RU2588464C2 - Бакуловирусный вектор и его применение - Google Patents
Бакуловирусный вектор и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2588464C2 RU2588464C2 RU2012108129/10A RU2012108129A RU2588464C2 RU 2588464 C2 RU2588464 C2 RU 2588464C2 RU 2012108129/10 A RU2012108129/10 A RU 2012108129/10A RU 2012108129 A RU2012108129 A RU 2012108129A RU 2588464 C2 RU2588464 C2 RU 2588464C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acnpv
- dna
- gene
- dual
- promoter
- Prior art date
Links
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title claims abstract description 241
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 164
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 claims abstract description 77
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 66
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 50
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 244000045947 parasites Species 0.000 claims abstract description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 101700040790 PH Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241001505483 Plasmodium falciparum 3D7 Species 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract 4
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 claims description 129
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 claims description 129
- 230000003612 virological Effects 0.000 claims description 63
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 35
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 129
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 111
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 111
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 90
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 15
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 159
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 76
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 71
- 101710012186 SLC7A1 Proteins 0.000 description 62
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 59
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 53
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 49
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 37
- 101700037939 DNAPR Proteins 0.000 description 36
- 101700030310 FUS Proteins 0.000 description 36
- 101700018595 gp64 Proteins 0.000 description 36
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 34
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 34
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 101710043164 Segment-4 Proteins 0.000 description 31
- 101700038759 VP1 Proteins 0.000 description 31
- 101700005460 hemA Proteins 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 27
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 description 27
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 27
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 25
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 description 24
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 24
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 24
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 23
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 22
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 22
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 22
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 21
- 102100002229 MYO1G Human genes 0.000 description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 19
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 18
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 18
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 15
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 15
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 14
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 14
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 14
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 14
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 14
- 239000002609 media Substances 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 12
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 11
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 10
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 230000002924 anti-infective Effects 0.000 description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 8
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 8
- 241000224021 Plasmodium berghei ANKA Species 0.000 description 8
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 8
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 7
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 7
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 7
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 7
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 6
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 6
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 6
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 6
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 6
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 5
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 5
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000001331 Nose Anatomy 0.000 description 5
- 229920000320 RNA (poly(A)) Polymers 0.000 description 5
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 210000003046 sporozoites Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 241001609213 Carassius carassius Species 0.000 description 4
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 4
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 4
- 210000003928 Nasal Cavity Anatomy 0.000 description 4
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 4
- 241001600434 Plectroglyphidodon lacrymatus Species 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 4
- 208000007510 West Nile Fever Diseases 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003936 merozoites Anatomy 0.000 description 4
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 4
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 101700008818 AMA1 Proteins 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 3
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 3
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 3
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 3
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 101710040745 B19R Proteins 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101710011595 DPT Proteins 0.000 description 3
- 101710038747 EEF1A1 Proteins 0.000 description 3
- 101710038764 EEF1A1P5 Proteins 0.000 description 3
- 101710038745 EEF1A2 Proteins 0.000 description 3
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 3
- 229940100662 Nasal Drops Drugs 0.000 description 3
- 101710005679 POLR2A Proteins 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 3
- 229920000972 Sense strand Polymers 0.000 description 3
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 3
- 101710005270 TEF1 Proteins 0.000 description 3
- 101710038569 TNFRSF25 Proteins 0.000 description 3
- 101700054742 TRAM1 Proteins 0.000 description 3
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 101700081164 ZBED1 Proteins 0.000 description 3
- 102100014257 ZBED1 Human genes 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710031453 groL2 Proteins 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 101700045377 mvp1 Proteins 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 210000001367 Arteries Anatomy 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N Behenic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 2
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 210000004958 Brain cells Anatomy 0.000 description 2
- 101710010587 CASP13 Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 2
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 2
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 2
- 208000001848 Dysentery Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000277342 Esox lucius Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100014497 GOLPH3 Human genes 0.000 description 2
- 101710008339 GOLPH3 Proteins 0.000 description 2
- 241000943452 Gobius vittatus Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101700062818 NP Proteins 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 2
- 101700053701 OS25 Proteins 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N Oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 241000131739 Oncorhynchus masou rhodurus Species 0.000 description 2
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 2
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 2
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N Palmitic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 208000006551 Parasitic Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 2
- 241000277284 Salvelinus fontinalis Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 206010041925 Staphylococcal infection Diseases 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N Stearic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 208000006379 Syphilis Diseases 0.000 description 2
- 241001504592 Trachurus trachurus Species 0.000 description 2
- 210000003708 Urethra Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 2
- 230000003444 anaesthetic Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000000569 anti-influenza Effects 0.000 description 2
- 230000000078 anti-malarial Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 101710034616 gVIII-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- 244000195895 saibo Species 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 1
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 1
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K Aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241001414900 Anopheles stephensi Species 0.000 description 1
- 210000000702 Aorta, Abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 206010064097 Avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N Bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100019404 CDSN Human genes 0.000 description 1
- 101700062689 CDSN Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 241000222239 Colletotrichum truncatum Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 101700079760 EFCB Proteins 0.000 description 1
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 1
- 101710005090 ERVFC1-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 101710013371 ERVS71-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N Fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101700054771 GCA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 229940093915 Gynecological Organic acids Drugs 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710005864 HI_0216 Proteins 0.000 description 1
- 101710013836 HSPD1 Proteins 0.000 description 1
- 210000003128 Head Anatomy 0.000 description 1
- 206010019233 Headache Diseases 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 101700046422 IFNA Proteins 0.000 description 1
- 101700011451 IFNB1 Proteins 0.000 description 1
- 102100015720 IFNB1 Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000721696 Lymantria Species 0.000 description 1
- 101710038591 MDP1 Proteins 0.000 description 1
- 102100008190 MDP1 Human genes 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 101710005865 MPN_201 Proteins 0.000 description 1
- 101710005862 MPN_285 Proteins 0.000 description 1
- 101710005861 MPN_289 Proteins 0.000 description 1
- 101710005860 MPN_290 Proteins 0.000 description 1
- 101710029070 MPN_343 Proteins 0.000 description 1
- 101710005841 MPN_365 Proteins 0.000 description 1
- 101710005863 MPN_615 Proteins 0.000 description 1
- 101710005859 MPN_638 Proteins 0.000 description 1
- 101700061402 MTRX Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028323 Muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000004897 N-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 241000277277 Oncorhynchus nerka Species 0.000 description 1
- 241000701437 Orgyia pseudotsugata single capsid nuclopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710040922 Os08g0547100 Proteins 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 101700036698 POLH Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N Phosphoramidite Chemical compound NP([O-])[O-] LLKYUHGUYSLMPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000502 Poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229950008882 Polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 210000003240 Portal Vein Anatomy 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029610 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710017884 Segment-8 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000276699 Seriola Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N Tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N Thymalfasin Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N 0.000 description 1
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 description 1
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 210000003135 Vibrissae Anatomy 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006689 Viral Structural Proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010093001 anti-IgG Proteins 0.000 description 1
- 230000000111 anti-oxidant Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229950008690 docosanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 101700053622 esxA Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 200000000003 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000008125 pain agnosia Diseases 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 101700016463 pls Proteins 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 101700083974 prrB Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 102000016558 viral non-structural proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067674 viral non-structural proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к области вирусологии и биотехнологии. Бакуловирусный вектор для переноса содержит структуру, в которую встроены сдвоенный промотор и слитая ДНК. При этом слитая ДНК содержит 2 фрагмента: (A) фрагмент последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка-антигена малярии, который можно получить посредством ПЦР из геномной ДНК, выделенной из штамма паразита малярии P. falciparum 3D7, в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 19 и SEQ ID №: 20 и последующим расщеплением EcoRI и Cfr9I, или частичный фрагмент указанного фрагмента ДНК. Полипептид, кодируемый указанным частичным фрагментом, обладает иммуногенностью; и (B) фрагмент ДНК гена, который можно получить посредством ПЦР с pBACsurf-1 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 7 и SEQ ID №: 8 и последующим расщеплением RsrII и KpnI. Полипептид, кодируемый указанным фрагментом, способен быть компонентом вирусной частицы. Слитая ДНК присоединена ниже сдвоенного промотора, содержащего промотор полиэдрина и промотор CMV, связанные друг с другом. Бакуловирусный вектор может быть использован для создания вакцины против малярии для экспрессии белка с желаемой иммуногенностью. 2 н.п. ф-лы, 15 ил., 1 табл., 13 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к новому вектору для переноса, рекомбинантному бакуловирусу, получаемому гомологичной рекомбинацией вектора для переноса и ДНК бакуловируса, а также к способам их получения.
Также настоящее изобретение относится к фармацевтическим веществам (например, вакцинам, профилактическим или терапевтическим лекарственным средствам против инфекционных заболеваний, таких как малярия и грипп), содержащим рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бакуловирус используется в качестве вектора в способе промышленного получения заданного белка с использованием клеток насекомых. В последние годы было открыто, что посредством бакуловируса можно вводить чужеродный ген не только в клетки насекомых, но также и в клетки млекопитающих, и кроме того, была открыта возможность получения вектора, в который вводят ген для терапии. В патентном документе 1 раскрыт рекомбинантный бакуловирусный вектор экспрессии с многочисленными независимыми промоторами, который включает участок ДНК, содержащий ген, кодирующий вирусный неструктурный белок, при промоторе, который получен из раннего гена из бакуловируса, а также включает участок ДНК, содержащий ген, который кодирует вирусный структурный белок, при промоторе, полученном из позднего гена.
В патентном документе 2 раскрыт способ, где в клетку вводят не относящийся к млекопитающим ДНК-вирус, содержащий промотор, контролируемый таким образом, что экзогенный ген экспрессируется из вектора, в котором желаемые экзогенные гены связаны с многочисленными независимыми промоторами, и где экзогенный ген экспрессируется в клетке млекопитающих.
Кроме того, в патентном документе 3 раскрыт способ получения белка посредством технологии рекомбинации генов с использованием бакуловируса, а также раскрыт способ получения белка в результате экспрессии слитого гена, получаемого связыванием гена gp64 из бакуловируса с геном, кодирующим желаемый белок, с получением желаемого белка в том виде, в котором желаемый белок слит с вирусными частицами, сбором слитых с желаемым белком вирусных частиц и отщеплением желаемого белка от вирусных частиц для получения желаемого белка.
В патентном документе 4 для бакуловирусной системы экспрессии раскрыт рекомбинантный бакуловирусный вектор экспрессии с многочисленными независимыми промоторами, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую маркер для регистрации, связанный в способном к функционированию виде с первым промотором, который активен в клетке-хозяине и не активен в несоответствующей клетке, а также вектор содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая включает чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, связанную в способном к функционированию виде со вторым промотором, который активен в несоответствующей клетке.
В патентном документе 5 раскрыто, что экспрессирующий антиген гемагглютинина (HA) вируса гриппа рекомбинантный бакуловирусный вектор, который связан с полученным из β-актина цыпленка промотором CAG, является эффективным в качестве препарата вакцины, поскольку вектор оказывает профилактический эффект в отношении инфицирования вирусом гриппа.
В патентном документе 6 раскрыт способ получения бакуловирусного вектора, включающий стадию совместной трансфекции, при которой в клетку насекомого совместно трансфицируют плазмиду, в которой гены, кодирующие экспрессирующиеся на клеточной поверхности белки, были связаны с бакуловирусным промотором, а промотор получен из клетки млекопитающего, соответственно, а также трансфицируют плазмиду, в которой гены, кодирующие экспрессирующиеся на клеточной поверхности белки, были связаны с двумя бакуловирусными промоторами, соответственно.
Кроме того, в патентном документе 7 раскрыто исследование активности против вируса гриппа в отношении инфицирования вирусом гриппа, где использовали рекомбинантный бакуловирус, в котором кДНК из HA вируса гриппа была встроена в промотор CAG, а также в этом документе раскрыто, что активностью обладает не только рекомбинантный бакуловирус, но и бакуловирус дикого типа.
Таким образом, в последние годы были сконструированы различные рекомбинантные бакуловирусы и было исследовано получение с их использованием фармацевтических веществ для млекопитающих при применении рекомбинантного бакуловируса в качестве активного ингредиента.
В связанной с данной области являются желаемыми рекомбинантный бакуловирусный вектор с новой структурой и получение фармацевтического препарата, в частности препарата вакцины, с использованием рекомбинантного бакуловируса в качестве активного ингредиента, где препарат эффективен против инфекционных заболеваний, таких как малярия и грипп, или против таких заболеваний, как рак.
Патентный документ 1: японский патент № 3366328, "Бакуловирусная система экспрессии с многочисленными промоторами и продукты с дефектными частицами".
Патентный документ 2: WO 98/011243, "Не относящийся к млекопитающим ДНК-вирус с модифицированным белком оболочки".
Патентный документ 3: JP № 2002-235236-A, "Способы получения белков".
Патентный документ 4: JP № 2003-284557-A, "Новый бакуловирусный вектор для трансфекции и рекомбинантный бакуловирус для экспрессии чужеродного гена".
Патентный документ 5: WO 02/062381, "Вакцина из бакуловирусного вектора".
Патентный документ 6: WO 04/029259, "Бакуловирусный вектор, способ получения бакуловирусного вектора и способ введения гена".
Патентный документ 7: JP № 2005-15346-A, "Противовирусное средство, содержащее бакуловирус".
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель настоящего изобретения состоит в обеспечении нового рекомбинантного вектора для переноса, рекомбинантного бакуловируса, получаемого гомологичной рекомбинацией рекомбинантного вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, а также в обеспечении способов их получения.
Другая цель настоящего изобретения состоит в обеспечении фармацевтического вещества, в частности, препарата вакцины, с использованием рекомбинантного бакуловируса в качестве активного ингредиента.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
Авторами настоящего изобретения был открыт обладающий новой структурой вектор для переноса, способный к экспрессии белка с желаемой иммуногенностью или слитого белка, состоящего из неполноценного белка или белка, обладающего иммуногенностью, и цитокина, в клетках насекомых и клетках позвоночных (в частности, млекопитающих, птиц и рыб), отличных от клеток насекомых, а также был открыт рекомбинантный бакуловирус, получаемый гомологичной рекомбинацией вектора для переноса и бакуловирусной ДНК. В результате обеспечения рекомбинантного бакуловируса было тщательно исследовано фармацевтическое вещество, содержащее рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента, которое оказывает эффективные профилактические и/или терапевтические эффекты в отношении инфекционных заболеваний. В результате авторами изобретения было сделано новое открытие, что рекомбинантный бакуловирус оказывает эффект как желаемое фармацевтическое средство.
Кроме того, согласно настоящему изобретению были подтверждены обладающий новой структурой рекомбинантный вектор для переноса, рекомбинантный бакуловирус, получаемый гомологичной рекомбинацией вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и способы их получения, а также было подтверждено, что рекомбинантный бакуловирус сам по себе был эффективным в качестве фармацевтического средства, являясь способным к экспрессии белка с желаемой иммуногенностью в клетках-мишенях, и был эффективным в качестве профилактического фармацевтического средства против инфекционных заболеваний, таких как малярия и грипп, и на этом настоящее изобретение было завершено.
Настоящее изобретение относится к изобретению, представленному в следующих ниже [1]-[31].
[1] Способ получения вектора для переноса, содержащего структуру, в которую встроены сдвоенный промотор и слитый ген, характеризующуюся тем, что слитый ген, который содержит, по меньшей мере, один ген, кодирующий белок, способный быть компонентом вирусной частицы, и, по меньшей мере, один иммуногенный чужеродный ген связаны в нижестоящем положении относительно сдвоенного промотора, связывающего один промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, и другой бакуловирусный промотор.
[2] Способ по [1], где промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, представляет собой промотор млекопитающих, способный функционировать в млекопитающих.
[3] Способ по [1] или [2], характеризующийся тем, что ген, кодирующий, по меньшей мере, один белок, способный быть компонентом вирусной частицы, представляет собой любой из бакуловирусного гена gp64, гена гликопротеина вируса везикулярного стоматита, гена гликопротеина вируса иммунодефицита человека типа I, гена мембранного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека, гена белка гемагглютинина вируса гриппа типа A, гена белка гемагглютинина вируса гриппа типа B, гена гликопротеина вируса простого герпеса и гена белка S вируса гепатита мыши.
[4] Способ по [1] или [2], где промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, выбирают из любого из промотора цитомегаловируса, промотора SV40, ретровирусного промотора, промотора металлотионеина, промотора белка теплового шока, промотора CAG, промотора фактора элонгации 1α, промотора актина, промотора убиквитина, промотора альбумина и промотора MHC класса II.
[5] Способ по любому из [1]-[4], где бакуловирусный промотор выбирают из промотора полиэдрина, промотора p10, промотора IE1, промотора IE2, промотора p35, промотора p39 и промотора gp64.
[6] Способ по любому из [1]-[5], где иммуногенный чужеродный ген выбирают из любого из антигена малярии, антигена гриппа, антигена M. tuberculosis, антигена вируса SARS, антигена вируса лихорадки Западного Нила, антигена вируса лихорадки денге, антигена ВИЧ, антигена HCV, антигена лейшмании, антигена трипаносомы, антигена лейкоцитозоона по отдельности или слитого антигена, состоящего, по меньшей мере, из одного антигена, выбранного из этой группы генов антигенов, и цитокина.
[7] Способ по любому из [1]-[6], где вектор для переноса представляет собой любой из pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64 и pCP-H1N1/HA1-vp39.
[8] Способ получения рекомбинантного бакуловируса, включающий стадию получения вектора для переноса, содержащего структуру, в которую встроены сдвоенный промотор и слитый ген, характеризующуюся тем, что слитый ген, который содержит, по меньшей мере, один ген, кодирующий белок, способный быть компонентом вирусной частицы, и, по меньшей мере, один иммуногенный чужеродный ген связаны в нижестоящем положении относительно сдвоенного промотора, связывающего один промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, и другой бакуловирусный промотор; стадию совместной трансфекции вектора для переноса и бакуловирусной ДНК в клетку-хозяина насекомого; и стадию выделения рекомбинантного бакуловируса.
[9] Способ по [8], характеризующийся тем, что ген, кодирующий, по меньшей мере, один белок, способный быть компонентом вирусной частицы, представляет собой любой из бакуловирусного гена gp64, гена гликопротеина вируса везикулярного стоматита, гена гликопротеина вируса иммунодефицита человека типа I, гена мембранного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека, гена белка гемагглютинина вируса гриппа типа A, гена белка гемагглютинина вируса гриппа типа B, гена гликопротеина вируса простого герпеса и гена белка S вируса гепатита мыши.
[10] Способ по [9], где промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, выбирают из любого из промотора цитомегаловируса, промотора SV40, ретровирусного промотора, промотора металлотионеина, промотора белка теплового шока, промотора CAG, промотора фактора элонгации 1α, промотора актина, промотора убиквитина, промотора альбумина и промотора MHC класса II.
[11] Способ по любому из [8]-[10], где бакуловирусный промотор выбирают из промотора полиэдрина, промотора p10, промотора IE1, промотора p35, промотора p39 и промотора gp64.
[12] Способ по любому из [8]-[11], где иммуногенный чужеродный ген выбирают из любого из антигена малярии, антигена гриппа, антигена M. tuberculosis, антигена вируса SARS, антигена вируса лихорадки Западного Нила, антигена вируса лихорадки денге, антигена ВИЧ, антигена HCV, антигена лейшмании, антигена трипаносомы, антигена лейкоцитозоона по отдельности или слитого антигена, состоящего из одного антигена, выбранного из этой группы генов антигенов, и цитокина.
