KR20080113217A - 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스(AI)에 대한 키메릭 백신 항원에 관한 것이다. 상기 백신 항원은 세포성 및 체액성 면역 시스템 둘 다를 자극하는 단백질 분자에 결합하는 바이러스 서브유닛에 기초한다. 키메릭 항원은 본 발명의 기초를 구성하는 키메릭 분자의 정확한 삼차 폴딩을 보장하는 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 상기 키메릭 항원을 포함하는 백신 조성물은 높은 적혈구응집소-저해 항체 역가 및 바이러스 항원에 대해 강력한 특이 세포성 반응을 자극하여 백신화된 포유동물 및 새 둘 다에서 강력한 초기 면역 반응을 유도한다. 키메릭 항원 및 또한 결과적으로 생성된 백신 조성물은 예방 용도의 백신으로서 건강한 인간 및 동물에게 적용시킬 수 있다.

조류 인플루엔자 바이러스, HA 단백질, CD154 분자

Description

조류 인플루엔자 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원{CHIMERIC VACCINE ANTIGENS AGAINST THE AVIAN INFLUENZA VIRUS}

본 발명은 인간 및 수의학적 의약 분야, 특히 체액성 및 세포성 면역계 둘 다를 증가시키는 공-자극 분자에 결합하는, 조류 인플루엔자 바이러스의 바이러스 서브유닛을 포함하는, 신규한 키메릭 항원에 관한 것으로, 이러한 바이러스에 대한 강한 초기의 면역 반응을 새 및 인간 둘 다에 나타낸다.

조류 인플루엔자(Avian Influenza; AI)는 세계적으로 분포된 호흡기 질환이다. 높은 전염성을 갖는 이 질환은 닭, 칠면조, 오리, 거위, 뿔닭의 암컷 뿐만 아니라 광범위한 가축 및 야생 조류를 감염시킬 수 있다. 이 질환을 야기하는 바이러스의 자연적 주요 저장기인 이주성 수생종인, 모든 조류종이 감염되기 쉬운 가능성이 존재한다.

가축 가금류에서의 조류 인플루엔자 바이러스는 이의 높거나 낮은 수준의 독력에 따라 구별되는 두 유형의 질환을 야기한다. "낮은 병원성" 형태는 간과될 수 있으며 일반적으로 약한 증상(예를 들어, 알 생성의 감소 및 억센 깃털)만을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 높은 병원성 형태는 가금류 사이에서 빠르게 퍼져나갔다. 이 형태는 48시간 동안 90-100%까지 이를 수 있는 사망률을 갖는 심각한 내부 기관을 공격하는 질환을 야기할 수 있다.

조류 인플루엔자 바이러스를 초래하는 바이러스는 오르토믹소바이리대(Ortomixoviridae) 과에 속한다. 인플루엔자 바이러스는 이의 항원성 차이에 기초하여 A, B 및 C 유형으로 나누어진다. 이의 유전 물질은 분절된 음극성의 리보핵산(ARN)이다. 인플루엔자 바이러스 A 및 B는 8개 분절을 가지며 C 인플루엔자 바이러스는 7개 분절만을 갖는다. 바이러스 게놈이 분절화될 것이라는 사실은 원조와는 다른 특성을 갖는 바이러스를 만드는 유전적 재조합을 뒷받침한다(Capua; Alexander (2004) Avian Influenza: Recent Developments. Avian Pathol. 33:393-404).

바이러스 외피는 두 가지의 주요 당단백질인 적혈구응집소(hemagglutinin; HA) 및 뉴라미니다제(neuraminidase; NA)를 포함한다. HA 단백질은 세포성 수용체로의 결합 단백질이며 이는 표적 세포로의 바이러스 침투를 위해 중요한, 세포성 막과 바이러스 외피의 융합을 매개한다. 이 단백질은 중화 항체의 반응을 유도한다. Mutations on the HA 단백질에서의 돌연변이는 크거나 작은 연장을 갖는 항원성 변이체를 발생시킨다. 단백질 NA는 세포로부터의 바이러스 방출을 촉진하는, 숙주 세포의 시알산을 절단하고, 점막을 퇴화시키며 조직으로의 바이러스의 접근을 용이하게 만든다. 조류 인플루엔자 바이러스의 NA는 또한 항원성 변화를 겪는다.

일반적으로, 조류 인플루엔자의 바이러스는 가금류 및 돼지로부터 다른 종을 감염시키지 않는다. 조류 인플루엔자 바이러스에 의한 인간 감염의 최초 케이스는 1997년에 홍콩에서 보고되었으며, H5N1 균주가 18명의 인간에게 급성 호흡기 질환 을 야기했으며 이 중 6명이 사망했다. 이러한 개체에서의 감염은 같은 균주에 의해 생성되는, 홍콩에서의 조류 무리에서 높은 병원성을 갖는 조류 인플루엔자의 유행과 동시에 일어난다. 2003년 2월의 홍콩에서 조류 인플루엔자 H5N1의 발생이 최근에 남부 중국으로 여행했던 가족의 맴버 중 하나의 죽음을 야기했을 때 새로운 경보가 발생했다. 가족 중 다른 아동은 이러한 방문 중에 사망했지만 그의 사망은 알려지지 않았다.

최근에, AI의 다른 두 바이러스 균주가 인간에서의 질환을 야기했다. 1999년 홍콩에서, AI H9N2의 두 경미한 경우가 아동에게 발생했으며, 2003년 12월 중순에 다른 경우가 보고되었다. 일반적으로 가금류에서 H9N2 아형은 높은 병원성을 나타내지 않는다. 그럼에도 불구하고, 2003년 네덜란드에서 시작된 높은 병원성의 H9N2 조류 인플루엔자 바이러스가 두 달 후에 수의사의 죽음을 유발했으며, 83명의 인간에서 약한 질환을 야기했다.

1997년부터 현재까지, 인간을 감염시킬 수 있는 조류 인플루엔자의 발생이 좀더 빈번해졌으며 바이러스는 아시아로부터 유럽까지 수많은 나라를 통해 퍼졌다. 현재까지, H5N1 균주는 인간에서의 인플루엔자의 주요 원인 인자이다. 2005년 10월까지, H5N1에 의해 감염된 200명의 인간이 보고되었으며, 대략 55%의 사망률을 갖는다. 아시아 및 유럽의 13개 국가가 감염되었으며, 120만 이상의 조류가 죽거나 검역되었다.

일반적으로, AI의 각각의 발생은 전체로서 큰 경제적 손실을 의미하는, 수백만 마리 새의 희생 및 위생 제어 규칙의 채택을 이끌어냈다.

가금류에서의 조류 인플루엔자의 발생 동안에 감염된 새 또는 전염성을 갖는 이러한 새의 분비물 및 배설물로 오염된 표면에 접촉한 인간에서의 위험성이 존재한다. 새들 사이의 감염의 분포는 인간의 직접적 감염의 기회를 증가시킨다. 만일 더 많은 인간이 감염될 경우, 시간에 따라 위험 또한 증가하며, 만일 인간이 조류 및 인간 인플루엔자 균주에 의해 감염될 경우 새로운 아형의 등장을 위한 "혼합물 배설물"로서 공급될 수 있다. 인간 인플루엔자 바이럿의 충분한 유전자를 갖는 이러한 새로운 아형은 인간에서 인간으로 쉽게 전이될 수 있으며, 1918년에 25만명 내지 50만명의 사람이 사망한 "스페인 독감"으로 알려진 전세계적 유행병을 발생시킨 H1N1의 변이체와 같이 완전히 점염될 수 있는 전세계적 유행병 균주에서 형질변환될 수 있을 것이다.

바로 이전에 가금류 집단 사이의 전세계적 유행병의 추가 보급이 중단되었다. 이 전략은 바이러스로의 인간의 노출 빈도를 감소시키는데 효과적이다. 감염된 새에 노출되는 위험성이 높은 인간의 백신화는 현재 인플루엔자 바이러스의 균주에 대한 효과적인 백신을 사용했으며, 조류 및 인간 인플루엔자 균주에 의한 인간 감염 가능성을 감소시킬 수 있고 이러한 방식으로 두 바이러스 균주 사이의 유전적 교환을 발생시키는 위험성이 줄어들었다.

현재에는, 인간 뿐만 아니라 조류에서의 질환의 예방을 위해, 인플루엔자에 대한 백신의 생성 방법이 닭의 배아에서의 바이러스 전파에 기초한다. 결과적으로, 이 방식으로 생산된 바이러스는 화학적으로 불활성이고 반-정제되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 기술은 가능한 전세계 유행병 위기를 보증하지는 못한다.

능한 균주의 확인 후에, 이의 흡수는 충분한 성장 특성을 수득하기 위해 고도의 생산적인 균주를 필요로 한다. 오히려, 최근의 가축유행병을 야기하는 H5 균주가 백신 생산에 사용되는 닭 배아에서 치사되도록 하는 인간에서의 몇몇 감염에 관련되었음이 더 중요하다. 이러한 백신들의 생산은 추가적으로 병원성 균주의 조절을 포함한다. 이는 과정의 결과로서 생성된 증가를 갖는 BL3 및 위기의 경우에 정률 증가하는 어려움을 갖는 안정성 조건 하에서의 연구가 필수적이기 때문이다.

