BRPI0922867B1

BRPI0922867B1 - Glicoproteina de fusão (f) de vírus sincicial respiratório (rsv), ácido nucleico isolado, célula hospedeira, composição de vacina e micela purificada

Info

Publication number: BRPI0922867B1
Application number: BRPI0922867-5A
Authority: BR
Inventors: Peter Pushko; Yingyun Wu; Michael Massare; Ye Liu; Gale Smith; Bin Zhou
Original assignee: Novavax, Inc.
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2020-09-29
Also published as: MX2011006205A; IL247341B; EP2370099B1; US20190134187A1; PL2370099T3; WO2010077717A1; US20100239617A1; US9717786B2; SG172022A1; JP6462048B2; KR101801213B1; PT3067064T; SI3067064T1; EP3718566A1; CN102307591B; HRP20160859T1; JP6162751B2; US9731000B2; HK1161690A1; AU2009333484A1

Abstract

proteína de fusão (f) de vírus sincicial respiratório (rsv), ácido nucléico isolado, composição de vacina, micela purificada, bem como partícula semelhante a um vírus (vlp) a presente invenção refere-se, genericamente, a proteínas de fusão (f) de vírus respiratório sincicial mutadas ou modificadas e os métodos para a fabricação e uso dessas, incluindo composições imunológicas, tais como vacinas para o tratamento e/ou prevenção de infecção por rsv.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade para o pedido provisório norte-americano de n° 61/121,126, depositado em 09 de dezembro de 2008, pedido provisório norte-americano n° 61/169, 077, depositado em 14 de abril de 2009, e o pedido provisório norte-americano n° 61/224,787, depositado em 10 de julho de 2009, cada um desses sendo aqui incorporados por referência, em sua totalidade, para todos os fins.

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se, genericamente, a proteínas de fusão (F) de virus respiratório sincicial mutadas ou modificadas e aos métodos para a fabricação e uso dessas, incluindo composições imunogênicas, tais como vacinas para o tratamento e/ou prevenção de infecção por RSV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O virus sincicial respiratório (RSV) é um membro do gênero Pneumovírus da familia Paramyxovíridae. O RSV humano (HRSV) é a principal causa de doença severa do trato respiratório inferior em crianças pequenas e é responsável por considerável morbidade e mortalidade em humanos. O RSV é também reconhecido como um importante agente de doença em adultos imunocomprometidos e nos idosos. Devido à resistência incompleta para o RSV no hospedeiro infectado após uma infecção natural, o RSV pode infectar múltiplas vezes durante a infância e a vida adulta.

Esse virus possui um genoma composto de um RNA de sentido negativo de fita simples, que está fortemente associado à proteina virai para a formação do nucleocapsideo. O envelope virai é composto de uma bicamada lipidica derivada da membrana plasmática que contém proteínas estruturais viralmente codificadas. A polimerase virai é empacotada com o virion e transcreve o RNA genômico em mRNA. O genoma do RSV codifica três proteínas estruturais da transmembrana, F, G e SH, duas proteínas da matriz, M e M2, três proteínas do nucleocapsideo N, P e L, e duas proteínas não estruturais, NS1 e NS2.

Pensa-se que a fusão do HRSV e das membranas ocorre na superfície da célula e é uma etapa necessária para a transferência de ribonucleoproteina virai para o citoplasma da célula durante os estágios iniciais da infecção. Esse processo é mediado pela proteina de fusão (F), que também promove a fusão da membrana das células infectadas com a das células adjacentes, para a formação de uma sincicia característica, que é tanto um efeito citopático proeminente quanto um mecanismo adicional de propagação virai. Portanto, a neutralização da atividade de fusão é importante na imunidade do hospedeiro.

De fato, os anticorpos monoclonais desenvolvidos contra a proteina F foram mostraram neutralizar a infectividade do virus e inibir a fusão da membrana (Calder et al, 2000, Virology271: 122-131).

A proteina F do RSV compartilha as características estruturais e a identidade limitada, mas significativa, da sequência de aminoácidos com glicoproteinas F de outros paramixovirus. Ela é sintetizada como um precursor inativo de 574 aminoácidos (F0), que é glicosilada co- translacionalmente nas asparaginas no retículo endoplasmático, onde se organiza em homo-oligômeros. Antes de alcançar a superfície da célula, o precursor F0 é clivado por uma protease na F2 do terminal N e Fl do terminal C. As cadeias Fl e F2 permanecem covalentemente ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto.

Descobriu-se que as proteínas F de comprimento total purificadas por imunoafinidade se acumulam na forma de micelas (também caracterizadas como rosetas), semelhantes às observadas com outras glicoproteínas da membrana virai de comprimento total (Wrigley et al, 1986, in Electron Microscopy of Proteins, Vol 5, p. 103-163, Academic Press, Londres). Na microscopia eletrônica, as moléculas nas rosetas parecem hastes em forma de cone invertido (-70%) ou estruturas em forma de pirulito (-30%) com suas extremidades mais larga projetando longe dos centros das rosetas. O estado conformacional da haste está associado a uma glicoproteína F no estado de inativação de pré-fusão, enquanto que o estado conformacional de "pirulito"está associado a uma glicoproteína F no estado ativo, pós-fusão.

A micrografia eletrônica pode ser utilizada para a distinção entre as conformações de pré-fusão e pós-fusão (alternativamente designadas pré-fusogênica e fusogênica) , conforme demonstrado por Calder et al, 2000, Virology 271:122-131. A conformação de pré-fusão também pode ser distinguida da conformação fusogênica (pós-fusão) por testes de associação de lipossomas. Além disso, as conformações pré-fusão e fusogênicas podem ser distinguidas através do uso de anticorpos (e.g., anticorpos monoclonais) que reconhecem especificamente epítopos de conformação presentes na forma de pré-fusão ou fusogênica da proteína F do RSV, mas não em outra forma. Tais epitopos de conformação podem ocorrer devido à exposição preferencial de um determinante antigênico na superfície da molécula. Alternativamente, os epitopos conformacionais podem surgir a partir da justaposição de aminoácidos que são não contíguos na polipeptídeo linear.

Foi demonstrado anteriormente que o precursor F é clivado em dois sítios (sítio I, após o resíduo 109, e sítio II, após o resíduo 136), ambos precedidos por motivos reconhecidos pelas proteases semelhantes à furina. O sítio II é adjacente a um peptídeo de fusão, e a divagem da proteína F em ambos os sítios é necessária para a fusão da membrana (Gonzalez-Reyes et al, 2001, PNAS 98(17): 9859- 9864) . Quando a divagem é completada em ambos os sítios, acredita-se que haja uma transição da forma de cone para as hastes em forma de pirulito.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Conforme aqui descrito, os presentes inventores descobriram que, surpreendentemente, os altos níveis de expressão da proteína de fusão (F) podem ser alcançados quando certas modificações são realizadas na estrutura da proteína F do RSV. Tais modificações também, inesperadamente, reduzem a toxicidade celular da proteína F do RSV em uma célula hospedeira. Além disso, as proteínas F modificadas da presente invenção demonstram uma capacidade melhorada de exibição da morfologia de "pirulito"de pós- fusão, ao contrário da morfologia de "haste" da pré-fusão. Assim, em um aspecto, as proteínas F modificadas da presente invenção também podem apresentar uma imunogenicidade melhorada em comparação às proteínas F do tipo selvagem. Essas modificações possuem aplicações significativas para o desenvolvimento de vacinas e métodos de utilização dessas vacinas para o tratamento e/ou prevenção de RSV. A presente invenção fornece proteínas F recombinantes do RSV que demonstram expressão aumentada, toxicidade celular reduzida, e/ou propriedades imunogênicas melhoradas se comparadas às proteínas F selvagens do RSV.

Em um aspecto, a invenção fornece proteínas F recombinantes do RSV compreendendo sequências de aminoácidos modificadas ou mutadas, em comparação às proteínas F selvagens do RSV. Em geral, essas modificações ou mutações aumentam a expressão, reduzem a toxicidade celular, e/ou melhoram as propriedades imunogênicas das proteínas F do RSV em comparação às proteínas F selvagens do RSV. Em certas modalidades exemplares, as proteínas F do RSV são proteínas F humanas do RSV.

A proteina F do RSV preferivelmente compreende uma sequência de aminoácido modificadas ou mutadas em comparação às proteínas F selvagens do RSV (e.g., conforme exemplificado na SEQ ID NO: 2) . Em uma modalidade, a proteina F do RSV contém uma modificação ou mutação no aminoácido correspondente à posição PI 02 da proteina F selvagem do RSV (SEQ ID NO: 2) . Em outra modalidade, a proteina F do RSV contém uma modificação ou mutação no aminoácido correspondente à posição PI 1379 da proteina F selvagem do RSV (SEQ ID NO: 2) . Em outra modalidade, a proteina F do RSV contém uma modificação ou mutação no aminoácido correspondente à posição M447 da proteina F selvagem do RSV (SEQ ID NO: 2).

Em uma modalidade, a proteína F do RSV contém duas ou mais modificações ou mutações nos aminoácidos correspondentes às posições descritas acima. Em outra modalidade, a proteína F do RSV contém três ou mais modificações ou mutações nos aminoácidos correspondentes às posições descritas acima.

Em uma modalidade específica, a invenção visa às proteínas F do RSV em que a prolina na posição 102 é substituída por alanina. Em outra modalidade específica, a invenção visa às proteínas F do RSV em que a isoleucina na posição 379 é substituída por valina. Ainda em outra modalidade específica, a invenção visa às proteínas F do RSV em que a metionina na posição 447 é substituída por valina. Em certas modalidades, a proteína F do RSV contém duas ou mais modificações ou mutações nos aminoácidos correspondentes às posições descritas nessas modalidades específicas. Em certas modalidades, a proteína F do RSV contém três modificações ou mutações nos aminoácidos correspondentes às posições descritas nessas modalidades específicas. Em uma modalidade exemplar, a proteína de RSV possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade, a sequência de codificação da proteína F de RSV é ainda otimizada para a melhora de sua expressão em uma célula hospedeira adequada. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de inseto. Em uma modalidade exemplar, a célula de inseto é uma célula Sf9.

Em uma modalidade, a sequência de codificação do gene F de RSV de códon otimizado é SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a proteína F de RSV de códon otimizado possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade, a proteina F de RSV compreende ainda ao menos uma modificação no sitio críptico poli(A)de F2. Em outra modalidade, a proteina F de RSV inclui ainda uma ou mais mutações de aminoácidos no sitio primário de clivagem (CS) . Em uma modalidade, a proteina F do RSV contém uma modificação ou mutação no aminoácido correspondente à posição R133 da proteina F selvagem de RSV (SEQ ID NO: 2) ou da proteina F de RSV de códon otimizado (SEQ ID NO: 4) . Em outra modalidade, a proteina F do RSV contém uma modificação ou mutação no aminoácido correspondente à posição R135 da proteina F selvagem do RSV (SEQ ID NO: 2) ou da proteina F de RSV de códon otimizado (SEQ ID NO: 4). Ainda em outra modalidade, a proteina F do RSV contém uma modificação ou mutação no aminoácido correspondente à posição R136 da proteina F selvagem do RSV (SEQ ID NO: 2) ou da proteina F de RSV de códon otimizado (SEQ ID NO: 4).

Em uma modalidade especifica, a invenção visa às proteínas F de RSV em que a arginina na posição 133 é substituída por glutamina. Em outra modalidade especifica, a invenção visa às proteínas F de RSV em que a arginina na posição 135 é substituída por glutamina. Ainda em outra modalidade especifica, a invenção visa às proteínas F de RSV em que a arginina na posição 136 é substituída por glutamina. Em certas modalidades, a proteina F de RSV contém duas ou mais modificações ou mutações nos aminoácidos correspondentes às posições descritas nessas modalidades especificas. Em outra modalidade determinada, a proteina F de RSV contém três modificações ou mutações nos aminoácidos correspondentes às posições descritas nessas modalidades especificas. Em uma modalidade exemplar, a proteina de RSV possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 6.

Em outra modalidade, a proteina F de RSV compreende ainda uma deleção na metade do terminal N do dominio de fusão correspondente aos aminoácidos 137-146 da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, e SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade exemplar, a proteina F de RSV possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade alternativa, a proteina F de RSV possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 10.

Ainda inclusos no escopo da invenção, encontram-se outras proteínas F de RSV que não a proteina F de RSV humana (SEQ ID NO: 2), que contêm alterações correspondentes às acima referidas. Tais proteínas F de RSV podem incluir, entre outras, as proteínas F de RSV de cepas A do RSV humano, cepas B do RSV humano, cepas do RSV bovino, e cepas do RSV aviário.

Em algumas modalidades, a invenção direciona as proteínas F de RSV modificadas ou mutadas que demonstram expressão aumentada em uma célula hospedeira em comparação às proteínas F selvagens de RSV, conforme a mostrada pela SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, a invenção direciona as proteínas F de RSV modificadas ou mutadas que demonstram toxicidade celular reduzida em uma célula hospedeira em comparação às proteínas F selvagens de RSV, conforme a mostrada pela SEQ ID NO: 2. Ainda em outras modalidades, a invenção direciona as proteínas F de RSV modificadas ou mutadas que demonstram propriedades imunogênicas melhoradas em comparação às proteínas F selvagens de RSV, conforme a mostrada pela SEQ ID NO: 2.

Em aspectos adicionais, a invenção fornece composições imunogênicas compreendendo uma ou mais proteínas F de RSV modificadas ou mutadas conforme aqui descritas. Em uma modalidade, a invenção fornece uma micela de Formada por uma ou mais proteínas F de RSV modificadas ou mutadas (e.g., uma micela de F de RSV).

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma partícula semelhante a um vírus (VLP) compreendendo uma proteína F de RSV modificada ou mutada. Em algumas modalidades, a VLP compreende ainda uma ou mais proteínas adicionais.

Em uma modalidade, a VLP compreende ainda uma proteína matriz (M) . Em uma modalidade, a proteína M é derivada de uma cepa humana do RSV. Em outra modalidade, a proteína M é derivada de uma cepa bovina do RSV. Em outras modalidades, a proteína matriz pode ser uma proteína Ml de uma cepa do vírus da influenza. Em uma modalidade, a cepa de vírus da influenza é uma cepa do vírus da influenza aviária. Em outras modalidades, a proteína M pode ser derivada de uma cepa do Vírus da Doença de Newcastle (NDV).

Em modalidades adicionais, a VLP inclui ainda a glicoproteína G do RSV. Em uma outra modalidade, a VLP compreende ainda a glicoproteína SH do RSV. Ainda em outra modalidade, a VLP compreende a proteína N do nucleocapsideo de RSV.

As proteínas F de RSV modificadas ou mutadas podem ser utilizadas para a prevenção e/ou tratamento de infecção por RSV. Assim, em outro aspecto, a invenção fornece um método para a indução de uma resposta imune contra o RSV. O método envolve a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição contendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada a um sujeito, tal como um sujeito humano ou animal.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece composições de vacina farmaceuticamente aceitáveis compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada.

Em uma modalidade, a invenção compreende uma formulação imunogênica compreendendo ao menos uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção compreende uma formulação imunogênica compreendendo ao menos uma dose eficaz de uma micela de F do RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Ainda em outra modalidade, a invenção compreende uma formulação imunogênica compreendendo ao menos uma dose eficaz de uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada.

Em outra modalidade, a invenção fornece um pacote ou kit farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes com um ou mais dos ingredientes das formulações de vacina da invenção.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de formulação de uma vacina ou composição antigênica que induz a imunidade a uma infecção ou ao menos um sintoma de doença dessa a um mamífero, compreendendo a adição à formulação de uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade preferida, a infecção é uma infecção por RSV.

As proteínas F do RSV modificadas ou mutadas da invenção são úteis para o preparo de composições que estimulam uma resposta imune que confere imunidade ou imunidade substancial a agentes infecciosos. Assim, em uma modalidade, a invenção fornece um método de indução de imunidade a infecções ou ao menos um sintoma de doença dessas em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método de indução de imunidade substancial de infecções pelo vírus RSV ou ao menos um sintoma de doença dessas em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada.

As composições da invenção podem induzir uma imunidade substancial em um vertebrado (e.g., um humano) quando administradas aos vertebrados. Assim, em uma modalidade, a invenção fornece um método de indução de imunidade substancial de infecções pelo vírus RSV ou ao menos um sintoma de doença dessas em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de vacinação de um mamífero contra RSV compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade indutora de proteção de uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada.

Em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta de anticorpo protetora a uma infecção ou ao menos um sintoma dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada.

Em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta celular protetora a uma infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta celular protetora a uma infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma micela de F do RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Ainda em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta celular protetora a uma infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma VLP, em que a VLP compreende uma proteina F do RSV modificada ou mutada.

Em outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucléico isolado que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção. Em uma modalidade exemplar, o ácido nucléico isolado que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece uma célula isolada compreendendo um ácido nucléico que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção. Em uma modalidade exemplar, o ácido nucléico isolado que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucléico que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção. Em uma modalidade exemplar, o ácido nucléico isolado que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, o vetor é um vetor baculovirus.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de fabricação de uma proteina F de RSV, compreendendo (a) a transformação de uma célula hospedeira para expressar um ácido nucléico que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção; e (b) o cultivo da referida célula hospedeira em condições propicias para a produção da referida proteina F de RSV. Em uma modalidade, o ácido nucléico que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de inseto. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é uma é uma célula de inseto transfectada com um vetor baculovirus compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção.

Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método de fabricação de uma micela de proteina F de RSV, compreendendo (a) a transformação de uma célula hospedeira para expressar um ácido nucléico que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção; e (b) o cultivo da referida célula hospedeira em condições propicias para a produção da referida micela da proteina F de RSV. Em uma modalidade , o ácido nucléico que codifica uma proteina F do RSV modificada ou mutada é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de inseto. Em uma modalidade exemplar, a célula hospedeira é uma é uma célula de inseto transfectada com um vetor baculovirus compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a estrutura da proteina F do HRSV do tipo selvagem.

A Figura 2 mostra as estruturas de proteínas F do RSV modificadas ou mutadas com mutações no sítio de divagem conforme descrito no Exemplo 3.

A Figura 3 mostra substituições conservadoras (R133Q, R135Q e R136Q) no sítio primário de divagem de proteínas F de HRSV modificadas BV #541 (SEQ ID NO: 6).

A Figura 4 mostra a sequência e a estrutura da proteína F de HRSV modificada BV #541 (SEQ ID NO: 6).

