KR101597633B1

KR101597633B1 - 변형 인플루엔자 바이러스

Info

Publication number: KR101597633B1
Application number: KR1020107011566A
Authority: KR
Inventors: 크리스찬 키텔; 니나 브레스닉
Original assignee: 박스터 헬쓰케어 에스에이
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2016-02-26
Also published as: CA2705444A1; CN101903043B; EP2072058A1; WO2009080806A3; CA2705444C; US8592196B2; EA201001045A1; JP2011505863A; EA024036B1; KR20100102593A; US20100322970A1; WO2009080806A2; EP2222334A2; EP2222334B1; CN101903043A; BRPI0821034A8; BRPI0821034A2; MX2010006918A; AU2008339972A1

Abstract

본 발명은 M 유전자의 N-말단에 근접한 적어도 하나의 뉴클레오티드, 더욱 구체적으로는 M 유전자의 뉴클레오티드 위치 265~294 중 어느 하나의 변형을 갖는 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자 및 상기 변형 M 유전자를 포함하는 인플루엔자 B 바이러스를 제공한다. 또한, 백신의 제조를 위한 그것의 용도 및 상기 변형 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법이 게시된다.

Description

변형 인플루엔자 바이러스{MODIFIED INFLUENZA VIRUS}

본 발명은 M 유전자의 N-말단에 인접한 적어도 하나의 뉴클레오티드, 더욱 구체적으로는 상기 M 유전자의 뉴클레오티드 위치 265~294 중 어느 하나의 변형을 포함하는 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자 및 상기 변형 M 유전자를 포함하는 인플루엔자 B 바이러스에 관한 것이다.

바이러스 질환에 의해 야기된 유행성 전염병 및 세계적인 유행병은 여전히 생명을 앗아가고, 세계 경제에 영향을 준다. 인플루엔자는 많은 날을 일을 할 수 없게 하고 의사를 방문하게 하고, 전 세계적으로 수십만의 입원(Couch 1993, Ann. NY. Acad. Sci 685;803), 수만의 과잉 사망(Collins & Lehmann 1953 Public Health Monographs 213:1, Glezen 1982 Am.J.Public Health 77:712) 및 의료비로의 수십억 유로를 사용(Williams et al. 1988, Ann. Intern. Med. 108:616)하게 한다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 모두 과거에 인간으로의 이들 유행성 전염병의 원인이 됐고, 따라서 인플루엔제 A 및 B 바이러스 표면 항원은 인플루엔자 이환율을 감소시키는데 효과적인 모든 백신의 필수 성분이다. 인플루엔자 바이러스는 오르소믹소비리다이과에 속하고, 각각 크기가 총 합계 13.6~14.6kb가 되는 세그먼트 음성 스트랜드 RNA 게놈을 특징으로 한다. 게놈 바이러스 RNA는 상기 바이러스를 전염시키기 위해 바이러스 입자로 패키징되어야 한다. 자손 바이러스 입자가 조립되고, 조립 동안에 프로테인/프로테인 상호작용이 발생되는 공정은 RNA 바이러스 내에서와 유사하다. 바이러스 입자의 형성은 단일 호스트내에서 또는 다른 호스트 기관 중에서 하나의 호스트 세포에서 다른 세포로의 RNA 게놈의 효율적인 전달을 보증한다. 인플루엔자 비리온은 단일 스트랜드 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보뉴클레오프로테인 코어(나선형 뉴클레오캡시드) 및 매트릭스 프로테인(M1)으로 내부가 라이닝된 외부 리포프로테인 엔벨롭으로 이루어진다. 상기 인플루엔자 A 바이러스의 분절 게놈은 뉴클레오캡시드를 형성하는 뉴클레오프로테인(NP) 및 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 프로테인(PB2, PB1 및 PA); 매트릭스 멤브레인 프로테인(M1, M2 또는 BM2); 엔벨롭을 함유하는 리피드로부터 프로젝팅되는 2개 표면 글리코프로테인을 포함하는 11개(인플루엔자 A 스트레인은 10개인 경우도 있음) 폴리펩티드를 인코딩하는 8개 분자의 음성 극성의 직쇄상, 단일 스트랜드 RNA; 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA); 비구조 프로테인(NS1) 및 핵산 방출 프로테인(NEP)으로 이루어진다. 또한 대부분의 인플루엔자 A 스트레인은 프로아포프토시 특성을 갖는다고 여겨지는 11번째 프로테인(PB1-F2)을 인코딩하는 반면에 인플루엔자 B 바이러스만이 바이러스 독성에 기여하는 NB 프로테인을 발현한다(Hatta 및 Kawaoka, 2003, J. Virol., 77, 6050-6054). 또한, 상기 바이러스 NA 및 M 유전자 세그먼트에 의해 인코딩된 유전자 생성물의 그들의 발현 전략에 있어서, 인플루엔자 A 및 B 바이러스간에 미미한 차이가 있다(Lamb 및 Horvath, 1991, Trends Genet. 7:261-266). 각각의 유기체의 보다 큰 레저브와(reservoir)일 수도 있는 것을 나타내는 시일(seal)로부터 인플루엔자 B 바이러스를 단리하는 연구가 이미 이루어져 있지만, 인간에 대한 인플루엔자 B 바이러스의 대부분의 배타적인 컨파인먼트에 의해 현저한 생물학 및 전염학의 차이가 나타내어진다. 인플루엔자 A 바이러스는 다수의 조류 및 포유류종에 있어서 매우 광범위한 레저브와를 갖는다.

상기 게놈의 전사 및 복제는 핵에서 일어나고, 조립은 플라즈마 멤브레인으로부터 버딩을 통하여 일어난다. 상기 바이러스는 혼합 감염 동안에 유전자를 재집합할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 세포 멤브레인 글리코프로테인 및 글리코리피드에서 시알릴올리고사카리드에 HA를 통하여 흡착한다. 비리온의 엔도시토시스 후에 상기 HA 분자의 구조적인 변화가 멤브레인 퓨전을 가능하게 하여 언코팅을 유발하는 세포 엔도솜내에서 일어난다. 상기 뉴클레오캡시드는 바이러스 mRNA가 전사되는 핵으로 이동한다. 바이러스 mRNA는 바이러스의 엔도뉴클레아제가 바이러스 전사효소에 의해 바이러스 RNA 템플릿의 전사용 프라이머로서의 역할을 하는 세포의 이종 mRNA로부터 캐핑된 5'-말단을 개열하는 독특한 메카니즘에 의해 전사된다. 전사는 그들의 템플릿의 끝으로부터 15~22염기 위치에서 종결되고, 여기서, 올리고(U) 서열은 폴리(A) 트랙트의 첨가를 위한 신호로서 작용한다. 인플루엔자 A 복제 동안에 이와 같이 생성된 8개 바이러스 RNA 분자 중 6개는 HA, NA, NP를 대표하는 프로테인 및 바이러스 폴리머라제 프로테인인 PB2, PB1 및 PA로 직접 번역되는 모노시스트론성 메시지이다. 나머지 2개는 다른 리딩 프레임에서 번역되는 2개의 mRNA를 각각 생성하는 스플라이싱하에 전사되어 M1, M2, NS1 및 NEP를 생성한다. 환언하면, 8개 바이러스 RNA 세그먼트는 11개 프로테인: 9개의 구조적 및 2개의 비구조적(NS1 및 최근 확인된 PB1-F2) 프로테인을 코딩한다. 인플루엔자 B는 2개의 프로테인, 즉, NB 및 BM2에 대하여 다른 코딩 전략을 사용한다. 전자는 NA 유전자의 중첩 리딩 프레임으로부터 번역되고, 후자는 M 유전자로부터 중첩 중지-개시 코든을 통해 발현된다.

