WO2011108521A1 - 粘膜ワクチン - Google Patents

粘膜ワクチン Download PDF

Info

Publication number
WO2011108521A1
WO2011108521A1 PCT/JP2011/054586 JP2011054586W WO2011108521A1 WO 2011108521 A1 WO2011108521 A1 WO 2011108521A1 JP 2011054586 W JP2011054586 W JP 2011054586W WO 2011108521 A1 WO2011108521 A1 WO 2011108521A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
amount
mucosal
vaccine
cvp
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/054586
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
博 木戸
大 水野
Original Assignee
国立大学法人徳島大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人徳島大学 filed Critical 国立大学法人徳島大学
Priority to KR1020127022894A priority Critical patent/KR101751376B1/ko
Priority to RU2012140064/15A priority patent/RU2570394C2/ru
Priority to BR112012022059-4A priority patent/BR112012022059B1/pt
Priority to EP11750631.1A priority patent/EP2543387B1/en
Priority to CN201180011812.0A priority patent/CN103002908B/zh
Priority to CA2791661A priority patent/CA2791661C/en
Priority to JP2012503178A priority patent/JP5804278B2/ja
Priority to US13/582,160 priority patent/US9540420B2/en
Publication of WO2011108521A1 publication Critical patent/WO2011108521A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a mucosal vaccine that effectively induces mucosal immunity IgA and blood immunity IgG.
  • Patent Documents 1 and 2 describe in detail the drawbacks of conventional inactivated vaccines and toxoids, the current state of development of mucosal vaccines and immune adjuvants, and the like.
  • Patent Document 1 an antigen drug (AD) vehicle that is a complex of lung surfactant protein B and / or lung surfactant protein C and lipid, and a mucosa comprising the AD vehicle and an antigen.
  • a vaccine has been invented and a patent application has been filed (Patent Document 1). Furthermore, the inventors of the present application can convert between selective production of IgA antibody and production of both IgA / IgG antibodies by adjusting the weight ratio V / A of AD vehicle amount (V) and antigen amount (A). And a patent application has been filed for a mucosal vaccine having this mechanism of action (Patent Document 2).
  • These Patent Documents 1 and 2 also disclose the effectiveness of fragments (peptides) of pulmonary surfactant proteins B and C.
  • nasal drops that take the same route of administration as mucosal vaccines have carboxyvinyl polymer (CVP) and hydroxypropylcellulose (HPC) in order to increase their viscosity and continuously exert their effects on hay fever and allergies.
  • CVP carboxyvinyl polymer
  • HPC hydroxypropylcellulose
  • other thickening gelling agents such as sodium alginate are used.
  • a mucosal vaccine containing HPC Patent Document 4
  • a mucosa-applied vaccine formulation containing CVP Patent Document 5
  • an influenza vaccine for intranasal spray administration Patent Document 6
  • Patent Document 7 discloses a vaccine for mucosal administration comprising an antigen, an adjuvant [especially Poly (IC)] and a thickener (such as sodium alginate).
  • an adjuvant especially Poly (IC)
  • a thickener such as sodium alginate.
  • the mucosal vaccine of Patent Document 3 has a strong antibody-producing ability. However, as a common problem of the mucosal vaccine, it has a problem of requiring a larger amount of antigen than a transdermal vaccine.
  • the invention of the present application has an even stronger antibody-producing ability than the mucosal vaccine described in Patent Document 3, and as a result, an improvement that can exert an excellent effect with a small amount of antigen comparable to a transdermal injection vaccine
  • the objective is to provide a type mucosal vaccine.
  • the present inventors worked on an AD vehicle from gelling agents (CVP, HPC) used in nasal sprays and mucosal vaccines.
  • CVP gelling agents
  • HPC gelling agents
  • the mucosal vaccine consisting of “antigen + synthetic peptide + lipid + CVP” It has far superior antibody-inducing ability, and its effect greatly exceeds the range expected from a simple combination of Patent Document 3 (antigen + synthetic peptide + lipid) and Patent Documents 5 and 6 (antigen + CVP). thing.
  • HPC excipients which are widely reported as gelling agents for nasal drops and mucosal vaccines as well as CVP, have no antibody-inducing ability when used in combination with antigens or in combination with antigens and AD vehicles.
  • the present invention has been completed based on the above novel findings.
  • the present invention has the following composition: (A) AD vehicle comprising a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8, m is 11-20) and a lipid; An effective infection comprising (b) carboxyvinyl polymer; and (c) alone, an amount of mucosal immunity IgA that produces an effective protective effect and an amount of antigenic protein that does not produce blood immunity IgG.
  • a mucosal vaccine characterized by producing an antigen-specific mucosal immunity IgA and blood immunity IgG in an amount that produces a protective effect.
  • the antigen protein (c) is further combined with the AD vehicle (a) or the carboxyvinyl polymer (b) in an amount that causes an effective infection-protective effect. It is an amount that does not produce mucosal immune IgA and blood immune IgG.
  • the synthetic peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the lipid is a phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and oleic acid. At least one. More specifically, the lipid is a trilipid mixture of dipalmitoyl phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and palmitic acid.
  • the antigen comprises an inactivated antigen derived from a pathogen, a purified antigen, a partially purified antigen, a recombinant antigen or a detoxified toxin, and an allergen that causes allergies.
  • the present invention further comprises the following composition: (A) AD vehicle comprising a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence of KnLm (where n is 4-8, m is 11-20) and a lipid; (B) a carboxyvinyl polymer; and (c) an amount of antigenic protein that does not produce mucosal immunity IgA and blood immunity IgG alone that produces effective immunity induction alone;
  • a method for producing a mucosal vaccine characterized by producing an antigen-specific mucosal immunity IgA and blood immunity IgG in an amount that produces a protective effect, comprising: (1) Suspend (a) and (c) in water, (2) Repeat heating and stirring one or more times, (3) Freeze-dried (4) The freeze-dried product is suspended in physiological saline and prepared to a predetermined concentration. (5) Add the solution of (b) above, It is a manufacturing method characterized by this.
  • “amount of mucosal immune immunity IgA and blood immunity IgG that cause effective immunity induction” means, for example, an amount such that the value of the blood virus infection inhibitory effect HI is equal to or higher than the international evaluation standard IgA and IgG.
  • composition composed of a synthetic peptide and a lipid may be referred to as “AD vehicle”, and a composition composed of this AD vehicle and the antigen may be referred to as “mucosal vaccine”.
  • AD vehicle a composition composed of this AD vehicle and the antigen
  • mucosal vaccine a composition composed of this AD vehicle and the antigen
  • CVP-added mucosal vaccine a composition obtained by adding CVP to this mucosal vaccine.
  • the present invention includes the disclosed contents of Patent Documents 1-3 regarding the above-mentioned “lipids” and the disclosed contents of Patent Document 3 regarding “synthetic peptides” and “AD vehicles”.
  • the CVP-added mucosal vaccine of the present invention has a very strong induction effect of vaccine antigen-specific IgA and IgG antibodies and a strong virus infection prevention effect (HI effect) far exceeding the international standards of induced antibodies. These effects are extremely remarkable even when compared with the mucosal vaccine described in Patent Document 3 or “antigen + CVP vaccine” (Patent Documents 5 and 6). It is an unexpectedly superior effect from the CVP effect.
  • the necessary infection protection effect can be achieved by containing a smaller amount of antigen than conventional mucosal vaccines. That is, the CVP-added mucosal vaccine of the present invention shows a much stronger antibody-inducing effect even when the amount of antigen used in the conventional mucosal vaccine (antigen + synthetic peptide + lipid) is reduced to 1/5 or less.
  • the mucosal vaccine of Patent Document 3 uses an influenza antigen as an antigen
  • the virus infection prevention effect HI of blood is HI of the influenza vaccine even if the antigen amount is 0.2 ⁇ g.
  • the CVP-added mucosal vaccine of the present invention has an antigen amount of 0.1 ⁇ g, and even with an antigen amount of 0.03 ⁇ g, it has an excellent HI value of 100 or more. Show the effect.
  • the CVP-added mucosal vaccine composition of the present invention itself has no antigen-recognizing cell stimulating effect, and therefore, unexpected side effects caused by antigens other than the administered vaccine antigen, such as autoimmune diseases, vaccination The possibility of subsequent exacerbations of allergies is extremely low.
  • FIG. 3 shows the results of Test 1, and shows the nasal wash IgA amount (left) and serum IgG amount (right) when each vaccine of Example 1 and Comparative Example 1-5 and HA antigen were administered nasally to mice.
  • antigen-presenting dendritic cells were stimulated with endotoxin (LPS), poly (IC), and SF-10 (CVP + AD vehicle), respectively, and cell membrane activation display molecules (MHCII, CD40, CD80 (B7-1) ) And CD86 (B7-2)).
  • the left graph shows cells that are positive as the expression level of each membrane molecule increases (beyond the value of the negative value upper limit display bar near the center determined from the physiological saline treatment used as a control in the right dot diagram)
  • Cell is a ratio (%) of the total number of cells
  • the right is a measurement result of flow cytometry, in which the amount of the activated display molecule on the cell membrane is visualized and quantified.
  • It is a result of Test 4, showing the relationship between the amount of infected influenza virus PFU and the survival rate.
  • Results of Test 4 when mice (10 mice in each group) were infected with 50 PFU influenza virus after nasal administration of vaccines of Example 1, Example 5, Comparative Example 5 and Comparative Example 6 The change in the survival rate is shown.
  • Results of Test 4 when mice (10 mice in each group) were administered nasally with the vaccines of Example 1, Example 5, Comparative Example 5 and Comparative Example 6 and then infected with 800 PFU influenza virus The change in the survival rate is shown. 4 is an increase in transmission electron micrographs showing the results of Test 6.
  • FIG. (A) is a mucosal vaccine of Comparative Example 1
  • (B) is a CVP-added mucosal vaccine of Example 1 and a partially enlarged image thereof (right figure).
  • Test 7 it is the result of measuring the amount of fluorescently labeled antigens detected from dendritic cells by flow cytometry.
  • “Fold versus HA” on the vertical axis indicates how many times the amount of fluorescent labeling was accelerated under each measurement condition, assuming that the amount of fluorescent labeling of antigen detected in dendritic cells when HA antigen is administered alone is 1.