[13] Способ по любому из [8]-[12], где рекомбинантный бакуловирус представляет собой любой из AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 и AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39.
[14] Вектор для переноса, содержащий структуру, в которую встроены слитый ген, содержащий, по меньшей мере, один ген, кодирующий белок, способный быть компонентом вирусной частицы, и, по меньшей мере, один иммуногенный чужеродный ген, связанные в нижестоящем положении относительно сдвоенного промотора, связывающего один промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, и другой бакуловирусный промотор.
[15] Вектор для переноса по [14], характеризующийся тем, что ген, кодирующий, по меньшей мере, один белок, способный быть компонентом вирусной частицы, представляет собой любой из бакуловирусного гена gp64, гена гликопротеина вируса везикулярного стоматита, гена гликопротеина вируса иммунодефицита человека типа I, гена мембранного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека, гена белка гемагглютинина вируса гриппа типа A, гена белка гемагглютинина вируса гриппа типа B, гена гликопротеина вируса простого герпеса и гена белка S вируса гепатита мыши.
[16] Вектор для переноса по [14], где промотор позвоночных, способный функционировать в позвоночных, выбирают из любого из промотора цитомегаловируса, промотора SV40, ретровирусного промотора, промотора металлотионеина, промотора белка теплового шока, промотора CAG, промотора фактора элонгации 1α, промотора актина, промотора убиквитина, промотора альбумина и промотора MHC класса II.
[17] Вектор для переноса по любому из [14]- [16], где бакуловирусный промотор выбирают из промотора полиэдрина, промотора p10, промотора IE1, промотора IE2, промотора p35, промотора p39 и промотора gp64.
[18] Вектор для переноса по любому из [14]- [17], где иммуногенный чужеродный ген выбирают из любого из антигена малярии, антигена гриппа, антигена M. tuberculosis, антигена вируса SARS, антигена вируса лихорадки Западного Нила, антигена вируса лихорадки денге, антигена ВИЧ, антигена HCV, антигена лейшмании, антигена трипаносомы, антигена лейкоцитозоона по отдельности или слитого антигена, состоящего из одного антигена, выбранного из этой группы генов антигенов, и цитокина.
[19] Вектор для переноса по любому из [14]- [18], представляющий собой любой из pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64 и pCP-H1N1/HA1-vp39.
[20] Рекомбинантный бакуловирус, получаемый способом получения рекомбинантного бакуловируса по любому из [8]-[13].
[21] Рекомбинантный бакуловирус по [20], представляющий собой любой из AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual- PbMSP119, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 и AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39.
[22] Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный бакуловирус по [20] или [21].
[23] Фармацевтическая композиция по [22], содержащая любой из AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 и AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39.
[24] Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный бакуловирус по [20] или [21], где композицию вводят внутримышечно, интраназально или ингаляцией.
[25] Вакцина, содержащая в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 и AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39.
[26] Вакцина по [26], где вакцину вводят внутримышечно, интраназально или ингаляцией.
[27] Терапевтическое или профилактическое средство против инфицирования вирусом гриппа, содержащее в качестве активного ингредиента AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 и AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39.
[28] Терапевтическое или профилактическое средство против инфицирования вирусом гриппа по [27], где средство вводят внутримышечно, интраназально или ингаляцией.
[29] Вакцина против инфицирования вирусом гриппа, содержащая в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2 и AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39.
[30] Вакцина против инфицирования вирусом гриппа по [29], где средство вводят внутримышечно, интраназально или ингаляцией.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому рекомбинантному вектору для переноса, рекомбинантному бакуловирусу, получаемому гомологичной рекомбинацией рекомбинантного вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, а также к способам их получения. Фармацевтические вещества, содержащие в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, являются эффективными в качестве терапевтических или профилактических лекарственных средств против инфекционных заболеваний, таких как малярия, грипп, туберкулез и гепатит, вариантов рака и аутоиммунных заболеваний или в качестве медицинского средства на клеточном уровне, а также в качестве препаратов вакцин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На фиг.1 представлен профилактический эффект (титр инфекционности вируса) рекомбинантного бакуловируса AcNPV-Dual-H1N1/HA1 в отношении инфицирования вирусом гриппа;
На фиг.2 представлен профилактический эффект (период выживания) рекомбинантного бакуловируса AcNPV-Dual-H1N1/HA1 в отношении инфицирования вирусом гриппа;
На фиг.3 представлен анализ Вестерн-блоттингом экспрессии слитого продукта в клетке насекомого, инфицированной с использованием рекомбинантного бакуловируса, полученного из вектора для переноса, посредством гена HA вируса гриппа (H1N1/HA1), гена Hsp65 M. tuberculosis (Hsp65) или гена CSP малярийного паразита (PbCSP).
Дорожка 1: AcNPV-WT
Дорожка 2: AcNPV-Dual-H1N1/HA1
Дорожка 3: AcNPV-WT
Дорожка 4: AcNPV-Dual-Hsp65
Дорожка 5: AcNPV-WT
Дорожка 6: AcNPV-Dual-PbCSP;
На фиг.4 представлено изображение окрашивания с флуоресцентной меткой, где рекомбинантный бакуловирус, полученный из рекомбинантного вектора для переноса, экспрессировал в клетках позвоночных слитый продукт гена HSP65 туберкулеза и гена gp64.
(A): клетки HepG2, трансдуцированные посредством AcNPV-Dual-Hsp65;
(B): клетки HepG2, трансдуцированные посредством AcNPV-WT.
На фиг.5 представлено изображение, на котором в результате иммунопреципитации показано, что рекомбинантный бакуловирус, полученный из рекомбинантного вектора для переноса в относящихся к млекопитающим клетках животных, экспрессировал слитый белок, который кодируется геном антигена HA вируса гриппа и геном gp64. Иммунопреципитация клеток HepG2, в которые были введены рекомбинантные бакуловирусы. Клетки HepG2 были трансдуцированы с использованием AcNPV-WT (дорожка 1), полного AcNPV-CMV-H1N1/HA (дорожка 2) или AcNPV-Dual-H1N1/HA1 (дорожка 3). Через 3 часа после трансдукции клетки в течение 12 часов метили радиоактивной меткой с использованием [35S]метионина. Проводили иммунопреципитацию клеточных лизатов вместе с сывороткой от мышей, инфицированных вирусом гриппа H1N1.
На фиг.6 представлен анализ посредством Вестерн-блоттинга, где показана экспрессия слитой структуры из гена CSP малярийного паразита и гена gp64 в вирусных частицах рекомбинантного бакуловируса, полученного из рекомбинантного вектора для переноса в клетках насекомых.
Дорожка 1: AcNPV-WT
Дорожка 2: AcNPV-CMV-PbCSP
Дорожка 3: AcNPV-PbCSPsurf
Дорожка 4: AcNPV-Dual-PbCSP.
На фиг.7 представлены результаты RT-PCT, указывающие на то, что содержащий антиген HA1 рекомбинантный бакуловирус, полученный заменой промотора позвоночных, экспрессировал в клетках HeLa слитый продукт HA1 и gp64.
На фиг.8 представлена продукция антитела IgG, специфичного в отношении антигена PbCSP, в сыворотке от мышей, которых инокулировали с использованием рекомбинантного бакуловируса.
На фиг.9 представлено количество продуцирующих IFN-γ клеток, реакционноспособных в отношении эпитопа CTL из PbCSP в клетках селезенки от мышей, которых инокулировали с использованием рекомбинантного бакуловируса.
На фиг.10 представлены профилактические эффекты (титр инфекционности вируса) рекомбинантного бакуловируса AcNPV-Dual-M2e в отношении инфицирования вирусом гриппа.
На фиг.11 представлены профилактические эффекты (титр инфекционности вируса) рекомбинантного бакуловируса AcNPV-CP-HA1/NC99 в отношении инфицирования вирусом гриппа.
На фиг.12 представлена продукция в крови антитела IgG, специфичного в отношении вируса гриппа, которая индуцируется рекомбинантным бакуловирусом AcNPV-Dual-H1N1/HA1, вводимым четырьмя различными способами.
На фиг.13 представлена продукция в жидкости от назального лаважа и жидкости от альвеолярного лаважа антитела IgG и антитела IgA, специфичных в отношении вируса гриппа, где продукция индуцирована рекомбинантным бакуловирусом AcNPV-Dual-H1N1/HA1, вводимым четырьмя различными способами.
На фиг.14 представлены профилактические эффекты (титр инфекционности вируса) вводимого четырьмя различными способами рекомбинантного бакуловируса AcNPV-Dual-H1N1/HA1 в отношении вируса гриппа в полости носа.
На фиг.15 представлены профилактические эффекты (титр инфекционности вируса) вводимого четырьмя различными способами рекомбинантного бакуловируса AcNPV-Dual-H1N1/HA1 в отношении внутрилегочного вируса гриппа.
ЛУЧШИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленное в настоящей заявке обозначение посредством сокращенных названий аминокислот, пептидов, последовательностей оснований и нуклеиновых кислот удовлетворяет IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9(1984), определяемому IUPAC-IUB, "Руководством по созданию описаний, включающих последовательности оснований и аминокислотные последовательности" (патентное бюро) и обычно используемыми указаниями в данной области.
В рамках настоящей заявки молекула ДНК включает не только двухцепочечную ДНК, но также и одноцепочечную ДНК, в том числе составляющие их смысловые цепи и антисмысловые цепи, и не ограничена по своей длине. Таким образом, если не указано иначе, полинуклеотид (молекула ДНК), кодирующий иммуногенный чужеродный ген согласно настоящему изобретению, включает двухцепочечную ДНК, в том числе геномную ДНК, и одноцепочечную ДНК (смысловую цепь), в том числе кДНК, а также одноцепочечную ДНК (антисмысловую цепь) с последовательностью, комплементарной смысловой цепи, а также их синтетические фрагменты ДНК.
В рамках настоящей заявки полинуклеотид или молекула ДНК не заданы функциональным участком и могут включать, по меньшей мере, один из участка подавления экспрессии, кодирующего участка, лидерной последовательности, экзона и интрона.
Также полинуклеотид включает РНК и ДНК. Полипептид состоит из определенной последовательности аминокислот, а полинуклеотид состоит из определенной последовательности ДНК, включая их фрагменты, гомологи, производные и мутантные формы.
Мутантные формы полинуклеотида, например, мутантная ДНК, включают природные аллельные мутанты, не встречающиеся в природе мутанты и мутанты с делецией, заменой, добавлением и вставкой. При этом эти мутанты кодируют полипептид, обладающий практически той же самой функцией, что и функция полипептида, кодируемого до мутации.
Согласно настоящему изобретению вектор для переноса относится к плазмиде для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего структуру, в которой слитый ген, связывающий, по меньшей мере, один ген, кодирующий белок, способный быть компонентом вирусной частицы, с, по меньшей мере, одним иммуногенным чужеродным геном, был встроен в нижестоящем положении относительно сдвоенного промотора, где связаны один промотор позвоночных (промотор млекопитающих, промотор птиц, промотор рыб) и другой бакуловирусный промотор.
Предпочтительно, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения иммуногенный чужеродный ген расположен ниже сдвоенного промотора и выше гена, кодирующего белок, который способен быть компонентом вирусной частицы.
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению используют для позвоночных в качестве активного ингредиента фармацевтических веществ или вакцин. В качестве позвоночных примерами млекопитающих, включая человека, могут быть лошади, свиньи, овцы, козы, обезьяны, мыши, собаки и кошки, птицы, такие как цыплята, перепелки, гуси, водоплавающие, голуби, индейки, цесарки и попугаи, а также рыбы, такие как желтохвосты, взрослые желтохвосты, морские караси, сериолы, ставриды, полосатые щуки, полосатый бычок, лососи, нерки, карпы, обыкновенные караси, радужные форели, ручьевые форели и форели амаго.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вектору для переноса, содержащему новую структуру, в которой слитый ген, содержащий ген, который кодирует вирусный мембранный белок, экспрессируемый в клетке насекомого, и содержащий один иммуногенный чужеродный ген, был встроен под контролем сдвоенного промотора, в котором один промотор позвоночных связан с другим бакуловирусным промотором. Посредством совместной трансфекции этого вектора для переноса вместе с бакуловирусной ДНК в клетку насекомого для индукции гомологичной рекомбинации можно получать рекомбинантный бакуловирус, в который был встроен находящийся под контролем бакуловирусного промотора слитый ген, экспрессирующийся в клетке насекомого и способный продуцировать слитый белок, который может быть компонентом активно реплицирующейся вирусной частицы.
Согласно настоящему изобретению в случае введения рекомбинантного бакуловируса позвоночному, слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом активно реплицирующейся вирусной частицы, и иммуногенного белка, предположительно функционирует как компонент вакцины. Вводимый в позвоночных рекомбинантный бакуловирус встраивается в клетку позвоночного, в клетке позвоночных продуцируется слитый антиген с заданным иммуногенным чужеродным антигеном из вирусного генома, и происходит функционирование в качестве вакцины ДНК.
Соответственно, в случае млекопитающего, при введении млекопитающему рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом вирусной частицы, и иммуногенного белка, презентируется в качестве антигена, слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом вирусной частицы, и иммуногенного белка, продуцируется в клетке млекопитающего и, предположительно, вследствие своего иммунопотенциального действия функционирует в качестве профилактического или терапевтического средства в отношении инфицирования вирусом, простейшими и бактериями.
Бакуловирусная ДНК, подлежащая совместной трансфекции с вектором для переноса, может представлять собой любую из дикого типа, мутанта и рекомбинантной бакуловирусной ДНК. Подлежащие совместной трансфекции клетки-хозяева включают, например, клетки от насекомого, такого как Spodoptera frugiperda.
Согласно настоящему изобретению иммуногенным чужеродным геном назван ген, кодирующий аминокислотную последовательность антигенного белка, который является иммуногеном в иммунотерапии, включающей лечение вакцинами для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, таких как малярия, грипп и туберкулез, аутоиммунных заболеваний и вариантов рака, например, ген, кодирующий аминокислотную последовательность такого белка, как антиген малярии, антиген вируса гриппа и антиген M. tuberculosis.
В рамках настоящей заявки "чужеродный" ген обозначает ген, вводимый извне, что соответствует "чужеродному" гену, даже если тот же самый ген присутствует в клетке.
Согласно настоящему изобретению ген, который кодирует аминокислотную последовательность белка, являющегося указанным выше иммуногеном, не ограничен конкретно геном, который кодирует аминокислотную последовательность антигенного белка при условии, что ген представляет собой ген, кодирующий аминокислотную последовательность антигенного белка, которая обладает иммуногенностью в отношении вещества, вызывающего такие заболевания, как инфекционные заболевания, варианты рака и аутоиммунные заболевания. Примеры таких генов, которые кодируют обладающую иммуногенностью аминокислотную последовательность антигенного белка, включают следующие ниже.
В качестве примеров гена, кодирующего аминокислотную последовательность малярийного антигена, могут быть представлены, например, гены, которые кодируют аминокислотные последовательности таких белков, как поверхностный антиген CSP (белок, покрывающий спорозоит) поверхности спорозоита малярийного паразита, MSP1 (белок поверхности мерозоита 1) из мембранного белка поверхности мерозоита, малярийный антиген S, секретируемый из инфицированных малярией эритроцитов, белок PfEMP1, присутствующий в выпуклом утолщении инфицированных малярией эритроцитов, белок SERA, белок TRAMP и белок AMA1.
В качестве примеров гена, кодирующего аминокислотную последовательность антигена вируса гриппа, могут быть представлены гены, кодирующие аминокислотные последовательности таких белков, как антиген HA (антиген гемагглютинина), антиген NA (антиген нейраминидазы), антиген M2 (антиген белка матрикса) и антиген NP (антиген ядерного белка).
В качестве примеров гена, кодирующего аминокислотную последовательность антигенного белка для туберкулеза, могут быть представлены гены, кодирующие аминокислотные последовательности таких белков, как HSP65 (белок теплового шока 65 кДа), α-антиген (антиген 85A, антиген 85B, антиген 85C), Mtb72f, MDP-1, ESAT-6, MPB51, Mtb8.8, Mtb9.9, Mtb32, Mtb39 и Mtb11.
В отношении генов позвоночных, например, генов млекопитающих, в качестве примеров могут быть представлены гены, кодирующие аминокислотные последовательности антигенных белков при инфекционных заболеваниях у человека, крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, обезьян, мышей, собак и кошек. В качестве генов птиц для примера могут быть представлены гены антигенов (например, антиген птичьего гриппа S) при инфекционных заболеваниях у цыплят, водоплавающих, голубей, индеек, цесарок и попугаев. В качестве генов рыб рассмотрены гены антигенов при инфекционных заболеваниях у желтохвостов, взрослых желтохвостов, морских карасей, сериол, ставрид, полосатых щук, полосатого бычка, лососей, нерок, карпов, обыкновенных карасей, радужных форелей, ручьевых форелей и форелей амаго.
Патогенные гены, о чьей связи с инфекционными заболеваниями у описанных выше млекопитающих, птиц и рыб было указано, являются легко доступными в учреждениях, где хранились такие общедоступные данные, как банк генов, в котором регистрируют патогенные гены.
Согласно настоящему изобретению в случае иммуногенных чужеродных генов в дополнение к указанным выше иммунным антигенам, присутствующим вне организма человека, в качестве иммуногенных чужеродных генов согласно настоящему изобретению также могут быть рассмотрены, например, гены цитокинов из организма человека, например, ген IL-12, ген IL-6, ген рецептора IL-6, ген IL-2, ген IL-18, ген IFN-γ и ген M-CSF, или слитые гены, получаемые слиянием заданного иммуногенного антигена с указанным выше антигенным белком с использованием способа рекомбинации, при условии, что эти гены вводят извне.
Согласно настоящему изобретению можно обеспечивать вектор для переноса, содержащий такие иммуногенные чужеродные гены, и рекомбинантный бакуловирус, получаемые их гомологичной рекомбинацией, а также обеспечивать фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус с иммуногенным чужеродным геном, и препарат вакцины, содержащий фармацевтическую композицию.
Используемый согласно настоящему изобретению бакуловирус представляет собой патогенный вирус насекомых, вызывающий у насекомых инфекционное заболевание, и он относится к одной из групп (Baculoviridae) ДНК-вирусов с генами в виде кольцевой двухцепочечной ДНК. Из них одна группа вирусов, называемая вирусом ядерного полиэдроза (NPV), приводит к образованию включения, названного полиэдром, в ядре инфицированной клетки на поздней стадии инфекционного заболевания. Даже если подлежащий экспрессии чужеродный ген вставлен на место гена полиэдра, вирус инфицирует, растет и продуцирует в большом количестве желаемый продукт чужеродного гена в отсутствии каких-либо проблем. Таким образом, в последние годы этот способ часто использовали на практике для получения желаемого белка.
В качестве примеров бакуловируса, используемого согласно настоящему изобретению, могут быть представлены вирус ядерного полиэдроза Autographa californica: AcNPV, вирус ядерного полиэдроза Bombyx mori: BmNPV, вирус ядерного полиэдроза Orgyia pseudotsugata: OpNPV и вирус ядерного полиэдроза Lymantria disper: LdNPV.
Бакуловирусная ДНК может представлять собой любую ДНК, для которой возможно осуществление гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению. Конкретно, могут быть вставлены вирусный ген из бакуловирусной ДНК, способный к осуществлению гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению, составляющий 130 т.п.о., что является большой величиной, а также иммуногенный чужеродный ген величиной 15 т.п.о. Сам по себе бакуловирусный ген почти не экспрессируется в клетках позвоночных. Таким образом, практически нет необходимости учитывать его цитотоксичность, и, соответственно, предполагают, что индукция неблагоприятной иммунной реакции отсутствует.