현재, 백신 접종이 인플루엔자에 대하여 인간을 보호하는 최선책으로 여겨진다. 건강한 성인이 면역력을 갖게 되면, 현재 입수 가능한 백신은 임상 질환을 70~90% 예방한다. 이 수치는 65세를 초과하는 인간에 대해서는 30~70%로 감소되고, 양로원의 65세를 초과하는 인간에 대해서는 더욱 감소된다(Strategic Perspective 2001: The Antiviral Market, Datamonitor. p. 59). 또한, 빈번한 바이러스의 항원 변화는 매년 백신 접종 조차도 예방을 보증할 수 없기 때문에 큰 사망 자수의 원인이 된다.

백신 접종은 시판의 화학적 불활성(사균)화 인플루엔자 바이러스 백신 또는 약독화 인플루엔자 바이러스 생백신으로 행해진다. 유감스럽게도, 불활성화 백신은 거의 예방이 거의 유도되지 않고, 따라서, 백신 스트레인이 미지의 미래의 유행성 스트레인의 항원 특성에 정확하게 일치해야만 한다.

복제 결손 인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 배출의 관점에서 안전성 문제를 극복하는 것으로 추정된다. 이들은 NS1 프로테인이 결실된 인플루엔자 A 돌연변이일 수 있다. 상기 NS1 프로테인의 부재는 백신이 접종된 포유류의 기도에서 상기 바이러스를 복제 결손하게 한다. 비강 투여시에, 상기 백신 바이러스는 바이러스 배출의 효과없이 뮤코잘 조직에 불임 감염을 개시할 수 있다. 동시에 상기 바이러스는 국부적 사이토카인 반응을 자극하고, B 및 T-세포 중재 방어 면역 반응을 일으킨다.

인플루엔자 B 바이러스는 대개 힘들고 시간이 걸리는 적응을 요구하여 베로 세포상에 충분한 성장을 이룬다. NS1의 파기된 기능으로 인한 인터페론 감수성 표현형 이외에 베로 세포상에 높은 역가로 복제할 수 있는 인플루엔자 B NS1 돌연변이는 문헌에 기재되어 있지 않다. 현재, 상기 NS1 ORF를 완전하게 결핍시킨 공개된 인플루엔제 B 바이러스는 베로 세포에서 효율적으로 복제되지 않는다(0.1moi를 사용한 1.7-2.5*10²FFU/ml의 역가 및 0.001moi에서 검출 가능한 역가가 없음. Dauber et. al; Journal of Virology, Feb. 2004, p. 1865-1872). 또한, 약 10⁴ FFU/ml의 최대 역가로의 복제에 있어서, 아미노 말단 16aa로 이루어지는 인플루엔자 B NS1 결실 돌연변이는 매우 약독화된다(Hai et. Al; Journal of Virology; Nov 2008, p. 10580-90).

인플루엔자 B 항원 화합물을 함유하는 높은 안전성의 백신 제제를 개발하기 위한 요구를 반영하면, NS1의 불임 기능으로 인해 약화되지만, 세포 배양에서 여전히 높은 성장 특성을 나타내는 인플루엔자 B 스트레인을 개발하는 것에 있어서 큰 요구가 있다.

통상의 인플루엔자 B 바이러스의 임상 단리는 고되고 시간이 걸리는 적응을 요구하여 베로 세포상에 높은 성장을 이룬다. 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 야생형 바이러스 및 예컨대, 38개 아미노산의 절단 NS1 프로테인을 발현하는 돌연 변이 또는 NS1 ORF를 완전하게 결핍시킨 돌연 변이는 인터페론 결손 베로 세포에 높은 역가로 복제될 수 있다. 이 발견은 복제 결손 약독화 인플루엔자 A 생백신을 제조하는데 사용되었다.

종래, 상기 내용은 조직 배양에서 높은 역가로 성장시키도록 비기능성 NS1 프로테인과의 돌연변이의 비상용성으로 인해 인플루엔자 B 바이러스에 적용할 수 없었다.

현재, 놀랍게도 본 발명자들은 인플루엔자 B 바이러스 게놈의 M 유전자의 N-말단 영역에 인접한 선택된 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 성장 능력이 매우 증가한다는 것을 발견했다. 인플루엔자 B 바이러스의 M 유전자는 M1 및 BM2 ORF를 포함하여 약 1.076bp길이이다.

또한, 본 발명은 상기 변형 M 유전자를 포함한 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 포함한다. 바람직하게는 상기 B 바이러스는 예컨대, NS1 프로테인내의 결실로 인하여 복제 결손이거나 또는 적어도 약화된다.

구체적으로, 본 발명은 M1 프로테인에 있어서, 아미노산 위치 82~90 중 어느 하나, 바람직하게는 아미노산 위치 85~87 중 어느 하나, 바람직하게는 아미노산 위치 86에서의 변형, 기능성 RNA 결합 도메인 및 카르복시 말단 도메인을 결핍한 NS1 프로테인을 코딩한 변형 NS1 세그먼트 및 필요에 따라서, 상기 M 유전자의 뉴클레오티드 위치 950에 잠재성 돌연변이를 포함하는 재조합 인플루엔자 B 스트레인을 포함한다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 바이러스를 함유하는 백신 제제, 인플루엔자의 예방적 처리의 방법 및 본 발명의 바이러스의 제조 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자를 인코딩하는 고립 핵산 및 그 제조방법을 포함한다.

도 1은 야생형, NS14, NS38, NS57 및 NS80(a) 및 야생형 및 △NS1(b)의 인플루엔자 B NS 유전자의 개략 번역 프로파일이다.
도 2는 14, 38, 57, 80 아미노산의 NS1 프로테인 및 야생형 NS1을 각각 발현하는 표식 바이러스의 NS 유전자의 PT-RCR 생성물이다.
도 3은 베로 세포(a) 및 A549 세포(b)상에 각각 14, 38, 57, 또는 80 아미노산의 NS1 프로테인 또는 야생형 NS1을 발현하는 인플루엔자 B/말레이시아 바이러스의 성장을 나타낸다.
도 4는 트랜스펙션 6일 후 wt M 유전자 또는 M1-M86V 유전자를 함유하는 wt NS1 또는 38 또는 80 아미노산의 NS1 프로테인을 지닌 인플루엔자 B/말레이시아 돌연변이(a) 및 트랜스펙션 5일 후 wt M 유전자 또는 M1-M86V 유전자를 함유하는 wt NS1 또는 38 또는 80 아미노산의 NS1 프로테인 또는 △NS1 유전자를 함유하는 B/플로리다 돌연 변이(b)의 바이러스 역가를 나타낸다.
도 5는 유전자 은행에서 공개한 M1-M86V 및 다른 서열과 원래 B/말레이시아/2506/04류 스왑 M 유전자의 아미노산 비교를 나타낸다.
도 6은 베로 세포(a) 및 A549 세포(b) 상에 △NS1 유전자 또는 야생형 NS1을 함유하는 인플루엔자 B/플로리다 바이러스의 성장을 나타낸다.
도 7은 M86V 돌연변이를 함유하는 B/비엔나/33/06 M1 프로테인(굵은 글자로 표시, SEQ ID No.1)(a) 및 M86V 돌연변이를 함유하는 B/튀링겐/02/06 M1 프로테인(굵은 글자로 표시, SEQ ID No.2)(b)의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8은 구성된 인플루엔자 B NS 돌연변이의 개략을 나타낸다. 구성된 인플루엔자 B 돌연변이의 모든 유전적 조성물(a); B/비엔나/33/06 M 유전자 M1-M86V의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.3(b); B/비엔나/33/06 M 유전자 M1-M86V 및 C950T의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.4(c); B/튀링겐/02/06 M 유전자 M1-wt의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.5(d); B/튀링겐/02/06 M 유전자 M1-M86V의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.6(e); B/비엔나/33/06 M 유전자 M1-C950T의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.7(f); NS 14의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.8(g); NS 38의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.9(h); NS 57의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.10(i); NS 64의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.11(j); NS 80의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.12(k); ΔNS1-B의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.13(l); ΔNS1-B의 B/튀링겐/02/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.14(m).
도 9는 각각 38, 80, 104 및 145 aa 길이의 NS1 프로테인을 지닌 인플루엔자 B 벡터를 발현하는 IL2의 개략 번역 프로파일(a); 인플루엔자 B 벡터를 발현하는 구성된 IL2의 모든 유전적 조성물(b); NS1-38IL2의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.15(c); NS1-80IL2의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.16(d); NS1-1041IL2의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.17(e); NS1-145IL2의 B/비엔나/33/06 NS 유전자의 뉴클레오티드 서열, SEQ ID No.18(f)를 나타낸다.
도 10은 베로 세포 상의 5일 경과 후의 인플루엔자 B/NS1-wt, B/NS1-38 및 B/NS1-38IL2 바이러스의 RT-PCR 생성물을 나타낸다.