A Figura 5 mostra a sequência e a estrutura da proteína F de HRSV modificada BV #622 (SEQ ID NO: 10).

A Figura 6 mostra gel de SDS-PAGE corado por Coomassie da proteína F recombinante purificada de HRSV BV #622 com ou sem a presença de βME.

A Figura 7 mostra a estrutura da proteína F de HRSV modificada BV #683 (SEQ ID NO: 8).

A Figura 8 mostra géis de SDS-PAGE corados por Coomassie das proteínas F recombinantes purificadas de HRSV BV #622 e BV #683 com ou sem a presença de βME (à esquerda), e seus estruturas.

A Figura 9 mostra o gel de SDS-PAGE corado por Coomassie (à esquerda) e a análise Western Blot (à direita) da proteína F recombinante purificada de HRSV BV #683 com ou sem a presença de βME.

A Figura 10 mostra o gel de SDS-PAGE corado por Coomassie utilizado na análise de pureza por densitometria de varredura (à esquerda) e Western Blot (à direita) da proteína F recombinante purificada de HRSV BV #683.

A Figura 11 mostra imagens de micelas da proteína F recombinante purificada de HRSV BV #683 micelas (rosetas), tiradas em microscopia eletrônica de coloração negativa.

A Figura 12 descreve a análise de tamanho de partícula das micelas da proteina F de HRSV BV #683.

A Figura 13 mostra o gel de SDS-PAGE corado por Coomassie (à esquerda) e análise Western Blot (à direita) das proteínas F de HRSV modificadas BV #622 e BV #623 (SEQ ID NO: 21), com ou sem a co-expressão com as proteínas N de HRSV e M de BRSV nas colheitas de cultura celular brutas (intracelulares) ou amostras peletizadas por separação em gradiente de sacarose de 30%, e as estruturas da BV #622 e BV #623.

A Figura 14 mostra o gel de SDS-PAGE corado por Coomassie (à esquerda) e a análise Western Blot (à direita) da proteína F modificada de HRSV BV #622, das quiméricas de tandem duplo BV #636 (BV #541 + BRSV M) , BV #683, BV #684 (BV #541 com domínio L YIAL) e BV # 685 (BV # 541 com domínio L YKKL) com ou sem a co- expressão com as proteínas N de HRSV e M de BRSV nas amostras de colheitas de cultura celular brutas (intracelulares), e a estrutura de cada proteína F modificada de HRSV analisada.

A Figura 15 mostra o gel de SDS-PAGE corado por Coomassie (à esquerda) e análise Western Blot (à direita) da proteína F de RSV modificada BV #622 (SEQ ID NO: 10), das quiméricas de tandem duplo BV #636 (BV #541 +BRSV M) , BV #683 (SEQ ID NO: 8), BV #684 (BV #541 com domínio L YIAL), e BV #685 (BV #541 com domínio L YKKL) , com ou sem a co-expressão com as proteínas N de HRSV e M de BRSV nas amostras peletizadas por separação em gradiente de sacarose de 30%, e estrutura de cada proteína F modificada de HRSV analisada.

A Figura 16 mostra a estrutura, o nome de clone, descrição, resultados de Western Blot Coomassie de SDS- PAGE, e a conclusão para cada proteina F modificada de RSV, conforme descrito no Exemplo 9.

A Figura 17 descreve os procedimentos experimentais do estudo do RSV desafio, conforme descrito no Exemplo 10.

A Figura 18 mostra os resultados do ensaio de neutralização de RSV no dia 31 e dia 4 6 de camundongos imunizados com PBS, RSV vivo, FI-RSV, 1 ug de PFP, 1 ug de PEP + Alum, 10 ug de PFP, 10 ug de PEP + Alum, 30 ug de PFP, e o controle positivo (ovelha anti-F).

A Figura 19 mostra os titulos de RSV em tecidos pulmonares de camundongos imunizados com PBS, RSV vivo, FI- RSV, 1 ug de PFP, 1 ug de PFP + Alum, 10 ug de PFP, 10 ug de PFP + Alum, e 30 ug PFP, 4 dias após o desafio do RSV infeccioso.

A Figura 20 mostra o gel de SDS-PAGE corado com Coomassie de proteina F recombinante purificada de RSV BV #683 armazenado a 2-8°C por 0, 1, 2, 4 e 5 semanas.

A Figura 21 mostra as respostas de anticorpos A de RSV e B de RSV neutralizantes após a imunização com RSV vivo (RSV), RSV inativado por formalina (FI-RSV), proteina F de RSV BV #683 com e sem aluminio (PFP e PFP + adjuvante de aluminio), e controles PBS.

A Figura 22 mostra patologia do pulmão após o desafio com RSV em ratos imunizados com RSV vivo, RSV inativado por formalina (FI-RSV), proteina F de RSV BV #683 com e sem aluminio (micela de F (30 ug) e micela de F (30ug) + adjuvante de aluminio), e controles PBS.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

Conforme aqui utilizado, o "adjuvante"refere-se a um composto que, quando utilizado em combinação com um imunógeno especifico (e.g., proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada) em uma formulação, aumentará ou, do contrário, alterará ou modificará a resposta imune resultante. A modificação da resposta imune inclui a intensificação ou ampliação da especificidade de um dos dois, ou ambos, anticorpo e respostas celulares imunes. A modificação da resposta imune também pode significar a diminuição ou a supressão de certas respostas imunes de antígenos específicos.

Conforme aqui utilizado, o termo "formulação antigênica" ou "composição antigênica" refere-se a uma preparação que, quando administrada a animais vertebrados, especialmente um pássaro ou um mamífero, induzirá uma resposta imune.

Conforme aqui utilizado, o termo "virus da influenza aviária" refere-se a virus da influenza encontrados principalmente em aves, mas que também podem infectar os seres humanos ou outros animais. Em algumas instâncias, os virus da influenza aviária podem ser transmitidos ou propagados de um humano para outro. Um virus da influenza aviária que infecta os seres humanos apresenta o potencial para provocar uma pandemia de influenza, i.e., a morbidade e/ou mortalidade em humanos. Uma pandemia ocorre quando uma nova cepa do virus da influenza (um virus no qual os humanos não possuem imunidade natural) emerge, espalhando- se além de localidades individuais, possivelmente em todo o mundo, e infectando vários seres humanos de uma só vez.

Conforme aqui utilizado, uma "dose eficaz" geralmente se refere à quantidade de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção suficiente para a indução de imunidade, para a prevenção e/ou melhora de uma infecção ou para a redução de ao menos um sintoma de uma infecção ou doença, e/ou para o aumento da eficácia de outra dose de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, de uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou de uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Uma dose eficaz pode se referir à quantidade de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada suficiente para o retardo ou diminuição dos primeiros sintomas de uma infecção ou doença. Uma dose eficaz também pode se referir à quantidade de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada que apresenta um beneficio terapêutico no tratamento ou manejo de uma infecção ou doença. Ademais, uma dose eficaz é a quantidade relativa a uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção, sozinha, ou combinada com outras terapias, que apresenta um beneficio terapêutico no tratamento ou manejo de uma infecção ou doença. Uma dose eficaz também pode ser a quantidade suficiente para o aumento de uma resposta imunológica própria do sujeito (e.g., de humano) contra uma exposição subsequente a um agente infeccioso ou doença. Os niveis de imunidade podem ser monitorados, e.g., pela medição das quantidades de anticorpos neutralizadores secretores e/do soro, e.g., por ensaios de neutralização em placa, de fixação de complemento, imunoabsorvente ligado à enzima, ou de microneutralização, ou pela medição das respostas celulares, tais como, entre outras, as células T citotóxicas, células apresentadoras de antígenos, as células T auxiliadoras, células dendríticas e/ou outras respostas celulares. As respostas de células T podem ser monitoradas, e.g., medindo, por exemplo, a quantidade de células CD4+ e CD8+ presentes, utilizando marcadores específicos por ensaios de citometria de fluxo fluorescente ou de células T, tais como, entre outros, o ensaio de proliferação de células T, ensaio citotóxico de células T, ensaio TETRAMER, e/ou ensaio ELISPOT. No caso de uma vacina, uma "dose eficaz" é aquela que previne a doença e/ou reduz a gravidade dos sintomas.

Conforme aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de uma proteina F de RSV modificada ou mutada, um RSV F micela compreendendo um modificadas ou mutantes RSV F proteina, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, necessária ou suficiente para a realização de um efeito biológico desejado. Uma quantidade eficaz da composição seria a quantidade que alcança um resultado selecionado, e essa quantidade poderia ser determinada por uma questão de experimentação de rotina por um técnico no assunto. Por exemplo, uma quantidade eficaz para a prevenção, tratamento e/ou melhora de uma infecção poderia ser que quantidade necessária para provocar a ativação do sistema imunológico, resultando no desenvolvimento de uma resposta imune de antigeno especifica em consequência à exposição a uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção. O termo também é sinônimo de "quantidade suficiente".

Conforme aqui utilizado, o termo "expressão" refere- se ao processo pelo qual os ácidos polinucleicos são transcritos em mRNA e traduzidos em peptideos, polipeptídeos ou proteínas. Se o ácido polinucleico é derivado de um DNA genômico, a expressão pode, se uma célula hospedeira eucariótica apropriada ou organismo for selecionado, incluir a emenda do mRNA. No contexto da presente invenção, o termo também abrange o rendimento do mRNA do gene F do RSV e proteínas F do RSV alcançado após a expressão desses.

Conforme utilizado aqui, o termo "proteina F" ou "proteina de fusão" ou "polipeptideo da proteina F" ou "polipeptideo da proteina de fusão" refere-se a um polipeptideo ou uma proteina que possuem toda, ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptideo de proteina de fusão do RSV. Da mesma maneira, o termo "proteina G" ou "polipeptideo da proteina G" refere-se a um polipeptideo ou uma proteina que possui toda, ou parte de uma sequência de aminoácidos de um polipeptideo da proteina de fixação de RSV. Várias proteinas de Fixação e Fusão de RSV foram descritas e são conhecidas pelos técnicos no assunto. O WO/2008/114149, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, define as variantes exemplares das proteinas F e G (por exemplo, variantes de ocorrência natural).

Conforme aqui utilizados, os termos "imunógenos" ou "antigenos" referem-se a substâncias tais como proteinas, peptideos, ácidos nucléicos, que são capazes de induzir uma resposta imune, limbos os termos também englobam epitopos, e são utilizados intercambiavelmente.

Conforme utilizado aqui, o termo "estimulador imunológico" refere-se a um composto que aumenta a resposta imune através de mensageiros quimicos do próprio corpo (citocinas). Essas moléculas compreendem várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividades imunoestimuladoras, imunopotenciadoras e pró-inflamatórias, tais como interferons (IFN-y), interleucinas (e.g., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL -12, IL-13); fatores de crescimento (e.g., fator estimulante de colônia (CSF) de macrófagos Granulócitos (GM)); e outras moléculas imunoestimulantes, tais como o fator inflamatório de macrófagos, ligante Flt3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas imunoestimulantes são passíveis de administração na mesma formulação que as VLPs da invenção, ou podem ser administrada separadamente. A proteina ou um vetor de expressão que codifica a proteina podem ser administrados para a produção de um efeito imunoestimulante.

Conforme aqui utilizado, o termo "formulação imunogênica" refere-se a uma preparação que, quando administrada a animais vertebrados, e.g., um mamífero, induzirá uma resposta imune.

Conforme aqui utilizado, o "agente infeccioso" refere-se a microrganismos que provocam uma infecção em um vertebrado. Normalmente, os organismos são virus, bactérias, parasitas, protozoários e/ou fungos.

Conforme aqui utilizados, os termos "mutante", "modificado", "mutação", ou "modificação" indicam qualquer modificação de um ácido nucléico e/ou polipeptídeo que resulta em um ácido nucléico ou polipeptídeo alterado. As mutações incluem, por exemplo, mutações pontuais, deleções ou inserções de resíduos únicos ou múltiplos em um polinucleotídeo, que inclui alterações que surgem dentro de uma região codificadora da proteina de um gene, bem como alterações em regiões fora de uma sequência codificadora de proteina, tais como, entre outras, as sequências reguladoras ou promotoras. Uma alteração genética pode ser uma mutação de qualquer tipo. Por exemplo, a mutação pode constituir uma mutação de ponto, uma mutação por deslocamento do quadro de leitura, uma inserção ou uma deleção de parte ou da totalidade de um gene. Em algumas modalidades, as mutações são de ocorrência natural. Em outras modalidades, as mutações são os resultados da pressão de mutação artificial. Ainda em outras modalidades, as mutações nas proteínas F de RSV são o resultado da modificação genética.

Conforme utilizado aqui, o termo "multivalente" refere-se a composições que possuem uma ou mais proteínas antigênicas/peptideos ou imunógenos contra múltiplos tipos ou cepas de agentes infecciosos ou doenças.

Conforme aqui utilizado, o termo "vacina farmaceuticamente aceitável" refere-se a uma formulação que contém uma proteina F do RSV modificada ou mutada, e uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da presente invenção, que é uma forma passivel de administração a um vertebrado, e que induz uma resposta imunológica suficiente para a indução de imunidade, para a prevenção e/ou melhora de uma infecção ou doença, e/ou para a redução de ao menos um sintoma de uma infecção ou doença, e/ou para o aumento da eficácia de outra dose de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, de uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou de uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Normalmente, a vacina compreende um meio convencional de solução aquosa salina ou tamponada no qual a composição da presente invenção é suspensa ou dissolvida. Nessa forma, a composição da presente invenção pode ser utilizada convenientemente para a prevenção, melhora, ou, caso contrário, para o tratamento de uma infecção. Após a introdução em um hospedeiro, a vacina é capaz de provocar uma resposta imune, incluindo, entre outras, a produção de anticorpos e/ou citocinas e/ou a ativação de células T citotóxicas, células apresentadoras de antígenos, células T auxiliadoras, células dendriticas e/ou outras respostas celulares.

Conforme utilizado aqui, a expressão "resposta imune protetora" ou "resposta protetora" refere-se a uma resposta imune mediada por anticorpos contra um agente infeccioso ou doença, que é exibida por um vertebrado (e.g., um humano), que previne ou melhora uma infecção ou reduz ao menos um sintoma de doença do mesmo. As proteinas F do RSV modificadas ou mutadas, as micelas de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou as VLPs compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção podem estimular a produção de anticorpos que, por exemplo, neutralizam os agentes infecciosos, bloqueiam a entrada dos agentes infecciosos nas células, bloqueiam a replicação de agentes infecciosos e/ou protegem as células do hospedeiro contra a infecção e destruição. O termo também pode se referir a uma resposta imune que é mediada por linfócitos T e/ou outras células brancas do sangue contra um agente infeccioso ou doença, exibida por um vertebrado (e.g., um ser humano), que previne ou melhora a infecção ou a doença, ou reduz ao menos um sintoma dessa.

Conforme aqui utilizado, o termo "vertebrado" ou "sujeito" ou "paciente" se refere a qualquer membro da cordata subfile, incluindo, sem limitação, os seres humanos e outros primatas, incluindo os primatas não-humanos, tais como os chimpanzés e outros simios e espécies de macacos. Os animais de fazenda, tais como bovinos, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos, tais como cães e gatos; animais de laboratório, incluindo os roedores, tais como camundongos, ratos (incluindo ratos-de-algodão) e porcos da guiné; aves, incluindo as aves domésticas, selvagens e de caça, tais como as galinhas, os perus e outros pássaros galináceos, patos, gansos, e similares são também exemplos não-limitativos. Os termos "mamíferos" e "animais" estão incluídos nessa definição. Os indivíduos adultos e recém-nascidos são objeto de abrangência. Em particular, infantes e crianças jovens são sujeitos ou pacientes apropriados para uma vacina contra o RSV.

Conforme aqui utilizado, o termo "partícula semelhante ao virus"(VLP) refere-se a uma estrutura que em ao menos um atributo se assemelha a um virus, mas que não foi demonstrado ser contagiante. As partículas semelhantes a um virus de acordo com a invenção não carregam informação genética que codifica para as proteínas das partículas semelhantes a um virus. Em geral, as partículas semelhantes a um virus apresentam a ausência de um genoma virai e, portanto, não são infecciosas. Além disso, as partículas semelhantes a um virus podem, muitas vezes, ser produzidas em grandes quantidades por expressão heteróloga e podem ser facilmente purificadas.

Conforme aqui utilizado, o termo "VLP quimérica"refere-se à VLPs que contêm proteínas, ou partes dessas, de ao menos dois agentes infecciosos diferentes (proteínas heterólogas). Normalmente, uma das proteínas é derivada de um virus que pode levar à formação de VLPs a partir de células hospedeiras. Os Exemplos, para fins ilustrativos, são a proteina M de BRSV e/ou o proteínas G ou F do HRSV. Os termos VLPs de RSV e VLPs quiméricas podem ser utilizados como sinônimos, quando cabivel.

Conforme aqui utilizado, o termo "vacina" refere-se a uma preparação de patógenos mortos ou enfraquecidos, ou de determinantes antigênicos derivados, que é utilizada para a indução de formação de anticorpos ou imunidade contra o patógeno. A vacina é fornecida a fim de proporcionar imunidade à doença, por exemplo, a influenza, que é provocada pelos virus da influenza. Além disso, o termo "vacina" também se refere a uma suspensão ou solução de um imunógeno (e.g., proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada) que é administrada a um vertebrado para a produção de imunidade protetora, í.e., a imunidade que previne ou reduz a gravidade da doença associada à infecção. A presente invenção proporciona composições de vacina que são imunogênicas e podem fornecer proteção contra uma doença associada à infecção.

Proteínas F do RSV

Duas proteínas estruturais da membrana, as proteínas F e G, são expressas na superfície do RSV, e foram mostradas como sendo alvos de anticorpos neutralizantes (Sullender, W., 2000, Clinical Microbiology Review13, 1- 15). Essas duas proteínas também são as principais responsáveis pelo reconhecimento virai e a entrada em células-alvo; a proteína G se liga a um receptor celular específico e a proteína F promove a fusão do vírus com a célula. A proteína F também é expressa na superfície das células infectadas e é responsável pela subsequente fusão com outras células, levando à formação de sincícios. Assim, os anticorpos para a proteína F podem neutralizar o vírus ou bloquear a entrada do vírus na célula ou prevenir a formação de sincicios. Embora as diferenças antigênicas e estruturais entre os subtipos A e B tenham sido descritas tanto para as proteínas G quanto para as proteínas F, as diferenças antigênicas mais significativas residem na proteína G, onde sequências de aminoácidos são apenas 53% homólogas e relacionamento antigênico é de 5% (Walsh et al. (1987) J. Infect. Dis. 155, 1198-1204; e Johnson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,5625 - 5629) . Por outro lado, os anticorpos produzidos para a proteína F mostram um alto grau de reatividade cruzada entre os vírus do subtipo A e B.

