WO2013031827A1 - Rsv粘膜ワクチン - Google Patents

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antigen
vehicle
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博 木戸
大 水野
博嗣 上田
浩司 吉川
恵介 大隅
周藤　健治
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国立大学法人徳島大学
株式会社応用酵素医学研究所
山本　信行
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    • C12N2760/18551—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition that effectively induces mucosal immunity IgA and blood immunity IgG against RSV, specifically an RSV mucosal vaccine, and preferably relates to a nasal RSV mucosal vaccine.
  • Patent Documents 1 and 2 describe in detail the drawbacks of conventional inactivated vaccines and toxoids, the current state of development of mucosal vaccines and immune adjuvants, and the like.
  • Patent Document 1 an antigen drug (AD) vehicle that is a complex of pulmonary surfactant protein B and / or pulmonary surfactant protein C and lipid
  • Patent Document 2 the AD vehicle and A mucosal vaccine comprising an antigen
  • the inventors of the present application can convert the selective production of IgA antibody and the production of both IgA and IgG antibodies by adjusting the weight ratio V / A of AD vehicle amount (V) and antigen amount (A).
  • Patent Document 2 a patent application has been filed for a mucosal vaccine having this mechanism of action.
  • RSV respiratory diseases other than influenza viruses.
  • RSV infection causes bronchiolitis and pneumonia in infants, the elderly, and immunocompromised patients, with about 30% of the first infections in infants leading to lower respiratory tract inflammation.
  • the appearance of vaccines is eagerly desired because 1-3% of them become seriously ill and require hospitalization.
  • RSV is an RNA virus belonging to the Paramyxoviridae family and can be broadly divided into subtype A and subtype B.
  • Non-patent Document 1 F protein (Non-patent Document 1) important for fusion with a host cell
  • G protein (Non-patent Document 1), and SH protein involved in adhesion to the host cell exist on the virus surface. Therefore, many RSV vaccines using whole virus particles and these proteins as antigens have been studied.
  • the first attempt at viral vaccines is a formalin inactivated vaccine.
  • Influenza viruses have been used for a long time because formalin-inactivated vaccines have been obtained because sufficient vaccine effects have been obtained by this method.
  • a formalin-inactivated vaccine was attempted in the 1960s, but unlike the influenza virus, the RSV did not provide a vaccine effect, but caused serious side effects in infants.
  • Non-Patent Document 2 Since then, RSV vaccines have been studied for split vaccines in which a part of virus components and an adjuvant are mixed (Patent Documents 4 and 5). To date, RSV vaccine development efforts have been conducted to identify antigens capable of protecting against infection, development of effective adjuvants, and vaccination methods.
  • Non-patent document 3 reports that RSV membrane fusion F protein is effective as an antigen (Non-patent document 4), and RSV G protein There are reports that it is effective as an antigen (Non-Patent Document 5), and various results have been obtained depending on the difference in the method of administering the antigen as a vaccine and the difference in the combination of the added adjuvant and the antigen.
  • Non-Patent Document 5 reports that it is effective as an antigen.
  • RSV vaccine that has been approved and marketed to date due to insufficient vaccine efficacy or side effects.
  • Patent Document 5 is a nasal RSV vaccine using attenuated cholera toxin as an adjuvant, and can induce IgA in the nasal mucosa.
  • nasal vaccines using bacterial toxins are concerned about the side effects of facial paralysis (The New England Journal of Medicine 2004; 350: 896-903). Therefore, alternative adjuvants are essential for safe nasal vaccines.
  • the conventional mucosal vaccine requires a larger amount of antigen than the transdermal vaccine, and there is a problem that the production efficiency is poor.
  • the present invention induces IgA, which is expected to have an effect of preventing RSV infection, into the nasal cavity, and there is no concern about side effects such as facial paralysis. Therefore, the issue is to provide a vaccine that exhibits an excellent effect in protecting against RSV infection.
  • the present invention has a stronger antibody-producing ability than the mucosal vaccine when the AD vehicle (a) described in Patent Document 3 is applied to an RSV antigen, and as a result, a small amount comparable to a transdermal vaccine. It is an object of the present invention to provide an improved RSV mucosal vaccine capable of exerting an excellent infection-suppressing effect on blood and mucous membranes by nasal administration of the above antigen.
  • CVP Carboxyvinyl polymer
  • the present invention has the following composition: (A) an AD vehicle comprising a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8 and m is 11-20) and a lipid (hereinafter abbreviated as AD vehicle (a)); A composition comprising (b) a carboxyvinyl polymer; and (c) an RSV antigen.
  • AD vehicle comprising a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8 and m is 11-20) and a lipid (hereinafter abbreviated as AD vehicle (a));
  • a composition comprising (b) a carboxyvinyl polymer; and (c) an RSV antigen.
  • it is a pharmaceutical composition comprising (a) to (c), preferably an RSV mucosal vaccine, more preferably a nasal RSV mucosal vaccine.
  • the RSV antigen (c) is further combined with an AD vehicle (a) or an amount of an antigen-specific amount that also produces an effective infection-protective effect when combined with a carboxyvinyl polymer (b). It is an amount that does not produce mucosal immunity IgA and blood immunity IgG.
  • the synthetic peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, preferably a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the lipid comprises phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and oleic acid. At least one. More specifically, the lipid is a trilipid mixture of dipalmitoyl phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and palmitic acid.
  • RSV antigens in this composition are all particles of RSV, all attenuated strain particles, all particles split, F protein, G protein, SH protein, N protein, P protein, M2-1 protein, M2-2 protein , L protein, M protein, NS1 protein, NS2 protein, or a combination thereof or a mixture containing them, and RSV-F protein is particularly preferable.
  • each protein is modified by genetic engineering such as introduction of mutation, deletion, insertion of a partial sequence, and substitution, and further includes a partial sequence of each protein and a chimera with a different protein.
  • the F protein is a genetically modified one or a chimera containing at least a part of the F protein.
  • a method for producing a composition using RSV-F protein as an antigen a method in which a mixture of RSV-F protein and AD vehicle is freeze-dried or sonicated and then mixed with carboxyvinyl polymer is preferable.
  • “amount of mucosal immunity IgA and blood immunity IgG that produces effective immunity induction” is, for example, an amount of IgA and IgG that suppresses virus growth in an RSV cell infection system.
  • composition comprising a synthetic peptide and a lipid represented by the composition (a) of the present invention is referred to as “AD vehicle (a)”, and this AD vehicle (a) and the RSV antigen are used.
  • the mucosal vaccine may be described as “RSV + AD vehicle”, and the mucosal vaccine composed of RSV antigen and CVP may be described as “RSV + CVP”.
  • the composition of the present invention comprising AD vehicle (a), CVP and RSV antigen may be described as “RSV + AD vehicle + CVP”.
  • the composition of the present invention may be described as “RSV mucosal vaccine” or RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP”.
  • the RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP” of the present invention has an extremely strong induction effect of RSV antigen-specific IgA and IgG antibodies and a virus growth suppression effect of the induced antibodies in the RSV cell infection system. These effects are extremely remarkable as unexpected from the effects of the RSV + AD vehicle in which the mucosal vaccine of Patent Document 3 is applied to the RSV antigen and the effects of RSV + CVP in which the CVP of US Pat. No. 5,158,761 is applied to the RSV antigen. is there.
  • RSV + AD vehicle does not show sufficient antibody production induction, but the RSV mucosal vaccine of the present invention “RSV + AD vehicle + CVP” produces IgA compared to “RSV + AD vehicle”.
  • the antibody titer is 24.3 times as much as the amount and 12.1 times as much as the amount of IgG produced.
  • the RSV + AD vehicle + CVP of the present invention shows an antibody titer that is 21.1 times as IgA production and 4.6 times as IgG production compared to RSV + CVP.
  • results of Test 1 nasal wash IgA and serum IgG levels in 10 mice in each group when RSV-G protein and RSV-G protein epitope peptide HA conjugate were administered as an antigen to mice.
  • Show. L and H in the figure indicate the small amount (L) and large amount (H) of the amount of antigen protein described in Table 1, and L + SF-10 and H + SF-10 are the respective antigen amounts (L , H), the AD vehicle was added, freeze-dried, and finally the above CVP was added.
  • the titer of serum anti-RSV IgG antibody is shown on the left, and the anti-RSV IgA antibody titer of nasal wash is shown on the right.
  • the upper part (3) shows an example of an HA conjugate of an antigen epitope amino acid of RSV-G protein
  • the lower part (4) shows a case where RSV-G protein is used as an antigen.
  • An experimental system in which an AD vehicle is added to the antigen amount (L, H) is described as L (H) + ADv, and L (H) + CVP, L (H) + ADv + CVP is expressed as L (H) + SF-10 Respectively.
  • the results of Test 2 show the amount of nasal wash IgA (lower) and the amount of serum IgG (upper) when each sample was administered nasally to mice.
  • RSV + AD vehicle + CVP has the following composition.
  • Synthetic peptide consisting of amino acid sequence of synthetic peptide KnLm (where n is 4-8, m is 11-20). In KnLm, n K (Lys) residues on the N-terminal side and m L residues on the C-terminal side are continuous.
  • Such a synthetic peptide is, for example, any of the following peptides.
  • the parentheses are peptide abbreviations. Amino acid residues are indicated by single letter symbols.
  • Sequence number 1 (K6L16): KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL
  • Sequence number 2 (K6L11): KKKKKKLLLLLLLLLLL
  • SEQ ID NO: 1 (K6L16) consists of 6 K (Lys) residues on the N-terminal side and 16 L residues (Leu) on the C-terminal side, and SEQ ID NO: 2 (K6L11) is on the N-terminal side. 6 K (Lys) residues and 11 C-terminal L (Leu) residues. It is preferable to use those synthetic peptides having a purity of 95% or more prepared according to a known chemical synthesis method.
  • lipid phospholipid As the lipid phospholipid, it is desirable to use phospholipids contained in lung surfactant, such as phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, and the like.
  • phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, sphingomyelin and the like can be used.
  • fatty acid lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, palmitooleic acid, oleic acid and the like can be used.
  • lipids derived from aquatic animals such as whales and dolphins with active lung expansion can be used.
  • Carboxyvinyl polymer (CVP) CVP is a hydrophilic polymer obtained by polymerizing acrylic acid as a main component.
  • Hibiswaco 103, Hibiswaco 104, Hibiswaco 105, Sigma pAA130 (Sigma, St. Louis, MO, Cat No. 181293) , PAA450 (Sigma, Cat No. 181285), pAA1250 (Sigma, Cat No. 306215), etc. can be used.
  • Hibiswako 104 which is widely used for preparation of cosmetics and pharmaceutical gels, and pAA130 and pAA1250 manufactured by Sigma are preferable.
  • pH 5.0-10.5 can be prepared with NaOH neutralization solution. It is preferred to select a pH that does not affect. For example, in the case of RSV antigen, the pH is adjusted to 6.8-8.0, preferably pH 7.0-7.2.
  • Antigen RSV antigen includes all particles, attenuated strain all particles (International Publication WO2010 / 053883 (Weiss, attenuated strain)), all particles split, F protein (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 ( 24), 7683-7687 (1984) (A2 strain F protein)), G protein (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (12), 4075-4079 (1985) (A2 strain G protein)), SH protein (Virology 141 (2), 283-291 (1985) (A2 strain SH protein)), N protein (Virology 146 (1), 69-77 (1985) (A2 strain N protein)), P protein (J.
  • each protein has been genetically engineered such as introduction of mutation, deletion, insertion of a partial sequence, and substitution (International Publication WO2010 / 077717 (Application including Novavax # 683), International Publication WO2009 / 079796 ( ID Bio Medical, Pre Form Immobilized Modified F), International Publication WO2010 / 075491 (Rochester University, F Antigen Self-Folding Neutralizing Antibody Epitope), International Publication WO2010 / 149745 (GSK, Trimer-Promoted Modified F Protein) , International Publication WO2010 / 039224 Publication (Massachusetts Medical University, RSV Modified Protein and VLP), International Publication WO2010 / 059689 Publication (LYGOCYTE, F Protein VLP), International Publication WO2009 / 000433 Publication (PEVION virosome), US US2010111989 Publication (PEVION Modification) F protein), US US20080003236 publication (US Department of Health and Human Services,
  • Patent Document 9 US 2010/0172925 (NHRI, CTL epitope), International Publication WO2011 / 017442 (US Department of Health and Welfare, G protein peptide antigen), International Publication WO2011 / 050168 (US Department of Health and Welfare, Neutralizing Antibody Epitope Fragment)), and chimera with different protein (Patent No.
  • the antigen may be derived from a virus belonging to the Pneumovirus subfamily (International Publication WO2010149743 (GSK, RSV + PIV3 + MPV chimera)).
  • antigens are not particularly limited in quantity, but in amounts alone, particularly in combination with an AD vehicle (a) or in combination with a carboxyvinyl polymer (CVP), an antigen-specific amount of effective antigen induction.
  • An amount that does not produce mucosal immunity IgA and blood immunity IgG can be prepared and used.
  • AD vehicle (a) Some of the above-mentioned lipids are mixed at an arbitrary ratio, and the amount of lipid is, for example, chloroform: methanol (2: 1 (v / v)) to a concentration of 10 mg / mL. Suspend in the mixture to make the lipid component. Moreover, a synthetic peptide is melt
  • the mixing ratio is about 0.2 to about 12.0% by dry weight for synthetic peptides and about 88 to about 99.8% by dry weight for lipids.