달걀에 급성 알레르기를 갖는 인간은 인플루엔자에 대한 백신 제제의 잔여 달걀 단백질에 의해 즉각적인 반응의 과민증을 나타낼 수 있다. 1976년에, 돼지 인플루엔자에 대한 백신은 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome)의 빈도의 증가에 관련되어 있다(Schonberger et al. (1979) Syndrome following vaccination in the National Immunization Program, United States, 1977-1977, Am. J. Epidemio, 110-105-23). 현재까지, 다른 균주로부터의 그 후의 백신 제형을 갖는 이 질환의 발생의 증가는 관찰되지 않았다.

배양 세포에 기초한 바이러스의 생산은 닭 배아에서 생산 시스템을 교체하기 위한 매력적인 대안으로서 나타났다. 이러한 전략은 배양 세포에서 인플루엔자의 생산 및 그 후의 바이러스 정제 단계를 내포한다. 이 과정은 다음과 같은 이점이 있다: 1) 배양 세포는 조작하기 쉬우며 단기간에 배양된다, 2) 이 시스템에서의 인플루엔자 생산의 백신은 I 상 및 II상 임상 실험에서 평가되었으며 이는 적어도 닭 배아에서 생산되는 것 만큼 효과적이고 안전함이 증명되었다(Brands et al. (1999) Influvac: a sale Madin Darby Canine Kidney (MDCK) cell culture based on influenza vaccine. Dev Biol Stand. 98:93-100; Percheson et al. (1999) A Phase I, randomized controlled clinical trial to study the reactogenicity and immunogenicity of a new split influenza B virus vaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs. J. Virol. 72:4472-7). 그럼에도 불구하고, 이 전략은 고수득률을 허용하는 재흡수 바이러스를 필요로 하는 제한을 여전히 갖는다. 과정은 원칙적으로 HA 단백질에서 잠재적으로 적은 유효성의 백신을 야기할 수 있는 구조적 및 항원적 변화에 의해 특징지어진 변이체의 선택을 이끌 수 있는 바이러스 유전자에서 세포주의 특이 돌연변이를 도입할 수 있다(Meiklejohn et al. (1987) Antigen drift and efficacy of influenza virus vaccines. J Infect Dis. 138:618-24;Robertson et al. (1985) Alterations in the hemagglutinin associated with adaptation of influenza B virus to growth in eggs. Virology 143: 166-74; Schild et al. (1983) Evidence for host-cell selection of influenza virus antigenic variants. Nature 303:706-9). 추가적인 제한은 다음을 포함한다: 1) 높은 경쟁에서 유리한 병원성 바이러스 요구의 생산 및 조정; 2) 일반적으로 세포 배양에 기초한 생산 시스템은 비용이 많이 들고 기술적으로 어렵다.

인플루엔자 바이러스에 대한 보호는 15개의 상이한 아형이 존재하는 HA 단백질에 대한 면역 반응의 결과이며 9개의 아형이 존재하는 NA 단백질에 대해서는 더 적은 측정치가 보고되었다(Suarez, Schultz (2000) Immunology of avian influenza virus: a review. Dev. Comp. Immunol. 24:269-283;Swayne, Halvorson, (2003) Influenza. In: Saif, Y.M., Barnes, H.J., Fadly, A.M., Glisson, J.R., McDougald, L.R., Swayne, D.E. (Eds). Diseases of Poultry, 11^th edn. Iowa State University Press, Ames, IA, pp. 135-160). 핵-단백질 또는 매트릭스 단백질과 같은 내부 단백질에 대한 면역 반응은 이 분야에서 보호를 보증하게에 충분하지 않다. 실제적으로, 보호는 백신에 포함된 HA에 특이적인 아형에 의해 제공된다.

조류 인플루엔자에 대한 백신은 생 바이러스 백터에서 HA 유전자의 삽입 및 가금류 면역을 위한 이러한 재조합 벡터의 순차적 사용을 통해 생산된다. 생 재조합체 바이러스 벡터 백신의 사용은 여러 이점을 갖는다: 1) 이들은 체액성 뿐만 아니라 세포성 반응을 유도할 수 있는 생 백신이다, 2) 이들은 작은 닭에게 투여할 수 있으며 초기 보호를 유도한다. 예를 들어, 가금류 폭스바이러스에 기초한 재조합체는 일주일 후에 마렉병에 대한 초기 보호를 유도하는 1일령의 새에게 투여할 수 있다(Arriola et al. (1999) Experiencias de campo en el uso de vacunos contra influenza aviar. In; Proceedings Curso de Enfermedades Respiratorias de las Aves, Asociacion Nacional de Especialistas en Ciencias Avicolas: 3-13). 이 종류의 백신은 백신화된 새 및 감염된 새 사이의 차별을 쉽게 만들 수 있는데 이는 조류 인플루엔자 바이러스에 대해 일반적인 핵 단백질 또는 매트릭스로서 항원에 대한 항체를 유도하지 않기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 백신들은 이들이 이의 백신 기능을 중화할 수 있는, 재조합체 바이러스 벡터에 대한 항체를 이미 갖고 있는 새에서 부분 보호 면역성을 유도하기에 불충분하게 복제될 수 있다는 단점을 갖는다(Lyschow et al. (2001). Protection of chickens from lethal A avian influenza virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin (H5) gene. Vaccine 19:4249-4259; Swayne et al. (2000) Failure of a recombinant fowl pox virus vaccine containing an avian influenza hemagglutinin gene to provide consistent protection against influenza in chicken pre immunized with a fowl pox vaccine. Avian Dis. 44: 132-137). 재조합체 바이러스 벡터를 어린 닭에게 사용했을 때, 모계 항체의 효과가 사용된 바이러스 벡터 및 전이된 모계 항체의 수준에 따라 변할 수 있다. 생 재조합체 벡터의 사용의 다른 제한은 숙주 범위가 제한되어(예를 들어, 감염성 후두기관염은 거위에서 복제되지 않는다), 이러한 백신들이 효능이 증명된 종에 한정된다.

인플루엔자에 대한 효과적인 백신 후보제의 발생은 가능한 범유행성의 경우에 빠른 반응을 보장하는 상당한 변화를 요구한다. 재조합체 HA의 사용에 주로 기초한 서브유닛 백신의 사용은 이 전략이 병원성 바이러스에 관련되어 있지 않아 이의 생산이 종 안전성 조건을 요구하지 않으므로 매력적인 대안물을 구성한다. HA에 대한 항체는 바이러스를 중화시킬 수 있으며 인플루엔자로의 감염에 대한 자연 면역성의 기초를 구성한다[(Clements 1992) "Influenza Vaccines" in Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis, pp. 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA)]. HA는 삼랑체 형태로 바이러스 외피에 존재한다. 각 단량체는 두 사슬로서 존재하며, HA1 및 HA2는 단일 디설피드 결합에 의해 결합된다. HA는 HA1 및 HA2 상에서 순차적으로 나누어지는, 약 85 kDa의 분자 량을 갖는 글리코실화 전구체 폴리펩티드로서 숙주 세포에서 생산된다. HA 분자 상에서의 항원성 변이체는 인플루엔자 발생 및 면역화 후 감염의 제한된 조절의 원인이다.

현재까지 인플루엔자에 대한 서브유닛의 강력한 백신으로서 재조합체 HA의 생산이 바쿨로바이러스 발현 시스템에 의해 착수되는 방법이 기재되었다(Smith et al. US5858368; Smith et al. US6245532). 곤충 세포에서 생산된 HA가 인간(I 상 및 II상 임상 실험) 및 가금류에서 이의 안전성을 증명하기 위해 평가되었다. 그러나, 이 종류의 백신은 유도할 수 있는 중화 항체의 낮은 역가 때문에 그리 성공적인 결과를 나타내지 못했다. 백신 항원으로서 HA 단독 사용은 적혈구응집반응의 항체 저해제의 낮은 역가 및 감소된 세포 반응을 반영하는 매우 낮은 항원성을 갖는다. 낮은 항원성 때문에, 이 항원으로의 효과적인 면역 반응의 유도는 고투여량 및 높은 빈도의 다중 재-투여를 필요로 한다. 이러한 불편함 때문에, 조류 인플루엔자에 대한 효과적인 백신의 요구를 충족하기 위해 매우 많은 부피의 생산이 배양 세포에 기초한 모든 생산 시스템에 관련된 수반되는 비용을 필요로 한다. 이러한 제한 이외에, 단일 유닛으로 면역화될 동물의 수가 수천만에 이를 수 있는 가금류에서의 다중 투여량의 투여에 관련된 추가 비용 및 논리계산학적 복잡성을 갖는 것이 필수적이다.

그러므로, 조류 인플루엔자의 예방에서 중요한 문제는 현재까지 비용/유리한 이익 관계를 허용하는 동시에 백신화 후 강한 초기 면역 반응을 생성할 수 있는 서브유닛 백신이 존재하지 않는다는 것이다.

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 외피로부터의 HA의 세포외 세그먼트 및 CD154 분자의 세포외 세그먼트를 포함함을 특징으로 하는, 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 대상 백신의 키메릭 항원을 제공하여 상기 언급된 문제점을 해결한다. 이러한 키메릭 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 포유동물 및 조류를 보호하는 초기 면역 반응을 유도한다. 이러한 백신 항원의 수득은 적은 면역 부작용을 갖는 좀더 순수한 백신을 산물로서 수득하는, 달걀에서의 증식을 필요로 하지 않는다. 게다가, 바이러스로부터 막 성분의 추출 또는 바이러스 불활성을 요구하지 않으며, 항원성 에피토프의 변성 및 여기에서 화학 반응성의 잔기에 의해 유발되는, 인간에서 백신 안전성에 관련된 다른 단점을 피한다. 게다가, 달걀의 부재시 생산된 인플루엔자 백신은 달걀을 통한 적응 및 통과 동안에 발생하는 이질성을 피한다. 이는 고효율을 이끌어내는 인플루엔자의 유행병 균주를 더 잘 조정하는 백신을 야기한다.

