、肌動蛋白啟動子、泛蛋白啟動子、白蛋白啟動子、MHC第II類啟動子任一者。
第11項. 如第8至10項中任一項所記載之方法,其中前述桿狀病毒之啟動子係選自於多角體蛋白啟動子、p10啟動子、IE1啟動子、p35啟動子、p39啟動子、gp64啟動
子任一者。
第12項. 如申請專利範圍第8至11項中任一項所記載之方法,其中前述免疫原性外來基因係選自於瘧疾抗原、流行性感冒病毒抗原、結核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住血白冠病孢子蟲抗原單獨,或選自於該等抗原基因中至少1種與細胞介素之融合抗原中的任一者。
第13項. 如第8至12項中任一項所記載之方法,其中前述重組桿狀病毒係AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP119
、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39之任一者。
第14項. 一種轉移載體,係包含有重組入於一側連接可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子且另一側連接桿狀病毒啟動子之雙啟動子的下游處,連接有包含至少一
個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因及至少一個免疫原性外來基因之融合基因的結構者。
第15項. 如申請專利範圍第14項所記載之轉移載體,其中前述至少一個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因係桿狀病毒gp64基因、水泡性口炎病毒醣蛋白基因、第一型人類免疫缺乏病毒醣蛋白基因、人類呼吸道融合病毒膜醣蛋白基因、A型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質基因、B型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質基因、單純性疱疹病毒醣蛋白基因、小鼠肝炎病毒S蛋白質基因之任一者。
第16項. 如第14項所記載之轉移載體,其中前述可在脊椎動物中發揮作用的脊椎動物啟動子係選自於巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子、反轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延長因子1α啟動子、肌動蛋白啟動子、泛蛋白啟動子、白蛋白啟動子、MHC第II類啟動子任一者。
第17項. 如第14至16項中任一項所記載之轉移載體,其中前述桿狀病毒之啟動子係選自於多角體蛋白啟動子、p10啟動子、IE1啟動子、IE2啟動子、p35啟動子、p39啟動子、gp64啟動子任一者。
第18項. 如第14至17項中任一項所記載之轉移載體,其中前述免疫原性外來基因係選自於瘧疾抗原、流行性感冒病毒抗原、結核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼羅河熱病毒抗原、登革熱病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利
什曼原蟲抗原、錐蟲抗原、住血白冠病孢子蟲抗原單獨,或選自於該等抗原基因中至少1種與細胞介素之融合抗原中的任一者。
第19項. 如第14至18項中任一項所記載之轉移載體,係pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP119
-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64及pCP-H1N1/HA1-vp39任一者。
第20項. 一種重組桿狀病毒,係藉由如第8至13項中任一項所記載之重組桿狀病毒之製造法製成者。
第21項. 如第20項所記載之重組桿狀病毒,係AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP119
、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、
AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39之任一者。
第22項. 一種醫藥組成物,包含如第20或21項所記載之重組桿狀病毒。
第23項. 如申請專利範圍第22項之醫藥組成物,包含AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39之任一者。
第24項. 一種醫藥組成物,包含如第20或21項所記載之重組桿狀病毒,且該醫藥組成物係藉由肌肉內、經呼吸道或經鼻之任一途徑投予者。
第25項. 一種疫苗,係將AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、
AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39之任一者作為有效成分者。
第26項. 如第25項所記載之疫苗,係藉由肌肉內、經呼吸道或經鼻之任一途徑投予者。
第27項. 一種流行性感冒病毒感染症之治療或預防劑,係將AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39作為有效成分者。
第28項. 如第27項所記載之流行性感冒病毒感染症之治療或預防劑,係藉由肌肉內、經呼吸道或經鼻之任一途徑投予者。
第29項. 一種用於流行性感冒病毒感染症之疫苗,係將AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、
AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39作為有效成分者。
第30項. 如第29項所記載之用於流行性感冒病毒感染症之疫苗,係藉由肌肉內、經呼吸道或經鼻之任一途徑投予者。
依據本發明,係提供一種新穎的重組轉移載體、該重組轉移載體與桿狀病毒DNA進行同源重組之重組桿狀病毒及其等之製造方法。又,將本發明之重組桿狀病毒作為有效成分之藥品,於作為瘧疾、流行性感冒病毒、結核、肝炎等之感染症、癌症、自體免疫疾病等之治療及/或預防藥,或是作為細胞療法、疫苗配方等十分有用。
【第1圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第2圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的流行性感冒病毒感染預防效果(存活期)之圖。
【第3圖】由轉移載體製造之重組桿狀病毒於感染細胞內
之流行性感冒病毒抗原基因(H1N1/HA1)、結核菌抗原基因(Hsp65)及瘧原蟲之孢子蟲(sporozoite)表面之表面抗原基因(PbCSP)的融合物之分別表現的西方墨點分析法之圖。
泳道1:AcNPV-WT
泳道2:AcNPV-Dual-HA1N
泳道3:AcNPV-WT
泳道4:AcNPV-Dual-Hsp65
泳道5:AcNPV-WT
泳道6:AcNPV-Dual-PbCSP
【第4圖】表示於脊椎動物細胞中由轉移載體製造之重組桿狀病毒的結核抗原基因(Hsp65)與gp64基因之融合表現的螢光標定染色之圖。
(A):轉殖入AcNPV-Dual-Hsp65之HepG2細胞
(B):轉殖入AcNPV-WT之HepG2細胞
【第5圖】表示以免疫沉澱法確認於脊椎動物細胞中由轉移載體製造之重組桿狀病毒的流行性感冒病毒HA抗原基因與gp64基因之融合蛋白質表現情形之圖。轉殖入重組桿狀病毒之HepG2細胞之免疫沉澱。HepG2細胞係轉殖了AcNPV-WT(泳道1)、AcNPV-CMV-H1N1/HA full(泳道2)或AcNPV-Dual-H1N1/HA(泳道3)。於轉導3小時後,細胞係被以[35S]甲基硫胺酸放射性標定12小時。將細胞分解物以採自感染有H1N1流行性感冒病毒之小鼠之血清進行免疫沉澱。
【第6圖】表示於昆蟲細胞中對自轉移載體製造之重組桿
狀病毒粒子中的瘧原蟲CSP基因與gp64基因之融合表現物之表現的西方墨點分析法之圖。
泳道1:AcNPV-WT;泳道2:AcNPV-CMV-PbCSP;泳道3:AcNPV-PbCSPsurf;泳道4:AcNPV-Dual-PbCSP;
【第7圖】表示確認更換成脊椎動物啟動子之HA1重組桿狀病毒分別正於HeLa細胞中表現HA1與gp64之融合基因之RT-PCR的結果之圖。
【第8圖】表示經接種重組桿狀病毒之小鼠的血清中的PbCSP抗原專一性IgG抗體的製造之圖。
【第9圖】表示於經接種重組桿狀病毒之小鼠的脾臟細胞中的對PbCSP之CTL表位(epitope)之抗反應性IFN-γ製造細胞數之圖。
【第10圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-M2e所致的流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第11圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-CP-HA1/NC99所致的流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第12圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1於血液中誘導的流行性感冒病毒專一性IgG抗體的製造之圖。
【第13圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1於鼻洗滌液及肺泡洗滌液
中之誘導的流行性感冒病毒專一性IgG抗體及IgA抗體的製造之圖。
【第14圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的鼻腔內流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第15圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的肺內流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
於本說明書中的胺基酸、胜肽、鹼基序列、核酸等藉由省略記號的表示,係遵循IUPAC-IUB之規定[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomcnclature,Eur.J.Biochem.,138:9(1984)]、「供包含有鹼基序列或胺基酸序列之說明書等之寫作之指導方針」(特許廳編)及該領域中的慣用記號者。
於本說明書中,DNA分子係不僅為雙股DNA,亦包含構成其之被稱為訊息股(sense chain)及非訊息股(antisense chain)的各單股DNA之意,此外其長度並無限制。因此,於本發明編碼有免疫原性外來基因之聚核苷酸(DNA分子)中,只要無特別提及,係包含含基因體DNA之雙股DNA及含cDNA之單股DNA(訊息股)與具有與該訊息股互補的序列之單股DNA(非訊息股)及合成DNA及其等之片段之任一者。
再者,於本說明書中,聚核苷酸、DNA分子係不論功能區域之差別,而可包含表現抑制區域、編碼區域、先導序列、外顯子及內含子之至少任一者。
又,聚核苷酸係可包含RNA及DNA。而由特定胺基酸序列所構成之多肽及由特定DNA序列所形成之聚核苷酸,係包含其等之片段、同類物、衍生物及突變物。
聚核苷酸之突變物,例如突變DNA,係包含自然存在的對偶基因突變物;非自然存在的突變物;發生缺失、取代、附加及插入之突變物等。但,該等突變物係編碼有具有與突變前之聚核苷酸所編碼的多肽之功能實質上相同功能之多肽者。
於本發明中,轉移載體係指供製造重組桿狀病毒之質體,且該重組桿狀病毒係含有於一側為脊椎動物啟動子(哺乳動物啟動子、鳥類之啟動子、魚類之啟動子)與另一側為桿狀病毒之啟動子的連接二個啟動子之雙啟動子之下游處,重組入至少一個編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因,與至少一個與免疫原性外來基因連接的融合基因之結構。
於本發明較佳的一個實施形態中,免疫原性外來基因係以位於雙啟動子之下游處及編碼有可成為病毒粒子之成分的蛋白質之基因的上游側為宜。又,本發明之重組桿狀病毒可作為藥品或疫苗之有效成分而被使用於脊椎動物。該脊椎動物可舉例如,包含人類的哺乳動物,例如牛、馬、家豬、綿羊、山羊、猴、小鼠、狗、貓等;鳥類則可舉例
如雞、鵪鶉、鵝、鴨、鴿、火雞、珠雞、鸚鵡等。魚類則可舉例如幼鰤魚、鰤魚、鯛魚、紅魽、竹筴魚、縱帶鰺(striped jack)、黑鰭髭鯛(grunt)、鮭魚、紅鮭、鯉魚、鯽魚、虹鱒、陸封鮭魚、櫻鱒(Red spotted masu trout)等。
於一實施形態中,本發明係提供一種包含新穎結構的轉移載體,該新穎結構係重組入包含編碼有可在一側為脊椎動物啟動子且另一側為桿狀病毒之啟動子的經連接的雙啟動子之調控下於昆蟲細胞表現之病毒膜蛋白質的基因及免疫原性外來基因的融合基因。藉由將此轉移載體與桿狀病毒DNA共轉染於昆蟲細胞中,引起同源重組,且在桿狀病毒啟動子之調控下,於昆蟲細胞中表現,而能獲得將可製造能成為出芽之病毒粒子的成分之融合蛋白質的前述融合基因重組入桿狀病毒中的重組桿狀病毒。
於本發明中對脊椎動物投予重組桿狀病毒,可成為出芽之病毒粒子的成分之蛋白質與免疫原性蛋白質之融合蛋白質就很有可能會作為成分疫苗發揮作用。並且,對脊椎動物投予之重組桿狀病毒會侵入脊椎動物細胞中,而於脊椎動物細胞內由病毒基因體製造與目標免疫原性外來抗原融合之融合抗原,而可作為DNA疫苗發揮作用。
因此,可認定例如於哺乳動物的情形中,藉由對哺乳動物投予本發明之重組桿狀病毒,可成為病毒粒子的成分之蛋白質與免疫原性蛋白質之融合蛋白質會作為抗原呈現,且可成為病毒粒子的成分之蛋白質與免疫原性蛋白質之融合蛋白質會在哺乳動物之細胞中製造,並藉由其免疫
活化作用,而可作為病毒感染症、原蟲感染症、細菌感染症等之預防或治療劑發揮功能。
與轉移載體共轉染之桿狀病毒DNA係可為野生型、突變型及重組桿狀病毒DNA之任一者。被共轉染之宿主細胞可舉例如夜盜蛾(Spodoptera frugiperda
)細胞等之昆蟲細胞。
再者,於本發明中,係將編碼有會成為供瘧疾、流行性感冒病毒、結核等之感染症、自體免疫疾病、癌症等之預防、治療的包含疫苗療法之免疫療法之免疫原的抗原蛋白質之胺基酸序列的基因,例如編碼有瘧疾抗原、流行性感冒病毒抗原、結核菌抗原等之蛋白質之胺基酸序列的基因稱為免疫原性外來基因。
於此,「外來」基因係指從外部轉殖之基因之意,即使在細胞內亦具有相同的基因,前述從外部轉殖之基因亦屬於「外來」基因。
於本發明中,編碼有會成為前述免疫原的蛋白質之胺基酸序列的基因,只要是編碼有對感染症、癌症、自體免疫疾病等之疾病引發物質具有免疫原性的抗原蛋白質之胺基酸序列的基因,作為編碼有抗原蛋白質之胺基酸序列的基因就無特別限定。該等編碼有具有免疫原性的抗原蛋白質之胺基酸序列的基因之例係可舉例如下。
編碼有瘧疾抗原之胺基酸序列的基因,可例示如編碼有瘧原蟲的孢子蟲(sporozoite)表面之表面抗原CSP(Circumsporozoite Protein)、裂殖子(merozoite)表面之膜
蛋白質MSP1(Merozoite Surface Protein 1)、自感染瘧疾之紅血球分泌之瘧疾S抗原、存在於感染瘧疾之紅血球的小圓節(knob)之PfEMP1蛋白質、SERA蛋白質、TRAMP蛋白質、AMA1蛋白質等蛋白質之胺基酸序列的基因。
編碼有流行性感冒病毒抗原之胺基酸序列的基因,可例示如HA抗原(血球凝集素抗原)、NA抗原(神經胺糖酸酶抗原)、M2抗原(基質蛋白抗原)、NP抗原(核蛋白抗原)等蛋白質之胺基酸序列的基因。
編碼有對應結核的抗原蛋白質之胺基酸序列的基因,可例示如HSP65(65-kDa熱休克蛋白)、α抗原(抗原85A、抗原85B、抗原85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51、Mtb8.8、Mtb9.9、Mtb32、Mtb39及Mtb11等蛋白質之胺基酸序列的基因。
於脊椎動物之基因中,哺乳動物基因,可舉例如編碼有人類、牛、馬、家豬、綿羊、猴、小鼠、狗、貓等之感染症的抗原蛋白之基因;鳥類基因則可舉例如雞、鴨、鴿、火雞、珠雞、鸚鵡等之感染症的抗原基因(例如鳥類流行性感冒S抗原)。魚類基因則可舉例如幼鰤魚、鰤魚、鯛魚、紅魽、竹筴魚、縱帶鰺、黑鰭髭鯛、鮭魚、紅鮭、鯉魚、鯽魚、虹鱒、陸封鮭魚、櫻鱒等之感染症之抗原基因。
已有報告指出的與前述哺乳動物、鳥類、魚類之感染症有關的病原體基因係可自基因資料庫(Genbank)等保存已登記病原體基因之公共資料的機關輕易地取得。
又,於本發明中,免疫原性外來基因除如前述之於人
類活體外存在的免疫抗原之外,於人類活體內存在的細胞介素基因,例如IL-12基因、IL-6基因、IL-6受體基因、IL-2基因、IL-18基因、IFN-γ基因、M-CSF基因等之細胞介素基因,或使用基因重組技術將具有免疫原性之任意抗原與前述抗原蛋白質之基因融合之融合基因,只要是從外部轉殖入者,於本發明中亦可作為免疫原性外來基因來操作。