본 발명은 인플루엔자 B 스트레인의 성장 능력을 증가시킬 수 있는 인플루엔자 B 바이러스의 M 유전자의 뉴클레오티드 서열 변경을 제공한다. 이러한 변경은 결실 및 치환을 포함할 수 있다. 인플루엔자 B의 M1 프로테인의 적어도 하나의 단일 아미노산 변경은 세포 배양, 특히 베로 세포에서 높은 성장 특성으로 연결될 수 있다는 것을 본 발명에 의해 성공적으로 나타내어진다. 특히, 이것은 NS1 ORF에서의 완전 결실이 있는 wt NS1 프로테인 또는 돌연변이에 비하여 감소된 길이의 NS1 프로테인을 발현하는 바이러스의 레스큐(rescue)를 가능하게 할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자는 상기 M 유전자의 뉴클레오티드 위치 265~294 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드, 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 277~285 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 뉴클레오티드 위치 280~282 중 어느 하나에 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형을 포함한다.

구체적으로, 상기 변형 M 유전자는 단리된 바이러스의 상응 서열의 ATG 대신에 위치 280~282에 뉴클레오티드 GTG를 포함한다. 또한, 상기 변형 M 유전자는 위치 280~282에 뉴클레오티드 GTA, GTC, GTT를 포함할 수도 있다. 물론, 상기 실시형태는 각각의 RNA 코든, GUG, GUA, GUC, GUU도 포함한다.

본 발명의 다른 실시형태에 따라서, 상기 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자는 상기 M1 프로테인에 있어서, 아미노산 위치 82~90 중 어느 하나, 바람직하게는 아미노산 위치 85~87 중 어느 하나, 바람직하게는 아미노산 위치 86에 적어도 하나의 아미노산 치환이 된 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 치환 아미노산은 바람직하게는 임의의 아미노산; 비극성, 소수성 아미노산일 수 있다. 구체적으로는 상기 아미노산 변경은 아미노산 위치 86에 발린으로 메티오닌을 변경하는 것으로 이어진다.

상기 M1 프로테인에 있어서, 아미노산 위치 82~90 중 어느 하나, 바람직하게는 아미노산 위치 85~87 중 어느 하나, 바람직하게는 아미노산 위치 86에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 M1 프로테인도 물론 본 발명에 포함된다. 상기 치환 아미노산은 바람직하게는 임의의 아미노산; 비극성, 소수성 아미노산일 수 있다. 구체적으로는 상기 아미노산 변경은 아미노산 위치 86에 발린으로 메티오닌을 변경하는 것으로 이어진다. 상기 M1 프로테인은 공지된 바와 같은 임의의 방법으로 생성될 수 있다.

"아미노산 치환"이란 그 분자의 비경구 아미노산 서열에서의 특정 위치에 변형 또는 다른 아미노산의 존재를 말한다. 상기 아미노산 치환은 그 위치에 채워질 수 있는 임의의 다른 아미노산에 관하여 발생된다. 상기 아미노산 서열 변경으로 얻어진 폴리펩티드는 아미노산 치환 뿐만 아니라 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 임의의 다른 아미노산 변형 등의 번역 후 변형(post-translational modification)에서의 변경을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 M 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스는 본 발명에 포함된다.

다른 실시형태에 있어서, 또한, 본 발명에 따른 변형 M 유전자를 함유하는 복제-결손 인플루엔자 바이러스는 NS 유전자내에 변형, 구체적으로는 전체 NS1 프로테인(ΔNS1)의 결핍 또는 부분 결핍을 함유할 수 있다. 상기 NS1 프로테인의 절단 또는 발현 결핍으로 인하여, 이러한 바이러스는 인터페론 결손 세포에서만 복제될 수 있지만, 그들의 능력을 잃어서 통상의 호스트 및 유기체에서 성장된다.

상기 인플루엔자 A 바이러스의 NS1 프로테인은 약 230개 아미노산으로 이루어지고, 감염에 있어서 빠르고 아주 분명하게 합성되는 다기능 프로테인이다. 이것은 세포의 항바이러스 활성에 대응하고, 병독성 인자이다. 그것의 카르복시 말단 영역의 활성에 의해, 상기 NS1 프로테인은 호스트 mRNA의 프로세싱 메카니즘을 억제할 수 있다. 두번째, 이것은 상기 세포의 번역 개시 인자와의 직접 상호반응에 의해 바이러스 mRNA의 우선 번역을 가능하게 한다. 세번째, dsRNA와 결합하여 추정 세포 키나아제와의 상호작용에 의해, 상기 NS1 프로테인은 인터페론(IFN) 유발성 dsRNA-활성 키아나제(PKR), 2'5'올리고아데닐레이트 합성효소계 및 사이토킨 전사 인자의 활성을 억제할 수 있다. 네번째, 상기 NS1의 N 말단 부분이 RIG-1에 결합되고, IFN-β의 전사 유도를 억제하는 IRF-3의 하류 활성을 저해한다. 따라서, 상기 NS1 프로테인은 INF-α 또는 INF-β 유전자의 발현을 억제하고, 상기 감염된 세포에서의 아포프토시스의 발생을 지연하고, 이웃 세포에서의 항바이러스 상태의 형태를 억제한다. 인플루엔자 B 바이러스는 체외에서 PRK 활성을 억제하고, 동일한 RNA 타켓을 결합하는 능력을 그것의 NS1-A 반대부와 공유하는 NS1-B라 칭하는 281-아미노산 비구조 프로테인을 바이러스 NS 세그먼트의 미스플라이싱 전사로부터 발현한다. 인플루엔자 A와 달리, 인플루엔자 B NS1은 프리-mRNA 스플라이싱을 억제하는 하는 것이 아니라 상기 인터페론 자극 유전자 15(ISG15) 생성물과 결합하여 세포내 표적과의 그것의 콘주게이션을 억제한다.

NS1 프로테인내에 변형을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스는 공지되어 있다. 예컨대, WO 99/64571은 NS1 유전자 세그먼트의 완전 넉아웃(knock out)을 기재하고 있고, WO 99/64068은 일부분이 결실된 각종 NS1 유전자 세그먼트를 기재하고 있다. 이들 공보는 참조에 의해 모두 여기에 포함된다. 현재, 상기 NS1 프로테인에 변형을 포함하는 몇몇의 인플루엔자 B 바이러스만이 알려져 있고, NS1에서의 폐지 기능으로 인한 인터페론 감수성 표현형을 지닌 바이러스가 베로 세포에서 높은 역가로 성장하는 것은 없다. 여기서, 상기 NS1 프로테인에 있어서, 변형을 지닌 이러한 바이러스의 구성이 기재되어 있다.

본 발명에 따라서, 상기 NSI 프로테인내의 변형은 복제 결손 인플루엔자 바이러스에서 얻어진 적어도 하나의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.