본 발명의 실시형태에서 트랜스맴브레인 및 세포질 도메인이 결여된 HA의 분비성 변이체를 사용했다. HA의 분비성 변이체는 인플루엔자 바이러스에 대한 중화 항체의 높은 역가를 수득하는 것을 보증하는 면역계의 자극 서열(분자성 아쥬반트)에 바람직하게 결합한다.

바람직한 실시형태에서, 키메릭 백신 항원은 각각 서열(Seq ID.) 번호. 6, Seq ID. No. 8 및 Seq ID. No. 4를 갖는 서열 목록에서 확인된, 조류, 돼지 또는 인간 기원의 CD154 분자의 세포외 세그먼트의 아미노산 서열을 포함하는 것이 필수적인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시형태에서, 키메릭 백신 항원은 바이러스 아형 H5 (Seq ID. No.2), H7 (Seq ID. No. 9) 및 H9 (Seq ID. No. 10)의 HA의 세포외 세그먼트의 아미노산 서열을 필수적으로 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 이러한 맥락에서 용어 "필수적으로"는 키메릭 항원의 일부인 아미노산 서열이 번호가 매겨진 서열을 갖는 높은 단계의 상동성을 가짐을 의미하나, 이 항원의 높은 변이성 때문에 주류 인플루엔자 바이러스의 HA로부터의 모든 아미노산 서열이 본 발명의 키메릭 항원 목적의 일부일 수 있다. 이러한 키메릭 항원은 유력한 A 아형(H5N1), 아형 H9N1, 바이러스성 아형 H7의 분리체, 인간을 감염시키는 유형 B 뿐만 아니라 그외 포유동물 및 조류종을 감염시키는 인플루엔자 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 이러한 목적을 위해, 키메릭 항원을 재조합체, 합성에 의해 또는 화학 접합 방식을 통해 수득할 수 있다. HA를 코드하는 서열을 통상적 지술인 역전사 및 그 이후의 폴리머라제 사슬 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 생산할 수 있다. 그러나, 본 발명의 실시형태에서, HA를 코드하는 서열은 병원성 바이러스의 연구에서 요구되는 특이 안전성 조건 하에서 연구할 필요가 없는, 상당히 짧은 기간에 대상 서열을 갖도록 보증되는 완전한 합성이다.

합성 서열의 사용은 또한 요구되는 발현 시스템에 따라 코돈 사용의 최적화를 허용한다. 유사한 방식에서, HA에 대한 합성 유전자의 설계는 면역원성을 증가시키기 위한 목적을 갖는 일차 구조에서의 변화에서 번역될 점 돌연변이(punctual mutation)의 도입을 허용한다.

바람직한 실시형태에서, 키메릭 항원은 C-말단이 98%보다 높은 순도 수준을 갖는 재조합 단백질의 정제를 촉진하는 여섯개 히스티딘에 융합된 서브유닛 HA1 및 HA2에 의해 구성된 이형이량체이다. 그 후에, 히스티딘 테일의 C-말단 종단에 Gly4Ser(4G4S)의 4개의 반복된 유닛으로 구성된 스페이서 펩티드를 융합시켰다. 스페이서 펩티드의 C-말단 서열을 분자성 아쥬반트로서 CD154 분자의 세포외 도메인에 융합될 것이다. HA 및 CD154 분자 사이에 위치한 펩티드 4G4S는 정확한 삼차 구조를 얻기 위해 두 분자로부터의 충분한 입체적 자유를 주기 위한 목적이다.

본 발명의 목적인 키메릭 분자HA-CD154는 세 폴리펩티드 HA-CD154의 비-공유 유니온에 의해 구성된 삼량체일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 사용된 발현 시스템에 의존하여, 각 단량체 HA-CD154는 이형이량체 HA1-HA2/CD154의 삼량체를 이루기 위해 결합될 수 있는, 이형이량체 분자를 생성하는 두 분자(HA1 및 HA2/CD154)로 나누어질 수 있다. CD154 세포외 도메인에 상응하는 아미노산 서열은 이러한 분자 상에서 삼량체화를 결정한다. 본 발명의 목적인 백신 항원의 삼량체 구조는 면역계의 전문적 항원 제시 세포(antigen presenting cell; APC)의 표면 상에 CD40 수용체를 갖는 키메릭 분자의 상호작용에 매우 중요하다.

혈류로 방출되면, 본 발명의 백신 항원은 면역계의 APC 세포의 표면 상의 CD49 수용체와 특이적으로 상호작용한다. CD40 수용체와 상호작용한 후에, 키메릭 분자 HA-CD154는 APC 세포에 의해 흡수된 후 주조직적합성 복합(Major Histocompatibility Complex; MHC) 클래스 I의 맥락에서 진행되고 존재한다. 동시에, 수지상 세포(dendritic cells; DCs)로의 이 키메릭 단백질의 결합은 지역적 림프절로의 HA-충진 DCs의 이동을 야기하는, DCs 상의 CCR-7 케모카인(chemokine) 수용체 및 활성화의 이차 신호(CD80 및 CD86)의 증가된 수준을 유도한다. 이러한 사건은 면역화 동물의 비장에서 HA-특이 CD8+ 세포독성 T 림프구의 수준에서 증가를 유도한다.

키메릭 단백질 HA-CD154은 또한 ,B 세포와 특이적으로 상호작용할 수 있다. B 세포 표면상의 IgM 분자와 HA의 초기 상호작용은 항원 특이성 B 세포의 표면상의 수용체 CD40과 키메릭 분자의 CD154 의 부분의 상호작용을 촉진한다. B 세포에서의 이러한 자극은 키메릭 분자의 세포내이입(internalization), MHC 클래스 II 맥락에서의 이의 프로세싱 및 제시(presentation)를 유도한다. 이러한 사건은 B 세포에서의 면역글로불린 클래스 스위칭, 이의 성숙화 및 증식을 유도하는, 림프구T CD4+의 활성화 및 그 후의 T-핼퍼 유형 2 반응의 활성화를 이끌어낸다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 키메릭 백신 항원은 유전적으로 변이된 포유동물로부터의 젖에서 수득된다. 본 발명의 목적인 백신 항원은 바람직하게는 젖분비 과정 동안에 포유동물 젖에서 생산될 것이다. 이 목적으로, 원하는 단백질을 코드하는 서열이 유선에 대해 특이적인 프로모터의 제어 하에서 또는 사용된 아데노바이러스 벡터에 의한 비-트랜스제닉 동물의 유선 상피의 직접 형질전환을 통해 삽입되는 트랜스제닉 동물의 젖에서 생산될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, CD154 분자의 세포외 도메인에 융합되는 HA에 기초한 키메릭 항원은 유전적으로 변이된 효소의 배양에서 또는 코딩 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 포유동물 세포 배양에서 생산된다.

또한본 발명의 목적인 백신 조성물은 상술된 키메릭 항원을 포함하는, 조류 및 포유동물에서 인플루엔자 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 백신 조성물은 새, 돼지 및 인간에서 인플루엔자 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 생성한다. 백신 조성물은 인간을 포함하는 동물에게 전신 또는 점막 경로에 의해 예방적 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물로의 백신화를 통해 인플루엔자 바이러스의 감염에 관한 막대한 인간, 물질 및 경제적 손실을 피할 수 있다.

도 1. 각각 AdHA 및 AdHACDp로 형질도입된 염소의 젖에서 HA 및 HACDp 항원의 발현. 아데노바이러스 형질도입 후 5일째의 유청 시료에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE at 7.5% under 환원(○) 또는 비환원(△) 조건 하에서 7.5%의 SDS-PAGE로 분리했다. 항원 HA 및 HACDp의 면역 확인을 H5N3 균주엥 대한 과면역 닭 혈청을 갖는 "웨스턴 블롯"을 실시했다.

도 2. 표현형 Mut^S를 보이는 재조합체 P. 파스토리스 클론의 발현 분석. 배양 배지에 존재하는 원하는 단백질의 웨스턴 블롯. 1열: HA; 2열: HACDh; 3열: 비형질전환 MP36; 4열: 분자량 마커.

도 3. 변이체 HA 및 HACDp를 갖는 백신화된 면역 반응의 비교. (A) 10마리 닭의 8개 실험 그룹 각각에 1, 3, 6 or 12 ㎍의 HA 또는 HACDp의 독특한 피하 투여 량을 투여하였다. 백신화 후 28일째에, 적혈구응집반응의 항체 저해제의 역가를 측정했다. 결과를 각 그룹의 표준 편차의 산술 평균 +/- 로서 나타냈다. (B) 6 ㎍ 의 HA 및 HACDp으로 백신화된 닭에서의 적혈구응집반응의 항체 저해제의 동역학. 데이터를 각 시료 채취에서 그룹으로부터 모든 동물의 산술 평균으로서 나타냈다.

