JPWO2020045155A1 - 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤 - Google Patents
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Abstract
Description
Balb/cマウス(6〜7週齢、雌)の頭側背部の毛をバリカンで除去した後に、100μLのSDS水溶液(4%)を均一に塗布して皮膚バリアー機能に損傷を与え、さらに、10分後に、100μLのオボムコイド(OVM)(ナカライテスク社製)水溶液(10mg/mL)、100μLのオボアルブミン(OVA)(Sigma-Aldrich社製)水溶液(10mg/mL)、又は100μLのカゼイン(Sigma-Aldrich社製)水溶液(10mg/mL)を均一に塗布した。このようなアレルゲン塗布を合計10回(5回/週の頻度で2週間)行い、OVM、OVA、又はカゼインに対する経皮感作食物アレルギーモデルマウスを作製した。以下の実験には、経皮感作から10〜14日後のマウスを供した。
以下、それぞれのモデルマウスをそれぞれ「本発明のOVMアレルギーマウス」、「本発明のOVAアレルギーマウス」、及び「本発明のカゼイアレルギーマウス」と称する場合がある。また、これらの3種のマウスを「本発明のアレルギーマウス」と総称する場合がある。
食物アレルギー患者では、経口摂取されたアレルゲンが腸管粘膜を介して体内に取り込まれることによって、アナフィラキシーを含むアレルギー反応が誘発される。しかし従来、感作モデルマウスにアナフィラキシーを発症させる方法としては、少量のアレルゲン(数十μg〜1mg/マウス1匹)の静脈又は腹腔内注射が一般的であった。これらの投与方法は重症アナフィラキシーを確実に発症させることが可能であるが、アレルゲンの取込み経路が経口とは異なるために、ヒトにおける食物アレルギーの発症機序を正確に反映したものとは言い難い。また、大量のアレルゲン(50〜100mg/マウス1匹)をモデルマウスに経口投与して、アナフィラキシーを誘発させる試みもなされているが、大量アレルゲン投与にも係わらずアナフィラキシー誘発の程度に大きなばらつきがあり、アナフィラキシー抑制効果の定量的評価が困難であることが知られている。これらのことから、モデルマウスに高い確率でアナフィラキシーを誘発させる経口アレルゲンチャレンジ法の開発が望まれていた。
一方、アスピリン(アセチルサリチル酸;ASA)は、食物アレルギーの症状を増強する物質として知られており、ヒトでは食物依存性運動誘発アナフィラキシー試験に使用されてもいる。具体的には、食物依存性運動誘発アナフィラキシー診断で、「アスピリンの前投与」と「食物+運動」の3種の負荷とを組み合わせて診断する方法の中で、アスピリンが誘発促進剤として使用されることがあった(Brockow K et al. J Allergy Clin Immunol. 2015; 135: 977-984.e4.)。
(1)ASA前投与
本発明のOVA経皮感作モデルマウス(体重約20g)を2時間以上絶食させた後に、50%エタノールに溶解したASA(Sigma-Aldrich社製)を経口投与した(1.25mg/100μL/匹)。また、コントロールとして、ASAを含まない50%エタノールのみを経口前投与した群を設けた。
(2)OVA経口チャレンジ
ASA又はエタノールの前投与から30分後に、OVA水溶液(Sigma-Aldrich社製)を経口チャレンジした(20mg/100μL/匹)。また、コントロールとして、水のみ(OVAを含まない)を経口投与した群を設けた。
(3)直腸温モニタリング
直腸温はアナフィラキシー発症の指標として一般的に使用されており、アナフィラキシーの症状が重いほど直腸温が低下することが知られている。本実験では、OVA投与の10分前から、投与後90〜120分間の直腸温を10分間隔で測定した。そして、OVA投与10分前の温度を基準値として、OVA投与後の温度変化をモニタリングし、基準値よりも直腸温度が1度以上低下した場合、そのマウスがアナフィラキシーを発症していると判定した。
(4)結果
結果を図2に示す。また、以下の表1に、図2における表記がどの投与群に対応するかを示した。
これに対し、ASAの前投与なしに、OVAを経口投与した群では(図2の「OVA単独」)、OVAのチャレンジから10分後にわずかに直腸温が低下(1.1℃程度)したが、短時間で回復したことから、アナフィラキシーの誘発は極めて軽度と判定した。