바람직하게는, 상기 변형 인플루엔자 B NS1 프로테인은 상기 NS1 아미노산의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 결실을 포함한다. 또한, 상기 NS1 프로테인의 기능성은 완전하게 감소될 수 있다. 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스의 NS1 프로테인은 기능성 RNA 결합 도메인을 결핍시킬 수 있다. 상기 NS1 프로테인의 아미노 끝(아미노산 1~93)에 위치된 도메인의 일차 기능은 dsRNA를 결합하고, PKR의 활성을 억제한다(Dauber et al, J Virol. 2006 Dec; 80(23):11667-77).

본 발명에 따라서, 기능성 카르복시 말단 도메인이라는 것은 호스트 mRNA의 프로세싱 메카니즘의 억제가 가능한, 즉, 그것의 활성이 상기 호스트 세포의 IFN 응답을 억제하는 NS1 프로테인내에 영역을 포함할 수 있다.

인플루엔자 B-NS1은 인플루엔자 A-NS1 보다 유사한 기능을 지닌 카르복시 말단 이펙터 도메인이 결여된 것으로 여겨진다. 인플루엔자 B 바이러스의 NS1 프로테인의 C-말단 도메인(아미노산 위치 84~281)은 주로 상기 IFN-α/β 응답의 저해를 초래한다(Dauber et al. J Virol. 2006 Dec; 80(23):11667-77).

본 발명에 따라서, 상기 인플루엔자 B NS1 프로테인의 카르복시 말단 도메인은 비기능성이 되게 한다. 기술 분야에 기재된 바와 같이, 상기 도메인은 아미노산이 치환 또는 삽입될 수 있을 뿐만 아니라 완전히 또는 부분적으로 결실될 수 있고, 잔존 도메인은 기능성의 검사를 할 수 있다(Dauber et al, J Virol. 2006 Dec; 80(23):11667-77).

따라서, 상기 M 유전자의 본 발명의 돌연변이는 인터페론 감수성 표현형을 지닌 절단 NSI 프로테인(예컨대, 80 미만의 아미노산)을 발현하는 인플루엔자 B 돌연변이체의 발생을 가능하게 한다. 특히, 이러한 돌연변이체는 높은 안전성 및 효능의 약독화 생백신 스트레인으로서 사용될 수 있었다.

특히, 상기 M 유전자내의 본 발명의 변형은 상기 복제 결손 인플루엔자 B의 성장 능력을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 상기 M1-M86V 돌연변이를 함유하는 80 아미노산의 NS1 프로테인(NS1-80)을 발현하는 인플루엔자 B 바이러스는 5*10⁵~5*10⁷TCID₅₀의 범위내에서 역가를 달성한 반면에, wt M1 프로테인을 지닌 동일한 바이러스는 3*10³~3*10⁵TCID₅₀으로만 성장한다. 80개 아미노산 보다 짧은 NS1 프로테인, 즉, 14, 38, 57 또는 64 아미노산을 함유하는 바이러스는 상기 M 유전자에 본 발명의 변형만을 사용하여 레스큐되고, 1*10⁴~3*10⁸TCID₅₀ 범위로 역가를 성장시켰다. 또한, 상기 M1-M86V 돌연변이는 각종 유전 아형(예컨대, 강소성10/03류)의 다른 인플루엔자 B 바이러스의 주쇄로 도입될 수 있어, 특히 NS1 절단 돌연변이체의 개선된 성장 능력이 스트레인 특이적이기 보다는 오히려 보편적이라는 것을 증명한다. 상기 주쇄에 있어서, 본 발명의 M1-M86V 돌연변이는 베로 세포에서 10⁷~10⁸ TCID₅₀/ml의 범위에서 높은 역가로 성장된 NS1 ORF가 완전히 제거된 ΔNS1-B바이러스의 발생을 가능하게 한다.

본 발명의 구체적 실시형태에 따라서, 재조합 인플루엔자 바이러스는

a) 상기 M1 프로테인의 아미노산 위치 86에서의 변형

b) 기능성 RNA 결합 도메인 및 기능성 카르복시 말단 도메인을 결핍한 NS1 프로테인을 코딩한 변형 NS1 세그먼트 및

c)필요에 따라 상기 M 유전자의 뉴클레오티드 위치 950에서의 사일런트 돌연변이를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태로서, 재조합 복제 결손 인플루엔자 B 바이러스는 이종 서열을 발현하기 위한 비히클, 예컨대, 케모카인 또는 사이토카인, 또는 그 단편의 발현을 위한 비히클로서 사용될 수도 있다.

더욱 구체적으로, 이것은

a. M1 프로테인의 아미노산 위치 86에서의 변형

b. 기능성 RNA 결합 도메인 및 기능성 카르복시 말단 도메인을 결핍한 NS1 프로테인을 코딩하는 변형 NS1 세그먼트, 및

c. 상기 NS1 유전자 세그먼트의 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 억셉터 부위 사이에 삽입된 이종 서열.

필요에 따라 상기 M 유전자의 뉴클레오티드 위치 950에서의 사일런트 돌연변이를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 상기 이종 서열은 사이토카인 또는 케모카인 또는 그들의 단편 또는 유도체를 발현한다. 사이토카인은 면역성, 염증 및 조혈을 조절하고 규제하는 작은 분비 프로테인이다. 최대 사이토카인 그룹은 면역 세포의 증식 및 분화를 촉진하는 것이다. 상기 그룹에 포함되는 것은 백혈구에 의해 생성된 사이토카인인 인터류킨 및 다양한 세포 형태로 생성될 수 있는 인터페론이다.

인터페론(IFN)은 박테리아, 바이러스, 기생충 및 암세포 등의 병원체에 의한 도전에 답하여 포유류, 조류, 파충류 및 어류를 포함한 척추 동물의 면역계의 세포로 생성된 글리코프로테인을 자연적으로 발생시키는 과이다. 인간에게 있어서, 3개의 주요 종류의 인터페론이 있다. 타입 I 인터페론은 14 IFN-알파 아류형 및 단일 IFN-베타, 오메가, 카파 및 엡실론 이소형을 포함한다. 타입 II 인터페론은 IFN-감마로 이루어지고, 최근 발견된 세번째 종류는 3개의 다른 이소폼을 지닌 IFN람다로 이루어진다.

Th1 세포는 주로 IL-2, IFN-γ 및 TNF-β를 분비하는 반면에 인간 면역 응답에 관련된 Th2 세포는 IL-4, IL-5 및 IL-10 등의 사이토카인을 분비한다. Th2-타입 사이토카인은 세포내 병원체에 대한 지연형 과민 반응을 조정하고, 상기 Th1 응답을 저해한다.

원래 케모어트랙턴트 사이토카인으로부터 유래된 케모카인은, 실제로 50 이상의 멤버를 포함하고, 면역 감시 및 염증 과정 동안에 결정적 역할을 하는 저분자량(단량체형으로 6-12kDa)의 작고, 유도가능하고 분비된 프로테인 과를 대표한다. 면역 및 염증에 있어서, 그들의 기능에 따라서, 2개의 종류로 구분될 수 있다. 염증성 케모카인은 많은 각각의 조직 세포에 의해, 또한 박테리아 독성 및 염증성 케모카인류 IL-1, TNF 및 인터페론에 응하여 백혈구를 이주시킴으로써 생성된다. 그들의 주요 기능은 호스트 디펜서를 위해 염증의 진행시에 백혈구를 동원하는 것이다. 한편, 케모카인의 귀환은 림프 조직의 한정된 영역에서 구조적으로 발현된다. 이들은 면역계 내에서 림프구와 수지상 세포의 트래픽 및 귀환을 지시한다. BCA-1, SDF-1 또는 SLC에 의해 나타낸 바와 같이 이들 케모카인은 성숙, 분화, 활성의 맥락에서 림프구의 재배치 및 재순환을 제어하고, 2차 림프 기관내에 그들의 정확한 귀환을 보장한다.