於本發明中提供該等具有免疫原性外來基因之轉移載體,以及其經同源重組的重組桿狀病毒,且提供將含有該免疫原性外來基因之重組桿狀病毒作為有效成分之醫藥組成物及由前述醫藥組成物所組成之疫苗配方。
於本發明中所使用的桿狀病毒,係於昆蟲中引起感染的昆蟲病源病毒且將環狀雙股DNA作為基因保有之DNA病毒的一群(桿狀病毒科)。其中,稱為核多角體病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus:NPV)之一群的病毒會於感染後期時在感染細胞的核內製作稱為多角體的封裝物。即使插入欲表現的外來基因來取代多角體基因,該病毒仍會毫無問題地感染、增殖並大量製造所希望的外來基因產物,因此近年來係已應用於製造所希望的蛋白質。
前述本發明所使用的桿狀病毒,係可例示如苜蓿尺蠖核多角體病毒(Autographa californica
Nuclear Polyhedrosis Virus:AcNPV)、家蠶核多角體病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus:BmNPV)、黃杉毒蛾核多角體病毒(Orgyia pseudotsugata Nuclear Polyhedrosis Virus:OpNPV)及吉普賽舞蛾核多角體病毒(Lymantria disper
Nuclear Polyhedorosis Virus:LdNPV)。
桿狀病毒DNA只要是可與本發明之轉移載體引起同源重組者即可。具體而言,可與本發明之轉移載體引起同源重組之桿狀病毒DNA之病毒基因最大可達130kbp,可插入15kbp以上的免疫原性外來基因。又,因為桿狀病毒基因本身於脊椎動物細胞中幾乎不會表現,故幾乎不必考慮到細胞傷害性,因此,判定不會誘發有害的免疫反應。
(1)本發明之轉移載體及轉移載體之製造
免疫原性外來基因DNA之製造
可於桿狀病毒轉移載體之成分之一的病毒基因融合之免疫原性外來基因DNA之製造法,可藉由基於將編碼有於本說明書中所揭示之作為目標的具有免疫原性的抗原蛋白質之胺基酸序列的聚核苷酸之核酸序列資訊來合成,或基於免疫原性外來基因之核酸序列資訊將相當於該免疫原性外來基因編碼領域之核酸序列的DNA依原樣合成(化學DNA合成法),而輕易地製造、取得。於此製造中,可適宜地使用一般的遺傳工程之手法[例如,參照基因選殖第二版(Molecular Cloning 2d Ed),Cold Spring Harbor Lab.Press(1989);續生化學實驗講座「基因研究法I、II、III」,日本生化學會編(1986)等]。
又,該DNA之合成方法可舉例如磷酸三酯法、亞磷醯胺法等之化學合成方法[J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967);同前,91,3350(1969);Science,150,178(1968);Tetrahedron Lett.,22,1859(1981);同前,24,
245(1983)]及其等之組合方法。更具體而言,該DNA可藉由亞磷醯胺法或三酯法進行化學合成,亦可利用市售的自動寡核苷酸合成裝置進行合成。雙股片段可藉由合成互補鏈並於適當的條件下與化學合成該互補鏈之單股鏈合,或是藉由同時使用適當的引子序列與DNA聚合酶以附加於化學合成該互補鏈之單股上而獲得。
於本發明中製造免疫原性外來基因DNA之具體之一個態樣,可舉例如編碼有結核菌抗原蛋白質之胺基酸序列的DNA序列、編碼有瘧疾抗原蛋白質之胺基酸序列的DNA序列、或編碼有流行性感冒病毒抗原蛋白質之胺基酸序列的DNA序列。
再者,本發明中所利用的DNA,並不限定於前述編碼有具有免疫原性之抗原蛋白質的多肽之胺基酸序列的DNA序列,只要被DNA編碼之胺基酸序列的蛋白質具有抗原性,即使是編碼有部分序列之DNA序列也無所謂。
又,本發明中所利用的DNA,亦可為前述編碼有具有免疫原性之抗原蛋白質之胺基酸序列的DNA序列,與存在於人類活體中的細胞介素基因,例如IL-12基因、IL-1基因、IL-6基因、IL-6受體基因、IL-2基因、IL-18基因、IFN-α基因、IFN-β基因、IFN-γ基因、TNF基因、TGF-β基因、GM-CSF基因、M-CSF基因之編碼區域之DNA融合之DNA序列。
該融合DNA序列,與編碼有具有免疫原性之抗原蛋白質的多肽之胺基酸序列的DNA序列融合之細胞介素基因
之DNA序列,其編碼區域並不限定為全長,係亦可為部分DNA序列。
於本發明中所使用的免疫原性外來基因之DNA,並不限定為如此具有特定的DNA序列之DNA分子,亦可為具有組合、選擇對應各胺基酸殘基之任意密碼子的DNA序列。密碼子的選擇可遵循一般方法。在此,舉例而言,可考慮所利用的宿主之密碼子使用頻率[Ncleic Acids Res.,9,43(1981)]。
本發明中所使用的免疫原性外來基因之DNA其藉由遺傳工程之方法的製造,更具體而言可藉由下述方法實施:可從表現有免疫原性外來基因之DNA之適當的來源,遵循一般方法製備cDNA資料庫,並使用對應免疫原性外來基因之DNA特有之適當的引子、表現物等之抗體,從該資料庫中篩選出所希望之選殖株[請參照Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981);Science,222,778(1983)等]。
於上述內容中,基因體DNA之來源可例示如表現免疫原性外來基因之DNA之各種細胞、組織、源自於其等之培養細胞等。特別是,較希望以感染瘧原蟲之感染紅血球萃取物、流行性感冒病毒感染細胞萃取物、結核菌萃取物等作為來源。從該來源進行之全DNA及RNA之萃取及分離、mRNA之分離及純化、cDNA的取得及其選殖等,任一者皆可遵循一般方法來實施。
免疫原性外來基因之DNA之製造,係如上述一般,可將前述萃取物作為來源,使用將免疫原組織、細胞之mRNA
萃取、分離、純化而得之各免疫原的cDNA資料庫來實施之外,亦可使用例如將前述各免疫原之mRNA萃取後,並於該RNA上附加聚腺嘌呤(poly A)後,收集該附加有聚腺嘌呤之RNA,再使用反轉錄酶來製造cDNA,並於該cDNA之兩端上附加限制酶部位後,重組入嗜菌體內而製備之嗜菌體資料庫來實施。
將免疫原性外來基因之DNA從cDNA之資料庫中篩選之方法,並無特別限制,可遵循一般方法。具體的方法,可舉例如藉由使用針對由cDNA製造之蛋白質之專一性抗體(例如,抗瘧疾抗體、抗流行性感冒病毒抗體、抗結核菌抗體)的免疫篩選,以篩選對應的cDNA選殖株的方法;使用對目標DNA序列選擇性結合的探針之溶菌斑雜交法;菌落雜交法等;及該等方法之組合。
前述各雜交法中所使用的探針,一般為基於與免疫原性外來基因之DNA序列相關的資訊以化學合成之DNA片段。又,可有利地利用既得之免疫原性外來基因及其片段之DNA序列來作為前述探針。再者,可使用基於與免疫原性外來基因之DNA序列資訊而設定的訊息股引子及非訊息股引子,來作為前述篩選用探針。
作為探針使用的DNA(核苷酸),係對應免疫原性外來基因之DNA序列之部分DNA(核苷酸),且至少具有15個連續的DNA者,並以至少具有20個連續的DNA者為宜,又以至少具有30個連續的DNA者為佳。供製造前述DNA之陽性選殖株本身亦可作為探針來使用。
當要取得免疫原性外來基因之DNA序列時,可適宜地利用依據PCR法[Science,230,1350(1985)]之DNA/RNA擴增法。特別是,當難以從資料庫獲得全長之cDNA時,以採用RACE法[cDNA末端快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends);實驗醫學、12(6),35(1994)]、特別是5'-RACE法[M.A.Frohman,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8,8998(1988)]等為宜。
PCR法中所使用的引子,可基於與免疫原性外來基因之DNA序列資訊而適當地設定,並遵循一般方法來合成。又,此引子亦可如後述實施例一般,使用重組入有免疫原性外來基因之DNA之載體質體中於該DNA兩端上所附加的DNA部分(SP6啟動子引子及T7終止子引子)。
再者,藉由PCR法擴增之DNA/RNA片段之分離純化,可遵循一般方法例如以膠體電泳法等來實施。
如前述一般而得之免疫原性外來基因之DNA或各種DNA片段,係可遵循一般方法,例如二去氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977)]、馬克森-吉伯特法[Maxam-Gilbert method,Methods in Enzymology,65,499(1980)],或簡單地使用市售的定序套組等,來決定該DNA序列。
編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因,只要是編碼有於目標細胞中可作為與前述免疫原性外來基因融合而成之融合蛋白質表現,並於昆蟲細胞中可成為病毒粒子成分之蛋白質來表現之蛋白質之基因則皆可為
之。
前述編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因,可舉例如gp64蛋白質(GenBank Accession No.L22858)、水泡性口炎病毒醣蛋白G(VSVG:GenBank Accession No.M21416)、單純性疱疹病毒醣蛋白(KOS:GenBank Accession No.K01760)、第一型人類免疫缺乏病毒gp120(GenBank Accession No.U47783)、人類呼吸道融合病毒膜醣蛋白(GenBank Accession No.M86651)、A型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白質(GenBank Accession No.U38242)等之基因,或是與桿狀病毒親緣接近的病毒套膜蛋白質等之基因。於本發明中,較佳地可舉例如後述實施例中所示的gp64基因。
前述編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因之DNA的製造,係與前述免疫原性外來基因之DNA之製造相同,可基於編碼有將作為目標的編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因之多肽的胺基酸序列之聚核苷酸之核酸序列資訊來合成,或是基於編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因之胺基酸序列資訊,依原樣合成相當於編碼有該胺基酸之核酸序列的DNA(化學DNA合成法),藉此輕易地製造、取得。
再者,相當於編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的核酸序列之DNA序列,並不限定為編碼區域之全長,而亦可為由部分的DNA序列構成之DNA。
或者,與前述免疫原性外來基因之DNA分子之製造時
相同,可使用一般的遺傳工程方法,製造出編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因之DNA。[例如,參照基因選殖第二版,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989);續生化學實驗講座「基因研究法I、II、III」、日本生化學會編(1986)]。
於本發明中,亦可使用後述之業已重組入調控免疫原性外來基因之表現的啟動子之一部分,並已預先導入編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因(之一部分)的市售載體質體。
脊椎動物啟動子
本發明所使用的作為轉移載體成分之一的脊椎動物啟動子(於脊椎動物中可發揮功能的啟動子),可舉例如哺乳動物啟動子、鳥類之啟動子、魚類之啟動子等之啟動子。
哺乳動物啟動子
又,本發明所使用的作為轉移載體成分之一的哺乳動物啟動子(於哺乳動物中可發揮功能的啟動子),可舉例如巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子、反轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、CAG啟動子、延長因子1α啟動子、肌動蛋白啟動子、泛蛋白啟動子、白蛋白啟動子、及MHC第II類啟動子等。
鳥類之啟動子
鳥類之啟動子,可舉例如肌動蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、延長因子啟動子、泛蛋白啟動子、及白蛋白啟動子等。
魚類之啟動子
魚類之啟動子,可舉例如肌動蛋白啟動子、熱休克蛋白啟動子、及延長因子啟動子等。
桿狀病毒之啟動子
本發明所使用的作為桿狀病毒轉移載體成分之一的桿狀病毒啟動子,可舉例如多角體蛋白啟動子、p10啟動子、IE1啟動子、p35啟動子、p39啟動子、及gp64啟動子等。
重組轉移載體之製造
本發明係有關於一種具有可在昆蟲細胞與脊椎動物細胞,特別是哺乳動物細胞兩者之細胞中,將目標免疫原性外來基因作為抗原蛋白質表現之新穎構造的新穎轉移載體。於本發明中,所製作的新穎轉移載體之構造,其特徵在於一側為脊椎動物的啟動子,特別是哺乳動物的啟動子,而另一側為桿狀病毒的啟動子,且連接該等啟動子的下游處具有與編碼有所希望的免疫原性蛋白質之胺基酸序列的DNA序列連接的構造。包含有被連接的脊椎動物啟動子,特別是哺乳動物的啟動子與桿狀病毒的啟動子之二啟動子之DNA序列的DNA區域,係可直接連接,亦可存在有介於雙方的啟動子之DNA序列間存在的DNA序列(但,此時雙方的啟動子必須要在昆蟲細胞與脊椎動物細胞,特別是哺乳動物細胞中具有啟動子活性)。再者,被連接的脊椎動物啟動子,特別是哺乳動物的啟動子與桿狀病毒的啟動子,於啟動子區域處任一者皆可配置成較近於被表現之基因,於後述實施例中,係以桿狀病毒的啟動子比哺乳動
物的啟動子之構造更近於被表現之基因之位置來製造。
於該構造中,含有編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸的基因,與所希望的免疫原性外來基因之融合基因之DNA序列,可為由將該二者之基因直接連接的DNA序列而形成者,亦可於其等間存在有介在DNA序列(但,此時必須要將下游側與上游側之基因配置成不會有移碼發生)。以所希望的具有免疫原性之外來基因的蛋白質之抗原呈現區域,來與可成為病毒粒子之成分之蛋白質融合會較適宜,因此必須要使所希望的具有免疫原性之外來基因的蛋白質可不從可成為病毒粒子之成分之蛋白質切離,而以與該蛋白質融合之形態來使用。
又,可預先形成含有該等二基因之融合基因再將其重組入載體中,亦可先將任一側的基因重組入載體中,接著再將另一基因重組入載體中而於載體內來形成融合基因。
前述操作,可分別使用既具有本發明轉移載體必要構成之一部份的前述脊椎動物啟動子,特別是哺乳動物的啟動子、桿狀病毒啟動子等之啟動子區域、編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因區域的市售表現載體,且任意地以限制酶切出,而重組入其他的啟動子等,於該載體之選殖區域處插入融合有所希望的免疫原性外來基因與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因之DNA序列,或將所希望的免疫原性外來基因插入業已重組入質體中的編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因之DNA區域的N端側等,
來插入必要的構成要素。
於前述融合所希望的免疫原性外來基因與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因之DNA序列的C端側的聚腺嘌呤尾之前,可具有供蛋白質檢測用的組胺酸標記(His Tag)、HVS標記等附加物,或亦可於融合前述啟動子區域與所希望的免疫原性外來基因與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因的區域之間,插入編碼有供表現、純化、檢測融合的重組蛋白質用且由8個胺基酸所構成之FLAG序列的DNA序列來作為胜肽標記。於本發明中亦可使用市售質體來製造,其中該質體具有本發明之可在昆蟲細胞與脊椎動物細胞,特別是哺乳動物細胞兩者之細胞中含有將所希望的免疫原性外來基因作為抗原蛋白質表現之構造的質體載體之已滿足其等一部份的構成。亦可將用以於脊椎動物細胞內可藉酵素使融合蛋白質裂開的多肽的胺基酸序列介於其中存在。再者,本發明之轉移載體,可於二啟動子區域之上游處,配置脊椎動物細胞,特別是哺乳動物細胞中使轉錄活性提升之增強子(enhancer);亦可使編碼有供促使表現之蛋白質分泌出宿主外的訊息胜肽之胺基酸序列之DNA序列與融合表現之基因結合。再者,為了終止轉錄,亦可於融合表現之基因下游處具有例如於脊椎動物細胞中有效的兔β球蛋白終止子等脊椎動物終止子區域。
如此一來,於桿狀病毒粒子中可表現免疫原性之免疫原性外來基因與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之