A proteína F do RSV visa à penetração do RSV pela fusão entre a proteína de envelope do vírion e a membrana plasmática da célula hospedeira. Depois da infecção, a proteína F expressada na superfície celular pode mediar a fusão com as células vizinhas para a formação de sincicios. A proteína F é uma proteína de superfície da transmembrana do tipo I que possui um peptídeo sinal clivado na região N- terminal e uma âncora de membrana perto do terminal C. A F do RSV é sintetizada como um precursor Fo inativo que se associa para um homotrímero e é ativada por clivagem no complexo trans-Golgi por uma endoprotease celular para o rendimento de duas subunidades ligadas ao dissulfeto, as subunidades Fi e F2. O terminal N da subunidade Fi que é criado por clivagem contém um domínio hidrofóbico (o peptídeo de fusão) que insere diretamente na membrana-alvo a fim de iniciar a fusão. A subunidade Fi também contém repetições heptad que se associam durante a fusão, conduzindo uma mudança conformacional que faz com que as membranas viral e celular fiquem bem próximas (Collins and Crowe, 2007, Fields Virology, 5th ed., D.M Kipe et al., Lipincott, Williams and Wilkons, p. 1604). A SEQ ID NO: 2 (n° de acesso ao GenBank . AAB59858) descreve uma proteina F de RSV representativa, que é codificada pelo gene mostrado na SEQ ID NO: 1 (n° de acesso ao GenBank M11486).

Na natureza, a proteina F do RSV é expressa como um precursor único do polipeptídeo, 574 aminoácidos no comprimento, designado FO . In vivo, o FO oligomeriza no reticulo endoplasmático e é processado proteoliticamente por uma protease furina em duas sequências conservadas de consenso de furina (sitios de clivagem de furina), RARR (SEQ ID NO: 23) (secundária) e KKRKRR (SEQ ID NO: 24) (primária) para a geração de um oligômero que consiste em dois fragmentos ligados ao dissulfeto.

O menor desses fragmentos é denominado F2 e se origina a partir da porção N-terminal do precursor FO. Será reconhecido pelo técnico no assunto que as abreviações FO, F1 e F2 são comumente designadas Fo, Fi e F2 na literatura cientifica. Quanto maior, o fragmento Fl do terminal C ancora a proteina F na membrana através de uma sequência de aminoácidos hidrofóbicos, que são adjacentes a uma cauda citoplasmática do aminoácido 24. Três F2-F1 dimeros se associam para a formação de uma proteina F madura, que adota uma conformação prefusogênica metaestável ("pré- fusão") que é acionada para sofrer uma mudança conformacional pelo contato com uma membrana da célula- alvo. Essa mudança conformacional expõe uma sequência hidrofóbica, conhecida como o peptideo de fusão, que se associa com a membrana da célula hospedeira e promove a fusão da membrana do vírus, ou uma célula infectada, com a membrana da célula-alvo.

O fragmento F1 contém ao menos dois domínios de repetições heptad, designados e HRA HRB, e está situado na proximidade do peptídeo de fusão e dos domínios da âncora da transmembrana, respectivamente. Na conformação de pré- fusão, o dímero F2-F1 forma uma cabeça globular e uma estrutura de cauda (stalk),em que os domínios HRA estão em uma conformação (estendida) segmentada na cabeça globular. Em contraste, os domínios HRB formam uma cauda (stalk) de "coiled-coil" de três fitas que se estende desde a região da cabeça. Durante a transição da conformação de pré-fusão à conformação de pós-fusão, os domínios HRA entram em colapso e são trazidos para perto dos domínios HRB para a formação de um pacote de seis hélices antiparalelas. No estado de pós-fusão, os domínios dos peptídeos de fusão e da transmembrana são justapostos a fim de facilitar a fusão da membrana.

Embora a descrição conformacional fornecida acima tenha por base a modelagem molecular de dados cristalográficos, as distinções estruturais entre as conformações de pré-fusão e pós-fusão podem ser monitoradas sem recorrer à cristalografia. Por exemplo, a micrografia eletrônica pode ser utilizada para distinguir as conformações de pré-fusão e pós-fusão (alternativamente designadas prefusogênica e fusogênica), conforme demonstrado por Calder et al, Virology,271:122-131 (2000) e Morton et al, Virology,311:275-288, que são incorporados por referência para fins de seus ensinamentos tecnológicos. A conformação de pré-fusão também pode ser distinguida da conformação fusogênica (pós-fusão) por ensaios de associação de lipossomas, conforme descrito por Connolly et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 103:17903-17908 (2006), que também é aqui incorporado por referência para fins de seus ensinamentos tecnológicos. Além disso, as conformações pré- fusão e fusogênicas podem ser distinguidas através do uso de anticorpos (e.g., anticorpos monoclonais) que reconhecem especificamente epitopos de conformação presentes na forma de pré-fusão ou fusogênica da proteina F do RSV, mas não em outra forma. Tais epitopos de conformação podem ocorrer devido à exposição preferencial de um determinante antigênico na superfície da molécula. Alternativamente, os epitopos conformacionais podem surgir a partir da justaposição de aminoácidos que são não-contiguos na polipeptideo linear.

Proteinas F do RSV Modificadas ou Mutadas

Os presentes inventores descobriram que, surpreendentemente, os altos niveis de expressão da proteina de fusão (F) podem ser alcançados quando certas modificações são realizadas na estrutura da proteina F do RSV. Tais modificações também, inesperadamente, reduzem a toxicidade celular da proteina F do RSV em uma célula hospedeira. Além disso, as proteinas F modificadas da presente invenção demonstram uma capacidade melhorada de exibição da morfologia de "pirulito"de pós-fusão, ao contrário da morfologia de "haste" da pré-fusão. Assim, em um aspecto, as proteinas F modificadas da presente invenção também podem apresentar uma imunogenicidade melhorada (e.g., aumentada,) em comparação às proteinas F do tipo selvagem (e.g., exemplificado pela SEQ ID NO: 2, que corresponde ao n° de acesso ao GenBank AAB59858). Essas modificações possuem aplicações significativas para o desenvolvimento de vacinas e métodos de utilização dessas vacinas para o tratamento e/ou prevenção de RSV.

De acordo com a invenção, qualquer número de mutações pode ser realizado para as proteínas F do RSV do tipo selvagem ou nativas, e, em um aspecto preferido, múltiplas mutações podem ser realizadas a fim de resultar em expressão melhorada e/ou propriedades imunogênicas, em comparação às proteínas F do RSV nativas ou do tipo selvagem. Tais mutações incluem mutações de ponto, mutações por deslocamento do quadro de leitura, e inserções, sendo uma ou mais (por exemplo, uma, duas, três, ou quatro, etc.) mutações o preferido.

O polipeptídeo da proteina F nativa pode ser selecionado a partir de qualquer proteina F de uma cepa A de RSV, cepa B de RSV, cepa B de HRSV, cepa de HRSV, cepa de RSV aviária, ou de suas variantes (conforme acima definido). Em certas modalidades exemplares, o polipeptídeo da proteina F nativa é a proteina F representada pela SEQ ID NO: 2 (n° de acesso GenBank AAB59858). A fim de facilitar a compreensão desta divulgação, todas as posições de resíduos de aminoácidos, independentemente de cepa, são dadas com relação (isto é, a posição dos resíduos de aminoácidos corresponde a) à posição de aminoácidos da proteina F exemplar. As posições de aminoácidos comparáveis da proteina F de outras cepas de RSV podem ser determinadas facilmente pelos técnicos no assunto, através do alinhamento das sequências de aminoácidos da cepa de RSV selecionada com a da sequência exemplar utilizando algoritmos de alinhamento prontamente disponíveis e bem conhecidos (tais como BLAST, e.g., utilizando parâmetros- padrão) . Numerosos exemplos adicionais de polipeptídeos de proteina F de diferentes cepas de RSV são divulgados no WO/2008/114149 (que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). As variantes adicionais podem surgir através de deriva genética, ou podem ser produzidas artificialmente utilizando mutagênese aleatória ou sitio- direcionada, ou por recombinação de duas ou mais variantes pré-existentes. Tais variantes adicionais também são adequadas no contexto das proteínas F de RSV modificadas ou mutadas aqui reveladas.

As mutações podem ser introduzidas nas proteínas

F de RSV da presente invenção utilizando qualquer metodologia conhecida pelos técnicos no assunto. As mutações podem ser introduzidas de forma aleatória, por exemplo, através da realização de uma reação de PCR na presença de manganês como um cofator de ion metálico bivalente. Alternativamente, a mutagênese dirigida por oligonucleotideos pode ser utilizada para a criação das proteínas F de RSV modificadas ou mutadas que permite todas as classes possíveis de mudanças de par de bases em qualquer sitio determinado ao longo da molécula de DNA de codificação. Em geral, essa técnica envolve um anelamento complementar do oligonucleotídeo (exceto por uma ou mais emparelhamentos errados) para uma sequência de nucleotideo de fita única que codifica para a proteina F do RSV de interesse. O oligonucleotídeo com emparelhamento errado é então estendido por polimerase de DNA, gerando uma molécula de DNA de fita dupla que contém a mudança desejada na sequência em uma fita. As mudanças na sequência podem, por exemplo, resultar na deleção, substituição ou inserção de um aminoácido. O polinucleotideo de fita dupla pode ser inserido em um vetor de expressão adequado, e um polipeptideo mutante ou modificado podem ser, assim, produzido. A mutagênese dirigida por oligonucleotideo, descrita acima, pode, por exemplo, ser realizada através de PCR.

Proteinas de RSV Adicionais

A invenção também abrange as partículas semelhantes ao virus de RSV (VLPs) compreendendo uma proteina F de RSV modificada ou mutada, que pode ser formulada em vacinas ou formulações antigênicas para a proteção de vertebrados (e.g., humanos) contra a infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença desse. Em algumas modalidades, a VLP modificada compreendendo uma proteina F de RSV mutada ou modificada compreende proteinas de RSV adicionais, tais como a M, N, G e SH. Em outras modalidades, a VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada ainda compreende proteinas de cepas heterólogas de virus, tais como as proteinas do virus da influenza HA, NA, e Ml. Em uma modalidade, a proteina Ml do virus da influenza é derivada de uma cepa do virus da influenza aviária.

A proteina N de RSV se liga firmemente tanto ao RNA genômico quanto ao RNA anti-genômico intermediário replicativo do para a formação de nucleocapsideo resistente à RNAse. As SEQ ID NOs: 16 (tipo selvagem) e 18 (otimizadas por códon) mostram sequências representativas de aminoácidos da proteina N de RSV, e as SEQ ID NOs: 15 (tipo selvagem) e 17 (otimizadas por códon) mostram sequências representativas de ácidos nucleicos da proteina N de RSV. Abarcadas nesta invenção se encontram as proteínas N do RSV que são ao menos cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95 %, cerca de 96%, cerca de 97 %, cerca de 98% ou cerca de 99% idênticas à SEQ ID NO: 18, e todos os fragmentos e variantes (incluindo as proteínas quiméricas) da mesma.

A proteina M de RSV é uma proteina de virion interna não glicosilada que se acumula na membrana plasmática que interage com a proteina F de RSV e outros fatores durante a morfogênese do virus. Em certas modalidades preferidas, a proteina M de RSV é uma proteina M de RSV bovino(BRSV). As SEQ ID NOs: 12 (tipo selvagem) e 14 (otimizadas por códon) mostram sequências representativas de aminoácidos da proteina M de BRSV, e as SEQ ID NOs: 11 (tipo selvagem) e 13 (otimizadas por códon) mostram sequências representativas de ácidos nucleicos que codificam a proteina M de BRSV. Abarcadas nesta invenção se encontram as proteínas M do RSV (incluindo, entre outros, o BRSV) que são ao menos cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% idênticas às SEQ ID NOs: 12 e 14, e todos os fragmentos e variantes (incluindo as proteínas quiméricas) da mesma.

A proteina G de RSV é uma glicoproteína de transmembrana do tipo II com uma única região hidrofóbica perto da extremidade do N-terminal que serve tanto como um peptideo de sinal não-clivado quanto uma âncora de membrana, deixando dois terços do C-terminal da molécula orientados externamente. A G de RSV também é expressa como uma proteina secretada que surge a partir do inicio translacional no segundo AUG no ORF (em torno do aminoácido 48), que fica dentro do sinal/âncora. A maioria dos ectodominios da G de RSV é altamente divergente entre as cepas de RSV (Id., p. 1607). A SEQ ID NO: 26) descreve uma proteina G de RSV representativa, que é codificada pela sequência de genes mostrada na SEQ ID NO: 25. Abarcadas nesta invenção se encontram as proteínas G do RSV que são ao menos cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% idênticas à SEQ ID NO: 26, e todos os fragmentos e variantes (incluindo as proteínas quiméricas) da mesma.

A proteina SH da RSV é uma proteina da transmembrana do tipo II que contém resíduos do aminoácido 64 (subgrupo A do RSV) ou 65 (subgrupo B do RSV). Alguns estudos sugeriram que a proteina SH do RSV pode desempenhar um papel na fusão virai ou na mudança de permeabilidade da membrana. No entanto, o RSV sem o gene de SH é viável, causar a formação e crescimento de sincicios, assim como o virus do tipo selvagem, indicando que a proteina SH não é necessária para a entrada do virus nas células hospedeiras ou para a formação de sincicios. A proteina SH do RSV demonstrou a capacidade de inibição da sinalização de TNF-α. A SEQ ID NO: 27 mostra uma sequência de aminoácidos representativa da proteina SH do RSV. Abarcadas nesta invenção se encontram as proteínas SH do RSV que são ao menos cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% idênticas à SEQ ID NO: 27, e todos os fragmentos e variantes (incluindo as proteinas quiméricas) da mesma.

Vacinas de RSV

Atualmente, a única abordagem aprovada para a profilaxia da doença por RSV é a imunização passiva. A evidência inicial, que sugere um papel protetor para IgG foi obtida a partir de observações envolvendo anticorpos maternos em furões (Prince, GA, Ph.D. diss., Universidade da Califórnia, Los Angeles, 1975) e humanos (Lambrecht et al, (1976) J. Infect. Dis. 134, 211-217; e Glezen et al. (1981) J. Pediatr. 98,708-715). Hemming et al. (Morell et al. , eds., 1986, Clinical Use of Intravenous

Immunoglobulins, Academic Press, Londres, páginas 285 294), que reconheceu a possivel utilidade de anticorpos de RSV no tratamento ou prevenção de infecção por RSV durante os estudos que envolvem a farmacocinética de uma imunoglobulina intravenosa (IVIG) em recém-nascidos com suspeita de sepses neonatal. Eles observaram que um infante, cujas secreções respiratórias renderam o RSV, recuperou-se rapidamente após a infusão de IVIG. A análise posterior do lote Ide VIG revelou um titulo anormalmente elevado de anticorpo neutralizante de RSV. Esse mesmo grupo de investigadores, então, examinaram a capacidade do soro ou imunoglobulina hiper-imune, enriquecido para o anticorpo neutralizante de RSV, a fim de proteger os ratos- de-algodão e os primatas contra a infecção por RSV (Prince et al. (1985) Virus Res. 3, 193-206; Prince et al. (1990) J. Virol. 64, 3091-3092. Os resultados desses estudos sugerem que o anticorpo neutralizante de RSV, administrado profilaticamente, inibiu a replicação do trato respiratório de RSV em ratos-de-algodão. Quando administrado terapeuticamente, o anticorpo de RSV reduziu a replicação virai pulmonar, tanto em ratos-de-algodão quanto em um modelo primata não humano. Ademais, a infusão passiva de soro imune ou imunoglobulina imune não produziu uma patologia pulmonar aumentada em ratos-de-algodão, subsequentemente desafiados com RSV.

Uma vez que a infecção por VSR pode ser prevenida através de anticorpos neutralizantes para um vertebrado, uma vacina compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada pode induzir, quando administrada a um vertebrado, anticorpos neutralizantes in vivo. As proteínas F de RSV modificadas ou mutadas são favoravelmente utilizadas para a prevenção e/ou tratamento de infecção por RSV. Assim, outro aspecto desta divulgação diz respeito a um método para a indução de uma resposta imune contra o RSV. O método envolve a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição contendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada a um sujeito (tal como um sujeito humano ou animal) . A administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da composição induz uma resposta imune especifica para os epitopos presentes na proteina F do RSV modificada ou mutada. Tal resposta imune pode incluir respostas de células B (e.g., a produção de anticorpos neutralizantes) e/ou respostas de células T (e.g., a produção de citocinas). Preferivelmente, a resposta imune induzida pela proteina F do RSV modificada ou mutada inclui elementos que são específicos para ao menos um epitopo conformacional presentes na proteina F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade, a resposta imune é especifica para um epitopo presente em uma proteina F de RSV encontrada no estado ativo de pós-fusão "pirulito". As proteínas F de RSV e as composições podem ser administradas a um sujeito, sem o aumento da doença virai após o contato com o RSV. Preferivelmente, as proteínas F do RSV modificadas ou mutadas divulgadas neste documento as composições imunogênicas adequadamente formuladas suscitam uma resposta imune tendenciosa de Thl, que reduz ou impede a infecção com um RSV e/ou reduz ou impede uma resposta patológica após a infecção com um RSV.

Em uma modalidade, as proteínas F de RSV da presente invenção são encontradas na forma de micelas (e.g., rosetas). As micelas passíveis de obtenção de acordo com a invenção consistem em agregados das proteinas-espiga F imunogenicamente ativas dotadas de uma estrutura semelhante a uma roseta. As rosetas são visíveis no microscópio eletrônico (Calder et al. , 2000, Virology271: 122- 131) . Preferivelmente, as micelas da presente invenção que compreendem proteínas F de RSV modificadas ou mutadas exibem a morfologia de "pirulito"indicativa do estado ativo de pós-fusão. Em uma modalidade, as micelas são purificadas após a expressão em uma célula hospedeira. Quando administradas a um sujeito, as micelas da presente invenção preferivelmente induzem os anticorpos neutralizantes. Em algumas modalidades, as micelas podem ser administradas com um adjuvante. Em outras modalidades, as micelas podem ser administradas sem um adjuvante.