본 발명에 따라서, 생물학적 활성 사이토카인 또는 케모카인 또는 그들의 유도체 또는 단편은 상기 NS1 프로테인을 발현하는 ORF과 다른 오픈 리딩 프레임을 사용하여 안정하고 효율적으로 발현될 수 있다. 또한, 자연 시그널 펩티드 이외의 추가 리더 서열은 상기 프로테인의 효율적 분비를 더욱 지지하고 체내에서 면역 반응의 매우 효율적 유도를 나타내는 사이토카인 또는 케모카인으로 융합될 수 있다. 놀랍게도, 케모카인 및 사이토카인은 성숙 사이토카인/케모카인에 상응하는 아미노산 서열이 시그널 펩티드로서의 역할을 하는 아미노산 서열을 통하여 상기 NS1 프로테인의 일부로 융합될 때 효율적으로 발현될 수도 있다. 예컨대, 이들은 마우스 lgKappa 시그널 펩티드의 일부일 수 있다.

본 발명에 따라서, 바람직하게는 상기 이종 서열은 인터류킨 2(IL-2) 또는 그 단편 또는 유도체를 코딩한다. IL-2는 분비 시그널 서열을 포함하고, 항원 활성 T-세포의 클로날 확장에 요구되는 면역 조절, T-세포 유래 분자이다. CD4 + T 림프구에 의한 IL-2의 분비는 T-헬퍼 및 T-킬러 세포의 증식의 유도 및 T-세포의 자극 등 많은 생물학적 효과를 가져 다른 사이토카인을 생성한다. 또한, IL-2는 B-세포, NK세포 및 대식 세포를 활성화시킬 수도 있다. IL-2가 비림프계 세포를 감염시킨 재조합 바이러스로부터 발현되는 경우, 그것의 분비는 바이러스 감염의 발병을 현저하게 감소시킬 수 있고, 면역 응답을 변형할 수 있다. 또한, IL-2는 면역 애쥬번트 역할을 한다고 알려져 있다.

본 발명에 따라서, 상기 사이토카인 및 케모카인의 임의의 단편 또는 유도체는 생물학적 활성인, 즉 면역 조절 활성을 나타내는 것을 포함한다.

또한, 상기 사이토카인/케모카인은 IL-15, GM-CSF, CCL3 또는 CCL20 또는 그들의 유도체 또는 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수도 있다.

또한, 마이코박테리움 튜버큐로시스, 예컨대, ESAT-6으로부터 유래된 임의의 에피톱 또는 면역 조절 영역일 수도 있다.

또한, 상기 이종 서열은 항원 프로테인 또는 항원 펩티드와 융합된 사이코카인 또는 케모카인 또는 그들의 단편 또는 유도체인 키메라 프로테인을 포함할 수도 있다. 융합은 직접 또는 적어도 4 아미노산, 바람직하게는 적어도 5 아미노산의 길이를 갖는 펩티드 링커 서열을 통할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 링커 서열은 GGGS 또는 GGGGS이다. IL-2 키메라 프로테인의 예로는 공지되어 있다. 바람직하게는 이것은 IL-2-PE40(여기서, PE는 슈도모나스 외독소 A), DAB389-IL-2(여기서, DAB는 디프테리아 독소) 또는 IL-2 Bax(여기서 Bax는 인간 기원의 프로아포프토시스 프로테인)(Aqeilan R. et al., Biochem.J., 2003, 129-140)일 수 있다.

본 발명에 따라서, 상기 복제 결손 인플루엔자 벡터로 도입되는 이종 서열의 뉴클레오티드 서열은 그들의 천연 서열과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 동일성을 나타낸다. 코든 사용의 관점에서 상기 뉴클레오티드 서열의 임의의 최적화는 여기에 포함된다.

또한, 상기 이종 서열은 B-세포 에피톱 또는 T-세포 에피톱, 예컨대, 인플루엔자 적혈구 응집소로부터의 B 세포 에피톱(HATB), 예컨대, 상기 인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소(HA) 또는 그 일부로부터의 A 루프 에피톱, 또는 아미노산 서열 150~159에 상응하는 HA의 면역 우성 에피톱 중 하나를 나타내는 펩티드를 포함할 수 있다(Caton et al., 1982, Cell, 417-427).

또한, 상기 에피톱은 WO06/119527에 기재된 바와 같은 멜라노마 관련 내인성 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.

특정 실시헝태에 따라서, 상기 NS1 유전자 세그먼트는 기능성 천연 스플라이스 도너 및 억셉터 스플라이스 부위를 함유할 수 있다. 즉, 상기 스플라이스 도너 및 억셉터 부위는 천연 부위로서 유지된다. 즉, 상기 뉴클레오티드는 인공 기술에 의해 변형되지 않는다.

환경 적응 또는 천연 스트레인 개발에 기초한 인플루엔자 바이러스의 변형으로 인한 자연적으로 야기된 스플라이스 부위에서의 임의의 뉴클레오티드 변형은 천연 변형이고, 합성 또는 인공 변형이라는 용어에 포함되지 않는다.

또한, 상기 스플라이스 도너 및/또는 상기 억셉터 부위의 상류를 둘러싸는 서열은 변경될 수 있다. 바람직하게는 변경 또는 변형이 NS 인트론의 3 뉴클레오티드 5'에서 및/또는 8뉴클레오티드 3'에서 5'경계, 및 NS 인트론의 100 뉴클레오티드 5'에서 및/또는 2 뉴클레오티드 3'에서 3'경계 내에서 행해질 수 있다. 이것은 스플라이싱 활성을 변형시키기 위해서 합성 서열을 도입하는 것이 바람직하다.

예컨대, 이종 서열의 삽입이 NS 인트론 사이즈를 증가시키면, 이것은 스플라이싱 효력 및 상기 재조합 NS 세그먼트의 유전적 안정성을 증가시키기 위해서 상기 스플라이스 도너 및/또는 억셉터 부위를 둘러싸는 서열을 변형시키는 것이 바람직하다.

예컨대, 이것은 상기 스플라이스 도너 부위를 둘러싸는 양 서열을 변경하여 인간 U1 snRNA의 5'끝 및/또는 분기점을 포함하는 스플라이스 억셉터 부위의 상류 서열에 호몰로지를 증가시키고(Plotch et al. 1986, Proc Natl Acad Sci USA. 83:5444-8; Nemeroff et al. 1992, Mol Cell Biol. 12:962-70), 피리미딘 스트레치(pyrimidine stretch)가 상기 NS 세그먼트의 스플라이싱을 향상시키는 서열로 교체되는 것으로 변형될 수 있다.

스플라이싱을 최적화하기 위해서, 상기 스플라이스 억셉터 부위의 5'에 도입된 바람직한 서열은 래리어트 컨센서스 서열 및 피리미딘 스트레치를 포함한다. 상기 이종 서열의 발현율 및 바이러스 벡터의 안정성의 관점에서, 상기 NS 유전자내의 특정 위치, 예컨대, 상기 스플라이스 억셉터 부위의 바로 상류에 래리어트 컨센서스 서열 및 피리미딘 스트레치를 함유하는 합성/변형 서열을 도입하는 것이 중요할 수 있다.

또한, 상기 래리어트 컨센서스 서열과 피리미딘 스트레치 사이의 거리를 변경하여 NS 세그먼트의 스플라이싱률을 변경할 필요가 있다(Plotch S. 및 Krug R., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5444-5448; Nemeroff M. et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 962-970).

예컨대, 상기 재조합 인플루엔자 B 스트레인은 SEQ ID. No. 1 또는 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 SEQ ID No. 3~18 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 98% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 그들의 유도체를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라서, "재조합"이란 예컨대, 역유전학 기술과 같은 재조합 기술을 사용하여 생성된 모든 인플루엔자 스트레인을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 인플루엔자 스트레인은 M 유전자 내의 변형을 함유하지만, 부모 스트레인에 비하여 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열내에 임의의 다른 변형을 함유할 필요는 없다.