  • [MFI at the time of measuring each sample] / [MFI of HA-added dendritic cells] was displayed.
  • MFI: Mean Fluorescence Intensity **: p ⁇ 0.01 vs. HA (n 3).
  • antigen-presenting dendritic cells were stimulated with poly (I.C.) And SF-10 (CVP + AD vehicle), respectively, and the expression level of the cell membrane activation display molecule (CD86) was measured.
  • ⁇ is the result without HA antigen protein, and ⁇ is the result with HA antigen protein.
  • MFI Mean Fluorescence Intensity
  • SF-10 (CVP + AD vehicle) adjuvant was administered to mice nasally in the presence and absence of antigen, and the CD86 expression level of dendritic cells prepared from nasal tissues was measured.
  • MFI Mean Fluorescence Intensity.
  • the CVP-added mucosal vaccine of the present invention has the following composition.
  • Synthetic peptide consisting of amino acid sequence of synthetic peptide KnLm (where n is 4-8, m is 11-20). In KnLm, n K (Lys) residues on the N-terminal side and m L residues on the C-terminal side are continuous.
  • Such a synthetic peptide is, for example, any of the following peptides.
  • the parentheses are peptide abbreviations. Amino acid residues are indicated by single letter symbols.
  • Sequence number 1 (K6L16): KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL L
  • Sequence number 2 (K6L11): KKKKKKLLLLLLLLLLL
  • SEQ ID NO: 1 (K6L16) is composed of 6 K (Lys) residues on the N-terminal side and 16 L residues on the C-terminal side, and SEQ ID NO: 2 (K6L11) is 6 on the N-terminal side. And the 11 L residues on the C-terminal side.
  • synthetic peptides those having a purity of 95% or more prepared according to a known chemical synthesis method are used.
  • lipid phospholipid As the lipid phospholipid, it is desirable to use phospholipids contained in lung surfactant, such as phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, and the like.
  • phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, sphingomyelin and the like can be used.
  • fatty acid lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, palmitooleic acid, oleic acid and the like can be used.
  • lipids derived from aquatic animals such as whales and dolphins with active lung expansion can be used.
  • Carboxyvinyl polymer (CVP) CVP is a hydrophilic polymer obtained by polymerizing acrylic acid as a main component.
  • Hibiswaco 103, Hibiswaco 104, Hibiswaco 105, Sigma pAA130 (Sigma, St. Louis, MO, Cat No. 181293) , PAA450 (Sigma, Cat No. 181285), pAA1250 (Sigma, Cat No. 306215), etc. can be used.
  • Hibiswako 104 which is widely used for preparation of cosmetics and pharmaceutical gels, and pAA130 and pAA1250 manufactured by Sigma are preferable.
  • pH 5.0-10.5 can be prepared with NaOH neutralization solution. It is preferred to select a pH that does not affect. For example, in the case of influenza split vaccine antigen, the pH is adjusted to 6.8-8.0, preferably pH 7.0-7.2.
  • Antigen antigens include antigenic molecules such as bacteria-derived antigens highly purified for vaccines having a purity of about 90% or more, viral antigens, toxoid proteins, glycoproteins, allergens, macromolecular carbohydrates and nucleic acids.
  • varicella virus For example, varicella virus, measles virus, mumps virus, poliovirus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, West Nile virus, hantavirus, dengue virus, Japanese encephalitis virus, Yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus, HIV virus, hepatitis C virus, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Influenza b, Streptococcus pneumoniae. It is an antigen for vaccines against Vibrio cholerae, malaria pathogens, sleeping sickness pathogens and the like.
  • SARS severe acute respiratory infection syndrome
  • antigens alone, especially in combination with AD vehicle (a) or in combination with carboxyvinyl polymer (CVP) in an amount that produces effective immune induction, antigen-specific mucosal immunity IgA and blood immunity IgG An amount that does not produce is used.
  • AD vehicle a
  • CVP carboxyvinyl polymer
  • influenza antigen protein contains M protein, neuramirase, nucleoprotein and the like in addition to the HA antigen molecule.
  • amount of antigen protein means the total amount of protein containing these antigen molecules.
  • the amount of HA antigen molecule itself was about 50% of the total antigen protein in the lot of influenza vaccine used.
  • AD vehicle lipids
  • lipid component lipid component and the synthetic peptide are mixed.
  • the mixing ratio is about 0.2 to about 12.0% by dry weight for synthetic peptides and about 88 to about 99.8% by dry weight for lipids.
  • This mixture is dried at about 40 ° C. using a rotary evaporator, resuspended in 10% ethanol at an arbitrary concentration, and shaken and mixed in a water bath at about 45 ° C. for about 15 minutes to prepare a uniform dispersion and frozen. dry.
  • This dried product is stored at about ⁇ 30 ° C., and is suspended by adding pure water or physiological saline each time it is used, and then made into a uniform dispersion using ultrasonic waves, a homogenizer, a mixer, a shaker or the like.
  • Preparation of CVP-added mucosal vaccine The above-mentioned AD vehicle, CVP and antigen are mixed in an arbitrary ratio.
  • the AD vehicle solution is added to the vaccine stock solution and mixed so that the dry weight ratio V / A of the AD vehicle amount (V) to the antigen protein amount (A) in the vaccine becomes a desired value.
  • the dry weight (A) of antigen protein administered per mouse is about 0.01 to about 10 ⁇ g / kg body weight, preferably about 0.03 to about 5.0 ⁇ g / Kg body weight.
  • This antigen amount is 1/5 or less of the antigen amount (about 0.1 to 50 ⁇ g / kg body weight, preferably about 0.3 to 30 ⁇ g / Kg body weight) in the mucosal vaccine (antigen + AD vehicle) of Patent Document 3.
  • the V / A for preferentially and selectively inducing IgA antibody production is preferably about 0.1 to about 1.0.
  • V / A for inducing production of both IgA and IgG antibodies can be in the range of about 1.0 to about 100, preferably about 5 to about 20.
  • about 60% or more of the antigen binds to the AD vehicle, and the mucosal immune vaccine obtained thereby can efficiently induce IgA antibody production and / or IgG antibody production.
  • the CVP concentration in the final nasal vaccine solution with CVP added is about 0.1% to 1.0%, preferably 0.3% to 0.8%.
  • a homogenizer, a mixer, a shaker, a stirrer, or the like can be used.
  • Example 1 the antigen protein and AD vehicle were mixed, sonicated for 3 minutes, further rotated and mixed at room temperature for 2 hours, and finally 1% CVP physiological saline.
  • An equal volume of aqueous solution can be added to produce a CVP-added mucosal vaccine.
  • This method is the same as the method described in Patent Document 3 except that CVP is added.
  • the virus antigen may be inactivated by heat generated by sonication, and the sonication process depends on the type of equipment used, the size of the oscillator, the state of the oscillator, etc. There is a disadvantage that it may be difficult to hold
  • a production method comprising the following steps as shown in Example 7 is preferable. (1) Suspend the AD vehicle and antigen protein in water (pure water) (2) Repeat heating and stirring one or more times (3) Freeze-drying (4) Suspend the freeze-dried product in physiological saline Prepared to a predetermined concentration (5) Addition of CVP solution dissolved in physiological saline This method not only solves the above-mentioned problems due to sonication, but also shows higher antigen-specific IgA as shown in Test 5 below. And an excellent method that enables the production of IgG.
  • the prepared CVP-added mucosal vaccine can be used as a single administration, but it can be used as a double administration (primary immunization and secondary immunization) or as a triple administration (primary immunization, secondary immunization, tertiary immunization). It is preferable.
  • Such multiple immunizations can significantly increase the antibody titers of IgA and IgG.
  • Two or three vaccine administrations are performed at intervals of 1 to 3 weeks, preferably about 2 weeks.
  • the administration route of the CVP-added mucosal vaccine of the present invention can be administered into the oral cavity and vaginal cavity in addition to the nasal cavity (for example, LubrizolizPharmaceutical Bulletin, inPolymers for Pharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc. 2008). .
  • an AD vehicle was prepared as follows. Dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), phosphatidylglycerol (PG), and palmitic acid (PA) are mixed at a ratio of 75:25:10 (w / w / w) so that the concentration of phospholipid is 10 mg / ml.
  • DPPC Dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • PG phosphatidylglycerol
  • PA palmitic acid
  • a CVP-added mucosal vaccine was prepared as follows using the above-mentioned AD vehicle.
  • Influenza vaccine (HA) antigen is A / NewCaledonia / 20/99 (H1N1), 1.94 mg protein / mL (sodium phosphate buffer, sodium chloride, thimerosal solution: 1 mL) provided by the Osaka University Microbial Disease Research Group Sodium hydrogen phosphate hydrate 3.53 mg, sodium dihydrogen phosphate 0.54 mg, sodium chloride 8.50 mg, thimerosal 0.008 mg) were used.
  • influenza vaccine (HA) antigen protein amount / phospholipid amount of AD vehicle solution / CVP weight 0.2 ⁇ g / 2.0 ⁇ g / 20 ⁇ g.
  • the pH of the CVP-added mucosal vaccine was set within a range (7.0-7.2) in which the antigenicity of the HA antigen protein was maintained.
  • this CVP-added mucosal vaccine is referred to as “HA + SF-10”.
  • the SF-10 amount in other examples is also described as a value excluding the CVP amount.
  • Example 1 a CVP-added mucosal vaccine having an HA antigen protein amount of 0.1 ⁇ g was prepared.
  • the mixing ratio of the HA antigen protein, AD vehicle and CVP was the same as that in Example 1 (that is, containing AD vehicle 10 times the amount of antigen protein and CVP at a final concentration of 0.5%).
  • Example 1 According to the method of Example 1, a CVP-added mucosal vaccine having an HA antigen protein amount of 0.03 ⁇ g was prepared.
  • the mixing ratio of the HA antigen protein, AD vehicle and CVP was the same as that in Example 1 (that is, containing AD vehicle 10 times the amount of antigen protein and CVP at a final concentration of 0.5%).
  • a mucosal vaccine (HA + AD vehicle) of Patent Document 3 was prepared.
  • the HA antigen protein and AD vehicle were the same as those in Example 1, and the vaccine was prepared according to Example 1.
  • the amount of HA antigen protein is 0.2 ⁇ g, and the amount of AD vehicle is 2.0 ⁇ g.
  • the mucosal vaccine (HA + CVP) disclosed in Patent Documents 5 and 6 was prepared.
  • the same HA antigen protein and CVP as in Example 1 were used, and the vaccine was prepared according to Example 1.
  • the HA antigen protein amount is 0.2 ⁇ g and CVP is 0.5% final concentration.
  • a mucosal vaccine (HA + HPC) disclosed in Patent Document 4 was prepared.
  • the same HA antigen protein as in Example 1 was used, and HPC 6.0-10.0 (Wako Pure Chemical Industries) was used as the HPC.
