JP2009528305A - 鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原 - Google Patents
鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009528305A JP2009528305A JP2008556645A JP2008556645A JP2009528305A JP 2009528305 A JP2009528305 A JP 2009528305A JP 2008556645 A JP2008556645 A JP 2008556645A JP 2008556645 A JP2008556645 A JP 2008556645A JP 2009528305 A JP2009528305 A JP 2009528305A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chimeric
- antigen
- vaccine
- avian influenza
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 73
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 17
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 16
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 16
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 7
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 claims 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 abstract description 101
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 abstract description 101
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 abstract description 101
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 abstract description 101
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 abstract description 93
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 18
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 abstract description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 31
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 22
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 11
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 11
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 2
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 2
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical group NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930091051 Arenine Natural products 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710149858 C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241001350371 Capua Species 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001473386 H9N2 subtype Species 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241001500343 Influenzavirus C Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710159621 Very-long-chain (3R)-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010035806 endodeoxyribonuclease PacI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- GGGDNPWHMNJRFN-UHFFFAOYSA-N metrizoic acid Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I GGGDNPWHMNJRFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、鳥インフルエンザウイルス(AIV)に対するキメラワクチン抗原について述べる。前記ワクチン抗原は、細胞免疫系だけでなく、体液性免疫系も刺激するタンパク質分子に結合したウイルスサブユニットを基にする。本キメラ抗原は、本発明の基盤を構成するキメラ分子の正確な三次元的折りたたみ(three−dimensional folding)を保証する発現系において生産することができる。前記キメラ抗原を含むワクチン組成物は、高い赤血球凝集素阻害抗体価を刺激する、鳥類及びワクチン接種された哺乳動物の両方に強力で早期の免疫反応、及びウイルス抗原に対する強力な特異的細胞反応を誘発する。キメラ抗原、及び得られたワクチン組成物も、予防的使用のためのワクチンとして、ヒト及び動物衛生の分野に適用できる。
Description
本発明は、ヒトの医学及び獣医学の分野の、特に、鳥類及び哺乳動物の両方において、鳥インフルエンザウイルスに対する強力で早期の免疫反応を発生させる体液性免疫系及び細胞免疫系の両方を高める共刺激分子と結合した、鳥インフルエンザウイルスのウイルスサブユニットを含む新規なキメラ抗原に関する。
鳥インフルエンザ(AI)は、世界的に分布している呼吸器疾患である。接触感染性が高い本疾患は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウだけでなく、多種多様な家禽及び野鳥に影響を及ぼす可能性がある。すべての鳥類の種が、感染を起こしやすく、渡りをする水鳥種が、本疾患を引き起こすウイルスの主要な自然宿主である可能性がある。
家禽類における鳥インフルエンザウイルス感染は、その病原性レベルが高いか低いかによって区別される2つの疾患型を引き起こす。「病原性の低い」形態は、見過ごされる可能性があり、一般に、軽度の症状だけを生じさせる(硬い羽、産卵の減少など)。それにもかかわらず、病原性の高い形態は、家禽内でより急速に伝播する。この形態は、48時間の期間に、90〜100%までに達する可能性のある死亡率を有する、いくつかの内部器官を攻撃する疾患を引き起こす可能性がある。
鳥インフルエンザの原因であるウイルスは、オートミクソビリダエ(Ortomixoviridae)科に属する。インフルエンザウイルスは、その抗原性の差異に基づいて、A、B及びC型に分けられる。その遺伝物質は、セグメントに分かれた負極性のリボ核酸(RNA)である。インフルエンザウイルスA及びBは、8つのセグメントを持ち、一方、インフルエンザウイルスCは、7つのセグメントのみ持つ。ウイルスゲノムがセグメントに分かれるという事実は、原型とは異なる特性を有するウイルスを生み出す遺伝的組換えを支持する(Capua;Alexander(2004)「鳥インフルエンザ:最近の発生(Avian Influenza:Recent Developments)」、Avian Pathol.33:393−404)。
ウイルスエンベロープは、2つの主要な糖タンパク質の血球凝集素(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)を含む。HAタンパク質は、細胞受容体への結合タンパク質であり、ウイルスの標的細胞への侵入のために重要な、ウイルスエンベロープと細胞膜との結合を媒介する。本タンパク質は、中和抗体の反応を誘発する。HAタンパク質上の突然変異は、伸展のより大きい又はより小さい抗原変異株を生じさせる。NAタンパク質は、細胞からのウイルスの放出を助けて宿主細胞のシアル酸を切断し、粘液を分解し、ウイルスの組織へのアクセスを容易にする。また、鳥インフルエンザウイルスのNAも、抗原変化を受ける。
通常、鳥インフルエンザのウイルスは、家禽及びブタ以外の他の種に感染しない。鳥インフルエンザウイルスによるヒト感染症の最初の症例は、1997年に香港で記録され、このとき、H5N1株が18名に対して急性呼吸疾患を引き起こし、このうち6名が死亡した。これら個々の感染は、同一の菌株により発生した香港におけるトリ集団に対する病原性の高い鳥インフルエンザの流行と同時に起きた。2003年2月、香港において、鳥インフルエンザH5N1の集団発生により、最近、南中国を旅行したある家族のうちの1名が死亡したとき、新しい警戒が発令された。家族の別の小児がこの旅行中に死亡したが、この男児の死因は不明である。
最近、AIの別の2種のウイルス株がヒトにおいて疾患を引き起こしている。1999年に香港において、小児でAI H9N2の軽症2例が出現し、2003年12月中旬に別の症例が報告された。一般に、家禽においてH9N2サブタイプは、病原性は高くない。それにもかかわらず、病原性の高いH9N2鳥インフルエンザウイルスは、2003年2月にオランダにおいて始まり、2カ月後に獣医師1名の死亡、及び別の83名では軽度疾患を引き起こした。
1997年から現在まで、ヒトに感染可能な鳥インフルエンザの集団発生が、より頻繁に発生しており、ウイルスがアジア及びヨーロッパから多数の国を通して広がっている。そのときまで、H5N1株は、ヒトにおけるインフルエンザの主要な原因因子であった。2005年10月までに、H5N1に感染した200名が報告されており、死亡率は約55%であった。アジア及びヨーロッパの13の国が影響を受け、1億2,000万羽を超えるトリが死亡又は隔離されている。
