MX2010006918A - Virus de influenza modificado. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee un gen M del virus de influenza B con una modificación de por lo menos un nucleótido próximo al extremo N del gen M, más específicamente en cualquiera de las posiciones de nucleótido 265 a 294 del gen M, y también un virus de influenza B que comprende dicho gen M modificado; además, se describe su uso en la preparación de una vacuna y métodos de preparación de dicho virus de influenza modificado.

Description

VIRUS DE INFLUENZA MODIFICADO La presente invención incluye un gen M del virus de la influenza B que comprende una modificación de por lo menos un nucleótido próximo al extremo N del gen M, más específicamente en cualquiera de las posiciones de nucleótido 265 a 294 del gen , y también un virus de influenza B que comprende dicho gen M modificado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las epidemias y pandemias causadas por las enfermedades virales todavía están cobrando vidas humanas y teniendo un impacto sobre la economía global. La influenza es responsable de millones de días de trabajo perdidos y visitas al médico, cientos de miles de hospitalizaciones en todo el mundo (Couch 1993, Ann . NY. Acad. Sci, 685; 803), decenas de miles de muertes de más (Collins y Lehmann, 1953, "Public Health onographs" 213:1; Glezen 1982, Am. J. Public Health, 77:712), y billones de euros en costos de servicios de salud (Williams et al. 1988, Ann . Intern . Med. 108:616). En el pasado, los virus de la influenza tanto A como B han sido responsables en estas epidemias en los humanos; por lo tanto, además de los antigenos de superficie del virus de la influenza A, los de la influenza B también son un componente esencial de cualquier vacuna efectiva para reducir la morbilidad por influenza. Los virus de la influenza pertenecen a la familia Orthomyxoviridae, y se caracterizan por genomas de ARN de segmentos de cadena negativa que se agregan hasta tamaños en total de 13.6 kb a 14.6 kb, respectivamente. El ARN viral genómico se debe empaquetar en partículas virales para que el virus sea transmitido. El proceso mediante el cual se ensamblan las partículas virales de progenie y ocurren las interacciones proteína/proteína durante el ensamble, es similar entre los virus de ARN. La formación de partículas de virus asegura la transmisión eficiente del genoma de ARN de una célula hospedera a otra dentro de un solo hospedero, o entre diferentes organismos hospederos. Los viriones de influenza consisten en un núcleo interno de ribonucleoproteína (una nucleocápside helicoidal) que contiene el genoma de ARN de una sola cadena, y una envoltura exterior de lipoproteína forrada en el interior por una proteína de matriz (MI) . El genoma segmentado del virus de influenza A consiste en ocho moléculas de ARN' s lineales de una sola cadena de polaridad negativa, que codifica once polipéptidos (algunas cepas de influenza A, diez) , que incluyen: las proteínas de ARN polimerasa dependientes de ARN (PB2, PB1 y PA) y la nucleoproteína (NP) , que forman la nucleocápside; las proteínas de membrana de matriz (MI, M2 y BM2) ; dos glicoproteínas de superficie que se proyectan desde la envoltura que contiene lípido: hemoaglutinina (HA) y neuroaminidasa (NA); la proteína no estructural (NS1), y la proteína de exportación nuclear (NEP) . La mayoría de las cepas de influenza A también codifican una onceava proteína (PB1-F2) que se cree que tiene propiedades proapoptóticas, mientras que solo los virus de la influenza B expresan la proteína NB, que podría contribuir a la virulencia viral (Hatta y Kawaoka, 2003, J. Virol., 11, 6050-6054). Hay diferencias menores adicionales entre los virus de la influenza A y B, en sus estrategias de expresión de los productos génicos codificados por los segmentos de gen virales NA y M (Lamb y Horvath, 1991, Trends Genet. 7:261-266).. El confinamiento casi exclusivo de los virus de la influenza B a los humanos indica diferencias biológicas y epidemiológicas significativas, aunque ya han habido estudios en donde se aisla el virus de la influenza B de las focas, indicando que también podría haber un reservorio más grande de organismos diferentes. Los virus de la influen2a A tienen un reservorio muy amplio en muchas especies de aves y mamíferos .

La transcripción y duplicación del genoma ocurren en el núcleo, y el ensamble ocurre por medio de germinación de la membrana plasmática. Los virus pueden reordenar los genes durante infecciones mixtas. El virus de la influenz.a se adsorbe por medio de la HA en sialiloligosacáridos en las glicoproteínas y glicolípidos de la membrana celular. Después de la endocitosis del virión ocurre un cambio conformacional en la molécula de HA dentro del endosoma celular gue facilita la fusión de membrana, activando así el descubrimiento. La nucleocápside emigra al núcleo en donde es transcrito el ARNm viral. El ARNm viral es transcrito mediante un mecanismo único en el cual la endonucleasa viral corta el extremo 5' bloqueado de los ARNm' s heterólogos celulares, que entonces sirven como cebadores para la transcripción de moldes de ARN viral por medio de la transcriptasa viral. Los transcritos terminan en sitios de 15 a 22 bases de los extremos de sus moldes, en donde secuencias de oligo(U) actúan como señales para la adición de tramos de poli (A) . De las ocho moléculas de ARN viral así producidas durante la duplicación de la influenza A, seis son mensajes monocistrónicos que son traducidos directamente en las proteínas que representan HA, NA, NP y las proteínas de polimerasa virales PB2, PB1 y PA. Los otros dos transcritos experimentan empalme, cada uno produciendo dos ARNm's, que son traducidos en diferentes marcos de lectura para producir MI, 2, NS1 y NEP. En otras palabras, los ocho segmentos de ARN viral codifican once proteínas: nueve proteínas estructurales y dos no estructurales (NS1 y la recién identificada PB1-F2) . La influenza B utiliza una estrategia de codificación diferente para 2 proteínas, particularmente BN y BM2. La primera es traducida de un marco de lectura superpuesto del gen NA, y la segunda es expresada por medio de un codón de terminación-iniciación superpuesto del gen M.

Actualmente la vacunación parece ser la mejor forma de proteger a los humanos contra la influenza. Cuando los adultos sanos se inmunizan, las vacunas actualmente disponibles previenen la enfermedad clínica en 70-90 % de los casos. Este porcentaje se reduce a 30-70 % en aquellos mayores de 65 años y desciende aún más en los mayores de 65 años que viven en asilos ("Strategic Perspective 2001: The Antiviral arket Datamonitor", p. 59) . Los frecuentes cambios antigénicos del virus también contribuyen a una mortandad grande porque ni la vacunación anual puede garantizar la protección.

La vacunación se efectúa con vacunas del virus de influenza químicamente desactivado (muerto) o vivo atenuado, disponibles comercialmente . Desafortunadamente, las vacunas desactivadas difícilmente pueden inducir inmunidad protectora cruzada y por lo tanto la cepa de la vacuna debe adecuarse exactamente a las propiedades antigénicas de la futura cepa pandémica desconocida.