또한, 약학적으로 허용가능한 캐리어와 혼합하여 바이러스의 면역성 유도 효과량을 함유하는 백신 조성물을 포함한다. 또한, 상기 조성물에 애쥬번트가 함유될 수 있다.

본 발명에 따라서, "면역성"이란, 상기 바이러스가 체액성 또는 세포성 면역 응답 또는 바람직하게는 양쪽 모두를 일으킬 수 있는 것을 의미한다. 또한, 면역성 엔터티(immunogenic entity)는 항원이다. 바이러스의 면역성 유도 효과량은 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 체액성 또는 세포성 면역 응답, 또는 양쪽 모두를 일으킨다.

상기 백신 조성물은 조성물의 면역성 유도 효과량을 치료가 필요한 인간 환자에게 주입하는 것을 포함하는 인플루엔자 질병의 예방적 치료에 사용될 수 있다.

백신 조성물은 본 발명에 따른 완전한 인플루엔자 B 바이러스를 함유할 수 이지만, 바이러스 세그먼트의 일부가 다른 인플루엔자 B 스트레인 및 세그먼트로부터 유래된, 특히, 본 발명에 따라서 M1 프로테인이 재조합 인플루엔자 B 바이러스로부터 유래된 재교배 스트레인(reassortant strain)도 함유할 수 있다. 본 발명의 M1-M86V 돌연변이는 임의의 다른 인플루엔자 B 스트레인으로 더 도입될 수 있다.

상기 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염을 예방, 관리, 제압, 치료 및/또는 개선하는 방법에 또는 약제로서 사용되어도 좋다. 물론, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료용 약제의 제조에 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 M 유전자의 사용이 포함된다. 상기 면역성 조성물은 본 발명의 활성 인플루엔자 B 바이러스 또는 불활성 인플루엔자 B 바이러스 중 어느 하나를 포함해도 좋다. 상기 바이러스는 당업자에게 공지된 방법으로 불활성화될 수 있다. 일반적인 방법은 포르말린을 사용하고 불활성화을 위해 가열한다. 생균 면역성 제제는 증가된 면역원성 때문에 선호될 수 있다. 이라한 생균 재조합 면역성 제제의 제조는 정제 이후의 발육란(예컨대, 닭발육란)에서 또는 세포 배양에서의 바이러스의 증식을 포함한 통상의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

"약학적으로 허용가능하다"란, 미국의 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 리스트에 언급된 것을 의미한다.

"캐리어"란 약학 조성물(예컨대, 면역성 또는 백신 제제)이 투여되는 희석액, 애쥬번트, 첨가제 또는 비히클을 말한다.

또한, 식염수 및 덱스트로스와 글리세롤 수용액이 액체 캐리어, 특히, 주사제로서 사용될 수 있다. 바람직한 첨가제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소디움 클로라이드, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 바람직한 약학 캐리어의 예로는 E.W.Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 제제는 투여 형태에 따라서 선택되어야 한다. 또한, 특정 제제는 상기 바이러스가 활성인지 불활성인지의 여부에 따른다.

애주번트란 항원에 대한 면역 응답을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 말한다.

본 발명의 면역성 제제의 예방 및/또는 치료 효과는 어느 정도 면역 응답(예컨대, 체액성 면역 응답)을 달성 또는 유도하는 것에 기초한다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 면역성 제제는 피험자 또는 그것의 동물 모델(예컨대, 마우스, 페릿, 래트 또는 캐닌 모델) 중 어느 하나에 상기 인플루엔자 B 바이러스의 항원에 대한 항체의 검출가능한 혈청 역가를 유도한다. 상기 항체의 혈청 역가는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대, ELIAS 또는 혈구 응집소 억제 시험 등의 면역 측정법을 사용하여 측정할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라서, 바이러스를 생성시키는 방법은 본 발명의 인플루엔자 바이러스 M 유전자를 발현하는 재조합 발현계를 사용하는 것도 포함한다. 본 발명에 따라서, 상기 발현계는 Hoffmann et al.(Hoffmann et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97:6108-13)에 기재된 것 또는 EP07450117에 따른 선상 발현 구조체 등의 유용한 임의의 플라스미드일 수 있다.

변형 인플루엔자 바이러스 스트레인의 발현 및/또는 재교배체를 성장시키기 위해서, 베로 세포에 역유전학계를 사용할 수 있다. 상기 기술은 이미 공지되어 있다(Pleschka S. et al., 1996, J. Virol., 70(6), 4188-4192, Neumann 및 Kawaoka, 1999, Adv. Virus Res., 53, 265-300, Hoffmann et al. 2000. Proc Natl Acad Sci USA. 97:6108-13).

배양 매체를 사용한 바이러스의 배양에 사용되는 세포는 합성 매체에서의 체외에서 성장할 수 있고, 바이러스의 증식에 사용할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 본 발명의 범위내에서 "세포"란 개개의 세포, 조직, 기관, 곤충 세포, 조류 세포, 포유류 세포, 하이브리도마 세포, 1차 세포, 무한 증식 세포주, 및/또는 바이러스를 발현하는 재조합 세포 등의 유전자 변형 세포의 배양을 말한다. 이들은 예컨대, BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, CHO 세포, COS 세포, 뮤린 세포, 인간 세포, HeLa 세포, 293 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, MDOK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, TCMK 세포, LLC-PK 세포, PK 15 세포, WI-38 세포, MRC-5 세포, T-FLY 세포, BHK 세포, SP 2/0 세포, NS0, PerC6(인간 망막 세포), 닭배아 세포 또는 유도체, 부화란 세포, 닭 부화란 또는 그 유도체일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포주는 VERO 세포주이다.

바이러스의 생성에 사용되는 배양 매체는 바이러스 배양에 적용할 수 있는 종래 기술로부터 공지된 임의의 매체일 수 있다. 바람직하게는 상기 매체는 합성 매체이다. 이것은 예컨대, 변형 이글 매체(Modified Eagle media; MEM), 최소 필수 매체(minimum essential media; MEM), 둘베코 변형 이글 매체(Dulbecco's modified Eagle's media; D-MEM), D-MEM-12 매체, 윌리암스 E 매체(William's E media), RPMI 매체 및 그 유사체 및 유도체일 수 있다.

또한, 이들은 VP-SFM, OptiPro^TM SFM, AIM V®매체, HyQ SFM4Mega Vir^TM, EX-CELL^TM Vero SFM, EPISERF, ProVero, 임의의 293 또는 CHO 매체 및 그들의 유사체 및 유도체와 같은 특수 세포 배양 및 바이러스 성장 매체일 수 있다. 이들 매체는 예컨대, 동물 혈청 및 그 단편 또는 유사체, 아미노산, 성장 인자, 호르몬, 버퍼, 미량 원소, 트립신, 소디움 피루베이트, 비타민, L-글루타민 및 생리적 버퍼와 같이 세포 및 바이러스 배양에 적용될 수 있는 종래의 기술로부터 공지된 임의의 첨가제로 보충될 수 있다. 바람직하게는 매체는 L-글루타민 및 트립신이 보충된 OptiPRO^TM SFM 이다.

M 유전자의 본 발명의 변형을 사용하면 인플루엔자 B NS1 절단 돌연변이체의 성장률이 비변형 및 개선된 M 유전자 간의 바이러스 역가(TCID50)가 비교될 때, 상기 NS1-38바이러스에 대해 입증되는 바와 같이 적어도 약 100-1000의 인자까지 증가할 수 있다. 14, 57 또는 80 아미노산의 NS1 프로테인을 각각 발현하는 인플루엔자 B 바이러스에 대해서, 상기 돌연변이는 이러한 바이러스를 성장시키는데 당연히 요구되는 M 유전자에 있다. 상기 바이러스는 약 10⁶~10⁸ TCID₅₀의 역가까지 성장할 수 있다.