Em outra modalidade, invenção abrange as partículas semelhantes ao virus de RSV (VLPs) compreendendo uma proteina F de RSV modificada ou mutada, que pode ser formulada em vacinas ou formulações antigênicas para a proteção de vertebrados (e.g., humanos) contra a infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença desse. A presente invenção também se refere a VLPs de RSV e vetores que compreendem genes de RSV mutados e do tipo selvagem ou uma combinação desses, derivada de diferentes cepas do virus RSV, que, quando transfectados para células hospedeiras, produzirão partículas semelhantes ao virus (VLPs) compreendendo as proteinas de RSV.

Em algumas modalidades, as partículas semelhantes ao virus RSV podem ainda incluir ao menos uma proteina da matriz virai (e.g., uma proteina M de RSV). Em uma modalidade, a proteina M é derivada de uma cepa humana do RSV. Em outra modalidade, a proteina M é derivada de uma cepa bovina do RSV. Em outras modalidades, a proteina matriz pode ser uma proteina Ml de uma cepa do virus da influenza. Em uma modalidade, a cepa de virus da influenza é uma cepa do virus da influenza aviária. Em uma modalidade preferida, a cepa de influenza aviária é a cepa A/Indonesia/5/05 de H5N1. Em outras modalidades, a proteina da matriz pode ser do Virus da Doença de Newcastle (NDV).

Em algumas modalidades, as VLPs podem ainda compreender uma proteina G de RSV. Em uma modalidade, a proteina G pode ser do grupo A do HRSV. Em uma outra modalidade, a proteina G pode ser do grupo do B do HRSV. Ainda em outra modalidade, a G de RSV pode ser derivada do grupo A e/ou grupo B do HRSV.

Em algumas modalidades, as VLPs podem ainda compreender uma proteina SH de RSV. Em uma modalidade, a proteina SH pode ser do grupo A do HRSV. Em uma outra modalidade, a proteina SH pode ser do grupo do B do HRSV. Ainda em outra modalidade, a SH de RSV pode ser derivada do grupo A e/ou grupo B do HRSV.

Em algumas modalidades, as VLPs podem ainda compreender uma proteina N de RSV. Em uma modalidade, a proteina N pode ser do grupo A do HRSV. Em uma outra modalidade, a proteina N pode ser do grupo do B do HRSV. Ainda em outra modalidade, a N de RSV pode ser derivada do grupo A e/ou grupo B do HRSV.

Em modalidades adicionais, as VLPs da invenção podem compreender um ou mais imunógenos heterólogos, tais como a hemaglutinina (HA) e/ou neuraminidase de influenza (NA).

Em algumas modalidades, a invenção também compreende combinações de diferentes proteínas M, F, N, SH, e/ou G de RSV da mesma cepa e/ou cepas diferentes em uma ou mais VLPs. Ademais, as VLPs podem incluir uma ou mais moléculas adicionais para o aumento de uma resposta imune.

Em outra modalidade da invenção, as VLPs de RSV podem transportar agentes, tais como ácidos nucleicos, siRNA, microRNA, agentes quimioterápicos, agentes de captura de imagem e/ou outros agentes que precisem ser entregues a um paciente.

As VLPs da invenção são úteis para o preparo de vacinas e composições imunogênicas. Uma importante característica da VLP é a capacidade de expressar as proteínas de superfície de interesse, de modo que o sistema imune de um vertebrado induza uma resposta imune contra a proteina de interesse. No entanto, nem todas as proteínas podem ser expressas na superfície das VLPs. Pode haver muitas razões pelas quais certas proteínas não são expressas, ou ser pouco expressas, na superfície das VLPs. Uma razão é que a proteína não é direcionada à membrana de uma célula hospedeira, ou que a proteína não possui um domínio de transmembrana. Como exemplo, as sequências próximas ao terminal carboxila da hemaglutinina de influenza podem ser importantes para incorporação de HA na bicamada lipídica dos nucleocapsídeos envelopados de influenza madura e para a montagem de uma interação dos trímeros de HA com a proteína da matriz Ml da influenza (Ali, et al., (2000) J. Virol. 74, 8709-19).

Assim, uma modalidade da invenção compreende VLPs quiméricas compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada e ao menos um imunógeno que normalmente não é eficiente expressa na superfície celular ou não é uma proteína normal de RSV. Em uma modalidade, a proteína F do RSV modificada ou mutada pode ser fundida a um imunógeno de interesse. Em outra modalidade, a proteína F do RSV modificada ou mutada se associa ao imunógeno através do domínio de transmembrana e uma cauda citoplasmática de uma proteína da membrana de superfície virai heteróloga, e.g., proteína de envelope MMTV.

Outras VLPs quiméricas da invenção compreendem as VLPs que contêm uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina de um agente infeccioso heterólogo. Os exemplos de agente infeccioso heterólogo incluem, entre outros, um virus, uma bactéria, um protozoário, fungos e/ou um parasita. Em uma modalidade, o imunógeno de outro agente infeccioso é uma proteina heteróloga viral. Em outra modalidade, a proteina de um agente infeccioso heterólogo é uma proteina associada ao envelope. Em outra modalidade, a proteina de outro agente infeccioso heterólogo é expressa na superfície das VLPs. Em outra modalidade, a proteina de um agente infeccioso compreende um epitopo que gerará uma resposta imune protetora em um vertebrado. Em uma modalidade, a proteina de outro agente infeccioso é co- expressa com uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a proteina de outro agente infeccioso é fundida a uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, apenas uma parte da proteina de outro agente infeccioso é fundida a uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, apenas uma parte da proteina de outro agente infeccioso é fundida a uma parte da proteina F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a parte da proteina de outro agente infeccioso fundida a uma proteina F do RSV modificada ou mutada é expressa na superfície das VLPs.

A invenção também engloba variantes das proteinas expressas sobre ou dentro das VLPs da invenção. As variantes podem conter alterações nas sequências de aminoácidos das proteinas constituintes. O termo "variante", referente a uma proteina, refere-se a uma sequência de aminoácidos que é alterada por um ou mais aminoácidos relativo a uma sequência de referência. A variante pode apresentar mudanças "conservadoras", em que um aminoácido substituído possui propriedades estruturais ou químicas semelhantes, e.g., a substituição de leucina por isoleucina. Alternativamente, uma variante pode apresentar mudanças "não conservadoras", e.g., a substituição de uma glicina por um triptofano. As variações análogas pequenas também podem incluir a deleção ou a inserção de aminoácidos, ou ambas. As orientações para a determinação de quais residues de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou excluídos sem a eliminação da atividade biológica ou imunológica podem ser encontrados utilizando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, o software DNASTAR.

As variantes naturais podem ocorrer devido às mutações nas proteínas. Essas mutações podem conduzir a uma variabilidade antigênica dentro de grupos individuais de agentes infecciosos, por exemplo, a influenza. Assim, uma pessoa infectada, por exemplo, com uma cepa de influenza, desenvolve anticorpos contra esse virus, e conforme ocorre o aparecimento de cepas de virus mais recentes, os anticorpos contra as cepas mais antigas já não reconhecem o virus mais recente, e uma reinfecção pode ocorrer. A invenção abrange toda a variabilidade antigênica e genética das proteínas de agentes infecciosos para a produção de VLPs .

Os textos gerais que descrevem técnicas da biologia molecular, aplicáveis à presente invenção, tais como a clonagem, a mutação, a cultura celular, entre outras, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning—A Laboratory Manual (3aEd.), Vol. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). Esses textos descrevem a mutagênese, o uso de vetores, promotores e muitos outros temas relevantes relacionados, e.g., às moléculas de mutação e clonagem de F e/ou G do RSV, etc. Assim, a invenção também abarca o uso de métodos conhecidos de tecnologia de DNA de engenharia e recombinante de proteínas a fim de melhorar ou alterar as características das proteínas expressas sobre ou dentro das VLPs da invenção. Vários tipos de mutagênese podem ser utilizados para produzir e/ou isolar os ácidos nucleicos variantes que codificam para as moléculas de proteína e/ou ainda modificam/mutam as proteínas dentro ou sobre as VLPs da invenção. Estão inclusas, entre outras, a mutagênese sítio- dirigida, randômica (aleatória), de recombinação homóloga (DNA shuffling) mutagênese que utiliza modelos contendo uracila, mutagênese direcionada por oligonucleotídeos, mutagênese de DNA modificada por fosforotioato, mutagênese que utiliza DNA de intervalo duplo {duplex gapped DNA) ou similar. Os métodos adequados adicionais incluem o reparo de emparelhamento errado, mutagênese que utiliza as cepas de hospedeiro deficientes em reparo, a restrição-seleção e restrição-purificação, mutagênese de deleção, mutagênese por síntese total de genes, reparo de quebra de fita dupla, entre outros. A mutagênese, e.g., que envolve as construções quiméricas, também está inclusa na presente invenção. Em uma modalidade, a mutagênese pode ser guiada por informações conhecidas da molécula de ocorrência natural ou da molécula de ocorrência natural alterada ou mutada, e.g., sequência, as comparações de sequência, propriedades fisicas, estrutura de cristais ou similares.

A invenção compreende ainda as variantes de proteina que apresentam atividade biológica substancial, e.g., capazes de provocar uma resposta imunológica eficaz quando expressas sobre ou nas VLPs da invenção. Essas variantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições e substituições selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de modo a terem pouco efeito sobre a atividade.

Os métodos de clonagem de proteinas são conhecidos na arte. Por exemplo, o gene que codifica uma proteina especifica do RSV pode ser isolado por RT-PCR do mRNA poliadenilado extraido de células que haviam sido infectadas com um virus RSV. O gene produto resultante pode ser clonado como uma inserção de DNA em um vetor. O termo "vetor" refere-se ao meio pelo qual um ácido nucléico pode ser propagado e/ou transferido entre organismos, células ou componentes celulares. Os vetores incluem plasmideos, virus, bacteriófagos, pró-virus, fagemideos, transposons, cromossomos artificiais, e similares, que se replicam de forma autônoma ou podem integrar em um cromossomo de uma célula hospedeira. Um vetor também pode ser um polinucleotideo de RNA livre, um polinucleotideo de DNA livre, um polinucleotideo composto tanto por DNA quanto RNA dentro da mesma fita, um DNA ou RNA conjugado de polilisina, DNA ou RNA conjugado peptideo, um DNA conjugado de lipossoma, ou similar, que não seja de replicação autônoma. Em muitas, mas não todas, modalidades comuns, os vetores da presente invenção são plasmideos ou bacmideos.

Assim, a invenção compreende nucleotideos que codificam proteínas, inclusive moléculas quiméricas, clonadas em um vetor de expressão que pode ser expresso em uma célula indutora da formação de VLPs da invenção. Um "vetor de expressão" é um vetor, tal como um plasmideo, que é capaz de promover a expressão, bem como a replicação de um ácido nucléico nele incorporado. Normalmente, o ácido nucléico a ser expresso é "operavelmente ligado" a um promotor e/ou potenciador, e é submetido a um controle regulador de transcrição pelo promotor e/ou potenciador. Em uma modalidade, os nucleotideos codificam para uma proteina F de RSV mutada ou modificada (conforme discutido acima). Em outra modalidade, o vetor compreende ainda nucleotideos que codificam as proteínas M e/ou G de RSV. Em outra modalidade, o vetor compreende ainda nucleotideos que codificam as proteínas M e/ou N de RSV. Em outra modalidade, o vetor compreende ainda nucleotideos que codificam as proteínas M, G e/ou N de RSV. Em outra modalidade, o vetor compreende ainda nucleotideos que codificam as proteínas M de BRSV, e/ou proteínas N de RSV. Em outra modalidade, o vetor compreende ainda nucleotideos que codificam as uma proteina M e/ou G de BRSV, ou proteina HÁ e/ou NA da influenza. Em outra modalidade, os nucleotideos codificam uma proteina G de RSV e/ou F de RSV modificada ou mutada com uma proteina NA e/ou HÁ de influenza. Em outra modalidade, o vetor de expressão é um vetor baculovirus.

Em algumas modalidades da invenção, as proteínas podem compreender as mutações que contêm alterações que produzem substituições silenciosas, adições ou deleções, mas não alteram as propriedades ou atividades da proteina codificada ou a maneira como as proteínas são feitas. As variantes de nucleotideos podem ser produzidas por uma variedade de razões, e.g., a fim de otimizar a expressão do códon para um determinado hospedeiro (mudança de códons no mRNA humano para os preferidos por células de inseto, tais como as células Sf9. Veja a publicação patentária US 2005/0118191, aqui incorporada por referência, em sua totalidade, para todos os efeitos.

Além disso, os nucleotideos podem ser sequenciados a fim de garantir que as regiões de codificação corretas foram clonadas e não contêm quaisquer mutações indesejadas. Os nucleotideos podem ser subclonados em um vetor de expressão (e.g.z baculovirus) para a expressão em qualquer célula. A descrição acima é apenas um exemplo de como as proteínas virais de RSV podem ser clonadas. Um técnico no assunto entende que métodos adicionais estão disponíveis e são possíveis.

A invenção também prevê construções e/ou vetores que compreendem os nucleotideos de RSV que codificam para genes estruturais de RSV, incluindo F, M, G, N, SH, ou de partes dessas, e/ou qualquer molécula quimérica descrita acima. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor fago, plasmidial, virai ou retroviral. As construções e/ou vetores que compreendem os genes estruturais de RSV, incluindo F, M, G, N, SH, ou partes desses, e/ou qualquer molécula quimérica descrita acima, devem ser operativamente ligados a um promotor apropriado, tal como um promotor de poliedrina AcMNPV (ou outros baculovirus), promotor PL do fago lambda, promotores lac, phoA e tac de E. colí, promotores precoces e tardios do SV40, e promotores de LTRs retrovirais são exemplos não-limitativos. Outros promotores adequados são de conhecimento de um técnico no assunto, dependendo da célula hospedeira e/ou da taxa de expressão desejada. As construções de expressão ainda conterão sitios para a iniciação da transcrição, terminação, e, na região transcrita, um sitio de ligação de ribossomo para a tradução. A parte de codificação das transcrições expressas por construções incluirá, preferivelmente, um códon de iniciação de tradução no inicio e um códon de terminação apropriadamente posicionado na extremidade do polipeptideo a ser traduzido.

Os vetores de expressão incluirão, preferivelmente, ao menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem resistência à diidrofolato redutase, G418 ou neomicina para cultura de células eucarióticas e genes de resistência à tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultura de E. coli e outras bactérias. Dentre os vetores preferidos, encontram-se os vetores virais, tais como o baculovirus, poxvirus (e.g., virus vacinia, virus avipox, virus canaripox, virus bouba, virus raccoonpox, virus swinepox, etc), adenovirus (e.g., adenovirus canino), herpesvirus, e retrovirus. Outros vetores que podem ser utilizados com a invenção compreendem os vetores para uso em bactérias, que compreendem os vetores pQE70, pQE60 e PQE-9, vetores pBluescript , vetores Phagescript,pNH8A, pNHlôa, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Dentre os vetores eucarióticos preferidos estão pFastBacl pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL.

Outros vetores adequados serão prontamente evidentes para um técnico no assunto. Em uma modalidade, o vetor que compreende os nucleotideos que codificam para genes de RSV, inclusive os genes da proteina F de RSV mutada ou modificada, assim como genes das proteínas M, G, N, SH ou partes dos mesmos, e/ou qualquer molécula quimérica descrita acima, é o pFastBac.

Os construtos recombinantes mencionados acima poderiam ser utilizados para transfectar, infectar, ou transformar, e podem expressar as proteínas RSV, inclusive uma proteina F de RSV modificada ou mutada e ao menos um imunógeno. Em uma modalidade, a construção recombinante compreende F, M, G, N, SH de RSV modificadas ou mutadas, ou de partes dessas, e/ou qualquer molécula descrita acima, em células eucarióticas e/ou células procarióticas. Assim, a invenção prevê células hospedeiras que compreendem um vetor (ou vetores) que contêm ácidos nucléicos que codificam genes de RSV estruturais, inclusive uma proteina F de RSV modificada ou mutada; e pelo menos um imunógeno, tal como, entre outros, G, N e SH de RSV, ou partes dessas, e/ou qualquer molécula descrita acima, e permitem a expressão de genes, inclusive F, G, N, M, ou SH de RSV ou partes dessas, e/ou qualquer molécula descrita acima, na célula hospedeira, em condições que permitam a formação de VLPs.

Dentre as células hospedeiras eucarióticas estão as células hospedeiras de levedura, insetos, aves, plantas, C. elegans (ou nematóides) e mamíferos. Exemplos não limitativos de células de inseto são as células de Spodoptera frugiperda (Sf), e.g., Sf9, Sf21, células Trichoplusia ni, e.g., células High five e células Drosophila S2. Os exemplos de células hospedeiras de fungos (incluindo leveduras) são S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), espécies de Candida que incluem C. albicanse C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris, e Yarrowla lipolytica. Os exemplos de células de mamíferos são as células COS, células renais de hamster bebê, células L de camundongo, células LNCaP, células de ovário de hamster chinês (CHO), células renais embrionárias humanas (HEK) e células de macaco verde africano, células CV1, células HeLa, células MDCK , células Vero e Hep-2. Os oócitos Xenopus laevis, ou outras células de origem de anfibios, também são passíveis de uso. Os exemplos de células hospedeiras procarióticas incluem células bacterianas, por exemplo, E. coli, B. subtilis, Salmonella typhi e micobactérias.

Os vetores, e.g., vetores compreendendo polinucleotideos de uma proteina F de RSV modificada ou mutada; e ao menos um imunógeno incluindo, entre outros, G, N, ou SH de RSV, ou partes desses, e/ou qualquer molécula quimérica descrita acima, podem ser transfectados em células hospedeiras de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a introdução de ácidos nucleicos em células eucarióticas pode ocorrer por co-precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofilico, transfecção com o emprego de reagentes de transfecção de poliamina. Em uma modalidade, o vetor é um baculovirus recombinante. Em outra modalidade, o baculovirus recombinante é transfectado para uma célula eucariótica. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula de inseto.

Em outra modalidade, a célula de inseto é uma célula Sf9.