胺基酸序列的基因,可以融合之形態來製造可表現的轉移載體。
本發明之轉移載體及其製造方法的一具體例,係如後述實施例所示,由作為脊椎動物啟動子,特別是哺乳動物的啟動子之巨細胞病毒(CMV)之啟動子、改良CMV啟動子之CAG啟動子、於CMV增強子處接合泛蛋白(UBB)啟動子之啟動子等,與作為桿狀病毒啟動子之多角體蛋白(Polh)啟動子之啟動子連結,並插入融合有作為外來基因的流行性感冒病毒抗原基因、瘧疾抗原基因、結核抗原基因,與作為編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因之gp64抗原基因之DNA序列之構造所構成的轉移載體,係可舉例如pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP119
-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39。
(2)重組桿狀病毒之製造
再者,本發明係提供一重組桿狀病毒之製造方法,該
製造方法係由製造轉移載體之步驟及將該轉移載體係與桿狀病毒DNA共轉染至宿主細胞中之步驟所組成,並包含分離重組桿狀病毒之步驟,其中該轉移載體係由重組入包含連接於由一側為脊椎動物的啟動子,特別是哺乳動物的啟動子,而另一側為桿狀病毒的啟動子之經連接的雙啟動子的下游處的,至少一編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因,與含有至少一免疫原性外來基因之融合基因之結構物所構成者。
於前述重組桿狀病毒之製造方法中,對宿主細胞轉殖入所希望的重組DNA(轉移載體)之轉殖法及藉由其之轉型法,並無特別限制而可採用一般於本領域中已成為公知的慣用技術之各種方法,例如可遵循一般的基因重組技術(例如Science,224,1431(1984);Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,5990(1983))來進行製備。重組DNA(轉移載體)之表現方法,係可參考大野等人之「蛋白實驗規程1機能解析篇,細胞工學別冊,實驗規程系列,1997年,秀潤公司」來製造。又,昆蟲細胞的操作方法、基因重組、共轉染之一般方法,可使用與公知的昆蟲細胞之重組病毒製作法相同的方法(松浦善治,蛋白核酸酵素,37,211-222(1992);松浦善治,細胞,33(2)30-34(2001))。
獲得的重組桿狀病毒可遵循一般方法來培養,而藉由該培養,如所希望般設計之本發明中的免疫原性外來基因之DNA與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基
酸序列的DNA所融合之融合物(表現物),會於昆蟲細胞之細胞內、細胞外或細胞膜上表現、生產(累積、分泌)。
培養所使用的培養基,係可因應所採用的宿主細胞而適當地選擇利用慣用的各種培養基,且培養亦可在適於宿主細胞生長的條件下實施。
重組桿狀病毒之製造方法,更詳而言之,係由用以與依前述內容所製造之轉移載體進行同源重組之桿狀病毒DNA之準備步驟,及將該轉移載體與桿狀病毒DNA共轉染作為宿主細胞的源自夜盜蛾之Sf-9細胞、Sf-21細胞、源自擬尺蠖(Trichoplusia ni)之Tn-5細胞(High Five細胞,Invitrogen公司製)等之昆蟲細胞之細胞中的步驟所組成。
用以與以前述所製造之轉移載體進行同源重組之桿狀病毒DNA,為野生型、突變型或重組桿狀病毒DNA任一皆可。桿狀病毒DNA,只要是具有與包夾雙啟動子區域之DNA與免疫原性外來基因與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因所融合之融合基因之DNA的源自桿狀病毒DNA有同源性的DNA構造,而可引發與本發明之轉移載體的同源重組者,就可提高同源重組之機率。
為了引發同源重組,轉移載體與桿狀病毒DNA之重量比,可以例如1:1~10:1左右來混合。
藉由共轉染步驟同時轉殖入昆蟲細胞並培養後,由前述培養上清液製作病毒之溶菌斑後,懸浮於培養液中,並進行振盪(vortex)以從瓊脂中溶出病毒,再離心分離,而可
得到含有重組病毒的溶液。
前述內容中的桿狀病毒DNA,亦可使用市售品,例如可使用已自AcNPV除去多角體基因之等BacVector-1000 DNA、BacVector-2000 DNA等(Novagen公司製)。
為了於昆蟲細胞中使該等以前述內容得到的轉移載體與桿狀病毒DNA進行同源重組之共轉染,係可如前述般使用市售的載體轉染套組(BacVector Transfection Kits:Novagen公司製),並遵循該載體轉染套組所附的操作書來實施。如此一來,可得到與以前述內容製造的轉移載體與桿狀病毒DNA一起共轉染Sf-9細胞等昆蟲細胞之重組桿狀病毒。
於本發明中,遵循前述重組桿狀病毒之製造方法,使用pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP119
-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39之轉移載體與桿狀病毒DNA於Sf-9昆
蟲細胞中進行共轉染,而可得到AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP119
、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39之重組桿狀病毒。
再者,亦可獲得AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S之重組桿狀病毒。
除前述的重組桿狀病毒之製造法之外,其他重組桿狀病毒之製造法,亦可使用於重組入有全嗜菌體基因體之噬質體(穿梭載體)中利用轉位子而可在大腸桿菌菌體內有效率地插入外來基因之方法。依據該方法,可只將具有病毒基因的穿梭載體自菌體萃取出,且藉由進行轉染昆蟲細胞就可輕易地製造並回收重組桿狀病毒。
藉由前述重組桿狀病毒之製造方法而得之本發明重組桿狀病毒的純化,可使用眾所皆知的病毒純化法來進行。
重組桿狀病毒的純化,舉例而言,可對Sf-9等昆蟲細胞(1 x 107
個/10cm盤)接種0.5~1.0ml之以前述重組桿狀病
毒之製造方法而得之庫存病毒(通常為1x107-8
pfu/ml),於感染數日(4日)後回收培養上清液,並將離心分離而得之病毒片狀沈澱物懸浮於PBS等之緩衝液中。將得到的懸浮液施以10~60%之蔗糖密度斜度後,再進行離心分離(25000rpm,60分,4℃之條件)而以病毒片狀沈澱物回收。將回收物再懸浮於PBS後,繼續進行離心分離(同上),並將得到的純化重組物桿狀病毒之片狀沈澱物於PBS等之緩衝液中保存於4℃。
再者,前述得到的純化重組物病毒之感染價,可使用Sf-9等之昆蟲細胞並藉由溶菌斑分析法(Fields VIROLOGY第4版p29-32 2001)來測量。
於本實例中所例示的病毒中,因桿狀病毒蛋白質gp64其N端係露出於粒子的外側,而C端露於粒子的內側,故若使所希望的免疫原性外來基因之蛋白質融合於gp64的N端側,於昆蟲細胞中會使得其全體皆自作為病毒粒子之成分之病毒蛋白質粒子的外側露出,會變得更容易進行抗原呈現而適合於作為本發明之疫苗配方的目的。
(3)本發明醫藥組成物(將本發明重組桿狀病毒作為有效成分之藥品)
於本發明醫藥組成物中作為有效成分的本發明重組桿狀病毒,係可如前述(2)所示藉由遺傳工程之方法來獲得。
本發明醫藥組成物,重要的是要含有將使融合本發明免疫原性外來基因與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因之融合物建構成可於昆蟲細胞及脊
椎動物細胞,特別是包含人類的哺乳動物細胞中表現轉移載體,與桿狀病毒DNA進行同源重組而得之重組桿狀病毒作為有效成分。
特別地,本發明之醫藥組成物,係提供將特定的AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39之任一者之重組桿狀病毒之任一者作為有效成分之醫藥組成物。
於本發明之醫藥組成物中作為有效成分之本發明AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、
AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39之重組桿狀病毒,係具有提高對於感染性抗原之感染預防效果並減低感染價的作用,且利用該作用或是活性,可運用於與目標細胞或組織的感染有關的疾病的處理。受到該感染影響的目標細胞,可舉例如血液細胞,其他目標細胞則可舉例如肝細胞、腎細胞、腦細胞、肺細胞、表皮細胞、肌肉細胞等。含有該等細胞之組織,可舉例如肺、肝臟、腎臟、腦、動靜脈血管、胃腸、尿道、皮膚、肌肉等。
該醫藥組成物,可針對例如瘧原蟲之孢子蟲表面的表面抗原CSP、裂殖子表面之膜蛋白質之MSP1、自感染瘧疾之紅血球分泌之瘧疾S抗原、存在於感染瘧疾之紅血球的小圓節PfEMP1蛋白質、SERA蛋白質、TRAMP蛋白質、AMA1蛋白質等之瘧疾抗原,或對於HA抗原、NA抗原、M2抗原、NP抗原等之流行性感冒病毒抗原,提高對該等感染性抗原之感染預防效果並減低感染價(例如病毒感染價),因此將針對已感染之包含人類之哺乳動物之存活期之延長或存活率與未投予本發明醫藥組成物之群比較下,該醫藥組成物特別是在作為瘧疾、流行性感冒病毒感染之預防或治療劑上十分有用。
本發明醫藥組成物,利用提高對感染性抗原之感染預防效果並減低感染價之作用,作為流行性感冒病毒、乳頭狀瘤病毒、疱疹病毒、愛滋病毒、C型肝炎病毒、SARS病毒、西尼羅河熱病毒、登革熱病毒等之病毒性疾病;瘧疾、
錐蟲、利什曼原蟲等之原蟲性疾病;痢疾、腸熱病傷寒、霍亂、肺炎雙球菌、MRSA、VRE、淋病雙球菌、衣原體、梅毒、結核等之細菌性疾病等由病原體引起之感染而成為發病原因的感染性疾病、併發症之治療或預防劑上十分有用。
再者,藉由將為了獲得於本發明醫藥組成物中作為有效成分的用以得到重組桿狀病毒之轉移載體的免疫原性外來基因,作為針對人以外的脊椎動物之免疫原性基因使用,例如作為雞流行性感冒疫苗、牛錐蟲疫苗、香魚冷水病疫苗,會具有提高對於該等疾病之感染性抗原之感染預防效果並減低感染價的作用,且利用該作用或是活性,可運用於與目標細胞或組織的病毒感染有關的疾病的處理。
本發明之醫藥組成物,可作為含有藥學上有效量之本發明重組桿狀病毒與藥學上容許之載劑的組成物來製備。
本發明重組桿狀病毒之脊椎動物,特別是包含人類的哺乳動物或是哺乳動物細胞中的感染防禦效果,係例如將脊椎動物,特別是包含人類的哺乳動物,以肌肉內、經鼻、或經呼吸道地投予由本發明重組桿狀病毒與用於藥品投予用的可添加組成物所製造的醫藥組成物後複數次,可藉由將本發明重組桿狀病毒作為有效成分的醫藥組成物而免疫。本發明之醫藥組成物之投予可舉例如特別是以經呼吸道投予為佳。
並且,於本發明醫藥組成物之複數次免疫後,將作為對象的病原體投予至脊椎動物,特別是包含人類的哺乳動
物使其感染時,可藉由比較經過一定期間後的已投予本發明醫藥組成物之有效成分的重組桿狀病毒之脊椎動物,特別是包含人類的哺乳動物中的存活率,而可測量感染預防效果。
(4)本發明疫苗
作為本發明醫藥祖成物之有效成分的AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39之重組桿狀病毒,係如後述實施例所示般具有可表現出提高對病原體之感染預防效果並減低感染價之作用之免疫原性的本發明免疫原性外來基因,與編碼有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之胺基酸序列的基因之融合DNA序列的融合表現物,可作為從昆蟲細胞中出芽的病毒粒子而被純化。接著,可判定藉由將本發明之醫藥組成物以病毒粒子之形態投予至脊椎動物,特別是包含人類的哺乳動物,而使得成為病毒粒子之成分之外來抗原蛋白質可促進後天免疫(體液性免疫及細胞性免疫),更於
脊椎動物,特別是包含人類的哺乳動物細胞內,前述融合DNA序列表現物之抗原蛋白質可進一步促進後天免疫(體液性免疫及細胞性免疫),而本發明之醫藥組成物作為如此的疫苗亦十分有用。
特別地,本發明之疫苗,係提供將特定的AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39之重組桿狀病毒之任一者作為有效成分之疫苗。
該疫苗,與前述(3)之醫藥組成物相同,針對例如瘧原蟲之孢子蟲表面的表面抗原CSP、裂殖子表面之膜蛋白質之MSP1、自感染瘧疾之紅血球分泌之瘧疾S抗原、存在於感染瘧疾之紅血球的小圓節PfEMP1蛋白質、SERA蛋白質、TRAMP蛋白質、AMA1蛋白質等之瘧疾抗原,或對於流行性感冒病毒HA抗原、流行性感冒病毒NA抗原、流行性感冒病毒M2抗原、流行性感冒病毒NP抗原等之流行性感冒抗原,可提高對該等病原生物之感染預防效果並減
低感染價(例如病毒感染價),因此將針對已感染之包含人類之哺乳動物之存活期之延長或存活率與未投予本發明醫藥組成物之群比較下,該疫苗特別是在作為瘧疾、流行性感冒病毒感染之預防或治療劑上十分有用。
本發明之疫苗,利用提高對感染性抗原之感染預防效果並減低感染價之作用,作為流行性感冒病毒、乳頭狀瘤病毒、疱疹病毒、愛滋病毒、C型肝炎病毒、SARS病毒、西尼羅河熱病毒、登革熱病毒等之病毒性疾病;瘧疾、錐蟲、利什曼原蟲等之原蟲性疾病;痢疾、腸熱病傷寒、霍亂、肺炎雙球菌、MRSA、VRE、淋病雙球菌、衣原體、梅毒、結核等之細菌性疾病等由病原體引起之感染而成為發病原因的感染性疾病、併發症之治療或預防劑上十分有用。
再者,藉由將為了獲得於本發明疫苗中作為有效成分的用以獲得重組桿狀病毒之轉移載體的免疫原性外來基因,作為針對人以外的脊椎動物之免疫原性基因使用,例如作為雞流行性感冒疫苗、牛錐蟲疫苗、魚之香魚冷水病疫苗,會具有提高對於該等疾病之感染性抗原之感染預防效果並減低感染價的作用,且利用該作用或是活性,可運用於與目標細胞或組織的病毒感染有關的疾病的處理。
特別是,於本發明之疫苗中作為有效成分之本發明AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、
AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39之重組桿狀病毒,係具有提高對於感染性抗原之感染預防效果並減低感染價的作用,且利用該作用或是活性,可運用於與目標細胞或組織的病毒感染有關的疾病的處理。
受到該感染影響的目標細胞,可舉例如血液細胞,其他目標細胞則可舉例如肝細胞、腎細胞、腦細胞、肺細胞、表皮細胞、肌肉細胞等。含有該等細胞之組織,可舉例如肺、肝臟、腎臟、腦、動靜脈血管、胃腸、尿道、皮膚、肌肉等。
本發明之疫苗,作為上述(3)之醫藥組成物,可作為含有藥學上有效量之本發明重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、
AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)與藥學上容許之載劑的組成物來製備。
疫苗係可利用與上述(3)之醫藥組成物相同之作為醫藥可容許的載劑,並遵循一般方法製備成醫藥組成物形態。該載劑,可舉例如滅菌生理食鹽水、滅菌緩衝化生理食鹽水等之生理上可容許的溶液。
再者,疫苗(以下,關於配方係與醫藥組成物相同)可以將前述本發明重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)作為有效成分的脂質體配方來製備,亦可與佐劑等併用。
本發明之疫苗(醫藥組成物)之一具體例係可舉例如脂質體配方。脂質體配方,係可為使本發明重組桿狀病毒保持在,將酸性磷脂質作為膜結構成分、或將中性磷脂質與酸性磷脂質作為膜結構成分之脂質體中者。
作為膜結構成分之酸性磷脂質及中性磷脂質,並無特
別限制,可單獨或混合二種以上使用此種脂質體配方所慣用的各種脂質之一種。
脂質體膜係可單獨使用酸性磷脂質或是併用中性磷脂質與酸性磷脂質,並遵循一般方法來形成。在併用中性磷脂質時,酸性磷脂質之併用比例係以脂質體膜成分中0.1~100莫耳%左右為宜,且以1~90莫耳%左右為佳,又以10~50莫耳%左右更佳。
製備前述脂質體時,可添加例如膽固醇等。藉此調配磷脂質的流動性,可使脂質體之製備更為簡便。該膽固醇,一般相對於磷脂質,係以至多為等量來添加掺合為宜,且以0.5倍重至等重量之量來添加掺合為佳。
脂質體配方中之有效成分與酸性磷脂質之掺合比例,係相對於有效成分,使酸性磷脂質為0.5~100當量左右為宜,且以1~60當量左右為佳,又以1.5~20當量左右更佳。
作為有效成分之本發明重組桿狀病毒之相對於全脂質的使用莫耳%,可為數莫耳%至數十莫耳%左右,且以5~10莫耳%左右為宜,又以5莫耳%左右為佳。
此外,前述脂質體配方之製造、濃縮、粒徑控制等可遵循一般方法來實施。又,於脂質體配方中,亦可因應期望來掺合前述各種添加劑。
於前述脂質體配方之製造中,可於作為有效成分的本發明重組桿狀病毒上結合脂肪酸(例如廿二酸、硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、油酸等)、烷基、膽固醇基等來使用。將其等結合並製備脂質體配方之製造亦可遵循一般方法(參