また、ASA前投与のみを行い、OVAをチャレンジしていない群(図2の「ASA/50%エタノール」)では、直腸温が30分後から上昇する傾向が認められた。同様に、50%エタノールの前投与を行い、OVAを経口チャレンジした群(図2の「50%エタノール+OVA」)でも、直腸温の上昇が30分後から認められた。これらの群における直腸温度上昇は、50%エタノール投与の影響によるものと推測され、アレルギー症状とは無関係であると考えられる。また「ASA/50%エタノール」群でも、同様の経時変化で直腸温の上昇が認められた。
以上の結果から、本発明のアレルギーマウスに予めASAを経口投与することによって、アレルゲン経口投与によるアナフィラキシーの誘発が促進されることが明らかとなった。
上述の通り、インフルエンザ抗原(ヘマグルチニン;HAv)とSF10との複合体(HAv−SF10)は経鼻接種用ワクチンとして有用であることが既に知られている(Kimoto T, et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6):1218-1226, 2013.;Mizuno D, et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.;Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.)。またこれらの論文では、HAv−SF10を経鼻接種すると、血中だけでなく、鼻腔洗浄液や気管支肺胞洗浄液中でも、HAv特異的IgAが誘導されることが明らかになっている。
そこで、本発明者らは、経鼻接種HAv−SF10ワクチンの消化管を含む全身粘膜のIgA産生誘導に及ぼす影響を調べた。具体的には、HAv―SF10をマウス(体重約20g)に経鼻接種し、2週間後に、気管支肺胞洗浄液、鼻腔洗浄液、膣液、及び腸管液(小腸液、大腸液(便)、小腸液+大腸液)を採取して、それぞれに含まれるHAv特異的IgA量を測定した。また、SF10との比較のため、経鼻接種ワクチンの動物実験に一般的に使用される強力な粘膜アジュバントであるPoly(I:C)を用いて(Ichinohe T, et al. J Virol. 2005; 79: 2910-2919.)、同様の実験を行った。
結果を図3に示す。HAv−SF10の経鼻接種後、鼻腔洗浄液や気管支洗浄液だけでなく、膣や消化管の分泌液中でもHAv特異的IgA量が増加することが明らかとなった。salineとHAv単独投与群では、気管支洗浄液で示すようにHAv特異的IgA抗体量は検出限界値であり、この傾向は鼻腔洗浄液、膣液、及び腸管液でも同様であったため、表示を省略している。以上から、HAv単独経鼻接種に比べて、HAvとSF10の複合体の経鼻接種により、HAv特異的IgA産生量が大きく増加することが判明した。また、HAv−SF10ワクチンの経鼻接種が腸管のIgA産生に及ぼす効果が最も大きく、その効果はPoly(I:C)を含む経鼻接種ワクチンと同等か、それよりも高いことが示され、SF10のアジュバント効果が消化管で現れ易いことが示唆された。
実施例3の結果から、SF10アジュバントが消化管における抗体産生に影響を及ぼす可能性が強く示唆された。また、ウサギを用いた研究により、ヒト肺サーフェクタントと胎脂の複合体を羊水中に投与すると、ウサギ胎児消化管粘膜に選択的に吸収され、吸収部位の粘膜上皮の発育を促進することが報告されている(Nishijima K, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012; 303: L208-L214.)。これらのことから、本発明者らは、SF10が経鼻接種以外に経口接種用ワクチンでの抗原運搬体として利用できる可能性があると考え、OVAとSF10との複合体(以下、「OVA―SF10」と称する場合がある)をマウスに経口接種して小腸粘膜樹状細胞へのOVAの取込みを調べた。以下の(1)〜(4)に、実験手順及び結果を示す。
(1)蛍光標識OVA−SF10の作製
公知の手法(Mizuno D, et al. Vaccine 29(33):5368-5678, 2011.; Kimoto T, et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6):1218-1226, 2013.; Mizuno D, et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.; Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.)に従って、蛍光標識されたOVAとSF10との複合体を作製した。なお、蛍光色素標識OVAの小腸樹状細胞への取り込みを明確に測定するため、経口接種OVA―SF10に含まれるOVA量は、経口接種抗体誘導実験(通常の抗原量:0.2〜1μg/匹、体重約20g)に比較すると大量の抗原(100μg/匹、体重約20g)を用いた。