AIの集団発生の各々は、通常、億単位のトリの屠殺及び衛生管理規則の採用に至り、このことは概して大きな経済的損失を意味する。家禽における鳥インフルエンザの集団発生中に、感染したトリ、又はそのようなトリの分泌物及び排泄物に汚染した表面に接触したヒトが接触感染するリスクが存在する。トリ間の感染の伝播は、ヒトの直接感染の機会を増加させる。より多くのヒトが感染すれば、時間と共にリスクも増加し、ヒトが鳥インフルエンザ株及びヒトインフルエンザ株に感染すれば、新規なサブタイプの出現の「混合レシピエント」の役目を果たす可能性がある。ヒトインフルエンザウイルスの十分な遺伝子を有するこの新しいサブタイプは、ヒトからヒトへ容易に感染する可能性があり、1918年に生じ、2,500万人から5,000万人が死亡した「スペイン風邪」として知られる汎流行を生じさせたH1N1の変異株のような、完全に伝播性の汎流行株に形質転換することになる。
最優先課題は、家禽集団間の汎流行のさらなる蔓延を食い止めることである。この戦略は、ウイルスへのヒトの曝露の機会を減少させるために有効である。現在流行しているインフルエンザウイルスの菌株に対して有効なワクチンを、感染したトリへの曝露のリスクの高いヒトへのワクチン接種に使用することによって、鳥インフルエンザ株及びヒトインフルエンザ株によるヒト感染を生じる可能性を減少させることが可能であり、このようにして、両方のウイルス株の間の遺伝子交換が生じるリスクを減少させる。
今日、ヒトだけでなく、トリにおいても本疾患を予防するための、インフルエンザに対するワクチンの生産の手順は、ニワトリの胚でのウイルス増殖に基づいている。続いて、この方法によって生産されたウイルスを、化学的に不活性化し、半精製する。それにもかかわらず、そのような技術では、起こり得る汎流行の危機に対応することはできない。この手順を通して、ワクチンの開発及び生産は、数カ月かかる。
潜在的菌株の同定後、適切な増殖特性を得るために、増殖性の高い菌株による吸収が必要である。さらに、最近の動物間流行病の原因であるH5株が、ヒトの数例の感染例と関連し、ワクチン生産で使用されるニワトリ胚で致死性となることはより重要である。これらワクチンの生産は、病原株の操作をさらに意味する。このため、結果としてのプロセスの増強及び危機の場合におけるスケールアップを実施するための困難により、安全条件BL3の下での作業が必要である。
卵に対して急性アレルギーのヒトが、インフルエンザに対するワクチン製剤の残留する卵タンパク質により、過敏症の即時反応を起こす可能性があることが実証されている。1976年、ブタインフルエンザに対するワクチンが、ギラン−バレー症候群の頻度の増加に結びついた(Schonbergerら、(1979)「米国の全米免疫接種プログラムにおけるワクチン接種後の症候群(Syndrome following vaccination in the National Immunization Program,United States)」、1977−1977,Am.J.Epidemio,110−105−23)。現在まで、他の菌株からの以降のワクチン調製物による本疾患の発生増加は観察されていない。
培養細胞に基づくウイルスの生産は、ニワトリの胚における生産システムと交換するための魅力的な代替法として登場した。そのような戦略は、培養細胞におけるインフルエンザウイルスの生産とそれに続くウイルスの精製ステップを意味している。この手順の利点として、1)培養細胞は操作が容易で、短期間で拡大する、2)これらのシステムで生産されたインフルエンザワクチンは、第I相及び第II相臨床試験で評価されており、安全で、少なくともニワトリの胚で生産されたワクチンと同等に有効であることが実証されている(Brandsら、(1999)「Influvac:インフルエンザワクチンをベースとした安全なマディンダービーイヌ腎細胞培養(Influvac:a safe Madin Darby Canine Kidney(MDCK)cell culture based on influenza vaccine)」Dev Biol Stand.98:93−100;Perchesonら、(1999)「哺乳動物の細胞又は発育鶏卵において増殖された新規な分離インフルエンザBウイルスワクチンの反応原性及び免疫原性について研究した第I相ランダム化対照臨床試験(A Phase I,randomized controlled clinical trial to study the reactogenicity and immunogenicity of a new split influenza B virus vaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs)」、J.Virol.72:4472−7)。それにもかかわらず、本戦略は、依然として高収率を可能にする再吸収されたウイルスを必要とする限界を持つ。また、本プロセスは、ウイルス遺伝子に細胞系の特定の突然変異を導入する可能性があり、これらは原則として、結果として潜在的にワクチンの効果を低下させるHAタンパク質の構造的及び抗原的変化を特徴とする変異株の選択につながる可能性がある(Meiklejohnら、(1987)「インフルエンザウイルスワクチンの抗原性の変動及び有効性(Antigen drift and efficacy of influenza virus vaccines)」、J Infect Dis.138:618−24;Robertsonら、(1985)「卵での増殖に対するインフルエンザBウイルスの適応に伴う血球凝集素の変化(Alterations in the hemagglutinin associated with adaptation of influenza B virus to growth in eggs)」、Virology 143:166−74;Schildら、(1983)「インフルエンザウイルス抗原変異株の宿主−細胞選択に関するエビデンス(Evidence for host−cell selection of influenza virus antigenic variants)」、Nature 303:706−9)。さらなる限界には以下が含まれる、1)病原性ウイルスの生産及び操作は、高能力の施設を要求する;2)通常は、細胞培養に基づく生産システムは、費用がかかり、技術的に厳しい。
インフルエンザウイルスに対する保護は、異なる15のサブタイプが存在するHAタンパク質、またより小さな尺度では記録された9つのサブタイプが存在するNAタンパク質に対する免疫反応の結果である(Suarez,Schultz(2000)「鳥インフルエンザウイルスの免疫学:概説(Immunology of avian influenza virus:a review)」、Dev.Comp.Immunol.24:269−283;Swayne,Halvorson,(2003)、「インフルエンザ(Influenza)」、Saif,Y.M.,Barnes,H.J.,Fadly,A.M.,Glisson,J.R.,McDougald,L.R.,Swayne,D.E編、「家禽の疾患(Diseases of Poultry)」、第11版Iowa State University Press,Ames,IA,135−160ページ)。核タンパク質又は基質タンパク質などの内部タンパク質に対する免疫反応は、本分野に対する保護を保証するには十分ではない。実際に、保護は、ワクチンに含まれるHAに特有のサブタイプによって提供される。
鳥インフルエンザに対するワクチンは、生ウイルスベクターへのHA遺伝子の挿入及びその後の家禽免疫接種におけるこれら組換えベクターの使用を通して生産されている。生組換えウイルスベクターワクチンの使用は、以下のようないくつかの利点を持つ、1)これらは、体液だけでなく、細胞の反応を誘発することが可能な生ワクチンである、2)これらは、小型のニワトリにおいて投与し、早期の保護を誘発することができる。例えば、家禽ポックスウイルスをベースとした組換え体を、1日齢のトリに投与し、1週間後にマレック病に対する早期の防御を誘発させることができる(Arriolaら、(1999)Experiencias de campo en el uso de vacunos contra influenza aviar.In;Proceedings Curso de Enfermedades Respiratorias de las Aves,Asociacion Nacional de Especialistas en Ciencias Avicolas:3−13)。この種のワクチンは、ワクチン接種がされたトリと感染したトリの区別を容易にする。なぜならば、鳥インフルエンザウイルスに共通の核タンパク質又は基質のような抗原に対する抗体を誘発しないためである。それにもかかわらず、これらのワクチンは、十分に複製されない可能性があるという欠点を有し、これによりそのワクチン機能を中和することが可能である、組換えウイルスベクターに対する抗体をすでに有するトリにおいて、不完全な防御免疫を誘発する(Lyschowら、(2001)。「血球凝集素(H5)遺伝子を発現している伝染性喉頭気管炎ウイルス組換え体を用いた生ウイルスワクチン接種による致死性A鳥インフルエンザウイルス感染症からのニワトリの保護(Protection of chickens from lethal A avian influenza virus infection by live−virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin(H5)gene)」、Vaccine 19:4249−4259;Swayneら、(2000)「鶏痘ワクチンで予備免疫したニワトリにおけるインフルエンザに対する一貫した保護を提供するための鳥インフルエンザ血球凝集素遺伝子を含む組換え鶏痘ウイルスワクチンの失敗(Failure of a recombinant fowl pox virus vaccine containing an avian influenza hemagglutinin gene to provide consistent protection against influenza in chicken pre immunized with a fowl pox vaccine)」、Avian Dis.44:132−137)。組換えウイルスベクターを若齢のニワトリで使用すると、母体由来抗体の効果は、使用されたウイルスベクターの種類及び移行した母体由来抗体のレベルによって変動する可能性がある。生組換えベクター使用の別の限界は、宿主の範囲が制限され(例えば、伝染性喉頭気管炎は、ガチョウでは複製されない)、結果的には、これらのワクチンが、有効性が実証されている種に制限されるということである。