  • Preparation of the vaccine was in accordance with Example 1.
  • the amount of HA antigen protein is 0.2 ⁇ g, and the amount of HPC is 20 ⁇ g.
  • a mucosal vaccine (HA + AD vehicle + HPC) in which HPC was further added to the HA + AD vehicle of Patent Document 3 was prepared.
  • the HA + AD vehicle was the same as in Comparative Example 1
  • the HPC was the same as in Comparative Example 3, and the vaccine was prepared according to Example 1.
  • the amount of HA antigen protein is 0.2 ⁇ g
  • the amount of AD vehicle is 2.0 ⁇ g
  • the amount of HPC is 20 ⁇ g.
  • a mucosal vaccine (HA + poly (IC)) containing poly (IC) (Alexis Corp.), which is a ligand of dendritic cell Toll-Like Receptor (TLR) and stimulates antigen-presenting cells to stimulate antibody production (Asahi-Ozaki Y et al., Microbes Infect 2006; 8: 2706-2714, Ichinohe T, et al., J Virol 2005; 79 (5): 2910-2919).
  • the amount of HA antigen protein is 0.2 ⁇ g
  • the amount of poly (IC) is 2 ⁇ g.
  • the HA antigen was diluted with physiological saline and used as a vaccine.
  • the dose of HA antigen protein per animal is 0.2 ⁇ g. [Test 1]
  • Mucosal vaccine HA + SF-10 (Example 1) ⁇ HA + AD vehicle (Comparative Example 1) ⁇ HA + CVP (Comparative Example 2) ⁇ HA + HPC (Comparative Example 3) ⁇ HA + AD vehicle + HPC (Comparative Example 4) ⁇ HA + poly (IC) (Comparative Example 5) ⁇ HA alone (Comparative Example 6) 2. Animals 6-8 weeks old female BALB / c female mice were purchased from Nippon SLC Co., Ltd. (Shizuoka, Japan) and used.
  • Immunization was carried out by nasal administration of the same amount of specimens having the same composition as the second immunization in each group 2 weeks after the first immunization.
  • the third immunization was performed in the same manner on the second week after the second immunization, and then a sample was collected on the second week. Although the vaccine is administered three times in total, almost the same result can be obtained even when the secondary immunization is completed. 4).
  • Preparation of mouse nasal cavity / alveolar lavage fluid and serum A mouse nasal cavity / alveolar lavage fluid and serum were prepared 2 weeks after the third immunization, and IgA and IgG specific for virus HA antigen were measured.
  • mice were laparotomized under pentobarbital anesthesia, the trachea was incised, Atom vein catheterized 3 Fr (Atom Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan) was inserted into the lung, and 1 mL of physiological saline was injected. The liquid was collected. This was repeated 3 times, and a total of 3 mL was used as the alveolar lavage fluid. After collecting the lung lavage fluid, an atom vein catheter was inserted from the incised trachea toward the nasal cavity, 1 mL of physiological saline was injected, and the fluid that came out of the nose was collected. This solution was used as a nasal wash.
  • ELISA assay was performed according to the method of Mouse ELISA quantitation kit of BETHYL LABORATORIES (Texas, USA). 96-well Nunc immunoplate (Nalgen Nunc International USA, New York) Each well was added 1 ⁇ g of vaccine and bovine serum albumin (BSA, SIGMA USA, MO) 1 ⁇ g / mL PBS solution 100 ⁇ L, followed by overnight solidification at 4 ° C It was. Thereafter, the rinse vaccine solution was removed three times with a washing solution (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0).
  • BSA bovine serum albumin
  • the IgA amount is 24.77 ng / mL and the IgG amount is 0.54 ⁇ g / mL
  • the IgA amount is 3307.60 ng / mL
  • the amount of mL and IgG was 568.75 ⁇ g / mL, and it was enhanced 132 times with IgA in nasal wash and 1137 times with IgG in serum. It was confirmed that the CVP-added mucosal vaccine of the present invention (HA + SF-10) has a very strong antibody-inducing effect (FIG. 1, Table 1).
  • the adjuvant effect of the AD vehicle is not just an excipient having a thickening effect, but an enhancement effect based on the characteristics of the AD vehicle.
  • the amount of antibody production in the HA + SF-10 (Example 1) administration group was 11.4 times as high as IgA in nasal wash and 2.3 times as high as IgG in serum than HA + poly (IC) (Comparative Example 5).
  • SF-10 does not directly activate antigen-presenting dendritic cells, but enhances antigen-presenting ability and increases antibody production, that is, SF-10 effectively effectively Was induced to induce antibody production [Test 3]
  • Example 1 HA antigen protein amount: 0.2 ⁇ g
  • Example 2 HA antigen protein amount: 0.1 ⁇ g
  • Example 3 HA antigen protein amount: 0.03 ⁇ g
  • Example 1 HA antigen protein amount: 0.2 ⁇ g
  • Example 2 HA antigen protein amount: 0.1 ⁇ g
  • Example 3 HA antigen protein amount: 0.03 ⁇ g
  • Comparative Example 2 HA + AD vehicle (HA antigen protein amount: 0.2 ⁇ g)
  • Comparative Example 3 Compared with HA + CVP (HA antigen protein amount: 0.2 ⁇ g), the antibody induction effect was much stronger. That is, the IgA amount in the administration group of Example 3 was 11.7 times that of Comparative Example 2, 8.0 times that of Comparative Example 3, and the IgG amount was 77.2 times that of Comparative Example 2 and 60.1 times that of Comparative Example 3.
  • the CVP-added mucosal vaccine of the present invention produced a sufficient amount of antibody with a much smaller amount of antigen than the mucosal vaccines of Patent Document 3 (HA + AD vehicle) and Patent Documents 5 and 6 (HA + CVP). It was confirmed that it was possible.
  • the virus infection prevention effect HI effect
  • Example 2 a CVP-added mucosal vaccine having an AD vehicle amount of 0.3 ⁇ g and an HA antigen protein amount of 0.03 ⁇ g was prepared.
  • the mixing ratio of the HA antigen protein, AD vehicle and CVP was the same as that in Example 1 (that is, containing AD vehicle 10 times the amount of antigen protein and CVP at a final concentration of 0.5%).
  • Example 1 Each CVP of Example 1 (AD vehicle: 2.0 ⁇ g, HA antigen protein amount: 0.2 ⁇ g) and Example 4 (AD vehicle: 0.3 ⁇ g, HA antigen protein amount: 0.03 ⁇ g) was added to mice (10 mice in each group).
  • Mucosal vaccines were administered in the same manner as in Test Example 1, and infected with 50 PFU and 800 ⁇ ⁇ PFU influenza viruses (A / PR8 (N1H1) / ⁇ L) 14 days after the second booster vaccine administration (total 3 immunizations) I let you.
  • the amount of infectious virus that can achieve half-mortality is PFU ⁇ 5.
  • 50 PFU is 9 days after infection, and more than 100 PFU is 8 days. All mice died within eyes.
  • mice administered with the CVP mucosal vaccine of Example 1 and Example 4 survived for 15 days with a 50 PFU virus infection. Moreover, in the virus infection of 800 PFU, the death of the vaccine of Example 1 was 1 out of 10 animals (after 8 days), and the vaccine of Example 4 was 5 out of 10 animals (after 10 days).
  • lyophilized powder was suspended in physiological saline to obtain a CVP-added mucosal vaccine.
  • 2 ⁇ L of one nose per mouse is administered to both noses.
  • the CVP in the vaccine solution contained in a total of 4 ⁇ L was adjusted to 0.5%
  • the HA antigen protein amount was 0.2 ⁇ g
  • the phospholipid amount of the AD vehicle was adjusted to 2.0 ⁇ g.
  • this CVP-added mucosal vaccine is referred to as HA + SF-10-B.
  • a lyophilized AD vehicle powder was dissolved in pure water and mixed with the same HA antigen protein solution as in Example. This suspension was heated to 42 ° C. for 10 minutes using a water bath, and stirred for 10 seconds with a mixer at 3 minutes and 7 minutes during the heating process to make the solution uniform. After the heating treatment, the suspension was frozen at ⁇ 30 ° C. to ⁇ 75 ° C. overnight and freeze-dried to prepare a dry powder. The lyophilized powder was stored at -30 ° C.
  • HA + SF-10-C this CVP-added mucosal vaccine is referred to as HA + SF-10-C.
  • Example 1 Addition of CVP in Example 1 (hereinafter referred to as “HA + SF-10-A”), Example 5 (HA + SF-10-B), and Example 6 (HA + SF-10-C)
  • the mucosal vaccine was inoculated into mice (10 mice in each group) in the same manner as in Test Example 1 (3 times at 2-week intervals), and anti-influenza IgA and IgG antibodies were measured in the same manner as in Test Example 1.
  • Example 6 (HA + SF-10-C) is about 2-4 times as much as IgA compared to Example 1 (HA + SF-10-A) and Example 5 (HA + SF-10-B).
  • the antibody induction effect was about twice as much as that in the IgG amount. That is, it was presumed that the method of Example 6 (Step C) does not include an ultrasonic treatment step, and the addition of the CVP solution in the final step brings about an excellent antibody induction effect.
  • CVP is a thickener polymer that improves the retention of the active ingredient in the nasal cavity, as well as hydroxypropyl cellulose (Patent Document 4), sodium alginate (Patent Document 7), and other excipients. Have been used as thickeners (Patent Documents 5 and 6).
  • Patent Documents 5 and 6 have been used as thickeners.
  • the CVP in the present invention enhances the binding between the antigen and the AD vehicle in combination with the AD vehicle, increases the amount of antigen taken into the antigen-presenting cells, and increases the AD vehicle effect. It turns out that it is strengthening. [Test 7]
  • SF-10 (AD vehicle + CVP) (20 ⁇ g) described in Example 1 and the HA antigen protein (2 ⁇ g) described in Example 1 labeled with the fluorescent dye ATTO488 were mixed to obtain mouse bone marrow-derived dendritic cells ( 2 ⁇ 10 5 cells), and after 1 hour, the amount of fluorescent labeling of dendritic cells labeled with fluorescent dye-labeled HA antigen protein was measured by flow cytometry. Further, poly (I: C) (10 ⁇ g) described in Comparative Example 5 and the above-mentioned fluorescently labeled HA antigen protein (2 ⁇ g) were mixed, and the amount of the fluorescently labeled antigen similarly exhibited by dendritic cells was measured. The fluorescence exhibited by the dendritic cells reflects the amount of fluorescent dye-labeled HA antigen protein bound and taken up by the cells.
  • the SF-10 mucosal vaccine of the present invention increases the amount of antibody production by promoting the binding and uptake of the antigen protein to the antigen-presenting cells, and further exhibits an excellent infection protection ability. It was confirmed that [Test 8]
  • SF-10 of the CVP-added mucosal adjuvant of the present invention carried antigens to antigen-presenting dendritic cells to activate dendritic cells and promote antibody production.
  • Test 8 dendritic cell activation dependent on SF-10 antigen transport confirmed in vitro was tested in mouse individuals (in vivo), and the same as in Test 8 was administered intranasally in the mouse.
  • ⁇ Saline ⁇ Saline + HA antigen protein ⁇ SF-10 -SF-10 + HA antigen protein The animal experiment was conducted according to Test 1.
  • HA antigen protein (0.2 ⁇ g) and SF-10 (2 ⁇ g) were those described in Example 1, and Poly (IC) (2 ⁇ g) was the same as in Comparative Example 5.
  • CVP-added mucosal vaccine was produced in the same manner as in Example 6 except that pAA130 made by Sigma was used as CVP and the concentration was 0.1%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, or 1.0%.
  • Mouse nasal wash IgA and serum IgG were measured by the method described in Example 1.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