본 발명의 또 따른 실시형태는 본 발명의 인플루엔자 바이러스 M 유전자를 인코딩한 고립 핵산 및/또는 상기 변형 M 유전자를 함유하는 재조합 인플루엔자 바이러스 B이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 핵산을 제조하는 방법은 본 발명의 M 유전자를 인코딩한 벡터로 뉴클레오티드 서열을 도입하는 것을 포함한다. DNA 벡터가 사용되면, 상기 벡터는 마이너스 센스 인플루엔자 RNA에 대한 전사계이다. 예컨대, 이것은 Hoffmann et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA. 97:6108-13에서 사용되는 것과 같은 벡터일 수 있다.

상술의 것이 이하 실시예를 참조하여 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 실행하는 대표적인 방법이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되지 않아야 한다.

(실시예)

실시예 1:

복제 결손 약독화 인플루엔자 생백신으로서의 용도를 위한 절단 NS1 프로테인을 발현하는 인플루엔자 B 바이러스

B/빅토리아/2/87 계통의 대표로서 베로 적용 인플루엔자 B 스트레인(B/말레이시아/2506/04로서 서브타이핑된 B/비엔나/33/06)의 구성에 대한 역유전계가 개발되어 있었다(Hoffmann et. al 2000, PNAS 97(11):6108-13). HA 및 NA는 인플루엔자 B/튀링겐/02/06(B/강소성/10/03류)으로부터 클로닝되었다. 상기 M1 프로테인에서의 코딩 돌연변이를 도입함으로써(아미노산 위치 86에서 메티오닌을 발린으로 치환), 14, 38, 57 및 80아미노산의 NS1 프로테인의 절단 버전을 발현하는 인플루엔자 돌연변이체가 얻어질 수 있고, 각각 B/말레이시아 NS1-14, NS1-38, NS1-57 또는 NS1-80으로 명명되었다. 프레임 종결 코든에서 NS1의 번역이 2번 연속적으로 종료되었고, NEP의 스플라이싱 시그널까지 상기 종결 코든의 비번역부 하류가 결실되었다(도 1a). 상기 NS 유전자의 다른 길이로 인하여 다른 길이의 NS1 프로테인을 함유하는 바이러스는 PT-PCR에 의해 그들의 사이즈에 따라서 구별될 수 있었다(도 2). 모든 발생된 돌연변이체는 인터페론 결손 베로 세포에 고역가로 복제되었지만(도 3a), 인터페론 캄피턴트 A549 세포에서 약화되었다(도 3b).

구체적으로, 상기 M 유전자내의 본 발명의 변형은 상기 복제 결손 인플루엔자 B 바이러스의 성장 능력을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 상기 M1-M86V 돌연변이를 함유하는 80아미노산의 NS1 프로테인(NS1-80)을 발현하는 인플루엔자 B 바이러스는 트랜스펙션 6일 후 분석될 때, M1에 어떠한 변형도 함유하지 않는 동일한 바이러스의 약 1,33*10⁴ TCID₅₀ 의 역가와는 달리 약 5,62*10⁴ TCID₅₀의 역가로 성장된다. 38 아미노산의 NS1 프로테인(NS1 38)을 발현하는 인플루엔자 B 바이러스는 적응 M1 돌연변이 없이 전혀 레스큐될 수 없지만, 상기 M1-M86V 돌연변이가 도입되면 약 3.16*10² TCID₅₀의 평균 역가로 성장된다(도 4a). 상기 효과는 역가까지 반영된 트랜스펙션 후 2세대에서 더욱 표명되었다(표 1). 동일한 레스큐 효율성이 14 또는 57 아미노산의 NS1 프로테인을 각각 발현하는 인플루엔자 B 바이러스로 관찰되었고, 이것은 상기 M1-M86V 돌연변이의 존재에서만 레스큐되었다(데이터 생략). 또한, 베로 세포에 대한 적응 세대가 모든 NS1 돌연변이체 중 효율적 백신 생산에 요구되는 6,5-8,5 logs TCID₅₀의 범위의 고역가를 야기했다(도 3a). 본 발명의 돌연변이는 wt NS1 바이러스의 성장에 대하여 효과가 없거나 최소 효과만을 가졌다. 상기 비변형 M 유전자를 함유하는 wt NS1 인플루엔자 B 바이러스라도 트랜스펙션 후 6일(도 4a) 및 트랜스펙션 후 2세대(표 1)에서 상기 M1-M86V 돌연변이를 함유하는 유사 바이러스 보다 약간 높은 역가로 성장되었다. 이것은 트랜스펙션 후 1세대의 성장에 의해 설명되는 바와 같이, 다른 세대간의 성장의 변화에 의해 해석될 수 있다(M1-M86V에 의한 2,82*10⁷TCID₅₀와 비교하면 wt M 유전자에 의해 1,78*10⁷TCID₅₀, 모두 wt NS 유전자를 함유).

감염 4일 후 wt 또는 M1-M86V M 유전자 중 어느 하나와 결합된 wt, NS80 또는 NS38 NS1을 지닌 인플루엔자 B 바이러스의 바이러스 역가(TCID 50)가 트랜스펙션 후 2세대에서 분석되었다.

따라서, 상기 신규한 돌연변이만이 비기능성 NS1으로 인터페론 감수성 표현형을 지닌 짧은 NS1 프로테인(즉, 첫번째 N-말단 80 아미노산 미만을 포함)을 발현하는 인플루엔자 B 돌연변이체의 발생을 가능하게 한다.

따라서, 이러한 돌연변이체는 백신 스트레인으로서 사용할 수 있었다. 상기 돌연변이는 전혀 이전에 기재되어 있지 않고, NIBSC 서열 데이터 베이스에서 발견되지 않았다. 도 5는 상기 M1-M86V 유전자를 지닌 M 유전자 원래 B/말레이시아/2506/04류 스왑의 서열 비교 및 유전자 은행에 게시된 기타 서열을 나타낸다.

실시예 2

본 발명의 M1 프로테인(M86V)에서의 돌연변이는 다른 인플루엔자 B 계통에서의 베로 세포에 절단된 NS1 프로테인을 지닌 인플루엔자 B 바이러스의 생성을 가능하게 한다.

다른 인플루엔자 B 스트레인에서의 상기 M1-M86V 돌연변이의 영향을 시험하기 위해, 상기 B/야마가타/16/88 계통의 대표로서 인플루엔자 B/튀링겐/02/06(B/강소성/10/03류)의 생성을 위한 역유전계가 발생되었고, 상기 M1 프로테인(M86V)에서의 상술된 돌연변이가 도입되었다. 북반구에서 시즌 2008/2009 동안에 인플루엔자 백신 스트레인에 대한 WHO 추천을 따라서, B/플로리드/04/06류 바이러스의 HA 및 NA가 사용되었다. 38 및 80 아미노산의 NS1 프로테인의 절단 버전을 발현하는 인플루엔자 B 돌연변이체 또는 모노시스트로닉 RNA로서 NS2/NEP가 발현되는 NS1 ORF(ΔNS1-B)에서 완전 결실에 의한 돌연변이체(ΔNS1-B)(도 1b)가 얻어졌고, 각각 B/플로리다 NS1-38, NS1-80 또는 ΔNS1-B라 명명되었다. B/빅토리아/2/87 계통의 대표인 B/말레이시아의 돌연변이체에 의한 경우와 같이, 상기 M1-M86V 돌연변이는 야마가타 계통의 대표인 B/플로리다의 NS1-80 및 NS1-wt 바이러스의 레스큐 효율성에 작은 영향만을 갖는다. 이것은 wt M 유전자를 함유하는 돌연변이체에 비하여 트랜스펙션 5일 후 약간 증가된 역가에 의해 설명되었다(도 4b). M1-M86V 돌연변이를 함유하는 NS1-38 돌연변이체에 대한 바이러스 역가는 wt M1 유사체 보다 대략 4log 컸다. 상기 M1-M86V 돌연변이 때문에, 본 발명자는 트랜스펙션 5일 후 거의 4log의 역가를 도달한 ΔNS1-B 바이러스를 레스큐할 수 있었다(도 4b). ΔNS1-B 바이러스의 복제 결실 표현형을 설명하기 위해서, 본 발명자는 상응하는 wt 바이러스와 비교하여 IFN-결실 베로(도 6a) 및 IFN-캄피턴트 A549(도 6b)에서의 그것의 성장 능력을 시험했다. 양 바이러스는 10⁷~10⁸ TCID₅₀/ml의 범위내의 역가를 도달하는, 베로 세포에서 비슷한 성장 속도론을 나타냈다. ΔNS1-B 바이러스의 복제는 IFN-캄피턴트 A 549 세포에 전적으로 한정되었고, 이것은 2×10²TCID₅₀/ml의 검출한계를 초과하는 성장은 나타나지 않는 반면에 NS1-wt 바이러스는 3.15×10⁸TCID₅₀/ml의 고역가로 복제되었다. 돌연변이 바이러스 NS1-80 및 NS1-38은 중간체 복제 능력을 나타냈다(데이타 생략).