インフルエンザに対する有効なワクチン候補の出現は、起こり得る汎流行時に、迅速な反応を保証する著明な変化を必要とする。主に組換えHAの使用に基づくサブユニットワクチンの使用は、この戦略が病原性ウイルスの操作を含まず、結果として、この生産が特別な安全条件を必要としないので、魅力的な代替となる。HAに対する抗体は、本ウイルスを中和することが可能で、インフルエンザによる感染に対する自然免疫の基盤を成す(Clements 1992)「ワクチンにおける『インフルエンザワクチン』:免疫学的問題に対する新しいアプローチ(“Influenza Vaccines”,in Vaccines:New Approaches to Immunological Problems)」Ronald W.Ellis編、129−150ページ(Butterworth−Heinemann,Stoneham,MA)。HAは、斜方晶形態のウイルスエンベロープに存在する。各モノマーは、1つのジスルフィド架橋によって結合したHA1及びHA2の2つの鎖として存在する。HAは、約85kDaの分子量を有し、その後HA1及びHA2に分かれるグリコシル化前駆体ポリペプチドとして宿主細胞において産生される。HA分子の抗原変異株は、インフルエンザの集団発生及び免疫接種後の感染の制限的制御に関与する。
現在まで、インフルエンザに対するサブユニットの潜在的ワクチンとして、組換えHAの生産がバキュロウイルス発現系により実施される方法が記載されている(Smithら、US5858368;Smithら、US6245532)。昆虫の細胞で生産されるHAが、ヒト(第I相及び第II相の臨床試験において)及び家禽において評価され、両方の場合において、この安全性が実証されている。しかし、この種のワクチンは、主に、誘発することが可能な中和抗体の力価が弱いために、あまり良好な結果は得られなかった。ワクチン抗原として、HA単独では、赤血球凝集反応に関する抗体阻害物質の低い力価、及び細胞反応の低下に反映する抗原性が非常に低い。抗原性が低いため、本抗原によって有効に免疫反応を誘発するためには、高用量の投与、及びしばしば複数回の再投与が必要である。これらの不便性のため、及び鳥インフルエンザに対する有効なワクチンの需要に応えるために、非常に大量の生産が、培養細胞に基づくあらゆる生産システムに関連するその後の費用と共に必要とされる。これらの限界に加えて、計画実施の複雑さ及び1単位で免疫化される動物数が何万にも達する可能性のある家禽での複数用量の投与に関連する追加費用も念頭に置く必要がある。
したがって、鳥インフルエンザの予防における重要な問題は、ワクチン接種後に強力で早期の免疫反応を産生することが可能で、同時に、費用/良好な有益性の関係を可能にするサブユニットワクチンが、現在まで存在しないことである。
本発明は、鳥インフルエンザウイルスエンベロープ由来のHAの細胞外セグメント及びCD154分子の細胞外セグメントを含むことを特徴とする、鳥インフルエンザウイルスに対する当該のワクチンのキメラ抗原を提供することで、前述の問題を解決する。そのようなキメラタンパク質は、哺乳動物及び鳥類を鳥インフルエンザウイルス感染から保護する早期の免疫反応を誘発する。そのようなワクチン抗原の獲得は、卵での増殖を必要とはせず、生産物として、有害な免疫反応の少ない、より純粋なワクチンを提供する。そのうえ、ウイルスの不活性化又は本ウイルスの膜成分の抽出を必要とせず、抗原エピトープの変性及びその中の化学反応物質の残留物により引き起こされるヒトにおけるワクチンの安全性に関連した他の不都合を避ける。さらに、卵の非存在下で生産されるインフルエンザワクチンは、卵による適応及び継代中に生じる不均一性を避ける。このことは、高い有効性につながるインフルエンザの汎流行株によりよく適合するワクチンに結びつく。
本発明の実施形態において、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いたHAの分泌変異体(secretable variant)を使用する。HAの分泌変異体は、好ましくは、インフルエンザウイルスに対する高い力価の中和抗体の獲得を保証する免疫系の刺激配列(stimulating sequence)に結合している(分子アジュバント)。
好ましい実施形態において、キメラワクチン抗原は、本質的に、それぞれ配列同定(配列ID)番号6、配列番号8及び配列番号4に記載された配列で同定されるトリ、ブタ又はヒト起源のCD154分子の細胞外セグメントのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
本発明の実施形態において、キメラワクチン抗原は、本質的にウイルスサブタイプH5(配列番号2)、H7(配列番号9)及びH9(配列番号10)のHAの細胞外セグメントのアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
本発明の文脈において、「本質的に」という用語は、キメラ抗原の一部であるアミノ酸配列が番号付けされた配列と高いレベルの相同性を有するが、この抗原の高い変動性により、鳥インフルエンザウイルスのHA由来のいずれのアミノ酸配列も、本発明の目的のキメラ抗原の一部である可能性があることを指す。そのようなキメラ抗原は、流行性Aサブタイプ(H5N1)、サブタイプH9N1、ウイルスサブタイプH7の分離株、ヒトに感染させるタイプB、並びに他の哺乳動物及び鳥類の種を感染させるインフルエンザウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の目的のために、キメラ抗原を、組換え、合成又は化学的共役法により得ることができる。HAをコードする配列を、従来技術の逆転写及びその後のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作成し得る。しかし、本発明の実施形態において、HAをコードする配列は、病原性ウイルスに対する作業で必要とされる特別な安全条件下での作業の必要なしに、相当に短い期間で当該の配列を得ることを保証する完全な合成物である。
また、合成配列の使用は、所望の発現系に従ってコドン使用頻度の最適化を可能にする。同様の方法において、HAの合成遺伝子のデザインは、その抗原性を増加させる目的で、タンパク質の一次構造の変化に翻訳される正確な突然変異の取り込みを可能にする。
好ましい実施形態で、キメラ抗原は、C末端配列が、98%より高い純度レベルで、組換えタンパク質の精製を促進する6つのヒスチジンのペプチドを融合している、サブユニットHA1及びHA2によって構成されたヘテロ二量体である。次に、ヒスチジンの尾部のC末端で、4つの反復単位のGly4Ser(4G4S)によって構成されたスペーサーペプチドが融合している。スペーサーペプチド配列のC末端で、分子アジュバントとしてのCD154分子の細胞外ドメインが融合している。HAとCD154分子の間に位置するペプチド4G4Sは、正確な三次元的構造を得るために、両方の分子に十分な立体的自由を与えることを意図している。
本発明の目的のキメラ分子HA−CD154は、3つのポリペプチドHA−CD154の非共有結合によって構成された三量体であることができる。使用する発現系の依存において、各モノマーHA−CD154は、結合してヘテロ二量体HA1−HA2/CD154の三量体に一致することができるヘテロ二量体分子を生成する2つの分子(HA1及びHA2/CD154)に分かれる可能性がある。CD154細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列は、これら分子の三量体形成を決定する。本発明の目的のワクチン抗原の三量体構造は、免疫系のプロフェッショナルな抗原提示細胞(APC)表面のCD40受容体とキメラ分子の相互作用のために非常に重要である。
一旦、血流に放出されると、本発明のワクチン抗原は、特に、免疫系のAPC細胞表面のCD40受容体と相互作用する。CD40受容体との相互作用の後、キメラ分子HA−CD154はAPC細胞によって内部に取り入れられ、次に処理され、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIのコンテクストに示される。同時に、このキメラタンパク質の樹状細胞(DC)への結合は、活性化(CD80及びCD86)及びDC上にあるCCR−7ケモカイン受容体の二次的シグナルのレベルの増加を誘発し、このことにより、HAを取り込んだDCの局所リンパ節への移行を引き起こす。これらのイベントは、免疫化された動物の脾臓においてHA−特異的CD8+細胞障害性T細胞の濃度増加を誘発する。
また、キメラタンパク質HA−CD154は、特にB細胞と相互作用することが可能である。B細胞表面のIgMの分子とHAとの最初の相互作用は、抗原特異的B細胞の表面の受容体CD40とキメラ分子のCD154の部分との相互作用を促進する。B細胞におけるこの刺激は、キメラ分子の内在化、その処理及びMHCクラスIIコンテクストにおける提示を誘発する。これらのイベントは、Tリンパ球CD4+の活性化、及びその後の2型ヘルパーT細胞の反応の活性化をもたらし、これによりB細胞での免疫グロブリンのクラススイッチ、その成熟及び増殖を誘発する。
本発明の好ましい実施形態において、キメラワクチン抗原を、遺伝子改変した哺乳動物のミルクから得る。本発明の目的のワクチン抗原を、好ましくは授乳過程中の哺乳動物のミルクにおいて生産する。この目的で、所望のタンパク質をコードした配列が、乳腺に特異的なプロモーターの制御下で挿入されたトランスジェニック動物のミルクにおいて、又はアデノウイルスベクターを使用することによる非トランスジェニック動物の乳腺上皮の直接的形質転換を通して生産を実施することができる。
別の好ましい実施形態において、CD154分子の細胞外ドメインに融合したHAに基づくキメラ抗原を、遺伝子改変された酵母菌の培養、又はコーディング遺伝子を含むアデノウイルスベクターで形質導入した哺乳動物の細胞培養において生産した。
また、前述のキメラ抗原を含む鳥類及び哺乳動物におけるインフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を引き起こすことが可能なワクチン組成物も本発明の目的である。本発明の特定の実施形態において、そのようなワクチン組成物は、トリ、ブタ及びヒトにおいてインフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を引き起こす。ワクチン組成物を、予防の形で、全身又は粘膜経路によりヒトを含む動物に投与することができる。そのような組成物を用いたワクチン接種を通して、インフルエンザウイルスの感染に関係した莫大な人的、物質的及び経済的損失が避けられる。
(実施例1)