  • This mixture is dried at about 40 ° C. using a rotary evaporator, resuspended in 10% ethanol at an arbitrary concentration, and shaken and mixed in a water bath at about 45 ° C. for about 15 minutes to prepare a uniform dispersion and frozen. dry.
  • This dried product is stored at about 4 ° C to -30 ° C, and after each use, it is suspended by adding pure water or physiological saline, and then uniformly dispersed using ultrasonic waves, a homogenizer, a mixer, a shaker or the like.
  • RSV + AD vehicle + CVP The above-mentioned AD vehicle (a), CVP and RSV antigen are mixed in an arbitrary ratio. That is, in the case of RSV vaccine, the AD vehicle (a) solution is added to the vaccine stock solution so that the dry weight ratio V / A of the AD vehicle (a) amount (V) to the antigen amount (A) in the vaccine becomes a desired value. Add and mix to prepare.
  • the dry weight (A) of antigen administered per mouse is about 0.01 to about 100 ⁇ g / kg body weight, preferably about 0.03 to about 50.0 ⁇ g / kg body weight.
  • the V / A for preferentially and selectively inducing IgA antibody production is preferably about 0.1 to about 1.0.
  • V / A for inducing production of both IgA and IgG antibodies can be in the range of about 1.0 to about 100, preferably about 5 to about 20.
  • about 60% or more of the antigen binds to the AD vehicle, and the resulting RSV mucosal vaccine (RSV + AD vehicle + CVP) efficiently induces IgA antibody production and / or IgG antibody production. can do.
  • the CVP concentration in the final nasal vaccine solution with CVP added is about 0.1% to 1.0%, preferably 0.3% to 0.8%.
  • a homogenizer In order to uniformly mix the AD vehicle (a), antigen, and CVP, a homogenizer, a mixer, a shaker, a stirrer, or the like can be used.
  • the production method suitable for the type of antigen used may differ, but when using a particularly preferred F protein (Test 1) as an RSV antigen, A manufacturing method including the following ultrasonic treatment steps and a manufacturing method including a freeze-drying step are recommended.
  • RSV-F antigen and AD vehicle (a) are mixed and then sonicated for 3 minutes to obtain a 1% CVP physiological saline solution.
  • the RSV mucosal vaccine of the present invention (RSV + AD vehicle + CVP) can be produced by adding an equal amount. This method is the same as the method described in Patent Document 3 except that RSV antigen is used instead of HA and CVP is added.
  • the method including the freeze-drying step is a manufacturing method including the following steps as shown in Example 2. (1) Suspend AD vehicle (a) and antigen in water (pure water) (2) Repeat heating and stirring one or more times (3) Freeze-drying (4) Suspend the freeze-dried product in physiological saline (5) Addition of CVP solution dissolved in physiological saline As shown in Test 1 to be described later, this method is similar to the case of using sonication to produce high antigen-specific IgA and It is an excellent method that enables production of IgG.
  • the prepared RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP” can be used in a single administration, but it is administered twice (primary immunization and secondary immunization) or three times (primary immunization, secondary immunization, tertiary immunization) ) Is preferably used. Such multiple immunizations can significantly increase the antibody titers of IgA and IgG. Two or three vaccine administrations are performed at intervals of 1 to 3 weeks, preferably about 2 weeks.
  • an AD vehicle (a) was prepared as follows. Dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), phosphatidylglycerol (PG), and palmitic acid (PA) are mixed at a ratio of 75:25:10 (w / w / w) so that the concentration of phospholipid is 10 mg / mL.
  • DPPC Dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • PG phosphatidylglycerol
  • PA palmitic acid
  • RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP” was prepared as follows using the above-mentioned AD vehicle (a).
  • the freeze-dried AD vehicle (a) was suspended in physiological saline before use.
  • RSV-F protein prepared by the following method was used as an antigen.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is expressed in a silkworm larva-baculovirus expression system (former Katakura Industrial Co., Ltd., present Sysmex Co., Ltd.) and anti-FLAG antibody affinity gel (Sigma-Aldrich Co. LLC.) After purification, RSV-F protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 was obtained.
  • the protein concentration of the antigen solution measured by DC protein assay (Bio-Rad Laboratories, Inc.) was 2.03 mg / mL.
  • the RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP” produced by a method including this ultrasonic treatment step is referred to as “RSV + SF-10”.
  • the SF-10 amount in other examples is also described as a value excluding the CVP amount.
  • a lyophilized AD vehicle (a) powder was dissolved in pure water and mixed with the same RSV-F protein solution as in Example 1. This suspension was heated to 42 ° C. for 10 minutes using a water bath, and stirred for 10 seconds with a mixer at 3 minutes and 7 minutes during the heating process to make the solution uniform. After the heating treatment, the suspension was frozen at ⁇ 20 ° C. to ⁇ 75 ° C. overnight and freeze-dried to produce a dry powder. The lyophilized powder was stored at 4 ° C to -30 ° C.
  • RSV + AD vehicle + CVP an RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP”.
  • the amount of RSV antigen protein contained in 4 ⁇ L in total of 2 ⁇ L per nose per mouse is 1.0 ⁇ g, and the amount of phospholipid in AD vehicle (a) is 8.0 ⁇ g.
  • RSV mucosal vaccine “RSV + AD vehicle + CVP” produced by the method including the freeze-drying step is referred to as RSV + SF-10F.
  • a mucosal vaccine (RSV + AD vehicle (a)) was prepared.
  • RSV-F protein and AD vehicle (a) are the same as in Example 1.
  • the vaccine is prepared according to Example 1, and finally 1% CVP (Hibis Wako 104) is 0.5% in the final concentration. Instead of adding, an equal volume of saline was added.
  • the RSVF antigen protein amount is 1.0 ⁇ g and the AD vehicle (a) amount is 8.0 ⁇ g.
  • a mucosal vaccine (RSV + CVP) was prepared.
  • RSV-F protein was diluted with pure water, and an equal amount of 1% CVP (Hibis Wako 104) was added. The amount of RSV-F protein is 1.0 ⁇ g, the amount of AD vehicle (a) is 8.0. ⁇ g, and CVP has a final concentration of 0.5%.
  • CVP has a final concentration of 0.5%.
  • RSV-F protein was diluted with physiological saline and used as a vaccine. The dose of RSV-F protein per animal is 1.0 ⁇ g.
  • SF-10 was adjusted by adding 1% CVP (Hibiswaco 104) to 8.0. ⁇ g AD vehicle (a) to a final concentration of 0.5%. [Test 1]
  • Mucosal vaccine Four types of viral antigens shown in Table 1: RSV ether split, RSV-F protein (secretory type), RSV-G protein (secretory type), epitope partial sequence of RSV-G protein (GenBank / CAA51765, 156- 175 amino acid sequences) each of which has a conjugate of ovalbumin (OVA), bovine serum albumin (BSA), influenza hamagglutinin (HA), a small amount of nasal inoculation antigen per mouse (L), After mixing RSV mucosal vaccine by the lyophilization method described in Example 2 as a large amount (H), mixing at the mixing ratio with the AD vehicle shown in Table 1, the final adjustment is performed by the method of Comparative Example 1, Mice were inoculated nasally.
  • OVA ovalbumin
  • BSA bovine serum albumin
  • HA influenza hamagglutinin
  • L small amount of nasal inoculation antigen per mouse
  • mice Animals 6-8 weeks old, BALB / c female mice were purchased from Charles River Japan and used. All animal experiments were conducted at the Astellas Pharmaceutical Tsukuba Research Center's Animal Experiment Facility and were conducted according to the Astellas Pharmaceutical Animal Experiment Committee guidelines. 3. Immunization In nasal administration of vaccines, the above-mentioned four mucosal vaccines are administered to both sides, 2 ⁇ L each on one side, and a total of 4 ⁇ L is anesthetized with Somnopentyl (Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) (81.0 mg / kg). The mice were instilled into the nasal cavity of both sides. The assay was performed with two types of antigens, a small amount (L) and a large amount (H). Each group consists of 10 mice. The amount of antigen (L, H) is as shown in Table 1.
  • Immunization was carried out by nasal administration of the same amount of specimens having the same composition as the second immunization in each group 2 weeks after the first immunization.
  • the third immunization was performed in the same manner on the second week after the second immunization, and then a sample was collected on the second week.
  • the administration of a vaccine is performed 3 times in total, it is thought that the same result is obtained even if it complete
  • Preparation of mouse nasal wash and serum Two weeks after the third immunization, nasal wash and serum were prepared, and RSV antigen-specific IgA and IgG were measured.
  • Literature Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T, Kubo I, Kido H.
  • Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen. J Immunol. 2006; 176: 1122-30 ) According to the method described, it was carried out as follows.
  • ELISA assay was performed by the following method. Each well of 96-well Nunc immunoplate (Nalgen Nunc International, New York, USA) was layered with 5 ng antigen protein of the same antigen used for immunization. Subsequently, 50 ⁇ L of 0.05M Carbonate-Bicarbonate (pH 9.6) was added, and a solidification reaction was performed at 4 ° C. overnight. Thereafter, the antigen solution was rinsed three times with a washing solution (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20).
  • Anti-mouse IgA Peroxidase or Anti-mouse IgG Peroxidase (Sigma.) was used as a secondary antibody, and color reaction was performed using TMB Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Maryland, USA). The reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 2 N H 2 SO 4 (Nacalai Tesque, Inc.) to each well, and the absorbance at 450 nm was measured with EnVision. 6). Results FIG.
  • FIG. 1 shows the amount of serum anti-RSV IgG antibody and the amount of anti-RSV IgA antibody in nasal lavage fluid when nasally ingested RSV mucosal vaccine with RSV ether split antigen and RSV-F protein antigen as antigen. Shown in 2 titers.
  • Fig. 2 shows the amount of anti-RSV IgG antibody in serum and the amount of anti-RSV IgA in nasal wash when nasally ingesting RSV-G protein antigen and antigen conjugated with G-protein antigen epitope peptide to HA.
  • Log 2 titer The amount of antigen administered per mouse (L) and large amount (H) are as shown in Table 1. As shown in FIGS.
  • the antibody titer tends to increase with any antigen as the antigen amount changes from L to H, but the best anti-RSV IgA antibody production of nasal wash in RSV-F protein And blood anti-RSV IgG antibody production was observed.
  • RSV ether split antigen and RSV-G protein antigen blood IgG antibodies were induced, but nasal washes hardly produced anti-RSV IgA antibodies. From these results, it was confirmed that the RSV antigen suitable for the SF-10 adjuvant is F protein. [Test 2]
  • RSV-F protein was used as the RSV antigen.
  • ⁇ Saline / RSV alone (Comparative Example 3) ⁇ RSV + CVP (Comparative Example 2) ⁇ RSV + SF-10F (Example 2) ⁇ RSV + AD vehicle (a) (Comparative Example 1)
  • RSV + SF-10 (Example 1) 1. Animals The same mice as in Test 1 were used. 2. Immunization In nasal administration of vaccines, mice were anesthetized with Somnopentyl (Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) (81.0 mg / kg) by administering 2 ⁇ L of each of the above 5 specimens to both sides on both sides and a total of 4 ⁇ L. Nasal administration was performed in both nasal cavities. Each group consists of 10 mice.
  • Immunization was carried out by nasal administration of the same amount of specimens having the same composition as the second immunization in each group 2 weeks after the first immunization.
  • the third immunization was performed in the same manner on the second week after the second immunization, and then a sample was collected on the second week.
  • the administration of a vaccine is performed 3 times in total, it is thought that the same result is obtained even if it complete
  • Preparation of mouse nasal rinse and serum The test was performed under the same conditions as in Test 1.
  • ELISA assay was performed by the following method. 96-well Nunc immunoplate (Nalgen Nunc International, New York, USA) RSV F protein 5 ng was solidified in each well and measured by the method described in Test 1. 7). Result 7-1. Antibody Production Enhancement Action The anti-RSV antibody induction results are shown in the lower part of FIG. 3 (anti-RSV IgA antibody in nasal wash) and the upper part of FIG. 3 (anti-RSV IgG antibody in blood). A summary of the results is as follows. (1) The antibody titer in the RSV + SF-10 (Example 1) administration group was 24.3 times higher for IgA and 12.1 times higher for IgG than RSV + AD vehicle (a) (Comparative Example 1).
  • the antibody titer in the RSV + SF-10 (Example 1) administration group was 21.1 times higher for IgA and 4.6 times higher for IgG than RSV + CVP (Comparative Example 2).
  • the antibody titer in the RSV + SF-10F (Example 2) administration group was 12.1 times higher for IgA and 18.4 times higher for IgG than RSV + AD vehicle (a) (Comparative Example 1).
  • the antibody titer in the RSV + SF-10F (Example 2) administration group was 10.6 times higher for IgA and 7.0 times higher for IgG than RSV + CVP (Comparative Example 2).
  • the antibody titer of RSV antigen alone was very low.
  • Serial dilution series solution (20, 60, 180, 540, 1620, 4820, 14580-fold dilution) of 50 ml was added to Sendai Virus Center) to make 100 mL, and this was added to the cells after reacting for 30 minutes at room temperature. It was.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 72 hours, then fixed with 10% formalin for 10 minutes, and stained with naphthol blue-black for 30 minutes.
  • the denatured cells were removed by washing with running water twice, the cells remaining on the plate were lysed with 100 mL (micro L) of 0.1 N NaOH, and the absorbance at 630 nm was measured to determine the end point of cell degeneration. 2.
  • the TCID 50 valence of virus, 1 x 10 3.7 , derived from RSV + SF-10 (Example 1), obtained by adding an IgA fraction collected from a mouse nasally administered with saline to a cell culture system
  • the IgA fraction had a TCID value of 50 and 1 x 10 2.7 , and the virus value decreased to 1/10.
  • almost the same value was obtained for the sample derived from RSV + SF-10F of Example 2. From the above results, it was confirmed that the nasal lavage fluid induced by the composition of the present invention (mucosal vaccine RSV + SF-10 and RSV + SF-10F) showed an RSV neutralizing activity and exhibited an infection protective effect.