Se supone que los virus de influenza A deficientes en duplicación superan los problemas de seguridad en vista de la emisión viral. Estos pueden ser mutantes de influenza A que tienen supresiones de la proteína NS1. La ausencia de la proteína NS1 hace a este virus deficiente de duplicación en el tracto respiratorio de los mamíferos vacunados. Después de la administración intranasal, el virus de la vacuna es capaz de iniciar una infección abortiva en los tejidos de la mucosa sin el efecto de la emisión viral. Al mismo tiempo, el virus estimula una respuesta local de citocinas y provoca una respuesta inmune protectora mediada por células B y T.

Los virus de la influenza B principalmente requieren una adaptación laboriosa y tardada para alcanzar un crecimiento suficiente en células Vero. En la literatura no se describen mutantes NS1 de influenza B que sean capaces de duplicarse en células Vero a títulos altos y además con un fenotipo sensible al interferón debido a la función anulada de NS1. Actualmente, el único virus de influenza B publicado que carece completamente del ORF de NS1 no se duplica eficientemente en células Vero (títulos de 1.7-2.5*102 FFU/ml utilizando una moi de 0.1, y títulos no detectables a una moi de 0.001, respectivamente: Dauber et. al; Journal of Virology, febrero de 2004, p. 1865-1872) . Un mutante de supresión NS1 de influenza B que consiste en los 16 aa amino-terminales también está muy atenuado en su duplicación, con títulos máximos de aproximadamente 104 FFU/ml (Hai et. al; Journal of Virology; Nov/2008, p. 10580-90) .

Reflejando la necesidad de desarrollar preparaciones de vacuna de alta seguridad que contengan compuestos antigénicos de influenza B, existe una gran demanda para desarrollar cepas de influenza B atenuadas debido a la función anulada de NS1 pero que todavía muestren propiedades de crecimiento superiores en el cultivo de células .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los aislados clínicos de los virus de influenza B normalmente requieren una adaptación laboriosa y tardada para alcanzar un crecimiento superior en células Vero. Para los virus de la influenza A no solo los virus de tipo silvestre sino también los mutantes que expresan una proteína NS1 truncada de, por ejemplo, 38 aminoácidos, o mutantes que carecen completamente del ORF de NS1, son capaces de duplicarse a títulos altos sobre células Vero deficientes de interferón. Este hallazgo se usó para producir, una vacuna viva atenuada de influenza A deficiente de duplicación.

Hasta ahora, este concepto no podía ser aplicado a los virus de influenza B debido a la incompatibilidad de los mutantes con proteína NS1 no funcional para crecer a títulos altos en el cultivo de tejido.

Ahora los inventores han mostrado sorprendentemente que las capacidades de crecimiento pueden aumentar mucho modificando nucleótidos seleccionados próximos a la región N-terminal del gen M del genoma del virus de influenza B. El gen de los virus de influenza B es de aproximadamente 1,076 pb de longitud, que comprende los ORF's de MI y BM2.

Además, la invención también incluye virus de influenza B recombinantes que comprenden dicho gen modificado. Preferiblemente, los virus B son deficientes o por lo menos atenuados de duplicación, por ejemplo debido a supresiones dentro de la proteina NSl.

Específicamente, la presente invención incluye una cepa de influenza B recombinante que comprende una modificación en cualquiera de las posiciones de aminoácido 82 a 90, preferiblemente en cualquiera de las posiciones de aminoácido 85 a 87, preferiblemente en la posición de aminoácido 86 en la proteína MI, un segmento NSl modificado que codifica una proteína NSl que carece de un dominio de unión de ARN funcional y dominio carboxi terminal, y opcionalmente una mutación silenciosa en la posición de nucleótido 950 del gen M.

Además, se incluyen preparaciones de vacuna que contienen el virus de la invención y métodos para el tratamiento profiláctico de la influenza, así como también métodos para hacer el virus de la invención.

La presente invención también incluye un ácido nucleico aislado que codifica el gen M del virus de influenza de la invención, y su producción.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Perfil esquemático de traducción de los genes NS de influenza B de tipo silvestre, NS14, NS38, NS57 y NS80 (a), y tipo silvestre y ANSI (b) .

Figura 2: Productos de RT-PCR del gen NS de los virus indicados que expresan una proteína NSl de 14, 38, 57, 80 aminoácidos, o NSl de tipo silvestre, respectivamente.

Figura 3: Crecimiento de los virus de influenza B /Malaysia que expresan una proteína NSl de 14, 38, 57 u 80 aminoácidos, o NSl de tipo silvestre, respectivamente, en células Vero (a) y A549 (b) .

Figura 4: Títulos virales de mutantes de influenza B /Malaysia con proteínas NSl de 38 u 80 aminoácidos o gen M wt que contiene NSl wt o gen M1-M86V, 6 días después de la transfección (a) , y mutantes B/Florida que contienen el gen ANSI o con proteínas NSl de 38 u 80 aminoácidos, o gen M wt que contiene NSl wt o el gen M1-M86V, 5 días después de la transfección (b) .

Figura 5: Comparación de aminoácidos del gen M del hisopo similar a B original /Malaysia/2506/0 , con el gen M1-M86V y otras secuencias publicadas en el banco Genebank.

Figura 6: Crecimiento del virus de influenza B/Florida que contiene el gen ANSI o NS1 de tipo silvestre, sobre células Vero (a) y A549 (b) .

Figura 7 : Secuencia de aminoácidos de la proteina MI B/Vienna/33/06 que contiene la mutación M86V (marcada en negritas, SEQ ID No. 1) (a) ; y la proteina MI B/Thüringen/02/06 que contiene la mutación M86V (marcada en negritas, SEQ ID No. 2) (b) .

Figura 8: Vista general de los mutantes construidos NS de influenza B. Composición genética de todos los mutantes construidos de influenza B (a) ; secuencia de nucleótido del gen M B/Vienna/33/06 M1-M86V, SEQ ID No. 3 (b) ; secuencia de nucleótidos del gen M B/Vienna/33/06 M1-M86V y C950T, SEQ ID No. 4 (c) ; secuencia de nucleótidos del gen M B/Thüringen/02/06 Ml-wt, SEQ ID No. 5 (d) ; secuencia de nucleótidos del gen M B/Thüringen/02/06 M1-M86V, SEQ ID No. 6 (e) ; secuencia de nucleótidos del gen M B/Vienna/33/06 M1-C950T, SEQ ID No. 7 (f); secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 NS de NS14, SEQ ID No. 8 (g) ; secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS38, SEQ ID No. 9 (h) secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS57, SEQ ID No. 10 (i); secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS64, SEQ ID No. 11 (j); secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS80, SEQ ID No. 12 (k); secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de ANS1-B, SEQ ID No. 13 (1) ; secuencia de nucleótidos del gen NS B/Thüringen/02/06 de ANS1-B, SEQ ID No. 14 (m) ; Figura 9: Perfil esquemático de traducción de vectores de influenza B que expresan IL2 con proteínas NS1 de 38, 80, 104 y 145 aa de longitud, respectivamente (a); composición genética de todos los vectores de influenza B construidos que expresan IL2 (b) ; secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS1-38IL2, SEQ ID No. 15 (obsecuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS1- 80IL2, SEQ ID No. 16 (d) ; secuencia de nucleótidos del gen BNS /Vienna/33/06 de NS1-104IL2, SEQ ID No. 17 (e) ; secuencia de nucleótidos del gen NS B/Vienna/33/06 de NS1- 145IL2, SEQ ID No. 18 (f ) ; Figura 10: Productos de RT-PCR de' virus de influenza B/NSl-wt, B/NS1-38 y B/NS1-38IL2 después de 5 pases en células Vero.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee un cambio de secuencia de nucleótidos del gen M del virus de la influenza B que puede aumentar la capacidad de crecimiento de la cepa B de influenza. Tales cambios pueden incluir supresiones y sustituciones. Los inventores han mostrado exitosamente que por lo menos un cambio de un solo aminoácido en la proteina Mi de la influenza B puede dar como resultado propiedades de crecimiento superiores en el cultivo de células, especialmente en células Vero. Esto puede permitir específicamente el rescate de virus que expresan proteínas NS1 de longitud reducida en comparación con las proteínas NS1 wt o mutantes que llevan una supresión completa en el ORF de NS1.