(1) Вектор для переноса и получение вектора для переноса согласно настоящему изобретению
Получение ДНК иммуногенного чужеродного гена
ДНК иммуногенного чужеродного гена, способную к слиянию с вирусным геном, являющимся одним из компонентов бакуловирусного вектора для переноса, можно легко получать и производить с использованием синтеза на основе данных по последовательности нуклеиновой кислоты для полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность антигенного белка с заданной иммуногенностью, описанной в настоящей заявке, или с использованием прямого синтеза ДНК (способом химического синтеза ДНК), которая соответствует последовательности нуклеиновой кислоты из кодирующего участка иммуногенного чужеродного гена, на основе данных по последовательности нуклеиновой кислоты для иммуногенного чужеродного гена. Для такого получения можно использовать общепринятые способы генной инженерии (например, см. Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" под редакцией Японского биохимического общества, 1986).
В качестве примеров способов синтеза ДНК могут быть представлены способы химического синтеза ДНК, такие как фосфотриэфирный способ и фосфатамидитный способ (J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967); ibid., 91, 3350(1969); Science, 150, 178(1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859(1981); ibid., 24, 245(1983)), а также сочетания таких способов. Более конкретно, ДНК можно также химически синтезировать фосфорамидитным способом или триэфирным способом, а также ее можно синтезировать с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Двухцепочечный фрагмент можно получать синтезом комплементарной цепи и отжигом комплементарной цепи с химически синтезированной одиночной цепью в соответствующих условиях или добавлением комплементарной цепи с соответствующими последовательностями праймеров к химически синтезированной одиночной цепи с использованием ДНК-полимеразы.
В качестве примера одного из конкретных аспектов ДНК иммуногенного чужеродного гена, получаемой согласно настоящему изобретению, может быть представлена ДНК, состоящая из последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность антигенного белка M. tuberculosis, последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность антигенного белка малярии, или последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность антигенного белка вируса гриппа.
Используемая согласно настоящему изобретению ДНК не ограничивается полноразмерной последовательностью ДНК из последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность полипептида из обладающего иммуногенностью антигенного белка, и она может представлять собой последовательность ДНК, кодирующую часть последовательности, при условии, что белок с аминокислотной последовательностью, кодируемой последовательностью ДНК, обладает иммуногенностью.
Используемая согласно настоящему изобретению ДНК может представлять собой последовательность ДНК, которую получают слиянием последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность обладающего антигенными свойствами антигенного белка, с геном цитокина, присутствующим в организме человека, например, геном IL-12, геном IL-1, геном IL-6, геном рецептора IL-6, геном IL-2, геном IL-18, геном IFN-α, геном IFN-β, геном IFN-γ, геном TNF, геном TGF-β, геном GM-CSF и геном M-CSF.
Слитая последовательность ДНК не ограничивается полноразмерным кодирующим участком последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность полипептида из обладающего антигенными свойствами антигенного белка, и последовательностью ДНК для гена цитокина, но также может представлять собой часть последовательности ДНК.
Используемая согласно настоящему изобретению ДНК иммуногенного чужеродного гена не ограничивается молекулой ДНК, содержащей такую конкретную последовательность ДНК, но также может содержать последовательность ДНК, получаемую сочетанием и отбором желаемого кодона для каждого аминокислотного остатка. Выбор кодона можно проводить в соответствии с общепринятыми способами. В то же время, например, можно учитывать частоту применения кодона в используемом организме-хозяине. (Nucleic Acids Res., 9, 43(1981)).
Способ получения ДНК иммуногенного чужеродного гена, используемой согласно настоящему изобретению, с использованием способов генной инженерии можно более конкретно осуществлять посредством получения общепринятыми способами библиотеки кДНК из соответствующего источника, экспрессирующей ДНК иммуногенного чужеродного гена, и выбором желаемого клона из библиотеки с использованием соответствующего зонда или антитела против экспрессируемого продукта, который свойственен для иммуногенного чужеродного гена (см. Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613(1981); Science, 222, 778(1983)).
Как указано выше, в качестве примера источника геномной ДНК могут быть представлены различные клетки, ткани и получаемые из них культивируемые клетки, которые экспрессируют ДНК иммуногенного чужеродного гена. В частности, в качестве источника предпочтительно использовать экстракт эритроцитов, инфицированных малярийным паразитом, экстракт клеток, инфицированных вирусом гриппа, или экстракт M. tuberculosis. Экстрагирование и выделение тотальной ДНК и РНК из источника, выделение и очистку мРНК, а также получение и клонирование кДНК можно проводить в соответствии с общепринятыми способами.
Также получение ДНК иммуногенного чужеродного гена можно осуществлять выделением мРНК каждого иммуногена, а затем добавлением к РНК поли(A)-последовательности, получением РНК с добавленной поли(A)-последовательностью, получением кДНК с использованием обратной транскриптазы, добавлением участков для ферментов рестрикции к обоим концевым участкам кДНК и использованием фаговой библиотеки, которую получают встраиванием кДНК в фаг, в дополнение к получению с использованием библиотеки кДНК для каждого иммуногена, получаемой экстракцией, отделением и очисткой мРНК из иммуногенной ткани или клетки с применением экстракта в качестве источника.
Способ скрининга ДНК иммуногенного чужеродного гена в библиотеке кДНК не ограничен чем-либо конкретным, и его можно проводить в соответствии с общепринятыми способами. Например, в качестве примера конкретного способа может быть представлен способ отбора соответствующего клона кДНК посредством иммунологического скрининга с использованием специфического антитела (например, антитела против малярии, антитела против вируса гриппа, антитела против M. tuberculosis) против белка, продуцируемого с кДНК; способ гибридизации бляшек с использованием зонда, специфически связывающегося с заданной последовательностью ДНК; способ гибридизации колоний; а также их сочетания.
В качестве зондов, используемых в способах гибридизации, общепринятыми являются фрагменты ДНК, химически синтезированные на основе данных по последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена. Преимущественно в качестве указанного выше зонда можно использовать уже полученный иммуногенный чужеродный ген и последовательности ДНК его фрагментов. Кроме того, в качестве зонда для указанного выше скрининга можно также использовать смысловой праймер и антисмысловой праймер, сконструированные на основе данных по последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена.
Используемая в качестве зонда ДНК (нуклеотиды) представляет собой часть ДНК (нуклеотидов), соответствующей последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена, и она содержит, по меньшей мере, 15 последовательных остатков ДНК, предпочтительно - по меньшей мере 20 последовательных остатков ДНК, а более предпочтительно - по меньшей мере 30 последовательных остатков ДНК. Также в качестве зонда можно сам по себе использовать положительный клон для получения указанной выше ДНК.
При получении ДНК иммуногенного чужеродного гена можно эффективно использовать способ амплификации ДНК/РНК посредством PCR (Science, 230, 1350 (1985)). В частности, если из библиотеки сложно получить полноразмерную кДНК, то соответственно используют способ RACE [Rapid amplification of cDNA ends; Jikken Igaku 12(6), 35(1994)], в частности, способ 5'-RACE [M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998(1988)].
Используемый для PCR праймер можно конструировать на основе данных по последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена и синтезировать в соответствии с общепринятыми способами. В качестве такого праймера, как представлено в описанных ниже примерах, можно также использовать участки ДНК (праймер из промотора SP6 и праймер из терминатора T7), добавляемые к обоим концевым участкам векторной плазмиды, в которую была встроена ДНК иммуногенного чужеродного гена.
Выделение/очистку фрагмента ДНК/РНК, амплифицируемого посредством PCR, можно проводить в соответствии с общепринятыми способами, например, гель-электрофорезом.
В случае получаемой, как указано выше, ДНК иммуногенного чужеродного гена или различных фрагментов ДНК их последовательности ДНК можно определять в соответствии с общепринятыми способами, например, дидезокси-способом (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463(1977)) или способом Максама-Гилберта (Methods in Enzymology, 65, 499(1980)), или простым использованием коммерчески доступного набора для секвенирования.
Ген, который кодирует аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы, может представлять собой любой ген при условии, что он является геном, кодирующим белок, который экспрессируется в виде белка, способного быть компонентом вирусной частицы в клетке насекомого, и в виде слитого белка, получаемого при слиянии с иммуногенным чужеродным геном в заданной клетке.
В качестве примера гена, кодирующего аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы, могут быть представлены, например, гены белка gp64 (уникальный идентификатор банка генов № L22858), гликопротеина вируса везикулярного стоматита (уникальный идентификатор банка генов № M21416), гликопротеина вируса простого герпеса (KOS; уникальный идентификатор банка генов № K01760), gp120 вируса иммунодефицита человека типа I (уникальный идентификатор банка генов № U47783), мембранного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека (уникальный идентификатор банка генов № M86651), белка гемагглютинина вируса гриппа типа A (уникальный идентификатор банка генов № U38242) или ген белков оболочки вирусов, близкородственных бакуловирусу. Согласно настоящему изобретению в качестве предпочтительного примера может быть приведен ген gp64, представленный в описанных ниже примерах.
ДНК гена, который кодирует аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы, можно легко продуцировать и получать посредством синтеза на основе данных по последовательности нуклеиновой кислоты для полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность полипептида, из гена, который кодирует аминокислоты заданного белка, способного быть компонентом вирусной частицы, или посредством прямого синтеза ДНК, которая соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность аминокислот, на основе данных по аминокислотной последовательности для гена, кодирующего аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы (химический синтез ДНК), как в случае с получением ДНК иммуногенного чужеродного гена.
Последовательность ДНК, соответствующая последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы, не ограничивается полноразмерным кодирующим участком и может представлять собой ДНК, содержащую часть последовательности ДНК.
Как и в случае с получением молекулы ДНК иммуногенного чужеродного гена, ДНК гена, кодирующего аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы, можно получать общепринятыми способами генной инженерии (например, см. Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" под редакцией Японского биохимического общества, 1986).
Согласно настоящему изобретению можно также использовать коммерчески доступную векторную плазмиду, в которую уже была встроена часть промотора, контролирующая экспрессию описанного ниже иммуногенного чужеродного гена, и был предварительно введен ген (участок), кодирующий аминокислоты белка, способного быть компонентом вирусной частицы.
Промоторы позвоночных
В качестве примера промотора позвоночных (способного функционировать у позвоночных), который является одним из компонентов вектора для переноса, используемого согласно настоящему изобретению, могут быть представлены такие промоторы, как промоторы млекопитающих, промоторы птиц и промоторы рыб.
Промоторы млекопитающих
В качестве примера промотора млекопитающих (способного функционировать у млекопитающих), который является одним из компонентов вектора для переноса, используемого согласно настоящему изобретению, могут быть представлены промотор цитомегаловируса, промотор SV40, ретровирусный промотор, промотор металлотионеина, промотор белка теплового шока, промотор CAG, промотор фактора элонгации 1α, промотор актина, промотор убиквитина, промотор альбумина и промотор MHC класса II.
Промоторы птиц
В качестве примера промоторов птиц могут быть представлены промотор актина, промотор белка теплового шока, промотор фактора элонгации, промотор убиквитина и промотор альбумина.
Промоторы рыб
В качестве примера промоторов рыб могут быть представлены промотор актина, промотор белка теплового шока и промотор фактора элонгации.
Промоторы бакуловируса
В качестве примера промотора бакуловируса, который является одним из компонентов бакуловирусного вектора для переноса, используемого согласно настоящему изобретению, могут быть представлены промотор полиэдрина, промотор p10, промотор IE1, промотор p35, промотор p39 и промотор gp64.
Получение рекомбинантного вектора для переноса
Настоящее изобретение относится к новому вектору для переноса, содержащему структуру, которая способна экспрессировать в клетке насекомого и клетке позвоночного, в частности, клетке млекопитающего, заданный иммуногенный чужеродный ген в виде антигенного белка. Согласно настоящему изобретению структура полученного нового вектора для переноса характеризуется тем, что последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность желаемого иммуногенного белка, и последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы, являются связанными в нижестоящем положении относительно связанных промоторов, где один представляет собой промотор позвоночных, в частности, промотор млекопитающих, а другой является бакуловирусным промотором. Участки ДНК, содержащие последовательности ДНК двух промоторов, из которых один представляет собой промотор позвоночных, в частности, промотор млекопитающих, а другой является бакуловирусным промотором, могут быть связаны непосредственно, или между последовательностями ДНК двух промоторов может присутствовать промежуточная последовательность ДНК (однако в таком случае соответствующие промоторы должны обладать активностью в клетке насекомого и клетке позвоночного, в частности, клетке млекопитающего). Подлежащий связыванию промотор позвоночных, в частности, промотор млекопитающих, или бакуловирусный промотор можно располагать на более близком расстоянии к гену, который следует экспрессировать в их промоторной области. В описанных ниже примерах бакуловирус расположен на более близком расстоянии к подлежащему экспрессии гену, чем промотор млекопитающих.
В структуре, где слитый ген содержит ген, кодирующий белок, способный быть компонентом вирусной частицы, и желаемый иммуногенный чужеродный ген, эти два гена могут быть связаны непосредственно, или между ними может присутствовать промежуточная последовательность ДНК (однако необходимо располагать ДНК так, чтобы не вызвать сдвиг рамки считывания). Предпочтительно антигенпрезентирующий участок обладающего желаемой иммуногенностью белка, кодируемый чужеродным геном, слит с белком, который способен быть компонентом вирусной частицы. Таким образом, необходимо использовать слитую форму, в которой обладающий желаемой иммуногенностью белок, кодируемый чужеродным геном, не отсечен от белка, способного быть компонентом вирусной частицы.
Слитый ген, содержащий эти два гена, можно получать заранее, и его можно встраивать в вектор. Альтернативно в вектор можно заранее встраивать любой ген, а затем в вектор можно встраивать другой ген для получения слитого гена в векторе.
Для указанных выше способов можно использовать коммерчески доступные векторы экспрессии, которые уже содержат промоторные участки из описанного выше промотора позвоночных, в частности, промотора млекопитающих, а также бакуловирусный промотор и участки гена, кодирующие аминокислотную последовательность, способную быть компонентом вирусной частицы, где все это представляет собой участки структуры, необходимой в качестве вектора для переноса согласно настоящему изобретению. С их использованием необходимые компоненты можно вставлять посредством вставки последовательности ДНК, в которой желаемый иммуногенный чужеродный ген был слит в участке для клонирования вектора с геном, кодирующим аминокислотную последовательность белка, который способен быть компонентом вирусной частицы, посредством расщепления ферментами рестрикции или встраивания в другой вектор, или посредством вставки желаемого иммуногенного чужеродного гена в N-концевой участок области ДНК уже встроенного в плазмиду гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который способен быть компонентом вирусной частицы.
Для выявления белка можно добавлять His-метку или HVS-метку перед поли(A)-участком к C-концевому участку последовательности ДНК, посредством которой осуществляют слияние желаемого иммуногенного чужеродного гена с геном, кодирующим аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы. Альтернативно, для экспрессии, очистки и выявления рекомбинантного слитого белка можно вставлять последовательность ДНК, которая кодирует содержащую 8 аминокислот последовательность FLAG, в качестве пептидной метки между промоторным участком и участком, в котором желаемый иммуногенный чужеродный ген был слит с геном, кодирующим аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы. Согласно настоящему изобретению плазмидный вектор со структурой, способной экспрессировать желаемый иммуногенный чужеродный белок в виде антигенного белка в клетке насекомого и клетке позвоночного, в частности, клетке млекопитающего, можно получать с использованием коммерчески доступной плазмиды со структурой, уже содержащей его участок. Для расщепления ферментом слитого белка в клетке позвоночного можно вставлять аминокислотную последовательность пептида. В вектор для переноса согласно настоящему изобретению в вышестоящее положение относительно двух промоторов можно помещать энхансер для повышения транскрипционной активности в клетке позвоночного, в частности, клетке млекопитающего, или с геном, подлежащим слиянию и экспрессии, можно связывать последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность сигнального пептида, для способствования внеклеточной секреции экспрессируемого белка в организме-хозяине. Для терминации транскрипции в нижестоящее положение относительно гена, подлежащего слиянию и экспрессии, можно помещать участок терминатора позвоночного, например, эффективный в клетке позвоночного терминатор β-глобулина кролика.
Как указано выше, можно получать вектор для переноса, способный экспрессировать слитый ген, который состоит из иммуногенного чужеродного гена, способного экспрессировать желаемое иммуногенное вещество в бакуловирусной частице, и гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы.
В качестве конкретных примеров вектора для переноса и способа его получения, как указано в описанных ниже примерах, можно представить пример вектора для переноса, состоящего из структуры, в которую были встроены слитые с энхансером CMV промотор цитомегаловируса (CMV), промотор CAG, модифицированный из промотора CMV, и промотор убиквитина (UBB) в качестве промотора позвоночных, в частности, промотора млекопитающих, связанные с промотором полиэдрина (Polh) в качестве бакуловирусного промотора, а также последовательность ДНК, в которой ген антигена вируса гриппа, ген антигена малярии и ген антигена M. tuberculosis в качестве чужеродных генов были слиты с геном антигена gp64 в качестве гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы, где таким примером являются pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64 и pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39, pCP-H1N1/NP-vp39.
(2) Получение рекомбинантного бакуловируса
Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного бакуловируса, включающему стадию получения вектора для переноса, состоящего из структуры, в которую был встроен слитый ген, содержащий, по меньшей мере, один ген, который кодирует белок, способный быть компонентом вирусной частицы, и, по меньшей мере, один иммуногенный чужеродный ген, связанные в нижестоящем положении относительно сдвоенного промотора, в котором связаны один промотор позвоночных и другой бакуловирусный промотор, стадии совместной трансфекции вектора для переноса и бакуловирусной ДНК в клетку-хозяина и выделения рекомбинантного бакуловируса.
В указанном выше способе получения рекомбинантного бакуловируса можно использовать способы введения желаемой рекомбинантной ДНК (вектор для переноса) в организм-хозяин и способы трансформации, а кроме того, не ограничиваясь чем-либо конкретным, различные хорошо известные и общепринятые способы, и их можно осуществлять в соответствии с общепринятым способом рекомбинации генов (например, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5990 (1983). Рекомбинантную ДНК (вектор для переноса) можно экспрессировать и получать согласно Ohno et al., "Tanpaku Jikken Protocol 1 Functional analysis, Saibo Kogaku Bessatu Jikken Protocol Series, 1997, Shujunsha". В случае общих способов использования клеток насекомых, рекомбинации генов и совместной трансфекции можно использовать такие же способы, как хорошо известные способы получения рекомбинантного вируса в клетках насекомых (Yoshiharu Matsuura, Proteins, Nucleic acids and Enzymes, 37:211-222, 1992; Yoshiharu Matsuura, Saibo 33(2):30-34, 2001).
Получаемый рекомбинантный бакуловирус можно культивировать в соответствии с общепринятыми способами. Сконструированный желаемым образом слитый продукт (экспрессируемый продукт), в котором были слиты ДНК иммуногенного чужеродного гена и ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы согласно настоящему изобретению, в результате культивирования экспрессируют, получают (накапливают) и секретируют внутрь, вовне клеток или на клеточной мембране.
В качестве используемой для культивирования среды можно соответствующим образом выбирать и применять различные общепринятые среды в зависимости от используемых клеток-хозяев, а культивирование можно проводить в условиях, приемлемых для роста клеток-хозяев.