Abstract

KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル、カルボキシビニルポリマーおよびRSV抗原を含む組成物を提供する。この組成物は、粘膜ワクチンとして、従来の粘膜ワクチンよりもさらに強い抗体産生能を有し、その結果として極めて少量のRSV抗原量で鼻洗浄液と血清にそれぞれ優れた抗ウイルス抗原特異的IgA抗体とIgG抗体の誘導効果を発揮することができる。

Description

RSV粘膜ワクチン
　この発明は、RSVに対して粘膜免疫IgAと血中免疫IgGを効果的に誘導する医薬組成物、具体的にはRSV粘膜ワクチンであり、好ましくは経鼻用のRSV粘膜ワクチンに関するものである。
　特許文献１および２には、従来の不活化ワクチンやトキソイド等における欠点、粘膜ワクチンおよび免疫アジュバントの開発に関する現状等が詳細に記載されている。
　これら特許文献１、２に記載のとおり、皮下や筋肉内等へ接種する従来ワクチンから、ウイルスの自然感染ルートである粘膜においてIgA抗体の産生を誘導する粘膜ワクチンへの切り替えの必要性は、広くかつ深く認識されている。特に、２１世紀における次世代ワクチンとしては、IgA抗体の産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する、いわゆる粘膜ワクチンの開発と実用化が全世界で待望されてはいるが、未だ達成されていない。
　本願発明者らはこのような課題に対して、(1)肺サーファクタントプロテインＢおよび／または肺サーファクタントプロテインＣと脂質との複合体である抗原薬物（ＡＤ）ビークル、並びに(2)このADビークルと抗原とからなる粘膜ワクチンを発明し、特許出願している（特許文献１）。さらに本願発明者らは、ADビークル量（Ｖ）と抗原量（Ａ）との重量比Ｖ／Ａの調節によって、IgA抗体の選択的産生とIgA及びIgG両抗体産生とが変換可能であることを見出し、これを作用機序とする粘膜ワクチンを特許出願している（特許文献２）。またこれらの特許文献１、２は、肺サーファクタントプロテインＢおよびＣの断片（ペプチド）の有効性についても開示している。
　さらに本願発明者らは、肺サーファクタントプロテイン断片の様々な変異体について抗体産生増強作用を検討した結果、特許文献１、２に開示された部分ペプチドよりもサイズの小さいペプチドであるにもかかわらず、抗体産生の強い誘導あるいは増強作用、特に、分泌型IgA抗体の単独産生、また、分泌型IgAと血中IgGの両抗体産生の優れて効果的な誘導作用を有する合成ペプチドKnLm（ただしnは4-8、mは11-20）と脂質を成分とするADビークル(以下、「ADビークル(a)」と略す)と、このADビークル（a）と抗原とからなる粘膜ワクチンを発明し、特許出願している（特許文献３）。
上記特許文献１～３に記載の発明は、汎用性を有する粘膜ワクチンに関するものであるが、実施例に記載されているようにインフルエンザウイルスを用いて検証されたものである。
　一方、粘膜ワクチンはインフルエンザウイルス以外の他の呼吸器疾患原因ウイルスでも検討されてきた。中でもRSVはかぜ症候群の主要な原因ウイルスの一つであり、生涯に何度も感染することから免疫獲得の難しいウイルスの１つである。
　RSV感染は乳幼児、高齢者、免疫不全患者に細気管支炎、肺炎を引き起こし、特に乳幼児の初感染においては 30%程度が下気道炎に至る。そのうち１～３%が重症化して入院治療を要することからワクチンの登場が切望されている。
　RSVはパラミクソウイルス科に属するRNAウイルスで、大きくサブタイプAとサブタイプBに分けられる。ウイルス表面には宿主細胞との融合に重要なFタンパク（非特許文献１）、宿主細胞への接着に関与するGタンパク（非特許文献１）、SHタンパクが存在することが知られている。したがって、ウイルスの全粒子やこれらの蛋白質を抗原とした多くのRSV ワクチンが研究されてきた。
　通常、ウイルスワクチンにおいて最初に試みられるのはホルマリン不活化ワクチンである。インフルエンザウイルスではこの方法で十分なワクチン効果が得られたため、ホルマリン不活化ワクチンは長く利用されてきた。
　RSVにおいても1960年代にホルマリン不活化ワクチンが試みられたが、インフルエンザウイルスの場合とは異なり、RSVにおいてはワクチン効果が得られないばかりか、乳幼児で逆に重篤な副作用引き起こした。（非特許文献２）
　それ以降、RSVワクチンにおいてはウイルス構成成分の一部とアジュバントを混合したスプリットワクチンの研究が行われるようになった（特許文献４、特許文献５）。現在に至るまでRSVワクチン開発の試みは、感染防御能のある抗原を特定する試みと、有効なアジュバントの開発、ワクチン接種法についての開発が実施されてきた。これまでに、新規不活性化法による感染防御抗体誘導の報告(非特許文献３)、RSVの膜融合Fタンパクが抗原として有効であるとの報告(非特許文献４)、RSVのGタンパクが抗原として有効であるとの報告(非特許文献５)があり、ワクチンとしての抗原投与方法の違い、添加するアジュバントと抗原の組み合わせの違いにより、種々の結果が出ている現状である。しかしながら依然としてワクチン効果が不十分、もしくは副作用によって現在までに承認及び販売されたRSVワクチンは存在しない。
国際公開WO 2005/097182号公報 国際公開WO 2007/018152号公報 国際公開WO 2009/123119号公報 国際公開WO2004/083251 公報 国際公開WO1995/027787公報 Biochem. Biophys. Res. Commun. 366 (2), 308-313 (2008) Am J Epidemiol. 1969 Apr;89 (4):422-34. PLoS one. 6(7), e21823, 1-14 (2011) Future Microbiol. 5, 585-602 (2010)) J. Virol. Doi:10.1128/JVI.01162-12 (2012))
　過去および現在臨床開発が行われているほとんどのRSVワクチンは経皮注射ワクチンであるため、血液中にIgGを誘導することはできるものの、粘膜上でウイルスの感染防御に重要な役割を果たすIgA抗体を誘導することができない。
　一方、特許文献５はアジュバントとして弱毒化コレラ毒素を用いた経鼻RSVワクチンであり、鼻腔粘膜中にIgAを誘導することができる。しかし細菌毒素を用いた経鼻ワクチンは顔面麻痺の副作用が懸念される（The New England Journal of Medicine 2004; 350:896-903）。したがって安全な経鼻ワクチンには代替アジュバントが必須である。
　また一般的に従来の粘膜型ワクチンは経皮注射ワクチンよりも多量の抗原を必要とし、生産効率が悪いという問題もある。
　本願発明は、RSVにおいて従来の経皮注射ワクチンと同等のIgG誘導効果に加え、RSV感染防止効果が期待されるIgAを鼻腔中に誘導し、かつ顔面麻痺のような副作用の懸念がない、安全でRSV感染防御に優れた効果を発揮するワクチンの提供を課題とする。
　本願発明は、特許文献３に記載されたADビークル(a)をRSV抗原に適用した場合の粘膜ワクチンよりもさらに強い抗体産生能を有し、その結果として経皮注射ワクチンに匹敵するような少量の抗原の経鼻投与で血液と粘膜に優れた感染抑制効果を発揮することのできる改良型RSV粘膜ワクチンを提供することを課題とする。
　本願発明者らは、特許文献３に記載されたADビークル(a)をRSV抗原に適用した場合の粘膜ワクチンの抗体誘導をさらに増強する手段として、インフルエンザウイルス抗原を用いた点鼻薬や粘膜適用型ワクチンに使用されているゲル化剤であるカルボキシビニルポリマー（以下、CVPと略す）が、ADビークルに働いて抗原提示細胞に運ばれる抗原量を増加させ、粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを誘導する効果を有することを確認し、本願発明を完成させた。
　すなわち、本願発明は、以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル(以下、ADビークル（a）と略す)；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）RSV抗原
を含む組成物である。具体的には、(a)～（ｃ）を含む医薬組成物であり、好ましくはRSV粘膜ワクチンであり、より好ましくは経鼻用のRSV粘膜ワクチンである。
　本願発明の組成物においてRSV抗原（c）は、さらに、ADビークル（a）との組合せ、またはカルボキシビニルポリマー（b）との組合せによっても効果的な感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量である。
　この組成物における一つの態様において、前記の合成ペプチドは配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドであり、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　またこの組成物における別の態様において、脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の少なくとも１種である。さらに具体的には、脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸の３種脂質混合物である。
　この組成物におけるRSV抗原は、RSVの全粒子、弱毒株全粒子、全粒子をスプリット化したもの、Fタンパク、Gタンパク、SHタンパク、Nタンパク、Pタンパク、M2-1タンパク、M2-2タンパク、Lタンパク、Mタンパク、NS1タンパク、若しくはNS2タンパク、又は、それらの組み合わせやそれらを含む混合物のRSV全粒子であり、特に好ましくはRSV-Fタンパクである。
　さらには、各タンパクについて変異の導入、欠失、部分配列の挿入、置換など遺伝子工学的に改変したもの、さらには各タンパクの部分配列、異なるタンパクとのキメラを含む。好ましくは、Ｆタンパクを遺伝子工学的に改変したもの、またはFタンパクの少なくとも一部を含むキメラである。
　また、RSV-Fタンパクを抗原とする場合の組成物の製造法としては、RSV-FタンパクとADビークルとの混合物を凍結乾燥または超音波処理したのち、カルボキシビニルポリマーと混合する方法が好ましい。
　本願発明において、「効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgG」とは、例えば、RSV細胞感染系において、ウイルス増殖を抑制する量のIgAおよびIgGである。
　なお、以下の説明において、前記本願発明の組成（a）で示す合成ペプチドと脂質とからなる組成物を「ADビークル(a)」と記載し、このADビークル(a)と前記RSV抗原とからなる粘膜ワクチンを「RSV＋ADビークル」と記載し、RSV抗原とCVPからなる粘膜ワクチンを「RSV＋CVP」と記載することがある。また、ADビークル(a)とCVPとRSV抗原とからなる本願発明の組成物を「RSV＋ADビークル＋CVP」と記載することがある。さらに、本願発明の組成物は「RSV粘膜ワクチン」またはRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」と記載することがある。