도 4. IHA 항체의 동역학. 백신을 화살표로 표시된 주에 투여했다. 비연속적인 선은 1:80의 역가를 나타낸다.

실시예 1: 바이러스 A/Viet Nam/1203/2004, 및 동물, 돼지 및 닭 CD154 분자로부터의 적혈구응집소의 세포외 도메인을 코드하는 유전자 세그먼트의 수득.

고 병원성 바이러스 A/Viet Nam 1203/2004로부터 유래된 HA 분자의 코딩 서열을 화학적으로 합성했다. 일차 단백질 서열을 네셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 기탁 번호 AY818135의 데이터베이스로부터 수득했다. 서열목록의 Seq ID No. 1의 서열과 동일한 서열인, 카프라 히르쿠스(Capra hircus)에서 발현을 위한 최적화된 코돈의 사용법을 사용하여 합성했다. 합성 유전자 코돈은 단백질의 막통과 및 세포질 도메인을 제거한, 1부터 537까지의 아미노산으로부터의 HA의 아미노산 서열을 코드한다(Seq ID No. 2). 유전자 합성 동안에, 추가 제한 부위 Kpn I 및 Xho I을 코딩 서열의 5 말단에 삽입했다. 번역 효율을 증가시키기 위한 목적으로, 코작(Kozak) 공통 서열을 시작 코돈 바로 전에 삽입했다. HA 코딩 단편의 3' 말단에서 다음의 순서로 포함한다: Nhe I 제한 부위, 6개 히스티딘 단편에 대한 코딩 단편, 제한 부위 EcoR I, 종결 코돈, 및 제한 부위 EcoR V.

인간, 돼지 및 닭 CD154 분자의 세포외 도메인에 대한 코딩 서열을 또한 화학적으로 합성했다. NCBI 데이터베이스로부터의 참고 AJ243435 (갈루스 갈루스; Gallus gallus), AB040443 (수스 스크로파; Sus scrofa) 및 X67878 (호모 사피엔스; Homo sapiens)에 따라 합성했다. 카프라 히르쿠스에서 발현을 위한 최적화 코돈 사용법을 닭 CD154 (Seq ID. No. 5) 및 돼지 CD154 (Seq ID. No. 7) 분자의 합성에 사용했다. 인간 CD154 (Seq ID. No. 3)의 코돈 사용법은 변화되지 않았다. Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 4회 반복 유닛에 의해 구성되는 펩티드에 대해 코드하는 세그먼트는 이의 구조적 자유를 확보하기 위한 목적으로 세 분자의 아미노 말단 끝에 포함된다.

제한 부위 EcoR I을 CD154 분자의 세포외 도메인의 코딩 단편의 5' 말단에 포함시켰다. Sal I 제한 부위를 3' 말단(시작 코돈 바로 뒤에)에 삽입했다. 합성 누클레오티드 서열로부터 유래된 결과적으로 생성된 폴리펩티드는 서열목록의 Seq ID. No. 6 (갈루스 갈루스), Seq ID. No. 8 (수스 스크로파) 및 Seq ID. No. 4 (호모 사피엔스)에서와 동일하게 나타난다.

실시예 2: 적혈구응집소 발현 카세트의 구조화.

HA의 인공 유전자를 Kpn I/ EcoR V 절단한 후 동일한 효소로 미리 절단시킨 발현 벡터 pAEC-SPT (Herrera et al. (2000) Biochem Biophys. Res. Commun. 279: 548-551) 내에 삽입했다. 결과적으로 생성된 벡터를 pHA로 명명했다. 벡터 pHA를 제한 엔도누클레아제 EcoR I(HA의 종결 코돈 바로 뒤의 히스티딘 꼬리 다음에 절 단) 및 엔도누클레아제 Sal I (HA의 3'으로부터의 벡터 pHA의 다중 클로닝 부위에서 절단)로 절단했다. CD154 유전자를 엔도누클레아제 Eco RI 및 Sal I를 갖는 GeneArt에 의해 공급된 플라스미드 벡터로부터 제거했다. 이러한 클로닝으로부터 세 포유동물 세포 발현 벡터를 생성했다: pHA-CDp(닭 CD154의 도메인 포함), pHA-CDc(돼지 CD154의 도메인 포함), pHA-CDh(인간 CD154의 도메인 포함). 모든 경우에서 HA 키메릭 유전자는 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터 (Cytomegalovirus Immediate-Early Promoter; pCMV)의 조절 하에 있다.

실시예 3: HA 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터(△E1△E3)의 구조화.

복제 결실 아데노바이러스 벡터를 AdEasy 시스템에 기초하여 구성했다(Tong-Chuan H et al. (1998). A simplified system for generating recombinant adenoviruses PNAS USA, 95: 2509-2514). 플라스미드 pAdTrack-CMV를 전이 벡터로서 사용했다. AdEasy에 기초한 시스템은 재조합체 아데노바이러스 구조의 빠르고 간단한 대안을 구성한다. HA 및 CD154 분자의 인간, 돼지 및 닭 변이체의 세포외 도메인에 융합된 HA에 대한 코딩 서열을 엔도누클레아제 Xho I 및 Sal I를 사용하여 제거하고 pAdTrack-CMV 벡터로부터 Xho I 부위 상에 클로닝했다. 결과적으로 생성된 벡터(ptrack-HA, ptrack-HACDp, ptrack-HACDh, ptrack-HACDc)를 Pme I 절단으로 선형화하고 박테리아 균주 BJ5183 내로 pAdEasy 벡터와 함께 공-전기천공했다. 감염성 비리온을 수득하기 위해, 재조합체 바이러스 게놈을 엔도누클레아제 Pac I로 절단하고 HEK-293 세포주 상에 트랜스펙션시켰다. 4개의 바이러스 벡터가 생성 됐다: Ad-HA, Ad-HACDp, Ad-HACDh 및 AdHACDc. 모든 벡터를 5x10¹² 콜로니 형성 유닛(colony forming units; CFU)의 역가에 이를 때까지 HEK-293 세포에서 증폭시켰다. 생산된 바이러스를 CsCl 내에서 이중 원심분리로 정제하고 저장 완충용액(10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl₂, 4% 사카로스)에서 투석한 후 다음 사용을 위해 -70℃에서 보관했다.

실시예 4: 염소 유선 상피의 직접 형질도입:

사용된 염소는 3달째 젖분비 중이며 매일 평균 1.3 리터의 젖을 생산한다. 0일에, 동물에게 치료 동안의 스트레스를 감소시키기 위해 근육내 경로로 10 mg투여량의 디아제팜을 투여했다. 동물의 저장기의 젖 대부분을 제거하기 위해 광범위하게 젖을 짰다; 유선을 37℃에서 식염수 용액으로의 주입을 통해 2회 세척하고 그 후에 젖을 짰다. 모든 주입은 연동 펌프에 연결된 카테터를 사용하여 유두의 채널을 통해 직접적으로 이루어진다. 주입은 동시 방식 메시지가 주입된 유방에서 적용되는 동안 천천히 이루어진다.

염소에서, 유방은 두 개의 독립체로 절반씩 나누어질 수 있다. 30 mM의 EGTA가 보충되고 10⁹ CFU/ml의 바이러스 충진을 포함하는 PBS 용액을 각 유선에 주입시켰다. 각 유방의 절반에 주입된 부피는 유방의 능력(평균으로서, 유방의 중간물에 의한 600 ml)에 따라 변할 수 있다. 주입 후에, 메시지가 유방에 적용되어 용액이 전체 관 및 유선에 균질하게 분배되는 것을 촉진한다. 다음 날에 주입된 용액을 젖을 짜서 제거했다. 저장기 및 유관에 남아있는 많은 양의 아데노바이러스 벡터를 제거하기 위한 목적으로 유선을 PBS 주입으로 다시 세척했다.

주입된 동물의 젖을 주입 후 48시간째에 수집하기 시작하고 수작업으로 젖을 짰다. 아침에 한번 및 오후의 마지막에 한번, 매일 2회 젖을 짰다. 수집된 젖의 대부분을 다음 단백질 정제를 위해 -70℃에서 보관하고, 작은 시료를 각 배치에서 HA 변이체의 함량을 검출하기 위해 사용했다.

젖에서의 HA 변이체의 검출은 다음과 같이 실행됐다. 분리 완충용액(10 mM Tris-HCI, 10mM CaCI₂)의 네 부피를 150 ㎕의 젖 시료에 첨가하고 얼음 상에서 30분 간 항온한 후 시료를 15,000 g에서 30분간 4℃에서 원심분리했다. 혈청 분획을 회수하고 10 ㎕의 단백질을 7% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis; SDS-PAGE) 상에서 분리했다. 단백질을 니트로셀룰로스 필터로 옮기고 HA의 존재를 닭 과면역 혈청을 사용하여 검출했다. 이차 항체로서 고추냉이 퍼옥시다제 마우스(Horseradish Peroxidase; HRP)에 접합된 항-닭 항체를 사용했다. 면역반응성 밴드를 아메샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)로부터의 증가된 화학발광(Enhanced Chemiluminiscence; ECL)으로 시각화했다(도 1). HA의 변이체는 폴리펩티드 사슬(HA0 및 HA0-CD154) 형태로 대부분 생성되었지만, 두 분자들에서 도메인 HA1의 존재 또한 발견될 수 있다.