Esta invenção também prevê construções e métodos que aumentarão a eficiência da produção de VLP. Por exemplo, a adição de sequências lideres para F, M, G, N, SH de RSV, ou suas partes, e/ou quaisquer moléculas quiméricas ou heterólogas descritas acima, pode melhorar a eficiência do transporte da proteina no interior da célula. Por exemplo, uma sequência de sinais heteróloga pode ser fundida para a F, M, G, N, SH, ou de partes dessas, e/ou qualquer molécula quimérica ou heteróloga descrita acima. Em uma modalidade, a sequência de sinais pode derivar do gene de uma célula de inseto e fundida à M, F, G, N, SH, ou partes dessas, e/ou quaisquer moléculas quiméricas ou heteróloga descritas acima. Em outra modalidade, o peptideo sinal é a sequência sinal da quitinase, que trabalha de forma eficiente em sistemas de expressão de baculovirus.

Outro método para o aumento da eficiência da produção de VLP é a otimização, pelo códon, dos nucleotideos que codificam RSV incluindo uma proteina F de RSV modificada ou mutada, M, G, N, SH ou partes dessas, e/ou quaisquer moléculas quiméricas ou heterólogas descritas acima para um tipo celular especifico. Como exemplos de códon que otimiza os ácidos nucléicos para expressão em célula Sf9, ver as SEQ ID Nos: 3, 5, 7, 9, 13, 17, 19 e 25.

A invenção também prevê métodos de produção de VLPs, os métodos que compreendem a expressão de genes de RSV incluindo uma proteina F de RSV modificada ou mutada, e ao menos uma proteina adicional, incluindo, entre outras, a M, G, N, SH de RSV, ou partes dessas, e/ou quaisquer moléculas quiméricas ou heterólogas descritas acima, em condições que permitam a formação de VLP. Dependendo do sistema de expressão e da célula hospedeira selecionada, as VLPs são produzidas por células hospedeiras em crescimento transformadas por um vetor de expressão em condições pelas quais as proteínas recombinantes são expressas e as VLPs são formadas. Em uma modalidade, a invenção compreende um método de produção de uma VLP, compreendendo a transfecção de vetores que codificam de ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada para uma célula hospedeira adequada e que expressam a proteina F do RSV modificada ou mutada em condições que permitam a formação de VLP. Em outra modalidade, a célula eucariótica é selecionada do grupo que consiste em células de levedura, inseto, anfibio, ave ou mamifero. A seleção das condições de crescimento apropriadas está dentro da habilidade ou uma pessoa com habilidade de um técnico no assunto.

Os métodos para o cultivo de células modificadas para a produção de VLPs da invenção incluem, entre outros, técnicas de batelada (batch), batelada-alimentada (batch- fed) , de cultura celular continua e de perfusão. Cultura de células significa o crescimento e a propagação de células em um biorreator (uma câmara de fermentação) , onde as células propagam e expressam a proteina (e.g., proteínas recombinantes) para a purificação e o isolamento. Normalmente, a cultura de células é realizada em condições estéreis, atmosféricas e de temperatura controlada em um biorreator. Um biorreator é uma câmara utilizada para células de cultura nas quais as condições ambientais tais como temperatura, atmosfera, agitação e/ou pH podem ser monitoradas. Em uma modalidade, o biorreator é uma câmara de aço inoxidável. Em outra modalidade, o biorreator é uma bolsa plástica pré-esterilizadas (e.g., Cellbag ®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ) . Em outra modalidade, as bolsas plásticas pré-esterilizadas são bolsas de cerca de 50:1 a 1000:1.

As VLPs são então isoladas utilizando os métodos que preservam a integridade dessas, como, por exemplo, por centrifugação de gradiente, e.g., cloreto de césio, sacarose e iodixanol, bem como técnicas de purificação usuais que incluem, por exemplo, a troca iônica e a cromatografia de filtração em gel.

A seguir há um exemplo de como as VLPs da invenção podem ser feitas, isoladas e purificadas. Normalmente, as VLPs são produzidas a partir de linhagens de células recombinantes projetadas para a criação de VLPs quando as células são cultivadas em cultura celular (ver acima). Um técnico no assunto compreenderia que existem métodos adicionais passíveis de uso para produzir e purificar as VLPs da invenção; assim, a invenção não se limita ao método descrito.

A produção de VLPs da invenção pode ter inicio por semeadura de células Sf9 (não-infectadas) em frascos agitadores (shaker), permitindo que as células se expandam e aumentando a escala (scaling up) conforme o crescimento e multiplicação das células (por exemplo, de um frasco de 125 ml a uma bolsa wave bag de 50 L ). O meio utilizado para o crescimento celular é formulado para a linhagem celular apropriada (de preferência, meio livre de soro, e.g., meio de inseto ExCell-420, JRH). Em seguida, as células são infectadas com o baculovirus recombinante na multiplicidade mais eficiente de infecção (e.g., de cerca de 1 a cerca de 3 unidades formadoras de placas por célula). Uma vez ocorrida a infecção, a proteina F do RSV modificada ou mutada, a M, G, N, SH, ou de partes dessas, e/ou qualquer molécula quimérica ou heteróloga descrita acima, são expressas a partir do genoma do virus, auto organizáveis nas VLPs e secretadas a partir de células aproximadamente de 24 a 72 horas após a infecção. Normalmente, a infecção é mais eficiente quando as células estão em fase mid-log de crescimento (4-8 x 106 células/ml) e são ao menos cerca de 90% viáveis.

As VLPs da invenção podem ser colhidas aproximadamente 48 a 96 horas após a infecção, quando os niveis de VLPs no meio de cultura celular estão próximos do máximo, mas antes da lise celular extensiva. A densidade e a viabilidade das células Sf9, no momento da colheita, podem ser de cerca de 0,5x 106 células/ml a cerca de 1,5 x 106 células/ml, com uma viabilidade de, pelo menos, 20%, conforme mostrado pelo ensaio de exclusão por coloração. Em seguida, o meio é removido e clarificado. NaCl pode ser adicionado ao meio a uma concentração de cerca de 0,4 a cerca de 1,0 M, de preferência a cerca de 0,5 M, a fim de evitar a agregação da VLP. A remoção de células e fragmentos (debris) celulares do meio de cultura de células contendo as VLPs da invenção pode ser realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) com um cartucho de filtro de fibra oca pré-esterilizado, de uso único, de 0,5 ou 1,00 pm ou um dispositivo similar.

Em seguida, as VLPs no meio de cultura clarificado podem ser concentradas por ultrafiltração utilizando um cartucho de fibra oca pré-esterilizado e descartável com um peso molecular de corte de 500.000. As VLPs concentradas podem ser diafiltradas contra um tampão fosfato-salino (PBS) de 10 volumes pH 7, 0-8,0 contendo 0,5 M de NaCl para a remoção de componentes residuais do meio.

As VLPs concentradas e diafiltradas podem ser ainda purificadas em um gradiente descontinuo de sacarose de 20% a 60% em pH 7,2 tampão PBS com 0,5 M de NaCl por centrifugação a 6.500 x g por 18 horas a cerca de 4 ° C a cerca de 10° C. Normalmente, as VLPs formarão uma banda distintiva visivel entre cerca de 30% a cerca de 40% de sacarose ou na interface (em um gradiente de etapa de 20% e 60%) que podem ser coletadas a partir do gradiente e armazenadas. Esse produto pode ser diluido a fim de compreender 200 mM de NaCl em preparação para a próxima etapa no processo de purificação. Esse produto contém as VLPs e pode conter partículas intactas de baculovirus.

Uma purificação adicional de VLPs pode ser alcançada através de cromatografia de troca aniônica, ou centrifugação isopicnica em colchão de sacarose a 44%. Na cromatografia de troca aniônica, a amostra do gradiente de sacarose (ver acima) é carregada para a coluna que contém um meio com um ânion (e.g., Matrix Fractogel EMD TMAE) e eluida através de um gradiente de sal (de cerca de 0,2 M a cerca de 1,0 M de NaCl) que pode separar a VLP a partir de outros contaminantes (e.g., baculovirus e DNA/RNA). No método de colchão de sacarose, a amostra que compreende as VLPs é adicionada a um colchão de sacarose a 44% e centrifugada por cerca de 18 horas a 30.000 g. As VLPs formam uma banda no topo da sacarose a 44%, enquanto que o baculovirus precipita no fundo e outras proteínas contaminantes permanecem na camada de sacarose a 0% no topo. O pico ou banda da VLP é coletado (a).

O baculovirus intacto pode ser inativado, se desejado. A inativação pode ser realizada por métodos quimicos, por exemplo, formalina ou P-propiolactona (BPL). A remoção e/ou inativação de baculovirus intacto também pode ser em grande parte realizado utilizando precipitação seletiva e métodos cromatográficos conhecidos na arte, conforme exemplificados acima.

Os métodos de inativação compreendem a incubação da amostra contendo as VLPs em 0,2% de BPL durante 3 horas a cerca de 25°C a cerca de 27°C. 0 baculovirus também pode ser inativado por incubação da amostra contendo as VLPs em 0,05% de BPL a 4°C por 3 dias, depois a 37°C durante uma hora.

Após a etapa de inativação/remoção, o produto que compreende as VLPs pode ser executado através de uma outra etapa de diafiltração a fim de remover qualquer reagente da etapa de inativação e/ou qualquer sacarose residual, e a fim de inserir as VLPs no tampão desejado (por exemplo, PBS) . A solução que compreende as VLPs pode ser esterilizada por métodos conhecidos na arte (e.g., filtração estéril) e armazenada no refrigerador ou freezer.

As técnicas acima podem ser praticadas através de uma variedade de escalas. Por exemplo, frascos T, frascos agitados (shake-flask), agitadores (spinner bottles), até biorreatores de porte industrial. Os biorreatores podem compreender um tanque de aço inoxidável ou uma bolsa plástica pré-esterilizada (por exemplo, o sistema vendido pela Wave Biotech, Bridgewater, NJ) . Um técnico no assunto saberá o que é mais desejável para os seus fins.

A expansão e a produção de vetores de expressão de baculovirus e a infecção de células com baculovirus recombinante para a produção de VLPs de RSV recombinantes podem ser realizadas em células de inseto, por exemplo, células de inseto Sf9, conforme descrito anteriormente. Em uma modalidade, as células Sf9 são infectadas com o baculovirus recombinante projetado para a produção de VLPs de RSV.

Formulações Farmacêuticas ou de Vacinas e Administração

As composições farmacêuticas úteis aqui contêm um transportador farmaceuticamente aceitável, incluindo qualquer diluente ou excipiente adequado, que inclui qualquer agente farmacêutico que não induza ele mesmo a produção de uma resposta imune prejudicial ao vertebrado a receber a composição, e que podem ser administradas sem toxicidade indevida, e uma proteina F de RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Conforme aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa ser aprovado por um órgão regulador do governo federal ou estadual, ou incluido na Farmacopeia norte americana, farmacopeia europeia ou outra farmacopeia comumente conhecida para uso em mamíferos, e, mais particularmente, em seres humanos. Essas composições podem ser úteis como uma vacina e/ou composições antigênicas para a indução de uma resposta imune protetora em um vertebrado.

A invenção abarca uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo VLPs que incluem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada, e ao menos uma proteina adicional, incluindo, entre outras, a M, G, N, SH de RSV, ou partes dessas, e/ou quaisquer moléculas quiméricas ou heterólogas descritas acima. Em uma modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos um imunógeno adicional. Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina M de RSV. Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina M de BRSV. Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina Ml de influenza. Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina Ml de influenza aviária.

Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteina G de RSV, incluindo, entre outras, uma proteina G de RSV de aves, HRSV ou BRSV. Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteína N de RSV, incluindo, entre outras, uma proteina N de HRSV, BRSV ou RSV de aves. Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteína SH de RSV, incluindo, entre outras, uma proteína SH de HRSV, BRSV ou RSV de aves.

Em outra modalidade, a invenção abarca uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo VLPs quiméricas, como, por exemplo, as VLPs compreendendo M de BRSV e uma proteína F do RSV modificada ou mutada e/ou proteína G, H, ou SH de um RSV e, opcionalmente, proteína HA ou NA derivada de um vírus da influenza, em que a proteína HA ou NA é uma proteína fundida ao domínio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteína F e/ou G de RSV.

A invenção também abrange uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada conforme descrito acima.

Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteína F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteína adicional. Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteína M de RSV, incluindo, entre outras, uma proteína M de BRSV. Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteína G de RSV, incluindo, entre outras, uma proteína G de HRSV. Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteína N de RSV, incluindo, entre outras, uma proteína N de HRSV, BRSV ou RSV de aves. Em outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ainda uma proteína SH de RSV, incluindo, entre outras, uma proteína SH de HRSV, BRSV ou RSV de aves. Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem uma proteína M e F de BRSV e/ou proteína G do grupo A do HRSV. Em uma outra modalidade, a composição da vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem uma proteína M e F de BRSV e/ou proteína G do grupo B do HRSV. Em outra modalidade, a invenção compreende uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo VLPs quiméricas, tais como as VLPs quiméricas que compreendem uma proteína M de um BRSV e opcionalmente uma proteína HA derivada de um vírus da influenza, em que a proteína M é fundida a uma proteína HA de influenza. Em outra modalidade, a invenção abarca uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo VLPs quiméricas, como, por exemplo, as VLPs compreendendo M de BRSV, e uma proteína quimérica F e/ou G do RSV e, opcionalmente, proteína HA derivada de um vírus da influenza, em que a proteína HA é fundida ao domínio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteína F e/ou G de RSV. Em outra modalidade, a invenção abarca uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo VLPs quiméricas, como, por exemplo, as VLPs 62/103 compreendendo M de BRSV e uma proteina quimérica F e/ou G de um RSV e, opcionalmente, proteina HA ou NA derivada de um virus da influenza, em que a proteina HA ou NA é uma proteina fundida ao dominio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteina F e/ou G de RSV.

A invenção também abrange uma composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreendendo uma VLP quimérica que compreende ao menos uma proteina de RSV. Em outra modalidade, a composição de vacina farmaceuticamente aceitável compreende VLPs que compreendem ao menos uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos um imunógeno de um agente infeccioso heterólogo ou célula doente. Em uma modalidade, o imunógeno de um agente infeccioso heterólogo é uma proteina viral. Em outra modalidade, a proteina viral de um agente infeccioso heterólogo é uma proteina associada ao envelope. Em outra modalidade, a proteina viral de um agente infeccioso heterólogo é expressa na superfície das VLPs. Em outra modalidade, a proteina de um agente infeccioso compreende um epitopo que gerará uma resposta imune protetora em um vertebrado.

A invenção também abrange um kit para a imunização de um vertebrado, como, por exemplo, um sujeito humano, compreendendo VLPs que compreendem ao menos uma proteina de RSV. Em uma modalidade, o kit compreende VLPs contendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade, o kit inclui ainda um proteina M de RSV, tal como uma proteina M de BRSV. Em outra modalidade, o kit ainda compreende uma proteina G de RSV. Em outra modalidade, a invenção abrange um kit compreendendo VLPs que compreendem uma proteína M quimérica de um BRSV e, opcionalmente, uma proteína HA derivada de um vírus da influenza, em que a proteína M é fundida à M do BRSV. Em outra modalidade, a invenção abrange um kit compreendendo VLPs que compreendem uma proteína M quimérica de um BRSV, uma proteína F e/ou G de RSV e um imunógeno de um agente infeccioso heterólogo. Em outra modalidade, a invenção abarca um kit compreendendo VLPs que compreendem uma proteína M de BRSV, uma proteína quimérica F e/ou G de um RSV e, opcionalmente, proteína HA derivada de um vírus da influenza, em que a proteína HA é fundida ao domínio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteína F e/ou G de RSV. Em outra modalidade, a invenção abarca um kit compreendendo VLPs que compreendem uma proteína M de um BRSV, uma proteína quimérica F e/ou G de um RSV e, opcionalmente, proteína HA ou NA derivada de um vírus da influenza, em que a proteína HA é fundida ao domínio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteína F e/ou G de RSV.

Em uma modalidade, a invenção compreende uma formulação imunogênica compreendendo ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção compreende uma formulação imunogênica compreendendo ao menos uma dose eficaz de uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Ainda em outra modalidade, a invenção compreende uma formulação imunogênica compreendendo ao menos uma dose eficaz de uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada.

A formulação imunogênica da invenção compreende uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, tampão aquoso isotônico estéril, e combinações desses. Uma discussão aprofundada dos transportadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e outros excipientes é apresentada no Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. edição atual) da Remington. A formulação deve se adequar ao modo de administração. Em uma modalidade preferida, a formulação é adequada para administração a seres humanos, de preferência, é estéril, não-particulada e/ou não-pirogênica.

A composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes emulsificantes ou umectantes, ou agentes tampão (tamponadores) de pH. A composição pode ser uma forma sólida, como um pó liofilizado adequado para a reconstituição, uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação controlada, ou pó. A formulação oral pode incluir transportadores-padrão , tais como os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc.

A invenção também prevê um pacote ou kit de produtos farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes com um ou mais dos ingredientes das formulações de vacina da invenção. Em uma modalidade preferida, o kit é composto por dois recipientes, um contendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, e a outra contendo um adjuvante. Associado a tal (is) recipiente (s), pode constar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental reguladora da fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso retrate a aprovação, pela agência, da fabricação, do uso ou venda para administração a seres humanos.

A invenção também prevê que a formulação seja acondicionada em um recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de composição. Em uma modalidade, a composição é fornecida como um liquido, em outra modalidade, como um pó liofilizado esterilizado seco ou um concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente fechado e pode ser reconstituído, por exemplo, com água ou solução salina para a concentração adequada para administração a um sujeito.

Em uma modalidade alternativa, a composição é fornecida em forma liquida em um recipiente hermeticamente fechado que indica a quantidade e a concentração da composição. Preferivelmente, a forma liquida da composição é fornecida em um recipiente hermeticamente fechado em ao menos cerca de 50 pg/ml, mais preferivelmente, ao menos cerca de 100 pg/ml, ao menos cerca de 200 pg/ml, ao menos 500 pg/ml, ou ao menos 1 mg/ml.