具体的には、蛍光色素のAlexa647で標識したOVA(Sigma-Aldrich社製)と上記の公知の手法で作成したSSFを混合して凍結乾燥し、蛍光標識OVAとSSFとの複合体(以下、「OVA−SSF」と称する場合がある)を作製した。上記混合の際には、SSF中のリン脂質:OVAが10:1(質量混合比)となるように調整した。経口接種の直前に、凍結乾燥済みOVA−SSF(凍結乾燥、5.5mg)当たり、生理食塩水で1.0%に調整したCVP(ハイビスワコー104、富士フィルム和光純薬社製)0.5mLを加えて均一に溶解し、さらに、胃酸による抗原の不活化を避けるために、等量の50mMの炭酸緩衝液(pH9.7)を加えて、最終蛍光標識OVA−SF10複合体(OVA−SF10)を作製した。この一連の操作により、1匹当たりに接種するワクチン液200μLには、100μgのOVA,0.5%CVP、25mM炭酸緩衝液が含まれる。
(2)マウスへの経口接種
ケタミン(62.6mg/kg体重)及びキシラジン(12.4mg/kg体重)の腹腔内注射により、マウスに麻酔を施した。マウス1匹(体重約20g)当たり、上記OVA−SF10溶液(200μL)を、経口ゾンデを用いてマウスの胃に直接接種した。また、コントロールとして、1匹当たりAlexa647標識OVA(100μg/200μL、25mM炭酸緩衝液)を、同様に経口接種した群を設けた。
(3)サンプル採取と解析
経口接種から12及び24時間後に、上記マウスから小腸粘膜を採取した。さらに、公知の手法(Harusato A, et al. Methods Mol Biol. 2016; 1422: 171-180.)に従って、2mMのEDTA,1.5mg/mLのコラゲナーゼtypeIV存在下で、小腸粘膜から粘膜上皮層細胞及び粘膜固有層細胞を単離した。
(4)フローサイトメトリー解析
得られた細胞を、樹状細胞マーカー抗体(抗マウスMHCクラスII(I−A/I−E)抗体、CD11b抗体、CD11c抗体、及びCD103抗体、BioLegend社製)によって染色した。フローサイトメトリー解析(BD FACSVerseフローサイトメーター;BD Bioscience社製)により、各種樹状細胞群における、Alexa647陽性細胞の割合を算出し、OVAの取込み細胞数を測定した。
(5)結果
図4B〜Eは、Aに示す小腸粘膜上皮層と粘膜固有層に含まれるMHC II+CD11
b+細胞(MHC II+CD11b+樹状細胞)、MHC II+CD11b+CD11c+CD103+細胞(CD103+樹状細胞)、MHC II+CD11b+CD11c+CD103−細胞(CD103−樹状細胞)のそれぞれの樹状細胞集団における、蛍光標色素標識OVAの取込みをヒストグラム解析した結果である。図4B〜Eに対応するサンプルを以下の表2に示す。
図4F〜Hに示されるように、経口ワクチン接種から12時間後では、3種全ての樹状細胞(MHC II+CD11b+樹状細胞、CD11b+、CD103+樹状細胞、及びCD11b+、CD103−樹状細胞)において、OVA単独経口接種に比較して、OVA―SF10ワクチン接種群の方が有意に蛍光色素標識OVA取込み細胞数が増加していた。一方、経口投与から24時間後では、いずれの細胞においても樹状細胞に取り込まれたOVAシグナルが検出限界程度にまで減弱していた。
以上の結果から、抗原とSF10とを組み合わせて経口接種すると、小腸粘膜中の樹状細胞に抗原が効率的に取り込まれることが明らかとなった。これまで強力なアジュバントとして知られているPoly(I:C)やCpGなどが、樹状細胞を直接刺激して抗体産生を促進することを考えると、本実験で確認されたSF10のアジュバント作用は抗原運搬効果を促進するユニークなものと言える。なお、SF10やSSFの本となった肺サーファクタントのアジュバント効果においては、Poly(I:C)やCpGなどのような樹状細胞への直接的刺激効果を示さないことが明らかになっており、安全性の高いアジュバントと言える(Mizuno D, et al. J Immunol, 176: 1122-1130, 2006)。消化管で抗原情報を認識した樹状細胞は、その後全身のリンパ節へ移動して、抗原特異的IgG及びIgAの産生を全身で可能にすると考えられている。