HA 변이체의 정량은 CIGB 에서 발생하는 H5-특이 ELISA에서 실시했다. E1?E3 아데노바이러스 벡터를 주입한 동물에서, HA의 변이체를 주입 후 11일 째에 수집의 처음 7일 간 HA, HACDp, HACDh, 및 HACDc 단백질 각각에 대해 0.94 g/L, 0.86 g/L, 0.78 g/L, 0.87 g/L의 발현 평균으로 검출했다.

실시예 5: 피치아 파스토리스 발현 벡터의 구성.

P. 파스토리스 발현 벡터 pPS10를 제한 엔토누클레아제 Nae I로 효소적으로 절단한 후 말단 탈인산화 및 HA, HACDp, HACDh, 및 HACDc 코딩 유전자의 추가 삽입을 위해 알칼리성인산염으로 처리했다.

단백질 HA, HACDp, HACDh 및 HACDc에 대한 코딩 서열을 엔도누클레아제 BcI I (절단 부위는 HA의 분비 펩티드 바로 뒤에서 발견됨) 및 Sma I(절단 부위는 종결 코돈 바로 뒤에서 발견됨)로 절단하여 제거했다. 결과적으로 생성된 말단을 블런트 말단으로 만들기 위해 클레나우(Klenow) 폴리머라제로 처리한 후 각 밴드를 pPS10 벡터에 클로닝하여 pPS-HA, pPS-HACDp, pPS-HACDh 및 pPS-HACDc 효소 발현 벡터를 수득했다. 모든 경우에서, HA의 상이한 변이체에 대한 코딩 서열은 알코올 옥시다제 프로모터(alcohol oxidase promoter; AOX1)의 제어 하에 있으며 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 Suc2로부터의 분비 펩티드에 융합되었다

형질전환 전에, 플라스미드를 제한 엔도누클레아제 Sph I로 절단하여 열리게 했다. P. 파스토리스의 균주 MP36을 발현 벡터 pPS-HA, pPS-HACDp, pPS-HACDh 및 pPS-HACDc로 전기천공하여 형질전환했다. 이러한 균주는 영양요구성 돌연변이체 his3로, 형질전환 후에 표현형 His+을 수득했다.

점 블롯(Dot Blot)에 의해 확인된 형질전환된 클론을 표현형 Mut^S (메탄올의 낮은 사용량) 및 His+에 상응하는, 재조합체 플라스미드의 발현 카세트를 위한 P. 파스토리스의 유전자 AOX1의 치환에 의한 삽입이 일어나는 것을 검출하기 위해 서던 블롯으로 분석했다. AOX1의 유전자 치환은 벡터 및 게놈 사이에 AOX1 및 3'AOX1의 프로모터 영역의 교차에 의해 발생한다.

이러한 교차 때문에, 유전자 AOX1의 코딩 영역의 결실이 일어난다. 표현형 Mut^S는 갖는 재조합체 균주를 유전자 AOX2 상의 옥사다제 알콜(AOX)의 생산에 집중하며 메탄올에서 이의 성장률은 낮다.

HA의 상이한 변이체를 코드하는 유전자는 메탄올을 통해 유도될 수 있는, 프로모터 AOX1의 조절 하에 있다. P. 파스토리스는 낮은 수준의 자체 단백질을 분비하며 이의 배양 배지는 단백질 보충물이 필요하지 않아서 그 후에 분비되는 이종성 단백질이 배양 배지에서 총 단백질의 대부분을 구성하는(80%까지) 것으로 예상될 수 있다. 재조합체 항원의 생산은 배지로 메탄올을 첨가하여 5 L 발효기에서 이루어지며 배지의 pH는 8.0으로 유지된다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, P. 파스토리스에서 생산된 HA의 많은 부분이 글리코실화되고 배양 배지로 분비됐다.

실시예 6: HA, HACDp, HACDh, 및 HACDc 항원의 정제.

염소젖으로부터 HA, HACDh, HACDh 및 HACDc의 정제를 위해, 지방을 4℃에서 30분간 10,000 rpm으로 원심분리하여 제거했다. 무지방 젖을 완충용액 Tris-HCl pH 8.0, CaCl₂ 10 mM에서 1:5(v/v)로 희석했다. 4℃에서 1시간 후에, 20분간 10,000으로 원심분리해 카제인을 침전시켰다.

항원으로부터의 각각을 포함하는 유청을 5 μM, 0.8 μM 및 2 μM의 필터, 유리 프리필터에서 연속 여과하여 정화시켰다. 정화된 유청을 인산염 완충용액(50 mM NaH₂PO₄ pH 8.0, 150 nM NaCI, 10mM 이미다졸)에 대해 정용여과(diafiltrated)하고 Ni-NTA 세파로스 컬럼 상에 충진시켰다. 50 mM의 이미다졸로 세척하고 재조합 단백질을 인산염 완충용액 상의 200mM의 이미다졸에서 용출시켰다.

발효가 종료되면, P. 파스토리스에서 생산된 항원 HA, HACDp, HACDh 및 HACDc의 정제를 위해, 세포를 원심분리를 통해 배양 배지로부터 분리했다. 재조합체 항원을 포함하는 배지를 5 μM, 0.8 μM 및 2 μM의 필터에서 연속 여과하여 정화시켰다. 나머지 정제를 젖으로부터 항원을 정제하기 위한 다음의 방법에 유사하게 실시했다.

실시예 7: HA 및 HACD 백신 항원에 기초한 백신 조성물의 닭에서의 면역원성의 평가.

면역화: 이 시험에서 사용된 HA 및 HACDp 항원을 SDS-PAGE의 밀도계측 분석에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 98% 이상까지 비-변성 방법으로 정제했다. 단백질의 동일성을 질량분석법을 통한 아미노산 분석에 의해 그리고 H5에 대한 과면역 혈청을 사용한 "웨스턴 블롯"에 의해 확인했다. 둘 다의 항원을 유성 아쥬반트 몬타니드(Montanide) ISA 720 내에서 제형화했다. 면역화를 위해, 3주령의 닭을 사용했다. 사용된 투여량에 따라, 각 10마리 닭의 8개 그룹으로 나누었다. 4개의 그룹에게 항원 HA에 기초한 제형을 투여하고 나머지 4개 그룹에게 HACDp에 기초한 제형을 투여했다. 그룹에 따라 동물에게 1 ㎍, 3 ㎍, 6 ㎍, 또는 12 ㎍의 항원을 200 ㎕의 최종 제형으로 피하 경로를 통해 투여하여 면역화시켰다. 1ml의 주사기와 결 합된 18G의 바늘을 면역화를 위해 사용했다. 이 시험을 위해 항원을 투여하지 않은 위약 그룹을 포함시켰다. 혈청학적 반응의 분석을 위해 혈액 시료를 백신화 후 28일 째에 수집했다.

적혈구응집반응 저해 및 ELISA: 적혈구응집반응 검정의 저해(inhibition of hemagglutination assay; IHA)를 위해, 혈청을 U-형 바닥 미세역가 플레이트에 계열 희석(초기 희석 1:2)했다. 각 웰에 불활성화 바이러스 항원 A/Viet Nam/1203/2004 (인산염 완충 식염수(PBS)에서 0.5%로 닭 적혈구의 현탁에 대한 적정에 의해 미리 결정됨)의 4 적혈구응집소 유닛을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온하고 이 시간이 지나면, PBS 내 0.5%로 닭 적혈구의 유사한 부피를 각 웰에 첨가했다. 적혈구응집반응의 역가 저해제를 30분 후에 판독했다. H5에 대해 특이적인 항체를 ELISA로 측정했다. 플레이트를 AdHA 벡터로 감염된 배양 배지에서 생산되고 정제된 0.5 ㎍/웰의 HA 단백질로 코팅했다. ELISA에 의해 수득된 역가는 유사한 방식으로 희석된 음성 시료로부터, 표준 편차가 더해진 평균의 곱보다 우세한 최적 밀도가 되게 하는 더 높은 희석으로서 표현된다.

사이토카인 발현 검정: 6㎍의 HA 또는 HACDp로 면역화시킨 닭으로부터의 비장을 백신화 후 30일째에 무균 수집했다. 균질한 세포 현탁액을 얻기 위해, 비장을 작은 단편으로 절단하고 120 μM의 다공성 크기를 갖는 강철 필터를 통해 통과시켰다. 세포를 10분간 1000으로 원심분리하여 수집하고 PBS에 현탁했다. 세포 현탁액을 1:1 (v/v)로 히스토파크(Histopaque) 컬럼 1083 (Sigma)에 거쳐 서서히 적용시킨 후 30분간 1000 rpm으로 원심분리했다. 단핵성 세포를 간기 링(interphase ring)에서 수집하고 PBS로 세척하고 RPMI 1640 배지의 밀리리터 당 1x 10⁷ 세포의 농도로 조정했다. 세포를 웰 당 5x10⁶ 세포로 24 웰 플레이트에 접종했다.

림프구증식(lymphoproliferation) 검정을 실시하기 위해, 세포를 5%의 CO₂상의 41℃에서 18시간 동안, 1㎍/ml의 농도로 HA 단백질을 첨가하여 자극했다. 음성 대조로서, 위약으로 백신화한 닭의 비장으로부터의 세포를 사용했다. 양성 대조로서, 콘카나발린 A(Concanavaline A; Con A)과 항온한 비장 세포를 사용했다. 배양물을 18시간 후에 수집하고 총 리보핵산(RNA)을 사이토카인 유전자의 도입을 평가하기 위해 정제했다. 전체 RNA를 Tri-시약(Sigma) 방법을 사용하여 정제했다. RNA의 시료를 물에 현탁하고 260 nm에서 분광법으로 정량했다.