Específicamente, el gen M del virus de la influenza B de acuerdo con la presente invención comprende una modificación de por lo menos un nucleotido de cualquiera de las posiciones de nucleotido 265 a 294 del gen M, preferiblemente de por lo menos un nucleotido en cualquiera de las posiciones de nucleotido 277 a 285, de preferencia por lo menos un nucleotido en cualquiera de las posiciones de nucleotido 280 a 282.

Específicamente, el gen M modificado contiene los nucleótidos GTG en las posiciones 280 a 282 en lugar de ATG de la secuencia correspondiente del virus aislado. Alternativamente, el gen M modificado también puede contener los nucleótidos GTA, GTC, GTT, en las posiciones 280 a 282. Desde luego, la modalidad también incluye los codones de ARN respectivos, GUG, GUA, GUC, GUU.

De acuerdo con una modalidad alternativa de la presente invención, el gen M del virus de la influenza B comprende por lo menos una modificación de nucleótido que resulta en por lo menos una sustitución de aminoácido en cualquiera de las posiciones de aminoácido 82 a 90, preferiblemente en cualquiera de las posiciones de aminoácido 85 a 87, preferiblemente en la posición de aminoácido 86 de la proteina MI. El aminoácido sustituido puede ser cualquier aminoácido; se prefiere un aminoácido hidrofóbico no polar. Específicamente, el cambio de aminoácido produce el cambio de metionina a valina en la posición de aminoácido 86.

Desde luego, la presente invención incluye una proteína MI que comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en cualquiera de las posiciones de aminoácido 82 a 90, preferiblemente en cualquiera de las posiciones de aminoácido 85 a 87, preferiblemente en la posición de aminoácido 86 de la proteína MI. El aminoácido sustituido puede ser cualquier aminoácido; se prefiere un aminoácido hidrofóbico no polar. Específicamente, el cambio de aminoácido produce el cambio de metionina a valina en la posición de aminoácido 86. La proteina MI puede ser generada mediante cualquier método conocido.

El término "sustitución de aminoácido" se refiere a la presencia de un aminoácido modificado o diferente en una localización particular en la secuencia de aminoácidos progenitora de esa molécula. El sustituto de aminoácido ocurre con respecto a cualquier otro aminoácido que puede ocupar esa posición. El polipéptido que resulta del cambio de secuencia de aminoácidos puede incluir cambios en modificaciones posteriores a la traducción, tales como glicosilaciones, acetilaciones , fosforilaciones, o cualquier otra modificación de aminoácido, asi como también la sustitución de aminoácidos.

La presente invención también incluye un virus de influenza B recombinante que comprende el gen M del virus de influenza de la invención.

Dentro de otros aspectos, los virus de influenza deficientes en duplicación que contienen un gen M modificado de acuerdo con la invención, también pueden contener una modificación dentro del gen NS, específicamente la falta de una parte o la falta de toda la proteína NS1 (ANSI). Debido al truncamiento o falta de expresión de la proteina NS1, tales virus se pueden duplicar solo en células deficientes de interferón pero han perdido su capacidad para crecer en hospederos y organismos comunes .

La proteina NS1 del virus de la influenza A es una proteina multifuncional que consiste en aproximadamente 230 aminoácidos y es sintetizada temprana y abundantemente en la infección. Contrarresta las actividades celulares antivirales y es un factor de virulencia. Por medio de la actividad de su región carboxi terminal, la proteina NS1 es capaz de inhibir los mecanismos de procesamiento de los ARNm' s del hospedero. En segundo lugar, facilita la traducción preferente del ARNm viral por interacción directa con el factor de inicio de traducción celular. En tercer lugar, al unirse al ARNdc e interaccionar con cinasas celulares putativas, la proteina NS1 es capaz de impedir la activación de la cinasa (PKR) activada por ARNdc inducible por interferón (IFN-), el sistema de 2'5'- oligoadenilato sintetasa, y factores de transcripción de citocina. En cuarto lugar, la parte N-terminal de NS1 se une a RIG-I e inhibe la activación de IRF-3 en dirección 3', impidiendo la inducción transcripcional de IFN-ß. Por lo tanto, la proteina NS1 inhibe la expresión de los genes de INF-OÍ o INF-ß, retrasa el desarrollo de la apoptosis en las células infectadas y previene la formación del estado antiviral en células vecinas. Los virus de la influenza B se expresan de un transcrito no empalmado del segmento viral NS, una proteina no estructural de 281 aminoácidos llamada NS1-B que comparte con su contraparte NS1-A la capacidad para unirse a los mismos objetivos de ARN e inhibir la activación de PKR in vitro. A diferencia de la influenza A, la NS1 de influenza B no inhibe el empalme previo de ARNm pero se une al producto del gen 15 estimulado por interferón (ISG15) e inhibe su conjugación con objetivos celulares.

Los virus de influenza A que contienen modificaciones dentro de la proteina NS1 son conocidos. Por ejemplo, O 99/64571 describe el knock out completo del segmento del gen NS1; WO 99/64068 describe varios segmentos del gen NS1 que han sido parcialmente suprimidos. Estas publicaciones se incorporan aqui completamente como referencia. Actualmente se conocen solo unos pocos virus de influenza B que contienen modificaciones en la proteina NS1, y ninguno de estos virus que llevan un fenotipo sensible al interferón debido a la función anulada en NS1 crecen a títulos altos en las células Vero. Aquí se describe la construcción de dichos virus con modificaciones en la proteina NSl.

De acuerdo con la presente invención, la modificación dentro de la proteina NSl puede ser una supresión, una inserción o una sustitución de por lo menos un aminoácido, dando como resultado un virus de influenza deficiente de duplicación .

Preferiblemente, la proteina NSl modificada de influenza B comprende la supresión de por lo menos 50% de los aminoácidos NSl, preferiblemente por lo menos 70%, de preferencia por lo menos 90%. Alternativamente, la funcionalidad de la proteina NSl puede estar completamente disminuida. La proteina NSl del virus de la influenza de acuerdo con la invención puede carecer del dominio funcional de unión al ARN . La función principal de este dominio localizado en el extremo amino de la proteina NSl (aminoácidos 1-93) es la unión de AR de y la inhibición de la activación de PKR (Dauber et al. J Virol., diciembre de 2006: 80 (23) :11667-77) .