ウイルスA/ベトナム/1203/2004、並びにヒト、ブタ及びニワトリCD154分子由来の血球凝集素の細胞外ドメインをコードする遺伝子断片の獲得。
極めて病原性の高いウイルスA/ベトナム/1203/2004に由来するHA分子のコード配列を、化学的に合成した。一次タンパク質配列を、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information;NCBI)のデータベースより入手した(アクセス番号AY818135)。合成は、配列番号1として記載された配列で同定された配列のヒマラヤ山羊(Capra hircus)での発現のために最適化されたコドン使用頻度を使用することにより実施した。合成遺伝子は、タンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを除外したアミノ酸1から537までのHAのアミノ酸配列をコードする(配列番号2)。遺伝子合成の間に、さらなる制限部位KpnI及びXhoIを、コーディング配列の5’末端に組み込んだ。翻訳効率を増加させる目的で、コザック(Kozak)コンセンサス配列を、開始コドンの直前に組み込んだ。HAコード断片の3’末端を、以下の順序で組み込んだ:NheI制限部位、6ヒスチジン断片のコード断片、制限部位EcoRI、終止コドン及び制限部位EcoRV。
ウイルスA/ベトナム/1203/2004、並びにヒト、ブタ及びニワトリCD154分子由来の血球凝集素の細胞外ドメインをコードする遺伝子断片の獲得。
極めて病原性の高いウイルスA/ベトナム/1203/2004に由来するHA分子のコード配列を、化学的に合成した。一次タンパク質配列を、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information;NCBI)のデータベースより入手した(アクセス番号AY818135)。合成は、配列番号1として記載された配列で同定された配列のヒマラヤ山羊(Capra hircus)での発現のために最適化されたコドン使用頻度を使用することにより実施した。合成遺伝子は、タンパク質の膜貫通及び細胞質ドメインを除外したアミノ酸1から537までのHAのアミノ酸配列をコードする(配列番号2)。遺伝子合成の間に、さらなる制限部位KpnI及びXhoIを、コーディング配列の5’末端に組み込んだ。翻訳効率を増加させる目的で、コザック(Kozak)コンセンサス配列を、開始コドンの直前に組み込んだ。HAコード断片の3’末端を、以下の順序で組み込んだ:NheI制限部位、6ヒスチジン断片のコード断片、制限部位EcoRI、終止コドン及び制限部位EcoRV。
また、ヒト、ブタ及びニワトリCD154分子の細胞外ドメインのコード配列も、化学的に合成した。合成を、NCBIデータベースから参考文献AJ243435(セキショクヤケイ(Gallus gallus)に関する)、AB040443(イノシシ(Sus scrofa)に関する)及びX67878(ヒト(Homo sapiens)に関する)に従って実施した。ヒマラヤ山羊における発現のために最適化されたコドン使用頻度を、ニワトリCD154(配列番号5)及びブタCD154(配列番号7)分子の合成のために使用した。ヒトCD154(配列番号3)のコドン使用頻度は変更しなかった。Gly−Gly−Gly−Gly−Serの4つの反復単位によって構成されたペプチドをコードするセグメントを、これらの立体的自由度を確実にする目的で、3つの分子のアミノ酸末端に組み込んだ。
制限部位EcoRIを、CD154分子の細胞外ドメインのコード断片の5’末端に組み込んだ。SalI制限部位を、3’末端(終止コドンの直後)に組み込んだ。合成ヌクレオチド配列から得られたポリペプチドは、配列番号6(セキショクヤケイに関する)、配列番号8(イノシシに関する)及び配列番号4(ヒトに関する)として記載された配列で同定されるように見える。
(実施例2)
血球凝集素発現カセットの構築。
HAの人工遺伝子は、KpnI/EcoRVで消化し、次に前もって同じ酵素で消化した発現ベクターpAEC−SPT(Herreraら、(2000)Biochem Biophys.Res.Commun.279:548−551)に挿入した。得られたベクターを、pHAと名づけた。ベクターpHAを、制限エンドヌクレアーゼEcoRI(HAの終止コドンの直前のヒスチジン尾部の後で切断する)及びエンドヌクレアーゼSalI(ベクターpHAからHAの3’末端の複数のクローン部位を切断する)で消化した。CD154遺伝子を、エンドヌクレアーゼEcoRI及びSalIを用いて、GeneArtより供給されたプラスミドベクターから除去し、ベクターpHAにクローン化した。これらのクローニングから、3つの哺乳動物細胞発現ベクターを生成した:pHA−CDp(ニワトリのCD154のドメインを含む)、pHA−CDc(ブタのCD154のドメインを含む)、pHA−CDh(ヒトのCD154のドメインを含む)。すべての場合で、HAのキメラ遺伝子は、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター(Cytomegalovirus Immediate−Early Promoter;pCMV)の制御下であった。
血球凝集素発現カセットの構築。
HAの人工遺伝子は、KpnI/EcoRVで消化し、次に前もって同じ酵素で消化した発現ベクターpAEC−SPT(Herreraら、(2000)Biochem Biophys.Res.Commun.279:548−551)に挿入した。得られたベクターを、pHAと名づけた。ベクターpHAを、制限エンドヌクレアーゼEcoRI(HAの終止コドンの直前のヒスチジン尾部の後で切断する)及びエンドヌクレアーゼSalI(ベクターpHAからHAの3’末端の複数のクローン部位を切断する)で消化した。CD154遺伝子を、エンドヌクレアーゼEcoRI及びSalIを用いて、GeneArtより供給されたプラスミドベクターから除去し、ベクターpHAにクローン化した。これらのクローニングから、3つの哺乳動物細胞発現ベクターを生成した:pHA−CDp(ニワトリのCD154のドメインを含む)、pHA−CDc(ブタのCD154のドメインを含む)、pHA−CDh(ヒトのCD154のドメインを含む)。すべての場合で、HAのキメラ遺伝子は、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター(Cytomegalovirus Immediate−Early Promoter;pCMV)の制御下であった。
(実施例3)
HA遺伝子を含むアデノウイルスベクター(ΔE1ΔE3)の構築。
複製欠損アデノウイルスベクターを、AdEasyシステムを基に構築した(Tong−Chuan Hら、(1998)「組換えアデノウイルスを作成するための簡略システム(A simplified system for generating recombinant adenoviruses)」PNAS USA、95:2509−2514)。プラスミドpAdTrack−CMVを、トランスファーベクターとして使用した。AdEasyに基づくシステムは、組換えアデノウイルス構造の迅速及び単純な代替を構成する。HA並びにCD154分子のヒト、ブタ及びニワトリ変異体の細胞外ドメインに融合したHAのコード配列を、エンドヌクレアーゼXhoI及びSalIで除去し、pAdTrack−CMVベクターのXhoI部位にクローン化した。得られたベクター(ptrack−HA、ptrack−HACDp、ptrack−HACDh、ptrack−HACDc)を、PmeI消化によって直線化し、pAdEasyベクターで菌種BJ5183に共電気穿孔した。感染性ビリオンを得るために、組換えウイルスのゲノムを、エンドヌクレアーゼPacIで消化し、HEK−293細胞系に形質移入した。4種のウイルスベクター:Ad−HA、Ad−HACDp、Ad−HACDh及びAdHACDcを作成した。すべてのベクターを、HEK−293細胞系において、5×1012コロニー形成単位(CFU)の力価に達するまで増幅した。生産されたウイルスを、CsCl中で二回、遠心分離によって精製し、貯蔵緩衝液に対して透析し(10mMトリスpH8.0、2mM MgCl2、4%サクロース(Sacarose))、その後の使用のために−70℃で保存した。
HA遺伝子を含むアデノウイルスベクター(ΔE1ΔE3)の構築。
複製欠損アデノウイルスベクターを、AdEasyシステムを基に構築した(Tong−Chuan Hら、(1998)「組換えアデノウイルスを作成するための簡略システム(A simplified system for generating recombinant adenoviruses)」PNAS USA、95:2509−2514)。プラスミドpAdTrack−CMVを、トランスファーベクターとして使用した。AdEasyに基づくシステムは、組換えアデノウイルス構造の迅速及び単純な代替を構成する。HA並びにCD154分子のヒト、ブタ及びニワトリ変異体の細胞外ドメインに融合したHAのコード配列を、エンドヌクレアーゼXhoI及びSalIで除去し、pAdTrack−CMVベクターのXhoI部位にクローン化した。得られたベクター(ptrack−HA、ptrack−HACDp、ptrack−HACDh、ptrack−HACDc)を、PmeI消化によって直線化し、pAdEasyベクターで菌種BJ5183に共電気穿孔した。感染性ビリオンを得るために、組換えウイルスのゲノムを、エンドヌクレアーゼPacIで消化し、HEK−293細胞系に形質移入した。4種のウイルスベクター:Ad−HA、Ad−HACDp、Ad−HACDh及びAdHACDcを作成した。すべてのベクターを、HEK−293細胞系において、5×1012コロニー形成単位(CFU)の力価に達するまで増幅した。生産されたウイルスを、CsCl中で二回、遠心分離によって精製し、貯蔵緩衝液に対して透析し(10mMトリスpH8.0、2mM MgCl2、4%サクロース(Sacarose))、その後の使用のために−70℃で保存した。
(実施例4)
ヤギ乳腺上皮の直接導入:
使用したヤギは、授乳期間の3カ月目で、1日当たり平均1.3リットルのミルクを出した。0日目、動物に、処置中のストレスを減らすために、ジアゼパム10mgの用量を筋肉内経路で投与した。槽の大部分のミルクを除くために、動物から多量に搾乳し、乳腺を、37℃の食塩水を用いた注入によって2回すすぎ、その後搾乳した。すべての注入は、蠕動ポンプにつないだカテーテルを使用して、乳頭管(nipple’s channel)を直接通して実施した。注入は、ゆっくりと実施し、一方、同時に、注入されている乳房にマッサージを行った。
ヤギ乳腺上皮の直接導入:
使用したヤギは、授乳期間の3カ月目で、1日当たり平均1.3リットルのミルクを出した。0日目、動物に、処置中のストレスを減らすために、ジアゼパム10mgの用量を筋肉内経路で投与した。槽の大部分のミルクを除くために、動物から多量に搾乳し、乳腺を、37℃の食塩水を用いた注入によって2回すすぎ、その後搾乳した。すべての注入は、蠕動ポンプにつないだカテーテルを使用して、乳頭管(nipple’s channel)を直接通して実施した。注入は、ゆっくりと実施し、一方、同時に、注入されている乳房にマッサージを行った。
ヤギでは、乳房が2つの独立した半分に分かれている可能性がある。EGTA30mMを補充し、109CFU/mlのウイルス負荷を含むPBS溶液を、各乳腺に注入した。乳房の各半分に注入した容量は、乳房の容量によってさまざまであった(平均して、乳房の媒質で600ml)。注入後、溶液が管及び槽の全体に達して均一的に分布することを促進するために、乳房にマッサージを行った。翌日、注入した溶液を、搾乳により除去した。槽及び乳管に残る最大量のアデノウイルスベクターを取り除く目的で、再度、乳腺をPBS注入によってすすいだ。
注入した動物からのミルクの採取を、注入の48時間後に開始し、手指による搾乳により実施した。1日2回搾乳を行い、1回は朝に、もう1回は午後の終わりに実施した。大部分の採取したミルクは、以降のタンパク質の精製のために−70℃で保存した一方、少量の試料は、バッチごとのHA変異体の内容物を検出及び定量化するために使用した。
ミルクのHA変異体の検出を以下のように実施した。分離緩衝液の4容量を(10mMトリスHCl、10mM CaCl2)、150μlのミルク試料に加え、氷上で30分間インキュベートした後、試料を4℃、15,000gで30分間遠心した。血清画分を回収し、タンパク質10μlを7%ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Sodium Dodecyl Sulphate−Polyacrylamide Gel Electrophoresis;SDS−PAGE)で分離した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルターへ移し、HAの存在を、ニワトリ高度免疫血清を使用することによって検出した。ホースラディシュペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase;HRP)に共役したマウス抗ニワトリ抗体を、二次抗体として使用した。免疫反応バンドを、Amersham Pharmacia Biotechの強化化学ルミネセンス(Enhanced Chemiluminiscence;ECL)によって視覚化した(図1)。HAの変異体は、大部分はポリペプチド鎖(HA0及びHA0−CD154)の形態で生産したが、両方の分子において、ドメインHA1の存在も観察することができる。
HA変異体の定量化を、CIGBにより開発されたH5特異的ELISAにより実施した。E1ΔE3アデノウイルスベクターを注入した動物において、HAの変異体を、注入の11日後まで検出し、HA、HACDp、HACDh及びHACDcタンパク質の採取の最初の7日間における平均発現が、それぞれ0.94g/L、0.86g/L、0.78g/L、0.87g/Lであった。
(実施例5)
メタノール資化性酵母(Pichia pastoris)発現ベクターの構築。
P.パストリス(P.pastoris)発現ベクターpPS10を、制限エンドヌクレアーゼNaeIで酵素的に消化し、次に末端脱リン酸化及びHA、HACDp、HACDh及びHACDcコード遺伝子のさらなる挿入のためにアルカリリン酸塩で処理した。
メタノール資化性酵母(Pichia pastoris)発現ベクターの構築。
P.パストリス(P.pastoris)発現ベクターpPS10を、制限エンドヌクレアーゼNaeIで酵素的に消化し、次に末端脱リン酸化及びHA、HACDp、HACDh及びHACDcコード遺伝子のさらなる挿入のためにアルカリリン酸塩で処理した。
タンパク質HA、HACDp、HACDh及びHACDcのコード配列を、エンドヌクレアーゼBclI(切断部位は、HAの分泌ペプチドの直後で見られる)及びSmaI(切断部位は、停止コドンの直後で見られる)を用いた消化によって除去した。得られた末端を、先端をブラント(平滑)化させるためにクレノウポリメラーゼで処理し、次に各バンドをpPS10ベクターにクローン化し、pPS−HA、pPS−HACDp、pPS−HACDh及びpPS−HACDc酵母菌発現ベクターを得た。すべての場合で、HAの異なる変異体のコード配列は、アルコールオキシダーゼプロモーター(AOX1)の制御下であり、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のSuc2由来の分泌ペプチドに融合した。
形質変換の前に、プラスミドを、制限エンドヌクレアーゼSphIを用いた消化によって開環した。P.パストリスの菌株MP36を、電気穿孔法によって発現ベクターpPS−HA、pPS−HACDp、pPS−HACDh及びpPS−HACDcで形質転換した。そのような菌株は、形質転換後、表現型His+を得る栄養要求性変異体his3である。
ドットブロット法によって同定された形質転換クローンを、サザンブロット法により解析し、表現型MutS(メタノールの使用が低い)及びHis+と対応する、組換えプラスミドの発現カセットに対するP.パストリスの遺伝子AOX1の置換によって組込みが生じたことを判定した。AOX1の遺伝子置換は、ベクターとゲノムの間のAOX1及び3’AOX1のプロモーター領域の交差によって生じる。
これらの交差のため、遺伝子AOX1のコード領域の欠失が生じる。表現型MutSによる組換え株は、遺伝子AOX2でのオキシダーゼアルコール(AOX)の生産を修復するが、メタノールに関するこの増殖率は低い。
HAの異なる変異体をコードする遺伝子は、メタノールを通して誘導性であるプロモーターAOX1の制御下にある。P.パストリスは、低レベルの自身のタンパク質のみ分泌し、その培地はタンパク質の補充を必要としない、したがって、分泌される異種タンパク質が培地の総タンパク質の大部分を構成すること(80%まで)が予期できる。組換え抗原の生産は、5L発酵槽で培地へのメタノールの添加及び培地のpHを8.0に維持することによって実施した。図2で示すように、P.パストリスで生産されたHAの大部分は、グリコシル化され、培地に分泌された。
(実施例6)
HA、HACDp、HACDh及びHACDc抗原の精製。
ヤギミルク由来のHA、HACDh、HACDh及びHACDcの精製のために、脂肪を4℃、10,000rpmでの30分間の遠心によって除去した。無脂肪乳を、緩衝液トリスHCl pH8.0、CaCl2 10mMに希釈1:5(v/v)した。4℃で1時間後、カゼインを10,000での20分間の遠心によって沈降させた。
HA、HACDp、HACDh及びHACDc抗原の精製。
ヤギミルク由来のHA、HACDh、HACDh及びHACDcの精製のために、脂肪を4℃、10,000rpmでの30分間の遠心によって除去した。無脂肪乳を、緩衝液トリスHCl pH8.0、CaCl2 10mMに希釈1:5(v/v)した。4℃で1時間後、カゼインを10,000での20分間の遠心によって沈降させた。
抗原をそれぞれ含むミルク血清を、5μM、0.8μM及び2μMのフィルターのガラスプレフィルターでの連続的濾過によって清澄化した。清澄化した血清を、リン酸緩衝液(50mM NaH2PO4 pH8.0、150nM NaCl、10mMイミダゾール)で透析濾過し、Ni−NTAセファロースカラムにローディングした。イミダゾール50mMによる洗浄ステップを実施し、組換えタンパク質を、リン酸緩衝液中200mMイミダゾールで溶出した。
P.パストリスで生産された抗原HA、HACDp、HACDh及びHACDcの精製については、一旦、発酵を終了し、細胞を遠心で培地から分離した。組換え抗原を含む媒体を、5μM、0.8μM及び2μMのフィルターにおける連続的濾過によって清澄化した。残りの精製は、ミルクから抗原を精製することに従った処置と同様の方法で実施した。
(実施例7)
ニワトリでのHA及びHACDワクチン抗原に基づくワクチン組成物の免疫原性の評価。
免疫接種:本試験で使用したHA及びHACDp抗原を、SDS−PAGEの濃度測定分析によって測定可能である、98%を超える純度まで非変性法によって精製した。タンパク質の同一性は、質量分析法によるアミノ酸分析、及びH5に対して高度免疫血清を使用する「ウエスタンブロット法」によって確認した。両方の抗原を、油アジュバントモンタニド(Montanide)ISA720で調合した。免疫接種のために、3週齢のニワトリを使用した。使用される用量に従って、各10羽の8群を作成した。群の4羽に、抗原HAを基にした調合物を投与し、一方、別の4羽にHACDpを基にした調合物を投与した。動物を、最終調合物200μlで群ごとに抗原1μg、3μg、6μg又は12μgの皮下投与によって免疫化した。1mlのシリンジに結合した18G針を免疫接種のために使用した。抗体を投与しないプラセボ群を、本試験に組み入れた。血清学的反応の分析のための血液試料を、ワクチン接種の28日後に採取した。
ニワトリでのHA及びHACDワクチン抗原に基づくワクチン組成物の免疫原性の評価。
免疫接種:本試験で使用したHA及びHACDp抗原を、SDS−PAGEの濃度測定分析によって測定可能である、98%を超える純度まで非変性法によって精製した。タンパク質の同一性は、質量分析法によるアミノ酸分析、及びH5に対して高度免疫血清を使用する「ウエスタンブロット法」によって確認した。両方の抗原を、油アジュバントモンタニド(Montanide)ISA720で調合した。免疫接種のために、3週齢のニワトリを使用した。使用される用量に従って、各10羽の8群を作成した。群の4羽に、抗原HAを基にした調合物を投与し、一方、別の4羽にHACDpを基にした調合物を投与した。動物を、最終調合物200μlで群ごとに抗原1μg、3μg、6μg又は12μgの皮下投与によって免疫化した。1mlのシリンジに結合した18G針を免疫接種のために使用した。抗体を投与しないプラセボ群を、本試験に組み入れた。血清学的反応の分析のための血液試料を、ワクチン接種の28日後に採取した。
赤血球凝集反応阻害及びELISA:赤血球凝集反応アッセイ(IHA)の阻害のために、血清をU底マイクロタイタープレートに連続的に希釈した(最初の希釈1:2)。不活性ウイルス抗原A/ベトナム/1203/2004の血球凝集素4単位(前もってニワトリ赤血球の0.5%リン酸緩衝食塩水(PBS)懸濁液に対して滴定によって測定した)を各ウェルに加えた。混合物を室温で1時間インキュベートし、一旦この時間が経過すると、PBS中0.5%のニワトリ赤血球の同容量を各ウェルに加えた。赤血球凝集反応の力価阻害物質(titers inhibitors)を30分後に読み取った。H5に対して特異的な抗体をELISAによって決定した。プレートを、AdHAベクターに感染させた細胞培養から生産及び精製したHAタンパク質の0.5μg/ウェルで被覆した。ELISAによって得られた力価を、同様の方法で希釈した陰性試料より、平均+標準偏差の2倍、優れた光学濃度を提供する高い希釈として表した。