照Long Circulating Liposomes:old drugs,New therapeutics.,M.C.Woodle,G.Storm,Eds:Springer-Verlag Berlin(1998)等)。
本發明之疫苗(醫藥組成物),以作為疫苗組成物使用為宜。使用其時,因與藥學上有效量之佐劑併用會提高抗感染(抗瘧疾或抗流行性感冒)效果故更為理想。
佐劑只要是於該種疫苗所慣用者的則無任何限制。其例可例示如佛氏完全佐劑、胞壁醯雙肽(muramyl dipeptide)、氫氧化鋁、BCG、IL-12、N-乙醯胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(MDP)、胸腺素α1、QS-21等。所併用的佐劑之量,係可因應其投予後會有表現出對於人類或動物之免疫反應一部分可能性的皮膚之軟化、疼痛、紅斑、發燒、頭痛、肌肉痛等之症狀的程度,來適當地決定。
本發明之疫苗(醫藥組成物),亦可與例如促免疫反應胜肽、抗菌劑(合成抗菌劑)等之其他眾所皆知的藥品等併用。
再者,疫苗(醫藥組成物)中亦可含有任意藥劑、添加物等。其例係可例示如鈣離子等之可有助於本發明重組桿狀病毒進入細胞內的藥劑。又,亦可使用前述脂質體及例如氟碳乳劑、螺旋物(cochleate)、小管(tubule)、金粒子、生物分解性微球、陽離子性聚合物等之能容易地進行轉染的藥劑或是添加物。
本發明之疫苗(醫藥組成物)(配方)中所包含的有效成分的量,只要是藥學上有效量就無特別限制,而能從廣範圍中選擇。前述疫苗(醫藥組成物)之投予量亦無特別限定,
可因應所希望的治療效果、投予方法(投予途徑)、治療時間、患者之年齡、性別、其他條件等,而從廣範圍中適當地選擇。
又,對人類投予本發明之疫苗(組成物)之有效成分之重組桿狀病毒時,以重組病毒之PFU換算,每一患者係被投予相當於102
~1012
PFU之重組桿狀病毒為宜,且以投予相當於105
~1010
PFU之重組桿狀病毒為佳、又以投予相當於106
~109
PFU之重組桿狀病毒更佳。
本發明之疫苗(醫藥組成物)之有效成分之重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)之投予量,作為轉殖疫苗宿主之可表現的DNA,或被轉錄的RNA的量,係可從非常廣的範圍中選擇。其等之量亦取決於例如於本發明之轉移載體使用的轉錄及轉譯啟動子之強度。
本發明之疫苗(醫藥組成物)之投予,係可藉著懸浮於PBS(磷酸緩衝化生理食鹽水)或生理食鹽水等中的桿狀病
毒懸浮液對局部(例如,肺組織內、肝臟內、肌肉內及腦內等)直接注入;經鼻、經呼吸道吸入;或是對血管內(例如動脈內、靜脈內及肝門靜脈內)投予來完成。本發明之疫苗之投予係可舉例如特別是以經呼吸道投予為佳。
本發明之疫苗(醫藥組成物),並非藉由僅投予一次,而是藉由一邊觀察初次投予後的狀態而進行1至複數次的追加疫苗投予來投予為宜。藉此,可變得能更為提高所希望的效果。又,投予疫苗(醫藥組成物)後,亦可以由前述之本發明重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)所組成之醫藥組成物進行追加免疫。甚者,併用前述各種併用藥亦有提高因投予疫苗(醫藥組成物)而產生的治療效果的可能性。
於本發明之疫苗(醫藥組成物)之一實施態樣中,作為本發明之疫苗(醫藥組成物)之有效成分之一的重組桿狀病毒,一般係將導入有其所希望的免疫原性外來基因與編碼
有可成為病毒粒子之成分之蛋白質之的基因所融合之基因的轉移載體與桿狀病毒DNA進行同源重組而得之重組桿狀病毒,以可注入單位用量的形態(溶液、懸浮液或乳液),與藥學上可容許之載劑(亦即,於所使用的投藥量及濃度之方面而言對包含人類的脊椎動物為非毒性,且與處方物中其他成分具有相容性者)混合而可藉此進行處方。舉例而言,處方物中以不含氧化劑及以重組桿狀病毒而言是有害的眾所皆知的其他化合物為宜。
載劑係可適當地含有如增強等張性及化學穩定性的物質的微量添加物。如此的物質,係於所使用的投藥量及濃度之方面而言對脊椎動物,特別是包含人類之哺乳動物為非毒性,且可包含如磷酸、檸檬酸、琥珀酸、醋酸及其他有機酸或其鹽之緩衝劑;如抗壞血酸之抗氧化劑;低分子量(約小於10殘基者)之多肽(例如,聚精胺酸或三肽);蛋白質(例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白);親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮);胺基酸(例如甘胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸或精胺酸);單糖、雙糖及其他碳水化合物(包含纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精);螯合劑(例如EDTA);糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇);對離子(counter ion,例如鈉);及/或非離子性界面活性劑(例如聚山梨糖醇酯、普羅沙姆(Poloxamer))或PEG。
含有重組桿狀病毒之藥學疫苗(組成物),代表性地,可於單位或多用量容器,例如於密封安瓿(ampoule)或小瓶中,以水溶液或凍結乾燥品儲藏。
含有本發明之疫苗(組成物)之藥學組成物係以與醫療實施基準(Goodmedical Practic)一致的樣式,一邊考慮各個患者之臨床狀態(例如,應預防或治療之狀態)、含有重組桿狀病毒之疫苗(組成物)之送達部位、目標組織、投予方法、投予計劃及習於此藝者所眾所皆知的其他因素,來一邊投予。因此,本說明書之疫苗(組成物)之恰當的投予量,係考慮上述因素而決定。
以下舉出實施例以更為詳細地說明本發明。該等實施例僅僅為例示,而當然不能限定本發明。
實施例1:本發明轉移載體質體及其製造法
(1)本發明轉移載體質體之pDual-Hsp65-gp64之建構
(1.1)質體pBACsurf-CSP之建構
pcDNA-CS87係遵從吉田等人之方法(Yoshida,S.,et al.,B.B.R.C.,271,107-115(2000))來獲得含有融合伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)ANKA株之基因體DNA與小鼠IgK分泌訊息序列及FLAG序列之序列的NheI-NotI片段,且將該NheI-NotI片段插入pcDNA3.1(Invitrogen公司製)之NheI-NotI部位而製作。
自感染小鼠瘧原蟲P.berghei ANKA株之BALB/c小鼠進行採血,並使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)來萃取P.berghei之基因體DNA。
接著,將萃取出的P.berghei ANKA株之基因體DNA使用引子PbCSP-F1(5’-
GGAGGGCTAGC ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC
GCGGATCCACTGCAGGGATATGGACAAAATAAAGCATCCAAGCCC-3’(序列編號1):新製作的NheI部位係以下標線表示、小鼠Igκ分泌訊息序列係以斜體字表示、FLAG序列係以雙下標線表示)與PbCSP-R1(5’-GGAGGGCGGCCGC
ATCCCGGGTTTTCTTATTTGAACCTTTTCGTTTTCTAACTCTTATACCAGAACC-3’(序列編號2):新製作的Not I部位係以下標線表示)進行PCR。PCR係使用PfuDNA聚合酶(Stratagene公司製),進行30循環(於94℃變性30秒、於55℃鏈合1分鐘、於72℃伸長2分鐘)。該PCR產物,係編碼有不具有C端之醣基磷脂醯肌醇錨(GPI anchor),且以融合於小鼠Igκ分泌訊息序列之PbCSP取代原本的訊息序列的產物。
純化PCR產物後,以限制酶NheI/NotI切斷,並插入pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司製)之NheI/NotI部位中,且將獲得之質體命名為pcDNA-CS87。
該pcDNA-CS87質體係包含CMV啟動子、小鼠Igk分泌訊息序列、PbCSP基因之蛋白質(對應21-305胺基酸位置)、源自於牛生長激素基因的聚腺嘌呤訊息、聚腺嘌呤序列。
將前述pcDNA-CS87以限制酶PstI與SmaI切斷,藉此得到編碼有PbCSP之胜肽的21-305之胺基酸序列的基因
片段,將該DNA片段插入pBACsurf-1(Novagen公司製)的PstI與SmaI部位中,而將建構的質體命名為pBACsurf-CSP。
(1.2)質體pBACsurf-Hsp65之建構
Hsp65基因係從結核菌(M.tuberculosis)H37Rv株使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司),萃取出結核菌H37Rv之基因體DNA,藉由PCR進行選殖。亦即,將萃取出的結核菌H37Rv之基因體DNA使用引子phsp65-F1(引子(5'-AATAATAGATCT
AATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3'(序列編號3):BglII部位係以下標線表示)與phsp65-R1((5'-AATCCAATGCGGCCGC
GGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3'(序列編號4):NotI係以下標線表示)進行PCR。
純化PCR產物後,以限制酶BglII/NotI切斷,且接合至pcDNA-CS87之BamHI/NotI部位中,而將得到的質體命名為pcDNA-Ighsp65。
該pcDNA-Ighsp65質體係小鼠Igk分泌訊息序列與hsp65基因融合之建構物。
將pcDNA-Ighsp65作為模板,且使用引子phsp65-F2(5’-CACCCCTGCAGG ACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTC
ATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3’(序列編號5):Sse8387I、EcoRI部位係以下標線表示、FLAG
序列係以斜體字表示)與phsp65-R2(5’-CCCGGG
CGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3,(序列編號6):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,將所得到的Hsp65基因DNA片段(約1660bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以Sse8387I/Cfr9I切斷,再插入以前述方法得到的pBACsurf-CSP(Yoshida et al.Virology 316:161-70,2003)之PstI/Cfr9I部位中。
將如此建構的質體命名為pBACsurf-Hsp65。
(1.3)質體pENTR-gp64之建構
將pBACsurf-1(Novagen公司製)作為模板,且使用引子pPolh-F2(5’-CACCCGGACCG
GATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’(序列編號7):RsrII部位係以下標線表示)與pgp64-R2(5’-GGTACC
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3’(序列編號8):KpnI部位係以下標線表示)進行PCR,並所得到的gp64基因DNA片段(約1700bp)插入至pENTR/D-TOPO中,而建構質體pENTR-gp64。
將如此建構的質體命名為pENTR-gp64。
(1.4)本發明之轉移載體pDual-Hsp65-gp64之建構
將pBACsurf-Hsp65以PstI/Cfr9I切斷,且將hsp65基因片段(約1660bp)插入pENTR-gp64之PstI/Cfr9I部位處,而建構質體pENTR-hsp65-gp64。
再將pENTR-hsp65-gp64以RsrII/KpnI切斷,並將由多角體啟動子與hsp65-gp64基因構成之DNA片段(約3360bp)插入pTriEx-3(Novagen公司製)之RsrII/KpnI部位處,而建構可藉由所希望的雙啟動子來調控表現的轉移載體質體pDual-Hsp65-gp64。
(2)本發明之轉移載體pDual-PbCSP-gp64之建構
將於(1.1.1)所得到的質體pBACsurf-CSP以PstI/Cfr9I切斷,並將PbCSP基因DNA片段(約890bp)插入至pDual-Hsp65-gp64之PstI/Cfr9I部位處,而建構質體pDual-PbCSP-gp64。
(3)本發明之轉移載體pDual-H1N1/HA1-gp64之建構
從經感染流行性感冒病毒PR/8/34株的MDCK細胞上清液使用QIAamp MiniElute病毒離心套組(QIAGEN)萃取RNA,並使用引子HA-f(5’-CCTGCAGG
TATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3’(序列編號9):SbfI部位係以下標線表示)與HA-r(5’-GCCCGGG
CGATGCATATTCTGCA-3’(序列編號10):Cfr9I部位係以下標線表示)進行RT-PCR,且將全長約1700bp之流行性感冒病毒HA基因片段於pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen公司)中進行選殖。
將得到的質體命名為pCR-Blunt-HA。將pCR-Blunt-HA作為模板,並使用引子pHA-F1(5’-CACCGAATTC
GACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3’(序列編號11):EcoRI部位係以下標線表示)與pHA-R1
(5’-CCCGGG
CACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3’(序列編號12):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,且將所得到的H1N1/HA1基因DNA片段(約1000bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以EcoRI/Cfr9I切斷,再插入於前述(1.4)所獲得之pDual-Hsp65-gp64之EcoRI/Cfr9I部位處,而建構質體pDual-H1N1/HA1-gp64。
(4)本發明之轉移載體pDual-PbTRAMP-gp64之建構
由經小鼠瘧原蟲P.berghei ANKA株感染之BALB/c小鼠進行採血,並使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)萃取P.berghei基因體DNA。
將此基因體DNA作為模板,藉由PCR將PbTRAMP基因以下述方法進行選殖。亦即,使用引子pTRAMP-F1(5’-CACCGAATTC
AAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG-3’(序列編號13):EcoRI部位係以下標線表示)與pTRAMP-R1(5’-CCCGGG
CTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3’(序列編號14):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,將所獲得之PbTRAMP DNA片段(約860bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以EcoRI/Cfr9I切斷,並插入pBACsurf-Hsp65之EcoRI/Cfr9I部位處。將建構的質體命名為pBACsurf-PbTRAMP。
接著將pBACsurf-PbTRAMP以EcoRI/Cfr9I切斷,並將PbTRAMP基因DNA片段(約860bp)插入
pDual-Hsp65-gp64之EcoRI/Cfr9I部位處,而建構質體pDual-PbTRAMP-gp64。
(5)本發明之轉移載體pDual-PbAMA1D123-gp64之建構
由經小鼠瘧原蟲P.berghei ANKA株感染之BALB/c小鼠進行採血,並使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)萃取P.berghei基因體DNA。
將此基因體DNA作為模板藉由PCR將PbAMA1基因領域123(D123)以下述方法進行選殖。亦即,使用引子pAMA1-F1(5’-CACCGAATTC
AATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3’(序列編號15):EcoRI部位係以下標線表示)與pAMA1-R1(5’-CCCGGG
CTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3’(序列編號16):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,並將所獲得之PbAMA1D123DNA片段(約1280bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以EcoRI/Cfr9I切斷,並插入pBACsurf-Hsp65之EcoRI/Cfr9I部位處。將建構的質體命名為pBACsurf-PbAMA1D123。
接著將pBACsurf-PbAMA1D123以EcoRI/Cfr9I切斷,並將PbAMA1D123基因DNA片段(約1280bp)插入於上述(1.4)所獲得之pDual-Hsp65-gp64之EcoRI/Cfr9I部位處,而建構質體pDual-PbAMA1D123-gp64。
(6)本發明之轉移載體pDual-PbMSP119
-gp64之建構
由經小鼠瘧原蟲P.berghei ANKA株感染之BALB/c小
鼠進行採血,並使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)萃取P.berghei基因體DNA。
將該基因體DNA作為模板藉由PCR將PbMSP119
基因以下述方法進行選殖。亦即,使用引子pMsp1-F1(5’-CACCCTGCA
GGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG-3’(序列編號17):PstI部位係以下標線表示)與pMsp1-R1(5’-CCCGGG
TTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3’(序列編號18):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,將所得到的PbMSP119
DNA片段(約450bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以PstI/Cfr9I切斷,並插入pBACsurf-Hsp65之PstI/Cfr9I部位處。將建構的質體命名為pBACsurf-PbMSP119
。
接著,將pBACsurf-PbMSP119
以PstI/Cfr9I切斷,並將PbMSP119
基因DNA片段(約450bp)插入pDual-Hsp65-gp64之PstI/Cfr9I部位處,而建構質體pDual-PbMS119
-gp64。
(7)本發明之轉移載體pDual-PfCSP-gp64之建構
從經熱帶瘧原蟲P.falciparum 3D7株感染之人類紅血球,使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)萃取P.falciparum基因體DNA。將此基因體DNA作為模板藉由PCR將PfCSP基因以下述方法進行選殖。亦即,使用引子pPfCSP-F1(5’-
CACCGAATTC
TTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3’(序列編號19):EcoRI部位係以下標線表示)與pPfCSP-R1(5’-CCCGGG
CTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3’(序列編號20):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,將所獲得之PfCSP DNA片段(約1100bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以EcoRI/Cfr9I切斷,並插入pDual-PbAMA1D123-gp64之EcoRI/Cfr9I部位處。將建構的質體命名為pDual-PfCSP-gp64。
(8)本發明之轉移載體pDual-PfAMA1-gp64之建構
從經熱帶瘧原蟲P.falciparum 3D7株感染之人類紅血球,使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)萃取P.falciparum基因體DNA。將此基因體DNA作為模板藉由PC將PfAMA1基因以下述方法進行選殖。亦即,使用引子pPfAMA1-F1(5’-CACCCTGCAG
GACTACAAGGACGACGATGACAAG
CAGAATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTG-3’(序列編號21):PstI部位係以下標線表示,FLAG序列係以斜體字表示)與pPfAMA1-R1(5’-CCCGGG
CTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3’(序列編號22):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,將所獲得之PfAMA1 DNA片段(約3500bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以PstI/Cfr9I切斷,並插入pDual-PbAMA1D123-gp64之PstI/Cfr9I部位處。將建
構的質體命名為pDual-PfAMA1-gp64。
(9)本發明之轉移載體pDual-Pfs25-gp64之建構
從經熱帶瘧原蟲P.falciparum 3D7株感染之人類紅血球,使用QIAamp DNA Midi套組(QIAGEN公司)萃取P.falciparum基因體DNA。將該基因體DNA作為模板藉由PCR將Pfs25基因以下述方法進行選殖。亦即,使用引子pPfs25-F1(5’-CACCGAATTC
AAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3’(序列編號23):EcoRI部位係以下標線表示)與pPfs25-R1(5’-CCCGGG
CAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT-3’(序列編號24):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,並將所獲得之Pfs25 DNA片段(約530bp)於pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司製)中進行選殖後,以EcoRI/Cfr9I切斷,並插入pDual-PbAMA1D123-gp64之EcoRI/Cfr9I部位處。將建構的質體命名為pDual-Pfs25-gp64。
(10)本發明之轉移載體pDual-H5N1/HA1-gp64之建構
合成源於雞流行性感冒病毒H5N1之HA1基因,並插入pDual-Hsp65-gp64EcoRI/Cfr9I部位中,而建構質體pDual-H5N1/HA1-gp64。
(11)本發明之轉移載體pDual-SARS/S-gp64之建構
合成SARS病毒之S基因,並插入pDual-Hsp65-gp64之EcoRI/Cfr9I部位處,而建構質體pDual-SARS/S-gp64。
(12)本發明之轉移載體pCP-H1N1/HA1-gp64之建構
將pDual-H1N1/HA1-gp64作為模板且使用Polh-f RsrII(5’-GGGCGGACC
GGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3’(序列編號25):RsrII部位係以下標線表示)與GP64-r DraIII(5’-GGGCACTTAGTG
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3’(序列編號26):DraIII部位係以下標線表示)進行PCR。將所得到之2700bp之DNA片段與將pDual-H1N1/HA1-gp64以限制酶RsrII與DraIII分解之載體接合,而建構pCP-H1N1/HA1-gp64。
(13)本發明之轉移載體pCAP-H1N1/HA1-gp64之建構
使將pCP-H1N1/HA1-gp64以限制酶RsrII與DraIII切斷而獲得之HA1與gp64之基因片段插入將pTriEx-1.1(Novagen公司製)以限制酶RsrII與DraIII切斷的載體中,而建構質體pCAP-H1N1/HA1-gp64。
(14)本發明之轉移載體pCU-H1N1/HA1-gp64之建構
將pTriEx3.1作為模板,使用CMVenh-f FseI(5’-GGGGGCCGGCC
CTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3’(序列編號27):FseI部位係以下標線表示)與CMVenh-r KpnI(5’-GGGGGTACC
CATGGTAATAGCGATGACTAATACG-3’(序列編號28):KpnI部位係以下標線表示)進行PCR,以擴增CMV增強子區域。再將人類基因體DNA作為模板,並使用UBBp-f KpnI(5’-GGGGGTACC
TCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC-3’(序列
編號29):KpnI部位係以下標線表示)與UBBp-r RsrII(5’-GGGCGGTCCG
GACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG-3’(序列編號30):RsrII部位係以下標線表示)進行PCR,以擴增UBB啟動子區域。將得到的二片段與將pCP-H1N1/HA1-gp64以限制酶FseI與RsrII分解之載體接合,而建構pCU-H1N1/HA1-gp64。
(15)本發明之轉移載體pDual-H1N1/NP-gp64之建構
將流行性感冒病毒PR/8/34株之基因體RNA作為模板,並使用NP-f EcoRI(5’-ACGGAATTC
CATTCAATTCAAACTGGA-3’(序列編號31):EcoRI部位係以下標線表示)與NP-r Cfr9I(5’-GATCCCGGG
CCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3’(序列編號32):Cfr9I部位係以下標線表示)進行RT-PCR,將所得到的片段以限制酶EcoRI與Cfr9I處理,且插入同樣經限制酶Ec0RI與Cfr9I處理的pDual-H1N1/HA1-gp64中,以製作pDual-H1N1/NP-gp64。
(16)本發明之轉移載體pDual-H1N1/M2-gp64之建構
將流行性感冒病毒PR/8/34株之基因體RNA作為模板,並使用M2-f EcoRI(5’-CGGAATTC
ATGAGTCTTCTAACCGAGG-3’(序列編號33):EcoRI部位係以下標線表示)與M2-r Cfr9I(5’-GATCCCGGG
CCTCCAGCTCTATGCTGAC-3’(序列編號34):Cfr9I部位係以下標線表示)進行RT-PCR,將所獲得之片段以限制酶EcoRI與Cfr9I處理,且插入同樣經限制酶
EcoRI與Cfr9I處理之pDau1-H1N1/HA1-gp64中,以製作pDual-H1N1/M2-gp64。
(17)本發明之轉移載體pDual-H1N1/NAe-gp64之建構
將流行性感冒病毒PR/8/34株之基因體RNA作為模板,並使用NAe-f EcoRI(5’-ACGGAATTC
CATTCAATTCAAACTGGA-3’(序列編號35):EcoRI部位係以下標線表示)與NAe-r Cfr9I(5’-GATCCCGGG
CCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3’(序列編號36):Cfr9I部位係以下標線表示)進行RT-PCR,將所獲得之片段以限制酶EcoRI與Cfr9I處理,且插入同樣經限制酶EcoRI與Cfr9I處理之pDual-H1N1/HA1-gp64中,以製作pDual-H1N1/NAe-gp64。
(18)本發明之轉移載體pDual-M2e-gp64之建構
將pDual-H1N1/M2-gp64作為模板,並使用M2-f EcoRI(5’-CGGAATTC
ATGAGTCTTCTAACCGAGG-3’(序列編號37):EcoRI部位係以下標線表示)與M2e-r Cfr9I(5’-GATCCCGGG
CATCACTTGAACCGTTGCA-3’(序列編號38):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,將所獲得之片段以限制酶EcoRI與Cfr9I處理,且插入同樣經限制酶EcoRI與Cfr9I處理之pDual-H1N1/HA1-gp64中,以製作pDual-M2e-gp64。
(19)本發明之轉移載體pCP-HA1/NC99-gp64之建構
從流行性感冒病毒新喀里多尼亞(NewCaledonia)/20/99(NC99)之冷凍保存液中使用QIAamp
MiniElute病毒離心套組(QIAGEN)萃取RNA,使用引子HA1-f EcoRI(5’-GATGAATTC
GACACAATATGTATAGGCTACC-3’(序列編號39):EcoRI部位係以下標線表示)與HA1-r Cfr9I(NC99)(5’-GATCCCGGG
CTCTGGATTGAATGGATGGGATG-3’(序列編號40):CFr9I部位係以下標線表示)進行RT-PCR,以擴增HA1基因片段。將所獲得之片段與pCP-H1N1/HA1-gp64以限制酶EcoRI與CFr9I處理,並於pCP-H1N1/HA1-gp64之HA1之轉殖區域中插入新的源自NC99之HA1基因片段。將所獲得之質體當作為pCP-HA1/NC99-gp64。
(20)本發明之轉移載體pCP-H1N1/HA0-gp64之建構
將pCR-Blunt-HA作為模板,並使用HA0-f EcoRI(5’-GGGGAATTC
ATGAAGGCAAACCTACTGG-3’(序列編號41):EcoRI部位係以下標線表示)與HA2-r Cfr9I(5’-GATCCCGGG
CGATGCATATTCTGCA-3’(序列編號42):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,以擴增HA基因全長。將獲得之片段與pCP-H1N1/HA1-gp64分別以限制酶EcoRI與Cfr9I處理,而於pCP-H1N1/HA1-gp64之HA1轉殖區域插入新的HA0基因片段。將所獲得之質體當作為pCP-H1N1/HA0-gp64。
(21)本發明之轉移載體pCP-H1N1/HA2-gp64之建構
將pCR-Blunt-HA作為模板,並使用HA2-f EcoRI(5’-GATGAATTC
ATATTTGGAGCCATTGCCG-3’(序列編號
43):EcoRI部位係以下標線表示)與HA2-r Cfr9I(5’-GATCCCGGG
CGATGCATATTCTGCA-3’(序列編號44):Cfr9I部位係以下標線表示)進行PCR,以擴增HA基因之HA2區域。將所獲得之片段與pCP-H1N1/HA1-gp64分別以限制酶EcoRI與Cfr9I處理,而於pCP-H1N1/HA1-gp64之HA1轉殖區域插入新的HA2基因片段。將所得到的質體當作為pCP-H1N1/HA2-gp64。
(22)本發明之轉移載體pCP-H1N1/HA1-vp39之建構
將附在BacVector-2000轉染套組(Novagen)中之桿狀病毒DNA作為模板,並使用vp39-f(5’-CTTACTAGT
ATGgactacaaggacgacgatgacaagGGCGGCGGCGGCTCGGCGCTAGTGCCCGTGGGT-3’(序列編號45):SpeI部位係以下標線表示,EcoRI係以雙下標線表示))與vp39-r(5’-CTTCACTTAGTG
ATGGTGATGATGGTGGTGGCTTTAAAGCTTGACGGCTATTCCTCCACC-3’(序列編號46):Dralll部位係以下標線表示,SmaI係以雙下標線表示))進行PCR,以擴增vp39基因區域。將所擴增之片段與pDual-H1N1/HA1-gp64以限制酶SpeI與DraIII切斷,並分別連接以建構pDual-vp39。再者,將pDual-H1N1/HA1-gp64作為模板,並使用Polh-S1(5’-GCTAACCATGTTCATGCC-3’(序列編號47))與HA1-r EcoRI(5’-GGGGAATTC
ACCTCTGGATTGGATGGAC-3’(序列編號48):EcoRI部位係以下標線表示)進行PCR,將所獲得之片
段以EcoRI分解,而調整HA1基因片段。將所得到之片段插入經限制酶EcoRI分解之pDual-vp39,以建構pCP-H1N1/HA1-vp39。