　本願発明のRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」は、RSV抗原特異的IgAおよびIgG抗体の極めて強い誘導効果と、誘導された抗体のRSV細胞感染系におけるウイルス増殖抑制効果を有している。これらの効果は、特許文献３の粘膜ワクチンをRSV抗原に適用したRSV＋ADビークルの効果や、米国特許US 5,158,761公報のCVPをRSV抗原に適用したRSV＋CVPの効果からは予期しえないほどの極めて顕著である。
　例えば、試験例１に示したように、「RSV＋ADビークル」は十分な抗体産生誘導を示さないが、本願発明のRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」は、「RSV＋ADビークル」に比較して、IgA産生量で24.3倍、IgG産生量で12.1倍の抗体価を示す。また、本願発明のRSV＋ADビークル＋CVPは、RSV＋CVPと比較して、IgA生産量で21.1倍、IgG生産量で4.6倍の抗体価を示す。
　このような強い抗体誘導能から、従来の粘膜ワクチンでは得ることのできない感染防御効果が達成される。
　なお、本願発明の粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」に含まれるADビークル（a）とCVP自身には、抗原認識細胞刺激効果は無いことが確認されている。そのため、本願発明の粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」を投与した場合、RSV抗原以外の抗原による予期しない副作用、例えば自己免疫疾患、ワクチン接種後のアレルギーの増悪等の起きる可能性は極めて低いと考えられる。
試験１の結果であり、エーテルスプリットRSV抗原とFタンパクを抗原としてマウスに経鼻投与した場合の、鼻洗浄液IgA量と血清IgG量を示す。図中のL、Ｈは、表１に記載してある抗原タンパク量の少量(L)と大量(H)を示し、Ｌ+ SF-10、H + SF-10は、それぞれの抗原量（L、H）にADビークルを加えた後に凍結乾燥し、最後に上記のCVPを添加したものを、それぞれ示している。血清の抗RSV ＩｇＧ抗体のタイターを左に、鼻洗浄液の抗RSV IgA 抗体のタイターを右に示す。それぞれ１０匹の結果である。 試験１の結果であり、RSV－Gタンパクと、RSV－ＧタンパクエピトープペプチドのHAコンジュゲートを抗原にしてマウスに経鼻投与した場合の、各群１０匹における鼻洗浄液IgA量と血清IgG量を示す。図中のL、Ｈは、表１に記載してある抗原タンパク量の少量(L)と大量(H)を示し、Ｌ+SF-10、H +SF-10は、それぞれの抗原量（L、H）にADビークルを加えた後に凍結乾燥し、最後に上記のCVPを添加したものを、それぞれ示している。血清の抗RSV ＩｇＧ抗体のタイターを左に、鼻洗浄液の抗RSV IgA 抗体のタイターを右に示す。上段（３）には、RSV-Gタンパクの抗原エピトープアミノ酸のHAコンジュゲートの例を、下段（４）にはRSV-Gタンパクを抗原にした場合を示す。抗原量（L、H）にADビークルを加えた実験系をL(H)+ADvと記載し、L(H)+CVP、L(H)+ADv+CVPをL(H)+SF-10としてそれぞれ表記した。 試験２の結果であり、各検体をマウスに経鼻投与した場合の、鼻洗浄液IgA量（下）と血清IgG量（上）を示す。
　本願発明のRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」は以下の組成からなる。
合成ペプチド
　KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドである。このKnLmはN末側のn個のK（Lys）残基とC末側のm個のL残基が連続している。このような合成ペプチドは、例えば以下のいずれかのペプチドである。なお、括弧内はペプチドの略号である。またアミノ酸残基は１文字記号で示している。
配列番号１（K6L16）:KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL
配列番号2（K6L11）:KKKKKKLLLLLLLLLLL
　配列番号１（K6L16）は、N末側の6個のK（Lys）残基とC末側の16個のL残基（Leu）とからなり、配列番号２（K6L11）は、N末側の6個のK（Lys）残基とC末側の11個のL（Leu）残基とからなる。これらの合成ペプチドは、公知の化学合成法に従って調製された、純度95%以上のものを使用することが好ましい。
脂質
　リン脂質としては、肺サーファクタントが含有するリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の使用が望ましい。その他、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン等を用いることができる。また、脂肪酸としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸等を用いることができる。更に、肺の膨張が活発なクジラ、イルカ等の水棲動物に由来の脂質を用いることができる。
カルボキシビニルポリマー（CVP）
　CVPはアクリル酸を主成分として重合して得られる親水性ポリマーであり、ハイビスワコー103、ハイビスワコー104、ハイビスワコー105、Sigma社製のpAA130（Sigma, St. Louis, MO, Cat No. 181293）、pAA450（Sigma, Cat No.181285）、pAA1250（Sigma, Cat No.306215）などの市販品を用いることができる。中でも化粧品や医薬品用ゲルの作製に汎用されているハイビスワコー104、Sigma社製のpAA130、pAA1250が好ましい。CVPを純水あるいは生理食塩水で超音波処理下に0.2-2.0重量%溶解液を作製した後、NaOH中和液でpH5.0-10.5の作製が可能であるが、RSV抗原の安定性に影響しないpHを選択することが好ましい。例えば、RSV抗原の場合では、pH6.8-8.0、好ましくはpH7.0-7.2に調整する。
抗原
　RSV抗原としては、全粒子、弱毒株全粒子（国際公開 WO2010/053883 公報（ワイス、弱毒株））、全粒子をスプリット化したもの、Fタンパク（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (24), 7683-7687 (1984)　（A2株 Fタンパク））、Gタンパク（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4075-4079 (1985)　（A2 株Gタンパク））、SHタンパク（Virology 141 (2), 283-291 (1985)（A2株 SHタンパク））、Nタンパク（Virology 146 (1), 69-77 (1985)（A2株 Nタンパク））、Pタンパク（J. Virol. 52 (3), 991-994 (1984)（A2株 Pタンパク））、M2-1タンパク、M2-2タンパク（J. Virol. 55 (1), 101-110 (1985)（A2株 M2-1、M2-2タンパク））、Lタンパク（Virology 183 (1), 273-287 (1991)（A2株 Lタンパク））、Mタンパク（J. Virol. 50 (1), 92-99 (1984)（A2株 Mタンパク））、NS1タンパク、若しくはNS2タンパク（Virology 143 (2), 442-451 (1985)（A2 株 NS1タンパク、NS2タンパク））、又は、それらの組み合わせやそれらを含む混合物のRSV全粒子が挙げられる。特に好ましくは、RSV-Fタンパクである。
　また、各タンパクについて、変異の導入、欠失、部分配列の挿入、置換など遺伝子工学的に改変したもの（国際公開 WO2010/077717 公報（Novavax ♯683 を含む出願）、国際公開 WO2009/079796 公報（ID Bio Medical、Pre　Form 固定化改変F）、国際公開 WO2010/075491 公報（Rochester 大学、F抗原自己フォールディング中和抗体エピトープ）、国際公開 WO2010/149745 公報（GSK, 三量体促進化改変Fタンパク）、国際公開 WO2010/039224 公報（マサチューセッツ医科大学、RSV改変タンパクとVLP）、国際公開 WO2010/059689 公報（LYGOCYTE、FタンパクVLP）、国際公開 WO2009/000433公報 （PEVION virosome）、米国 US2010111989 公報 （PEVION 改変 Fタンパク）、米国 US20080003236 公報（米国保健福祉省、GENVEC ベクタ ＋ RSV）、国際公開 WO2010/057650 公報（Bavarian Nordic、Vaccinia ベクタ ＋ RSV-F）、国際公開 WO2008110627 公報（ピエールファブレメディカモン、RSV マイクロカプセル）、Vaccine 28 (34), 5543-5550 (2010) (Groningen 大学、Virosome)、Vaccine 20 (29-30), 3436-3442 (2002) （Siena大学、Virosome）、Vaccine 27 (46), 6415-6419 (2009) (EPFL、Virosome)、Vaccine 25, 7132-7144 (2007)（Alphavax、RSV-Fタンパク＋ replicon））が挙げられる。
　さらには、各タンパクの部分配列（前記特許文献９、米国 US2010/0172925 公報（NHRI、CTLエピトープ）、国際公開WO2011/017442 公報（米国保健福祉省、Gタンパクペプチド抗原）、国際公開 WO2011/050168 公報（米国保健福祉省、中和抗体エピトープ断片））、及び異なるタンパクとのキメラ（特許第3290662号（コノートラボラトリー、PIV & RSV キメラ）、特表2010-522540公報（ID Bio Medical、FGFキメラ）、国際公開 WO2011/046925 公報（TECHNO VAX、F & M1 & M2タンパクVLP）、国際公開 WO2010149743 公報（GSK、RSV＋PIV3＋MPV キメラ））などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｆタンパクと異なるタンパクのキメラである。
　また、これらの抗原はRSVサブタイプA以外の、例えば RSVサブタイプB（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (25), 13961-13966 (1997)（B1株全タンパク、cs mutant、ゲノム配列AF013254）、（B9320株全タンパク、ゲノム配列 AY353550））に由来するものであっても良い。さらに別の態様においては抗原はニューモウイルス亜科に属するウイルスに由来するものであっても良い(国際公開 WO2010149743 公報（GSK、RSV＋PIV3＋MPV キメラ）)。