サイトカイン発現アッセイ:HA又はHACDpの6μgで免疫化したニワトリの脾臓を、ワクチン接種の30日後に無菌的に収集した。均一な細胞懸濁液を得るために、脾臓を小さな断片に切断し、120μMの穴径のスチールフィルターに通した。細胞を、1,000で10分間遠心して収集し、PBSに懸濁した。細胞懸濁液を、1:1(v/v)の関係でヒストパック(Histopaque)カラム1083(Sigma)にゆっくりと加え、1,000rpmで30分間遠心した。単核細胞を、インターフェーズリング(interphase ring)で収集し、PBSで3回洗浄し、RPMI1640媒質のミリリットル当たり、1×107の濃度に調整した。細胞を、ウェル当たり5×106細胞の割合で24ウェルプレートに播種した。
リンパ球増殖アッセイを実施するために、細胞をCO2 5%下の41℃で18時間、1μg/mlの濃度のタンパク質HAの添加によって刺激した。陰性対照として、プラセボでワクチン接種したニワトリの脾臓の細胞を採取した。陽性対照として、コンカナバリン(concanavaline)A(ConA)でインキュベートした脾臓細胞を使用した。培養物を18時間後に収集し、サイトカイン遺伝子の導入を評価するために総リボ核酸(RNA)を精製した。総RNAを、トリリエイジェント(Tri−Reagent)(Sigma)法を使用することによって精製した。RNAの試料は、水に懸濁し、260nmで分光測定によって定量化した。
インターロイキン2(IL−2)、インターフェロンガンマ(IFN−γ)及びグリセルアルデヒド−ホスホデヒドロゲナーゼ(GAPDH)のRNAメッセンジャーの相対レベルを測定する目的で、1991年のSvetic及び共同研究者(Svetic,Aら、(1991)、「インビボでのマウスIgD抗体に対するヤギ抗体による一次免疫化後のサイトカイン遺伝子発現(Cytokine Gene Expression after in vivo primary immunization with goat antibody to mouse IgD antibody)」、J.Immunol.147:2391−2397)の記載のように、逆転写アッセイ及びさらなるPCR(RT−PCR)を3回実施した。RNAを、製造者の指示に従って逆転写システムキット(Promega)を使用して3回逆転写した。予備研究で、分析するすべての遺伝子に対して、PCRの各サイクルで増幅したDNA量のプロフィールを作成した。使用したサイクル数は、増幅曲線の指数領域内で選択した。サイクルの最適数は、IL−12及びIFN−γでは35、GAPDHでは28であった。
陽性対照細胞(Con Aでインキュベートした)及び陰性対照細胞(プラセボ群から誘導及び非刺激)の両方を、各試験に組み入れた。構成遺伝子GAPDHを、各PCRで増幅し、当該の遺伝子を評価する前に、各反応に対する最初の相補DNAの同様な量を保証するために使用した。
PCRの後、最終反応物15μlを、2%アガロースゲル電気泳動法によって分析し、濃度測定分析によって半定量化した。バンドの輝度を、画像解析「コダック1D(Kodak 1D)」の計算プログラムを使用して測定した。結果は、当該のバンドにおけるピクセルの輝度値の平均として、及び構成遺伝子GAPDHに対して得た輝度に関するこの値の平均として推定した遺伝子の相対的発現として報告した。
ニワトリで得られた結果は、ワクチン抗原HA及びHACDpを含む油中水型調合物(water in oil formulation)が、ワクチン接種した動物に対して体液性免疫反応及び細胞免疫反応を誘発したことを示している。両方の場合で、免疫反応は、使用した用量に依存していた(図3A)。HA又はHACDpの6μgでワクチン接種した動物における赤血球凝集反応の抗体阻害物質の動態は、ワクチン接種後の第4週において、キメラ抗原HACDpがHA抗原でワクチン接種された動物において発生したIHA抗体の反応より約10倍高い反応を誘発できることを示した(図3B)。また、末梢血の単核細胞を抗原HAに曝露させると、IFN−γ及びIL−12の非常に顕著な発現が、キメラ抗原HACDpでワクチン接種される動物で観察された(表1)。この結果は、CD154のHAへの融合が、特にHA分子に対して、細胞レベルで強い反応を誘発することが可能であることを示している。
表1:細胞媒介免疫反応
インビトロの生産におけるIFN−γ及びIL−12の相対的レベルは、本群におけるすべての動物の算術平均として示す。
インビトロの生産におけるIFN−γ及びIL−12の相対的レベルは、本群におけるすべての動物の算術平均として示す。
(実施例8)
HA及びHACDh抗原に基づくワクチン組成物のヒトにおける免疫原性。
HA及びHACDhタンパク質を含むワクチン組成物の安全性、反応原性及び免疫原性について、ヒトにおける臨床試験で評価した。両方のタンパク質を、98.5%より高い純度レベルで得て、水酸化アルミニウムに吸着させて調合した。選択基準として、過去6カ月にいかなるワクチン接種も受けておらず、いかなるインフルエンザ症状も示していない25歳から40歳の健常な男性を採用した。各8名の6つの実験群を、投与する抗原の用量(25μg、50μg又は100μg)及び抗原のタイプ(HA又はHACDh)を基に作成した。0週時に、すべてのボランティアに免疫化し、4週間後に2回目の免疫接種を行った。投与は、組成物0.5mlの筋内注射によって行われた。
HA及びHACDh抗原に基づくワクチン組成物のヒトにおける免疫原性。
HA及びHACDhタンパク質を含むワクチン組成物の安全性、反応原性及び免疫原性について、ヒトにおける臨床試験で評価した。両方のタンパク質を、98.5%より高い純度レベルで得て、水酸化アルミニウムに吸着させて調合した。選択基準として、過去6カ月にいかなるワクチン接種も受けておらず、いかなるインフルエンザ症状も示していない25歳から40歳の健常な男性を採用した。各8名の6つの実験群を、投与する抗原の用量(25μg、50μg又は100μg)及び抗原のタイプ(HA又はHACDh)を基に作成した。0週時に、すべてのボランティアに免疫化し、4週間後に2回目の免疫接種を行った。投与は、組成物0.5mlの筋内注射によって行われた。
血液試料を、ワクチン接種時、及び2週間の間隔で以降の3週間に採取した。赤血球凝集反応の抗体阻害物質のレベル測定のために、血清試料を、コレラ菌(Vibrio cholera)由来のレセプター破壊酵素で処理し、続いて非特異的阻害物質の不活化のために65℃で加熱した。ウイルスA抗原/ベトナム/1203/2004に対する赤血球凝集反応を阻害する抗体を、0.5%ニワトリ赤血球を使用したマイクロタイトレーションの標準アッセイにより測定した。
ウイルスA/ベトナム/1203/2004由来のH5タンパク質に対して特異的なIgG免疫グロブリンレベルを、ELISAによって評価した。プレートは、細胞培養で生産したHAタンパク質で被覆した。次に、各血清の連続的希釈を実施した。よく洗浄した後、ウサギで生産し、HRPと複合化した抗ヒトIgG抗体を各ウェルに加えた。発色は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンで実施した。ELISAの力価は、抗原を含むウェルの光学濃度が抗原のない対応するウェルの少なくとも2倍である高い希釈として表した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、フィコールアイソパック(Ficoll Isopaque)勾配(ICN Biomedical Inc.オハイオ州Aurora)の分離によって単離し、免疫学的アッセイのために凍結保存した。解凍した後、製造業者の指示に従って、PBMCをIFN−γ ELISPOT(Ebioscience)のために使用した。簡単に述べると、プレートを、捕獲抗体で終夜被覆した。2つの洗浄ステップの後、プレートを、RPMI−1640媒質で1時間ブロックした。すべてのウェルにHA抗原を加え、5×105の細胞を播種した。培養物を、5%CO2、37℃で、48時間インキュベートした。細胞を、デカンタントし、プレートを、ビオチンと複合化した抗インターフェロン抗体で2時間インキュベートした。2つの洗浄ステップの後、HRPと複合化したアビジンを、各ウェルに加えた。発色は、基質として3−アミノ−9−エチルカルバゾールを含む溶液を使用して実施した。結果は、HA及びHACDh組換え抗原を含むワクチンが、局所の有害反応を生じさせないことを示した。
HACDhキメラタンパク質で免疫化されたボランティアと同様に、HAで免疫化されたボランティアでは、細胞免疫反応及び体液性免疫反応は、投与したタンパク質の用量と比例して増加した。それにもかかわらず、HAとHACDh変異体との比較は、キメラタンパク質が、HAの等価用量に対して4.2倍高い体液性反応(図4)、及びHAの等価用量によって生じる反応より5.2倍高い細胞反応を誘発することが可能であることを示した。
(実施例9)
HA及びHACDc抗原に基づくワクチン組成物のブタにおける免疫原性。
体重が18〜20kgのランドレース種ブタを使用した。動物を、評価する抗原及び用量によって6つの実験群に割り付けた。ブタ8頭を、実験群当たり使用した。HA及びHACDcに関して、20μg、40μg及び80μgの用量を評価した。両方のワクチン抗原を、油中水型乳濁液として調合し、2mlの用量で頚筋に対する注射によって接種した。アジュバント及びリン酸塩食塩液1:1(v/v)によって構成されたプラセボを、同様な方法で接種した。
HA及びHACDc抗原に基づくワクチン組成物のブタにおける免疫原性。
体重が18〜20kgのランドレース種ブタを使用した。動物を、評価する抗原及び用量によって6つの実験群に割り付けた。ブタ8頭を、実験群当たり使用した。HA及びHACDcに関して、20μg、40μg及び80μgの用量を評価した。両方のワクチン抗原を、油中水型乳濁液として調合し、2mlの用量で頚筋に対する注射によって接種した。アジュバント及びリン酸塩食塩液1:1(v/v)によって構成されたプラセボを、同様な方法で接種した。
血液試料を、ワクチン接種の時点、及び続く3カ月間で7日ごとに採取した。IHAの抗体価を測定する前に、血清試料を、非特異的阻害物質を不活性化するためにコレラ菌由来のレセプター破壊酵素で処理した。IHAの抗体価は、0.5%ニワトリ赤血球を使用したマイクロタイトレーションの標準アッセイにより測定した。細胞レベルでの免疫反応を、HA抗原で刺激したPBMCにおけるIFN−γ及びIL−12のRNAレベルの相対的推定によって評価した。