인터루킨 2 (IL-2), 인터페론 감마(IFN-γ) 및 글리세르알데히드-포스포디히드로게나제(glyceraldehyde-phosphodehydrogenase; GAPDH)의 RNA 메신저의 상대적 수준을 결정하기 위한 목적으로, 역전사 검정 및 추가 PCR (RT-PCR)을 1991년의 Svetic 및 동료의 문헌(Svetic, A. et al. (1991), Cytokine Gene Expression after in vivo primary immunization with goat antibody to mouse IgD antibody. J. Immunol. 147:2391-2397)에 기술된 바와 같이 삼중으로 실시했다. RNA를 역전사 시스템 키트(Promega)를 제조업자의 설명에 따라 삼중으로 사용하여 역전사시켰다. 이전 연구에서, 분석될 모든 유전자에 대해 각 사이클에서 증폭된 DNA 량의 프로필을 실시했다. 사용된 사이클의 수를 증폭 곡선의 급격한 영역에 내에서 선택했다. 사이클의 최적 수는 IL-12 및 IFN-γ에 대해서는 35이며 GAPDH에 대해서는 28이다.

양성 대조 세포(Con A와 항온) 및 음성 대조 세포(위약 그룹 및 비-자극 그룹에서 유래) 둘 다를 각 시험에 포함시켰다. 구조적 유전자 GAPDH를 각 PCR에서 증폭시키고 관심 유전자를 평가하기 전에 모든 반응에서 초기 상보성 ADN의 유사한 양을 보장하기 위해 사용했다.

PCR 후에, 15 ㎕의 최종 반응을 2% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고 밀도계측 분석으로 반정량했다(semiquantified). 밴드의 강도를 이미지 분석"Kodak 1D"의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정했다. 결과를 대상 밴드의 픽셀의 강도 수치의 평균으로 기록했으며 유전자의 상대적 발현으로서 구조적 유전자 GAPDH에 대해 수득된 강도에 대한 이 수치의 평균으로서 평가했다.

닭에서 수득된 결과는 백신 항원 HA 및 HACDp를 포함하는 유중수적(water in oil) 제형이 백신화 동물에서 체액성 및 세포성 반응을 유도함을 나타낸다. 둘 다의 경우에서, 면역 반응은 사용된 투여량에 의존한다(도 3A). 6 ㎍의 HA 또는 HACDp로 백신화된 동물에서의 적혈구응집반응의 항체 저해제의 동역학은 백신화 후 4주 째에 키메릭 항원 HACDp가 HA 항원으로 백신화된 동물에서 발생된 것 보다 10배 이상 높은 IHA 항체의 반응을 유도할 수 있다는 것을 보인다(도 3B). 또한, 키메릭 항원 HACDp로 백신화된 동물에서 말초 혈액의 단핵 세포가 항원 HA에 노출되었을 때 IFN-γ 및 IL-12의 고도의 현저한 발현이 발견된다(표 1). 이 결과는 HA로의 CD154의 융합이 HA 분자에 대해 특이적인, 세포성 수준에서 강한 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.

실시예 8: HA 및 HACDh 항원에 기초한 백신 조성물의 인간에서의 면역원성.

HA 및 HACDh 단백질을 포함하는 백신 조성물의 안전성, 반응성 및 면역원성을 인간에서의 임상 실험으로 평가했다. 두 단백질을 98.5% 보다 높은 수준의 순도로 수득하고 수산화알루미늄으로 흡착되어 제형화했다. 선별 기준으로서, 지난 6개월간 어떠한 백신을 투여받지 않았고 어떠한 인플루엔자 증상을 보이지 않는 25세 및 40세 사이의 건강한 남성을 사용했다. 각각 8명의 6개 실험 그룹을 투여량(25 ㎍, 50 ㎍, 또는 100 ㎍) 및 투여할 항원의 유형(HA 또는 HACDh)에 따라 나누었다. 0주에, 모든 자원자를 면역화하고 4주 후에 이차 투여했다. 0.5 ml의 조성물을 근육내 주입하여 투여했다.

혈액 시료를 백신화 시점 및 그 후 삼 주 동안에, 2주 간격으로 채취했다. 적혈구응집반응의 항체 저해제의 농도를 결정하기 위해, 혈청 시료를 비브리오 콜레리로부터의 수용체-파괴 효소로 처리하고 뒤이어 비-특이 저해제의 불활성화를 위해 65℃로 가열했다. 바이러스 A 항원/Viet Nam/1203/2004에 대한 적혈구응집반응을 저해하는 항체를 0.5%에서 닭 적혈구를 사용하여 미량역가의 표준 검정으로 측정했다.

바이러스 A/Viet Nam/1203/2004으로부터의 H5 단백질에 대해 특이적인 IgG 면역글로불린 수준을 ELISA로 평가했다. 플레이트를 세포 배양에서 생성된 HA 단백질로 코팅했다. 그런 다음, 각 혈청으로부터의 계열 희석을 실시했다. 광범위하게 세척한 후, HRP와 접합되고 토끼에서 생산된 항-인간 IgG 항체를 각 웰에 첨가했다. 3,3'5,5' 테트라메틸 벤제딘(Tetramethyl Benzedine)으로 발생시켰다. ELISA 역가를 항원을 포함하는 웰의 최적 밀도가 항체가 없는 웰에 상응하는 밀도의 적어도 두배인 더 높은 희석으로서 표현했다.

말초 혈액 단핵 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells; PBMC)를 피콜 이소파크(Ficoll Isopaque) 기울기(ICN Biomedical Inc. Aurora OH) 상에서 분리를 통해 분리하고 면역학적 검정을 위해 저온보존했다. 해동한 후에, PBMC를 제조업자의 지침에 따라 INF-γ ELISPOT (Ebioscience)에서 사용했다. 간략하게, 플레이트를 포획 항체(capture antibody)로 밤새도록 코팅했다. 2회의 세척 단계 후에, 플레이트를 1시간 동안 RPMI-1640 배지로 차단했다. 모든 웰마다 HA 항원을 첨가하고 5x10⁵ 세포를 접종했다. 48시간 동안 5% CO₂ 및 37℃에서 배지를 항온했다. 플레이트를 2시간 동안 비오틴에 접합되는 항-인터페론 항체와 항온했다. 2회의 세척 단계 후에, HRP에 접합된 아비딘을 각 웰에 첨가했다. 기질로서 3-아미노-9-에틸 카르바졸을 사용하여 발생시켰다. 결과는 HA 및 HACDh 재조합체 항원을 포함한 백신이 국소 부작용을 생성하지 않음을 나타낸다.

HACDh 키메릭 단백질로 면역화된 자원자에서와 같이 HA로 면역화된 자원자에서, 세포성 및 체액성 면역 반응이 투여된 단백질의 투여량에 비례하여 증가된다. 그럼에도 불구하고, HA 및 HACDh 변이체 사이의 비교는 키메릭 단백질이 HA의 등가 투여량에서보다 4.2배 높은 체액성 반응을 유도할 수 있으며(도 4), 등가의 HA 투여량에 의해 생성되는 반응에서보다 5.2배 높은 세포성 반응을 유도할 수 있음을 보인다.

실시예 9: HA 및 HACDc 항원에 기초한 백신 조성물의 돼지에서의 면역원성.

18-20 kg 중량 사이의 랜드레이스 돼지를 사용했다. 동물들을 평가할 항원 및 투여량에 따라 6개 그룹으로 나누었다. 각 실험 그룹 당 8마리 돼지가 사용되었다. HA 및 HACDc에 대해, 20㎍, 40　㎍ 및 80 ㎍의 투여량을 평가했다. 두 백신 항원을 유중수적 에멀젼으로 제형화하고 2-ml 투여량으로 목 근육에 주사하여 접종했다.아쥬반트 및 인산염 완충 식염수 1:1(v/v)로 구성된 위약을 유사한 방식으로 접종했다.

혈액 시료를 백신화 시점 및 다은 3달 동안 7일 간격으로 채취했다. IHA에서 항체 역가를 결정하기 전에, 혈청 시료를 비-특이 저해제를 불활성화시키기 위해, 비브리오 콜레라로부터의 수용체-파괴 효소로 처리했다. IHA에서의 항체 역가를 0.5%에서의 닭 적혈구를 사용하여 미량역가의 표준 검정으로 결정했다. 세포 수준에서의 면역 반응을 HA 항원으로 자극한 PBMC에서 IFN-γ 및 IL-12의 RNA 수준의 상대적 평가를 통해 평가했다.

일반 임상 파라미터의 변경은 백신 조성물에 대한 부작용이 없다고 제안된 면역화 동물에서 발견되지 않았다. 결과는 재조합체 항원 HA 및 HACDc를 포함하는 백신이 국소 특성의 매우 적은 부작용을 생성함을 나타낸다. 두 그룹에서, HA 항원의 존재시 사이토카인을 증식시키고 생산하는 능력으로서 표현되는 세포 반응 및 IHA 항체 역가를 갖는 투여량에 의존함이 발견되었다. HACDc 키메릭 항원으로 면역화된 그룹에서, 면역 반응의 현저한 가능성이 체액성 뿐만 아니라 세포성 수준으로 발견되었다. 이러한 단백질은 HA의 상응하는 투여량에 의해 발생하는 것에 비해 2.5배 더 높은 IHA에서의 항체 역가를 유도할 수 있다. IFN-γ 및 IL-2 발현 수준에 상대적인, 세포 반응 능력은 HA의 등가 투여량으로 면역화된 돼지에서와 비교시, HACDc 키메릭 항원으로 면역화된 동물에서 각각 4.5배 및 6배 더 높다.