　これらの抗原は、量的に特に制限されないが、それ単独、特にADビークル（a）との組合せまたはカルボキシビニルポリマー（CVP）との組合せによっても効果的な免疫誘導を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量を調製して使用することができる。
　次に、これらの材料からADビークル（a）および本願発明のRSV粘膜ワクチン（RSV＋ADビークル＋CVP）を調製する方法を説明する。
ADビークル(a)の調製
　前記の脂質のうちの幾つかを任意の割合で混合し、脂質量として、例えば10mg/mLの濃度となるようにクロロホルム：メタノール（２：１(v/v)）混合液に懸濁し、脂質成分とする。また、合成ペプチドは、例えば5.0mg/mL濃度となるようにエタノールに溶解する。次いで、この脂質成分と合成ペプチドとを混合する。混合比は、合成ペプチドが約0.2～約12.0乾燥重量%、脂質が約88～約99.8乾燥重量%である。この混合物をロータリーエバポレーターを用いて約40℃で乾固し、任意の濃度で１０%エタノールに再懸濁し、約45℃の水浴中で15分間程度振盪混和し、均一分散液を調製し、凍結乾燥する。この乾燥物は約４℃～－30℃で保存し、使用時にその都度、純水または生理食塩水を加えて懸濁したのち、超音波、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器等を用いて均一分散液とする。
RSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」の調製
　前記のADビークル(a)、CVPおよびRSV抗原を任意の割合で混合する。すなわち、RSVワクチンの場合、ワクチン中の抗原量（A）に対するADビークル(a)量（V）の乾燥重量比V/Aが所望の値になるよう、ワクチン原液にADビークル（a）液を添加混合し調製する。マウス１匹当たりに投与する抗原の乾燥重量（A）は約0.01～約100 μg/kg体重、好ましくは約0.03～約50.0 μg/kg体重である。
　このような抗原量において、IgA抗体産生を優先的かつ選択的に誘導するためのV/Aは、約0.1～約1.0が望ましい。また、IgA及びIgG両抗体産生を誘導するためのV/Aは、約1.0～約100、好ましくは約5～約20の範囲を採用できる。以上のとおりのV/Aにおいて、抗原の約60%以上がADビークルに結合し、それによって得られたRSV粘膜ワクチン（RSV＋ADビークル＋CVP）はIgA抗体産生及び／またはIgG抗体産生を効率的に誘導することができる。
　またCVPを加えた最終経鼻投与ワクチン液中のCVP濃度は約0.1%～1.0%、好ましくは0.3%～0.8%の割合である。ADビークル(a)、抗原、CVPを均一に混合するには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を用いることができる。
　なお、RSV粘膜ワクチンが有効な抗体誘導を引き起こすためには、用いる抗原の種類によって適した製造方法が異なる可能性があるが、RSV抗原として特に好ましいFタンパク（試験１）を用いる場合には、以下の超音波処理工程を含む製造法と凍結乾燥工程を含む製造法が推奨される。
　すなわち、超音波処理を含む方法では、下記実施例１に示したように、RSV-F抗原とADビークル(a)を混合した後、3分間超音波処理を行い、1%CVP生理食塩水溶液を等量加えて本願発明のRSV粘膜ワクチン（RSV＋ADビークル＋CVP）を製造することができる。この方法は、HAの代わりにRSV抗原を用いていること、CVPを添加することを除き、特許文献３に記載された方法と同一である。
　一方、凍結乾燥工程を含む方法は、実施例２に示したような以下の工程からなる製造方法である。
（1）ADビークル(a)と抗原とを水（純水）に懸濁
（2）加温と攪拌とを１回以上反復
（3）凍結乾燥
（4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製
（5）生理食塩水に溶解したCVP溶液の添加
　この方法は後記試験１に示したように、超音波処理を用いて製造した場合と同様に高い抗原特異的なIgAおよびIgGの産生を可能とする、優れた方法である。
　調製したRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」は、１回の投与で使用することもできるが、２回投与（初回免疫と２次免疫）または３回投与（初回免疫、２次免疫、３次免疫）として使用することが好ましい。このような複数回の免疫処置により、IgAおよびIgGの抗体価を著しく増加させることができる。なお、２回または３回のワクチン投与は、1週間から3週間、好ましくは約2週間の間隔で行うようにする。さらに、本願発明のRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」の投与経路は、鼻腔のほか、口腔内や膣腔への投与も可能である（例えば、Lubrizol Pharmaceutical Bulletin, Polymers for Pharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc. 2008）。
　以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
[超音波処理工程を含むRSV粘膜ワクチンの製造例]
　まず、以下のとおりにADビークル(a)を調製した。
　ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ホスファチジルグリセロール(PG)、パルミチン酸(PA)を75:25:10 (w/w/w) の割合で混合し、リン脂質量として10 mg/mLの濃度になるようにクロロホルム:メタノール (2:1 (v/v))混合液に懸濁し、脂質成分とした。また純度95%以上の合成ペプチドK6L16（KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL：配列番号１)（GenScript社製)を5.0 mg/mLになるようにメタノールに溶解した。脂質成分（DPPC:PG:PA = 75:25:10, w/w/w）溶液とK6L16ペプチド溶液を重量比として、リン脂質成分：K6L16= 100: 2となるように混合し、ロータリーエバポレーターを用いて40℃で乾固した。これをリン脂質量として4 mg/mLとなるように、10%エタノールに再懸濁し、45℃の水浴中で15分間振盪混和し、均一分散液を調製した。これを凍結乾燥して、ADビークル(a)として４℃～-30℃で保存した。
　次に、前記のADビークル(a)を用いてRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」を以下のとおりに調製した。
　凍結乾燥したADビークル(a)は用時に生理食塩水に懸濁して用いた。以下の方法にて調製したRSV-Fタンパクを抗原として用いた。配列番号３の塩基配列からなるDNAをカイコ幼虫-バキュロウイルス発現系にて発現させ（旧　片倉工業株式会社、現　シスメックス株式会社）、抗FLAG抗体アフィニティゲル(Sigma-Aldrich Co. LLC.)にて精製して配列番号４のアミノ酸配列からなるRSV-Fタンパクを得た。DCプロテインアッセイ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）にて測定した抗原溶液のタンパク濃度は2.03mg/mLであった。
　RSV-F抗原とADビークルの混合量は、抗原溶液のタンパク量（A）に対するADビークル(a)溶液のリン脂質量（V）の量比V/A＝8となるように混合し、超音波処理 を30秒間隔でオンとオフを３回繰り返し、合計90秒のオンと90秒のオフの合計3分間の超音波処理 (Handy sonic model UR-20P、TOMY SEIKO Co., LTD)を行い、生理食塩水に溶解し、中性に調整した1% CVP（ハイビスワコー104）を最終濃度で0.5%になるように加えた。すなわち、マウス一匹当たり、片鼻2 μLを両鼻に投与する合計4 μLに含まれる組成は、RSV抗原タンパク量/ADビークル(a)溶液のリン脂質量/CVP重量＝1.0 μg/8.0 μg/20 μgとなる。
　以下、この超音波処理工程を含む方法で製造したRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」を「RSV＋SF-10」と記載する。なお、SF-10量は、前記のとおりADビークル(a)（8.0μg）＋CVP（20 μg）＝28 μgであるが、下記の説明ではアジュバントのビークル作用の基本骨格となるADビークル(a)のリン脂質量で表記して、SF-10（8.0μg）と標記する。他の実施例におけるSF-10量もCVP量を除いた値で記載する。
[凍結乾燥工程を含むによるRSV粘膜ワクチンの製造例]
　実施例１と同様のRSV-Fタンパク液に、凍結乾燥したADビークル(a)粉末を純水に溶解して混合調製した。この懸濁液を、ウォーターバスを用いて10分間42℃に加温処理し、加温処理中3分、7分時にミキサーで10秒間攪拌して液を均一化にした。加温処理後、懸濁液を-20℃～-75℃で一晩凍結させ、凍結乾燥を行って乾燥粉末体を作製した。凍結乾燥粉末は４℃～-30℃で保存した。用時に凍結乾燥粉末を、あらかじめ生理食塩水に溶解した0.5% CVP液で泡立たないように軽く攪拌、溶解してRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」とした。マウス１匹当たり片鼻2μLを両鼻に投与する合計4μLに含まれるRSV抗原タンパク量は1.0 μg、ADビークル(a)のリン脂質量は8.0 μgである。以下、この凍結乾燥工程を含む方法で製造したRSV粘膜ワクチン「RSV＋ADビークル＋CVP」をRSV＋SF-10Fと記載する。
[比較例１]
　粘膜ワクチン（RSV＋ADビークル(a)）を調製した。RSV-FタンパクおよびADビークル(a)は実施例１と同一のものを使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じ、最後に1% CVP（ハイビスワコー104）を最終濃度で0.5%になるように加える代わりに、等容量の生理食塩水を加えた。RSVF抗原タンパク量は1.0μg、ADビークル(a)量は8.0.μgである。
[比較例２]
　粘膜ワクチン（RSV＋CVP）を調製した。RSV-Fタンパクを純水で希釈し、等量の1% CVP（ハイビスワコー104）を加えた。RSV-Fタンパク量は1.0μg、ADビークル(a)量は8.0.μgで、CVPは最終濃度0.5%である。
[比較例３]
　RSV-Fタンパクを生理食塩水で希釈して、ワクチンとして使用した。１匹当たりのRSV-Fタンパク投与量は1.0 μgである。
[比較例４]
　8.0.μgのADビークル(a)に1% CVP（ハイビスワコー104）を最終濃度で0.5%になるように加え、SF-10を調整した。
 