実施例3で、HAv−SF10の経鼻接種により消化管などでもHAv特異的IgA産生量が促進されることが示された。そこで、本発明者らは、全身のリンパ節におけるリンパ球の抗原特異的IgG及びIgA産生に、経口接種HAv−SF10ワクチンがどのような影響を及ぼすかを調べた。以下の(1)〜(4)に実験手順及び結果を示す。
(1)HAv−SF10ワクチンの経口接種
1μgのHAvを含むHAv−SF10(SSF中のリン脂質:HAvが10:1(質量混合比))を作製して、マウス(体重約20g)に経口接種した(1μg HAv/200μL/匹)。なお、HAv−SF10ワクチンの調整では、HAvが比較的胃酸の影響を受けにくいため、炭酸緩衝液は使用していない。HAv−SF10ワクチン接種は、最初の投与から、3日後、14日後、及び17日後の合計4回、同量のHAv−SF10を経口接種した(追加免疫)。また、コントロールとして、同様のスケジュールでHAを単独で経口接種した群を設けた。
(2)リンパ球の採取と培養
最終免疫(4回目のHAv−SF10の接種)から14日後に、肺、脾臓、頸部リンパ節、胸縦隔リンパ節、パイエル板、及び胃所属リンパ節からそれぞれリンパ球を採取した。HAv抗原でコーティングしたプレートに、得られたリンパ球(1×105〜1×106個)を播種して3日間培養した。培養には、1μg/mLのR848(Novus Biologicals社製)、10ng/mLのrmIL−2(BioLegend社製)、10mMのHEPES緩衝液、1mMのピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸溶液、14.3μMの2−メルカプトエタノール、10μg/mLのゲンタマイシン、及び10%の加熱不活性化胎児血清を含む、RPMI1640培養液を用いた。
(3)免疫染色
HRP標識抗IgG抗体又はHRP標識抗IgA抗体(Sigma−Aldrich社製)を用いて、培養リンパ球の免疫染色を行い、ELISpotアッセイを行った。細胞数の測定は、LUNA−IITM Automated Cell Counter(Logos Biosystems社製)を用いて実施した。
(4)結果
図5A〜Fの左側に、各臓器由来のリンパ球の染色像(IgA及びIgG産生スポット写真)を示す(A:肺、B:脾臓、C:頸部リンパ節、D:胸縦隔リンパ節、E:パイエル板、F:胃所属リンパ節)。また、図5A〜Fの右側のグラフに、1×106個のリンパ球当たりのIgA又はIgG産生細胞数(IgA:○、IgG:□、塗りつぶしシンボルはそれぞれの平均値)を示す(N.D.:not-detected、*P<0.05、**P<0.01)。
HAv単独投与群では、頸部リンパ節と脾臓由来のリンパ球においてIgG産生スポットが極わずかに検出されたが、それ以外の臓器由来のリンパ球においてスポットは検出されなかった。これに対して、HAv−SF10経口接種群では、全ての臓器由来のリンパ球において、多数のIgG及びIgA産生スポットが検出された。これらの結果から、SF10と抗原とを組み合わせて経口接種すると、全身の免疫応答が効果的に誘導され、抗原特異的IgG及びIgAの産生が強く促進されることが明らかとなった。
実施例5で認められた、HAv−SF10経口接種による抗体産生促進作用のメカニズムを探るために、HAv−SF10経口接種後の全身各組織のHAv特異的IgG及びIgA産生と、脾臓細胞のサイトカイン分泌の変化を調べた。以下の(1)〜(4)に実験手順及び結果を示す。
(1)ワクチン接種
HAv単独又はHAv−SF10を、マウス(体重約20g)に経鼻、経口接種した。比較対照としてHAvの皮下接種群を設けた。投与スケジュールは、実施例5における経口接種と同様であった(0日、3日目、14日目、及び17日目の計4回)。また、コントロールとして無処置群を設けた。それぞれの群についてn=6で実験を行った。
(2)脾臓細胞の培養とサイトカインの測定
最終免疫から2週間後に、各投与群のマウスから脾臓細胞を採取し、10μg/mLのHA存在下又は非存在下で3日間培養した。培養後に、培地中のIL−2、IFN−γ、IL−4、IL−5、IL−17A、及びIL−22の濃度をLEGENDplexTM(BioLegend社製)にて測定した。以下、IL−2及びIFN−γを「Th1サイトカイン」、IL−4及びIL−5を「Th2サイトカイン」、IL−17A及びIL−22を「Th17サイトカイン」とそれぞれ称する場合がある。
(3)HAv特異的抗体産生量の測定
上記(1)の各免疫群のマウスから、血液、気管支肺胞洗浄液、鼻腔洗浄液、及び胃抽出液、糞便抽出液を採取し、HAv特異的IgG及びIgAの濃度をこれまで記載の報告(Mizuno D, et al. J Immunol, 176: 1122-1130, 2006)に従って、ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)にて測定した。