A titulo de exemplo, as VLPs quiméricas do RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada da invenção são administradas em uma quantidade eficaz ou quantidade (conforme definido acima) suficiente para o estimulo de uma resposta imune, sendo cada resposta contra uma ou mais cepas de RSV. A administração da proteina F de RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP da invenção elicita a imunidade contra o RSV. Normalmente, a dose pode ser ajustada dentro dessa faixa com base em, por exemplo, idade, condição fisica, peso corporal, sexo, alimentação, tempo de administração, e outros fatores clínicos. A formulação profilática da vacina é administrada sistemicamente, e.g., por injeção subcutânea ou intramuscular utilizando uma agulha e seringa, ou um dispositivo de injeção sem agulha. Alternativamente, a formulação da vacina é administrada por via intranasal, em gotas, partículas grandes de aerossol (maiores que cerca de 10 microns), ou spray no trato respiratório superior. Embora qualquer das vias de entrega acima resulte em uma resposta imune, a administração intranasal confere a vantagem adicional de eliciar a imunidade da mucosa no sitio de entrada de muitos virus, inclusive o RSV e a influenza.

Assim, a invenção também compreende um método de formulação de uma composição antigênica ou de vacina que induz a imunidade a uma infecção ou ao menos um sintoma de doença dessa a um mamifero, compreendendo a adição à formulação de uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade, a infecção é uma infecção por RSV.

Ao passo que há a possibilidade de estimulação da imunidade com uma dose única, as doses adicionais podem ser administradas, por via igual ou diferente, a fim de alcançar o efeito desejado. Em recém-nascidos e infantes, por exemplo, as administrações múltiplas podem ser necessárias para obter niveis suficientes de imunidade. A administração pode continuar em intervalos durante a infância, conforme o necessário para a manutenção de niveis suficientes de proteção contra infecções, e.g., infecção por RSV. Da mesma forma, os adultos que são particularmente suscetíveis a infecções repetidas ou graves, como, por exemplo, funcionários da saúde, funcionários de creches, os familiares de crianças pequenas, idosos e indivíduos com função cardiopulmonar comprometida podem necessitar de múltiplas imunizações a fim de estabelecer e/ou manter respostas imunes protetoras. Os niveis de imunidade induzida podem ser monitorados, por exemplo, pela medição das quantidades de anticorpos séricos e secretores neutralizantes, e dosagens ajustadas ou vacinações repetidas conforme a necessidade, a fim de obter e manter os niveis de proteção desejados.

Os métodos de administração de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada (e.g., formulações de vacina e/ou antigênicas) incluem, entre outros, a administração parenteral (e.g., intradérmica, intramuscular, intravenosa e subcutânea), epidural, e mucosal (e.g., vias intranasal e oral ou pulmonar ou por supositórios). Em uma modalidade especifica, as composições da presente invenção são administradas por via intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica ou intradérmica. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, infusão ou injeção em bolus, por absorção através de forros epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa do cólon, conjuntiva, da nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, bexiga urinária e intestinal, etc.) e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos. Em algumas modalidades, as vias de administração intranasal ou de outras mucosas de uma composição da invenção podem induzir uma resposta imune de anticorpos ou outra resposta imune que seja substancialmente maior do que demais vias de administração. Em outra modalidade, a via de administração intranasal, ou outras da mucosa de uma composição da invenção podem induzir uma resposta imune de anticorpos ou outra resposta imune que induzirá a proteção cruzada contra outras cepas de RSV. A administração pode ser sistêmica ou local.

Ainda em outra modalidade, a formulação de vacina e/ou imunogênica é administrada de modo a atingir os tecidos da mucosa, a fim de obter uma resposta imune no sitio da imunização. Por exemplo, os tecidos da mucosa, tais como o tecido linfóide associado ao intestino (GALT), podem ser direcionados para a imunização por meio da administração oral de composições que contenham adjuvantes com propriedades que objetivem a mucosa particular. Os tecidos da mucosa adicionais também podem ser objetivados, tais como o tecido linfóide nasofaringeo (NALT) e o tecido linfóide associado ao brônquio (BALT).

As vacinas e/ou formulações imunogênicas da invenção também podem ser administradas em um esquema de dosagem, por exemplo, uma administração inicial da composição de vacina com subsequentes administrações de reforço. Em modalidades particulares, uma segunda dose da composição é administrada em qualquer lugar, de duas semanas a um ano, preferivelmente, de cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5 a cerca de 6 meses, após a administração inicial. Além disso, uma terceira dose pode ser administrada após a segunda dose e de cerca de três meses a cerca de dois anos, ou até mais, de preferência cerca de 4, cerca de 5, ou cerca de 6 meses, ou cerca de sete meses a cerca de um ano após a administração inicial. A terceira dose pode ser administrada, opcionalmente, quando nenhum nivel ou niveis baixos de imunoglobulinas especificas são detectadas no soro e/ou urina ou secreções das mucosas do sujeito após a segunda dose. Em uma modalidade preferida, uma segunda dose é administrada cerca de um mês após a primeira administração e uma terceira dose é administrada cerca de seis meses após a primeira administração. Em outra modalidade, a segunda dose é administrada cerca de seis meses após a primeira administração. Em outra modalidade, as composições da invenção podem ser administradas como parte de uma terapia de combinação. Por exemplo, as composições da invenção podem ser formuladas com outras composições imunogênicas, antivirals e/ou antibióticos.

A dosagem da composição farmacêutica pode ser determinada imediatamente pelo técnico no assunto, por exemplo, primeiramente, pela identificação de doses eficazes para suscitar uma resposta imune profilática ou terapêutica, por exemplo, pela medição do titulo sérico de imunoglobulinas especificas do virus ou pela medição da razão inibitória de anticorpos em amostras de soro, ou amostras de urina, ou secreções das mucosas. As doses podem ser determinadas a partir de estudos com animais. Uma lista não-limitativa de animais utilizados para o estudo da eficácia das vacinas incluem o porco da guiné, hamster, furões, chinchilas, camundongos e ratos-de-algodão. A maioria dos animais não são hospedeiros naturais de agentes infecciosos, mas ainda podem servir em estudos de vários aspectos da doença. Por exemplo, qualquer dos animais acima pode ser dosado com um candidato à vacina, por exemplo, proteinas F de RSV mutadas ou modificadas, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou VLPs da invenção, a fim de caracterizar parcialmente a resposta imune induzida e/ou para determinar se houve a produção de algum anticorpo neutralizante. Por exemplo, muitos estudos foram realizados no modelo de rato, posto que os camundongos são pequenos, e seu baixo custo permite que os pesquisadores realizem seus estudos em escala maior.

Além disso, os estudos clinicos humanos podem ser realizados a fim de determinar a dose de eficácia preferida para os seres humanos por um técnico no assunto. Tais estudos clinicos são rotineiros e bem conhecidos na arte. A dose exata a ser empregada também dependerá da via de administração. As doses eficazes podem extrapolar as curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitroou com animais.

Como também é conhecido na arte, a imunogenicidade de uma composição especifica pode ser reforçada pelo uso de estimuladores não-especificos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Os adjuvantes foram utilizados experimentalmente para a promoção de um aumento generalizado da imunidade contra antígenos desconhecidos (e.g., a patente norte americana 4,877,611). Os protocolos de imunização utilizaram adjuvantes para o estimulo de respostas por muitos anos, e, por isso, os adjuvantes são bem conhecidos para um técnico no assunto. Alguns adjuvantes afetam a maneira pela qual os antígenos são apresentados. Por exemplo, a resposta imune é maior quando os antígenos de proteina são precipitados por alum. A emulsificação de antígenos também prolonga a duração da apresentação de antígenos. A inclusão de qualquer adjuvante descrito em Vogei et al."A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2a Edição),", aqui incorporado por referência em sua totalidade, para todos os efeitos, é prevista no âmbito desta invenção.

Para fins de exemplo, os adjuvantes incluem o adjuvante completo de Freund (um estimulador não especifico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis mortos), adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante de hidróxido de aluminio. Outros adjuvantes compreendem GMCSP, BCG, hidróxido de aluminio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipideo A, e lipidio monofosforil A (MPL). O RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, o MPL, o trealose dimicolato (TDM) e o esqueleto da parede celular (CWS), em uma emulsão de 2% de esqualeno/Tween 80 também é contemplado. Os antígenos

MHC do MF-59, Novasomes ®, também podem ser utilizados.

Em uma modalidade da invenção, o adjuvante é uma vesicula de lipidio paucilamelar com cerca de 2 a 10 bicamadas dispostas em forma de conchas substancialmente esféricas separadas por camadas aquosas em torno de uma grande cavidade central amorfa livre de bicamadas lipidicas. As vesículas lipidicas paucilamelares podem agir a fim de estimular a resposta imune de várias maneiras, como estimuladores não-especificos, como transportadores para o antígeno, como transportadores de adjuvantes adicionais, e combinações desses. As vesículas lipidicas paucilamelares atuam como estimuladores imunológicos não- especificos quando, por exemplo, uma vacina é preparada pela intermistura do antígeno com as vesículas pré- formadas, de modo que o antígeno permanece extracelular às vesículas. Através do encapsulamento de um antígeno no interior da cavidade central da vesicula, a vesicula atua tanto como um estimulador imunológico quanto um transportador para o antígeno. Em outra modalidade, as vesículas são feitas principalmente de vesículas não- fosfolipidicas. Em outra modalidade, as vesículas são Novasomes®. As Novasomes® são vesículas não-fosfolipidicas paucilamelares que variam de cerca de 100 nm a cerca de 500 nm. Elas compreendem Brij 72, colesterol, ácido oleico e esqualeno. As Novasomes mostraram ser um adjuvante eficaz para os antígenos de influenza (ver, as Patentes norte americanas 5,629,021, 6,387,373, e 4,911,928, aqui incorporadas por referência, em sua totalidade, para todos os efeitos).

As composições da invenção também podem ser formuladas com "estimuladores imunológicos". Esses são mensageiros químicos do próprio corpo (citocinas) para o aumento da resposta do sistema imunológico. Os estimuladores imunológicos incluem, entre outros, várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividades imunoestimuladoras, immunopotenciadoras e pró- inflamatórias, tais como as interleucinas (por exemplo, IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 12, IL-13); fatores de crescimento (e.g., fator estimulante de colônia (CSF) de macrófagos Granulócitos (GM)); e outras moléculas imunoestimuladoras, tais como o fator inflamatório de macrófago, ligante FLT3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas imunoestimuladoras podem ser administradas na mesma formulação que as composições da invenção, ou podem ser administradas separadamente. A proteina ou um vetor de expressão que codifica proteina podem ser administrados para a produção de um efeito imunoestimulador. Assim, em uma modalidade, a invenção compreende formulações antigênicas e de vacina que compreendem um adjuvante e/ou um estimulador imunológico.

Métodos de Estimulação de uma Resposta Imune

As proteinas F do RSV modificadas ou mutadas, as micelas de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou as VLPs da invenção são úteis para o preparo de composições que estimulam uma resposta imune que confere imunidade ou imunidade substancial a agentes infecciosos. Tanto a imunidade da mucosa quanto a celular podem contribuir para a imunidade aos agentes infecciosos e às doenças. Os anticorpos secretados localmente no trato respiratório superior são um fator importante na resistência à infecção natural. A imunoglobulina secretora A (slgA) está envolvida na proteção do trato respiratório superior, e a IgG sérica, na proteção do trato respiratório inferior. A resposta imune induzida por uma infecção protege contra a reinfecção pelo mesmo virus ou uma cepa virai antigenicamente similar. Por exemplo, o RSV passa por mudanças frequentes e imprevisíveis; portanto, após a infecção natural, o periodo efetivo de proteção fornecido pela imunidade do hospedeiro só pode ser eficaz por alguns anos contra as novas cepas de virus em circulação na comunidade.

Assim, a invenção abrange um método de indução de uma imunidade à infecções ou ao menos um sintoma de doença dessas em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada.

Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina adicional. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs compreendendo ainda uma proteina M do RSV, por exemplo, uma proteina M do BRSV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs compreendendo ainda uma proteina N do RSV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs compreendendo ainda uma proteina G do RSV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs compreendendo ainda uma proteina SH do RSV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs compreendendo ainda uma proteina F e/ou G do grupo A e/ou grupo B do RSV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteina M de BRSV e uma proteina quimérica F e/ou G de um RSV ou uma proteina de envelope MMTV, por exemplo, proteina HA ou NA derivada de um virus da influenza, em que a proteina HA e/ou NA é fundida ao dominio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteina F e/ou G de RSV ou proteina de envelope MMTV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteina M de um BRSV e uma proteina quimérica F e/ou G de um RSV e, opcionalmente, proteina HA ou NA derivada de um virus da influenza, em que a proteina HA é fundida ao dominio da transmembrana e uma cauda citoplasmática de proteina F e/ou G de RSV. Em outra modalidade, o sujeito é um mamifero. Em outra modalidade, o mamifero é um humano. Em outra modalidade, as VLPs do RSV são formuladas com um estimulador imunológico ou adjuvante.

Em uma modalidade, a invenção compreende um método para a indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F de RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção compreende um método para a indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Ainda em outra modalidade, a invenção compreende um método para a indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de VLPs de RSV, onde as VLPs compreendem uma proteína F do RSV modificada ou mutada, e proteínas M, G, SH, e/ou N. Em outra modalidade, um método de indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma dessa em um sujeito, compreende a administração de ao menos uma dose eficaz de uma VLP de RSV, onde a VLP consiste essencialmente em proteína M de BRSV (incluindo a M quimérica), e proteínas F, G, e/ou N de RSV. As VLPs podem compreender proteínas de RSV adicionais e/ou contaminantes proteicos em concentrações desprezíveis. Em outra modalidade, um método de indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma dessa em um sujeito, compreende a administração de ao menos uma dose eficaz de uma VLP de RSV, onde a VLP consiste em proteína M de BRSV (incluindo a M quimérica), G ou F de RSV. Em outra modalidade, um método de indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma dessa em um sujeito, compreende a administração de ao menos uma dose eficaz de uma VLP de RSV, onde a VLP consiste em proteína M de BRSV (incluindo a M quimérica), proteínas F, G, e/ou N de RSV, inclusive as proteínas F, G, e/ou N quiméricas. Essas VLPs contêm as proteínas M de BRSV (inclusive M quimérica), F, G, e/ou N de RSV e podem conter constituintes celulares adicionais, tais como proteínas celulares, proteínas de baculovirus, lipídios, carboidratos, etc., mas não contêm proteínas de RSV adicionais (exceto os fragmentos de proteínas M de BRSV (inclusive a M quimérica), F, G, e/ou N de BRSV/RSV) . Em outra modalidade, o sujeito é um vertebrado. Em uma modalidade, o vertebrado é um mamífero. Em outra modalidade, o mamífero é um humano. Em outra modalidade, o método compreende a indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença através da administração da formulação em uma dose. Em outra modalidade, o método compreende a indução da imunidade à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença através da administração da formulação em doses múltiplas.

A invenção também abrange um método de indução de imunidade a uma infecção, ou ao menos um sintoma dessa, em um sujeito, provocada por um agente infeccioso, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina de um agente infeccioso heterólogo. Em uma modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteina F do RSV modificada ou mutada e ao menos uma proteina do mesmo ou um agente infeccioso heterólogo. Em outra modalidade, a proteina de um agente infeccioso heterólogo é uma proteina viral. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso é uma proteina associada ao envelope. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso é expressa na superfície das VLPs. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso compreende um epitopo que gerará uma resposta imune protetora em um vertebrado. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso pode se associar a uma proteina M de RSV, tal como a proteina M de BRSV, proteina F, G e/ou N de RSV. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso é fundida a uma proteina de RSV, tal como a proteina M de BRSV, proteina F, G e/ou N de RSV. Em outra modalidade, apenas uma parte da proteina do agente infeccioso é fundida a uma proteina de RSV, tal como a proteina M de BRSV, proteina F, G e/ou N de RSV. Em outra modalidade, apenas uma parte da proteina do agente infeccioso é fundida a uma parte da proteina de RSV, tal como a proteina M de BRSV, proteina F, G e/ou N de RSV. Em outra modalidade, a parte da proteina do agente infeccioso fundida a uma proteina do RSV é expressa na superfície das VLPs. Em outra modalidade, a proteina de RSV, ou parte dessa, fundida à proteina do agente infeccioso se associa à proteina M do RSV. Em outra modalidade, a proteina de RSV, ou parte dessa, é derivada da F, G, N e/ou P de RSV. Em outra modalidade, as VLPs quiméricas ainda compreendem uma proteina N e/ou P do RSV. Em outra modalidade, as VLPs quiméricas compreendem mais de uma proteina das mesmas e/ou de um agente infeccioso heterólogo. Em outra modalidade, as VLPs quiméricas compreendem mais de uma proteina de agente infeccioso, criando, assim, uma VLP multivalente.

As composições da invenção podem induzir a imunidade substancial em um vertebrado (por exemplo, um ser humano) quando administradas aos vertebrados. A imunidade substancial é resultado de uma resposta imune contra as composições da invenção que protegem ou melhoram a infecção ou ao menos reduzem um sintoma de infecção nos vertebrados. Em alguns casos, se o vertebrado for infectado, a infecção será assintomática. A resposta não pode ser uma resposta completamente protetora. Nesse caso, se o vertebrado for infectado com um agente infeccioso, o vertebrado experimentará sintomas reduzidos ou de menor duração em comparação a um vertebrado não-imunizado.

Em uma modalidade, a invenção compreende um método de indução substancial de imunidade à infecção pelo virus RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção compreende um método de vacinação de um mamífero contra o RSV compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade, o método compreende a administração de VLPs compreendendo ainda uma proteina M do RSV, tal como a proteina M do BRSV. Em outra modalidade, o método compreende ainda a administração de VLPs compreendendo uma proteina G do RSV, por exemplo, uma proteina G do HRSV. Em outra modalidade, o método compreende ainda a administração de VLPs compreendendo a proteina N do grupo A do HRSV. Em outra modalidade, o método compreende ainda a administração de VLPs compreendendo a proteina N do grupo B do HRSV. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteina M quimérica de BRSV e uma proteina F e/ou G derivada de um RSV, em que a proteina F e/ou G é fundida à transmembrana e a uma cauda citoplasmática de proteína A. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteína M de um BRSV e uma proteína quimérica F e/ou G de RSV, em que a proteína F e/ou G é fundida ao domínio da transmembrana e a uma cauda citoplasmática de proteína HA e/ou NA da influenza. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteína M de um BRSV e uma proteína quimérica F e/ou G de um RSV e, opcionalmente, proteína HA e/ou NA da influenza, em que a proteína F e/ou G é fundida ao domínio da transmembrana e a uma cauda citoplasmática da proteína HA. Em outra modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteína M de um BRSV e uma proteína quimérica F e/ou G de RSV e, opcionalmente, uma proteína HA e/ou NA da influenza, em que a proteína HA e/ou NA é fundida ao domínio da transmembrana e a uma cauda citoplasmática da proteína F e/ou G de RSV.