以下の組成： （a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル； （b）カルボキシビニルポリマー；および （c）単独では、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白 を含み、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチン。　本発明の粘膜ワクチンは、従来の粘膜ワクチンよりもさらに強い抗体産生能を有し、その結果として極めて少量の抗原で優れた効果を発揮することができる。

Description

粘膜ワクチン
　この発明は、粘膜免疫IgAと血中免疫IgGを効果的に誘導する粘膜ワクチンに関するものである。
　特許文献１および２には、従来の不活化ワクチンやトキソイド等における欠点、粘膜ワクチンおよび免疫アジュバントの開発に関する現状等が詳細に記載されている。
　これら特許文献１、２に記載のとおり、皮下や筋肉内等へ接種する従来ワクチンから、ウイルスの自然感染ルートである粘膜においてIgA抗体の産生を誘導する粘膜ワクチンへの切り替えの必要性は、広くかつ深く認識されている。特に、２１世紀における次世代ワクチンとしては、IgA抗体の産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する、いわゆる粘膜ワクチンの開発と実用化が全世界で待望されてはいるが、未だ達成されていない。
　本願発明者らはこのような課題に対して、肺サーファクタントプロテインＢおよび／または肺サーファクタントプロテインＣと、脂質との複合体である抗原薬物（ＡＤ）ビークルと、このADビークルと抗原とからなる粘膜ワクチンを発明し、特許出願している（特許文献１）。さらに本願発明者らは、ADビークル量（Ｖ）と抗原量（Ａ）との重量比Ｖ／Ａの調節によって、IgA抗体の選択的産生とIgA・IgG両抗体産生とが変換可能であることを見出し、これを作用機序とする粘膜ワクチンを特許出願している（特許文献２）。またこれらの特許文献１、２は、肺サーファクタントプロテインＢおよびＣの断片（ペプチド）の有効性についても開示している。
　さらに本願発明者らは、肺サーファクタントプロテイン断片の様々な変異体について抗体産生増強作用を検討した結果、特許文献１、２に開示された部分ペプチドよりもサイズの小さいペプチドであるにもかかわらず、抗体産生の強い誘導あるいは増強作用、特に、分泌型IgA抗体の単独産生、また、分泌型IgAと血中IgGの両抗体産生の優れて効果的な誘導作用を有する合成ペプチドKnLm（ただしnは4-8、mは11-20）を成分とするADビークルと、このADビークルと抗原とからなる粘膜ワクチンを発明し、特許出願している（特許文献３）。
　なお、粘膜ワクチンと同一の投与経路をとる点鼻薬には、その粘度を高め、花粉症やアレルギーへの効能を持続的に発揮させるためにカルボキシビニルポリマー（CVP）やヒドロキシプロピルセルロース（HPC）が広く使用されている他、その他アルギン酸ナトリウムを始めとする増粘ゲル化剤が使用されている。例えば、HPCを含有する粘膜ワクチン（特許文献４）や、CVPを含有する粘膜適用型ワクチン製剤（特許文献５）および鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチン（特許文献６）なども知られている。また、特許文献７には、抗原、アジュバント［特にPoly(I.C.)］および増粘剤（アルギン酸ナトリウム等）からなる粘膜投与用のワクチンが開示されている。
国際公開WO 2005/097182号公報 国際公開WO 2007/018152号公報 国際公開WO 2009/123119号公報 特開2008-231343号公報 国際公開WO 01/017556号公報 特開平03-38529号公報 特開2009-209086号公報
　特許文献３の粘膜ワクチンは強い抗体産生能を有するものであるが、粘膜ワクチンの共通の問題点として、経皮注射ワクチンよりも多量の抗原を必要とする問題点を有している。
　有効なワクチン治療のためには、その標的となる感染症の流行範囲に対して十分な量のワクチンが必要となるが、現状の抗原生産量の規模を鑑みた場合には、粘膜ワクチンの増産は困難である。従って、粘膜ワクチンにさらに強い抗体産生能を付与することが求められている。
　本願発明は、特許文献３に記載された粘膜ワクチンよりもさらに強い抗体産生能を有し、その結果として経皮注射ワクチンに匹敵するような少量の抗原で優れた効果を発揮することのできる改良型粘膜ワクチンを提供することを課題としている。
　本願発明者らは、特許文献３の粘膜ワクチンの抗体誘導をさらに増強する手段として、点鼻薬や粘膜適用型ワクチンに使用されているゲル化剤（CVP、HPC）の中から、ADビークルに働いて抗原提示細胞に運ばれる抗原量を増加させ、粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを誘導する効果を試験し、以下を確認した。
(1)特許文献３の粘膜ワクチン（抗原＋合成ペプチド＋脂質）、または特許文献５、６の粘膜ワクチン（抗原＋CVP）に比較して、「抗原＋合成ペプチド＋脂質＋CVP」からなる粘膜ワクチンは遙かに優れた抗体誘導能を有しており、その効果は、特許文献３（抗原＋合成ペプチド＋脂質）と特許文献５、６（抗原＋CVP）の単なる組合せから予測される範囲を大きく超えること。
(2)CVPと同様に点鼻薬や粘膜ワクチンのゲル化剤として広く報告されているHPC賦形剤は、抗原と併用、あるいは抗原とADビークルに併用した場合には全く抗体誘導能を持たず、粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを誘導する効果も期待できないこと。
(3)特許文献３の粘膜ワクチン（抗原＋合成ペプチド＋脂質）において必要な量の約１／５以下に抗原量を減じても、「抗原＋合成ペプチド＋脂質＋CVP」の粘膜ワクチンは遙かに強力な抗体誘導効果を有すること。
　本発明は、以上の新規な知見に基づき完成された。
　すなわち、本発明は、以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）単独では、効果的な感染防御効果を生じさせる量の粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白
を含み、効果的な感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチンである。
　本発明の粘膜ワクチンにおいて抗原蛋白（c）は、さらに、ADビークル（a）との組合せ、またはカルボキシビニルポリマー（b）との組合せによっても効果的な感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量である。
　この粘膜ワクチンにおける一つの態様において、前記の合成ペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　またこの粘膜ワクチンにおける別の態様において、脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の少なくとも１種である。さらに具体的には、脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸の３種脂質混合物である。
　この粘膜ワクチンにおけるさらに別の態様において、抗原は病原体に由来の不活化抗原、精製抗原、部分精製抗原、リコンビナント抗原又は無毒化毒素、アレルギーの原因となるアレルゲンを含む。
　さらに本発明は、以下の組成：
（a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
（b）カルボキシビニルポリマー；および
（c）単独では効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白
を含み、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチンの製造法であって、
（1）前記（a）および（c）を水に懸濁し、
（2）加温と攪拌とを１回以上反復し、
（3）凍結乾燥し、
（4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製し、
（5）前記（b）の溶液を加える、
ことを特徴とする製造方法である。
　本発明において、「効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免免疫IgAおよび血中免疫IgG」とは、例えば、血液のウイルス感染阻止効果HIの値が国際的評価基準以上であるような量のIgAおよびIgGである。
　なお、以下の説明において、合成ペプチドと脂質とからなる組成物を「ADビークル」と記載し、このADビークルと前記抗原とからなる組成物を「粘膜ワクチン」と記載することがある。これらの「ADビークル」および「粘膜ワクチン」は特許文献３に開示されたものと実施的に同一である。さらに、この粘膜ワクチンにCVPを添加した組成物を「CVP添加粘膜ワクチン」と記載することがある。また、本願発明は、前記の「脂質」に関しては特許文献１－３の開示内容、「合成ペプチド」および「ADビークル」に関しては特許文献３の開示内容を包含するものである。
　本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは、ワクチン抗原特異的IgAおよびIgG抗体の極めて強い誘導効果と、誘導された抗体の国際基準をはるかに超える強いウイルス感染阻止効果（HI効果）を有している。これらの効果は、特許文献３に記載の粘膜ワクチン、あるいは「抗原＋CVPワクチン」（特許文献５、６）と比較しても極めて顕著であり、特許文献３の粘膜ワクチン効果と特許文献５、６のCVP効果とからは予期しえないほどの優れた効果である。
　このような強い抗体誘導能から、従来の粘膜ワクチンより少量の抗原を含有させることによって必要な感染防御効果が達成される。すなわち、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは、従来の粘膜ワクチン（抗原+合成ペプチド+脂質）に使用する抗原量を１／５以下にまで減じても、はるかに強力な抗体誘導効果を示す。例えば、試験例２に示したように、特許文献３の粘膜ワクチンは、抗原としてインフルエンザ抗原を使用した場合には、抗原量が0.2μgであっても血液のウイルス感染阻止効果HIはインフルエンザワクチンの国際的評価基準であるHI=40に満たないが、本発明のCVP添加粘膜ワクチンは抗原量が0.1μg、さらには抗原量が0.03μgであってもHI値が100以上という優れたウイルス感染阻止効果を示す。
　さらに、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンの組成物（ADビークル、CVP）自身には、抗原認識細胞刺激効果は無く、そのため投与したワクチン抗原以外の抗原による予期しない副作用、例えば自己免疫疾患、ワクチン接種後のアレルギーの増悪等の起きる可能性は極めて低い。
　また、本発明の粘膜ワクチン製造法によれば、抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGのさらに高い産生能を有する粘膜ワクチンを製造することが可能となる。
試験１の結果であり、実施例１、比較例１－５の各ワクチン、HA抗原をそれぞれマウスに経鼻投与した場合の、鼻洗浄液IgA量（左）と血清IgG量（右）である。 試験１の結果であり、実施例１、比較例１、５の各ワクチン、HA抗原、比較対象としてHA+ADビークルをそれぞれマウスに経鼻投与した場合の、抗インフルエンザウイルスHA抗体が示すHI価である。 試験２において、抗原提示樹状細胞を、エンドトキシン（LPS）、poly(I.C.)、SF-10(CVP＋ADビークル)でそれぞれ刺激し、細胞膜の活性化表示分子（MHC II、CD40、CD80 (B7-1)およびCD86(B7-2)）の発現レベルを測定した結果である。左グラフは各膜分子の発現量が増加して陽性と判定される細胞（右のドット図でコントロールとして用いた生理食塩水処理から決められた中央近傍の陰性値上限表示バーの値を越えた細胞）の全細胞数における割合（％）で示し、右はフローサイトメトリーの測定結果で、細胞膜上の活性化表示分子の量を可視化定量した図である。 試験４の結果であり、感染させたインフルエンザウイルスPFU量と生存率の関係を示す。 試験４の結果であり、マウス（各群10匹）に実施例１、実施例５、比較例５、比較例６の各ワクチンを経鼻投与した後、50 PFUのインフルエンザウイルスを感染させた場合の生存率の変化を示す。 試験４の結果であり、マウス（各群10匹）に実施例１、実施例５、比較例５、比較例６の各ワクチンを経鼻投与した後、800 PFUのインフルエンザウイルスを感染させた場合の生存率の変化を示す。 試験6の結果を示す透過型電子顕微鏡写真増である。（A）は比較例１の粘膜ワクチン、（B）は実施例１のCVP添加粘膜ワクチンとその部分拡大像（右図）である。 試験７において、樹状細胞から検出される蛍光標識抗原量をフローサイトメトリーにより測定した結果である。HA抗原の単独投与時の樹状細胞で検出される抗原の蛍光標識量を１としたときに、それぞれの測定条件で蛍光標識量が何倍促進されたかを縦軸に “Fold versus HA” ＝[各サンプル測定時のMFI ]/[HA単独添加樹状細胞のMFI] として表示した。MFI: Mean Fluorescence Intensity **: p < 0.01 vs. HA (n = 3)。 試験８において、抗原提示樹状細胞を、poly(I.C.)、SF-10(CVP＋ADビークル)でそれぞれ刺激し、細胞膜の活性化表示分子（CD86）の発現レベルを測定した結果である。□はHA抗原蛋白なし、■はHA抗原蛋白ありの結果である。MFI: Mean Fluorescence Intensity、*: p < 0.05 vs.Adjuvant alone (n = 3)。 試験９において、マウスにSF-10(CVP＋ADビークル)アジュバントを抗原の存在下と非存在下に経鼻投与し、鼻腔組織から調製した樹状細胞のCD86発現レベルを測定した結果である。MFI: Mean Fluorescence Intensity。
　本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは以下の組成からなる。
合成ペプチド
　KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドでる。このKnLmはN末側のn個のK（Lys）残基とC末側のm個のL残基が連続している。このような合成ペプチドは、例えば以下のいずれかのペプチドである。なお、括弧内はペプチドの略号である。またアミノ酸残基は１文字記号で示している。
配列番号１（K6L16）:KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL
配列番号2（K6L11）:KKKKKKLLLLLLLLLLL
　配列番号１（K6L16）は、N末側の6個のK（Lys）残基とC末側の16個のL残基とからなり、配列番号２（K6L11）は、N末側の6個のK（Lys）残基とC末側の11個のL残基とからなる。これらの合成ペプチドは、公知の化学合成法に従って調製された、純度95％以上のものを使用する。
脂質
　リン脂質としては、肺サーファクタントが含有するリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の使用が望ましい。その他、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン等を用いることができる。また、脂肪酸としては、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸等を用いることができる。更に、肺の膨張が活発なクジラ、イルカ等の水棲動物に由来の脂質を用いることができる。
カルボキシビニルポリマー（CVP）
　CVPはアクリル酸を主成分として重合して得られる親水性ポリマーであり、ハイビスワコー103、ハイビスワコー104、ハイビスワコー105、Sigma社製のpAA130（Sigma, St. Louis, MO, Cat No. 181293）、pAA450（Sigma, Cat No.181285）、pAA1250（Sigma, Cat No.306215）などの市販品を用いることができる。中でも化粧品や医薬品用ゲルの作成に汎用されているハイビスワコー104、Sigma社製のpAA130、pAA1250が好ましい。CVPを純水あるいは生理食塩水で超音波処理下に0.2-2.0重量%溶解液を作成した後、NaOH中和液でpH5.0-10.5の作成が可能であるが、ワクチン抗原の安定性に影響しないpHを選択することが好ましい。例えば、インフルエンザスプリットワクチン抗原の場合では、pH6.8-8.0、好ましくはpH7.0-7.2に調整する。
抗原
　抗原は、ワクチン用に高度精製された純度が約90%以上の細菌由来抗原、ウイルス抗原、トキソイド等のタンパク質、糖タンパク質、アレルゲン、高分子の糖質や核酸等の抗原分子を含む。例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群(SARS)ウイルス、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、HIVウイルス、C型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザb型菌、肺炎菌。コレラ菌、マラリア病原体、眠り病病原体などに対するワクチン用の抗原である。