[試験１]
　マウスを用いて、各種RSV抗原を用いたＡＤビークルによる経鼻粘膜ワクチンの抗体産生増強作用を試験した。
１．粘膜ワクチン
　表１に示す４種のウイルス抗原： RSVエーテルスプリット、RSV-Fタンパク（分泌型）、RSV-Gタンパク（分泌型）、RSV-Gタンパクのエピトープ部分配列（GenBank/CAA51765の第156－175アミノ酸配列)のそれぞれにオブアルブミン(OVA)、牛血清アルブミン(BSA)、インフルエンザハマグルチニン (HA)をコンジュゲートした抗原を、マウス１匹当たりの経鼻接種抗原量を少量(L)、大量(H)として、表１に示すADビークルとの混合比で混合して、実施例２に記載の凍結乾燥方法にてRSV粘膜ワクチンを調整後、比較例１の方法で最終調整を行い、マウスに経鼻接種した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ２．動物
　6-8週齢、BALB/c雌マウスを日本チャールズリバーから購入して用いた。全ての動物実験はアステラス製薬筑波研究センターの動物実験施設で行われ、アステラス製薬動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
３．免疫法
　ワクチンの経鼻投与においては、上記１の４種の粘膜ワクチンを、片鼻に2μLづつを両側に投与して、合計4μLをソムノペンチル（共立製薬株式会社）(81.0 mg/kg)で麻酔したマウスの両側鼻腔に点鼻投与した。検定には抗原量を少量(L)、大量(H)の２種類で実施した。各群は１０匹のマウスから成る。なお、抗原量（L、H）は表1に示したとおりである。
　免疫は初回免疫後２週目に同様の組成からなる検体を、それぞれの群に２次免疫として同量経鼻投与した。２次免疫後２週目に同様な方法で３次免疫を行い、その後２週目に検体を採取した。なお、ワクチンの投与は合計３回おこなっているが、２次免疫で終了してもほぼ同様の結果が得られるものと考えられる。
４．マウス鼻腔洗浄液および血清の調製
　3次免疫後2週間目のマウスの、鼻腔洗浄液および血清を調製して、RSV抗原特異的なIgA、IgGの測定を行った。文献（Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T, Kubo I, Kido H. Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen. J Immunol. 2006;176 :1122-30）記載の方法に準じて、以下のとおりに行った。
　ワクチン投与マウスをソムノペンチル麻酔下で開腹開胸し、気管を切開しアトム静脈カテーテル節付3 Fr（アトムメディカル株式会社　日本・東京）鼻腔方向へ挿入し、1 mLの0.1% BSAを含む生理食塩水を注入し、鼻から出てきた液を採取した。この液を鼻洗浄液として用いた。さらに、眼窩もしくは腹部大静脈、あるいは心臓より採血を行い、遠心分離により血清を調製した。
５．抗RSV抗体価の測定
　鼻洗浄液の抗RSV抗原IgA抗体含有量および血清中の抗RSV抗原IgG抗体含有量は、ELISA assayにより定量した。
　ELISA assayは、以下の方法で行った。96ウェルNuncイムノプレート（Nalgen Nunc International アメリカ・ニューヨーク）各ウェルに、免疫に用いた抗原と同じものを抗原タンパク5ng個層化した。次いで0.05M Carbonate-Bicarbonate(pH 9.6) 50μLを加え、4℃で一晩固層化反応を行った。その後洗浄液（25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20）で3回すすぎ抗原液を除去した。各ウェルに0.15 M NaCl、1% BSAを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.6）200μLを加え、室温で1時間ブロッキング反応を行った。各ウェルを洗浄液で3回すすいだのち、サンプル結合緩衝液（50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 7.6）にて適量に希釈した鼻洗浄液あるいは血清を50μL加え、室温で1時間反応させた。 Anti-mouse IgA PeroxidaseまたはAnti-mouse IgG Peroxidase （Sigma.）を二次抗体として用い、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. アメリカ・メリーランド）を用いて発色反応を行った。各ウェルに50μL、2 N H2SO4（ナカライテスク株式会社）を添加することによって反応を停止し、450 nmの吸光度をEnVisionで測定した。
６．結果
　図１には、RSVエーテルスプリット抗原、RSV-Fタンパク抗原を抗原とするRSV粘膜ワクチンを経鼻摂取した時の、血清の抗RSV IgG抗体量および鼻洗浄液の抗RSV ＩｇＡ抗体量を、Log 2タイターで示している。図２には、RSV-Gタンパク抗原と、G-タンパク抗原エピトープペプチドをHAにコンジュゲートした抗原を経鼻摂取した時の、血清の抗RSV IgG抗体量、および鼻洗浄液の抗RSV ＩｇＡ量を、Log 2 タイターで示している。なお、マウス１匹当たりに投与した抗原量の少量(L)、大量(H)は表１に記載のとおりである。
　図１および２に示すように、抗原量がLからHに変化することで、いずれの抗原でも抗体価は上昇傾向を示すが、RSV-Fタンパクにおいて最も優れた鼻洗浄液の抗RSV ＩｇＡ抗体産生と血液の抗RSV ＩｇG抗体産生が観察された。RSVエーテルスプリット抗原、RSV-Gタンパク抗原の場合、血液のIgG抗体の誘導は起きるが、鼻洗浄液の抗RSV ＩｇＡ抗体産生が起きにくかった。これらの結果から、SF-10アジュバントに適したRSV抗原はFタンパクであることが確認された。