(23)本發明之轉移載體pCP-H1N1/NP-vp39之建構
將pDual-H1N1/NP-gp64作為模板,並使用NP-f5 EcoRI(5’-ACGGAATTC
ATGGCGTCCCAAGGCACC-3’(序列編號49):EcoRI部位係以下標線表示)與NP-r EcoRI(5’-ACGGAATTC
ATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3’(序列編號50):EcoRI部位係以下標線表示)進行PCR,將所獲得之片段以EcoRI分解。將所得到之片段插入至經限制酶EcoRI分解之pDual-vp39,而建構pCP-H1N1/NP-vp39。
参考例1:pBACgus-CMV-PbCSP之建構
(1.1)pcDNA-GL3(luc)之建構
將pGL3-增強子(Promega公司)以限制酶HindIII/XbaI切斷,並將螢光素酶(Luciferase)基因DNA片段(約1690bp)接合至pcDNA3.1(Invitrogen公司製)之HindIII/XbaI部位中,而將得到的質體命名為pcDNA-GL3(luc)。
(1.2)pBACgus-CMV-IgHsp65之建構
將pcDNA-IgHsp65以BglII/SphI切斷,並將由CMV啟動子、具有小鼠Igk訊息序列之Hsp65基因、源自牛生長基因之聚腺嘌呤訊息所組成之基因匣(約2850bp)插入pBACgus-1(Novagen公司)之BglII/SphI部位處。
將建構的質體命名為pBACgus-CMV-IgHsp65。
(1.3)pBACgus-CMV-GL3之建構
將於前述得到之質體pcDNA-GL3(luc)以限制酶NheI/XbaI切斷,並將螢光素酶基因DNA片段(約1690bp)插入質體pBACgus-CMV-IgHsp65之NheI/XbaI部位中,而將得到的質體命名為pBACgus-CMV-GL3。
(1.4)pBACgus-CMV-PbCSP之建構
將於前述實施例1之(1.1)所獲得之質體pBACsurf-CSP以限制酶PstI與SmaI切斷,藉此得到編碼有PbCSP之胜肽之21-305之胺基酸序列的基因片段,並將該DNA片段(約858bp)插入於前述獲得之pBACgus-CMV-GL3之PstI與SmaI部位中,而將得到的質體命名為pBACgus-CMV-PbCSP。
(1.5)pBACgus-CMV-HA-full之建構
將pCR-Blunt-HA以BamHI/Sse8387I切斷,並將HA基因DNA片段(約1750bp)插入pBluescript II(KS-)之BamHI/PstI部位中,而建構質體pBluescript-HA。
再將pBluescript-HA以HindIII/XbaI切斷,並將HA基因DNA片段(約1800bp)插入於(1.3)所得到之pBACgus-CMV-GL3之HindIII/XbaI部位中,而建構質體pBACgus-CMV-HA-full。
實施例2:本發明重組桿狀病毒及其製造法
(1)重組桿狀病毒,係使用重組桿狀病毒製作套組(BacVector-2000轉染套組,Novagen公司),將於前述實施例1所建構之轉移載體:pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、
pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP119
-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39及於參考例1所得到之質體pBACgus-CMV-PbCSP、pBACgus-CMV-HA-full各別與BacVector-2000 DNA進行共轉染(co-transfection)至Sf9細胞中以製作。
將製作的重組桿狀病毒分別命名為AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP119
、AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-CMV-H1N1/HA-full、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2及AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39。
將Sf9細胞以調整成每150mm細胞培養皿(Sumiron:秋田住友bake公司製)有2 x 107
個細胞來培養,將前述
之桿狀病毒分別以複感染率(Multiplicity of infection;M.O.I)約為5來感染。5-6日後,將培養液以10,000 x g、4℃離心25分鐘來回收,再藉由Beckman超高速離心機(SW28旋轉轉子)以25,000rpm、4℃來離心90分中而得到病毒粒子。
(2)重組桿狀病毒係可使用重組桿狀病毒製作套組(BacVector-2000轉染套組,Novagen公司),將於前述實施例1所建構之轉移載體pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64與BacVector-2000 DNA共轉染Sf9細胞來製作。將所製作的重組桿狀病毒分別命名為AcNPV-Dual-H5N1/HA1及AcNPV-Dual-SARS/S。
將Sf9細胞以調整成每150mm細胞培養皿(Sumiron:秋田住友bake公司製)有2 x 107
個細胞來培養,將前述之桿狀病毒分別以複感染率約為5來感染。5-6日後,將培養液以10,000 x g、4℃離心25分鐘來回收,再藉由Beckman超高速離心機(SW28旋轉轉子)以25,000rpm、4℃來離心90分鐘而得到病毒粒子。
實施例3:本發明重組桿狀病毒之藥理效果試驗
(作為瘧疾疫苗之藥理效果試驗)
(預防瘧疾感染實驗)
3.實驗方法
3.1 疫苗接種
對BALB/c雌小鼠,將用於疫苗之重組病毒液以3週間隔接種3次。於大腿肌肉肌肉內注射時接種液量係設為
0.2mL/個體,且將病毒液製備成5 x 106
pfu/個體之病毒量。
3.2 對小鼠之瘧疾感染
將各群小鼠於第三次之疫苗接種3週後,以用於小鼠之麻酔液麻酔,再使感染有小鼠瘧疾(Plasmodium berghei
ANKA 2.34選殖株)之蚊(史帝芬塞瘧蚊(Anopheles stephensi
)SDA 500品系)叮咬以使其感染瘧疾。
3.3 各群小鼠之存活率之計算
計算瘧疾感染後之各群小鼠之死亡例的數量,而計算出各群小鼠之存活率。
3.4 將針對本發明醫藥組成物作為疫苗之瘧疾感染防禦效果的藥理效果試驗結果示於表1。將各群小鼠之存活率示於表1之右邊。
如表1所示,於末梢血液中確認有瘧疾感染紅血球之小鼠,到感染第38天為止全例死亡。而於經插入孢子蟲期之抗原(CSP)基因之重組病毒中,於將於實施例2所得到的重組桿狀病毒(包含實施例1(2)之轉移載體:AcNPV-Dual-PbCSP)進行肌肉內注射的群(群編號4)確認有100%之感染防禦效果。
於野生型桿狀病毒(群編號2)中,無法確認與控制群(群編號1)有差異;而於使用哺乳動物病毒啟動子之於實施例1中所獲得之重組桿狀病毒(包含參考例1之載體:AcNPV-CMV-PbCSP)群(群編號3)中,與控制群相比確認有些許高的存活率,雖微弱卻暗示了顯示因重組病毒接種
而產生的效果之可能性。
實施例4:本發明重組桿狀病毒之藥理效果試驗
(作為流行性感冒病毒疫苗之藥理效果試驗)
(預防流行性感冒病毒感染實驗)
4.實驗方法
4.1 疫苗
用於疫苗之病毒液之接種係以2週間隔接種2次。疫苗病毒係對大腿肌肉肌肉內使用29G之用於胰島素注射之針筒,而於每一隻小鼠接種106.5
PFU。
4.2 用於挑戰(Challenge)之病毒液之製備
於流行性感冒病毒感染當日,將流行性感冒病毒(Influenza virus)A/PR/8/34株之保存病毒液以室溫自然融解。將已融解之保存病毒液使用滅菌0.1%牛血清白蛋白(含有BSA:Bovine Serum Albumin之達魯貝哥磷酸緩衝液(Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline:(D-PBS))於供下呼吸道時稀釋為1000TCID50
/0.05mL,而於供上呼吸道感染時稀釋為1000TCID50
/0.005mL,而作為供挑戰之病毒液。
4.3.病毒液之鼻腔內接種
自第二次之疫苗接種2週後,將用於小鼠之麻酔液以每隻小鼠0.05mL進行肌肉內投予而麻酔。將於4.2所製作之流行性感冒病毒液使用微量吸管,於經麻酔之小鼠的鼻腔內對上呼吸道感染接種0.005mL,而對下呼吸道感染系接種0.05mL。
4.4 肺之採取
自病毒接種3日後,對各群中4隻小鼠以每隻小鼠0.1mL對肌肉內投予用於小鼠之麻酔液,於麻酔之下使其自腹部下大靜脈放血進行安樂死後,解剖各群小鼠,無菌地將肺摘出。
4.5 流行性感冒病毒接種後之小鼠存活率之記錄
直至病毒接種11日,1日確認小鼠之存活1次並記錄。
4.6 肺均質物製作及稀釋液之製備
肺均質物係於經摘出的每1隻的肺加入添加3mL之0.1%BSA、10mM HEPES緩衝液、抗生物質的最低必需培養基:Minimum Essential Medium(MEM,GIBCO),使用POLYTRON均質機磨碎而製作。肺均質物係分別注入抗凍管中,並保存於超低溫冷凍庫中。
使用添加前述抗生物質及胰蛋白酶(SIGMA,T-4549,2μg/mL)之MEM培養基,製作10倍稀釋或100.5
倍稀釋系列。
4.7 細胞增殖用培養基的製作
製備對MEM500 mL添加有仔牛血清(Fetal Bovine Serum:FBS)50mL之細胞增殖用培養基(MEM+10% FBS)
冷藏保存至使用時。
4.8 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney)源自犬腎臟之細胞之培養
將凍結保存之MDCK細胞於溫水中急速融解後,懸浮於10mL之細胞增殖用培養基中,以離心(1000r.p.m.、5分、4℃)除去上清液。將經離心回收之細胞沉澱物懸浮漂於細胞增殖用培養基中。接種於培養瓶中培養於設定成37℃、5% CO2
之培養箱內。培養開始後,以顯微鏡觀察細胞之型態及增殖狀態,並於MDCK細胞即將成為群集(confluent)前,將細胞以D-PBS(-)洗滌後,以胰蛋白酶+EDTA處理且分散細胞,而懸浮於細胞增殖用培養基中。將細胞懸浮液接種於培養瓶中,加入新鮮的細胞增殖用培養基進行繼代培養。
4.9 供病毒增殖用之培養基(維持培養基)之製作
將對MEM 500mL(10mM HEPES緩衝液添加)添加BSA使其成為0.1%之培養基作為供病毒增殖用之培養基(MEM+0.1% BSA),於製備後冷藏保存至使用時。並於使用時添加抗生物質。
4.10 病毒感染價之測量(細胞病變作用(Cytopathic Effect),CPE法)
於培養瓶之MDCK細胞即將成為群集前,以胰蛋白酶+EDTA處理且分散細胞,計算細胞數,使用維持培養基,調整為60萬細胞/mL之MDCK細胞懸浮液。將其每0.05mL分別注入96孔盤中,於設定成5%CO2
、37℃之CO2
培養
箱內培養一晚。
隔天,確認細胞已附著,而將製作好的各肺均質物稀釋液以每1孔0.05mL分別注入於96孔盤之6孔中。將分別注入有肺均質物稀釋液之96孔盤於設定成5%CO2
、37℃之CO2
培養箱內培養3日。
於培養第3天確認孔中的細胞變性,將含有30%福馬林之結晶紫溶液以各0.05mL分別注入於96孔盤之各孔中,並固定染色,且藉由利德-曼區(Reed-Münch)法計算出肺內病毒感染價,藉此計算出感染價。
4.11 對於各疫苗群之小鼠體內之病毒感染價之效果
使用作為控制群之AcNPV-WT接種群與疫苗群之實施例2之重組桿狀病毒(包含於實施例1(3)所得到的轉移載體:AcNPV-Dual-H1N1/HA1)與重組桿狀病毒(包含於參考例1所得到之載體:AcNPV-CMV-H1N1/HA full)接種群之小鼠肺均質物液中之病毒感染價,且將各自之病毒感染價進行對數變換,而以考慮到多重性之單因子變異數分析塔基試驗(Tukey test)(Release 8.1,SAS Institute Japan Ltd)來解析各接種群間之治療效果。
將其結果示於第1圖。
對於各疫苗群之流行性感冒病毒感染後之存活期之效果
關於作為控制群之AcNPV-WT接種群與疫苗群之AcNPV-Dual-H1N1/HA1與AcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群之存活期,使用對數秩作比較,並示於第2圖。
統計解析係使用SAS系統(SAS Institute Japan,R.8.1)
進行研究。將顯著水準設為5%。
4.12 肺內病毒感染價
AcNPV-Dual-H1N1/HA1肌肉內接種群,與AcNPV-WT接種群相較之下係顯著地(p值:0.0009)抑制感染第6日之肺內病毒感染價。另一方面,AcNPV-Dual-H1N1/HA1肌肉內接種群,與AcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群相較之下係顯著地(p值:0.0094)抑制感染第6日之肺內病毒感染價。
4.13 存活期
AcNPV-Dual-H1N1/HA1肌肉內接種群,與AcNPV-WT接種群相較之下係顯著地(p值:0.0031)延長存活期。另一方面,AcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群之存活期與AcNPV-WT接種群並無差異(p值:0.7851)。
再者,AcNPV-Dual-H1N1/HA1肌肉內接種群之存活期,與AcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群相較之下係顯著地(p值:0.0031)延長。
藉由此評定系,係可自小鼠引起流行性感冒病毒肺炎而死亡來推測藉由將AcNPV-Dual-H1N1/HA接種至肌肉內,而可抑制肺內病毒之增殖,並抑制因肺炎而引起之小鼠死亡。
實施例5:昆蟲細胞中自本發明重組桿狀病毒表現疫苗抗原之試驗
將Sf9細胞於12孔盤中以每1孔3 x 106
細胞來培養,並使於實施例2所得到之桿狀病毒粒子
AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-H1N1/HA1及作為控制組之野生型桿狀病毒AcNPV-WT以複感染率約為5來感染。3-4日後,去除培養上清液,以PBS漂洗3次後,以每1孔0.2mL添加含有2% 2-巰乙醇之雷姆立(Leamuli)液(50mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸[pH6.8]、2% SDS、10%甘油(glycerol)、0.1%溴酚藍(bromophenol blue)),而完全溶解細胞。於95℃沸騰5分鐘後,以6% SDS-PAGE進行電泳。電泳後,將蛋白轉印至PVDF膜(Immobilon-P、Millipore公司製),浸泡於Block Ace(大日本製藥公司製)中於4℃進行12小時阻斷(blocking)。以以下程序進行西方墨點法。轉印有各桿狀病毒感染Sf9細胞蛋白之膜,係加入作為一次抗體之小鼠抗FLAG單株抗體(SIGMA公司製)、做為二次抗體之生物素標幟山羊抗小鼠IgG(H+L)(Vector公司製)培養,再加入鹼性磷酸酯酶標幟抗生物素(GIBCO-BRL公司製),以NBT/BCIP(GIBCO-BRL公司製)呈色而檢測出反應的蛋白之條帶(band)。將其結果示於第3圖。
於第3圖中,係顯示來自於重組轉移載體之流行性感冒病毒HA抗原基因、結核菌Hsp65基因及瘧原蟲CSP基因之重組桿狀病毒於昆蟲細胞內的融合抗原之表現之西方墨點分析之圖,圖中左方泳道之泳道1係顯示野生型桿狀病毒(AcNPV-WT);泳道2係顯示於本發明之雙啟動子下插入流行性感冒病毒HA抗原基因之重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)之條帶;圖中,中央泳道之泳道3
係顯示野生型桿狀病毒(AcNPV-WT);泳道4係顯示於本發明之雙啟動子下插入結核菌Hsp65基因之重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-Hsp65)之條帶;圖中右方泳道之泳道5係顯示野生型桿狀病毒(AcNPV-WT);泳道6係顯示於本發明之雙啟動子下插入瘧原蟲CSP基因之重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-PbCSP)。
如該圖之泳道2、4及6所示,在於本發明之雙啟動子下將各種抗原與gp64基因融合表現之重組桿狀病毒中,可觀察到免疫原性外來抗原基因與gp64基因之融合表現產物之條帶。
據此,確認到於昆蟲細胞可表現免疫原性外來抗原基因與gp64基因之融合表現產物。
實施例6:哺乳動物中之自本發明重組桿狀病毒的疫苗抗原之表現試驗