　これらの抗原は、それ単独、特にADビークル（a）との組合せまたはカルボキシビニルポリマー（CVP）との組合せによっても効果的な免疫誘導を生じさせる量の抗原特異的粘膜免疫IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量を調製して使用する。
　なお、インフルエンザ抗原蛋白の場合はHA抗原分子の他にM蛋白、ノイラミラーゼ、ヌクレオプロテイン等を含有する。以下の説明において、抗原蛋白量とはこれらの抗原分子を含む蛋白質総量を意味する。HA抗原分子それ自体の量は、使用したロットのインフルエンザワクチンでは、抗原総蛋白量の約50％であった。
　次に、これらの材料からADビークルおよびCVP添加粘膜ワクチンを調製する方法を説明する。
ADビークルの調製
　前記の脂質のうちの幾つかを任意の割合で混合し、脂質量として、例えば10mg/mLの濃度となるようにクロロホルム：メタノール（２：１(v/v)）混合液に懸濁し、脂質成分とする。また、合成ペプチドは、例えば5.0mg/mL濃度となるようにエタノールに溶解する。次いで、この脂質成分と合成ペプチドとを混合する。混合比は、合成ペプチドが約0.2～約12.0乾燥重量%、脂質が約88～約99.8乾燥重量%である。この混合物をロータリーエバポレーターを用いて約40℃で乾固し、任意の濃度で１０％エタノールに再懸濁し、約45℃の水浴中で15分間程度振盪混和し、均一分散液を調製し、凍結乾燥する。この乾燥物は約－30℃で保存し、使用時にその都度、純水または生理食塩水を加えて懸濁したのち、超音波、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器等を用いて均一分散液とする。
CVP添加粘膜ワクチンの調製
　前記のADビークル、CVPおよび抗原とを任意の割合で混合する。すなわち、インフルエンザワクチンの場合、ワクチン中の抗原蛋白量（A）に対するADビークル量（V）の乾燥重量比V/Aが所望の値になるよう、ワクチン原液にADビークル液を添加混合し調製する。マウス１匹当たりに投与する抗原蛋白の乾燥重量（A）は約0.01～約10 μg/kg体重、好ましくは約0.03～約5.0 μg/Kg体重である。この抗原量は、特許文献３の粘膜ワクチン（抗原＋ADビークル）における抗原量（約0.1～50μg/kg体重、好ましくは約0.3～30 μg/Kg体重）の1/5以下である。
　このような抗原量において、IgA抗体産生を優先的かつ選択的に誘導するためのV/Aは、約0.1～約1.0が望ましい。また、IgA及びIgG両抗体産生を誘導するためのV/Aは、約1.0～約100、好ましくは約5～約20の範囲を採用できる。以上のとおりのV/Aにおいて、抗原の約60%以上がADビークルに結合し、それによって得られた粘膜免疫ワクチンはIgA抗体産生及び／またはIgG抗体産生を効率的に誘導することができる。
　またCVPを加えた最終経鼻投与ワクチン液中のCVP濃度は約0.1％～1.0％、好ましくは0.3％～0.8％の割合で添加する。尚、ADビークル、抗原、CVPを均一に混合するには、ホモジナイザー、ミキサー、振盪器、攪拌器等を用いることができる。
　具体的には、下記実施例１に示したように、抗原蛋白とADビークルを混合した後、3分間超音波処理を行い、さらに室温で２時間回転混和した後、最後に1%CVP生理食塩水溶液を等量加えてCVP添加粘膜ワクチンを製造することができる。この方法は、CVPを添加することを除き、特許文献３に記載された方法と同一である。ただし、この方法は、超音波処理による発熱でウイルス抗原が失活する場合のあること、超音波処理の行程は、使用する機材の種類、発振器の大きさ、発振器の状態などから、一定の条件を保持することが困難な場合があることといった不都合がある。
　そこで、実施例７に示したような以下の工程からなる製造方法が好ましい。
（1）ADビークルと抗原蛋白とを水（純水）に懸濁
（2）加温と攪拌とを１回以上反復
（3）凍結乾燥
（4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製
（5）生理食塩水に溶解したCVP溶液の添加
　この方法は超音波処理による前記問題点を解決するだけでなく、後記試験５に示したように、さらに高い抗原特異的なIgAおよびIgGの産生を可能とする、優れた方法である。
　調製したCVP添加粘膜ワクチンは、１回の投与で使用することもできるが、２回投与（初回免疫と２次免疫）または３回投与（初回免疫、２次免疫、３次免疫）として使用することが好ましい。このような複数回の免疫処置により、IgAおよびIgGの抗体価を著しく増加させることができる。なお、２回または３回のワクチン投与は、1週間から3週間、好ましくは約2週間の間隔で行うようにする。さらに、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンの投与経路は、鼻腔のほか、口腔内や膣腔への投与も可能である（例えば、Lubrizol Pharmaceutical Bulletin, Polymers for Pharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc. 2008）。
　以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
[超音波処理を含む製造工程]
　まず、以下のとおりにADビークルを調製した。
　ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ホスファチジルグリセロール(PG)、パルミチン酸(PA)を75:25:10 (w/w/w) の割合で混合し、リン脂質量として10 mg/mlの濃度になるようにクロロホルム:メタノール (2:1 (v/v))混合液に懸濁し、脂質成分とした。また純度95%以上の合成ペプチドK6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL)(GenScript社製)を5.0 mg/mLになるようにメタノールに溶解した。脂質成分（DPPC:PG:PA = 75:25:10, w/w/w）溶液とK6L16ペプチド溶液を重量比として、リン脂質成分：K6L16= 100: 2となるように混合し、ロータリーエバポレーターを用いて40℃で乾固した。これをリン脂質量として4 mg/mLとなるように、10%エタノールに再懸濁し、45℃の水浴中で15分間振盪混和し、均一分散液を調整した。これを凍結乾燥して、ADビークルとして-30℃で保存した。
　次に、前記のADビークルを用いてCVP添加粘膜ワクチンを以下のとおりに調製した。
　凍結乾燥したADビークルは要事に生理食塩水に懸濁して用いた。インフルエンザワクチン(HA)抗原は阪大微生物病研究会より供与されたA/NewCaledonia/20/99(H1N1)、1.94 mg蛋白質/mL（リン酸ナトリウム緩衝液、塩化ナトリウム、チメロサール溶液：1 mL中にリン酸水素ナトリウム水和物3.53 mg、リン酸二水素ナトリウム0.54 mg、塩化ナトリウム8.50 mg、チメロサール0.008 mg）を用いた。ワクチンとADビークの混合量は、抗原溶液の蛋白量（A）に対するADビークル溶液のリン脂質量（V）の量比V/A＝10となるように混合し、超音波処理 を30秒間隔でオンとオフを３回繰り返し、合計90秒のオンと90秒のオフの合計3分間の超音波処理 (model S-250D、Branson Ultrasonics Danbury)を行い、さらに室温で２時間回転混和した後、生理食塩水に溶解し、中性に調整した1% CVP（ハイビスワコー104）で最終濃度で0.5%になるように加えた。すなわち、マウス一匹当たり、片鼻2 μLを両鼻に投与する合計4 μLに含まれる組成は、インフルエンザワクチン(HA)抗原蛋白量/ADビークル溶液のリン脂質量/CVP重量＝0.2 μg/2.0 μg/20 μgとなる。
なお、このCVP添加粘膜ワクチンのpHは、HA抗原蛋白の抗原性を維持する範囲（7.0―7.2）とした。
　以下、このCVP添加粘膜ワクチンを「HA＋SF-10」と記載する。なお、SF-10量は、前記のとおりADビークル（2.0μg）＋CVP（20 μg）＝22 μgであるが、下記の説明ではアジュバントのビークル作用の基本骨格となるADビークルのリン脂質量で表記して、SF-10（2.0μg）と標記する。他の実施例におけるSF-10量もCVP量を除いた値で記載する。
　実施例１の方法に準じて、HA抗原蛋白量が0.1μgのCVP添加粘膜ワクチンを調製した。HA抗原蛋白、ADビークルおよびCVPの混合比は実施例１と同一とした（すなわち、抗原蛋白量の10倍のADビークルと、最終濃度0.5％のCVPを含む）。
　実施例１の方法に準じて、HA抗原蛋白量が0.03μgのCVP添加粘膜ワクチンを調製した。HA抗原蛋白、ADビークルおよびCVPの混合比は実施例１と同一とした（すなわち、抗原蛋白量の10倍のADビークルと、最終濃度0.5％のCVPを含む）。
[比較例１]
　特許文献３の粘膜ワクチン（HA+ADビークル）を調製した。HA抗原蛋白およびADビークルは実施例１と同一のものを使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2μg、ADビークル量は2.0.μgである。
[比較例２]
　特許文献５、６に開示された粘膜ワクチン（HA＋CVP）を調製した。HA抗原蛋白およびCVPは実施例１と同一のものを使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2μg、CVPは最終濃度0.5％である。
[比較例３]
　特許文献４に開示された粘膜ワクチン（HA＋HPC）を調製した。HA抗原蛋白は実施例１と同一のものを使用し、HPCは市販のHPC 6.0-10.0（和光純薬）を使用した。ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2μg、HPC量は20 μgである。
[比較例４]
　特許文献３のHA＋ADビークルに、さらにHPCを添加した粘膜ワクチン（HA＋ADビークル＋HPC）を調製した。HA＋ADビークルは比較例１と同一のもの、HPCは比較例３と同一のものをそれぞれ使用し、ワクチンの調製は実施例１に準じた。HA抗原蛋白量は0.2 μg、ADビークル量は2.0 μg、HPC量は20 μgである。
[比較例５]
　樹状細胞のToll-Like Receptor (TLR)のリガンドであり、抗原提示細胞を強く刺激して抗体産生を促進するpoly (I.C.) (Alexis Corp.)を含む粘膜ワクチン（HA＋poly (I.C.)）を文献（(Asahi-Ozaki Y et al., Microbes Infect 2006; 8:2706-2714, Ichinohe T, et al., J Virol 2005; 79(5): 2910-2919)に記載の方法に準じて調製した。HA抗原蛋白量は0.2μg、poly (I.C.)量は2μgである。
[比較例６]
　HA抗原を生理食塩水で希釈して、ワクチンとして使用した。１匹当たりのHA抗原蛋白投与量は0.2 μgである。
[試験１]
　マウスを用いて、経鼻粘膜ワクチンの抗体産生増強作用を試験した。
１．粘膜ワクチン
・HA＋SF-10（実施例１）
・HA+ADビークル（比較例１）
・HA＋CVP（比較例２）
・HA＋HPC（比較例３）
・HA＋ADビークル＋HPC（比較例４）
・HA＋poly (I.C.)（比較例５）
・HA単独（比較例６）
２．動物
　6-8週齢、メスBALB/c雌マウスを日本エスエルシー株式会社（日本・静岡）から購入して用いた。全ての動物実験は徳島大学医学部実験動物センターの感染動物舎（P2レベル）で行われ、徳島大学医学部動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
３．免疫法
　ワクチンの経鼻投与においては、上記１の５種の粘膜ワクチンを、片鼻に2μLづつを両側に投与して、合計4μLをケタラール(62.6 mg/Kg)及びセラクタール(12.4 mg/Kg)で麻酔したマウスの両側鼻腔に点鼻投与した。対照には、ワクチン液と同量の生理食塩水投与群および比較例６（HA抗原蛋白単独投与群)を用いた。各群は9-10匹のマウスから成る。
　免疫は初回免疫後２週目に同様の組成からなる検体を、それぞれの群に２次免疫として同量経鼻投与した。２次免疫後２週目に同様な方法で３次免疫を行い、その後２週目に検体を採取した。なお、ワクチンの投与は合計３回おこなっているが、２次免疫で終了してもほぼ同様の結果が得られる。
４．マウス鼻腔・肺胞洗浄液および血清の調製
　3次免疫後2週間目のマウスの、鼻腔・肺胞洗浄液および血清を調製して、ウイルスHA抗原特異的なIgA、IgGの測定を行った。文献（Mizuno D, Ide-Kurihara M, Ichinomiya T, Kubo I, Kido H. Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen. J Immunol. 2006;176 :1122-30）記載の方法に準じて、以下のとおりに行った。
　ワクチン投与マウスをペントバルビタール麻酔下で開腹開胸し、気管を切開しアトム静脈カテーテル節付3 Fr（アトムメディカル株式会社　日本・東京）を肺へ挿入後、生理食塩水1 mLを注入し、この液を回収した。これを3回繰り返して採取した液、計3 mLを肺胞洗浄液として用いた。肺洗浄液採取後、切開した気管から鼻腔方向へアトム静脈カテーテルを挿入し、1 mLの生理食塩水を注入し、鼻から出てきた液を採取した。この液を鼻洗浄液として用いた。さらに、心臓より採血を行い、5,000 rpm、10分間の遠心分離により血清を調製した。
５．抗インフルエンザ抗体の定量
　鼻腔、肺胞洗浄液および血清中の抗インフルエンザIgA、IgG含有量を、前記文献（Mizuno D, et al. J Immunol. 2006;176 :1122-30）の記載に従い、ELISA assayにより定量した。
　ELISA assayはBETHYL LABORATORIES社（アメリカ・テキサス）のMouse ELISA quantitation kitの方法に従って行った。96ウェルNuncイムノプレート（Nalgen Nunc International アメリカ・ニューヨーク）各ウェルにワクチン1μg、ウシ血清アルブミン（BSA, SIGMA アメリカ・ミズーリ）1μg/mL PBS溶液100μLを加え、4℃で一晩固層化反応を行った。その後洗浄液（50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0）で3回すすぎワクチン液を除去した。各ウェルに0.15 M NaCl、1% BSAを含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）200μLを加え、室温で1時間ブロッキング反応を行った。各ウェルを洗浄液で3回すすいだのち、サンプル結合緩衝液（50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 8.0）にて適量に希釈した鼻洗浄液・肺洗浄液あるいは血清を100μL加え、室温で2時間反応させた。Goat anti-mouse IgAまたはIgG-horse rADish peroxidase（HRP）（BETHYL LABORATORIES INC.）を二次抗体として用い、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. アメリカ・メリーランド）を用いて発色反応を行った。各ウェルに100μL、2 M H2SO4（和光純薬株式会社）を添加することによって反応を停止し、450 nmの吸光度をSPECTRAmax PLUS 384で測定した。定量のためのスタンダードとして、上記肺洗浄液から精製した抗インフルエンザIgAおよびIgG 10 ngについて同様にして得られた吸光度を用いた。
６．結果
　抗インフルエンザHA抗体の誘導結果を、鼻洗浄液中のIgA（左図１）、血液中のIgG（右図１）に示す。また、それぞれの測定値を表１に示す。また、図２および表２は各試験群のHI価を示す。
（1）HA抗原単独投与群（比較例６）のIgA量は24.77ng/mL、IgG量は0.54μg/mLに対して、HA＋SF-10（実施例１）投与群ではIgA量が3307.60ng/mL、IgG量は568.75μg/mLであり、鼻洗浄液中のIgAで132倍に、血清中のIgGで1137倍に増強した。本願発明のCVP添加粘膜ワクチン（HA＋SF-10）が極めて強い抗体誘導効果を有することが確認された（図１、表１）。
（2）HA＋SF-10（実施例１）投与群における抗体産生量は、HA＋ADビークル（比較例１）よりもIgAで15.6倍、IgGで150倍であり、HA＋CVP（比較例２）よりもIgAで10.7倍、IgGで115.4倍であった（図１、表１）。HA＋SF-10におけるこのような顕著に優れた抗体誘導効果は、特許文献３のおいて公知の粘膜ワクチン（HA＋ADビークル）と、特許文献５、６において公知のCVPとの単純な組合わせから予測される範囲を遙かに超えるものであった。
（3）HA＋HPC（比較例３）投与群の抗体産生量は、HA単独投与群（比較例６）と同様またはそれ以下であった。また、HA＋ADビークル＋HPC（比較例４）投与群の抗体産生量は、HA＋ADビークル（比較例１）よりも低かった（図１、表１）。以上の結果から、CVPと同様に点鼻薬や粘膜ワクチンにおいてゲル化剤として広く知られているHPCは、抗原との併用およびADビークルとの併用において免疫誘導増強効果を持たないことが確認された。このことから、ADビークルのアジュバント効果の増強には、単に増粘効果を持つ賦形剤ではなくADビークルの特性を基盤としたその増強効果であることが推定される。　