De acuerdo con la invención, el término dominio funcional carboxi terminal puede comprender la región dentro de la proteina NSl que permite la inhibición de los mecanismos de procesamiento de los ARNm' s del hospedero, esto es, su actividad suprime la respuesta de IFN de las células hospederas.

La NSl de influenza B parece carecer de un dominio efector carboxi terminal con función similar a la NSl de influenza A. El dominio C-terminal de la proteina NSl (posiciones de aminoácido 84 a 281) del virus de la influenza B es principalmente responsable de la inhibición de la respuesta de IFN- /ß (Dauber et al, J Virol., diciembre de 2006; 80 (23) : 11667-77) .

De acuerdo con la invención, el dominio carboxi terminal de la proteina NSl de influenza B puede hacerse no funcional. Este dominio se puede suprimir parcial o totalmente y también los aminoácidos se pueden sustituir o insertar, y el dominio restante se puede probar para determinar su funcionalidad como se describe en la técnica (Dauber et al, J Virol., diciembre de 2006; 80 (23) .11667- 77) .

Una mutación del gen M de la invención permite la generación de mutantes de influenza B que expresan una proteina NSl truncada (por ejemplo menor de 80 aminoácidos) , que lleva por lo tanto un fenotipo sensible al interferón. Tales mutantes se pueden usar especialmente como cepas de vacuna viva atenuada de alta seguridad y eficacia.

La modificación de la invención dentro del gen puede aumentar específicamente la capacidad de crecimiento de dicho virus de influenza B deficiente de duplicación. Por ejemplo, un virus de influenza B que expresa una proteína NS1 de 80 aminoácidos (NS1-80) que contiene la mutación Ml-M86V alcanza títulos en una escala de 5*105 a 5*107 TCID50, mientras que un virus similar con proteína MI wt crece solamente a 3*103 - 3*105 TCID50. Los virus que contienen una proteína NS1 menor de 80 aminoácidos, esto es, de 14, 38, 57 o 64 aminoácidos, fueron rescatados solamente usando la modificación de la invención en el gen M y crecieron a títulos que varían de 1*104 - 3*108 TCID50. La mutación Ml-M86V también se puede introducir en el esqueleto de otro virus de influenza B de diferente subtipo genético (por ejemplo el similar a Jiangsu/10/03) , para probar que la capacidad de crecimiento mejorada, especialmente de mutantes de truncamiento de NS1, es más bien universal que específica de cepa. En este esqueleto, la mutación M1-M86V de la invención permitió la generación de un virus ANS1-B en el cual el ORF de NS1 está completamente suprimido, creciendo a títulos altos en la escala de 107 a 108 TCID5o/ml en células Vero.

De acuerdo con una modalidad especifica de la invención, el virus de influenza recombinante puede comprender : a) una modificación en la posición de aminoácido 86 de la proteina MI; b) un segmento NS1 modificado que codifica una proteina NSl que carece de un dominio funcional de unión de ARN y un dominio funcional carboxi terminal; y c) opcionalmente una mutación silenciosa en la posición de nucleótido 950 del gen M.

Como una modalidad alternativa de la invención, el virus de influenza B recombinante deficiente de duplicación también se puede usar como un vehículo para expresar secuencias heterólogas, por ejemplo para la expresión de quimocinas o citocinas, o fragmentos de las mismas.

Más específicamente, puede ser un' virus de influenza recombinante que comprende: a) una modificación en la posición de aminoácido 86 de la proteína MI; b) un segmento NSl modificado que codifica una proteína NSl que carece de un dominio funcional de unión de ARN y un dominio funcional carboxi terminal; y c) una secuencia heteróloga insertada entre el sitio donador de empalme y el sitio aceptor de empalme del segmento del gen NSl; opcionalmente una mutación silenciosa en la posición de nucleótido 950 del gen M.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la secuencia heteróloga expresa citocinas o quimocinas, o fragmentos o derivados de las mismas. Las citocinas son proteínas pequeñas secretadas que median y regulan la inmunidad, la inflamación y la hematopoyesis. El grupo más grande de citocinas es aquel en que promueven la proliferación y diferenciación de las células inmunes. En este grupo están incluidas las interleucinas , que son citocinas producidas por leucocitos, y los interferones , que pueden ser producidos por una variedad de tipos de células.

Los interferones (IFN) son una familia de glicoproteínas naturales producidas por células del sistema inmune de los vertebrados, incluyendo mamíferos, aves, reptiles y peces, en respuesta a la provocación con agentes tales como bacterias, virus, parásitos y células de tumor. En los humanos existen tres clases principales de interferones. Los interferones de tipo I incluyen 14 subtipos de IFN-alfa e isoformas únicas de IFN-beta, omega, kappa y épilson. Los interferones de tipo II consisten en IFN-gamma, y una tercera clase recién descubierta consiste en IFN-lambda, con tres diferentes isoformas.

Las células Thl secretan principalmente IL-2, IFN-?, y TNF-ß, mientras que las células Th2 que son relevantes en las respuestas inmunes humorales secretan citocinas tales como IL-4, IL-5 e IL-10. Las citocinas de tipo Th2 median las respuestas de hipersensibilidad de tipo tardío contra patógenos intracelulares e inhiben las respuestas de Thl.

Las quimocinas, derivadas originalmente de citocinas quimioatrayentes, realmente comprenden más de 50 miembros y representan una familia de proteínas pequeñas inducibles y secretadas, de bajo peso molecular (6-12 kDa en su forma monomérica) , que desempeñan una función decisiva durante la vigilancia inmune y los procesos inflamatorios. Dependiendo de su función en la inmunidad y la inflamación, se pueden distinguir dos clases. Las quimocinas inflamatorias son producidas por. muchas células de tejido diferentes y también por leucocitos inmigrantes en respuesta a toxinas bacterianas y citocinas inflamatorias como IL-1, TNF e interferones . Su principal función es reclutar leucocitos para la defensa del hospedero y en el proceso de inflamación. Las quimocinas de migración, por otra parte, son expresadas constitutivamente en áreas definidas de los tejidos linfoides. Dirigen el tráfico y la migración de Iinfocitos y células dendriticas dentro' del sistema inmune. Estas quimocinas, como se ilustra por BCA-I, SDF-1 o SLC, controlan la relocalización y recirculación de los Iinfocitos en el contexto de maduración, diferenciación y activación, y aseguran su migración correcta dentro de órganos linfoides secundarios.

De acuerdo con la presente invención, se ha mostrado que citocinas o quimocinas biológicamente activas, o derivados o fragmentos de las mismas, pueden ser expresadas estable y eficientemente usando un marco de lectura abierto diferente del ORF que expresa la proteina NSl. Alternativamente, se pueden fusionar secuencias guias adicionales diferentes de los péptidos de señal naturales con las citocinas o quimocinas, que además pueden soportar la secreción eficiente de la proteina y muestran una inducción altamente eficiente de la respuesta inmune in vivo. Sorprendentemente, las quimocinas y citocinas también pueden ser expresadas eficientemente cuando la secuencia de aminoácidos que corresponde a la citocina/quimocina madura se fusiona con una parte de la proteina NSl por medio de una secuencia de aminoácidos que actúa como un péptido señal. Por ejemplo, este puede ser una parte del péptido señal IgKappa de ratón.