免疫化した動物において、正常な臨床パラメータの変化は観察されなかった。このことは、ワクチン組成物に対する有害反応が存在しないことを示唆する。組換え抗原HA及びHACDcを含むワクチンが、局部特性の極めてわずかな有害反応しか引き起こさないという結果を示した。両群において、IHA抗体価での用量依存、並びにHA抗原の存在下においてサイトカインを増殖及び産生させる細胞の能力として表される細胞反応が観察された。HACDcキメラ抗原で免疫化された群では、体液だけでなく細胞レベルで免疫反応の著しい増強が観察された。そのようなタンパク質は、IHAにおいて抗体の力価を、HAの対応する用量によって生じた力価より2.5倍高く誘発することができた。また、IFN−γ及びIL−2発現レベルに関連した細胞反応能力は、HACDcキメラ抗原で免疫化された動物では、HAの同等量で免疫化されたブタのものと比較して、それぞれ4.5及び6倍高かった。
(実施例10)
鳥インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ由来の血球凝集素に基づくキメラ抗原の発現。
コードヌクレオチド配列を、HA細胞外ドメインに関して鳥インフルエンザウイルスA/オランダ/33/03(H7N7)(配列番号9)及びA/香港/1073/99(H9N2)(配列番号10)から合成した。
鳥インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ由来の血球凝集素に基づくキメラ抗原の発現。
コードヌクレオチド配列を、HA細胞外ドメインに関して鳥インフルエンザウイルスA/オランダ/33/03(H7N7)(配列番号9)及びA/香港/1073/99(H9N2)(配列番号10)から合成した。
両方の遺伝子をヒマラヤ山羊における発現に最適なコドン使用頻度を使用することによってデザインし、制限部位XhoI(5’)及びEcoRI(3’)に隣接させた。両方の遺伝子を、ブタCD154分子の細胞外ドメインを含むアデノウイルストランスファーベクターpAdtrackに直接クローン化した。得られた組換えクローンを、HEK−293T細胞系に形質移入し、72時間後、キメラ分子の発現を培地で検出した。両方の融合タンパク質は、主に三量体として発現し、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(Immobilized metal ion affinity chromatography)の1回のステップによって培地から精製することができた。
ウイルスA/オランダ/33/03(H7N7)及びウイルスA/香港/1073/99(H9N2)由来のHAのキメラ変異体を含むアデノウイルストランスファーベクターを、pAdEasyプラスミドベクターに含まれるアデノウイルスゲノム内に相同的組換えによって組み込み、そこから、両方のタンパク質を含むアデノウイルスを生成及び増幅させた。
CD154の細胞外ドメインに融合した前述の分離株由来のHAを、ヤギミルクにおいて高濃度で生産した。この戦略は、合成遺伝子が利用できる時期から55日より短い期間でHAのキメラ変異体の数グラムを生産することを可能にした。
両方のキメラ抗原の精製後、ブタでの免疫原性実験を、油中水型調合物で、2mlの用量での頚筋に対する筋肉注射によって投与した動物当たり20μgの一定量を使用して実施した。有害反応は、観察されなかった。血清学的解析は、両方のタンパク質が、ワクチン接種後の最初の28日以内に、1:800より高いIHA抗体価に達する強力な体液性免疫反応を誘発することができることを示した。
Claims (12)
- 鳥インフルエンザウイルスエンベロープ由来のHAタンパク質の細胞外セグメント及びCD154分子の細胞外セグメントを含むことを特徴とする、鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原。
- トリ(配列番号6)、ブタ(配列番号8)又はヒト(配列番号4)由来のCD154分子の細胞外セグメントのアミノ酸配列を本質的に含むことを特徴とする、請求項1に記載のキメラワクチン抗原。
- ウイルスサブタイプH5(配列番号2)、H7(配列番号9)及びH9(配列番号10)由来のHAの細胞外セグメントのアミノ酸配列を本質的に含むことを特徴とする、請求項1に記載のキメラワクチン抗原。
- 組換え法、合成法又は化学的共役によって得られる、請求項1に記載のキメラワクチン抗原。
- 遺伝子改変した哺乳動物のミルクから得られる、請求項1に記載のキメラワクチン抗原。
- 乳腺の直接遺伝形質転換によって非トランスジェニック哺乳動物のミルクから得られる、請求項5に記載のキメラワクチン抗原。
- 乳腺の直接遺伝形質転換がアデノウイルスベクター形質導入を使用することによって実施される、請求項6に記載のキメラワクチン抗原。
- トランスジェニック哺乳動物のミルクから得られる、請求項5に記載のキメラワクチン抗原。
- 遺伝子改変の酵母菌から得られる、請求項4に記載のキメラワクチン抗原。
- 請求項1から9までに記載のキメラ抗原を含むことを特徴とする、鳥類及び哺乳動物における鳥インフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を生じさせることが可能なワクチン組成物。
- トリ、ブタ及びヒトにおいて鳥インフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を生じさせることが可能な、請求項10に記載のワクチン組成物。
- 全身又は粘膜経路によって動物に予防的に投与することができる、請求項10に記載のワクチン組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CU20060051A CU23576A1 (es) | 2006-02-28 | 2006-02-28 | Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar |
PCT/CU2007/000009 WO2007098718A1 (es) | 2006-02-28 | 2007-02-28 | Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009528305A true JP2009528305A (ja) | 2009-08-06 |
Family
ID=40130782
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008556645A Pending JP2009528305A (ja) | 2006-02-28 | 2007-02-28 | 鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090324644A1 (ja) |
EP (1) | EP1997831A1 (ja) |
JP (1) | JP2009528305A (ja) |
KR (1) | KR20080113217A (ja) |
CN (1) | CN101421302A (ja) |
AR (1) | AR059647A1 (ja) |
AU (1) | AU2007219571A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0708383A2 (ja) |
CA (1) | CA2638832A1 (ja) |
CL (1) | CL2007000526A1 (ja) |
CU (1) | CU23576A1 (ja) |
MX (1) | MX2008011143A (ja) |
RU (1) | RU2008138535A (ja) |
WO (1) | WO2007098718A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2599905T3 (es) | 2007-11-01 | 2017-02-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Composiciones y métodos para aumentar las respuestas inmunitarias a Eimeria |
JP2012525134A (ja) * | 2009-04-30 | 2012-10-22 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | インフルエンザ赤血球凝集素の組成物とその使用 |
TWI597499B (zh) * | 2009-05-28 | 2017-09-01 | 亞培生物股份有限公司 | 體外病原體檢驗技術 |
KR101262300B1 (ko) * | 2009-10-06 | 2013-05-20 | 헬릭스 주식회사 | 형질전환 식물 유래의 고병원성 조류독감 바이러스 단백질 백신 및 그 제조방법 |
US9795661B2 (en) | 2009-11-16 | 2017-10-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | TH1/TH2 polarizing vaccines |
EP3578190A1 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-11 | The Board of Trustees of the University of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to enteric pathogens |
KR101582490B1 (ko) | 2014-04-14 | 2016-01-19 | 아이디바이오 주식회사 | 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 바이러스 백신 |
MX2018013331A (es) | 2016-05-03 | 2019-06-10 | Univ Arkansas | Vector de vacuna de levadura que incluye polipeptidos inmunoestimuladores y antigenicos y metodos para su uso. |
KR101964044B1 (ko) * | 2018-03-14 | 2019-04-02 | 인제대학교 산학협력단 | 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼 |
CN112679586A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-20 | 乾元浩生物股份有限公司 | H5、h7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用 |