Более конкретно, способ получения рекомбинантного бакуловируса включает стадию получения бакуловирусной ДНК для осуществления гомологичной рекомбинации с вектором для переноса, полученным, как указано выше, и стадию совместной трансфекции вектора для переноса и бакуловирусной ДНК в клетки насекомых, такие как клетки Sf-9, клетки Sf-21, получаемые из Spodoptera frugiperda, клетки Tn5 (клетки High-Five, предоставляемые Invitrogen), получаемые из Trichoplusia ni как клеток-хозяев.
Полученная, как указано выше, бакуловирусная ДНК для проведения гомологичной рекомбинации с вектором для переноса может представлять собой любое из дикого типа, мутанта или рекомбинантной бакуловирусной ДНК.
Бакуловирусная ДНК может повышать вероятность гомологичной рекомбинации при условии, что она имеет структуру ДНК, гомологичную в отношении ДНК, получаемой из бакуловирусной ДНК, которая расположена выше относительно используемого для вектора для переноса сдвоенного промотора таким образом, чтобы осуществить гомологичную рекомбинацию с вектором для переноса согласно настоящему изобретению, за исключением случая получаемой из бакуловируса ДНК, в промежутке которой расположен слитый ген, в котором были слиты ДНК в участке сдвоенного промотора, иммуногенный чужеродный ген и ген, кодирующий белок, способный быть компонентом вирусной частицы.
Для индукции гомологичной рекомбинации лучше смешивать вектор для переноса и бакуловирусную ДНК в массовом соотношении приблизительно от 1:1 до 10:1.
После введения в клетку насекомого посредством стадии одновременной совместной трансфекции и культивирования клетки получают из супернатанта культуры вирусные бляшки, затем суспендируют в среде, а потом вирус элюируют из агара с использованием встряхивающего устройства для получения раствора, содержащего рекомбинантный вирус.
При указанном выше можно использовать коммерчески доступную бакуловирусную ДНК, и, например, можно использовать ДНК BacVector-1000 и ДНК BacVector-2000 (получаемую из Novagen), в которых из AcNPV был удален ген полиэдрина.
Совместную трансфекцию вектора для переноса и полученной, как указано выше, бакуловирусной ДНК в клетку насекомого для гомологичной рекомбинации можно проводить с использованием описанного выше коммерчески доступного набора векторов для трансфекции (наборы для трансфекции BacVector, предоставляемые в Novagen) в соответствии с указаниями, прилагаемыми к набору векторов для трансфекции. Как указано выше, получаемый, как описано выше, вектор для переноса можно совместно трансфицировать вместе с бакуловирусной ДНК в клетку насекомого, такую как клетка Sf-9, для получения рекомбинантного бакуловируса.
Согласно настоящему изобретению, в соответствии с указанным выше способом получения рекомбинантного бакуловируса, для получения таких рекомбинантных бакуловирусов, как AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39, использовали и совместно трансфицировали в клетку насекомого Sf-9 векторы для переноса, такие как pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pDual-H5N1/HA1-gp64, pDual-SARS/S-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39, pCP-H1N1/NP-vp39, и бакуловирусную ДНК.
Также можно получать такие рекомбинантные бакуловирусы, как AcNPV-Dual-H5N1/HA1 и AcNPV-Dual-SARS/S.
Кроме указанного выше способа получения рекомбинантного бакуловируса, в качестве другого способа получения рекомбинантного бакуловируса можно использовать способ эффективной вставки чужеродного гена в Escherichia coli с применением транспозона для фагмиды (бакмиды), в который был встроен полный геном бакуловируса. В соответствии со способом рекомбинантный бакуловирус можно легко получать и собирать всего лишь посредством выделения из микробных клеток бакмиды, несущей вирусный ген, и трансфекции бакмиды в клетку насекомого.
Очистку рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению, получаемого указанным выше способом получения рекомбинантного бакуловируса, можно проводить с использованием общеизвестного способа очистки вирусов.
Например, для очистки рекомбинантного бакуловируса в клетки насекомых (1×107 клеток/планшет 10 см), такие как клетки Sf-9, инокулируют 0,5-1,0 мл исходного источника вируса (как правило, 1×107-8 бляшкообразующих единиц/мл), полученного указанным выше способом получения рекомбинантного бакуловируса, собирают в течение нескольких суток (4 суток) после инфекции супернатант культуры, и полученный центрифугированием осадок из вирусов суспендируют в таком буфере, как PBS. Получаемую суспензию наносят на градиент сахарозы 10-60%, который затем центрифугируют (25000 об./минута, 60 минут, 4°C) для сбора полосы с вирусом. Затем полученный вирус суспендируют в PBS, а после этого центрифугируют (при тех же условиях, как указано выше), и получаемый очищенный осадок рекомбинантного вируса хранят в буфере, таком как PBS, при 4°C.
Титр инфекционности указанного выше полученного очищенного рекомбинантного вируса можно измерять анализом бляшкообразования (Fields VIROLOGY 4th Edition p29-32 2001) с использованием таких клеток насекомых, как клетки Sf-9.
В рекомбинантном вирусе, представленном в качестве примера согласно настоящему изобретению, N-концевой участок бакуловирусного белка gp64 расположен вне частицы, а его C-концевой участок расположен внутри частицы. Таким образом, если белок, кодируемый желаемым иммуногенным чужеродным геном, слит с N-концевым участком gp64, то его структура, как компонент вирусной частицы, расположена вне вирусной белковой частицы в клетке насекомого, и, соответственно, антиген является более легко презентируемым, что эффективно в отношении цели препарата вакцины согласно настоящему изобретению.
(3) Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению (фармацевтическое вещество, содержащее в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению)
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, являющийся активным ингредиентом в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, можно получать способами генной инженерии, представленными выше в (2).
Важно, чтобы фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержала в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус, полученный гомологичной рекомбинацией бакуловирусной ДНК и вектора для переноса, который сконструирован таким образом, что слитый ген, в котором иммуногенный чужеродный ген согласно настоящему изобретению слит с геном, кодирующим аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы, может экспрессироваться в клетках насекомых и клетках позвоночных, в частности, клетках млекопитающих, в том числе человека.
В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента любой из таких конкретных рекомбинантных бакуловирусов, как AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 или AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39.
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, такой как AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 и AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39, являющийся активным ингредиентом в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, действует, усиливая противоинфекционный профилактический эффект в отношении инфекционного антигена и снижая титр инфекционности, и такое действие или активность можно использовать для процедур при заболеваниях, связанных с инфицированием клеток- или тканей-мишеней. Такие поражаемые инфекцией клетки-мишени включают, например, клетки крови, а другие клетки-мишени включают клетки печени, клетки почки, клетки головного мозга, клетки легких, эпителиальные клетки и мышечные клетки. Ткани, содержащие эти клетки, включают легкие, печень, почки, артерии и вены, желудок, кишечник, уретру, кожу и мышцы.
Фармацевтическая композиция усиливает противоинфекционный профилактический эффект в отношении инфекционных антигенов, таких как поверхностный антиген CSP поверхности спорозоита малярийного паразита, MSP1 из мембранного белка поверхности мерозоита, малярийный антиген S, секретируемый из инфицированных малярией эритроцитов, белок PfEMP1, присутствующий в выпуклом утолщении инфицированных малярией эритроцитов, белок SERA, белок TRAMP и белок AMA1, а также антигены гриппа, например, антиген HA, антиген NA, антиген M2 и антиген NP, и снижает титр инфекционности (например, титр инфекционности вируса). Таким образом, период выживания и уровень выживания млекопитающих, в том числе человека, которым вводят фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, являются повышенными в сравнении с таковыми при отсутствии введения. Таким образом, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению эффективна в качестве профилактического или терапевтического средства особенно в отношении инфицирования малярией и вирусом гриппа.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению эффективна в качестве профилактического или терапевтического средства в отношении вызываемых патогеном инфекционных заболеваний и их осложнений, например, вирусных заболеваний, вызываемых вирусом гриппа, вирусом папилломы, вирусом герпеса, вирусом СПИД, вирусом гепатита C, вирусом SARS, вирусом лихорадки Западного Нила и вирусом лихорадки денге, паразитических заболеваний, вызываемых малярийными паразитами, трипаносомой и лейшманией, а также бактериальных заболеваний, вызываемых такими бактериями, как дизентерийная, бактерия брюшного тифа, холерная, пневмококк, MRSA, VRE, Neisseria gonorrhoeae и Chlamydia, бактерия сифилиса и туберкулезная, где используют действие композиции, заключающееся в усилении противоинфекционного профилактического эффекта в отношении инфекционного антигена и снижении титра инфекционности.
В результате использования иммуногенного чужеродного гена для позвоночного, отличного от человека, в векторе для переноса для получения рекомбинантного бакуловируса, который является активным ингредиентом в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно применять для процедур при заболеваниях, связанных с инфицированием клеток- и тканей-мишеней, в виде вакцины от гриппа цыплят, вакцины трипаносомы быка и вакцины от холодноводной болезни японской форели, где применение основано на действии, заключающемся в усилении противоинфекционного профилактического эффекта в отношении инфекционного антигена и снижении титра инфекционности.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно получать в виде композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество рекомбинантного бакуловируса и фармацевтически приемлемый носитель.
Например, для оказания противоинфекционного профилактического эффекта рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению у позвоночного, в частности, млекопитающих, в том числе человека или клеток млекопитающих, фармацевтическую композицию, получаемую с использованием рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению, и композицию, которую можно добавлять для фармацевтического применения, вводят внутримышечно, интраназально или ингаляцией позвоночному, в частности, млекопитающему, в том числе человеку, которого затем многократно иммунизируют посредством фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению. В частности, фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят ингаляцией.
Кроме того, профилактический эффект в отношении инфекции можно оценивать после многократной иммунизации фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, вводя патоген, которым подлежит воздействовать на позвоночного, в частности, млекопитающего, в том числе человека, и сравнивая после прохождения определенного периода уровень выживаемости позвоночных, в частности, млекопитающих, в том числе человека, которым вводили рекомбинантный бакуловирус, являющийся активным ингредиентом фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, с уровнем выживаемости для тех, кому не вводили рекомбинантный бакуловирус.
(4) Вакцина согласно настоящему изобретению
Являющийся активным ингредиентом в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению рекомбинантный бакуловирус, такой как AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 или AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39, очищают из клетки насекомого в виде реплицирующейся вирусной частицы, содержащей экспрессируемый продукт слитой последовательности ДНК, в которой слит ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, способного быть компонентом вирусной частицы, и иммуногенный чужеродный ген согласно настоящему изобретению, обладающий желаемой иммуногенностью для усиления профилактического эффекта в отношении инфицирующего патогена и для проявления действия, заключающегося в снижении титра инфекционности. Таким образом, предполагают, что чужеродный антигенный белок, который стал компонентом вирусной частицы, способствует приобретенному иммунитету (гуморальному иммунитету и клеточному иммунитету) при введении фармацевтической композиции в виде вирусной частицы позвоночному, в частности, млекопитающим, в том числе человеку, а кроме того, антигенный белок, представляющий собой экспрессируемый продукт слитой последовательности ДНК, дополнительно способствует приобретенному иммунитету (гуморальному иммунитету и клеточному иммунитету) в клетках позвоночных, в частности, в клетках у млекопитающих, в том числе человека. Таким образом, рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению является эффективным в качестве вакцины.
В частности, настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей в качестве активного ингредиента любой из таких конкретных рекомбинантных бакуловирусов, как AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39.
Как и в случае с фармацевтической композицией из указанного выше (3), вакцина усиливает профилактический эффект на инфекцию и снижает титр инфекционности (например, титр инфекционности вируса) для патогенных организмов, таких как малярийные антигены, например, поверхностный антиген (CSP) поверхности спорозоита малярийного паразита, MSP1 из мембранного белка поверхности мерозоита, малярийный антиген S, секретируемый из инфицированных малярией эритроцитов, белок PfEMP1, присутствующий в выпуклом утолщении инфицированных малярией эритроцитов, белок SERA, белок TRAMP и белок AMA1, или антиген вируса гриппа HA, антиген вируса гриппа NA, антиген вируса гриппа M2 и антиген вируса гриппа NP. Таким образом, при сравнении периода выживаемости и уровня выживаемости для инфицированных млекопитающих, в том числе человека, и для тех, кому не вводили фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, вакцина оказывается особенно эффективной в качестве профилактического или терапевтического средства в отношении инфицирования малярией и вирусом гриппа.
Вакцина согласно настоящему изобретению эффективна в качестве профилактического или терапевтического средства в отношении вызываемых патогеном инфекционных заболеваний и их осложнений, например, вирусных заболеваний, вызываемых вирусом гриппа, вирусом папилломы, вирусом герпеса, вирусом СПИД, вирусом гепатита C, вирусом SARS, вирусом лихорадки Западного Нила и вирусом лихорадки денге, паразитических заболеваний, вызываемых малярийными паразитами, трипаносомой и лейшманией, а также бактериальных заболеваний, вызываемых такими бактериями, как дизентерийная, бактерия брюшного тифа, холерная, пневмококк, MRSA, VRE, Neisseria gonorrhoeae и Chlamydia, бактерия сифилиса и туберкулезная, где используют действие вакцины, заключающееся в усилении противоинфекционного профилактического эффекта в отношении инфекционного антигена и снижении титра инфекционности.
В результате использования иммуногенного чужеродного гена для позвоночного, отличного от человека, в векторе для переноса для получения рекомбинантного бакуловируса, который является активным ингредиентом в вакцине согласно настоящему изобретению, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно применять для процедур при заболеваниях, связанных с инфицированием клеток- и ткани-мишени, в виде вакцины от гриппа цыплят, вакцины трипаносомы быка и вакцины от холодноводной болезни японской форели, где применение основано на действии композиции, заключающемся в усилении противоинфекционного профилактического эффекта в отношении инфекционного антигена и снижении титра инфекционности.
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, такой как AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39, являющийся активным ингредиентом в вакцине согласно настоящему изобретению, действует, усиливая противоинфекционный профилактический эффект в отношении инфекционного антигена и снижая титр инфекционности, и такое действие или активность можно использовать для процедур при заболеваниях, связанных с инфицированием клеток- или тканей-мишеней. Такие поражаемые инфекцией клетки-мишени включают, например, клетки крови, а другие клетки-мишени включают клетки печени, клетки почки, клетки головного мозга, клетки легких, эпителиальные клетки и мышечные клетки. Ткани, содержащие эти клетки, включают легкие, печень, почки, артерии и вены, желудок, кишечник, уретру, кожу и мышцы.
Вакцину согласно настоящему изобретению, как и фармацевтическую композицию из указанного выше (3), можно получать в виде композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39) и фармацевтически приемлемый носитель.
Вакцину можно получать общепринятыми способами в виде фармацевтической композиции, используя такое же приемлемое фармацевтическое вещество, как для фармацевтической композиции в указанном выше (3). Например, носитель может включать физиологически приемлемые растворы, такие как стерильный солевой раствор и стерильный забуференный солевой раствор.
Вакцину (здесь и далее препарат является таким же, как в фармацевтической композиции) можно получать в виде препарата липосомы, содержащего в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус (AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39), и ее можно сочетать с адъювантом. Конкретные примеры вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению могут включать препарат липосомы. Препарат липосомы может представлять собой препарат, в котором рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению был зафиксирован в липосоме с использованием в качестве компонента мембраны кислого фосфолипида или с использованием в качестве компонента мембраны нейтрального фосфолипида и кислого фосфолипида.
Используемые в качестве компонента мембраны нейтральный фосфолипид и кислый фосфолипид не ограничены чем-либо конкретным, а различные липиды, обычно используемые для препарата липосомы, можно применять по отдельности или в смеси из двух или более.
Мембрану липосомы получают общепринятыми способами с использованием кислого фосфолипида по отдельности или сочетая нейтральный фосфолипид и кислый фосфолипид. В случае сочетания с нейтральным фосфолипидом доля подлежащего сочетанию кислого фосфолипида в компонентах мембраны липосомы может составлять приблизительно от 0,1 до 100 молярных %, предпочтительно - от 1 до 90 молярных %, а более предпочтительно - приблизительно от 10 до 50 молярных %.
При получении указанной выше липосомы можно, например, добавлять холестерин. Посредством этого можно контролировать текучесть фосфолипида и облегчать получение липосомы. Как правило, холестерин добавляют в количестве, эквивалентном количеству фосфолипида, и, предпочтительно, его предпочтительно добавлять и сочетать в количестве от 0,5-кратного до эквивалентного количеству фосфолипида.
Что касается количества активного ингредиента и кислого фосфолипида в препарате липосомы, количество кислого фосфолипида составляет приблизительно от 0,5 до 100 эквивалентов, предпочтительно - приблизительно от 1 до 60 эквивалентов, а более предпочтительно - приблизительно от 1,5 до 20 эквивалентов относительно активного ингредиента.
Количество рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению, представляющего собой подлежащий использованию активный ингредиент, может составлять от нескольких молярных % до нескольких десятков молярных %, предпочтительно - приблизительно от 5 до 10 молярных %, а как правило - приблизительно 5 молярных %.
Контроль над получением, концентрацией и диаметром частиц указанного выше препарата липосомы можно выполнять в соответствии с общепринятыми способами. Кроме того, по желанию, с препаратом липосомы можно сочетать различные описанные выше добавки. Также с препаратом можно связывать и использовать жирную кислоту (например, бегеновую кислоту, стеариновую кислоту, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, олеиновую кислоту), алкильную группу, холестерильную группу и т.п. Получение препарата липосомы, составляемого посредством связывания с этими веществами, можно также осуществлять в соответствии с общепринятыми способами (см. Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M. C. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)).
Предпочтительно вакцину (фармацевтическую композицию) согласно настоящему изобретению можно использовать в качестве композиции вакцины. Предпочтительно при использовании вакцины ее сочетают с адъювантом в фармацевтически эффективном количестве для усиления противоинфекционного (противомалярийного или противогриппозного) эффекта.
В качестве адъюванта можно без ограничения использовать любой адъювант, обычно применяемый для вакцины этого типа. В качестве примеров адъюванта могут быть представлены полный адъювант Фрейнда, дипептид мурамила, гидроксид алюминия, BCG, IL-12, N-ацетилмурамин-L-аланил-D-изоглутамин, тимозин α1 и QS-21. Количество подлежащего сочетанию адъюванта можно соответственно определять в зависимости от размягчения, покраснения кожи, лихорадки, головной боли и мышечной боли, которые могут проявляться как составляющая иммунной реакции у человека или животного после введения адъюванта. Вакцину (фармацевтическую композицию) согласно настоящему изобретению можно сочетать с другими общеизвестными фармацевтическими веществами, такими как пептид, способствующий иммунной реакции, и противобактериальные средства (синтетические противобактериальные средства).
Кроме того, в вакцине (фармацевтической композиции) могут содержаться выбранные по желанию лекарственные средства и добавки. В качестве примеров таких веществ может быть представлено такое лекарственное средство, как ион кальция, способствующий внутриклеточному захвату рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению. Можно использовать лекарственные средства и добавки, облегчающие проведение трансфекции, например, липосому, а также, например, фторуглеродный эмульгатор, улиткообразные структуры на основе липидов, трубкообразные структуры на основе липидов, частицы золота, биоразлагаемую микросферу и катионные полимеры.