De acuerdo con la presente invención, la secuencia heteróloga preferiblemente codifica interleucina 2 (IL-2), o un fragmento o derivado de la misma. La IL-2 comprende secuencias de señal secretorias y es una molécula inmunomoduladora derivada de células T, requerida para la expansión clonal de las células T activadas por antigeno. La secreción de IL-2 por linfocitos T CD4+ tiene múltiples efectos biológicos, tales como la inducción de proliferación de células T ayudadoras y células T asesinas, y la estimulación de células T para producir otras citocinas. Además, la IL-2 también puede activar las células B, células NK y macrófagos. Cuando la IL-2 es expresada de virus recombinantes que infectan células no linfoides, su secreción puede disminuir significativamente la patogénesis de la infección viral y modificar la respuesta inmune. También se sabe que la IL-2 actúa como adyuvante inmune.

De acuerdo con la presente invención, está incluido cualquier fragmento o derivado de las citocinas y quimocinas que sea todavía biológicamente activo, esto es, que muestre actividad inmunomoduladora.

Alternativamente, las citocinas/quimocinas también se pueden seleccionar del grupo que consiste en IL-15, G -CSF, CCL3 o CCL20 , o derivados o fragmentos de las mismas.

Alternativamente, también puede ser cualquier epitope o región inmunomoduladora derivada de Mycobacterium tuberculosis, por ejemplo ESAT-6.

Alternativamente, las secuencias heterólogas también pueden comprender proteínas quiméricas que son citocinas o quimocinas, o fragmentos o derivados de las mismas, fusionadas con proteínas antigénicas o péptidos antigénicos. La fusión puede ser directamente o por medio de secuencias enlazadoras de péptido que tienen una longitud de por lo menos 4 aminoácidos, de preferencia por lo menos 5 aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias enlazadoras de acuerdo con la invención son GGGS o GGGGS . Los ejemplos de proteínas quiméricas de IL-2 son conocidos. E emplarmente, estas podrían ser IL-2-PE40 (en donde PE es exotoxina A de Pseudomonas) , DAB389-IL-2 (en donde DAB es la toxina de difteria) , o IL-2 Bax (en donde Bax es una proteína proapoptótica de origen humano) (Aqeilan R. et al., Biochem.J., 2003, 129-140).

De acuerdo con la presente invención, las secuencias de nucleótidos de las secuencias heterólogas que se introducen en el vector de influenza deficiente de duplicación, muestran por lo menos 80% de identidad con sus secuencias nativas, preferiblemente por lo menos 85% de identidad, de preferencia por lo menos 90% de identidad. Con ello se incluye cualquier optimización de la secuencia de nucleótidos en vista del uso de codón.

Alternativamente, la secuencia heteróloga puede comprender epitopes de células B o células T, por ejemplo un epitope de células B de hemoaglutinina de influenza (HATB) , por ejemplo el epitope del bucle A de la hemoaglutinina (HA) del virus de influenza, o partes del mismo, o péptidos que representan uno de los epitopes inmunodominantes de HA que corresponden a la secuencia de aminoácidos 150 a 159 (Catón et al., 1982, Cell, 417-427).

El epitope también se puede derivar de retrovirus endógenos asociados con melanoma (MERV) , como se describe en WO 06/119527.

De acuerdo con una modalidad específica, el segmento del gen NS1 puede contener un sitio funcional natural de donador de empalme y uno de aceptor de empalme, esto es, los sitios donador y aceptor de empalme se mantienen como sitios naturales, esto es, los nucleótidos no son modificados por técnicas artificiales.

Cualquier modificación de nucleótido en los sitios de empalme que ocurre naturalmente debido a modificaciones de los virus de influenza basados en adaptaciones ambientales, o desarrollos de la cepa natural, es una modificación natural y no está incluida en el término modificaciones sintéticas o artificiales.

Alternativamente, se pueden alterar las secuencias que rodean el sitio de donador de empalme o en dirección 5' del sitio aceptor. Preferiblemente, la alteración o modificación se puede hacer en el espacio de 3 nucleótidos en dirección 5' al borde 5' del intrón NS, u 8 nucleótidos en dirección 3' a dicho borde, y también de 100 nucleótidos en dirección 5' al borde 3' del intrón NS, o 2 nucleótidos en dirección 3' de dicho borde. Esto es preferiblemente introduciendo secuencias sintéticas para modificar la actividad de empalme.

Si por ejemplo la inserción de una secuencia heteróloga aumenta el tamaño del intrón de NS, puede ser preferible modificar las secuencias que rodean el sitio donador o aceptor de empalme para aumentar la eficacia del empalme y por lo tanto la estabilidad genética del segmento NS recombinante .

Por ejemplo, puede ser modificada de modo que la secuencia que rodea el sitio donador de empalme sea alterada para aumentar la homología con el extremo 5' del ARNpn Ul de humano, o con la secuencia en dirección 5' del sitio aceptor de empalme que contiene el punto de ramificación (Plotch et al. 1986, Proc Nati Acad Sci U S A, 83: 5444-8; Nemeroff et al. 1992, Mol Cell Biol. 12:962-70) , y el tramo de pirimidina se reemplaza con una secuencia que incrementa el empalme del segmento NS .

Para optimizar el empalme, la secuencia preferida introducida en dirección 5' del sitio aceptor de empalme comprende una secuencia de consenso de lazo y un tramo de pirimidina. En vista de la estabilidad del vector viral y la velocidad de expresión de la secuencia heteróloga, puede ser importante introducir la secuencia sintética/modificada que contiene una secuencia de consenso de lazo y un tramo de pirimidina en una posición específica dentro del gen NS, por ejemplo directamente en dirección 5' del sitio aceptor Además, puede ser necesario variar la distancia entre la secuencia de consenso de lazo y el tramo de pirimidina para modificar la velocidad de empalme del segmento NS (Plotch S. y Krug R. , 1986, Proc. Nati. Acad. Sci., 83, 5444-5448; Nemeroff M. et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 962- 970) .

Por ejemplo, la cepa de influenza B recombinante puede comprender una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la SEQ ID. No. 1 o 2, o una secuencia de nucleótidos como la que se muestra en cualquiera de las SEQ ID Nos. 3 a 18, o un derivado de las mismas que tenga por lo menos 98% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 99% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 99.5%.

De acuerdo con la invención, el término "recombinante" incluye todas las cepas de influenza que han sido producidas usando técnicas recombinantes , como por ejemplo por tecnología genética inversa. Por lo tanto, las cepas de influenza de acuerdo con la invención contienen una modificación dentro del gen M pero no necesitan contener ninguna modificación adicional dentro de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en comparación con la cepa progenitora .

También se incluye una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénica eficaz del virus, mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable. También pueden estar contenidos adyuvantes en la composición .