於HepG2細胞中分別以複感染率約為1來感染AcNPV-Dual-Hsp65、作為控制組的AcNPV-WT。24小時後,除去培養上清液,以PBS漂洗3次後,加入經-20℃冷卻之丙酮.乙醇液(7:3混合),於-20℃5分鐘進行細胞固定。添加5%正常山羊血清液(SIGMA公司製),於室溫進行1小時之阻斷。接下來,加入作為之小鼠抗Hsp65抗體(Yoshida et al.,Vaccine 2005)、作為二次抗體之FITC標幟山羊抗小鼠IgG(H+L)(BIOSOURCE公司製)進行培養,以螢光顯微鏡檢測反應之細胞。
又,將HepG2細胞培養成每個直徑100mm之細胞培養皿1 x 107
細胞,並以複感染率約為5來感染於實施例2
所得到的桿狀病毒粒子AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-CMV-H1N1/HA full及作為控制組之AcNPV-WT。2小時後,除去培養上清液,以PBS漂洗3次後,以不含甲硫胺酸及半胱胺酸之培養基(於Dulbecco's Modified Eagle培養基(Invitrogen公司)中將經PBS透析之FBS加入成10%之培養基)培養3小時,並將經放射線同位素標定之甲硫胺酸及半胱胺酸溶液(TRANS35S-LABEL MP Biomedicals,Inc.)加入成最終濃度為5微Ci/ml。12小時後,除去培養上清液,以PBS漂洗3次後,以0.5mL RIPA緩衝液(1%脫氧膽鈉,1%川通X-100(Triton X-100),0.1% SDS,10mM TrisHCl[pH 7.5])溶解細胞而成為樣品。於預先吸附流行性感冒感染血清(小鼠)之蛋白質A-瓊脂糖CL-4B(Pharmacia公司)載劑中加入前述各樣品,於冰上培養2小時。將載劑以RIPA緩衝液洗滌5次後,加入含有2% 2-巰乙醇之雷姆立液,以95℃沸騰5分鐘後,以6% SDS-PAGE進行電泳。電泳後,使膠體乾燥,以自動放射照相術檢測與抗體反應之蛋白。
其結果係示於第4及5圖。
於第4圖中,(A)係表示顯示於HepG2細胞中的結核菌Hsp65基因重組桿狀病毒表現之螢光標定抗體染色細胞之圖。
於第4圖中,(B)係表示將野生型桿狀病毒加入HepG2細胞時之圖。
如可由該圖之(A)所了解一般,可知使用了本發明
之雙啟動子之轉移載體的重組桿狀病毒於哺乳動物細胞中,會使目標抗原表現。
據此,暗示了由本發明之重組轉移載體製造的重組桿狀病毒,於投予至包含人類的哺乳動物中時,病毒粒子會侵入哺乳動物細胞中,啟動哺乳動物啟動子,而於哺乳動物細胞內製造目標外來抗原基因與gp64基因之融合物,而誘發後天免疫。
第5圖中,係以免疫沉澱法分析於雙啟動子下重組入流行性感冒病毒HA抗原基因之重組桿狀病毒於哺乳動物細胞中之融合抗原的表現之圖。圖中左方泳道之泳道1係使用加入野生型桿狀病毒(AcNPV-WT)之HepG2細胞萃取液;泳道2係使用加入於CMV啟動子下重組入流行性感冒病毒HA抗原基因之重組桿狀病毒(AcNPV-CMV-H1N1/HA full)之HepG2細胞萃取液;泳道3係使用加入於雙啟動子下重組入流行性感冒病毒HA抗原基因以可與gp64基因融合表現的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)之HepG2細胞萃取液。
可了解於CMV啟動子下重組入流行性感冒病毒HA抗原基因之重組桿狀病毒(AcNPV-CMV-H1N1/HA full),與於雙啟動子下重組入流行性感冒病毒HA抗原基因以可與gp64基因融合表現的重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)中,對流行性感冒病毒感染血清專一地反應的蛋白質,亦即包含HA抗原之蛋白質可於HepG2細胞內新合成。
據此,可認為本發明之重組桿狀病毒,即使於哺乳動
物細胞內亦可使所希望的免疫原性外來抗原基因之抗原蛋白表現,而於對包含人類的哺乳動物投予重組病毒時,隨著融合抗原於人類細胞中的表現,可誘發專一性抗原的後天免疫。
實施例7:呈現於本發明重組桿狀病毒之病毒粒子(virion)上之疫苗抗原中的融合抗原之確認試驗
將於實施例2所得到的桿狀病毒粒子AcNPV-WT、AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-PbCSPsurf、AcNPV-Dual-PbCSP以超高速離心分離而回收之病毒濃縮液各0.005mL中加入0.005mL 2 x雷姆立液,於95℃沸騰5分鐘後,以6% SDS-PAGE進行電泳。電泳後,將蛋白質轉印至PVDF膜(Immobilon-P、Millipore公司製)上,浸泡於Block Ace(大日本製藥公司製)中於4℃進行12小時阻斷。以以下程序進行西方墨點法。轉印有各桿狀病毒粒子蛋白之膜,係加入作為一次抗體之小鼠抗FLAG單株抗體(SIGMA公司製)、作為二次抗體之生物素標幟山羊抗小鼠IgG(H+L)(Vector公司製)培養,再加入鹼性磷酸酯酶標幟抗生物素(GIBCO-BRL公司製),以NBT/BCIP(GIBCO-BRL公司製)呈色而檢測出反應的蛋白之條帶。將其結果示於第6圖。
於第6圖中,係顯示由重組轉移載體製作之重組桿狀病毒之瘧疾CSP基因(PbCSP)分別表現之西方墨點分析之圖,圖中左方泳道之泳道1係顯示野生型桿狀病毒;泳道2係將以於哺乳動物啟動子調控下插入PbCSP抗原基因之轉
移載體來製作重組桿狀病毒進行電泳;泳道3係將以於桿狀病毒多角體啟動子控制下插入PbCSP抗原基因以與gp64基因融合表現之轉移載體來製作的重組桿狀病毒進行電泳;泳道4係將本發明之使用雙啟動子,而可融合表現地插入PbCSP抗原基因與gp64基因之重組桿狀病毒進行電泳;以確認PbCSP基因與gp64基因之融合表現物。如該圖之泳道3及4所示,可分別確認到於AcNPV-PbCSPsurf與AcNPV-Dual-PbCSP中顯示在重組病毒粒子上融合抗原之存在之強條帶。
如此一來由實施例7,可知自本發明之重組轉移載體所製造的本發明之重組桿狀病毒,係於重組病毒粒子中可存在所希望的免疫原性外來基因與gp64基因之融合表現產物。
實施例8:藉由啟動子更換而造成基因表現之持續性
1)啟動子更換而造成之基因表現之持續性
為了確認重組病毒於培養細胞內的抗原之表現之持續性,將AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1對HeLa細胞感染,而確認抗原之表現。將細胞分別接種於24孔盤中以成為1.0×104
細胞/孔。之後,以MOI=10、20、100感染病毒,進行1小時之吸附。其後,自細胞培養上清液除去病毒,於培養箱內進行培養。定時地回收細胞,並進行RNA萃取。將萃取出之RNA作為模板並使用引子HA1_F01(5’-GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3’(序列編號51))與引子HA1_R01(5’-GGGTGATGAATACCCCACAG-3’(序列編號
52))進行RT-PCR,並將擴增之DNA藉由電泳進行解析。結果,確認3種類皆有表現,而可確認於本發明之重組桿狀病毒中可從CMV啟動子更換成其他真核生物啟動子。
第7圖係藉由RT-PCR檢測於HeLa細胞中基因之表現的結果,M係顯示將DNA電泳標記進行電泳的結果;1係顯示將源於以MOI=10感染野生型病毒之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;2係顯示將源於以MOI=20感染野生型病毒之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;3係顯示將源於以MOI=100感染野生型病毒之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;4係顯示將源於以MOI=10感染AcNPV-CP-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;5係顯示將源於以MOI=20感染AcNPV-CP-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;6係顯示將源於以MOI=100感染AcNPV-CP-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;7係顯示將源於以MOI=10感染AcNPV-CU-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於
感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;8係顯示將源於以MOI=20感染AcNPV-CU-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;9係顯示將源於以MOI=100感染AcNPV-CU-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;10係顯示將源於以MOI=10感染AcNPV-CAP-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;11係顯示將源於以MOI=20感染AcNPV-CAP-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果;12係顯示將源於以MOI=100感染AcNPV-CAP-H1N1/HA1之細胞之RNA定時地於感染0小後、1日後、4日後、7日後回收,並進行RT-PCR,且將該擴增DNA進行電泳之結果。
實施例9:藉由PbCSP抗原重組病毒而造成之抗體價與細胞性免疫的誘發
1.疫苗接種
對BALB/c雌小鼠,以3週間隔接種用於疫苗之重組病毒液3次。接種液量於大腿肌肌肉內注射時設為0.2mL/個體,並製備成1×108
pfu/個體之病毒量之病毒液。疫苗係接種野生型病毒(AcNPV-WT)、AcNPV-PbCSPsurf(Yoshida
et al.Virology 316:161-70,2003)、AcNPV-Dual-PbCSP。
2.小鼠之解剖
自最終免疫起3週後進行安樂死,自小鼠回收血清及脾臟。血清係使用於專一抗體價之測量,而脾臟則使用於ELISPOT分析法。
3.抗體價之測量
使用將於大腸桿菌中強制表現並純化回收之PbCSP重組蛋白質固相化之盤,以酵素免疫測定法(ELISA)法進行抗體價之測量。ELISA法係遵循標準方法進行。結果,於非接種群或野生型病毒接種群之中雖無法確認到抗體價之上升,但於AcNPV-PbCSPsurf接種群與AcNPV-Dual-PbCSP接種群之中可確認到專一性抗體價之上升。
於第8圖中,係表示非接種群、野生型病毒接種群、AcNPV-PbCSPsurf接種群、AcNPV-Dual-PbCSP接種群之PbCSP專一性IgG抗體之力價。
4.使用ELISPOT分析法之細胞性免疫之評定
使用已進行免疫之小鼠之脾臟細胞,進行ELISPOT分析法。從小鼠脾臟細胞來調整細胞,並於MultiScreen-IP(Millipore)添加適量的細胞。對其添加已知作為PbCSP之CD8表位的胜肽(胺基酸序列:SYIPSAEKI、序列編號53,進行一夜培養。之後,使用ELISPOT小鼠IFN-γ ELISPOT組(BD Sciences)進行反應,並使用AEC基質組(BD Sciences)進行呈色。藉由測量呈色之點,而可測量進行抗原專一性反應之細胞數。結果,於非接種群、野
生型病毒接種群、AcNPV-PbCSPsurf接種群之中雖無法確認到抗原專一性的細胞,但於AcNPV-Dual-PbCSP接種群之中可於每106
個之脾臟細胞中觀察到約350個反應細胞。由此可知,AcNPV-Dual-PbCSP係可比AcNPV-PbCSPsurf更顯著地誘發細胞性免疫。
於第9圖中,顯示了非接種群、野生型病毒接種群、AcNPV-PbCSPsurf接種群、AcNPV-Dual-PbCSP接種群對PbCSP之CTL表位製造專一性IFN-γ之細胞數。
實施例10:將重組桿狀病毒作為有效成分之疫苗的抗病毒之效果確認試驗
(M2e重組桿狀病毒之效果確認試驗)
將M2e重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-M2e)對大腿肌肌肉內以每隻小鼠3.4×108
PFU之量,並以2週間隔進行2次接種。自最終疫苗接種起算2週後,於小鼠鼻腔內將1000TCID50
之病毒以0.005mL之溶液接種流行性感冒病毒(Influenza virus)A/PR/8/34,來進行感染。於感染6日後進行安樂死,並將肺摘出,使用MDCK細胞進行肺內病毒量之檢測。結果,於經接種AcNPV-Dual-M2e之小鼠中進行試驗的所有小鼠皆無法檢測出流行性感冒病毒。再者,此同時為與HA1重組桿狀病毒疫苗(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)肌肉內接種群(每隻小鼠1.0×107
PFU)相同之效果。
第10圖中,顯示PBS群、AcNPV-Dual-M2e接種群、AcNPV-Dual-H1N1/HA1接種群之流行性感冒病毒感染6日後的肺內病毒量。
實施例11:將HA1/NC99重組桿狀病毒作為有效成分之藥品之預防效果確認試驗
將HA1/NC99重組桿狀病毒(AcNPV-CP-HA1/NC99)對大腿肌肌肉內以每隻小鼠1.0×108
PFU之量,並以2週間隔進行2次接種。自最終疫苗接種起算2週後,於小鼠鼻腔內將1000TCID50
之病毒以0.05mL之溶液接種流行性感冒病毒(Influenza virus)A/新喀里多尼亞/20/99,進行感染。於感染3日後進行安樂死,並將肺摘出,使用MDCK細胞進行肺內病毒量之檢測。結果,於經接種AcNPV-CP-HA1/NC99之小鼠中4例中有3例之小鼠並無法檢測出流行性感冒病毒。
第11圖中,顯示PBS群、野生型病毒接種(AcNPV-WT)群、AcNPV-CP-HA1/NC99接種群之流行性感冒病毒感染3日後的肺內病毒量。
實施例12:將重組桿狀病毒作為有效成分之醫藥組成物之依據投予途徑的專一抗體之確認測試
將HA1重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1),以每隻小鼠2.0×107
PFU之量,分別經由點鼻(將病毒液接種0.005mL於兩鼻中)、經鼻(將病毒液從鼻接種0.05mL)、經呼吸道(將病毒液經呼吸道接種0.05mL)、肌肉注射(將病毒液接種0.05mL於大腿肌肉)之投予途徑來接種,而以2週間隔進行2次接種。自最終疫苗接種起算2週後採取鼻洗滌液、肺泡洗滌液、血清,且確認流行性感冒病毒專一性的抗體表現。使用將感染有流行性感冒病毒(Influenza
virus)A/PR/8/34之MDCK細胞萃取液固相化之盤,以ELISA法進行抗體價之測量。ELISA法係遵循標準方法進行。結果,於經鼻、經呼吸道、肌肉注射投予群中,在血中確認到專一性的IgG抗體,特別是於經呼吸道投予中可確認有強抗體誘導。再者,於鼻洗滌液或肺泡洗滌液中,亦可同樣確認到抗原專一性的IgG抗體,特別是於經呼吸道投予中可確認有強抗體誘導。再者,於經呼吸道投予群中,亦確認到於肺泡洗滌液中之抗原專一性的IgA抗體之製造。
於第12圖中,表示了測量點鼻接種群、經鼻接種群、經呼吸道接種群、肌肉內接種群之血中的流行性感冒病毒專一性的IgG抗體的ELISA之結果。
於第13圖中,表示了測量點鼻接種群、經鼻接種群、經呼吸道接種群、肌肉內接種群之鼻洗滌液及肺泡洗滌液中之流行性感冒病毒專一性的IgG及IgA抗體之ELISA之結果。
實施例13:將重組桿狀病毒作為有效成分之醫藥組成物之依據投予途徑的效果之確認測試
將HA1重組桿狀病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1),以每隻小鼠1.0×107
PFU之量,分別經由點鼻、經鼻、經呼吸道、肌肉注射之投予途徑來接種,而以2週間隔進行2次接種。自最終疫苗接種起算2週後,將1000TCID50
之病毒以0.005mL之溶液,將流行性感冒病毒(Influenza virus)A/PR/8/34接種於小鼠鼻腔內,進行感染。於感染3
日後採取鼻洗滌液,於感染6日後摘出肺,並使用MDCK細胞進行肺內病毒量之檢測。結果,於經鼻投予群及經呼吸道投予群中顯著地抑制了感染第3天之鼻腔內病毒。再者,於經呼吸道投予群中,係與肌肉內接種群相同地將感染第6日的肺內病毒量抑制至檢測界限以下。
於第14圖中,表示了點鼻接種群、經鼻接種群、經呼吸道接種群、肌肉內接種群之流行性感冒病毒感染3日後的鼻洗滌液中的病毒量。
於第15圖中,表示了點鼻接種群、經鼻接種群、經呼吸道接種群、肌肉內接種群之流行性感冒病毒感染6日後的肺內洗滌液中的病毒量。
序列編號:1、2係用於P.berghei ANKA株之基因體DNA之PCR的引子PbCSP-F1與PbCSP-R1之引子序列。
序列編號:3、4係用於結核菌H37Rv之基因體DNA之PCR的引子phsp65-F1與phsp65-R1之引子序列。
序列編號:5、6係用於將pcDNA-IgHsp65作為模板之PCR的引子phsp65-F2與phsp65-R2之引子序列。