Количество активного ингредиента, содержащегося в вакцине (фармацевтической композиции) (препарате) согласно настоящему изобретению, не ограничено чем-либо конкретным и может быть выбрано из широкого диапазона при условии, что оно является фармацевтически эффективным количеством. Доза вакцины (фармацевтической композиции) не ограничена чем-либо конкретным и может быть выбрана соответствующим образом из широкого диапазона в зависимости от желаемого терапевтического эффекта, способа введения (пути введения), периода лечения, возраста и пола пациента, а также от других условий.
В случае введения человеку рекомбинантного бакуловируса, являющегося активным ингредиентом вакцины (композиции) согласно настоящему изобретению, исходя из значений бляшкообразующих единиц для рекомбинантного вируса, вводят рекомбинантный бакуловирус в количестве, соответствующем от 102 до 1012 бляшкообразующих единиц, предпочтительно - от 105 до 1010 бляшкообразующих единиц, а более предпочтительно - от 106 до 109 бляшкообразующих единиц на пациента.
Дозу рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39), являющегося активным ингредиентом вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению, выбирают из очень широкого диапазона как количество способной к экспрессии ДНК, введенной в вакцину-хозяина, или как количество транскрибируемой РНК. Также их количества зависят от силы промоторов для транскрипции и трансляции, используемых в векторе для переноса.
Вакцину (фармацевтическую композицию) согласно настоящему изобретению вводят инъекцией суспензии рекомбинантного бакуловируса, в которой вектор был суспендирован в PBS (забуференном фосфатом физиологическом растворе) или физиологическом растворе, непосредственно в местный участок (например, в ткань легких, в печень, в мышцы и в головной мозг), вводят ингаляцией через нос или интубационную трубку, или вводят в кровеносный сосуд (например, внутриартериально, внутривенно и в воротную вену). Предпочтительно вакцину согласно изобретению вводят ингаляцией.
Предпочтительно вакцину (фармацевтическую композицию) согласно настоящему изобретению вводят не один раз, а от одного до множества раз, наблюдая состояние после исходного введения и вводя дополнительную вакцину(ы). Это делает возможным усиление желаемого эффекта. После введения вакцины (фармацевтической композиции) можно дополнительно иммунизировать посредством фармацевтической композиции, состоящей из рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению (AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PfCSP, AcNPV-Dual-PfAMA1, AcNPV-Dual-Pfs25, AcNPV-Dual-H5N1/HA1, AcNPV-Dual-SARS/S, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39, AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39). Сочетание указанных выше различных лекарственных средств, подлежащих сочетанию, также может усиливать терапевтический эффект при введении вакцины (фармацевтической композиции).
В одном из вариантов осуществления вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению рекомбинантный бакуловирус, который является одним из активных ингредиентов вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению, можно составлять смешиванием рекомбинантного бакуловируса, получаемого гомологичной рекомбинацией бакуловирусной ДНК и вектора для переноса, в который был введен слитый ген, полученный слиянием желаемого иммуногенного чужеродного гена и гена, кодирующего белок, способный быть компонентом вирусной частицы, в форме, пригодной для инъекции разовой дозы (раствор, суспензия или эмульсия), вместе с фармацевтически приемлемым носителем (т.е. нетоксичным для позвоночных, в том числе человека, и совместимым с другими ингредиентами в препарате). Например, препарат предпочтительно не содержит антиоксиданта и других соединений, для которых известно неблагоприятное воздействие на рекомбинантный бакуловирус.
Соответственно, носитель содержит в малых количествах такие добавки, как вещества, улучшающие изотонические свойства и химическую стабильность. Такие вещества в подлежащих введению дозе и концентрации являются нетоксичными для млекопитающих, в том числе человека, и могут содержать такие буферы, как фосфорная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, уксусная кислота и другие органические кислоты или их соли, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, полипептиды с низкой молекулярной массой (например, приблизительно менее чем 10 остатков) (например, полиаргинин или трипептид), белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин), аминокислоты (например, глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин), моносахариды, дисахариды и другие углеводы (в том числе целлюлоза или ее производные, глюкоза, манноза или декстрин), хелатообразующие средства (например, EDTA), сахарные спирты (например, маннит или сорбит), противоионы (например, натрий) и/или неионные поверхностно-активные вещества (например, полисорбат, полоксамер).
Содержащую рекомбинантный бакуловирус фармацевтическую вакцину (композицию) можно типичным образом хранить в контейнере для разовой дозы или многократных доз, например, в виде водного раствора или лиофилизированного продукта в герметично запечатанной ампуле или флаконе.
Фармацевтическую композицию, содержащую вакцину (композицию) согласно настоящему изобретению, вводят способом, соответствующим надлежащей медицинской практике, с учетом клинического состояния конкретного пациента (например, состояния, которое следует предотвратить или лечить), участка, в который доставляют содержащую рекомбинантный бакуловирус вакцину (композицию), ткани-мишени, способа введения, схемы введения и других общеизвестных специалистам в данной области факторов. Таким образом, в рамках настоящей заявки надлежащую дозу вакцины (композиции) определяют с учетом указанного выше.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на примеры. Эти примеры предназначены только для иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение.
[Пример 1] Векторная плазмида для переноса и способ ее получения согласно настоящему изобретению
(1) Конструирование векторной плазмиды для переноса pDual-Hsp65-gp64 согласно настоящему изобретению
(1.1) Конструирование плазмиды pBACsurf-CSP
Плазмиду pcDNA-CS87 конструировали посредством получения фрагмента NheI-NotI, содержащего последовательность, в которой слиты геномная ДНК из Plasmodium berghei штамма ANKA, сигнальная последовательность для секреции Igk мыши и последовательность FLAG в соответствии со способом Yoshida et al. (Yoshida, S., et al., B.B.R.C., 271, 107-115 (2000), и посредством вставки фрагмента NheI-NotI в участок NheI-NotI в pcDNA3.1 (полученном из Invitrogen).
Получали образец крови от мыши BALB/c, инфицированной малярийным паразитом P. berghei ANKA, и выделяли геномную ДНК P. berghei с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (предоставляемого из Qiagen). После этого геномную ДНК P. berghei ANKA амплифицировали посредством PCR с использованием праймера pbCSP1-F1:
5'-GGAGGGCTAGC ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGATCCACTGCAGGACTACAAGGACGTAGACAAGGGATATGGACAAAATAAAGCATCCAAGCCC-3' (SEQ ID №:1) (полученный заново участок NheI представлен подчеркиванием, сигнальная последовательность для секреции Igk мыши представлена курсивом, а последовательность FLAG представлена двойным подчеркиванием) и PbCSP-R1:
GGAGGGCGGCCGCATCCCGGGTTTTCTTATTTGAACCTTTTCGTTTTCTAACTCTTATACCAGAACC-3' (SEQ ID №:2) (полученный заново участок NotI представлен подчеркиванием). PCR проводили с использованием полимеразы PfuDNA (предоставляемой из Stratagene), применяя 30 циклов (денатурация при 94°C в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение одной минуты и удлинение при 72°C в течение 2 минут). Продукт PCR не содержит гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) фиксирующий фрагмент и кодирует PbCSP, слитый с сигнальной последовательностью для секреции Igk мыши в участке его исходной сигнальной последовательности.
Продукт PCR очищали, расщепляли ферментами рестрикции NheI/NotI, затем получаемое вставляли в участки NheI/NotI в pcDNA3.1 (+) (предоставленную из Invitrogen) и обозначали полученную плазмиду как pcDNA-CS87. Плазмида pcDNA-CS87 содержит промотор CMV, сигнальную последовательность для секреции Igk мыши, кодируемый геном PbCSP белок (соответствующий аминокислотам от 21 до 305), поли(A)-сигнальную последовательность, полученную из гена гормона роста быка, и поли(A)-последовательность.
Фрагмент гена, кодирующий аминокислотную последовательность в положениях 21-305 в пептиде из PbCSP, получали расщеплением pcDNA-CS87 ферментами рестрикции PstI и SmaI, фрагмент ДНК вставляли в участки PstI и SmaI в pBACsurf-1 (предоставляемый из Novagen), а сконструированную плазмиду обозначали как pBACsurf-CSP.
(1.2) Конструирование плазмиды pBACsurf-Hsp65
Ген Hsp65 получали посредством выделения геномной ДНК из штамма M. tuberculosis H37Rv с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (предоставляемого из Qiagen) и посредством клонирования с применением PCR. Таким образом, выделенную из штамма M. tuberculosis H37Rv ДНК амплифицировали посредством PCR с использованием праймера phsp65-F1:
5'-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3 (SEQ ID №:3) (участок BglII представлен подчеркиванием) и phsp65-R1:
AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3 (SEQ ID №:4) (участок NotI представлен подчеркиванием).
Продукт PCR очищали, расщепляли ферментами рестрикции BglII/NotI, лигировали в участки BamHI/NotI в pcDNA-CS87, а получаемую плазмиду обозначали как pcDNA-Ighsp65.
Плазмида pcDNA-Ighsp65 представляет собой конструкт, в котором сигнальная последовательность для секреции Igk мыши была слита с геном hsp65.
PCR проводили с использованием pcDNA-Ighsp65 в качестве образца, применяя праймер phsp65-F2:
5'-CACCCCTGCAGG ACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3' (SEQ ID №:5) (участки Sse8387I, EcoRI представлены подчеркиванием, а последовательность FLAG представлена курсивом), а также phsp65-R2:
(5'-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3' (SEQ ID №:6) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК гена Hsp65 (приблизительно 1660 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемый из Invitrogen), после этого расщепляли посредством Sse8387I/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки PstI/Cfr9I в pBACsurf-CSP (Yoshida et al. Virology 316: 161-70, 2003), полученную, как указано выше.
Плазмиду, сконструированную, как указано выше, обозначали как pBACsurf-Hsp65.
(1.3) Конструирование плазмиды pENTR-gp64
PCR проводили с использованием pBACsurf-1 (предоставляемого из Novagen) в качестве образца, применяя праймер pPolh-F2:
5'-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3' (SEQ ID №:7) (участок RsrII представлен подчеркиванием), и pgp64-R2: 5'-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3' (SEQ ID №:8) (участок KpnI представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК гена gp64 (приблизительно 1700 п.о.) вставляли в pENTR/D-TOPO для конструирования плазмиды pENTR-gp64.
Плазмиду, сконструированную, как указано выше, обозначали как pENTR-gp64.
(1.4) Конструирование вектора для переноса pDual-Hsp65-gp64 согласно настоящему изобретению
Расщепляли pBACsurf-Hsp65 посредством PstI/Cfr9I и фрагмент ДНК гена hsp65 (приблизительно 1660 п.о.) вставляли в участки PstI/Cfr9I в pENTR-gp64 для конструирования плазмиды pENTR-hsp65-gp64.
Кроме того, pENTR-hsp65-gp64 расщепляли посредством RsrII/KpnI, а фрагмент ДНК (приблизительно 3360 п.о.), состоящий из промотора полиэдрина и гена hsp65-gp64, вставляли в RsrII/KpnI в pTriEx-3 (предоставляемый из Novagen) для конструирования векторной плазмиды для переноса pDual-Hsp65-gp64, в которой экспрессия контролировалась желаемым сдвоенным промотором.
(2) Конструирование вектора для переноса pDual-PbCSP-gp64 согласно настоящему изобретению
Полученную в (1.1.1) плазмиду pBACsurf-CSP расщепляли посредством PstI/Cfr9I, и фрагмент ДНК гена PbCSP (приблизительно 890 п.о.) вставляли в участки PstI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64 для конструирования плазмиды pDual-PbCSP-gp64.
(3) Конструирование вектора для переноса pDual-H1N1/HA1-gp64 согласно настоящему изобретению
Выделяли РНК из супернатанта культуры клеток MDCK, инфицированных штаммом вируса гриппа PR/8/34, с использованием набора QIAamp MiniElute Virus Spin (QIAGEN) и амплифицировали посредством RT-PCR с использованием праймера HA-f: 5'-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3' (SEQ ID №:9) (участок SbfI представлен подчеркиванием) и HA-r: 5'-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3' (SEQ ID №:10) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый полноразмерный фрагмент гена HA вируса гриппа величиной 1700 п.о. клонировали в pCR-Blunt II-TOPO (предоставляемую из Invitrogen).
Получаемую плазмиду обозначали как pCR-Blunt-HA. PCR проводили с использованием pCR-Blunt-HA в качестве образца, применяя праймер pHA-F1: 5'-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3' (SEQ ID №:11) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и pHA-R1: 5'-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3' (SEQ ID №:12) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК гена H1N1/HA1 (приблизительно 1000 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64 для конструирования плазмиды pDual-H1N1/HA1-gp64.
(4) Конструкт вектора для переноса pDual-PbTRAMP-gp64 согласно настоящему изобретению
Получали образец крови от мыши BALB/c, инфицированной малярийным паразитом P. berghei ANKA, и выделяли геномную ДНК P. berghei с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (предоставляемого из Qiagen).
Ген PbTRAMP клонировали посредством PCR с использованием этой геномной ДНК в качестве образца в соответствии со следующим способом. А именно, PCR проводили с использованием праймера pTRAMP-F1: 5'-CACCGAATTCAAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG-3' (SEQ ID №:13) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и pTRAMP-R1: CCCGGGCTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3' (SEQ ID №:14) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК PbTRAMP (приблизительно 800 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pBACsurf-Hsp65. Сконструированную плазмиду обозначали как pBACsurf-PbTRAMP.
Затем pBACsurf-PbTRAMP расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I, а фрагмент ДНК гена PbTRAMP (приблизительно 860 п.о.) вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64 для конструирования плазмиды pDual-PbTRAMP-gp64.
(5) Конструирование вектора для переноса pDual-PbAMA1D123-gp64 согласно настоящему изобретению
Получали образец крови от мыши BALB/c, инфицированной малярийным паразитом P. berghei ANKA, и выделяли геномную ДНК P. berghei с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (предоставляемого из Qiagen).
Домен 123 (D123) гена PbAMA1 клонировали посредством PCR с использованием этой геномной ДНК в качестве образца в соответствии со следующим способом. А именно, проводили PCR с использованием праймера pAMA1-F1: 5'-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3' (SEQ ID №:15) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и pAMA1-R1: 5'-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3' (SEQ ID №:16) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК PbAMA1D123 (приблизительно 1280 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pBACsurf-Hsp65. Сконструированную плазмиду обозначали как pBACsurf-PbAMA1D123.
После этого pBACsurf-PbAMA1D123 расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I и фрагмент ДНК гена PbAMA1D123 (приблизительно 1280 п.о.) вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64, полученной в указанном выше (1.4), для конструирования плазмиды pDual-PbAMA1D123-gp64.
(6) Конструирование вектора для переноса pDual- PbMSP119-gp64 согласно настоящему изобретению
Получали образец крови от мыши BALB/c, инфицированной малярийным паразитом P. berghei ANKA, и выделяли геномную ДНК P. berghei с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (предоставляемого из Qiagen).
Клонировали ген PbMSP119 посредством PCR с использованием этой геномной ДНК в качестве образца в соответствии со следующим способом. А именно, проводили PCR с использованием праймера pMsp1-F1: 5'-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG-3' (SEQ ID №:17) (участок PstI представлен подчеркиванием) и pMsp1-R1: 5'-CCCGGGTTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3' (SEQ ID №:18) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК PbMSP119 (приблизительно 450 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством PstI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки PstI/Cfr9I в pBACsurf-Hsp65. Сконструированную плазмиду обозначали как pBACsurf-PbMSP119.
После этого pBACsurf-PbMSP119 расщепляли посредством PstI/Cfr9I, и фрагмент ДНК гена PbMSP119 (приблизительно 450 п.о.) вставляли в участки PstI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64 для конструирования плазмиды pDual- PbMSP119-gp64.
(7) Конструирование вектора для переноса pDual-PfCSP-gp64 согласно настоящему изобретению
Геномную ДНК паразита тропической малярии P. falciparum выделяли из эритроцитов человека, инфицированных штаммом P. falciparum 3D7, с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (QIAGEN). Ген PfCSP клонировали посредством PCR с использованием этой геномной ДНК в качестве образца в соответствии со следующим способом. А именно, проводили PCR с использованием праймера pPfCSP-F1: 5'-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3' (SEQ ID №:19) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и pPfCSP-R1: 5'-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3' (SEQ ID №:20) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК PfCSP (приблизительно 1100 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-PbAMA1D123-gp64. Сконструированную плазмиду обозначали как pDual-PfCSP-gp64.
(8) Конструирование вектора для переноса pDual-PfAMA1-gp64 согласно настоящему изобретению
Геномную ДНК паразита тропической малярии P. falciparum выделяли из эритроцитов человека, инфицированных штаммом P. falciparum 3D7, с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (QIAGEN). Ген PfAMA1 клонировали посредством PCR с использованием этой геномной ДНК в качестве образца в соответствии со следующим способом. А именно, проводили PCR с использованием праймера pPfAMA1-F1: 5'-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCAGAATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTG-3' (SEQ ID №:21) (участок PstI представлен подчеркиванием, последовательность FLAG представлена курсивом) и pPfAMA1-R1: 5'-CCCGGGCTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3' (SEQ ID №:22) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК PfAMA1 (приблизительно 3500 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством PstI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки PstI/Cfr9I в pDual-PbAMA1D123-gp64. Сконструированную плазмиду обозначали как pDual-PfAMA1-gp64.
(9) Конструирование вектора для переноса pDual-Pfs25-gp64 согласно настоящему изобретению
Геномную ДНК паразита тропической малярии P. falciparum выделяли из эритроцитов человека, инфицированных штаммом P. falciparum 3D7, с использованием набора для выделения ДНК в среднем объеме QIAamp (QIAGEN). Ген Pfs25 клонировали посредством PCR с использованием этой геномной ДНК в качестве образца в соответствии со следующим способом. А именно, проводили PCR с использованием праймера pPfs25-F1: 5'-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3' (SEQ ID №:23) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и pPfs25-R1: 5'-CCCGGGCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT-3' (SEQ ID №:24) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК Pfs25 (приблизительно 530 п.о.) клонировали в pENTR/D-TOPO (предоставляемую из Invitrogen), после этого расщепляли посредством EcoRI/Cfr9I, а затем полученное вставляли в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-PbAMA1D123-gp64. Сконструированную плазмиду обозначали как pDual-Pfs25-gp64.
(10) Конструирование вектора для переноса pDual-H5N1/HA1-gp64 согласно настоящему изобретению
Ген HA1 синтезируют из вируса птичьего гриппа H5N1 и вставляют в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64 для конструирования плазмиды pDual-H5N1/HA1-gp64.
(11) Конструирование вектора для переноса pDual-SARS/S-gp64 согласно настоящему изобретению
Синтезируют ген S из вируса SARS и вставляют в участки EcoRI/Cfr9I в pDual-Hsp65-gp64 для конструирования плазмиды pDual-SARS/S-gp64.
(12) Конструирование вектора для переноса pCP-H1N1/HA1-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием pDual-H1N1/HA1-gp64 в качестве образца, применяя Polh-f RsrII (5'-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3': SEQ ID №:25) (участок RsrII представлен подчеркиванием) и GP64-r DraIII (5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3': SEQ ID №:26) (участок DraIII представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент ДНК 2700 п.о. связывали с вектором, полученным расщеплением pDual-H1N1/HA1-gp64 посредством ферментов рестрикции RsrII и DraIII, для конструирования pCP-H1N1/HA1-gp64.
(13) Конструирование вектора для переноса pCAP-H1N1/HA1-gp64 согласно настоящему изобретению
Для конструирования плазмиды pCAP-H1N1/HA1-gp64 в вектор, получаемый расщеплением pTriEx-1.1 (предоставляемой из Novagen) посредством ферментов рестрикции RsrII и DraIII, вставляли HA1, получаемый расщеплением pCP-H1N1/HA1-gp64 ферментами рестрикции RsrII и DraIII, и фрагмент гена gp64.