[試験２]
　以下の検体について、抗体産生増強効果を試験した。なお、RSV抗原としてはRSV-Fタンパクを用いた。
・生理食塩水
・RSV単独（比較例３）
・RSV＋CVP（比較例２）
・RSV＋SF-10F（実施例２）
・RSV＋ADビークル(a)（比較例１）
・RSV＋SF-10（実施例１）
１．動物
　試験１と同様のマウスを使用した。
２．免疫法
　ワクチンの経鼻投与においては、上記５種の検体を、片鼻に2μLづつを両側に投与して、合計4μLをソムノペンチル（共立製薬株式会社）(81.0 mg/kg)で麻酔したマウスの両側鼻腔に点鼻投与した。各群は１０匹のマウスから成る。
　免疫は初回免疫後２週目に同様の組成からなる検体を、それぞれの群に２次免疫として同量経鼻投与した。２次免疫後２週目に同様な方法で３次免疫を行い、その後２週目に検体を採取した。なお、ワクチンの投与は合計３回おこなっているが、２次免疫で終了してもほぼ同様の結果が得られるものと考えられる。
３．マウス鼻腔洗浄液および血清の調製
　試験１の方法と同様な条件で実施した。
４．抗RSV-F抗体価の測定
　鼻洗浄液の抗RSV-F IgA含有量および血清中の抗RSV-F IgG含有量は、ELISA assayにより定量した。
　ELISA assayは、以下の方法で行った。96ウェルNuncイムノプレート（Nalgen Nunc International アメリカ・ニューヨーク）各ウェルにRSV Fタンパク 5 ngを固層化して、試験１に記載している方法で測定した。
 
７．結果
７－１．抗体産生増強作用
　抗RSV抗体の誘導結果を、図３の下段（鼻洗浄液中の抗RSV IgA抗体）、および図３の上段（血液中の抗RSV IgG抗体）に示す。結果の要約は以下のとおりである。
（1）RSV＋SF-10（実施例１）投与群における抗体価は、RSV＋ADビークル(a)（比較例１）よりもIgAで24.3倍、IgGで12.1倍高かった。
（2）RSV＋SF-10（実施例１）投与群における抗体価は、RSV＋CVP（比較例２）よりもIgAで21.1倍、IgGで4.6倍高かった。
（3）RSV＋SF-10F（実施例２）投与群における抗体価は、RSV＋ADビークル(a)（比較例１）よりもIgAで12.1倍、IgGで18.4倍高かった。
（4）RSV＋SF-10F（実施例２）投与群における抗体価は、RSV＋CVP（比較例２）よりもIgAで10.6倍、IgGで7.0倍高かった。
（5）RSV抗原単独（比較例３）の抗体価は、非常に低いものであった。
　RSV＋SF-10やRSV＋SF-10Fにおけるこのような顕著に優れた抗体誘導効果は、RSV抗原単独を用いた場合には認められず、特許文献３において公知のADビークル(a)と、米国特許US5,158,761において公知のCVPとの単純な組合わせをRSV抗原に適用することから予測される範囲を遙かに超えるものであった。またSF-10とRSV Fタンパクとの組み合わせからなる組成物の製造には凍結乾燥と超音波処理が共に使用できることが判明した。
[試験３]
　以下の検体について、鼻腔洗浄液中の抗RSV IgA抗体のウイルス中和活性を試験した。なお、RSV抗原としてはRSV-Fタンパクを用いた。また、使用した動物、免疫法および鼻腔洗浄液の調製は試験２と同様に行った。
・生理食塩水
・RSV＋SF-10（実施例１）
１．中和活性の測定
　鼻腔洗浄液の抗RSV-F IgA抗体のウイルス中和活性は、中和されたウイルス力価の変動を50%細胞変性終末点 (TCID50 法 、Reed LJ & Muench H. Am J Hygiene 27: 493-497, 1938)　法 にて測定した。RSVに適合したTCID50の迅速な簡易測定法としてKaul TN等の方法 (Laul TN, Welliver RC, Ogra PL. J Cin Microbiol 13(5): 957-962, 1981) と naphthol blue-black を用いたイメージング測定法 (Perricone MA, Saldate V, Hyde DM. Microsc Res Tech 31(3): 257-264, 1995) を組み合わせて、以下のとおりに測定した。96ウェルNuncイムノプレートにHEp-2細胞を2 × 105 細胞加え、一晩培養した。鼻腔洗浄液から予めKAPTIV-AETM IgA-affinity column (Tecnogen S.p.A., Piacenza, Italy) でIgA分画（全IgA) を部分精製して50 mg/50 mLに調整した検体に、RSV A臨床分離ウイルス株（仙台ウイルスセンターより供与）の段階希釈系列液 (20, 60, 180, 540, 1620, 4820, 14580 倍希釈) 50 mL を加えて100 mLとして、室温で30分間反応した後でこれを細胞に加えた。細胞を37°C の条件下で72時間培養した後、10%フォルマリンで細胞を10分間固定し、naphthol blue-blackにて細胞を30分間染色した。２回の流水洗浄で変性した細胞を除去して、プレートに残存する細胞を.1 N NaOH 100 mL(micro L)で溶解して630 nmの吸光度を測定して細胞変性終末点を測定した。
２．結果
　生理食塩水を経鼻投与したマウスから採取したIgA分画を細胞培養系に加えた条件で示すウイルスのTCID50 価、1 × 103.7が、RSV + SF-10 （実施例１）由来のIgA分画ではTCID50 価、1 × 102.7となり、ウイルス価は 1/10に減少した。データには示していないが、実施例２のRSV＋SF-10F由来の検体でもほぼ同様な値が得られた。以上の結果から、本願発明の組成物（粘膜ワクチンRSV＋SF-10およびRSV＋SF-10F）が誘導する鼻腔洗浄液にはRSV中和活性が認められ、感染防御効果を発揮することが確認された。

Claims (9)