De acuerdo con la invención, el término inmunogénico significa que el virus es capaz de provocar una respuesta inmune humoral o celular, y preferiblemente ambas. Una entidad inmunogénica también es antigénica. Una cantidad inmunogénica eficaz del virus provoca una respuesta inmune humoral o celular, o ambas, cuando se administra a un animal, preferiblemente a un humano.

La composición de vacuna se puede usar para el tratamiento profiláctico de la enfermedad de influenza, que comprende administrar a un paciente humano en necesidad del tratamiento una cantidad de la composición efectiva para inducir inmunidad.

Las composiciones de vacuna pueden contener el virus de influenza B completo de acuerdo con la invención, pero también cepas reordenadas en donde una parte de los segmentos virales se derivan de cepas y segmentos diferentes de influenza B, especialmente la proteina MI se deriva del virus de influenza B recombinante de acuerdo con la invención. La mutación M1-M86V de la invención puede ser introducida adicionalmente en cualquier otra cepa de influenza B.

Las composiciones se pueden usar en los métodos o como medicamentos para prevenir, manejar, neutralizar, tratar o aliviar la infección del virus de la influenza. Desde luego, se incluye el uso de una molécula M del virus de influenza de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección de virus de influenza. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender un virus de influenza B de la invención vivo o desactivado. El virus puede ser desactivado por métodos muy conocidos para los expertos en la materia. Los métodos comunes utilizan formalina y calor para la desactivación.

Se puede preferir un preparado inmunogénico vivo debido a su mayor inmunogenicidad. La producción de dichos preparados inmunogénicos recombinantes vivos se puede hacer usando métodos convencionales que implican la propagación del virus en un cultivo celular o en huevos embrionados (por ejemplo, huevos de pollo embrionados) , seguido por purificación .

El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o registrado en los Estados Unidos.

El término "vehículo" se refiere a un diluente, adyuvante o excipiente con el cual se administra la composición farmacéutica (por ejemplo, el preparado inmunogénico o de vacuna) . También se pueden utilizar soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, etcétera. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remingtón's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. El preparado se debe seleccionar de acuerdo con el modo de administración. El preparado particular también puede depender de si el virus es vivo o desactivado.

El término adyuvante se refiere a un compuesto o mezcla que incrementa la respuesta inmune a un antígeno.

El efecto profiláctico o terapéutico de los preparados inmunogénicos de la invención se basa en parte en lograr o inducir una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune humoral) . En un aspecto, los preparados inmunogénicos inducen un título detectable en el suero de un anticuerpo contra antígenos del virus de la influenza B en el sujeto o en un modelo de animal del mismo (por ejemplo, un modelo de ratón, hurón, rata o canino) . El título de un anticuerpo en el suero se puede determinar usando las técnicas conocidas del experto en la materia, por ejemplo inmunoensayos tales como ELISA o pruebas de inhibición de hemoaglutinina.

De acuerdo con la invención también se incluye un método para generar un virus, en donde el método comprende usar un sistema de expresión recombinante que expresa la molécula M del virus de la influenza de la invención. De acuerdo con la presente invención, el sistema de expresión puede ser cualquier plásmido útil, por ejemplo como lo describen Hoffmann et al. (Hoffmann et al.r 2000, Proc Nati Acad Sci U S A, 97:6108-13), o una construcción de expresión lineal de acuerdo con EP 07450177.

Para desarrollar cepas reordenadas o para la expresión de cepas modificadas de virus de influenza se puede usar un sistema genético inverso en células Vero. La tecnología ya es muy conocida (Pleschka S. et al., 1996, J. Virol., 70(6), 4188-4192; Neumann y Kawaoka, 1999, Adv. Virus Res., 53, 265-300; Hoffmann et al. 2000, Proc Nati Acad Sci U S A, 97:6108-13).

Las células usadas para el cultivo del virus en un medio de cultivo pueden ser cualesquiera células que puedan crecer in vitro en medios sintéticos y se puedan usar para la propagación de los virus. Dentro del alcance de la invención, el término "células" significa el cultivo de células individuales, tejidos, órganos, células de insecto, células de ave, células de mamífero, células de hibridoma, células primarias, líneas de células continuas, o células construidas por ingeniería genética, tales como células recombinantes que expresan un virus. Estas pueden ser por ejemplo células BSC-1, células LLC-MK, células CV-1, células CHO, células COS, células murinas, células humanas, células HeLa, células 293, células VERO, células DBK, células MDCK, células DOK, células CRFK, células RAF, células TCMK, células LLC-PK, células PK15, células WI-38, células MRC-5, células T-FLY, células BHK, células SP2/0, NSO, PerC6 (células de retina humana), células de embrión de pollo o derivados, células de huevo embrionado, huevos de pollo embrionados o derivados de los mismos. Preferiblemente, la línea celular es una línea de células VERO.

El medio de cultivo usado para la producción de los virus puede ser cualquier medio conocido de la técnica anterior que sea aplicable al cultivo de virus. Preferiblemente, el medio es un medio sintético. Este puede ser por ejemplo medio basal como el medio Eagle modificado, MEM; medio MEM esencial mínimo; medio Eagle modificado de Dulbecco, D-ME ; medio D-MEM-F12 ; medio E de William, medio RPMI, y análogos y derivados de los mismos. Estos también pueden ser medios de cultivo celular y de crecimiento de virus de especialidad, tales como VP-SFM, OptiPro™ SFM, AIM V® media, HyQ SF 4MegaVir™, EX-CELL™ Vero SFM, EPISERF, ProVero, cualquier medio 293 o CHO y análogos y derivados de los mismos. Estos medios se pueden suplementar con cualquier aditivo conocido de la técnica anterior que sea aplicable al cultivo de células y virus, tal como por ejemplo suero de animal y fracciones o análogos del mismo, aminoácidos, factores de crecimiento, hormonas, amortiguadores, oligoelémentos, tripsina, piruvato de sodio, vitaminas, L-glutamina y amortiguadores biológicos. El medio preferido es OptiPRO™ SFM suplementado con L-glutamina y tripsina.

Usando la modificación del gen M de la invención, la velocidad de crecimiento de los mutantes de truncamiento NSl de influenza B se puede aumentar por lo menos en un factor de aproximadamente 100-1000, como lo muestra el virus NS1-38 al comparar los títulos virales (TCID50) entre los genes M no modificados y los mejorados. Para los virus de influenza B que expresan una proteína NSl de 14, 57 u 80 aminoácidos, respectivamente, la mutación en el gen M es absolutamente necesaria para generar tales virus. Estos virus pueden crecer hasta un título de aproximadamente 106-108 TCID50.

Una modalidad adicional de la invención es un ácido nucleico aislado que codifica el gen M del virus de la influenza de la invención, o un virus de influenza B recombinante que contiene el gen M modificado. Además, un método para preparar dicho ácido nucleico que comprende introducir una secuencia de nucleótidos en un vector que codifica la molécula M de la invención. Si se usa un vector de ADN, dicho vector es un sistema de transcripción para ARN de influenza de cadena negativa. Por ejemplo, puede ser un vector como el utilizado por Hoffmann et al., 2000, Proc Nati Acad Sci U S A, 97:6108-13.