A invenção também abrange um método de indução de imunidade substancial a uma infecção, ou ao menos um sintoma dessa, em um sujeito, provocada por um agente infeccioso, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteína F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteína F do RSV modificada ou mutada. Em uma modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem ainda uma proteína M do RSV, tal como uma proteína M de BRSV, e ao menos uma proteína de um outro agente infeccioso. Em uma modalidade, o método compreende a administração de VLPs que compreendem uma proteína M do BRSV e ao menos uma proteína do mesmo ou um agente infeccioso heterólogo. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso heterólogo é uma proteina viral. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso é uma proteina associada ao envelope. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso é expressa na superfície das VLPs. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso compreende um epitopo que gerará uma resposta imune protetora em um vertebrado. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso pode se associar a uma proteina M de RSV. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso pode se associar a uma proteina M de BRSV. Em outra modalidade, a proteina do agente infeccioso é fundida a uma proteina de RSV. Em outra modalidade, apenas uma parte da proteina de outro agente infeccioso é fundida a uma proteina do RSV. Em outra modalidade, apenas uma parte da proteina de outro agente infeccioso é fundida a uma proteina do RSV. Em outra modalidade, a parte da proteina do agente infeccioso fundida a uma proteina do RSV é expressa na superfície das

VLPs. Em outra modalidade, a proteina de RSV, ou parte dessa, fundida à proteina do agente infeccioso se associa à proteina M do RSV. Em outra modalidade, a proteina de RSV, ou parte dessa, fundida à proteina do agente infeccioso se associa à proteina M do BRSV. Em outra modalidade, a proteina de RSV, ou parte dessa, é derivada da F, G, N e/ou P de RSV. Em outra modalidade, as VLPs ainda compreendem uma proteina N e/ou P do RSV. Em outra modalidade, as VLPs compreendem mais de uma proteina do agente infeccioso. Em outra modalidade, as VLPs compreendem mais de uma proteina de agente infeccioso, criando, assim, uma VLP multivalente.

Em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta protetora de anticorpos a uma infecção ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F do RSV modificada ou mutada, uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada, ou uma VLP compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada.

Conforme aqui utilizado, um "anticorpo" é uma proteina compreendendo um ou mais polipeptídeos substancialmente ou parcialmente codificados por genes de imunoglobulinas ou fragmentos de genes de imunoglobulinas. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como inúmeros genes de imunoglobulina de região variável. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. A unidade estrutural tipica da imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, sendo cada par dotado de uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kD) . O N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais de aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento do antigeno. Os anticorpos existem como imunoglobulinas intactas ou como um número de fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestão com várias peptidases.

Em uma modalidade, a invenção compreende um método para a indução da resposta celular protetora à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma proteina F de RSV modificada ou mutada. Em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta celular protetora à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma micela de F de RSV compreendendo uma proteina F do RSV modificada ou mutada. Ainda em outra modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta celular protetora à infecção por RSV ou ao menos um sintoma de doença dessa em um sujeito, compreendendo a administração de ao menos uma dose eficaz de uma VLP, em que a VLP compreende uma proteina F do RSV modificada ou mutada. A imunidade mediada por células também desempenha um papel na recuperação da infecção por RSV e pode impedir complicações associadas ao RSV. Os linfócitos celulares específicos do RSV foram detectados no sangue e nas secreções do trato respiratório inferior de sujeitos infectados. A citólise das células infectadas pelo RSV é mediada por CTLs em conjunto com anticorpos e complemento de RSV específicos. A resposta citotóxica primária é detectável no sangue após 6-14 dias, e desaparece pelo dia 21 em indivíduos infectados ou vacinados (Ennis et al., 1981) . A imunidade mediada por células também desempenha um papel na recuperação da infecção por RSV e pode prevenir complicações associadas ao RSV. Os linfócitos celulares específicos do RSV foram detectados no sangue e nas secreções do trato respiratório inferior de sujeitos infectados.

Conforme acima mencionado, as composições imunogênicas da invenção previnem ou reduzem ao menos um sintoma de infecção pelo RSV em um sujeito. Os sintomas do RSV são bem conhecidos na arte. Eles incluem rinorréia, dor de garganta, dor de cabeça, rouquidão, tosse, expectoração, febre, estertores, sibilos e dispnéia. Assim, o método da invenção compreende a prevenção ou redução de ao menos um sintoma associado à infecção por RSV. A redução em um sintoma pode ser determinada subjetivamente ou objetivamente, e.g., a auto avaliação por um sujeito, a avaliação de um clinico ou a realização de um exame ou medição apropriado (e.g., temperatura corpórea), incluindo, e.g., uma avaliação da qualidade de vida, uma progressão retardada de uma infecção por RSV ou de sintomas adicionais, uma redução da gravidade dos sintomas de RSV, ou exames adequados (e.g., titulos de anticorpos e/ou testes de ativação de células T) . A avaliação objetiva compreende tanto as avaliações de origem animal quanto humana.

Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como uma limitação. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados, citados ao longo deste pedido, bem como as Figuras e a Listagem de Sequências, são aqui incorporados por referência para todos os fins.

EXEMPLOS Exemplo 1 Geração de bacmideos recombinantes, transfecção decélulas de inseto para formar estoques de vírus recombinantes, purificação de placa e infecção de células de inseto com o estoque de vírus primário.

Para a formação de vírus recombinantes, os genes virais de interesse foram otimizados por códon para a expressão das células de inseto Sf9 e clonados em vetores pFastBac™.

Uma vez ocorrida a confirmação e a purificação dos construtos desejados, um vial de células competentes MAX Efficiency® DHlOBac™ para cada construto foi descongelado no gelo. Aproximadamente, 1 ng (5 pl) do DNA plasmídico do construto pFastBac™ foi adicionado às células e misturado delicadamente. As células foram incubadas no gelo por 30 minutos. Isso foi seguido por choque térmico das células por 45 segundos a 42°C sem agitação. Em seguida, os tubos foram transferidos para o gelo e gelados por 2 minutos. Posteriormente, 900 pl do Meio S.O.S em temperatura ambiente foi adicionado em cada tubo. Os tubos foram colocados em um agitador a 37 °C a 225 rpm por 4 horas. Para cada transformação pFastBac™, diluições em série de 10 vezes das células (10-1, 10-2 e 10-3) foram preparadas com meio S.O.C. Em seguida, 100 pl de cada diluição foram semeados na superfície de uma placa de ágar LB contendo 50 pg/ml de canamicina, 7 pg/ml de gentamicina, 10 pg/ml de tetraciclina, 100 pg/ml de Bluo-gal, e 40 pg/ml de IPTG. As placas foram incubadas por 48 horas a 37° C. As colônias brancas foram escolhidas para a análise.

Diferentes DNAs de bacmídeos dos acima citados foram feitos para cada construto e foram isolados. Esses DNAs foram à precipitação e adicionados a células Sf9 por 5 horas.

Em seguida, 30 ml de células de inseto Sf9 (2 x 106 células/ml) foram infectadas com baculovirus expressando as proteinas virais de interesse com 0,3 ml de eluato de placa e incubadas por 48-72 h. Aproximadamente 1 ml da cultura bruta (células + meio) e colheitas de cultura clarificadas foram salvas para a análise de expressão e o restante foi salvo para fins de purificação.

Exemplo 2 Expressão, purificação, e análise de proteinas F de HRSV modificadas

Os genes que codificam F proteinas de HRSV de interesse foram sintetizados in vitrocomo oligonucleotideos sobrepostos, clonados e expressos em células hospedeiras. A clonagem e expressão dos genes de F de RSV modificada foram obtidos seguindo os métodos conhecidos na arte.

As placas recombinantes contendo proteinas virais de interesse foram escolhidas e confirmadas. O virus recombinante foi então amplificado pela infecção de células de inseto Sf9. Em alguns casos, as células de inseto Sf9 foram co-infectadas por um virus recombinante expressando a proteina F modificada e um outro virus recombinante expressando outras proteinas virais (e.g., proteina M de BRSV e/ou proteina N de HRSV) . Uma cultura de células de inseto foi infectada a ~ 3 MOI (Multiplicidade de infecção = virus ffu ou pfu/célula) , com baculovirus carregando as diversas construções. A cultura e o sobrenadante foram colhidos após 48-72 de infecção. A colheita bruta, aproximadamente 30 mL, foi clarificada por centrifugação

por 15 minutos a aproximadamente 800 x g. As colheitas brutas de células resultante contendo proteina F de HRSV modificada foram purificadas conforme descrição abaixo.

As proteínas F de HRSV modificadas de interesse foram purificadas a partir das colheitas de cultura de células de inseto Sf9 infectadas. O tensoativo não-iônico Tergitol® NP-9 (etoxilato de nonilfenol) foi utilizado em um protocolo de extração de proteínas da membrana. A extração bruta foi ainda purificada por passagem, através de cromatografia de troca aniônica, de afinidade de lectina de lentilha/HIC, e cromatografia de troca catiônica.

A expressão da proteina foi analisada por SDS-PAGE e corada para proteínas totais por coloração coomassie. Volumes iguais de amostras de células da colheita bruta e tampão de amostra 2x contendo βME (beta-mercaptoehtanol) foram carregados, aproximadamente 15 a 20 pl (cerca de 7,5- 10 pl da cultura)/pista (lane), em um gel Laemmli SDS.

Em alguns casos, em vez de cromatografia, as proteínas F de HRSV modificadas nas colheitas de células brutas foram concentradas por método de separação de 30% de sacarose gradiente, e, em seguida, foram analisadas por SDS-PAGE por coloração com Coomassie, ou Western Blot utilizando anticorpos monoclonais de F anti-RSV.

A colheita de células bruta contendo proteínas F modificadas recombinantes, proteínas F recombinantes purificadas, ou proteínas F recombinantes concentradas por gradiente de sacarose pode ser posteriormente analisada por Western Blot utilizando anticorpos monoclonais de F anti- RSV e/ou anticorpos policlonais de F anti-RSV.

Exemplo 3 Gene de F de HRSV modificada que codifica a proteína F BV # 541

As tentativas iniciais de expressão do comprimento total da proteina F de HRSV não foram bem sucedidas no alcance de altos níveis de expressão. A sequência do gene de F utilizado na expressão foi SEQ ID NO: 1 (gene de F HRSV do tipo selvagem, n° de acesso ao GenBank M11486). Ele codifica um precursor inativo (Fo) de 574 aa. Esse precursor é clivado duas vezes pelas proteases semelhantes à furina, durante a maturação, a fim de produzir dois polipeptídeos ligados ao dissulfeto, subunidade F2 do terminal N e Ei do terminal C (Figura 1). Os dois sítios de clivagens estão nos resíduos 109 e 136, que são precedidos por motivos de reconhecimento de furina (RARR, aa 106-109 (SEQ ID NO: 23) e KKRKRR, aa 131-136 (SEQ ID NO: 24)). A sequência do gene F da SEQ ID NO: 1 contém o uso de códon subótimo para expressão em células de inseto Sf9 e abriga 3 erros, produzindo uma proteína que pode apresentar menos que um dobramento ideal (SEQ ID NO: 2 (n° de acesso ao GenBank AAB59858). Além disso, um possível sítio de Poli- adenilação (A) (ATAAAA) foi identificado na região que codifica a subunidade F2. Além disso, a sequência do gene F do tipo selvagem possui aproximadamente 65% de riqueza AT, enquanto que a razão GC-AT desejada de um sistema de expressão de sequência de genes em células de inseto Sf9 é de aproximadamente 1:1.

Na tentativa de superar os níveis de expressão pobres de proteína F de HRSV, uma nova sequência de gene F foi projetada de modo que: (a) os três erros de sequenciamento de GenBank foram corrigidos; (b) o sitio críptico poli(A) na região que codifica a subunidade F2 codificação foi modificado; (c) os códons do gene F foram otimizados; e (d) o gene F codifica uma proteina F modificada com sitio primário de clivagem inativado.

Os três erros de aminoácidos corrigidos foram P102A, I379V, e M447V. O sitio criptico poli(A) no gene F de HRSV foi corrigido sem a mudança da sequência de aminoácidos.

O esquema de otimização do códon foi baseada nos seguintes critérios: (1) abundância de aminoacil-tRNAs para um códon particular em espécies Lepidoptera de células de inseto para um determinado aminoácido, conforme descrito por Levin, D.B. et al. (Journal of General Virology, 2000, vol. 81, pp 2313-2325), (2) manutenção da razão GC-AT em sequências de genes em aproximadamente 1:1, (3) a introdução minima de estruturas de DNA palindrômicas ou estruturas de hairpin loop (ansa), e (4) introdução minima das sequências de elemento repressor de transcrição e pós- transcrição. Um exemplo de sequência de gene F otimizada foi mostrado como SEQ ID NO: 19 (RSV-F BV #368).

A fim de inativar o sitio primário de divagem (Io CS, KKRKRR, aa 131-136) da proteina F de HRSV, o sitio de reconhecimento furina foi mutado para KKQKQQ (SEQ ID NO: 28) ou GRRQQR (SEQ ID NO: 29). Várias proteinas F modificadas com tais mutações no sitio de divagem foram avaliadas a fim de determinar a eficiência da prevenção da divagem. A Figura 2 mostra várias das proteinas F modificadas que foram avaliadas. Os resultados indicam que o sitio primário de divagem da proteina F do HRSV pode ser inativado por três mudanças conservadoras de aminoácidos R133Q, R135Q e R136Q. Essas mudanças conservadoras de aminoácidos a partir da Arginina (R), que é uma molécula de carga polar, para a Glutamina (Q) , que é uma molécula de polaridade neutra, alteraram o estado de carga nesses sitios e impediram a divagem por proteases semelhantes à furina (ver a Figura 3), ao passo que ainda preservando a estrutura 3D da proteina F. A prevenção de divagem no Io CS resultou na redução da atividade de fusão da membrana da proteina F.

Uma sequência exemplar não limitativa de gene F de HRSV modificado, concebida para apresentar todas as modificações mencionadas acima, é mostrada na Figura 4. Esse gene F modificado (SEQ ID NO: 5, RSV-F BV #541) codifica uma proteina F modificada de SEQ ID NO: 6. A sequência do gene foi sintetizada in vitrocomo oligonucleotídeos sobrepostos, clonada e expressa em células hospedeiras. A proteina F de HRSV modificada BV #541 foi purificada a partir das culturas de células de inseto Sf9 infectadas, e foi analisada por SDS-PAGE corada por Coomassie. O método de purificação e análise SDS-PAGE é descrito no Exemplo 2. O nivel de expressão da proteina F RSV-F BV #541 (por exemplo, a proteina F 541) foi melhorado em comparação à proteina Fo do tipo selvagem em células de inseto Sf9.

Exemplo 4 Proteina F de HRSV modificada com deleção parcial do dominio de fusão da subunidade Fi

A fim de melhorar ainda mais a expressão da proteina F de RSV, os genes F de HRSV adicionalmente modificados foram concebidos para que apresentassem as seguintes modificações: (a) os três erros de sequenciamento de GenBank foram corrigidos; (b) o sitio criptico poli(A) na região que codifica a subunidade F2 codificação foi modificado; (c) Os códons do gene F foram otimizados; e (d) as sequências de nucleotideos que codificam o dominio de fusão da subunidade Fi foram parcialmente excluídas. Em um experimento, a sequência de nucleotideos que codificam os primeiros 10 aminoácidos do dominio de fusão da subunidade Fi foi eliminada (correspondente aos aminoácidos 137-146 da SEQ ID NO: 2).

Um gene F de RSV modificado exemplar não-limitativo compreendendo tais modificações é mostrado na Figura 5, designado como SEQ ID NO: 9 (RSV-F BV #622, e.g., proteina F 622), que codifica uma proteina F modificada de SEQ ID NO: 10. A proteina F de HRSV modificada BV #622 foi purificada a partir das culturas de células de inseto Sf9 infectadas, e foi analisada por SDS-PAGE corada por

Coomassie. O método de purificação e análise SDS-PAGE é descrito no Exemplo 2. Niveis elevados de expressão da proteina F de HRSV BV #622 foram observados, conforme exibido na SDS-PAGE na Figura 6.

Exemplo 5 Proteina F de HRSV modificada tanto com o sitio primário de divagem inativado quanto com a deleção parcial de dominio de fusão Fi

A fim de determinar se a combinação de sitio primário de divagem inativado e a deleção parcial do dominio de fusão Fi pode promover adicionalmente a expressão da proteina F do RSV, particularmente em células de inseto Sf9, um outro gene modificado F de RSV foi concebido compreendendo as seguintes modificações: (a) os três erros de sequenciamento de GenBank foram corrigidos; (b) o sitio criptico poli(A) na região que codifica a subunidade F2 codificação foi modificado; (c) os códons do gene F foram otimizados; (d) o sitio primário de divagem foi inativado; e (e) as sequências de nucleotideos que codificam o dominio de fusão da subunidade Fi foram parcialmente excluídas. Em um experimento, a sequência de nucleotideos que codificam os primeiros 10 aminoácidos do dominio de fusão da subunidade Fi foi eliminada (correspondente aos aminoácidos 137-146 da SEQ ID NO: 2).

Um gene F de RSV modificado exemplar não-limitativo compreendendo tais modificações é mostrado na Figura 7, designado como SEQ ID NO: 7 (RSV-F BV #683, e.g., proteina F 683), que codifica uma proteina F modificada de SEQ ID NO: 8. A proteina F de RSV modificada BV #683 (e.g., proteina F 683) foi purificada a partir das culturas de células de inseto Sf9 infectadas, e foi analisada por SDS- PAGE corada por Coomassie. O método de purificação e análise SDS-PAGE é descrito no Exemplo 2. Outros realces nos niveis de expressão foram alcançados, conforme exibido no SDS-PAGE na Figura 8.

Exemplo 6 Expressão e purificação da proteina F de HRSV modificadasBV#683

A proteína F do HRSV modificada BV #683 (por exemplo, proteína F 683, SEQ ID NO: 8) foi expressa em um sistema de expressão de baculovirus conforme descrição no Exemplo 1, e as placas recombinante que expressam a proteína F de HRSV BV #683 foram escolhidas e confirmadas. O vírus recombinante foi então amplificado pela infecção de células de inseto Sf9. Uma cultura de células de inseto foi infectada a ~ 3 MOI (Multiplicidade de infecção = vírus ffu ou pfu/célula), com baculovirus. A cultura e o sobrenadante foram colhidos após 48-72 de infecção. A colheita bruta, aproximadamente 30 mL, foi clarificada por centrifugação por 15 minutos a aproximadamente 800 x g. As colheitas brutas de células resultante contendo proteína F de HRSV modificada BV #683 foram purificadas conforme descrição abaixo.