(14) Конструирование вектора для переноса pCU-H1N1/HA1-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием pTriEx3.1 в качестве образца, применяя CMVenh-f FseI (5'-GGGGGCCGGCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3': SEQ ID №:27) (участок FseI представлен подчеркиванием) и CMVenh-r KpnI (5'-GGGGGTACCCATGGTAATAGCGATGACTAATACG-3': SEQ ID №:28) (участок KpnI представлен подчеркиванием) для амплификации участка энхансера CMV. Кроме того, проводили PCR с использованием геномной ДНК человека в качестве образца, применяя UBBp-f KpnI (5'-GGGGGTACCTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC-3': SEQ ID №:29) (участок KpnI представлен подчеркиванием) и UBBp-r RsrII (5'-GGGCGGTCCGGACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG-3': SEQ ID №:30) (участок RsrII представлен подчеркиванием) для амплификации промоторного участка UBB. Полученные два фрагмента связывали с вектором, получаемым посредством расщепления pCP-H1N1/HA1-gp64 ферментами рестрикции FseI и RsrII, для конструирования pCU-H1N1/HA1-gp64.
(15) Конструирование вектора для переноса pDual-H1N1/NP-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили RT-PCR с использованием в качестве образца геномной РНК из штамма вируса гриппа PR/8/34, применяя NP-f EcoRI (5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3': SEQ ID №:31 (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и NP-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3': SEQ ID №:32) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I и вставляли в pDual-H1N1/HA1-gp64, расщепленную ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, для получения pDual-H1N1/NP-gp64.
(16) Конструирование вектора для переноса pDual-H1N1/M2-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили RT-PCR с использованием в качестве образца геномной РНК из штамма вируса гриппа PR/8/34, применяя M2-f EcoRI (5'-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3': SEQ ID №:33) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и M2-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCCTCCAGCTCTATGCTGAC-3': SEQ ID №:34) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I и вставляли в pDual-H1N1/HA1-gp64, расщепленную ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, для получения pDual-H1N1/M2-gp64.
(17) Конструирование вектора для переноса pDual-H1N1/NAe-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили RT-PCR с использованием в качестве образца геномной РНК из штамма вируса гриппа PR/8/34, применяя NAe-f EcoRI (5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3': SEQ ID №:35) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и NAe-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3': SEQ ID №:36) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I и вставляли в pDual-H1N1/HA1-gp64, расщепленную ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, для получения pDual-H1N1/NAe-gp64.
(18) Конструирование вектора для переноса pDual-M2e-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием pDual-H1N1/M2-gp64 в качестве образца, применяя M2-f EcoRI (5'-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3': SEQ ID №:37) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и M2e-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCATCACTTGAACCGTTGCA-3': SEQ ID №:38) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I и вставляли в pDual-H1N1/HA1-gp64, расщепленную ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, для получения pDual-M2e-gp64.
(19) Конструирование вектора для переноса pCP-HA1/NC99-gp64 согласно настоящему изобретению
Выделяли РНК из замороженного исходного источника вируса гриппа NewCaledonia/20/99 (NC99) с использованием набора QIAamp MiniElute Virus Spin (QIAGEN) и проводили RT-PCR с применением праймеров HA1-f EcoRI (5'-GATGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACC-3': SEQ ID №:39) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и HA1-r Cfr9I (NC99) (5'-GATCCCGGGCTCTGGATTGAATGGATGGGATG-3': SEQ ID №:40) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием) для амплификации фрагмента гена HA1. Получаемый фрагмент и pCP-H1N1/HA1-gp64 обрабатывали ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I для того, чтобы заново вставить получаемый из NC99 фрагмент гена HA1 в участок для введения HA1 в pCP-H1N1/HA1-gp64. Полученную плазмиду обозначали как pCP-HA1/NC99-gp64.
(20) Конструирование вектора для переноса pCP-H1N1/HA0-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием pCR-Blunt-HA в качестве образца, применяя HA0-f EcoRI (5'-GGGGAATTCATGAAGGCAAACCTACTGG-3': SEQ ID №:41) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и HA2-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3': SEQ ID №:42) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием) для амплификации полноразмерного гена HA. Получаемый фрагмент и pCP-H1N1/HA1-gp64 обрабатывали ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, чтобы заново вставить фрагмент гена HA0 в участок для введения HA1 в pCP-H1N1/HA1-gp64. Полученную плазмиду обозначали как pCP-H1N1/HA0-gp64.
(21) Конструирование вектора для переноса pCP-H1N1/HA2-gp64 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием pCR-Blunt-HA в качестве образца, применяя HA2-f EcoRI (5'-GATGAATTCATATTTGGAGCCATTGCCG-3': SEQ ID №:43) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и HA2-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3': SEQ ID №:44) (участок Cfr9I представлен подчеркиванием) для амплификации участка НА2 гена HA. Получаемый фрагмент и pCP-H1N1/HA1-gp64 обрабатывали ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, чтобы заново вставить фрагмент гена HA2 в участок для введения HA1 в pCP-H1N1/HA1-gp64. Полученную плазмиду обозначали как pCP-H1N1/HA2-gp64.
(22) Конструирование вектора для переноса pCP-H1N1/HA1-vp39 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием в качестве образца бакуловирусной ДНК, предоставленной в наборе для трансфекции BacVector-2000 (Novagen), применяя vp39-f (5'-CTTACTAGTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATTCGGCGGCGGCGGCTCGGCGCTAGTGCCCGTGGGT-3': SEQ ID №:45) (участок SpeI представлен подчеркиванием, а участок EcoRI представлен двойным подчеркиванием) и vp39-r (5'-CTTCACTTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGCCCGGGGCTTTAAAGCTTGACGGCTATTCCTCCACC-3': SEQ ID №:46) (участок DraIII представлен подчеркиванием, а участок SmaI представлен двойным подчеркиванием) для амплификации участка гена vp39. Амплифицированный фрагмент и pDual-H1N1/HA1-gp64 расщепляли ферментами рестрикции SpeI и DraIII и лигировали друг с другом для конструирования pDual-vp39. Кроме того, проводили PCR с использованием в качестве образца pDual-H1N1/HA1-gp64, применяя Polh-S1 (5'-GCTAACCATGTTCATGCC-3': SEQ ID №:47) и HA1-r EcoRI (5'-GGGGAATTCACCTCTGGATTGGATGGAC-3': SEQ ID №:48) (участок EcoRI представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент расщепляли посредством EcoRI для получения гена HA1. Полученный фрагмент вставляли в pDual-vp39, расщепленный посредством EcoRI, для конструирования pCP-H1N1/HA1-vp39.
(23) Конструирование вектора для переноса pCP-H1N1/NP-vp39 согласно настоящему изобретению
Проводили PCR с использованием pDual-H1N1/NP-gp64 в качестве образца, применяя f5 EcoRI EcoRI (5'-ACGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACC-3': SEQ ID №:49) (участок EcoRI представлен подчеркиванием) и NP-r EcoRI (5'-ACGGAATTCATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3': SEQ ID №:50) (участок EcoRI представлен подчеркиванием). Получаемый фрагмент расщепляли посредством EcoRI. Полученный фрагмент вставляли в pDual-vp39, расщепленный посредством EcoRI, для конструирования pCP-H1N1/NP-vp39.
[Справочный пример 1] Конструирование pBACgus-CMV-PbCSP
(1.1) Конструирование pcDNA-GL3 (luc)
Расщепляли pGL3-энхансер (Promega) ферментами рестрикции HindIII/XbaI, лигировали фрагмент ДНК гена люциферазы (приблизительно 1690 п.о.) в участки HindIII/XbaI в pcDNA3.1 (предоставляемой из Invitrogen), а получаемую плазмиду обозначали как pcDNA-GL3(luc).
(1.2) Конструкт pBACgus-CMV-IgHsp65
pcDNA-IgHsp65 расщепляли посредством BglII/SphI и в участки BglII/SphI в pBACgus-1 (Novagen) вставляли кассету гена (приблизительно 2850 п.о.), состоящую из промотора CMV, гена Hsp65, несущего сигнальную последовательность для Igk мыши, и сигнальную поли(A)-последовательность, полученную из гормона роста быка. Сконструированную плазмиду обозначали как pBACgus-CMV-IgHsp65.
(1.3) Конструирование pBACgus-CMV-GL3
Полученную, как указано выше, плазмиду pcDNA-GL3(luc) расщепляли ферментами рестрикции NheI/XbaI, вставляли фрагмент ДНК гена люциферазы (приблизительно 1690 п.о.) в участки NheI/XbaI плазмиды pBACgus-CMV-IgHsp65, а получаемую плазмиду обозначали как pBACgus-CMV-GL3.
(1.4) Конструирование pBACgus-CMV-PbCSP
Получали фрагмент гена, кодирующий аминокислотную последовательность, которая соответствует положениям 21-305 в пептиде PbCSP, посредством расщепления плазмиды pBACsurf-CSP ферментами рестрикции PstI и SmaI, фрагмент ДНК (приблизительно 858 п.о.) вставляли в участки PstI и SmaI в pBACgus-CMV-GL3, полученной, как указано выше, а получаемую плазмиду обозначали как pBACgus-CMV-PbCSP.
(1.5) Конструирование pBACgus-CMV-HA-full
Расщепляли pCR-Blunt-HA посредством BamHI/Sse8387I и вставляли фрагмент ДНК гена HA (приблизительно 1750 п.о.) в участок BamHI/PstI в pBluescript II (KS-) для конструирования плазмиды pBluescript-HA.
Кроме того, расщепляли pBluescript-HA посредством HindIII/XbaI и вставляли фрагмент ДНК гена HA (приблизительно 1800 п.о.) в участки HindIII/XbaI в pBACgus-CMV-GL3, полученной в (1.3), для конструирования плазмиды pBACgus-CMV-HA-full.
[Пример 2] Рекомбинантный бакуловирус и способ его получения согласно настоящему изобретению
(1) Рекомбинантный бакуловирус получали с использованием набора (набор для трансфекции BacVector-2000, предоставляемый из Novagen) для получения рекомбинантного бакуловируса, применяя совместную трансфекцию клеток Sf-9 посредством ДНК из BacVector-2000 вместе с каждым из векторов для переноса: pDual-Hsp65-gp64, pDual-PbCSP-gp64, pDual-H1N1/HA1-gp64, pDual-PbTRAMP-gp64, pDual-PbAMA1D123-gp64, pDual-PbMSP119-gp64, pDual-PfCSP-gp64, pDual-PfAMA1-gp64, pDual-Pfs25-gp64, pCP-H1N1/HA1-gp64, pCAP-H1N1/HA1-gp64, pCU-H1N1/HA1-gp64, pDual-H1N1/NP-gp64, pDual-H1N1/M2-gp64, pDual-H1N1/NAe-gp64, pDual-M2e-gp64, pCP-HA1/NC99-gp64, pCP-H1N1/HA0-gp64, pCP-H1N1/HA2-gp64, pCP-H1N1/HA1-vp39, pCP-H1N1/NP-vp39, сконструированными в описанном выше примере 1, и с плазмидами, pBACgus-CMV-PbCSP и pBACgus-CMV-HA-full, полученными в справочном примере 1.
Полученные рекомбинантные бакуловирусы были обозначены как AcNPV-Dual-Hsp65, AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-PbTRAMP, AcNPV-Dual-PbAMA1D123, AcNPV-Dual-PbMSP119, AcNPV-CMV-PbCSP, AcNPV-CMV-H1N1/HA-full, AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1, AcNPV-CU-H1N1/HA1, AcNPV-Dual-H1N1/NP, AcNPV-Dual-H1N1/M2, AcNPV-Dual-H1N1/NAe, AcNPV-Dual-M2e, AcNPV-CP-HA1/NC99, AcNPV-CP-H1N1/HA0, AcNPV-CP-H1N1/HA2, AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39 и AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39, соответственно.
Клетки Sf-9 культивировали таким образом, чтобы получить 2×107 клеток на культуральный планшет 150 мм (Sumilon, предоставляемый из Akita Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), и каждый описанный выше бакуловирус инфицировали при множественности инфицирования, составляющей приблизительно 5. Через 5-6 суток среду центрифугировали при 10000×g в течение 25 минут при 4°C для получения супернатанта, который затем центрифугировали с использованием ультрацентрифуги Beckman (плавающий ротор SW28) при 25000 об./минута в течение 90 минут при 4°C для получения вирусных частиц.
(2) Рекомбинантный бакуловирус можно получать с использованием набора (набор для трансфекции BacVector-2000, предоставляемый из Novagen) для получения рекомбинантного бакуловируса, применяя совместную трансфекцию клеток Sf-9 посредством ДНК из BacVector-2000 вместе с каждым из векторов для переноса: pDual-H5N1/HA1-gp64 и pDual-SARS/S-gp64, сконструированных в указанном выше примере 1. Подлежащие получению рекомбинантные бакуловирусы обозначают как AcNPV- Dual-H5N1/HA1 и AcNPV-Dual-SARS/S, соответственно.
Клетки Sf-9 культивировали таким образом, чтобы получить 2×107 клеток на культуральный планшет 150 мм (Sumilon, предоставляемый из Akita Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), и каждый описанный выше бакуловирус инфицировали при множественности инфицирования, составляющей приблизительно 5. Через 5-6 суток среду центрифугировали при 10000×g в течение 25 минут при 4°C для получения супернатанта, который затем центрифугировали с использованием ультрацентрифуги Beckman (плавающий ротор SW28) при 25000 об./минута в течение 90 минут при 4°C для получения вирусных частиц.
[Пример 3] Тестирование фармакологического эффекта рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению
(Тестирование фармакологического эффекта как вакцины против малярии)
(Тест на предмет предотвращения малярийной инфекции)
3. Экспериментальные способы
3.1 Вакцинация
Иммунизировали самку мыши BALB/c раствором рекомбинантного вируса для вакцины три раза с трехнедельными интервалами. В случае инъекции в бедренную мышцу количество составляло 0,2 мл/организм, а раствор вируса получали таким образом, чтобы количество вируса составляло 5×106 бляшкообразующих единиц/организм.
3.2 Инфицирование мышей малярией
Через 3 недели после третьей вакцинации мышей в каждой группе обезболивали раствором для обезболивания мышей и инфицировали малярией посредством осуществления укуса мышей видом Anopheles stephensi SDA 500, инфицированным клоном Plasmodium berghei ANKA 2.34.
3.3 Расчет уровня выживаемости мышей в каждой группе
После инфицирования малярией подсчитывали в каждой группе смертные случаи и вычисляли уровень выживаемости мышей в каждой группе.
3.4 В случае профилактического эффекта в отношении малярийной инфекции для фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, рассматриваемой в качестве вакцины, результаты тестирования фармакологического эффекта представлены в таблице 1. Уровень выживаемости в каждой группе представлен в правых столбцах таблицы 1.
Как представлено в таблице 1, все мыши, у которых в периферической крови были выявлены инфицированные малярией эритроциты, погибли в течение 38 суток после инфицирования. В случае рекомбинантного вируса, в который на стадии спорозоита был вставлен ген антигена (CSP), наблюдали 100% эффект предотвращения инфекции для группы (группа № 4), которую внутримышечно иммунизировали рекомбинантным бакуловирусом (пример 1 (2)), содержащим вектор для переноса: AcNPV-Dual-PbCSP, полученный в примере 2.
Для бакуловируса дикого типа (группа № 2) отличий от контрольной группы (группа № 1) не наблюдали. Для группы (группа № 3), в которую был включен рекомбинантный бакуловирус, полученный в примере 2 с использованием промотора млекопитающих (AcNPV-CMV-PbCSP, в том числе вектор из справочного примера 1), наблюдали незначительно более высокий уровень выживаемости в сравнении с контрольной группой, что позволяет предположить вероятность проявления эффекта иммунизации вирусом, хотя эффект был слабым.
Таблица 1 Уровни выживаемости мышей в каждой группе |
||
№ группы | выживаемость/число случаев | уровень выживаемости (%) |
1 отсутствует | 5/20 | 25 |
2 AcNPV-WT | 6/20 | 30 |
3 AcNPV-CMV-PbCSP | 5/10 | 50 |
4 AcNPV-Dual-PbCSP | 10/10 | 100 |
[Пример 4] Тестирование фармакологического эффекта рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению
(Тестирование фармакологического эффекта как вакцины против вируса гриппа)
(Тест на предмет предотвращения инфицирования вирусом гриппа)
4. Экспериментальные способы
4.1 Вакцина
Иммунизировали раствором вируса для вакцины два раза с двухнедельными интервалами. Вакцину из вируса вводили инъекцией в бедренную мышцу при 106,5 бляшкообразующих единиц на мышь с использованием шприца для инъекции инсулина 29G.
4.2 Получение раствора вируса для иммунизации
Хранящийся вирусный раствор штамма вируса гриппа A/PR/8/34 размораживали при комнатной температуре самопроизвольным образом в сутки проведения инфицирования вирусом гриппа. Для получения раствора вируса для иммунизации разводили размороженный хранящийся раствор вируса до 1000 TCID50/0,05 мл для инфицирования нижних дыхательных путей и до 1000 TCID50/0,005 мл для инфицирования верхних дыхательных путей, используя забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко: (D-PBS), содержащий стерильный 0.1% BSA: бычий сывороточный альбумин.
4.3 Интраназальная иммунизация раствором вируса
Через две недели после второй вакцинации мышей обезболивали внутримышечным введением 0,05 мл обезболивающего раствора для мышей. Полученный в 4.2 раствор вируса гриппа вводили мышам в нос в объеме 0,005 мл для инфицирования верхних дыхательных путей или 0,05 мл для инфицирования нижних дыхательных путей.
4.4 Получение образца легких
Через трое суток после вакцинации каждой из 4 мышей в каждой группе внутримышечно вводили 0,1 мл раствора для обезболивания мышей и умерщвляли посредством выпуска крови из брюшной аорты при обезболивании. После этого мышей вскрывали и в стерильных условиях извлекали легкие.
4.5 Регистрация уровня выживаемости мышей после иммунизации вирусом гриппа
Уровень выживаемости мышей удостоверяли и регистрировали раз в сутки в течение 11 суток после иммунизации вирусом гриппа.
4.6 Получение гомогената легких и разведение раствора
Гомогенат легких получали добавлением 3 мл 0,1% BSA, 10 мМ HEPES, минимальной эссенциальной среды (MEM, GIBCO), содержащей антибиотики, и гомогенизацией с использованием гомогенизатора Polytron. Гомогенат легких распределяли по криопробиркам и хранили в морозильной камере для сверхнизких температур.
Проводили последовательные 10-кратные или 100,5-кратные разведения с использованием среды MEM, в которую были добавлены указанные выше антибиотики и трипсин (SIGMA, T-4549, 2 мкг/мл).
4.7 Получение среды для роста клеток
Среду для роста клеток (MEM + 10% FBS) получали добавлением 50 мл эмбриональной бычьей сыворотки: FBS к 500 мл MEM и хранили в холодильном устройстве до использования.