La descripción anterior se entenderá más completamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, tales ejemplos son únicamente representativos de los métodos de práctica de una o más modalidades de la presente invención y no se deben considerar limitativos del alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Virus de influenza B que expresan proteínas NSl truncadas, para su uso como una vacuna de influenza viva atenuada, deficiente de duplicación Se generó un sistema genético inverso para la construcción de una cepa de influenza B adaptada a células Vero (B/Vienna/33/06, subtipificado como B/Malaysia/2506/0 ) , como un representante del linaje B/Victoria/2/87 (Hoffmann et al. 2000, PNAS 97 (11): 6108-13) . Se clonó HA y NA de B/Thüringen/02/06 de influenza (similar a B/Jiangsu/10/03) . Introduciendo una mutación de codificación en la proteina Mi (cambio de metionina a valina en la posición de aminoácido 86) , se pudieron obtener mutantes de influenza que expresan una versión truncada de la proteina NSl de 14, 38, 57 y 80 aminoácidos, y se denominaron NS1-14, NS1-38, NS1-57 y NS1-80 de B/Malaysia, respectivamente. La traducción de NSl se terminó por medio de dos codones de terminación consecutivos en marco, y la parte no traducida en dirección 3' de los codones de terminación y hasta la señal de empalme de NEP, fue suprimida (figura la) . Debido a las diferentes longitudes del gen NS, los virus que contenían proteínas NSl de diferentes longitudes pudieron distinguirse por medio de RT-PCR de acuerdo con su tamaño (figura 2) . Todos los imitantes generados se duplicaron a altos títulos en células Vero deficientes de interferón (figura 3a), pero fueron atenuados en células A549 competentes de interferón (figura 3b) .

La modificación de la invención dentro del gen M puede aumentar específicamente la capacidad de crecimiento de dichos virus de influenza B deficientes de duplicación. Por ejemplo, un virus de influenza B que expresa una proteína NSl de 80 aminoácidos (NS1-80) que contiene la mutación M1-M86V crece a títulos de aproximadamente 5.62*104 TCID50, a diferencia de los títulos de aproximadamente 1.33*10" TCID50 de un virus similar que no contiene ninguna modificación en Mi, analizados 6 días después de la transfección (figura 4a) . Un virus de influenza B que expresa una proteína NSl de 38 aminoácidos (NS1-38) no pudo ser rescatado sin la mutación MI adaptadora, pero crece a títulos promedio de aproximadamente 3.16*102 TCID50 cuando se introdujo la mutación M1-M86V (figura 4a) . Este efecto fue aún más pronunciado en el segundo pase después de la transfeccion, reflejado por los títulos (cuadro 1) . La misma eficiencia de rescate se observó con virus de influenza B que expresan una proteína NS1 de 14 o 57 aminoácidos, respectivamente, que solo fueron rescatados en presencia de la mutación Ml-M86V (datos no mostrados) . Pases adaptativos adicionales en células Vero resultaron en altos títulos que variaban de 6.5-8.5 log TCID50, que se requieren para una producción eficiente de vacuna, de todos los mutantes NS1 (figura 3a) . La mutación de la invención podría no tener ningún efecto o solo un efecto menor sobre el crecimiento de los virus NS1 wt. El virus de influenza B NS1 wt que contiene el gen M no modificado creció incluso a títulos ligeramente más altos que en virus análogo que contenía la mutación M1-M86V 6 días después de la transfeccion (figura 4a), y en el 2o pase después de la transfeccion (cuadro 1) . Esto puede ser interpretado por la variación de crecimiento entre los diferentes pases, como es mostrado por el crecimiento en el primer pase después de la transfeccion (1.78*107 TCID50 con el gen M wt, en comparación con 2.82*107 TCID50 con M1-M86V, ambos conteniendo el gen NS wt) .

CUADRO 1 Títulos virales (TCID5Q) de los virus de influenza B con proteina NS1 wt, NS80 o NS38 en combinación con el gen wt o M1-M86V, 4 días después de la infección, analizados en el 2° pase después de la transfeccion Por lo tanto, solo esta mutación novedosa permite la generación de mutantes de influenza B que expresan una proteina NS1 corta (esto es, que comprende menos de los primeros 80 aminoácidos N-terminales ) no funcional, llevando por lo tanto un fenotipo sensible al interferón. Tales mutantes se pueden usar consecuentemente como cepas de vacuna. Esta mutación nunca se había descrito antes ni se encontró en la base de datos de secuencias NIBSC. La figura 5 muestra una comparación de secuencias del gen M del hisopo similar a B original /Malaysia/2506/04 , con el gen M1-M86V y otras secuencias publicadas en Genebank.

EJEMPLO 2 La mutación de la invención en la proteína MI (M86V) permite la generación de virus de influenza B con proteínas NSl truncadas en células Vero en diferentes linajes de influenza B Para probar la influencia de la mutación M1-M86V en otras cepas de influenza B, se generó un sistema genético inverso para la generación de influenza B/Thüringen/02/06 (similar a B/Jiangsu/10/03) , como un representante del linaje B/Yamagata/16/88, y se introdujo la mutación descrita en la proteína MI (M86V) . Para seguir la recomendación de la OMS para cepas de vacuna de influenza para la temporada 2008/2009 en el hemisferio norte, se usó HA y NA de un virus similar a B/Florida/0 /06. Se obtuvieron mutantes de influenza B que expresan una versión truncada de la proteína NSl de 38 y 80 aminoácidos, o un mutante con una supresión completa en el ORF de NSl (ANSl- B) (figura Ib) , en los cuales es expresado NS2-NEP como un ARN monocistrónico, y se denominaron NS1-38, NS1-80 y ANSl- B de B/Florida, respectivamente. Como fue el caso con los mutantes de B/Malaysia, un representante del linaje B/Victoria/2/87, la mutación MI—M86V, tenía solo un pequeño impacto sobre la eficacia de rescate de los virus NSl-80 y NSl-wt de B/Florida, un representante del linaje Yamagata (figura 4b). Esto fue demostrado por títulos ligeramente elevados 5 días después de la transcripción en comparación con mutantes que contenían el gen M wt (figura 4b) . Los títulos virales para el mutante NS1-38 que contenían la mutación M1-M86V fueron aproximadamente 4 logaritmos más altos que los análogos MI wt. Debido a la mutación Ml-M86V, los presentes inventores pudieron rescatar un virus ANSl-B, alcanzando títulos de casi 4 logaritmos 5 días después de la transfección (figura 4b) . Para demostrar el fenotipo deficiente de duplicación del virus ANSl-B, los presentes inventores examinaron la capacidad del virus para crecer en células Vero deficientes de IFN (figura 6a) y en células A549 IFN competentes (figura 6b), en comparación con el virus wt correspondiente. Ambos virus mostraron una cinética de crecimiento comparable en células Vero, alcanzando títulos en la escala de 107 a 108 TCIDso/ml. La duplicación del virus ANS1-B fue restringida completamente en las células A549 IFN competentes, que no exhibieron crecimiento por arriba del límite de detección de 2 x 102 TCID50/ml, mientras que el virus NSl-wt se duplicó a altos títulos de 3.15xl08 TCID50/ml. Los virus mutantes NSl-80 y NSl-38 mostraron capacidad de duplicación intermedia (datos no mostrados) .