序列編號:7、8係用於將pBACsurf-1(Novagen公司製)作為模板以獲得gp64基因DNA片段的PCR的引子pPolh-F2與pgp64-R2之引子序列。
序列編號:9、10係用於製造流行性感冒病毒HA基因片段之PCR的引子HA-f與HA-r之引子序列。
序列編號:11、12係用於將pCR-Blunt-HA作為模板
之PCR的引子pHA-F1與pHA-R1之引子序列。
序列編號:13、14係用於PbTRAMP基因之PCR的引子pTRAMP-F1與pTRAMP-R1之引子序列。
序列編號:15、16係用於PbAMA1基因領域123(D123)之PCR的引子pAMA-F1與pAMA1-R1之引子序列。
序列編號:17、18係用於PbMSP119
基因之PCR的引子pMsp1-F1與pMsp1-R1之引子序列。
序列編號:19、20係用於PfCSP基因之PCR的引子pPfCSP-F1與pPfCSP-R1之引子序列。
序列編號:21、22係用於P.falciparum 3D7之PfAMA1基因之PCR的引子pPfAMA1-F1與pPfAMA1-R1之引子序列。
序列編號:23、24係用於P.falciparum之Pfs25基因之PCR的引子pPfs25-F1與pPfs25-R1之引子序列。
序列編號:25、26係用於將pDual-H1N1/HA-gp64作為模板之PCR的引子Polh-f RsrII與GP64-r DraIII之引子序列。
序列編號:27、28係用於CMV增強子區域之PCR的引子CMVenh-f FseI與CMVenh-r KpnI之引子序列。
序列編號:29、30係用於UBB啟動子區域之PCR的引子UBBp-f KpnI與UBBp-r RsrII之引子序列。
序列編號:31、32係用於流行性感冒病毒PR/8/34株之基因體RNA之RT-PCR的引子NP-f EcoRI與NP-r Cfr9I之引子。
序列編號:33、34係用於流行性感冒病毒PR/8/34株之基因體RNA之RT-PCR的引子M2-f EcoRI與M2-r Cfr9I之引子序列。
序列編號:35、36係用於流行性感冒病毒PR/8/34株之基因體RNA之RT-PCR的引子NAe-f EcoRI與NAe-r Cfr9I之引子序列。
序列編號:37、38係用於將pDual-H1N1/M2-gp64作為模板之PCR的引子M2-f EcoRI與M2e-r Cfr9I之引子序列。
序列編號:39、40係用於新喀里多尼亞/20/99(NC99)之基因體RNA之RT-PCR的引子HA1-f EcoRI與HA1-r Cfr9I(NC99)之引子序列。
序列編號:41、42係用於將pCR-Blunt-HA作為模板之PCR的引子HA0-f EcoRI與HA2-r Cfr9I之引子序列。
序列編號:43、44係用於將pCR-Blunt-HA作為模板之PCR的引子HA2-f EcoRI與HA2-r Cfr9I之引子序列。
序列編號:45、46係用於vp39基因區域之PCR的引子vp39-f與vp39-r之引子序列。
序列編號:47、48係用於HA1基因片段之PCR的引子Polh-S1與HA1-r EcoRI之引子序列。
序列編號:49、50係用於將pDual-H1N1/NP-gp64作為模板之PCR的引子NP-f5 EcoRI與NP-r EcoRI之引子序列。
序列編號:51、52係用於AcNPV-CP-H1N1/HA1,
AcNPV-CAP-H1N1/HA1,AcNPV-CU-H1N1/HA1之表現確認之引子。
序列編號:53係已知作為PbCSP之CD8表位之胜肽。
【第1圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第2圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的流行性感冒病毒感染預防效果(存活期)之圖。
【第3圖】由轉移載體製造之重組桿狀病毒於感染細胞內之流行性感冒病毒抗原基因(H1N1/HA1)、結核菌抗原基因(Hsp65)及瘧原蟲之孢子蟲(sporozoite)表面之表面抗原基因(PbCSP)的融合物之分別表現之西方墨點分析法之圖。
泳道1:AcNPV-WT
泳道2:AcNPV-Dual-HA1N
泳道3:AcNPV-WT
泳道4:AcNPV-Dual-Hsp65
泳道5:AcNPV-WT
泳道6:AcNPV-Dual-PbCSP
【第4圖】表示於脊椎動物細胞中由轉移載體製造之重組桿狀病毒的結核抗原基因(Hsp65)與gp64基因之融合表現的螢光標定染色之圖。
(A):轉殖入AcNPV-Dual-Hsp65之HepG2細胞
(B):轉殖入AcNPV-WT之HepG2細胞
【第5圖】表示以免疫沉澱法確認於脊椎動物細胞中由轉移載體製造之重組桿狀病毒的流行性感冒病毒HA抗原基因與gp64基因之融合蛋白質表現情形之圖。轉殖入重組桿狀病毒之HepG2細胞之免疫沉澱。HepG2細胞係轉殖了AcNPV-WT(泳道1)、AcNPV-CMV-H1N1/HA full(泳道2)或AcNPV-Dual-H1N1/HA(泳道3)。於轉導3小時後,細胞係被以[35S]甲基硫胺酸放射性標定12小時。將細胞分解物以採自感染有H1N1流行性感冒病毒之小鼠之血清進行免疫沉澱。
【第6圖】表示於昆蟲細胞中對自轉移載體製造之重組桿狀病毒粒子中的瘧原蟲CSP基因與gp64基因之融合表現物之表現的西方墨點分析法之圖。
泳道1:AcNPV-WT;泳道2:AcNPV-CMV-PbCSP;泳道3:AcNPV-PbCSPsurf;泳道4:AcNPV-Dual-PbCSP;
【第7圖】表示確認更換成脊椎動物啟動子之HA1重組桿狀病毒分別正於HeLa細胞中表現HA1與gp64之融合基因之RT-PCR的結果之圖。
【第8圖】表示經接種重組桿狀病毒之小鼠的血清中的PbCSP抗原專一性IgG抗體的製造之圖。
【第9圖】表示於經接種重組桿狀病毒之小鼠的脾臟細胞中的對PbCSP之CTL表位之抗反應性IFN-γ製造細胞數之
圖。
【第10圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-M2e所致的流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第11圖】表示藉由重組物桿狀病毒AcNPV-CP-HA1/NC99所致的流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第12圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1於血液中誘導的流行性感冒病毒專一性IgG抗體的製造之圖。
【第13圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1於鼻洗滌液及肺泡洗滌液中之誘導的流行性感冒病毒專一性IgG抗體及IgA抗體的製造之圖。
【第14圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的鼻腔內流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
【第15圖】表示經由不同的4個投予途徑投予之重組物桿狀病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1所致的肺內流行性感冒病毒感染預防效果(病毒感染價)之圖。
<110>
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新穎病毒載體<130> 200707TW <150> JP2006-32863 <151> 2006-2-9 <160> 53 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 140 <212> DNA <213> 引子<400> 1 <210> 2 <211> 67 <212> DNA <213> 引子<400> 2 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> 引子<400> 3 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> 引子<400> 4 <210> 5 <211> 74 <212> DNA <213> 引子<400> 5 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> 引子<400> 6 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> 引子<400> 7 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> 引子<400> 8 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> 引子<400> 9 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> 引子<400> 10 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> 引子<400> 11 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> 引子<400> 12 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> 引子<400> 13 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> 引子<400> 14 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> 引子<400> 15 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> 引子<400> 16 <210> 17 <211> 75 <212> DNA <213> 引子<400> 17 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> 引子<400> 18 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> 引子<400> 19 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> 引子<400> 20 <210> 21 <211> 73 <212> DNA <213> 引子<400> 21 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> 引子<400> 22 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> 引子<400> 23 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> 引子<400> 24 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> 引子<400> 25 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> 引子<400> 26 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> 引子<400> 27 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> 引子<400> 28 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> 引子<400> 29 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> 引子<400> 30 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> 引子<400> 31 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> 引子<400> 32 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> 引子<400> 33 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> 引子<400> 34 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> 引子<400> 35 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> 引子<400> 36 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> 引子<400> 37 <210> 38 <211> 28 <212> DNA <213> 引子<400> 38 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> 引子<400> 39 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> 引子<400> 40 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> 引子<400> 41 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> 引子<400> 42 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> 引子<400> 43 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> 引子<400> 44 <210> 45 <211> 75 <212> DNA <213> 引子<400> 45 <210> 46 <211> 66 <212> DNA <213> 引子<400> 46 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> 引子<400> 47 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> 引子<400> 48 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> 引子<400> 49 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> 引子<400> 50 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> 引子<400> 51 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> 引子<400> 52 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<400> 53
Claims (4)
- 一種藥學組成物,包含一重組苜蓿尺蠖核多角體病毒(AcNPV)作為活性劑,及選擇性的,一藥學上可接受的載體,其中,該重組AcNPV包含一具有下述融合DNA序列的DNA序列結構,並且受控於一含有互相連結之多角體蛋白啟動子(Polyhedrin promoter)及巨細胞病毒啟動子(CMV promoter)的雙啟動子(dual promoter):(A)一個編碼有瘧原蟲P.falciparum 3D7株之PfCSP(惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum )環子孢子蛋白)的DNA序列或其免疫原性片段;(B)一個編碼有桿狀病毒(baculovirus)gp64(醣蛋白64)蛋白質的基因資料庫登錄號L22858之DNA序列或其片段,前述DNA序列或片段可以成為該病毒顆粒的成分。
- 如請求項1之藥學組成物,其中,(A)之DNA片段是利用PCR及隨後以EcoR1及Cfr9I進行的切割來獲得者,該PCR是以下述方式來實施:以萃取自瘧原蟲P.falciparum 3D7株的基因體DNA當作模板,且利用序列編號19及序列編號20的引子;且,(B)之DNA片段是一已存在於利用PCR及隨後以RsrII及KpnI進行的切割來獲得之DNA片段的片段,該PCR是以下述方式來實施:以pBACsurf-1當作模板,並利用序列編號7及序列編號8的引子。
- 如請求項1之藥學組成物,其中,該重組AcNPV是 AcNPV-Dual-PfCSP。
- 如請求項1至3之藥學組成物,其係一瘧疾疫苗。
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