  1. 以下の組成：
    （a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
    （b）カルボキシビニルポリマー；および
    （c）RSV抗原
    を含む組成物。
  2. 医薬組成物である請求項１記載の組成物。
  3. 粘膜ワクチンである請求項２記載の組成物。
  4. 経鼻用の粘膜ワクチンである請求項３記載の組成物。
  5. 合成ペプチドが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項１～４記載の組成物。
  6. 脂質が、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の少なくとも１種である請求項１～５記載の組成物。
  7. 脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸の３種脂質混合物である請求項６記載の組成物。
  8. RSV抗原が、RSV-Ｆタンパクである請求項1～７の組成物。
  9. 　RSV-FタンパクとADビークルとの混合物を凍結乾燥または超音波処理したのち、カルボキシビニルポリマーと混合して製造される請求項８記載の組成物。
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WO (1) WO2013031827A1 (ja)

Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0338529A (ja) * 1989-07-04 1991-02-19 Toko Yakuhin Kogyo Kk 鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチンゲル製剤
US5158761A (en) 1989-04-05 1992-10-27 Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Spray gel base and spray gel preparation using thereof
WO1995027787A1 (fr) 1994-04-06 1995-10-19 Pierre Fabre Medicament Fragment peptidique de la proteine g du virus respiratoire syncytial, agent immunogene, composition pharmaceutique le contenant et procede de preparation
WO2001017556A1 (fr) * 1999-09-07 2001-03-15 Shionogi & Co., Ltd. Préparations vaccinales administrables par les muqueuses
JP3290662B2 (ja) 1992-01-06 2002-06-10 コノート ラボラトリーズ リミテッド キメラ免疫原
WO2004083251A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
WO2005097182A1 (ja) 2004-04-05 2005-10-20 The University Of Tokushima 経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、これを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン及びｄｄｓ
WO2007018152A1 (ja) 2005-08-05 2007-02-15 The University Of Tokushima IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン
US20080003236A1 (en) 2004-10-18 2008-01-03 Genvec, Inc. Adenovirus fiber shaft composition and methods of use
WO2008110627A1 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Pierre Fabre Medicament Novel vaccine composition for the treatment of respiratory infectious diseases
WO2009000433A1 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Pevion Biotech Ag Virosomes comprising hemagglutinin derived from an influenza virus produced in a cell line, compositions, methods of manufacturing, use thereof
WO2009079796A1 (en) 2007-12-24 2009-07-02 Id Biomedical Corporation Of Quebec Recombinant rsv antigens
WO2009123119A1 (ja) 2008-04-02 2009-10-08 国立大学法人徳島大学 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン
WO2010039224A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 University Of Massachusetts Medical School Respiratory syncytial virus (rsv) sequences for protein expression and vaccines
US20100111989A1 (en) 2006-12-21 2010-05-06 Pevion Biotech Ag Rsv f-protein and its use
WO2010053883A1 (en) 2008-11-05 2010-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Live, attentuated respiratory syncytial virus
WO2010059689A2 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Rsv f vlps and methods of manufacture and use thereof
WO2010057650A1 (en) 2008-11-21 2010-05-27 Bavarian Nordic A/S Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences
WO2010075491A2 (en) 2008-12-24 2010-07-01 University Of Rochester Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins
JP2010522540A (ja) 2007-03-21 2010-07-08 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック キメラ抗原
US20100172925A1 (en) 2009-01-04 2010-07-08 National Health Research Institutes Hla-a2-restricted t-cell epitopes of the respiratory syncytial virus fusion protein as peptide-based vaccines
WO2010077717A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Novavax, Inc. Modified rsv f proteins and methods of their use
WO2010149743A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
WO2010149745A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Recombinant rsv antigens
WO2011017442A2 (en) 2009-08-04 2011-02-10 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Anti-rsv immunogens and methods of immunization
WO2011046925A1 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Technovax, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) virus-like particles (vlps)
WO2011050168A2 (en) 2009-10-21 2011-04-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof
WO2011108521A1 (ja) * 2010-03-02 2011-09-09 国立大学法人徳島大学 粘膜ワクチン

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2413961B1 (en) * 2009-03-31 2016-08-17 Japan As Represented By The Director-General Of National Institute Of Infectious Diseases Method for prophylaxis of influenza using vaccine for intranasal administration

Patent Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5158761A (en) 1989-04-05 1992-10-27 Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Spray gel base and spray gel preparation using thereof
JPH0338529A (ja) * 1989-07-04 1991-02-19 Toko Yakuhin Kogyo Kk 鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチンゲル製剤
JP3290662B2 (ja) 1992-01-06 2002-06-10 コノート ラボラトリーズ リミテッド キメラ免疫原
WO1995027787A1 (fr) 1994-04-06 1995-10-19 Pierre Fabre Medicament Fragment peptidique de la proteine g du virus respiratoire syncytial, agent immunogene, composition pharmaceutique le contenant et procede de preparation
WO2001017556A1 (fr) * 1999-09-07 2001-03-15 Shionogi & Co., Ltd. Préparations vaccinales administrables par les muqueuses
WO2004083251A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
WO2005097182A1 (ja) 2004-04-05 2005-10-20 The University Of Tokushima 経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、これを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン及びｄｄｓ
US20080003236A1 (en) 2004-10-18 2008-01-03 Genvec, Inc. Adenovirus fiber shaft composition and methods of use
WO2007018152A1 (ja) 2005-08-05 2007-02-15 The University Of Tokushima IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン
US20100111989A1 (en) 2006-12-21 2010-05-06 Pevion Biotech Ag Rsv f-protein and its use
WO2008110627A1 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Pierre Fabre Medicament Novel vaccine composition for the treatment of respiratory infectious diseases
JP2010522540A (ja) 2007-03-21 2010-07-08 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック キメラ抗原
WO2009000433A1 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Pevion Biotech Ag Virosomes comprising hemagglutinin derived from an influenza virus produced in a cell line, compositions, methods of manufacturing, use thereof
WO2009079796A1 (en) 2007-12-24 2009-07-02 Id Biomedical Corporation Of Quebec Recombinant rsv antigens
WO2009123119A1 (ja) 2008-04-02 2009-10-08 国立大学法人徳島大学 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン
WO2010039224A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 University Of Massachusetts Medical School Respiratory syncytial virus (rsv) sequences for protein expression and vaccines
WO2010053883A1 (en) 2008-11-05 2010-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Live, attentuated respiratory syncytial virus
WO2010059689A2 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Rsv f vlps and methods of manufacture and use thereof
WO2010057650A1 (en) 2008-11-21 2010-05-27 Bavarian Nordic A/S Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences
WO2010077717A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Novavax, Inc. Modified rsv f proteins and methods of their use
WO2010075491A2 (en) 2008-12-24 2010-07-01 University Of Rochester Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins
US20100172925A1 (en) 2009-01-04 2010-07-08 National Health Research Institutes Hla-a2-restricted t-cell epitopes of the respiratory syncytial virus fusion protein as peptide-based vaccines
WO2010149743A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
WO2010149745A1 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Recombinant rsv antigens
WO2011017442A2 (en) 2009-08-04 2011-02-10 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Anti-rsv immunogens and methods of immunization
WO2011046925A1 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Technovax, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) virus-like particles (vlps)
WO2011050168A2 (en) 2009-10-21 2011-04-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof
WO2011108521A1 (ja) * 2010-03-02 2011-09-09 国立大学法人徳島大学 粘膜ワクチン

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Lubrizol Pharmaceutical Bulletin, Polymers for Pharmaceutical Applications", 2008, LUBRIZOL ADVANCED MATERIALS, INC
AM J EPIDEMIOL., vol. 89, no. 4, April 1969 (1969-04-01), pages 422 - 34
BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 366, no. 2, 2008, pages 308 - 313
FUTURE MICROBIOL., vol. 5, 2010, pages 585 - 602
J. VIROL., 2012
J. VIROL., vol. 50, no. 1, 1984, pages 92 - 99
J. VIROL., vol. 52, no. 3, 1984, pages 991 - 994
J. VIROL., vol. 55, no. 1, 1985, pages 101 - 110
KAUL TN; WELLIVER RC; OGRA PL, J CIN MICROBIOL, vol. 13, no. 5, 1981, pages 957 - 962
MIZUNO D; IDE-KURIHARA M; ICHINOMIYA T; KUBO; KIDO H: "Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen", J IMMUNOL., vol. 176, 2006, pages 1122 - 30
PERRICONE MA; SALDATE V; HYDE DM, MICROSC RES TECH, vol. 31, no. 3, 1995, pages 257 - 264
PLOS ONE, vol. 6, no. 7, 2011, pages E21823,1 - 14
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 81, no. 24, 1984, pages 7683 - 7687
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 82, no. 12, 1985, pages 4075 - 4079
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 94, no. 25, 1997, pages 13961 - 13966
REED LJ; MUENCH H, AM J HYGIENE, vol. 27, 1938, pages 493 - 497
See also references of EP2752199A4
TEBBEY, P.W. ET AL.: "Effective mucosal immunization against respiratory syncytial virus using purified F protein and a genetically detoxified cholera holotoxin, CT-E29H", VACCINE, vol. 18, no. 24, 2000, pages 2723 - 2734, XP004196905 *
THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, vol. 350, 2004, pages 896 - 903
VACCINE, vol. 20, no. 29-30, 2002, pages 3436 - 3442
VACCINE, vol. 25, 2007, pages 7132 - 7144
VACCINE, vol. 27, no. 46, 2009, pages 6415 - 6419
VACCINE, vol. 28, no. 34, 2010, pages 5543 - 5550
VIROLOGY, vol. 141, no. 2, 1985, pages 283 - 291
VIROLOGY, vol. 143, no. 2, 1985, pages 442 - 451
VIROLOGY, vol. 146, no. 1, 1985, pages 69 - 77
VIROLOGY, vol. 183, no. 1, 1991, pages 273 - 287

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