CN114106113B (zh) * | 2021-11-13 | 2024-04-19 | 江苏南农高科技股份有限公司 | 一种表达猪细小病毒vp2蛋白的重组杆状病毒、制备方法及应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2370937T3 (es) | 1993-09-13 | 2011-12-23 | Protein Sciences Corporation | Un método para producir vacunas antigripales polivalentes a base de hemaglutinina. |
US5762939A (en) | 1993-09-13 | 1998-06-09 | Mg-Pmc, Llc | Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus |
US20020136722A1 (en) * | 1997-06-18 | 2002-09-26 | Heath Andrew William | Vaccination method |
CU23102A1 (es) * | 2002-10-21 | 2005-12-20 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Método para la producción de proteínas recombinantes en la glándula mamaria de mamíferos no transgénicos |
US9533036B2 (en) * | 2005-11-07 | 2017-01-03 | Microvax, Llc | Methods for generating immune responses to influenza antigens with a secretable CD40L fusion protein |
-
2006
- 2006-02-28 CU CU20060051A patent/CU23576A1/es unknown
-
2007
- 2007-02-27 AR ARP070100807A patent/AR059647A1/es not_active Application Discontinuation
- 2007-02-27 CL CL2007000526A patent/CL2007000526A1/es unknown
- 2007-02-28 MX MX2008011143A patent/MX2008011143A/es unknown
- 2007-02-28 RU RU2008138535/13A patent/RU2008138535A/ru not_active Application Discontinuation
- 2007-02-28 JP JP2008556645A patent/JP2009528305A/ja active Pending
- 2007-02-28 US US12/280,568 patent/US20090324644A1/en not_active Abandoned
- 2007-02-28 EP EP07711103A patent/EP1997831A1/en not_active Withdrawn
- 2007-02-28 CA CA002638832A patent/CA2638832A1/en not_active Abandoned
- 2007-02-28 WO PCT/CU2007/000009 patent/WO2007098718A1/es active Application Filing
- 2007-02-28 AU AU2007219571A patent/AU2007219571A1/en not_active Abandoned
- 2007-02-28 KR KR1020087023743A patent/KR20080113217A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-02-28 CN CNA200780013590XA patent/CN101421302A/zh active Pending
- 2007-02-28 BR BRPI0708383-1A patent/BRPI0708383A2/pt not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007098718A8 (es) | 2008-12-18 |
CU23576A1 (es) | 2010-09-30 |
AU2007219571A1 (en) | 2007-09-07 |
WO2007098718A1 (es) | 2007-09-07 |
AR059647A1 (es) | 2008-04-16 |
RU2008138535A (ru) | 2010-04-10 |
CA2638832A1 (en) | 2007-09-07 |
EP1997831A1 (en) | 2008-12-03 |
CN101421302A (zh) | 2009-04-29 |
CL2007000526A1 (es) | 2009-03-27 |
MX2008011143A (es) | 2008-09-08 |
US20090324644A1 (en) | 2009-12-31 |
BRPI0708383A2 (pt) | 2011-05-24 |
KR20080113217A (ko) | 2008-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2009528305A (ja) | 鳥インフルエンザウイルスに対するキメラワクチン抗原 | |
JP2018166515A (ja) | インフルエンザウイルス疾患の予防及び治療で用いるためのワクチン | |
US20190134185A1 (en) | Universal influenza vaccine based on heterologous multiple m2e proteins | |
CN113186173B (zh) | 一种基于减毒流感病毒载体的新型冠状病毒肺炎疫苗 | |
US9505806B2 (en) | DNA vaccine, method of inducing the immune response, method of immunisation, antibodies specifically recognising the H5 haemagglutinin of an influenza virus and use of the DNA vaccine | |
CN103732749A (zh) | 计算优化的宽反应性的h1n1流感抗原 | |
US20090214590A1 (en) | Virus Vaccines Comprising Envelope-Bound Immunomodulatory Proteins and Methods of Use Thereof | |
WO2015163037A1 (ja) | 産卵低下症候群(eds)予防ワクチン | |
BR112012005703A2 (pt) | particuça do tipo virus, composição imunogênia e medicamento | |
MX2010006918A (es) | Virus de influenza modificado. | |
KR20060035602A (ko) | 말-2인플루엔자 바이러스의 ha1을 발현하는 dna 백신 | |
JP2021536228A (ja) | ヘマグルチニン(ha)タンパク質内の非ドミナントエピトープに対する免疫応答を誘起するためのベクター | |
US10117923B2 (en) | Production of an immunogen using a plant virus | |
JP5735121B2 (ja) | インフルエンザウィルスの組換えヘマグルチニン蛋白質及びそれを含むワクチン | |
KR20150036685A (ko) | 약독화된 돼지 인플루엔자 백신 및 이의 제조 방법 및 용도 | |
Zhang et al. | Enhancement of mucosal immune response against the M2eHBc+ antigen in mice with the fusion expression products of LTB and M2eHBc+ through mucosal immunization route | |
CN111971393A (zh) | 使用重组腺病毒的多价活流感疫苗平台 | |
Shrestha | Enhancing protective efficacy of avian influenza vaccines through targeted delivery of protective antigens to chicken immune cells | |
US20240024456A1 (en) | Ha stem vaccine for ha antibody-positive targets | |
JP2005170945A (ja) | インフルエンザ血球凝集素多価ワクチンの製造方法 | |
EP4370150A1 (en) | Overcoming antibody-interference in avians | |
Kerekov et al. | Built-in adjuvanticity of genetically and protein-engineered chimeric molecules for targeting of influenza A peptide epitopes | |
Thapa | Protective mucosal immunity elicited by intranasal DNA vaccination expressing HA1 of equine-2 influenza virus | |
JP2009102416A (ja) | インフルエンザ血球凝集素多価ワクチンの製造方法 | |
Trondsen | Preparing for an influenza pandemic: Re-evaluating the use of the whole inactivated virus vaccine formulation.–A comparison of the immune responses after intramuscular or intranasal immunization with an influenza H5N1 whole inactivated virus vaccine in a murine model. |