A proteína F de HRSV BV #683 foi purificada a partir das colheitas de cultura de células de inseto Sf9 infectadas. O tensoativo não-iônico Tergitol® NP-9 (etoxilato de nonilfenol) foi utilizado em um protocolo de extração de proteínas da membrana. A extração bruta foi ainda purificada por passagem, através de cromatografia de troca aniônica, de afinidade de lectina de lentilha/HIC, e cromatografia de troca catiônica.

A proteína F do HRSV purificada BV #683 foi analisada por SDS-PAGE corado com Coomassie, e Western Blot utilizando anticorpos monoclonais de F anti-RSV, conforme descrito no Exemplo 2. Os resultados foram mostrados na Figura 9. Níveis excelentes de expressão da proteína F de HRSV BV #683 (por exemplo, a proteína F 683, SEQ ID NO: 8) foram alcançados. Estimou-se que o nível de expressão foi superior a 10 mg/L em cultura bruta de células, e da proteína F #BV 683 recuperada foi cerca de 3,5 mg/L de cultura de células. Em alguns casos, os níveis de expressão acima de 20 mg/L foram alcançados e cerca de 5mg/L de proteína F modificada #BV 683 foi recuperada (ver a Figura 10).A pureza da proteína F recuperada BV #683 alcançou mais de 98%, conforme determinado pela densitometria de varredura (ver Figura 10).

Exemplo 7 Micelas de proteína F de HRSV purificada BV #683 (rosetas)

A proteína F de HRSV purificada BV #683 foi analisada por microscopia eletrônica de coloração negativa (ver Figura 11) . Proteínas F se agregaram na forma de micelas (rosetas), semelhantes às observadas para a proteína F de HRSV do tipo selvagem (Calder et ai., 2000, Virology271, pp. 122-131), e outras glicoproteínas da membrana viral de comprimento total (Wrigley et al., Academic Press, London, 1986, vol. 5, pp. 103-163) . Na microscopia eletrônica, as espigas F exibiram uma morfologia da haste com forma de pirulito com as extremidades mais largas projetando para longe dos centros das rosetas. O comprimento do trímero único foi de cerca de 20nm, e o diâmetro das partículas de micelas foi de cerca de 40nm (ver a Figura 12) . Esses resultados indicaram que a proteína F de HRSV BV #683 possui uma estrutura 3D correta para uma proteína ativa nativa.

Em resumo, uma versão modificada da proteína F recombinante de HRSV (e.g., BV #683) foi criada, expressa e purificada. Essa F de comprimento total modificada é glicosilada. As modificações do sitio primário de divagem e o dominio da fusão, juntos, aumentaram muito o nivel de expressão da proteina F. Além disso, essa proteina F modificada pode ser clivada para as subunidades Fi e F2, que são ligadas ao dissulfeto. Os trimeros das subunidades Fi e F2 formam espigões em forma de pirulito, de 19,6 nm, e partículas de 40,2 nm. Além disso, essa proteina F modificada é altamente expressa em células de inseto Sf9. A pureza de micelas > 98% é obtida após a purificação. O fato de os espigões dessa proteina modificada possuírem uma morfologia de pirulito, que podem ainda formar partículas de micelas de 40 nm, indica que a proteina F modificada BV #683 possui uma estrutura 3D correta de uma proteina nativa.

Exemplo 8 Co-expressão de proteínas F de HRSV modificadas com M de BRSV e/ou N de HRSV na produção da VLP

A presente invenção também fornece VLPs compreendendo uma proteina F de RSV modificada ou mutada. Tais VLPs são úteis para a indução de anticorpos neutralizantes contra antígenos de proteina virai, e, portanto, podem ser administradas para o estabelecimento de imunidade contra o RSV. Por exemplo, tais VLPs podem compreender uma proteina F de RSV modificada, e proteínas M de BRSV e/ou proteínas N de HRSV. Os códons dos genes que codificam as proteínas M de BRSV (SEQ ID NO: 14) ou N de HRSV (SEQ ID NO: 18) podem ser otimizadas para expressão em células de inseto. Por exemplo, uma sequência de gene M de BRSV otimizado é mostrada na SEQ ID NO: 13 uma sequência de gene N de RSV otimizado é mostrada na SEQ ID NO: 17.

Em um experimento, uma proteina F modificada BV #622 e outra proteina F modificada BV #623 (SEQ ID NO: 21, modificada de forma que ambos os sitios de divagem são inativados) foram expressas sozinhas, ou co-expressas com proteina N de HRSV e proteina M de BRSV. Tanto as colheitas brutas de células contendo VLPs (intracelular) e pellets de VLPs coletados a partir da separação de 30% de sacarose gradiente foram analisados por SDS-PAGE corado com Coomassie, e Western Blot utilizando anticorpos monoclonais de F anti-RSV. A Figura 13 mostra a estrutura das proteinas F modificadas BV #622 e #623 BV, e os resultados da análise SDS-PAGE e Western Blot. A BV #622 foi altamente expressa por si só ou co-expressa com proteina N de HRSV e proteina M de BRSV, enquanto que a BV #623 teve uma expressão muito pobre, indicando que a inativação de ambos os sitios de divagem inibe a expressão da proteina F.

Em outro experimento, a proteina modificada F BV #622, o gene de tandem duplo BV #636 (BV #541 + M de BRSV), BV #683, BV #684 (BV #541 com dominio L YIAL introduzido no terminal C), e BV #685 (#541 BV com dominio L YKKL introduzido no terminal C) foram expressos sozinhos, ou co- expressos com proteina N de HRSV e proteina M de BRSV. O dominio L (dominio conservado) é sequência conservada em retrovirus, e apresenta dentro da Gag atuando em conjunto com as proteinas celulares para a liberação eficiente de virions a partir da superfície da célula (Ott et al, 2005, Journal of Virology79: 9038-9045) . A estrutura de cada proteina F modificada é mostrada na Figura 14. Tanto as colheitas brutas de células contendo VLPs (intracelular) e pellets de VLPs coletados a partir da separação de 30% de sacarose gradiente foram analisados por SDS-PAGE corado com Coomassie, e Western Blot utilizando anticorpos monoclonais de F anti-RSV. A Figura 14 mostra os resultados de SDS-PAGE e análise de Western Blot das colheitas de células brutas contendo VLPs (intracelulares) e a Figura 15 mostrou os resultados de SDS-PAGE e análise de Western Blot de pellets de VLPs coletados a partir de separação de gradiente de 30% de sacarose. A BV #622 e BV #683 foram altamente expressas por si ou co-expressas com proteina N de HRSV e proteina M de BRSV, enquanto que a BV #636, BV #684 e BV #685 apresentaram expressão pobre.

Exemplo 9 Rastreamento de proteinas F quiméricas de HRSV com alta expressão

Esforços foram feitos para o rastreamento de proteinas F de RSV adicionais que podem ser altamente expressas na forma solúvel em células de inseto e podem formar VLPs de melhor rendimento. Vários genes F foram criados, expressos, e analisados. Tanto o Western Blot quanto o SDS-PAGE foram utilizados a fim de avaliar a expressão.

Da Figura 16a à Figura 16d são resumidos a estrutura, o nome de clone, descrição, resultados de análise Western Blot/coomassie, e conclusão para cada clone F quimérico de HRSV.

Conforme os resultados indicaram, a proteina F de comprimento de lâmina do tipo selvagem teve uma baixa expressão; As proteinas F de HRSV quiméricas que contêm a subunidade Fi mas não a F2 poderiam ser bem expressas, mas os produtos foram insolúveis, talvez devido a uma falta de dobramento, impossibilidade de junção com outras proteinas virais a fim de formar VLPs com bom rendimento após as co- infecções. A inativação do sitio primário de clivagem sozinho não resultou em aumentos substanciais na expressão, mas uma melhor expressão foi alcançada quando a inativação do sitio primário de clivagem foi combinada com outra modificação, tais como a deleção do sitio criptico poli(A) e a correção de erros do GenBank aa (e.g., BV #541) . A introdução do dominio L YKKL no terminal C da BV #541 aumentou a secreção de VLPs contendo proteinas F modificada por cerca de 2-3 vezes na co-expressão com proteinas M de BRSV e N de HRSV. Os resultados ainda mostraram que um gene quimérico de tandem duplo consistindo em gene de BV #541 e gene de M de BRSV exibiram ambos um rendimento intracelular melhorado e de VLPs em comparação à co-infecção das proteinas BV #541 e M de BRSV, indicando que a proteina M de BRSV pode facilitar a produção de VLPs contendo proteina F de HRSV modificada em células de inseto, quando expressas tandemicamente. Um gene quimérico de tandem triplo consistindo em BV #541, M de BRSV, e N de HRSV tiveram um rendimento intracelular muito maior e um rendimento de VLPS bem melhor em comparação ao conjunto de genes quiméricos de tandem duplo acima mencionados ou à co-infecção de proteinas BV #541, M de BRSV, e N de HRSV. Além disso, os resultados sugeriram que a proteina quimérica F de HRSV BV#683 (e.g., proteina F 683, SEQ ID NO: 8) teve a melhor expressão intracelular. A expressão de um gene quimérico de tandem duplo consistindo nos genes de BV#683 e M de BRSV, ou de um gene quimérico de tandem triplo consistindo nos genes de BV#683, M de BRSV, N de HRSV é também aqui incorporada. Esses genes quiméricos de tandem duplo e triplo deve melhorar ainda mais a produção de VLP em comparação à co-infecção.

Exemplo 10 Ensaio de neutralização de RSV e estudos de RSV desafio em camundongos

A fim de testar a eficiência da vacina compreendendo a proteina F modificada de HRSV BV #683 na proibição da infecção por RSV, um ensaio de neutralização e estudos de RSV desafio foram realizados em camundongos. Os procedimentos experimentais são mostrados na Figura 17.

Grupos de camundongos (n=10) foram injetados por via intramuscular (exceto RSV vivo) com placebo (solução PBS), RSV vivo (fornecido por via intranasal), vacina de RSV inativada por formalina (FI-RSV), 1 ug de partículas de F purificadas (PFP, proteina F modificada BV #683), 1 ug de partículas de F purificadas com Alum (PFP + Alum), 10 ug de partículas de F purificadas, 10 ug de partículas de F purificadas com Alum (PFP + Alum) , ou 30 ug de partículas de F purificadas no dia 0 e dia 21. Cada grupo imunizado foi desafiado por RSV vivo no dia 42 (21 dias após a segunda imunização). O soro de camundongo de cada grupo foi colhido no dia 0, dia 31 (10 dias após a segunda imunização), e dia 46 (4 dias após o desafio com RSV vivo).

O soro de camundongo de cada grupo de tratamento foi testado para a presença de anticorpos de neutralização anti-RSV. As diluições de soro de camundongos imunizados foram incubadas com RSV infeccioso em placas de microtitulação de 96 poços. O soro foi diluido de 1:20 a 1:2560. 50 ul de soro diluido foram misturados com 50 ul de virus RSV vivo (400 pfu) em cada poço. A mistura de vírus/soro foi incubada primeiramente por 60 minutos em temperatura ambiente, e então misturada com 100 ul de células HEp-2 e incubada por 4 dias. O número de placas de virus infecciosos foram então contadas após corados com violeta cristal. O titulo de neutralização para cada amostra de soro foi definido como o inverso da maior diluição de soro que produziu 100% de neutralização de RSV (e.g., sem placas) e foi determinado para cada animal. O titulo de anticorpos neutralizantes séricos de média geométrica no dia 31 (10 dias após o reforço (boost)) e dia 46 (4 dias após o desafio com RSV vivo) foram representados graficamente para cada grupo da vacina. A Figura 18 mostra os resultados de ensaios de neutralização. Os resultados indicam que 10 ug ou 30 ug de proteina purificada F produzem titulos de neutralização muito maiores em comparação ao RSV vivo. Além disso, titulos de neutralização de PFP são reforçados com a co-administração de adjuvante Alum.

Estudos de RSV desafio foram realizados a fim de determinar se a imunização poderia prevenir e/ou inibir a replicação do RSV nos pulmões dos animais imunizados. A quantidade de RSV nos pulmões de camundongos imunizados foi determinada por ensaio de placa utilizando células HEp-2. Os grupos de camundongos imunizados mencionados acima foram infectados com 1 x 106 pfu de cepa Long infecciosa de RSV por via intranasal no dia 42 (11 dias após a segunda imunização) . No dia 46 (quatro dias após a infecção por RSV), os pulmões dos camundongos foram removidos, pesados e homogeneizados. O tecido pulmonar homogeneizado foi clarificado. O sobrenadante da solução clarificada foi diluído e submetido ao ensaio de placas utilizando células HEp-2 a fim de determinar o título de RSV no tecido pulmonar (calculado como pfu/g de tecido pulmonar) . Os resultados são mostrados na Figura 19, indicando que todos os camundongos imunizados com a proteína recombinante F do RSV BV #683 tiveram o RSV indetectável nos pulmões, e até mesmo 1 ug da proteína recombinante F de HRSV purificada BV #683 sem o adjuvante apresentaram excelente eficiência na inibição da replicação do RSV (reduzido mais de 1000 vezes em comparação com o placebo).

A fim de determinar a estabilidade da vacina PFP do RSV acima utilizada, a vacina foi armazenada a 2-8 °C por 0, 1,2, 4 e 5 semanas, e, então, analisada por SDS-PAGE corado com Coomassie (Figura 20). Os resultados mostram que essa vacina PFP de RSV é muito estável a 2-8 °C, e não há degradação detectável.

Exemplo 11 Atividade da Micela de F do RSV Recombinante em Ratos- de-algodão

Neste exemplo, os grupos de animais incluíram a imunização nos dias 0 e 21 com RSV vivo (RSV), RSV inativado por formalina (FI-RSV), proteína RSV-F BV #683 com e sem alumínio (PFP e PFP + Adjuvante de Alumínio) , e controles PBS.

Conforme mostrado na Figura 21, a imunização com 30 ug da vacina de micela F (proteína RSV-F BV #683, i.e., proteína F 683, SEQ ID NO: 8), com e sem alumínio produziu respostas robustas de anticorpos neutralizantes após a exposição ao RSV A e RSV B. Além disso, observou-se que o alumínio aumenta significativamente a resposta de anticorpos. Além disso, os anticorpos neutralizantes foram aumentados após um reforço (boost) no dia 46 ou dia 49 no RSV A e RSV B, respectivamente.

Enquanto que uma patologia de pulmão significativa foi observada em ratos imunizados com RSV inativado por formalina (FI-RSV), nenhum aumento da doença foi observado com a vacina da micela F (Figura 22).0 uso da vacina de F- micela e a vacina de F-micela com adjuvante produziu contagens de inflamação menores (4,0 e 2,8, respectivamente) do que o grupo controle (5,8) da infecção primária por RSV (PBS + RSV desafio) . Conforme observado acima, o grupo tratado com FI-RSV teve uma contagem de inflamação maior do que o grupo controle (9,0 contra 5,8) da infecção primária por RSV (PBS + RSV desafio). Ademais, o grupo tratado com FI-RSV teve uma contagem média de inflamação significativamente superior (9,0) à dos controles placebo sem desafio, RSV vivo + RSV desafio, F- micela + RSV desafio, e F-micela + aluminio + RSV desafio.

A descrição acima detalhada foi provida para fins de clareza de entendimento, e limitações desnecessárias não devem ser compreendidas a partir dessa, uma vez que as modificações serão óbvias para os técnicos no assunto. Não se trata de um reconhecimento que nenhuma das informações aqui contidas seja anterioridade ou relevante para as invenções presentes, ou que qualquer publicação especificamente ou implicitamente referida se trate de uma anterioridade.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado comumente compreendido por um técnico no assunto ao qual pertence esta invenção.

Embora o pedido tenha sido dividido em seções a fim de direcionar a atenção do leitor para as modalidades especificas, tais seções não devem ser interpretadas como 5 uma divisão entre as modalidades. Os ensinamentos de cada seção e as modalidades neles descritas são aplicáveis a outras seções.

Sendo a invenção descrita em conexão com modalidades especificas da mesma, será compreendido que ela pode 10 apresentar alterações posteriores, e que este pedido é destinado a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção a seguir, em geral, bem como os princípios da invenção, e que incluem tais partidas da presente divulgação como sendo compreendidas por prática conhecida 15 ou comum dentro da técnica à qual a invenção pertence, e conforme possibilidade de aplicação às características essenciais acima definidas e de acordo com o que segue no escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Glicoproteína de fusão (F) de vírus sincicial respiratório (RSV) , caracterizadapelo fato de que dita glicoproteína F de RSV compreende: (i) uma deleção de um ou mais aminoácidos do domínio de fusão, em que dito domínio de fusão corresponde aos aminoácidos 137-146 da glicoproteína F de RSV do tipo selvagem (SEQ ID NO:2); e (ii) pelo menos um sítio primário de divagem da furina inativado; e em que a glicoproteína é codificada por um ácido nucléico possuindo a sequência de SEQ ID NO:7.

2. Glicoproteína F de RSV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a dita glicoproteína F de RSV compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

3. Ácido nucléico isolado, caracterizadopelo fato de que codifica uma glicoproteína F de RSV como definida na reivindicação 1.

4. Célula hospedeira de microrganismo, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucléico como definido na reivindicação 3.

5. Composição de vacina farmaceuticamente aceitável, caracterizadapelo fato de que compreende uma glicoproteína F de RSV como definida na reivindicação 1, em que a glicoproteína F de RSV é capaz de induzir uma resposta imune em um hospedeiro.

6. Micela purificada, caracterizadapelo fato de que compreende uma glicoproteína F de RSV como definida na reivindicação 1.

7. Composição de vacina farmaceuticamente aceitável, caracterizadapelo fato de que compreende uma micela purificada como definida na reivindicação 6, em que a micela é capaz de induzir uma resposta imune em um hospedeiro.

8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapor compreender um adjuvante.

9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadapelo fato de que o adjuvante é alum.

10. Glicoproteína F de RSV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a proteina não possui um peptideo sinal na região N-terminal.

11. Glicoproteína F de RSV, de acordo com a reivindicação 1 ou 10, caracterizadapelo fato de que foi clivada para o rendimento das subunidades Fi e Fg ligadas ao dissulfeto.