실시예 10: 조류 인플루엔자 바이러스의 상이한 아형으로부터의 적혈구응집소에 기초한 키메릭 항원의 발현.

코딩 누클레오티드 서열을 조류 인플루엔자 바이러스 A/Netherlands/33/03(H7N7) (Seq ID. No. 9) 및 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Seq ID. No. 10)으로부터의 HA 세포외 도메인에 대해 합성했다.

두 유전자 모두를 카프라 히르쿠스에서의 발현에 최적인 코돈의 사용으로 설계했으며 제한 부위 Xho I (5') 및 EcoR I (3')에 의해 측면화했다. 두 유전자 모두를 돼지 CD154 분자의 세포외 도메인을 포함하는 아데노바이러스 전이 벡터 pAdtrack에 직접적으로 클로닝했다. 결과적으로 생성된 재조합 클론을 HEK-293T 세포주에 트랜스펙션시켰으며 72 시간 후에 키메릭 분자의 발현을 배양 배지에서 검출할 수 있다. 두 융합 단백질 모두를 주로 삼량체로서 발현시키고 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피의 단일 단계로 배양 배지로부터 정제할 수 있다.

바이러스 A/Netherlands/33/03 (H7N7) 및 Hong Kong/1073/99 (H9N2)로부터의 HA의 키메릭 변이체를 포함하는 아데노바이러스 전이 벡터를 두 단백질 모두를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 발생시키고 증폭할 수 있는 pAdEasy 플라스미드 벡터에 포함되는 아데노바이러스 게놈 내의 상동성 재조합에 의해 삽입한다.

CD154의 세포외 도메인에 융합되는, 상기 언급된 분리체로부터의 HA는 염소젖에서 더 높은 농도로 생산된다. 이 전략은 합성 유전자를 입수할 수 있는 순간으로부터 55일 보다 짧은 기간에 HA의 키메릭 변이체의 수 g을 생산할 수 있게 한다.

키메릭 항원 둘 다의 정제 후에, 돼지의 면역원성 실험을 동물 당 20 ㎍의 고정 투여량을 유중수적 제형의 형태로 2 ml 투여량으로 목 근육에 근육내 주입으로 투여하여. 부작용은 발견되지 않았다. 혈청학적 분석은 두 단백질 모두가 IHA 항체 역가가 백신화 후 28일 내에 1:800보다 높은 IHA 항체 역가에 이르는, 강한 체액성 면역 반응을 유도할 수 있음을 증명한다.