(4)結果
上記(2)の結果を図6に示す。調整したマウス脾臓細胞では、HAv刺激有の培養条件下でTh1、Th2,Th17サイトカインの分泌量の増加が、いずれの免疫系においても認められた。これらの中で、HAv単独免疫の場合、皮下投与群(s.c.)において、経鼻接種群(i.n.)又は経口接種群(p.o.)と比較して、Th2及びTh1サイトカインの産生が強く促進されることが明らかとなった。一方、HAv−SF10ワクチンを用いた場合、経口接種群では経鼻接種群と比較して、TH17サイトカインとIL−2の分泌が強く増加することが明らかとなった。特に、IL−17Aについては、HAv−SF10ワクチン経口接種群における分泌量が経鼻接種群と比較して6.6倍も高く、有意な分泌促進効果が明らかとなった。IL−17Aは粘膜のIgA分泌に関与することが報告されている(Jaffar Z, et al. Eur J Immunol. 2009; 39: 3307-3314.; Hirota K, et al. Nat Immunol. 2013; 14: 372-379.)が、HAv−SF10経口ワクチン接種は、IL−17A分泌増加を誘導するユニークなワクチンと推定された。HAv−SF10経口ワクチン接種の特に高いIgA産生促進作用は、このようなIL−17A分泌増加を介したものである可能性が考えられる。またHAv−SF10ワクチンの経口接種では、Th17以外に高いIL−2(Th1サイトカイン)産生と、中等度のIL−5(Th2サイトカイン)産生が認められ、これらの結果が、以下に示す全身での高いHAv特異的IgAとIgG誘導に現れていると推定された。
上記(3)の結果を図7A〜Eに示す(A:血液、B:気管支肺胞洗浄液、C:鼻腔洗浄液、D:胃抽出液、E:糞便抽出液)。グラフの縦軸は、サンプル中のHAv特異的抗体濃度(白カラム:IgA、黒カラム:IgG)を示す(mean+SEM、*P<0.05、**P<0.01)。また、グラフの横軸は各接種ルートの異なる免疫群を示す(s.c.:皮下接種群、i.n.:経鼻接種群、p.o.:経口接種群)。
図7の「s.c.」のデータを見ると分かるように、HAvの皮下接種群(日本での通常行われているインフルエンザワクチンの投与方法)では、IgG産生のみが誘導され、IgA抗体はほとんど産生誘導されていなかった。これに対して、HAv−SF10ワクチンの経口接種群(p.o.)では、全ての検体において抗原特異的IgG及びIgAの産生が強く促進された。血液検体においては、HAv皮下投与群(s.c.)と比較して、HAv−SF10ワクチンの経口接種群(p.o.)では、IgGで約6.7倍、IgAで約180倍に増加していた。IgAは、病原体の侵入経路となる粘膜で分泌され、交叉免疫性の強いことが報告されている(Tamura SI, et al. Eur J Immunol. 1992; 22: 477-481.)。このことから、本実施例によって示された、HAv−SF10ワクチンの経口接種によってIgA抗体の産生が促進されるという結果は、生体防御の観点から優れた特徴を有することを示唆している。
また、HAv−SF10ワクチンの経鼻接種では、血液(A)における抗原特異的IgG及びIgAの産生量はIgGの方が約6.7倍高く産生されたが、これに対して気管支肺胞洗浄液(B)、鼻腔洗浄液(C)、及び胃抽出液(D)等の粘膜分泌液では、逆にIgAの方がIgGに比べて10倍から200倍より強く産生促進されることが明らかとなった。HAv−SF10ワクチンの経鼻接種群と経口接種群を比較すると、全ての検体において経口接種の方が強いIgG及びIgA抗体産生誘導効果を示し、この違いは気管支肺胞洗浄液で最も大きく、経鼻接種群に比較してIgAで約700倍、IgGで約200倍の強い抗体産生を示した。なお、血液(A)では、経口接種は経鼻接種よりも、IgG及びIgA量は共に約20倍の高い抗体産生量を示した。
以上のように実施例5及び6の結果から、HAv−SF10ワクチンの経口接種は全身の様々な免疫器官においてHAv特異的IgG及びIgAの産生を強く誘導することが明らかとなった。特に全身の粘膜分泌液における、抗原特異的IgA産生の強い誘導は、未だ作用機序は不明であるが、脾臓細胞におけるHAv−SF10の強いIL−17A分泌促進作用が関与している可能性が示唆された。
OVMは鶏卵中で最もアレルゲン性の高い成分であることが知られている。そこで、OVM経皮感作アレルギーマウスを用いて、OVMとSF10との複合体(以下、「OVM−SF10」)治療用ワクチンの経口接種による免疫寛容誘導効果を、アナフィラキシー抑制効果を指標に調べた。