4.8 Культивирование MDCK (клеток почки собаки Madin-Darby), полученных из почки собаки
Замороженные и хранящиеся клетки MDCK быстро размораживали в нагретой воде, затем суспендировали в 10 мл среды для роста клеток, а супернатант удаляли центрифугированием (1000 об./минута, 5 минут, 4°C). Полученный центрифугированием осадок клеток суспендировали в среде для роста клеток. Клетки высевали в культуральный флакон и культивировали в инкубаторе при 5% CO2 при 37°C. После начала культивирования наблюдали с использованием микроскопа морфологию и рост клеток, а непосредственно перед достижением смыкания монослоя клеток MDCK промывали клетки посредством D-PBS(-), обрабатывали клетки трипсином + EDTA для рассредоточения и суспендировали клетки в среде для клеточного роста. Суспензию клеток высевали в культуральный флакон, а для проведения пересева клеток добавляли свежую среду для клеточного роста.
4.9 Получение среды для роста вируса (поддерживающая среда)
Среду, в которой BSA в концентрации 0,1% был добавлен к 500 мл MEM (с добавлением 10 мМ буфера HEPES), использовали в качестве среды для роста вируса (MEM + 0,1% BSA) и после получения хранили в холодильном устройстве до использования. При использовании добавляли антибиотики.
4.10 Измерение титра инфекционности вируса (цитопатический эффект, способ CPE)
Непосредственно перед достижением клетками MDCK в культуральном флаконе смыкания монослоя проводили обработку клеток трипсином + EDTA для рассредоточения клеток, подсчитывали количество клеток и получали суспензию клеток MDCK при 6×105 клеток/мл с использованием поддерживающей среды. Суспензию распределяли по 0,05 мл в каждую лунку 96-луночного планшета и культивировали в течение ночи в инкубаторе CO2 при 5% CO2 при 37°C.
На следующие сутки удостоверялись, что клетки прикрепились, и распределяли по 0,05 мл каждого полученного ранее разведения гомогената легких в каждую лунку для 6 лунок в 96-луночном планшете, а затем культивировали в течение 3 суток в инкубаторе CO2 при 5% CO2 при 37°C.
На 3-и сутки культивирования удостоверялись, что клетки в лунке разрушены, после этого для фиксации и окрашивания клеток в каждую лунку 96-луночного планшета добавляли по 0,05 мл 30% раствора кристаллического фиолетового, содержащего формалин, и с использованием способа Рида-Менча рассчитывали титр инфекционности вируса в легких.
4.11 Эффекты каждой группы вакцин на титр инфекционности вируса in vivo у мыши
Сравнивали титры инфекционности в гомогенатах легких мышей в контрольной группе (иммунизируемой посредством AcNPV-WT) и в тестируемых группах (иммунизируемых посредством рекомбинантного бакуловируса [включая вектор для переноса: AcNPV-Dual-H1N1/HA1, получаемый в примере 1(3)] и посредством рекомбинантного бакуловируса [содержащего вектор: AcNPV-CMV-H1N1/HA-full, получаемый в справочном примере 1]). Каждую величину титра инфекционности вируса подвергали логарифмическому преобразованию. Терапевтический эффект для групп анализировали тестом Tukey (выпуск 8.1, SAS Institute Japan Ltd), принимая во внимание его многозначность.
Результаты представлены на фиг.1.
Эффект каждой вакцины на период выживаемости после инфицирования вирусом гриппа
Периоды выживаемости в контрольной группе (иммунизируемой посредством AcNPV-WT) и группах вакцин (в которых иммунизируют посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1 или AcNPV-CMV-H1N1/HA-full) сравнивали с использованием логарифмического рангового критерия, а результаты представлены на фиг.2.
Статистический анализ проводили с использованием системы SAS (SAS Institute Japan, R.8.1). Уровень значимости составлял 5%.
4.12 Титр инфекционности вируса в легких
В группе, в которой внутримышечно иммунизировали посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1, титр инфекционности вируса в легких на 6 сутки после инфицирования был значимо подавлен (p=0,0009) в сравнении с контрольной группой (иммунизируемой посредством AcNPV-WT). При этом в группе, в которой внутримышечно иммунизировали посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1, титр инфекционности вируса в легких на 6 сутки после инфицирования был значимо подавлен (p=0,0094) в сравнении с группой, в которой иммунизировали посредством AcNPV-CMV-H1N1/HA-full.
4.13 Период выживаемости
В группе, в которой внутримышечно иммунизировали посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1, период выживаемости был значимо более продолжительным (p=0,0031) в сравнении с контрольной группой (иммунизируемой посредством AcNPV-WT). При этом период выживаемости в группе, в которой иммунизировали посредством AcNPV-CMV-H1N1/HA-full, значимо не отличался (p=0,7851) от такового в контрольной группе (иммунизируемой посредством AcNPV-WT). В группе, в которой внутримышечно иммунизировали посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1, период выживаемости был значимо более продолжительным (p=0,0031) в сравнении с группой, в которой иммунизировали посредством AcNPV-CMV-H1N1/HA-full.
В этой оценочной системе вирус гриппа вызывает у мыши воспаление легких, и она погибает. Таким образом, можно предположить, что внутримышечная иммунизация посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1 ингибировала рост вируса в легких, снижая смертность мышей от воспаления легких.
[Пример 5] Тестирование экспрессии в клетках насекомых антигена вакцины из рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению
Клетки Sf-9 культивировали в 12-луночном планшете при 3×106 клеток в лунке, и инфицировали бакуловирусными частицами из AcNPV-Dual-PbCSP, AcNPV-Dual-Hsp65 или AcNPV-Dual-H1N1/HA1, полученными в примере 2, или бакуловирусом дикого типа, AcNPV-WT, в качестве контроля при множественности инфицирования, составляющей приблизительно 5. Через 3-4 суток удаляли супернатант культуры, планшет трижды промывали посредством PBS, а затем для полного лизиса клеток в каждую лунку добавляли 0,2 мл раствора Leamuli (Tris-гидрохлорид pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 0,1% бромфеноловый синий), содержащего 2% 2-меркаптоэтанол. Образец кипятили в течение 5 минут при 95°C и подвергали электрофорезу в SDS-PAGE. После электрофореза белок переносили на мембрану PVDF (Immobilon-P, предоставляемую из Millipore) и проводили блокирование посредством погружения мембраны в Block Ace (предоставляемый из Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) в течение 12 часов при 4°C. Вестерн-блоттинг проводили следующим способом. Мембраны, на которые были перенесены белки из клеток Sf-9, инфицированных каждым бакуловирусом, инкубировали с моноклональным антителом мыши против FLAG (предоставляемым из Sigma) в качестве первичного антитела, а затем инкубировали с меченным биотином козьим антителом против IgG (H+L) мыши в качестве вторичного антитела (предоставляемого из Vector). После этого добавляли меченную авидином щелочную фосфатазу (предоставляемую из GIBCO-BRL) и получали окраску с использованием NBT/BCIP (предоставляемого из GIBCO-BRL) для выявления полос белка.
Результаты представлены на фиг.3.
На фиг.3 представлен анализ посредством Вестерн-блоттинга, в котором показана экспрессия слитого антигена из гена HA вируса гриппа, гена Hsp65 M. tuberculosis и гена CSP малярийного паразита из рекомбинантного вектора для переноса в рекомбинантном бакуловирусе в клетках насекомых. На фигуре на дорожке 1 представлены полосы для бакуловируса дикого типа (AcNPV-WT), на дорожке 2 представлены полосы для рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-Dual-H1N1/HA1), в котором ген HA вируса гриппа был вставлен под управление сдвоенного промотора согласно настоящему изобретению, на дорожке 3 представлены полосы для бакуловируса дикого типа (AcNPV-WT), на дорожке 4 представлены полосы для рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-Dual-Hsp65), в котором ген Hsp65 M. tuberculosis был вставлен под управление сдвоенного промотора согласно настоящему изобретению, на дорожке 5 представлены полосы для бакуловируса дикого типа (AcNPV-WT), а на дорожке 6 представлены полосы для рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-Dual-PbCSP), в котором ген CSP малярийного паразита был вставлен под управление сдвоенного промотора согласно настоящему изобретению.
Как представлено на фигуре на дорожках 2, 4 и 6, полосу, соответствующую экспрессируемому слитому продукту иммуногенного чужеродного гена антигена и гена gp64, наблюдают для рекомбинантного бакуловируса, в котором каждый ген антигена и ген gp64 были слиты и экспрессировались под управлением сдвоенного промотора согласно настоящему изобретению.
На основании этого было установлено, что можно осуществлять слияние и экспрессию в клетках насекомых иммуногенного чужеродного гена антигена и гена gp64.
[Пример 6] Тестирование экспрессии в млекопитающих антигена вакцины из рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению
Инфицировали клетки HepG2 посредством AcNPV-Dual-Hsp65 или AcNPV-WT в качестве контроля при множественности инфицирования, составляющей приблизительно 1. Через 24 часа удаляли супернатант культуры, планшет трижды промывали посредством PBS, а затем добавляли охлажденный при -20°C раствор ацетон:этанол (7:3) для фиксации клеток в течение 5 минут при -20°C. Блокирование проводили при комнатной температуре посредством добавления 5% обычной козьей сыворотки (предоставляемой из Sigma). После этого добавляли антитело мыши против Hsp65 (Yoshida et al., Vaccine 2005) в качестве первичного антитела, а затем меченное FITC козье антитело против IgG (H+L) (BIOSOURCE) мыши и инкубировали. Прореагировавшие клетки выявляли с использованием флуоресцентного микроскопа.
Также культивировали клетки HepG2 при 1×107 клеток на планшет для культивирования клеток 100 мм и инфицировали посредством бакуловирусных частиц AcNPV-Dual-H1N1/HA1 или AcNPV-CMV-H1N1/HA-full, или AcNPV-WT в качестве контроля при множественности инфицирования, составляющей приблизительно 5. Через 2 часа удаляли супернатант культуры, планшет трижды промывали посредством PBS, а затем клетки культивировали в течение 3 часов в среде, не содержащей метионин и цистеин (среда, в которой к модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Invitrogen) был добавлен 10% FBS, диализированный против PBS). Добавляли раствор меченных изотопом метионина и цистеина (TRANS35S-LABEL MP Biomedicals, Inc.) в конечной концентрации 5 мкКи/мл. Через 12 часов удаляли супернатант культуры, планшет трижды промывали посредством PBS, а затем для получения образца лизировали клетки с использованием 0,5 мл буфера RIPA (1% дезоксихолат натрия, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 10 мМ Tris-HCl [pH 7,5]). Образец добавляли к носителю белок A-сефароза CL-4B (Pharmacia), на который предварительно была абсорбирована сыворотка от мыши, инфицированной вирусом гриппа, и инкубировали во льду в течение 2 часов. Носитель 5 раз промывали буфером RIPA, добавляли раствор Leamuli, содержащий 2% 2-меркаптоэтанол, образец кипятили в течение 5 минут при 95°C и подвергали электрофорезу в 6% SDS-PAGE. После электрофореза гель сушили, а белок, прореагировавший с антителом, регистрировали посредством авторадиографии.
Результаты представлены на фиг.4 и 5.
На фиг.4 (A) представлены клетки, окрашенные с использованием меченного флуоресцентной меткой антитела, показывая экспрессию гена Hsp65 M. tuberculosis в рекомбинантном бакуловирусе в клетках HepG2.
На фиг.4 (B) представлен случай, в котором к клеткам HepG2 добавляли бакуловирус дикого типа.
Как очевидно из фигуры (A), открыто, что рекомбинантный бакуловирус при использовании вектора для переноса со сдвоенным промотором согласно настоящему изобретению может экспрессировать заданный антиген в клетках млекопитающих.
Это позволяет предположить, что при введении млекопитающему, в том числе человеку, рекомбинантный бакуловирус, получаемый из рекомбинантного вектора для переноса согласно настоящему изобретению, встраивается в клетки млекопитающих, промотор млекопитающих функционирует, а ген заданного чужеродного антигена и ген gp64 оказываются слитыми в клетках млекопитающих, индуцируя приобретенный иммунитет.
На фиг.5 представлен иммунопреципитационный анализ экспрессии в клетках млекопитающих слитого антигена в рекомбинантном бакуловирусе, в котором ген антигена HA вируса гриппа был встроен под управление сдвоенного промотора. На фигуре на дорожке 1 представлен бакуловирус дикого типа (AcNPV-WT), на дорожке 2 представлен рекомбинантный бакуловирус (AcNPV-CMV-H1N1/HA-full), в котором ген антигена HA вируса гриппа был встроен под управление промотора CMV, а на дорожке 3 представлен рекомбинантный бакуловирус (AcNPV-Dual-H1N1/HA1), в котором ген антигена HA вируса гриппа был встроен для слияния с геном gp64 и экспрессии под управлением сдвоенного промотора.
В случае рекомбинантного бакуловируса AcNPV-CMV-H1N1/HA-full), в котором ген антигена HA вируса гриппа был встроен под управление промотора CMV, и рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-Dual-H1N1/HA1), в котором ген антигена HA вируса гриппа был встроен для слияния с геном gp64 и экспрессии под управлением сдвоенного промотора, является очевидным, что белок, специфически реагирующий с инфицированной вирусом гриппа сывороткой, т.е. белок, содержащий антиген HA, был заново синтезирован в клетках HepG2.
На основании этого предполагают, что рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению даже в клетках млекопитающих экспрессирует антигенный белок, кодируемый геном желаемого иммуногенного чужеродного антигена, и что при введении рекомбинантного вируса млекопитающим, в том числе человеку, в результате экспрессии слитого антигена в клетках человека может быть индуцирован специфичный в отношении антигена приобретенный иммунитет.
[Пример 7] Тест на выявление слитого антигена в антигене вакцины, презентируемом на вирусной частице (вирионе) рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению
Добавляли 0,005 мл раствора Leamuli (2×) к 0,005 мл раствора получаемых ультрацентрифугированием бакуловирусных частиц AcNPV-WT, AcNPV-CMV-PbCSP, AcNPV-PbCSPsurf или AcNPV-Dual-PbCSP для каждой концентрации вируса, а затем полученное кипятили в течение 5 минут при 95°C и подвергали электрофорезу в 6% SDS-PAGE. После электрофореза белки переносили на мембрану PVDF (Immobilon-P, предоставляемую из Millipore) и проводили блокирование посредством погружения мембраны в Block Ace (предоставляемый из Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) в течение 12 часов при 4°C. Вестерн-блоттинг проводили следующим способом. Мембрану, на которую были перенесены белки вирусных частиц, инкубировали с моноклональным антителом мыши против FLAG (предоставляемым из Sigma) в качестве первичного антитела, а затем инкубировали с меченным биотином козьим антителом против IgG (H+L) мыши в качестве вторичного антитела (предоставляемого из Vector). После этого добавляли меченную авидином щелочную фосфатазу (предоставляемую из GIBCO-BRL) и получали окраску с использованием NBT/BCIP (предоставляемого из GIBCO-BRL) для выявления полос белка.
Результаты представлены на фиг.6.
На фиг.6 представлен анализ посредством Вестерн-блоттинга, в котором показана экспрессия гена CSP малярии (PbCSP) в вирусных частицах рекомбинантного бакуловируса, полученного из рекомбинантного вектора для переноса. На фигуре на дорожке 1 представлен бакуловирус дикого типа, на дорожке 2 представлен рекомбинантный бакуловирус, полученный из вектора для переноса, в котором ген антигена PbCSP был вставлен под управление промотора млекопитающих, на дорожке 3 представлен рекомбинантный бакуловирус, полученный из вектора для переноса, в котором ген антигена PbCSP был вставлен для слияния с геном gp64 и экспрессии под контролем бакуловирусного промотора полиэдрина, а на дорожке 4 представлен рекомбинантный бакуловирус, полученный из вектора для переноса, в котором ген антигена PbCSP был вставлен для слияния с геном gp64 и экспрессии под контролем сдвоенного промотора. Бакуловирусы подвергали электрофорезу и выявляли продукт экспрессии слитых гена PbCSP и гена gp64.
Как представлено на дорожках 3 и 4, в случае AcNPV-PbCSPsurf и AcNPV-Dual-PbCSP для рекомбинантных вирусных частиц выявляли сильно выраженную полосу, указывающую на наличие слитого антигена.
Таким образом, из примера 7 было открыто, что в случае рекомбинантного бакуловируса, получаемого из рекомбинантного вектора для переноса согласно настоящему изобретению, в рекомбинантных вирусных частицах может присутствовать продукт экспрессии гена gp64, слитого с желаемым иммуногенным чужеродным геном.
Пример 8: устойчивая экспрессия гена в результате замены промотора
1) Устойчивая экспрессия гена в результате замены промотора
Для выявления того, поддерживает ли рекомбинантный вирус экспрессию антигена в культивируемых клетках, клетки HeLa инфицировали посредством AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 или AcNPV-CU-H1N1/HA1 и выявляли экспрессию антигена. Клетки высевали на 24-луночный планшет при 1,0×104 клеток/лунка, а затем инфицировали вирусом при множественности инфицирования = 10, 20, 100, воздействуя в течение одного часа. Затем вирус удаляли из супернатанта клеточной культуры, а клетки культивировали в инкубаторе. Клетки собирали с течением времени и выделяли РНК. Проводили RT-PCR с использованием выделенной РНК в качестве образца, применяя праймер HA1_F01 (5'-GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3' (последовательность: SEQ ID №:51) и праймер HA1_R01 (5'-GGGTGATGAATACCCCACAG-3' (последовательность: SEQ ID №:52). Амплифицируемую ДНК анализировали электрофорезом.
В результате экспрессию выявили для всех трех типов, подтвердив, что промотор CMV может быть заменен другим эукариотическим промотором в отношении рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению.
На фиг.7 представлены результаты регистрации посредством RT-PCR экспрессии гена в клетках HeLa. M представляет собой ДНК-маркеры для электрофореза. Образцы являются следующими:
1. РНК из клеток, инфицированных вирусом дикого типа при множественности инфицирования = 10;
2. РНК из клеток, инфицированных вирусом дикого типа при множественности инфицирования = 20;
3. РНК из клеток, инфицированных вирусом дикого типа при множественности инфицирования = 100;
4. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CP-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 10;
5. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CP-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 20;
6. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CP-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 100;
7. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CU-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 10;
8. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CU-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 20;
9. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CU-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 100;
10. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CAP-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 10;
11. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CAP-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 20;
и
12. РНК из клеток, инфицированных посредством AcNPV-CAP-H1N1/HA1 при множественности инфицирования = 100.
Образец получали через 0 часов, одни сутки, 4 суток и 7 суток после инфицирования, амплифицировали посредством RT-PCR, а амплифицированную ДНК подвергали электрофорезу.
Пример 9: титр антител и клеточный иммунитет, индуцированный антигеном PbCSP из рекомбинантного вируса
1. Вакцинация
Самку мыши BALB/c трижды с трехнедельными интервалами иммунизировали раствором рекомбинантного вируса для вакцинации. Вводимую дозу получали при 0,2 мл/организм, что соответствует количеству вируса, составляющему 1×108 бляшкообразующих единиц/организм, для внутримышечной инъекции в бедренную мышцу. В качестве вакцины вводили инъекцию вируса дикого типа (AcNPV-WT), AcNPV-PbCSPsurf (Yoshida et al. Virology 316: 161-70, 2003) или AcNPV-Dual-PbCSP.
2. Вскрытие мышей
Мышь умерщвляли через три недели после последней иммунизации и извлекали из мыши сыворотку и селезенку. Сыворотку использовали для измерения титра специфического антитела, а селезенку использовали для анализа ELISPOT.