Estos datos muestran que la mutación adaptativa MI no solo tiene un efecto de optimización del crecimiento en una cepa viral, sino que también parece ser eficaz en otros linajes de influenza B. Además, los datos demuestran que esta mutación es esencial para rescatar un virus ANS1-B en el cual el ORF de NS1 está completamente suprimido, creciendo a títulos altos en células Vero. Por lo tanto, este es un concepto universal para la generación de virus de influenza B deficientes de duplicación en donde el mecanismo de atenuación se basa en la remoción de NS1, el principal antagonista de interferon.

EJEMPLO 3 Un vector del virus de influenza B que expresa interleucina 2 humana del gen NS usando una estrategia de expresión bicistrónica, como posible vacuna viva atenuada de influenza con inmunogenicidad mejorada especialmente para los adultos mayores Un cásete de codón superpuesto de terminación- iniciación (TAATG) , seguido por la secuencia codificadora de IL2 humana, se insertó después de la posición de aminoácido 38, 80, 104 o 145 de la proteina NS1 de un virus de influenza B, respectivamente. Además, una secuencia sintética de 29 nucleótidos que comprende una secuencia de consenso de lazo, seguida por un sitio de empalme optimizado, un segmento de tramo de pirimidina de 20 bases (empalme optimizado) reemplaza la parte entre el codón de terminación de IL2 y el sitio aceptor de empalme de NS2 (EP 7450176.8) (figura 9a) .

Al introducir la mutación de la invención en la proteina MI (M86V) , los presentes inventores tuvieron éxito en el rescate de un virus B/NS1-38IL2 de influenza B en el esqueleto de influenza B/Thüringen/02/06 (similar a B/Jiangsu/10/03) . Sin la modificación de la invención en la proteina MI, este virus no fue rescatado. Aunque el crecimiento de B/NS1-38IL2 fue ligeramente más bajo en comparación con el "vector vacio" B/NS1-38, se alcanzó un titulo de más de 6 loglO de TCID50/ml (cuadro 2) . Esta reserva se pasó adicionalmente 5 veces en células Vero para verificar la estabilidad genética. No se observó la aparición de mutantes de supresión, como muestra la presencia de bandas de RT-PCR del tamaño esperado del gen NS, sin la aparición de bandas de PCR más pequeñas que reflejan potencialmente mutantes de supresión (figura 10) .

Las células Vero infectadas con B/NS1-38IL2 secretaron altos niveles de más de 2.5 µ /p?? de IL2, a diferencia de niveles no detectables de IL2 en las células no infectadas (infectadas en falso) , células infectadas con B/NS1-38 o B/NSl-wt (cuadro 2) . Tales vectores se pueden usar como vacunas vivas de influenza con una mayor inmunogenicidad, especialmente para adultos mayores, como ya se demostró para la influenza A (Ferko, Kittel et al., 2006).

CUADRO 2 Duplicación en células Vero y grado de expresión de IL2 humana de los virus indicados Los presentes inventores investigaron la inmunogenicidad de los virus generados en los 3 ejemplos. De estos datos concluyeron que la mutación M1-M86V de la invención no altera negativamente la inmunogenicidad de los virus construidos, como lo muestran los datos inmunogenecidad comparables de los virus de influenza respectivos .

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. - Un gen M del virus de influenza B que comprende una modificación de por lo menos un nucleótido en cualquiera de las posiciones de nucleótido 265 a 294 del gen M, preferiblemente de por lo menos un nucleótido en cualquiera de las posiciones de nucleótido 277 a 285, de preferencia por lo menos un nucleótido en cualquiera de las posiciones de nucleótido 280 a 282.

2. - El gen M del virus de influenza B de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende los nucleótidos GTG, GTA, GTC, GTT, GUG, GUA, GUC, GUU, en las posiciones 280 a 282.

3. - Un gen M del virus de influenza B que comprende por lo menos una modificación de nucleótido que resulta en por lo menos una sustitución de aminoácido en cualquiera de las posiciones de aminoácido 82 a 90, de preferencia en cualquiera de las posiciones de aminoácido 85 a 87, de preferencia en la posición de aminoácido 86 en la proteina MI.

4. - El gen M del virus de influenza B de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el aminoácido sustituido es un aminoácido hidrofóbico no polar.

5. - El gen M del virus de influenza B de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el aminoácido es valina.

6. - Un virus de influenza B recombinante que comprende el gen M de virus de influenza que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. - El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque es un virus reordenado .

8. - El virus de influenza recombinante de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizado además porque es atenuado o deficiente de duplicación, de preferencia es completamente deficiente de duplicación.

9. - El virus de influenza recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado además porque comprende una modificación dentro del gen NS.

10. - El virus de influenza recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado además porque comprende un segmento NS1 modificado que codifica una proteina NS1 que carece de un dominio funcional de unión de ARN y un dominio funcional carboxi terminal.

11. - Un virus de influenza recombinante que comprende: (a) una modificación en la posición de aminoácido 86 de la proteina MI; (b) un segmento NS1 modificado que codifica una proteina NS1 que carece de un dominio funcional de unión de ARN y un dominio funcional carboxi terminal; y (c) opcionalmente una mutación silenciosa en la posición de nucleótido 950 del gen M.

12. - Un virus de influenza recombinante que comprende: (a) una modificación en la posición de aminoácido 86 de la proteina MI; (b) un segmento NS1 modificado que codifica una proteina NS1 que carece de un dominio funcional de unión de ARN y un dominio funcional carboxi terminal; y (c) una secuencia heteróloga insertada entre el sitio donador de empalme y el sitio aceptor de empalme del segmento del gen NS1; (d) opcionalmente una mutación silenciosa en la posición de nucleótido 950 del gen M.

13. - Un virus de influenza B recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos como la que se muestra en cualquiera de las SEQ ID Nos. 3 a 18.

14. - Un virus de influenza B recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en las SEQ ID Nos. 1 o 2, o un derivado de las mismas que tiene por lo menos 98% de identidad de secuencia .

15. - Una composición de vacuna que comprende una cantidad inmunogénica eficaz del virus que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. - Un método de tratamiento profiláctico de la influenza, que comprende administrar a un paciente humano en necesidad del tratamiento una cantidad inmunogénica eficaz de una composición como la que se reclama en la reivindicación 15.

17. - Un método de preparación de un virus como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, que comprende introducir un vector recombinante que expresa la molécula M del virus de influenza que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, a un sistema genético inverso.

18. - Un método para aumentar la velocidad de crecimiento de virus de influenza B deficientes de duplicación, en donde dichos virus de influenza B contienen un gen M como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

19. - Un ácido nucleico aislado que codifica el gen M del virus de influenza que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

20. - Un método de preparación del ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 19, que comprende introducir una secuencia de nucleótidos en un ácido nucleico que codifica una molécula M como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

21. - Una molécula M del virus de influenza como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para usarse como un medicamento en el tratamiento o prevención de una infección de virus de influenza.

22. - El uso de una molécula M del virus de influenza como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección de virus de influenza.