SEQUENCE LISTING <110> CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY <120> CHIMERIC VACCINE ANTIGENS AGAINST AVIAN INFLUENZA VIRUS. <130> Avian influenza <140> <141> <150> CU 2006- 0051 <151> 2006-02-28 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1670 <212> ADN <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence description: Synthetic sequence which codifies for the hemagglutinin of the Viet Nam/1203/2004 virus fused to a 6 histidines tail and flanked by several restriction sites. <400> 1 ggtaccctcg agccaccatg gagaagatcg tgctgctgtt cgccatcgtg tccctggtga 60 agagtgatca gatctgtatc ggctaccacg ccaacaactc caccgagcag gtggacacca 120 tcatggaaaa gaacgtgacc gtgacccacg cccaggacat cctggagaag aagcacaacg 180 gcaagctgtg tgacctggac ggcgtgaagc ccctgatcct gagggactgc tccgtggccg 240 gctggctgct gggcaacccc atgtgtgacg agttcatcaa cgtgcccgag tggtcctaca 300 tcgtggagaa ggccaacccc gtgaacgacc tgtgctaccc cggcgacttc aacgactacg 360 aggagctgaa gcacctgctg tccaggatca accacttcga gaagatccag atcatcccca 420 agtccagctg gtcctcccac gaggcctccc tgggcgtgtc ctccgcctgc ccctaccagg 480 gcaagtcctc cttcttcaga aacgttgtgt ggctgattaa gaagaacagc acctacccca 540 ccatcaagag gtcctacaac aacaccaacc aggaggacct gctggttctg tggggcatcc 600 accaccccaa cgacgccgcc gagcagacca agctgtacca gaaccccacc acctacatct 660 ctgtgggcac ctccaccctg aaccagaggc tggtgcccag gatcgccacg cgttccaagg 720 tgaacggcca gagcggccga atggagtttt tctggaccat cctgaagcca aacgacgcca 780 tcaacttcga gtccaacggc aacttcatcg cccccgagta cgcctacaag atcgtgaaga 840 agggcgactc caccatcatg aagtccgagc tggagtacgg caactgtaac accaagtgcc 900 agaccccaat gggcgccatc aacagctcca tgcccttcca caacatccac cccctgacca 960 tcggcgagtg ccccaagtac gtgaagtcca acaggctggt gctggccacc ggcctgagga 1020 actcccccca gagggagagg aggaggaaga agaggggcct gttcggcgcc atcgccggct 1080 tcatcgaggg cggctggcag ggcatggtgg acggctggta cggctaccac cacagcaacg 1140 agcagggctc cggctacgcc gccgacaagg agtccaccca gaaggccatc gacggcgtca 1200 ccaacaaggt gaactccatc atcgacaaga tgaacaccca gttcgaggct gtgggcaggg 1260 agttcaacaa cctggagagg agaatcgaga acctgaacaa gaagatggag gacggcttcc 1320 tggatgtgtg gacctacaac gccgagctgc tggtgctgat ggagaacgag aggaccctgg 1380 acttccacga ctccaacgtg aagaacctgt acgacaaggt gaggctgcag ctgagggaca 1440 acgccaagga gctgggcaac ggctgcttcg agttctacca caagtgtgac aacgagtgta 1500 tggagtctgt gaggaacggc acctacgact acccccagta ctccgaggag gccaggctga 1560 agagggagga gatctctggc gtgaagctgg agtccatcgg catctaccag atcctgtcca 1620 tctactccgc tagccatcac catcaccacc atatgaattc ttgagatatc 1670 <210> 2 <211> 548 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(548) <223> Amino acid sequence (starting by the start codon "ATG" [nucleotide 18] of the Seq ID. No 1). <400> 2 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Ala Ser His His His His His 530 535 540 His Met Asn Ser 545 <210> 3 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Synthetic sequence that codicies for the extracellular domain of the CD154 molecule of Homo sapiens containing a spacer peptide in its N-terminal end.S <400> 3 gaattctggc ggcggctccg gagggggagg gagcggcgga gggggctcca agatagaaga 60 tgaaaggaat cttcatgaag attttgtatt catgaaaacg atacagagat gcaacacagg 120 agaaagatcc ttatccttac tgaactgtga ggagattaaa agccagtttg aaggctttgt 180 gaaggatata atgttaaaca aagaggagac gaagaaagaa aacagctttg aaatgcaaaa 240 aggtgatcag aatcctcaaa ttgcggcaca tgtcataagt gaggccagca gtaaaacaac 300 atctgtgtta cagtgggctg aaaaaggata ctacaccatg agcaacaact tggtaaccct 360 ggaaaatggg aaacagctga ccgttaaaag acaaggactc tattatatct atgcccaagt 420 caccttctgt tccaatcggg aagcttcgag tcaagctcca tttatagcca gcctctgcct 480 aaagtccccc ggtagattcg agagaatctt actcagagct gcaaataccc acagttccgc 540 caaaccttgc gggcaacaat ccattcactt gggaggagta tttgaattgc aaccaggtgc 600 ttcggtgttt gtcaatgtga ctgatccaag ccaagtgagc catggcactg gcttcacgtc 660 ctttggctta ctcaaactct gacccgggtc gac 693 <210> 4 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(225) <223> Amino acid sequence (starting by the codon "TCT" [nucleotide 5] of the Seq ID. No 3). <400> 4 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr 20 25 30 Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys 35 40 45 Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu 50 55 60 Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly 65 70 75 80 Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser 85 90 95 Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met 100 105 110 Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys 115 120 125 Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn 130 135 140 Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys 145 150 155 160 Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His 165 170 175 Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val 180 185 190 Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro 195 200 205 Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys 210 215 220 Leu 225 <210> 5 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Synthetic Sequence that codifies for the extracelular domain of the CD154 molecule of Gallus gallus containing an spacer peptide in its N-terminal end. <400> 5 gaattctggc ggcggctccg gagggggagg gagcggcgga gggggctcca agatggagga 60 ggtgctgtcc ctgaacgagg actacatctt cctgaggaag gtgcagaagt gccagaccgg 120 cgaggaccag aagagcaccc tgctggactg tgagaaggtg ctcaagggct tccaggacct 180 gcagtgcaag gacaggaccg ccagcgagga gctgcccaag ttcgagatgc acaggggcca 240 cgagcacccc cacctgaaga gcaggaacga gaccagcgtc gccgaggaga agaggcagcc 300 catcgccacc cacctggccg gcgtgaagag caacaccact gtgagggtgc tgaagtggat 360 gaccacctcc tacgccccca cctccagctt catcagctac cacgagggca agctgaaggt 420 ggagaaggcc ggcctgtact acatctacag ccaggtgtcc ttctgtacca aggccgctgc 480 cagcgccccc ttcaccctgt acatctacct gtacctgccc atggaggagg acaggctgct 540 gatgaagggc ctggacaccc acagcaccag caccgccctg tgtgagctgc agagcatcag 600 ggagggcggc gtgttcgagc tgaggcaggg cgacatggtg ttcgtgaacg tgaccgacag 660 caccgccgtg aacgtgaacc ccggcaacac ctacttcggc atgttcaagc tgtgacccgg 720 gtcgac 726 <210> 6 <211> 236 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(236) <223> Amino acid sequence(starting by the "TCT" codon [nucleotide 5] of the Seq ID. No 5). <400> 6 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 Met Glu Glu Val Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr Ile Phe Leu Arg Lys 20 25 30 Val Gln Lys Cys Gln Thr Gly Glu Asp Gln Lys Ser Thr Leu Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Lys Val Leu Lys Gly Phe Gln Asp Leu Gln Cys Lys Asp Arg 50 55 60 Thr Ala Ser Glu Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His Arg Gly His Glu 65 70 75 80 His Pro His Leu Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Val Ala Glu Glu Lys 85 90 95 Arg Gln Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Val Lys Ser Asn Thr Thr 100 105 110 Val Arg Val Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 115 120 125 Phe Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Val Glu Lys Ala Gly Leu 130 135 140 Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Cys Thr Lys Ala Ala Ala Ser 145 150 155 160 Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro Met Glu Glu Asp 165 170 175 Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr Ser Thr Ala Leu 180 185 190 Cys Glu Leu Gln Ser Ile Arg Glu Gly Gly Val Phe Glu Leu Arg Gln 195 200 205 Gly Asp Met Val Phe Val Asn Val Thr Asp Ser Thr Ala Val Asn Val 210 215 220 Asn Pro Gly Asn Thr Tyr Phe Gly Met Phe Lys Leu 225 230 235 <210> 7 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence Description: Synthetic Sequence that codifies for the extracelular domain of the CD154 of Sus scrofa containing an spacer peptide in its N-terminal end. <400> 7 gaattctggc ggcggctccg gagggggagg gagcggcgga gggggctcca agatcgagga 60 cgagaggaac ctgcacgagg acttcgtgtt catcaagacc atccagaggt gtaagcaggg 120 cgagggcagc ctgagcctcc tgaactgtga ggagatcagg agccagttcg aggacctggt 180 gaagggcatc atgcagagca aggaggtgaa gaagaaggaa aaaagcttcg agatgcacaa 240 gggcgaccag gacccccaga tcgccgccca cgtgattagc gaggccagca gcaagaccgc 300 cagcgtgctg cagtgggccc ccaagggcta ctacaccctg agcaccaacc tggtgaccct 360 ggagaacggc aggcagctgg ccgtgaagag gcagggcatc tactacatct acgcccaggt 420 gaccttctgc tccaacaggg acgccgctgg ccaggcccct ttcatcgcca gcctgtgcct 480 gaggagcccc agcggcagcg agcgcatcct gctgagggcc gccaacaccc acagcagcag 540 caagccctgt ggccagcaga gcatccacct gggcggcgtg ttcgagctgc agcctggcgc 600 cagcgtgttc gtgaacgtga ccgaccccag ccaggtgtcc cacggcaccg gcttcaccag 660 cttcggcctg ctgaagctgt gacccgggtc gac 693 <210> 8 <211> 225 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(225) <223> Amino acid Sequence(staring by the "TCT" codon [nucleotide 5] of the Seq ID. No 7). <400> 8 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Ile Lys Thr 20 25 30 Ile Gln Arg Cys Lys Gln Gly Glu Gly Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys 35 40 45 Glu Glu Ile Arg Ser Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys Gly Ile Met Gln 50 55 60 Ser Lys Glu Val Lys Lys Lys Glu Lys Ser Phe Glu Met His Lys Gly 65 70 75 80 Asp Gln Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser 85 90 95 Lys Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu 100 105 110 Ser Thr Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Arg Gln Leu Ala Val Lys 115 120 125 Arg Gln Gly Ile Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn 130 135 140 Arg Asp Ala Ala Gly Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Arg 145 150 155 160 Ser Pro Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His 165 170 175 Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val 180 185 190 Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro 195 200 205 Ser Gln 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Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp 145 150 155 160 Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Asp Pro Ala Leu Ile Ile Trp Gly Ile His 180 185 190 His Ser Gly Ser Thr Thr Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn 195 200 205 Lys Leu Ile Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro 210 215 220 Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp 225 230 235 240 Phe His Trp Leu Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe 245 250 255 Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys 260 265 270 Ser Met Gly Ile Gln Ser Glu Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly 275 280 285 Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln 290 295 300 Asn Ile Asn Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln 305 310 315 320 Glu Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro 325 330 335 Lys Arg Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 340 345 350 Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln 355 360 365 Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser 370 375 380 Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr 385 390 395 400 Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Thr Glu Val Glu Lys 405 410 415 Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val 420 425 430 Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr 435 440 445 Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys 450 455 460 Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu 465 470 475 480 Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn 485 490 495 Thr Tyr Asp His Ser Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Ile Gln Asn Arg Ile 500 505 510 Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Ala Ser His 515 520 525 His His His His His Met Asn Ser 530 535 <210> 10 <211> 537 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(537) <223> Sequence of the extracellular domains of the hemagglutinin of the Avian Influenza virus A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). <400> 10 Met Glu Thr Ile Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Ala Ser 1 5 10 15 Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly His Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 20 25 30 Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Thr Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys 35 40 45 Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu 50 55 60 Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asn 100 105 110 Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Phe Ser Ser Ala Ser Ser 115 120 125 Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Thr Trp Asn Val Thr Tyr 130 135 140 Thr Gly Thr Ser Arg Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg 145 150 155 160 Trp Leu Thr Gln Lys Ser Gly Phe Tyr Pro Val Gln Asp Ala Gln Tyr 165 170 175 Thr Asn Asn Arg Gly Lys Ser Ile Leu Phe Val Trp Gly Ile His His 180 185 190 Pro Pro Thr Tyr Thr Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Ile Arg Asn Asp Thr 195 200 205 Thr Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Leu Asn Arg Thr Phe Lys Pro Val 210 215 220 Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr 225 230 235 240 Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Val Arg Ser Asn 245 250 255 Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Val Leu Ser Gly Gly Ser 260 265 270 His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Gly Gly Asn Cys Val Val 275 280 285 Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Ser Thr Leu Pro Phe His 290 295 300 Asn Ile Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Thr Cys Pro Lys Tyr Val Arg Val 305 310 315 320 Asn Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Arg Ser 325 330 335 Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 340 345 350 Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln 355 360 365 Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp 370 375 380 Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln 385 390 395 400 Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn 405 410 415 Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Val Trp Ala Tyr 420 425 430 Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu 435 440 445 His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu 450 455 460 Gly Ser Asn Ala Met Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480 Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn 485 490 495 Arg Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu 500 505 510 Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ala Ser 515 520 525 His His His His His His Met Asn Ser 530 535 1

Claims (12)

1. 조류 인플루엔자 바이러스 외피로부터의 HA 단백질의 세포외 세그먼트 및 CD154 분자의 세포외 세그먼트를 포함함을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 키메릭 백신 항원
2. 제1항에 있어서, 조류(Seq ID. No. 6), 돼지(Seq ID. No. 8) 또는 인간(Seq ID. No. 4)으로부터의 CD154 분자의 세포외 세그먼트의 아미노산 서열을 필수적으로 포함함을 특징으로 하는 키메릭 백신 항원
3. 제1항에 있어서, 바이러스 아형 H5 (Seq ID. No. 2), H7 (Seq ID. No.9) 및 H9 (Seq ID. No.10)로부터의 HA의 세포외 세그먼트의 아미노산 서열을 필수적으로 포함함을 특징으로 하는 키메릭 백신 항원.
4. 제1항에 있어서, 재조합 방식, 합성 방식에 의해 또는 화학적 접합을 통해 수득되는키메릭 백신 항원.
5. 제1항에 있어서, 유전적으로 변이된 포유동물의 젖으로부터 수득된 키메릭 백신 항원.
6. 제5항에 있어서, 유선의 직접 유전적 형질변환에 의한 비트렌스제닉 포유동물의 젖으로부터 수득된 키메릭 백신 항원.
7. 제6항에 있어서, 유선의 직접 유전적 형질변환이 아데노바이러스 벡터 형질도입을 사용하여 이루어지는 키메릭 백신 항원.
8. 제5항에 있어서, 트렌스제닉 포유동물의 젖으로부터 수득되는 키메릭 백신 항원.
9. 제4항에 있어서, 유전적으로 변이된 효모로부터 수득된 키메릭 백신 항원.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메릭 백신 항원을 포함함을 특징으로 하는, 조류 및 포유동물에서 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 보호성 면역 반응을 생성할 수 있는 백신 조성물.
11. 제10항에 있어서, 새, 돼지 및 인간에서 조류 인플루엔자에 대한 보호성 면역 반응을 생성할 수 있는 백신 조성물.
12. 제10항에 있어서, 전신 또는 점막 경로로 동물에게 예방적으로 투여될 수 있는 백신 조성물.

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