（4）HA＋SF-10（実施例１）投与群における抗体産生量は、HA＋poly(I.C.)（比較例５）よりも鼻洗浄液中のIgAで11.4倍、血清中のIgGで2.3倍であった（図１、表１）。この結果から、本願発明のCVP添加粘膜ワクチン（HA＋SF-10）は、抗原提示細胞を強く刺激して抗体産生を促進するpoly (I.C.)よりも強い免疫誘導効果を有することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（5）インフルエンザワクチンの国際的評価基準では、血液のウイルス感染阻止効果HI=40を超えたワクチンを有効と判定しているが、HA＋ADビークル（比較例１）ではHI=40を越えた検体が50％で、平均値でHI=39を示した。これに対して、HA＋SF-10（実施例１）では全例がHI=40を越え、平均値でHI=213.3と高値を示し、またHA＋poly (I.C.)（比較例５）のHI=137.0に比べて1.56倍の強いウイルス感染阻止効果を示した（図２、表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 [試験２]
　調整した抗原提示樹状細胞（Mizuno D et al., J Immunol 2006;176:1122-1130）を、エンドトキシン（LPS: 100 ng/1×105 細胞）（Grauer O, et al., Histochem Cell Biol 2002; 117:351-362）、poly(I.C.)(10 μg/1×105 細胞)、SF-10(CVP添加ADビークル10 μg/1×105 細胞)でそれぞれ刺激し、細胞膜の活性化表示分子（MHC II、CD40、CD80(B7-1)およびCD86(B7-2)）の発現レベルを測定した。
　結果は図３に示したとおりである。LPSおよびpoly(I.C.)はCD40およびCD86の発現を著明に増加させ、抗原提示樹状細胞を活性化させたが、SF-10は抗原提示樹状細胞上のMHC II、CD40、CD80およびCD86の発現を増加させず、対照（無処理細胞）の発現量とほぼ同等のレベルであった。
　以上の結果から、SF-10は抗原提示樹状細胞を直接活性化することなしに、抗原提示能を増強して抗体産生量を増加させていること、すなわち、SF-10が効果的に抗原を抗原提示樹状細胞に運搬して抗体産生を誘導することが推定された
[試験３]
　実施例１（HA抗原蛋白量：0.2μg）、実施例２（HA抗原蛋白量：0.1μg）、実施例３（HA抗原蛋白量：0.03μg）の各CVP添加粘膜ワクチンを試験１と同様にマウス（各群10匹）に投与し、試験１と同様に鼻洗浄液中のIgA、血液中のIgGを測定した。
　結果は表３に示したとおりである。実施例１（HA抗原蛋白量：0.2μg）および実施例２（HA抗原蛋白量：0.1μg）はほぼ同等の抗体誘導効果を示した。さらに、実施例１よりも抗原蛋白量が１／６以下の実施例３（HA抗原蛋白量：0.03μg）も、試験例１（表1）の比較例２：HA＋ADビークル（HA抗原蛋白量：0.2μg）および比較例３：HA＋CVP（HA抗原蛋白量：0.2μg）に比べて遙かに強力な抗体誘導効果を示した。すなわち、実施例３投与群のIgA量は比較例２の11.7倍、比較例３の8.0倍であり、IgG量は比較例２の77.2倍、比較例３の60.1倍であった。
　以上の結果から、本願発明のCVP添加粘膜ワクチンは、特許文献３（HA＋ADビークル）や特許文献５、６（HA+CVP）の粘膜ワクチンよりも、遙かに少ない抗原量によって十分な抗体産生が可能であることが確認された。またウイルス感染阻止効果（HI効果）においても、CVP添加粘膜ワクチンではHA抗原蛋白量：0.03μgでもHI=198.0と十分な感染抑止効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１の方法に準じて、ADビークル量が0.3μg、HA抗原蛋白量が0.03μgのCVP添加粘膜ワクチンを調製した。HA抗原蛋白、ADビークルおよびCVPの混合比は実施例１と同一とした（すなわち、抗原蛋白量の10倍のADビークルと、最終濃度0.5％のCVPを含む）。
[試験４]
　マウス（各群10匹）に、実施例１（ADビークル：2.0μg、HA抗原蛋白量：0.2μg）および実施例４（ADビークル：0.3μg、HA抗原蛋白量：0.03μg）の各CVP添加粘膜ワクチンを試験例１と同様にしてそれぞれ投与し、２回目のブースターワクチン投与（合計３回免疫）から14日後に50 PFUおよび800 PFUのインフルエンザウイルス（A/PR8(N1H1)/μL）を感染させた。
　なお、図４に示したように、半数死亡率（LD50）が得られる感染ウイルス量はPFU＜5であり、ワクチン処置を行なわない場合、50 PFUは感染後9日、100 PFU以上では8日目以内に全マウスが死亡した。
　ワクチン接種の生存率への果は図５、図６に示したとおりである。コントロール（生理食塩水）および比較例６（HA抗原蛋白単独）の場合は共に、50 PFUのウイルス感染から7-9日で、800 PFUのウイルス感染では7日後に全例が死亡した。また比較例５（HA+poly（I.C.））の場合は、800 PFUのウイルス感染では10匹中9匹が9日後までに死亡した。
　これに対して、実施例１および実施例４のCVP粘膜ワクチンを投与したマウスは、50 PFUのウイルス感染では全例が15日間生存した。また、800 PFUのウイルス感染では、実施例１のワクチンでは死亡は10匹中1匹（8日以後）であり、実施例４のワクチンでは10匹中5匹（10日後）であった。
　以上の結果から、本発明のCVP添加粘膜ワクチンは優れた感染予防効果を有することが確認された。
[超音波処理を含まない製造工程B]
　実施例１と同様のHA抗原蛋白液に、凍結乾燥したADビークル粉末を純水に溶解して加え、次いでこの混合液に純水に溶解した1.0% CVPを等量混合して懸濁液を調整した。これを、超音波処理すること無くウォーターバスを用いて10分間42℃に加温処理し、加温処理中3分、7分時にミキサーで10秒間攪拌して液を均一化にした。加温処理後、懸濁液を-30℃～-75℃で一晩凍結させ、凍結乾燥を行って乾燥粉末体を作成した。凍結乾燥粉末は-30℃で保存した。要事に凍結乾燥粉末を生理食塩水に懸濁して、CVP添加粘膜ワクチンとした。マウス１匹当たり片鼻2μLを両鼻に投与する合計4μLに含まれるワクチン液中のCVPは0.5%、HA抗原蛋白量は0.2 μg、ADビークルのリン脂質量は2.0 μgに調整した。以下、このCVP添加粘膜ワクチンをHA+SF-10-Bと記載する。
[超音波処理を含まない製造工程C]
　実施例と同様のHA抗原蛋白液に、凍結乾燥したADビークル粉末を純水に溶解して混合調整した。この懸濁液を、ウォーターバスを用いて10分間42℃に加温処理し、加温処理中3分、7分時にミキサーで10秒間攪拌して液を均一化にした。加温処理後、懸濁液を-30℃～-75℃で一晩凍結させ、凍結乾燥を行って乾燥粉末体を作成した。凍結乾燥粉末は-30℃で保存した。要事に凍結乾燥粉末を、あらかじめ生理食塩水に溶解した0.5% CVP液で泡立たないように軽く攪拌、溶解してCVP添加粘膜ワクチンとした。マウス１匹当たり片鼻2μLを両鼻に投与する合計4μLに含まれるHA抗原蛋白量は0.2 μg、ADビークルのリン脂質量は2.0 μgである。以下、このCVP添加粘膜ワクチンをHA+SF-10-Cと記載する。
[試験５]
　実施例１（以下、「HA+SF-10-A」と記載する）、実施例５（HA+SF-10-B）、および実施例６（HA+SF-10-C）の各CVP添加粘膜ワクチンを、それぞれマウス（各群10匹）に試験例１と同様に接種（2週間間隔で３回）し、試験例１と同様に抗インフルエンザIgAおよびIgG抗体を測定した。
　結果は表４に示したとおりである。実施例６（HA+SF-10-C）は、実施例１（HA+SF-10-A）および実施例５（HA+SF-10-B）と比べてIgA量において約２－4倍、IgG量において約２倍の抗体誘導効果を示した。すなわち、実施例６の方法（工程C）は、超音波処理工程を含まないことと、CVP液の添加を最終工程で行なうことによって、その優れた抗体誘導効果をもたらすことが推定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 [試験６]
　本発明のCVP添加粘膜ワクチンの各組成（HA抗原蛋白、ADビークル、CVP）の状態を、透過型電子顕微鏡で観察した。図７に示したように、CVPは抗原とADビークルとの結合を大幅に増加させていることが確認された。
　CVPは、鼻腔内での有効成分の滞留性を改善する増粘剤ポリマーの一つとして、ヒドロキシポロピルセルロース（特許文献４）、アルギン酸ナトリウム（特許文献７）、その他の賦形剤と同様に、増粘剤として使用されてきた（特許文献５、６）。しかし、この試験６の結果が示すように、本発明におけるCVPがADビークルとの組合せにおいて、抗原とADビークルとの結合を増強させ、抗原提示細胞に取り込まれる抗原量を増加させ、ADビークル効果を増強していることが判明した。
[試験７]
　実施例１に記載したSF-10（ADビークル+CVP）(20μg)と、蛍光色素ATTO488でラベルした実施例１記載のHA抗原蛋白(2μg)とを混合して、マウス骨髄由来樹状細胞（2×105 cells）に添加し、1時間後に蛍光色素標識HA抗原蛋白によってラベルされた樹状細胞の蛍光標識量をフローサイトメトリーにより測定した。また、比較例５に記載のpoly (I:C)（10μg）と前記の蛍光標識HA抗原蛋白（2μg）とを混合し、同じく樹状細胞が示す蛍光標識抗原量を測定した。樹状細胞が示す蛍光は、蛍光色素標識HA抗原蛋白の細胞への結合と取り込み量を反映する。
　結果は図８に示したとおりである。Poly(I:C)には蛍光色素標識HA抗原蛋白の樹状細胞への結合と取り込み量を促進しなかったが、SF-10は有意な促進効果を示した。
　以上の結果から、本発明のSF-10粘膜ワクチンは、抗原提示細胞への抗原蛋白の結合及び取り込みを促進することによって、抗体産生量を増加させ、さらには優れた感染防御能を発揮していることが確認された。
[試験８]
　1 mLのcRPMI培地で培養したマウス骨髄由来樹状細胞（2 × 105 cells）に、以下を添加し、1時間後の樹状細胞の活性化を樹状細胞の活性化マーカーの一つであるCD86発現増加を指標にフローサイトメトリーにより測定した。なお、計測にはFACSCalibur cytometer （BD Biosciences、アメリカ、マサチューセッツ）を、データ処理にはCellQuest software （BD Bioscience、アメリカ、マサチューセッツ）を用いCD86の発現を測定した。
・生理食塩水
・生理食塩水＋HA抗原蛋白
・SF-10
・SF-10＋HA抗原蛋白
・Poly(I.C.)
・Poly(I.C.)＋HA抗原蛋白
　なお、HA抗原蛋白（2μg）およびSF-10（20μg）は実施例１に記載のものであり、Poly(I.C.)（10μg）は比較例５と同一のものを使用した。
　結果は図9に示したとおりである。Poly(I:C)は、試験２と同様に単独でCD86の発現を増加（樹状細胞を活性化）するが、抗原を添加してもCD86の発現はさらに増加することはなかった。これに対して、SF-10はそれ単独で樹状細胞を活性化しないが、抗原の共存下でのCD86発現量は約2倍に増強された。
　以上の結果から、本発明のCVP添加粘膜アジュバントのSF-10は、抗原を抗原提示樹状細胞に運搬して樹状細胞を活性化し、抗体産生を促進していることが推定された。
　なお、同じく樹状細胞の活性化マーカーの一つであるCD40でも同様の結果が得られた。
[試験９]
　試験８において、in vitroで確認したSF-10の抗原運搬に依存した樹状細胞活性化をマウス個体（in vivo）で試験するため、試験８と同一の以下をマウス鼻腔内に投与した。
・生理食塩水
・生理食塩水＋HA抗原蛋白
・SF-10
・SF-10＋HA抗原蛋白
　なお、動物実験は試験１に準じておこなった。HA抗原蛋白（0.2 μg）およびSF-10（2 μg）は実施例１に記載のものであり、Poly(I.C.)（2 μg）は比較例５と同一のものを使用した。
　経鼻接種後48時間にマウスから頭部を切断し、鼻腔内組織を採取し、コラゲナーゼ処理（1 mg/mL、37℃、30分振蕩）を行った。メッシュでろ過した後、遠心（4℃、10分、200×g）により回収した細胞から、Anti-CD11c (N-418)-conjugated magnetic beads（Miltenyl Biotech、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）、LSカラムを用いたVarioMACS（Miltenyi Biotec、ドイツ、ベルギッシュグラートバッハ）法にて、説明書に記載された方法に従い樹状細胞を調整した。次いで試験８と同様な方法で、CD86の発現増加を測定した。
　結果は図10に示したとおりである。マウスの鼻腔においても、SF-10の抗原運搬に依存した樹状細胞活性化が確認された。
[試験１０]
　CVPの好ましい濃度を試験した。
CVPとしてSigma社製のpAA130を使用し、その濃度を0.1％、0.25％、0.5％、0.75％または1.0％とした以外は、実施例6と同様の方法によりCVP添加粘膜ワクチンを製造し、試験例１記載の方法によりマウスの鼻洗浄液IgAおよび血清IgGを測定した。
　結果は表５に示したとおりであり、IgA、IgGともにCVP pAA130濃度0.5%まではCVP量の増加に従った抗体誘導効果の上昇が認められた。CVP 0.5%をピークとしてこれよりも高い濃度のCVPを用いた際には逆に抗体誘導効果が減少する傾向が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (7)