(1)OVM−SF10治療用経口免疫寛容誘導ワクチンの作製
実施例4の(1)の手法に沿って、マウス1匹(体重約20g)当たりに接種する種々の濃度のOVM(1μg、0.1μg、0.01μg)を含む、OVM−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンを作製した(以下、それぞれ「OVM(1μg)−SF10」、「OVM(0.1μg)−SF10」、及び「OVM(0.01μg)−SF10」と称する)。なお、治療用経口免疫寛容誘導ワクチンの作成にあたっては、実施例4と作成方法は同じであるが、抗原量が微量である点に特徴を示す。具体的には、OVM(1μg、0.1μg、又は0.01μg)と、その十倍量のリン脂質(10μg、1μg、又は0.1μg)を含むSSFとを混合して凍結乾燥した。経口投与直前に1.0%CVP/生理食塩水(100μL)を加えて溶解し、さらに、等量の50mMの炭酸緩衝液(pH9.7)を加えて、1匹に経口接種するOVM−SF10ワクチン溶液(200μL)を作製した。この一連の操作により、1匹当たりに接種する治療用経口ワクチン溶液200μLには、0.01〜1μgのOVM,0.5%CVP、25mM炭酸緩衝液が含まれた経口免疫寛容誘導ワクチンが作成される。
(2)OVM−SF10治療用経口免疫寛容誘導ワクチンの接種
予めアナフィラキシー誘発状態にした経皮感作OVMアレルギーマウスを2時間絶食させた後に、治療用OVM−SF10免疫寛容誘導ワクチン(200μL)を経口接種した。ワクチン接種は、最初の投与から、3日後、14日後、及び17日後に同量の治療用免疫寛容誘導OVM−SF10ワクチンを経口接種(合計4回接種)した。また、対照群として、ワクチン非投与群(感作のみ、経口ワクチン無し)を設けた。
(3)OVMによる経口チャレンジアナフィラキシー誘発試験
実施例2の手順に沿って、チャレンジ試験前の絶食とASA投与を行った後に、経口アレルゲンチャレンジ試験を行った。具体的には、最終免疫(4回目のOVM−SF10ワクチンの投与)から14日後のマウスを絶食した後、ASAを前投与し、その後OVMの経口チャレンジを実施し(10mgOVM/200μL/匹)、120分間に渡って直腸温をモニターした。また、コントロールとして、経皮感作していないマウス(無感作マウス)でも、同様にOVMを経口チャレンジして直腸温のモニターを実施した。
(4)結果
得られたデータは箱ひげ図として図8に示した。各投与群と図8における表記は、以下の表3の通りである。また、図8中の太い実線は「感作のみ(ワクチン無し)」群の直腸温の中央値を示し、太い点線は「感作+ワクチン0.01μg」群の直腸温の中央値をそれぞれ示す。
一方、治療用経口免疫寛容誘導ワクチン投与群では、「感作+経口ワクチン0.01μg」群において、OVMチャレンジ後の直腸温の低下は認められず、アナフィラキシーの発症がほぼ完全に抑制されることが確認された。また、「感作+経口ワクチン0.1μg」群及び「感作+経口ワクチン1μg」群では、OVM投与後にわずかな直腸温の低下が認められ、「感作+経口ワクチン0.01μg」群に比べると、免疫寛容誘導効果において若干劣る傾向が示された。
以上のことから、OVM経皮感作アレルギーマウスに、治療用OVM−SF10免疫寛容誘導ワクチンを経口接種すると、免疫寛容を誘導すると考えられる。また、治療用OVM−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンの作用は、OVM含有量が微量の場合により強い免疫寛容誘導効果を示すことが示された。
実施例7の結果から、治療用OVM−SF10免疫寛容誘導ワクチン効果(免疫寛容誘導作用)は、そのOVM含有量に依存して免疫寛容誘導効果が異なることが示唆された。そこで、実施例8では、治療用OVM−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンにおける最適OVM含有量を検討した。
実施例7の手順に沿って、0.001μg〜1μgのOVMを含む治療用OVM−SF10免疫寛容誘導ワクチンを作製した(以下、それぞれ「OVM(1μg)−SF10」、「OVM(0.1μg)−SF10」、「OVM(0.01μg)−SF10」、及び「OVM(0.001μg)−SF10」と称する)。次に、それらを経皮感作OVMアレルギーマウス(体重約20g)に経口接種し、14日後にOVMによる経口チャレンジ試験を行った。チャレンジ試験に先立って、マウスの絶食、ASA投与は、実施例2に従って実施した。