3. Измерение титров антител
Титр антител измеряли посредством ELISA с использованием планшета, на котором был зафиксирован принудительно экспрессированный в Escherichia coli и очищенный/выделенный рекомбинантный белок PbCSP. ELISA проводили в соответствии с общепринятыми способами. В результате, хотя для групп, которые не иммунизировали вирусом или которые иммунизировали вирусом дикого типа, не было выявлено повышения титра антител, повышение титра специфического антитела могло быть выявлено для группы, которую иммунизировали посредством AcNPV-PbCSPsurf, и для группы, которую иммунизировали посредством AcNPV-Dual-PbCSP.
На фиг.8 представлены титры специфичного в отношении PbCSP антитела IgG для группы без иммунизации, группы с иммунизацией вирусом дикого типа, группы с иммунизацией посредством AcNPV-PbCSPsurf и группы с иммунизацией посредством AcNPV-Dual-PbCSP.
4. Оценка клеточного иммунитета с использованием анализа ELISPOT
Анализ ELISPOT проводили с использованием клеток селезенки от иммунизированных мышей. Получали клетки селезенки от мыши и добавляли надлежащее число клеток в MultiScreen-IP (Millipore). К этому добавляли пептид (аминокислотная последовательность: SYIPSAEKI SEQ ID №:53), известный как эпитоп CD 8 из PbCSP, а затем полученное культивировали в течение ночи. После этого проводили реакцию с использованием набора ELISPOT IFN-γ мыши ELISPOT (BD Sciences) и получали окрашивание с использованием набора субстратов AEC (BD Sciences). Количество клеток, специфически прореагировавших на антиген, выявляли определением окрашенных областей. В результате в группе, которую не иммунизировали вирусом, которую иммунизировали вирусом дикого типа или AcNPV-PbCSPsurf, нельзя было выявить антиген-специфические клетки, однако в группе, которую иммунизировали посредством AcNPV-Dual-PbCSP, выявили приблизительно 350 прореагировавших клеток на 106 клеток селезенки. Это показало, что AcNPV-Dual-PbCSP может значимо сильнее индуцировать клеточный иммунитет, чем AcNPV-PbCSPsurf.
На фиг.9 представлены количества IFN-γ-продуцирующих клеток, специфичных в отношении эпитопа CTL из PbCSP, в группе без иммунизации, группе с иммунизацией вирусом дикого типа, группе с иммунизацией посредством AcNPV-PbCSPsurf и группе с иммунизацией посредством AcNPV-Dual-PbCSP.
Пример 10: тест для подтверждения противовирусных эффектов вакцины, содержащей в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус
(Тест для подтверждения эффектов рекомбинантного бакуловируса M2e)
Рекомбинантный бакуловирус M2e (AcNPV-Dual-M2e) в количестве 3,4×108 бляшкообразующих единиц на мышь вводили в бедренную мышцу два раза с двухнедельным интервалом. Мышей инфицировали вирусом гриппа A/PR/8/34 посредством интраназального введения 0,005 мл раствора, содержащего 1000 TCID50 вируса, через две недели после конечной вакцинации. На 6 сутки после инфицирования мышей умерщвляли, извлекали легкие и регистрировали количество вируса в легких с использованием клеток MDCK. В результате у всех мышей, иммунизированных посредством AcNPV-Dual-M2e, нельзя было обнаружить вирус гриппа. В то же время это был тот же самый эффект, что и в группе, в которой в бедренную мышцу вводили вакцину из рекомбинантного бакуловируса HA1 (AcNPV-Dual-H1N1/HA1) (1,0×107 бляшкообразующих единиц на мышь).
На фиг.10 представлены количества вируса внутри легких через 6 суток после инфицирования вирусом гриппа для группы PBS, группы с иммунизацией посредством AcNPV-Dual-M2e и группы с иммунизацией посредством AcNPV-Dual-H1N1/HA1.
Пример 11. Исследование для выявления профилактического эффекта фармацевтического вещества, содержащего в качестве активного компонента рекомбинантный бакуловирус HA1/NC99
В бедренную мышцу дважды с двухнедельным интервалом вводили рекомбинантный бакуловирус HA1/NC99 (AcNPV-CP-HA1/NC99) при 1,0×108 бляшкообразующих единиц на мышь. Через две недели после конечной иммунизации мышь инфицировали вирусом гриппа A/NewCaledonia/20/99 посредством введения в полость носа 0,05 мл раствора, содержащего вирус при 1000 TCID50. Через трое суток после инфицирования мышь умерщвляли, извлекали легкие и регистрировали количество вируса внутри легких с использованием клеток MDCK. В результате у трех из четырех мышей, иммунизированных посредством AcNPV-CP-HA1/NC99, нельзя было обнаружить вирус гриппа.
На фиг.11 представлены количества вируса внутри легких через 3 суток после инфицирования вирусом гриппа в группе PBS, группе с иммунизацией вирусом дикого типа (AcNPV-WT) и группе с иммунизацией посредством AcNPV-CP-HA1/NC99.
Пример 12. Исследование для выявления специфического антитела в зависимости от способов введения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента рекомбинантный бакуловирус
Рекомбинантный бакуловирус HA1 (AcNPV-Dual-H1N1/HA1) при 2,0×107 бляшкообразующих единиц на мышь вводили два раза с двухнедельным интервалом посредством введения 0,005 мл раствора вируса в обе ноздри (капли для носа), введения 0,05 мл раствора вируса в нос (риновакцинация), введения 0,05 мл раствора вируса в дыхательные пути (через дыхательные пути) и введения 0,05 мл раствора вируса в бедренную мышцу (мышечная инъекция). Через две недели после конечной иммунизации получали жидкость от назального лаважа, жидкость от альвеолярного лаважа и сыворотку и определяли экспрессию антитела, специфичного в отношении вируса гриппа. Титр антител измеряли посредством ELISA с использованием планшета, на котором был зафиксирован экстракт клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа A/PR/8/34. ELISA проводили в соответствии с общепринятыми способами. В результате в крови от группы с риновакцинацией, группы с внутритрахеальной вакцинацией и группы с внутримышечной вакцинацией было выявлено специфическое антитело IgG. В частности, было выявлено, что образование антитела в значительной степени индуцируется в группе с внутритрахеальной вакцинацией. Сходным образом, антиген-специфическое антитело IgG было также выявлено в жидкости от назального лаважа и жидкости от альвеолярного лаважа, и, в частности, образование антитела в значительной степени индуцировалось в группе с внутритрахеальной вакцинацией. Кроме того, для группы с внутритрахеальной вакцинацией в жидкости от альвеолярного лаважа также выявляли продукцию антиген-специфического антитела IgA.
На фиг.12 представлены результаты ELISA для измерения в крови антитела IgG, специфичного в отношении вируса гриппа, для группы с каплями для носа, группы с риновакцинацией, группы с внутритрахеальной вакцинацией и группы с внутримышечной вакцинацией.
На фиг.13 представлены результаты ELISA для измерения в жидкости от назального лаважа и жидкости от альвеолярного лаважа антител IgG и IgA, специфичных в отношении вируса гриппа, для группы с каплями для носа, группы с риновакцинацией, группы с внутритрахеальной вакцинацией и группы с внутримышечной вакцинацией.
Пример 13. Исследование для выявления эффектов в зависимости от способов введения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента рекомбинантный бакуловирус
Рекомбинантный бакуловирус HA1 (AcNPV-Dual-H1N1/HA1) при 1,0×107 бляшкообразующих единиц на мышь вводили два раза с двухнедельным интервалом посредством введения с использованием капель для носа, риновакцинацией, через дыхательные пути или мышечной инъекцией. Через две недели после конечной иммунизации мышь инфицировали вирусом гриппа A/PR/8/34 посредством введения в полость носа 0,005 мл раствора, содержащего вирус при 1000 TCID50. Через трое суток после инфицирования получали жидкость от назального лаважа, через 6 суток после инфицирования извлекали легкие и регистрировали количество вируса внутри легких с использованием клеток MDCK. В результате количество вируса в полости носа через 3 суток после инфицирования было значительно снижено в группе с риновакцинацией и группе с внутритрахеальной вакцинацией. Кроме того, в группе с внутритрахеальной вакцинацией, а также в группе с внутримышечной вакцинацией количество вируса внутри легких через 6 суток после инфицирования было снижено до порога чувствительности или до более низкого уровня.
На фиг.14 представлены количества вируса в жидкости от назального лаважа через 3 суток после инфицирования вирусом гриппа для группы с каплями для носа, группы с риновакцинацией, группы с внутритрахеальной вакцинацией и группы с внутримышечной вакцинацией.
На фиг.15 представлены количества вируса внутри легких через 6 суток после инфицирования вирусом гриппа для группы с каплями для носа, группы с риновакцинацией, группы с внутритрахеальной вакцинацией и группы с внутримышечной вакцинацией.
ОТКРЫТОЕ ОПИСАНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID №:1 и 2 представляют собой последовательности праймеров PbCSP-F и PbCSP-R1 для PCR для геномной ДНК из штамма P. berghei ANKA;
SEQ ID №:3 и 4 представляют собой последовательности праймеров phsp65-F1 и phsp65-R1 для PCR для геномной ДНК из M. tuberculosis H37Rv;
SEQ ID №:5 и 6 представляют собой последовательности праймеров phsp65-F2 и phsp65-R2 для PCR с использованием pcDNA-IgHsp65 в качестве образца;
SEQ ID №:7 и 8 представляют собой последовательности праймеров pPolh-F2 и pgp64-R2 для PCR с использованием pBACsurf-1 (предоставляемой из Novagen) в качестве образца для получения фрагмента ДНК гена gp64;
SEQ ID №:9 и 10 представляют собой последовательности праймеров HA-f и HA-r для PCR для получения фрагмента гена HA вируса гриппа; и
SEQ ID №:11 и 12 представляют собой последовательности праймеров pHA-F1 и pHA-R1 для PCR с использованием pCR-Blunt-HA в качестве образца.
SEQ ID №:13 и 14 представляют собой последовательности праймеров pTRAMP-F1 и pTRAMP-R1 для PCR для гена PbTRAMP.
SEQ ID №:15 и 16 представляют собой последовательности праймеров pAMA1-F1 и pAMA-R1 для PCR для домена 123 (D123) гена PbAMA1.
SEQ ID №:17 и 18 представляют собой последовательности праймеров pMsp1-F1 и pMsp1-R1 для PCR для гена PbMSP119.
SEQ ID №:19 и 20 представляют собой последовательности праймеров pPfCSP-F1 и pPfCSP-R1 для PCR для гена PfCSP.
SEQ ID №:21 и 22 представляют собой последовательности праймеров pPfAMA1-F1 и pPfAMA1-R1 для PCR для гена PfAMA1 из P. falciparum 3D7.
SEQ ID №:23 и 24 представляют собой последовательности праймеров pPfs25-F1 и pPfs25-R1 для PCR для гена Pfs25 из P. falciparum.
SEQ ID №:25 и 26 представляют собой последовательности праймеров Polh-f RsrII и GP64-r DraIII для PCR с использованием pDual-H1N1/HA-gp64 в качестве образца.
SEQ ID №:27 и 28 представляют собой последовательности праймеров CMVenh-f FseI и CMVenh-r KpnI для PCR для энхансерного участка CMV.
SEQ ID №:29 и 30 представляют собой последовательности праймеров UBBp-f KpnI и UBBp-r RsrII для PCR для промоторного участка UBB.
SEQ ID №:31 и 32 представляют собой последовательности праймеров NP-f EcoRI и NP-r Cfr9I для RT-PCR для геномной РНК из штамма вируса гриппа PR/8/34;
SEQ ID №:33 и 34 представляют собой последовательности праймеров M2-f EcoRI и M2-r Cfr9I для RT-PCR для геномной РНК из штамма вируса гриппа PR/8/34;
SEQ ID №:35 и 36 представляют собой последовательности праймеров NAe-f EcoRI и NAe-r Cfr9I для RT-PCR для геномной РНК из штамма вируса гриппа PR/8/34;
SEQ ID №:37 и 38 представляют собой последовательности праймеров M2-f EcoRI и M2e-r Cfr9I для PCR с использованием pDual-H1N1/M2-gp64 в качестве образца;
SEQ ID №:39 и 40 представляют собой последовательности праймеров HA1-f EcoRI и HA1-r Cfr9I(NC99) для RT-PCR для геномной РНК из NewCaledonia/20/99 (NC99);
SEQ ID №:41 и 42 представляют собой последовательности праймеров HA0-f EcoRI и HA2-r Cfr9I для PCR с использованием pCR-Blunt-HA в качестве образца;
SEQ ID №:43 и 44 представляют собой последовательности праймеров HA2-f EcoRI и HA2-r Cfr9I для PCR с использованием pCR-Blunt-HA в качестве образца;
SEQ ID №:45 и 46 представляют собой последовательности праймеров vp39-f и vp39-r для PCR для участка гена vp39.
SEQ ID №:47 и 48 представляют собой последовательности праймеров Polh-S1 и HA1-r EcoRI для PCR для фрагмента гена HA1.
SEQ ID №:49 и 50 представляют собой последовательности праймеров NP-f 5 EcoRI и NP-r EcoRI для PCR с использованием pDual-H1N1/NP-gp64 в качестве образца;
SEQ ID №:51 и 52 представляют собой последовательности праймеров для выявления экспрессии AcNPV-CP-H1N1/HA1, AcNPV-CAP-H1N1/HA1 и AcNPV-CU-H1N1/HA1.
SEQ ID №:53 представляет собой полипептид, известный как эпитоп CD8 из PbCSP.
Claims (2)
1. Бакуловирусный вектор для переноса, содержащий структуру, в которую встроены сдвоенный промотор и слитая ДНК,
отличающийся тем, что слитая ДНК, содержащая
(A) фрагмент последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка-антигена малярии, который можно получить посредством ПЦР из геномной ДНК, выделенной из штамма паразита малярии P. falciparum 3D7, в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 19 и SEQ ID №: 20 и последующим расщеплением EcoRI и Cfr9I, или частичный фрагмент указанного фрагмента ДНК, где полипептид, кодируемый указанным частичным фрагментом, обладает иммуногенностью; и
(B) фрагмент ДНК гена, кодирующего аминокислотную последовательность с номером доступа GenBank № L22858, где указанный фрагмент присутствует во фрагменте ДНК, который можно получить посредством ПЦР с pBACsurf-1 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 7 и SEQ ID №: 8 и последующим расщеплением RsrII и KpnI, и полипептид, кодируемый указанным фрагментом, способен быть компонентом вирусной частицы;
присоединена ниже сдвоенного промотора, содержащего промотор полиэдрина и промотор CMV, связанные друг с другом.
отличающийся тем, что слитая ДНК, содержащая
(A) фрагмент последовательности ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка-антигена малярии, который можно получить посредством ПЦР из геномной ДНК, выделенной из штамма паразита малярии P. falciparum 3D7, в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 19 и SEQ ID №: 20 и последующим расщеплением EcoRI и Cfr9I, или частичный фрагмент указанного фрагмента ДНК, где полипептид, кодируемый указанным частичным фрагментом, обладает иммуногенностью; и
(B) фрагмент ДНК гена, кодирующего аминокислотную последовательность с номером доступа GenBank № L22858, где указанный фрагмент присутствует во фрагменте ДНК, который можно получить посредством ПЦР с pBACsurf-1 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 7 и SEQ ID №: 8 и последующим расщеплением RsrII и KpnI, и полипептид, кодируемый указанным фрагментом, способен быть компонентом вирусной частицы;
присоединена ниже сдвоенного промотора, содержащего промотор полиэдрина и промотор CMV, связанные друг с другом.
2. Вакцина против малярии, содержащая рекомбинантный вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) в качестве активного агента и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель,
где рекомбинантный AcNPV содержит структуру на основе последовательности ДНК, содержащую слитую последовательность ДНК
из:
(A) фрагмента ДНК последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка-антигена малярии, который можно получить посредством ПЦР из геномной ДНК, выделенной из штамма паразита малярии P. falciparum 3D7, в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 19 и SEQ ID №: 20 и последующим расщеплением EcoRI и Cfr9I, или частичный фрагмент указанного фрагмента ДНК, где полипептид, кодируемый указанным частичным фрагментом, обладает иммуногенностью; и
(B) фрагмента ДНК гена, кодирующего аминокислотную последовательность с номером доступа GenBank № L22858, где указанный фрагмент присутствует во фрагменте ДНК, который можно получить посредством ПЦР с pBACsurf-1 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 7 и SEQ ID №: 8 и последующим расщеплением RsrII и KpnI, и полипептид, кодируемый указанным фрагментом, способен быть компонентом вирусной частицы;
под контролем сдвоенного промотора, содержащего промотор полиэдрина и промотор CMV или промотор CAG, связанные друг с другом.
где рекомбинантный AcNPV содержит структуру на основе последовательности ДНК, содержащую слитую последовательность ДНК
из:
(A) фрагмента ДНК последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка-антигена малярии, который можно получить посредством ПЦР из геномной ДНК, выделенной из штамма паразита малярии P. falciparum 3D7, в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 19 и SEQ ID №: 20 и последующим расщеплением EcoRI и Cfr9I, или частичный фрагмент указанного фрагмента ДНК, где полипептид, кодируемый указанным частичным фрагментом, обладает иммуногенностью; и
(B) фрагмента ДНК гена, кодирующего аминокислотную последовательность с номером доступа GenBank № L22858, где указанный фрагмент присутствует во фрагменте ДНК, который можно получить посредством ПЦР с pBACsurf-1 в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID №: 7 и SEQ ID №: 8 и последующим расщеплением RsrII и KpnI, и полипептид, кодируемый указанным фрагментом, способен быть компонентом вирусной частицы;
под контролем сдвоенного промотора, содержащего промотор полиэдрина и промотор CMV или промотор CAG, связанные друг с другом.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006-032863 | 2006-02-09 | ||
JP2006032863 | 2006-02-09 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008136204/10A Division RU2453603C2 (ru) | 2006-02-09 | 2007-02-08 | Вектор для переноса и вакцина против туберкулеза |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012108129A RU2012108129A (ru) | 2013-09-10 |
RU2588464C2 true RU2588464C2 (ru) | 2016-06-27 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004029259A1 (ja) * | 2002-09-25 | 2004-04-08 | Osaka Industrial Promotion Organization | バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法 |
WO2004041852A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-21 | Glaxo Group Limited | Hiv vaccine |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004029259A1 (ja) * | 2002-09-25 | 2004-04-08 | Osaka Industrial Promotion Organization | バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法 |
WO2004041852A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-21 | Glaxo Group Limited | Hiv vaccine |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YOSHIDA S. et al., Baculovirus virions displaying Plasmodium berghei circums porozoite protein protect mice against malaria sporozoite infection, Virology, vol.316, 2003, pages 161-170. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2453603C2 (ru) | Вектор для переноса и вакцина против туберкулеза | |
BRPI0922867B1 (pt) | Glicoproteina de fusão (f) de vírus sincicial respiratório (rsv), ácido nucleico isolado, célula hospedeira, composição de vacina e micela purificada | |
US9327018B2 (en) | Recombinant baculovirus vaccine | |
JP2009528305A (ja) | 鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原 | |
AU2008284664B2 (en) | Baculoviral vectors with a dual vertebrate and baculovirus promoter controlling an immunogenic fusion gene | |
TW202206598A (zh) | 對抗SARS-CoV-2之疫苗及其製品 | |
RU2588464C2 (ru) | Бакуловирусный вектор и его применение | |
JP2016512680A (ja) | ピコルナウイルス(Picornavirus)タンパク質の発現増強 | |
JP5409605B6 (ja) | 新規ウイルスベクター | |
JP2003528614A (ja) | 肝炎ウイルスのorf2のn末端領域に由来するプロセシング成分および抗原性ポリペプチドをコードする核酸構築物 |