  1. 以下の組成：
    （a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
    （b）カルボキシビニルポリマー；および
    （c）単独では、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原蛋白
    を含み、効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチン。
  2. 抗原蛋白（c）が、ADビークル（a）との組合せ、またはカルボキシビニルポリマー（b）との組合せによっても効果的な免疫誘導と感染防御効果を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量である請求項１の粘膜ワクチン。
  3. 合成ペプチドが、配列番号１または２のアミノ酸配列からなる請求項１の粘膜ワクチン。
  4. 脂質が、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の少なくとも１種である請求項１の粘膜ワクチン。
  5. 脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸の３種脂質混合物である請求項３の粘膜ワクチン。
  6. 抗原蛋白が病原体に由来の不活化抗原、精製抗原、部分精製抗原、リコンビナント抗原又は無毒化毒素、アレルギーの原因となるアレルゲンである請求項１の粘膜ワクチン。
  7. 以下の組成：
    （a）KnLm（ただしnは4-8、mは11-20）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと脂質とからなるADビークル；
    （b）カルボキシビニルポリマー；および
    （c）単独では、効果的な免疫誘導を生じさせる量の粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることのない量の抗原
    を含み、効果的な免疫誘導を生じさせる量の抗原特異的粘膜免役IgAおよび血中免疫IgGを産生させることを特徴とする粘膜ワクチンの製造法であって、
    （1）前記（a）および（c）を水に懸濁し、
    （2）加温と攪拌とを１回以上反復し、
    （3）凍結乾燥し、
    （4）凍結乾燥体を生理食塩水に懸濁して所定濃度に調製し、
    （5）前記（b）の溶液を加える、
    ことを特徴とする製造方法。
PCT/JP2011/054586 2010-03-02 2011-03-01 粘膜ワクチン WO2011108521A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020127022894A KR101751376B1 (ko) 2010-03-02 2011-03-01 점막 백신
RU2012140064/15A RU2570394C2 (ru) 2010-03-02 2011-03-01 Мукозальная вакцина
BR112012022059-4A BR112012022059B1 (pt) 2010-03-02 2011-03-01 Vacina de mucosa produtora de uma iga de mucosa antígenoespecífica e igg do sangue e método para produzir uma vacina de mucosa
EP11750631.1A EP2543387B1 (en) 2010-03-02 2011-03-01 Mucosal vaccine
CN201180011812.0A CN103002908B (zh) 2010-03-02 2011-03-01 粘膜疫苗
CA2791661A CA2791661C (en) 2010-03-02 2011-03-01 Mucosal vaccines
JP2012503178A JP5804278B2 (ja) 2010-03-02 2011-03-01 粘膜ワクチン
US13/582,160 US9540420B2 (en) 2010-03-02 2011-03-01 Mucosal vaccines