OVMチャレンジ投与後約30分の直腸温の変化の箱ひげグラフを図9に示す。直腸温の平均値及び中央値は、OVM(0.01μg)−SF10経口免疫寛容誘導ワクチン投与群が最も高く、アナフィラキシー抑制効果が見られたことから、ワクチンに含まれるOVMの最適含有量は0.01μgであることが示された。通常の経口チャレンジ試験に使用されるOVM量が10mg/匹であることを考えると、チャレンジ試験に使用される抗原(OVM)の1/10,000,000という極めて微量な抗原で、SF10存在下に免疫寛容が誘導できることが明らかとなった。
実施例7及び8により、0.01μgのOVMをSF10と組み合わせた経口免疫寛容誘導ワクチンを経口接種したマウスでは、OVMに対する免疫寛容が成立することが明らかとなった。そこで、実施例9では、経口免疫寛容を誘導した0.01μgのOVMを、SF10アジュバント非存在下に単独経口接種した場合、アナフィラキシーが誘導され得るか否かを調べた。即ちOVMとSF10の複合体からOVMが遊離して、アナフィラキシーを誘発するリスクの有無の検討である。
具体的には、経皮感作OVMアレルギーモデルマウス(体重約20g、n=10)を、実施例2の手順に沿って、チャレンジ試験前の絶食とASA投与を行った後に、経口OVMチャレンジ試験を実施した。経口OVMチャレンジ試験は、0.01μgのOVMを1回経口チャレンジし、60分間の直腸温の変化を調べた。図10の箱ひげグラフに示すように、0.01μgのOVM投与後の直腸温は、試験した全てのマウスにおいて低下することは無かった。このことから、経皮感作OVMアレルギーマウスであっても、0.01μgの微量OVMの経口投与では、アナフィラキシーは誘導されないことが明らかとなった。
実施例7〜9の結果を考えあわせると、アナフィラキシー誘発準備状態にあるマウスであっても、アレルゲン単独の経口チャレンジでは免疫応答(アナフィラキシー)を誘導しない微量のOVMとSF10アジュバントを組み合わせ、これを治療用OVM−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンとして経口接種することにより、免疫寛容を成立させることが可能であることが示された。また、微量抗原とSF10との複合体から成る治療用経口ワクチンの場合、例え抗原が複合体から遊離してもアナフィラキシー発症の危険性が低く、しかも効果的な免疫寛容を誘導することが示された。アレルギー治療・予防剤として優れた作用を有することを示唆している。
牛乳アレルギーは免疫寛容の誘導が困難で、経口免疫療法の過程でアナフィラキシーによる医療事故も多く報告されている。そこで本発明者らは、カゼインとSF10との複合体(以下、「カゼイン−SF10」と称する場合がある)を作製して、予防用カゼイン−SF10経口免疫寛容ワクチンによるアナフィラキシーの発症抑制予防効果を調べた。なお、予防用経口免疫寛容誘導ワクチンの場合、アレルギーの無い状態(アナフィラキシーの発症リスクの無い状態)時に接種することから、用いるアレルゲン量は実施例7に記載の治療用経口免疫寛容誘導剤に比べて多い方が効果的であり、含有アレルゲン量が多くても副反応のリスクは少ないと考えられる。
以下の(1)〜(4)に実験手順及び結果を示す。
(1)予防用カゼイン−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンの作製
実施例4の手法に沿って、予防用カゼイン−SF10免疫寛容誘導ワクチンを作製した。具体的には、10mgのカゼイン(Sigma−Aldrich社製)及び公知の手法で作成したSSF(Kimoto T, et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6):1218-1226, 2013.;Mizuno D, et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.;Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.)100mgを混合して凍結乾燥し、カゼインとSSFとの複合体(カゼイン−SSF)を作製した。上記混合の際には、SSF中のリン脂質:カゼインが10:1(質量混合比)となるように調整した。経口投与直前に、凍結乾燥した1.1mgのカゼイン−SSFに100mLの1.0%CVP(ハイビスワコー104、富士フィルム和光純薬社製)/生理食塩水を加えて均一に溶解し、さらに、50mMの炭酸緩衝液(pH9.7)等量を加えて最終の予防用経口免疫寛容誘導ワクチン溶液(200mL)を調整した。この一連の操作により、1匹当たり経口接種する予防用免疫寛容誘導ワクチン溶液200μLには、1μgのカゼイン,0.5%CVP、25mM炭酸緩衝液が含まれる。