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-045205 2010-03-02
JP2010045205 2010-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011108521A1 true WO2011108521A1 (ja) 2011-09-09

Family

ID=44542172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/054586 WO2011108521A1 (ja) 2010-03-02 2011-03-01 粘膜ワクチン

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9540420B2 (ja)
EP (1) EP2543387B1 (ja)
JP (1) JP5804278B2 (ja)
KR (1) KR101751376B1 (ja)
CN (1) CN103002908B (ja)
BR (1) BR112012022059B1 (ja)
CA (1) CA2791661C (ja)
RU (1) RU2570394C2 (ja)
WO (1) WO2011108521A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013031827A1 (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 国立大学法人徳島大学 Rsv粘膜ワクチン
CN110548136A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 王美亮 汉坦病毒长肽疫苗
WO2020045155A1 (ja) 2018-08-30 2020-03-05 国立大学法人徳島大学 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤
WO2021206103A1 (ja) * 2020-04-06 2021-10-14 応用酵素医学研究所株式会社 皮下投与型ワクチン

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6629877B2 (ja) * 2015-10-30 2020-01-15 帝人ファーマ株式会社 鼻粘膜投与用医薬組成物
KR20200015323A (ko) 2018-08-03 2020-02-12 에릭스바이오(주) 바이러스 치료 장치 또는 백신 제조 장치
CN114681586A (zh) * 2020-12-25 2022-07-01 黑龙江省儒中医疗科技有限公司 一种流感外用疫苗及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0338529A (ja) * 1989-07-04 1991-02-19 Toko Yakuhin Kogyo Kk 鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチンゲル製剤
WO2001017556A1 (fr) * 1999-09-07 2001-03-15 Shionogi & Co., Ltd. Préparations vaccinales administrables par les muqueuses
WO2009123119A1 (ja) * 2008-04-02 2009-10-08 国立大学法人徳島大学 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5158761A (en) * 1989-04-05 1992-10-27 Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Spray gel base and spray gel preparation using thereof
US5215739A (en) * 1989-04-05 1993-06-01 Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Spray gel base and spray gel preparation using thereof
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
WO2003035679A2 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Medical Research Council Molecules
EP1930025B1 (en) * 2005-08-05 2013-05-01 The University of Tokushima ANTIGEN-AND-DRUG VEHICLE WHICH ENABLES THE CHANGEOVER FROM THE SELECTIVE PRODUCTION OF IgA ANTIBODY TO THE PRODUCTION OF BOTH OF IgA AND IgG ANTIBODIES, AND TRANSNASAL/TRANSMUCOSAL VACCINE USING THE VEHICLE
JP2009209086A (ja) * 2008-03-04 2009-09-17 Masami Moriyama 粘膜投与型ワクチン

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0338529A (ja) * 1989-07-04 1991-02-19 Toko Yakuhin Kogyo Kk 鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチンゲル製剤
WO2001017556A1 (fr) * 1999-09-07 2001-03-15 Shionogi & Co., Ltd. Préparations vaccinales administrables par les muqueuses
WO2009123119A1 (ja) * 2008-04-02 2009-10-08 国立大学法人徳島大学 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASAHI-OZAKI Y ET AL., MICROBES INFECT, vol. 8, 2006, pages 2706 - 2714
GRAUER O ET AL., HISTOCHEM CELL BIOL, vol. 117, 2002, pages 351 - 362
ICHINOHE T ET AL., J VIROL, vol. 79, no. 5, 2005, pages 2910 - 2919
MIZUNO D ET AL., J IMMUNOL, vol. 176, 2006, pages 1122 - 1130
MIZUNO D ET AL., J IMMUNOL., vol. 176, 2006, pages 1122 - 30
MIZUNO D; IDE-KURIHARA M; ICHINOMIYA T; KUBO , KIDO H.: "Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen", J IMMUNOL., vol. 176, 2006, pages 1122 - 30
See also references of EP2543387A4
TIWARI, S. ET AL.: "Liposome in situ gelling system: Novel carrier based vaccine adjuvant for intranasal delivery of recombinant protein vaccine", PROCEDIA IN VACCINOLOGY, vol. 1, no. 1, 2009, pages 148 - 163, XP026800011 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013031827A1 (ja) * 2011-08-29 2013-03-07 国立大学法人徳島大学 Rsv粘膜ワクチン
EP2752199A1 (en) * 2011-08-29 2014-07-09 The University of Tokushima Rsv mucosal vaccine
EP2752199A4 (en) * 2011-08-29 2015-04-29 Univ Tokushima RSV MUCOSA VACCINE
CN110548136A (zh) * 2018-05-30 2019-12-10 王美亮 汉坦病毒长肽疫苗
WO2020045155A1 (ja) 2018-08-30 2020-03-05 国立大学法人徳島大学 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤
JPWO2020045155A1 (ja) * 2018-08-30 2021-08-10 国立大学法人徳島大学 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤
JP7393007B2 (ja) 2018-08-30 2023-12-06 国立大学法人徳島大学 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤
WO2021206103A1 (ja) * 2020-04-06 2021-10-14 応用酵素医学研究所株式会社 皮下投与型ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
US9540420B2 (en) 2017-01-10
CA2791661A1 (en) 2011-09-09
EP2543387B1 (en) 2016-10-26
US20130045232A1 (en) 2013-02-21
RU2570394C2 (ru) 2015-12-10
KR20130044204A (ko) 2013-05-02
JPWO2011108521A1 (ja) 2013-06-27
EP2543387A1 (en) 2013-01-09
BR112012022059A8 (pt) 2018-01-02
EP2543387A4 (en) 2013-06-19
CA2791661C (en) 2019-05-07
KR101751376B1 (ko) 2017-07-11
BR112012022059A2 (pt) 2016-11-01
CN103002908A (zh) 2013-03-27
BR112012022059B1 (pt) 2021-07-27
RU2012140064A (ru) 2014-04-10
JP5804278B2 (ja) 2015-11-04
CN103002908B (zh) 2015-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7095053B2 (ja) 免疫原性化合物
JP5804278B2 (ja) 粘膜ワクチン
JP4137640B2 (ja) 新規プロテオソーム−リポサッカリドワクチンアジュバント
Sokolova et al. The potential of nanoparticles for the immunization against viral infections
JP5028627B2 (ja) ＩｇＡ抗体の選択的産生からＩｇＡ及びＩｇＧ両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン
KR101751964B1 (ko) 전분을 이용한 경구 백신 급속 용해성 투여 형태
JP6054302B2 (ja) フルオロカーボン連結ペプチド製剤
CN109701010B (zh) 疫苗复合佐剂系统及其在抗原中的应用
US20200054571A1 (en) Formulation for protection through controlled release of microparticles containing recombinant outer membrane vesicles
Candela et al. Recent patents on nasal vaccines containing nanoadjuvants
EP2281574B1 (en) Antigen-and-drug vehicle comprising synthetic peptide, and mucosal vaccine using the same
WO2004052395A1 (en) L2-peptide of the human papillomavirus associated with virus-like particles
WO2021206103A1 (ja) 皮下投与型ワクチン
JP2005082581A (ja) 分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤
CN109701011B (zh) 疫苗复合佐剂系统及其在抗原中的应用
JP6085886B2 (ja) Ｒｓｖ粘膜ワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11750631

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2791661

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012503178

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20127022894

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 7596/DELNP/2012

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2011750631

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011750631

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012140064

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13582160

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112012022059

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112012022059

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20120831