(2)予防用カゼイン−SF10免疫寛容誘導剤の接種
実施例4の手法に沿って、健常マウス(Balb/cマウス、体重約20g)に予防用カゼイン−SF10ワクチン溶液200μLを経口接種し、さらに、その3日後に同量のカゼイン−SF10ワクチンを経口接種した(合計2回接種)。最終免疫から1ヶ月後のマウスを、以下(3)の実験に供した。また、コントロールとして、カゼイン−SF10免疫寛容誘導ワクチンの非投与群を設けた。さらに、予防用カゼイン−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンの接種群と予防効果を比較するために、カゼイン単独の皮下注射(1μgのカゼイン/100μLの生理食塩水;2回接種)群(既知の皮下免疫療法群)を設けた。最終免疫から1ヶ月後の免疫マウスを、以下(3)の実験に供した。
(3)カゼインの経皮感作
実施例1の手法に沿って、上記(2)のマウスに対するカゼインの経皮感作を行った。具体的には、マウスの背中に1回当たりカゼイン(1mg/100μL)水溶液を週5回、2週間に渡って塗布し(計10回塗布)、カゼインの経皮感作を行った。塗布感作から1ヶ月後に、以下のカゼイン腹腔内チャレンジ試験を行った。なお、このカゼインの経皮感作条件で、アナフィラキシー誘発状態になっていることは予め確認してある。
(4)カゼインの腹腔内チャレンジによるアナフィラキシー誘発試験
上記(3)のマウスに、カゼインを腹腔内投与して(1mg/匹)、その後100分間の直腸温をモニタリングした(n=4〜5)。アレルゲンの腹腔内投与、あるいは血管内投与によるアナフィラキシーの誘発は、アナフィラキシー誘発試験の中でも最も重症で激烈な免疫反応を発現する。予防用ワクチン接種の場合、経皮アレルゲン感作を含む全てのアレルゲン感作、例えば血管内感作の可能性をも考慮して、最も重度なアナフィラキシーに対しても予防効果を示すことが期待される。このような背景から、予防用カゼイン−SF10免疫寛容誘導ワクチンの接種効果は、カゼインの腹腔内チャレンジによるアナフィラキシー誘発抑制試験で評価した。
(5)結果
結果を図11及び12に示す。図11及び12における各投与群の表記は、以下の表4の通りである。
また、図11(B)では、「皮下免疫後、経皮感作した群の個別データ」(細い実践表示)に示されるように、カゼイン皮下注射(皮下免疫療法に相当)の前投与を行った後にカゼイン経皮感作を行った群では、1例のみ腹腔内チャレンジ試験後の直腸温低下の改善が見られたが、他の4例ではむしろ顕著に直腸温が低下する増悪傾向が明らかとなった。これらの結果は、従来の皮下免疫療法は、牛乳アレルギー発症を予防する効果において、更なる検討が必要であることを示している。
一方、図12に示されるように、予防用カゼイン−SF10経口免疫寛容誘導ワクチンの接種後にカゼインの経皮感作を行った群(細い実践表示)では、4例のマウス全てにおいて、カゼインの腹腔内チャレンジを実施したのも関わらず直腸温の顕著な低下は認められなかった。これらの結果は、予防用カゼイン−SF10経口免疫寛容誘導ワクチン接種がカゼインアレルギーの発症予防に効果的であることを示している。
Claims (6)
- 肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントSF10と、抗原とを含む、経口投与用の免疫寛容誘導剤。
- 抗原が、オボムコイド、オボアルブミン、及びカゼインから選択される1又は2以上の抗原である、請求項1に記載の免疫寛容誘導剤。
- 肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントSF10と抗原とを含む、経口投与用の免疫寛容誘導剤を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
- 治療又は予防が、経口免疫療法である、請求項3に記載のアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
- アレルギー性疾患が、食物アレルギーである、請求項3又は4に記載のアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
- 食物アレルギーが、牛乳アレルギー又は卵アレルギーである、請求項5に記載のアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
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