이들 데이타는 적응 M1 돌연변이가 하나의 바이러스 스트레인에서 성장 최적 효과를 가질 뿐만 아니라 다른 인플루엔자 B 계통에 효과적일 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 데이타는 상기 돌연변이가 베로 세포에서 높은 역가로 성장되는 상기 NS1 OFR가 완전하게 결실된 ΔNS1-B 바이러스를 레스큐하는데 필수라는 것을 설명한다. 따라서, 이것은 약독화 메카니즘이 주요 인터페론 길항제인 NS1 제거를 기본으로 하는 복제 결실 인플루엔자 B 바이러스 발생에 대한 보편 개념이다.

실시예 3:

특히, 고령자들에게 개선된 면역원성을 갖는 잠재적 약독화 인플루엔자 생백신으로서 비시스트로닉 발현을 사용한 NS 유전자로부터의 인간 인터루킨 2를 발현하는 인플루엔자 B 바이러스 벡터

인간 IL2의 코딩 서열에 이어서 중첩 중지-개시 카세트(TAATG)가 인플루엔자 B 바이러스의 NS1 프로테인의 아미노산 위치 38, 80, 104 또는 145 후에 각각 삽입되었다. 또한, 최적 스플라이스 부위에 잇따른 래리어트 컨센서스 서열을 포함하는 29 뉴클레오티드의 합성 서열, 20염기 피리미딘 스트레치 세그먼트(최적 스플라이스)는 IL2의 중지 코든과 NS2의 스플라이스 억셉터 부위 사이의 부분을 변경한다(EP7450176.8).(도 9a).

상기 M1 프로테인(M86V)에 있어서, 본 발명의 돌연변이를 도입함으로써, 본 발명자들은 인플루엔자 B/튀링겐/02/06(B/강소성/10/03류)의 주쇄에서 인플루엔자 B 바이러스 B/NS1-38IL2를 레스큐하는데 성공하였다. 상기 M1 프로테인에서의 본 발명의 변형없이, 상기 바이러스는 레스큐되지 않았다. B/NS1-38IL의 성장은 "공벡터"B/NS1-38에 비하여 약간 낮지만, 6log10 TCID 50/ml 초과의 역가가 달성되었다(표 2). 또한, 이 스톡은 베로 세포에서 계대접종되어 유전적 안정성을 체킹하였다. 잠정적으로 결실 돌연변이체를 반영한 보다 작은 PCR 결합의 출연없이 상기 NS 유전자의 기대 사이즈의 RT-PCT 결합의 존재로 설명되는 바와 같이 결실 돌연변이체의 출연은 확인되지 않았다(도 10).

B/NS1-38IL2로 감염된 베로 세포는 비감염 세포(mock), B/NS1-38 또는 B/NS1-wt로 감염된 세포에서 비검출성 IL2 레벨에 비하여 2.5㎍/ml IL2 초과의 높은 레벨로 분비되었다. 이러한 벡터는 인플루엔자 A에 대해 이미 입증된 바와 같이 특히, 고령자에게 개선된 면역원성을 갖는 인플루엔자 생백신으로서 사용될 수 있었다(Ferko, Kittel et al 2006).

본 발명자들은 3개 실시예 모두의 생성된 바이러스의 면역원성을 조사하였다. 이들 데이터로부터, 본 발명자들은 본 발명의 M1-M86V 돌연변이가 각각의 인플루엔자 A 바이러스의 유사 면역원성 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 구성된 바이러스의 면역원성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 결론을 내렸다.

SEQUENCE LISTING <110> AVIR GREEN HILLS BIOTECHNOLOGY RESEARCH DEVELOPMENT TRADE AG <120> Modified Influenza Virus <130> FluB/PCT <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 1 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Val Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 2 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Val Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Lys Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 3 <211> 1189 <212> DNA <213> Influenza B virus <400> 3 agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 60 tcattgacag aagatggaga aggcaaagca gaactagcag aaaaattaca ctgttggttt 120 ggtgggaaag aatttgacct agactctgcc ttggaatgga taaaaaacaa aagatgctta 180 actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatatgct ttttaaaacc caaagaccag 240 gaaagaaaaa gaagattcat cacagagccc 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gacatggttg tatcattatc attattagaa 1260 acattgtatg aaatgaagga tgtggttgaa gtgtacagca ggcagtgctt gtgaatttaa 1320 aataaaaatc ctcttgttac tact 1344

Claims

아미노산 위치 86에서 메티오닌을 발린으로 치환한 M1 프로테인을 야기하는 뉴클레오티드의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자.
제 1 항에 있어서,
위치 280~282에 뉴클레오티드 GTG, GTA, GTC, GTT, GUG, GUA, GUC, 또는 GUU를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자.
아미노산 위치 86에서 메티오닌을 발린으로 치환한 M1 프로테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
삭제
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제 3 항에 있어서,
상기 바이러스는 재교배 바이러스(reassortant virus)인 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 바이러스는 약독화 또는 복제 결손성인 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 바이러스는 NS 유전자내에 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
기능성 RNA 결합 도메인 및 기능성 카르복시 말단 도메인이 결핍된 NS1 프로테인을 코딩하는 변형 NS1 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
a. 기능성 RNA 결합 도메인 및 기능성 카르복시 말단 도메인이 결핍된 NS1 프로테인을 코딩하는 변형 NS1 세그먼트, 및
b. M 유전자의 뉴클레오티드 위치 950에서의 사일런트 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
a. 기능성 RNA 결합 도메인 및 기능성 카르복시 말단 도메인이 결핍된 NS1 프로테인을 코딩하는 변형 NS1 세그먼트,
b. NS1 유전자 세그먼트의 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 억셉터 부위 사이에 삽입된 이종 서열, 및
c. M 유전자의 뉴클레오티드 위치 950에서의 사일런트 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
SEQ ID No.3, 4, 6, 8 내지 18 중 어느 하나로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,
SEQ ID No.1 또는 2로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 그 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
제 3 항 또는 제 7 항에 기재된 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 면역성 유도 효과량을 약학적으로 허용가능한 캐리어와의 혼합물로 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 B 바이러스용 백신 조성물.
삭제
제 3 항 또는 제 7 항에 기재된 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 제조하는 방법으로서:
역유전자계에 있어서, 아미노산 위치 86에서 메티오닌을 발린으로 치환한 M1 프로테인을 포함하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 발현하는 재조합 벡터를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 제조방법.
복제 결손 인플루엔자 B 바이러스의 성장률을 증가시키는 방법으로서:
상기 인플루엔자 B 바이러스는 제 1 항에 기재된 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 복제 결손 인플루엔자 B 바이러스의 성장률 증가 방법.
제 1 항에 기재된 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 고립 핵산.
제 19 항에 기재된 고립 핵산의 제조방법으로서:
제 1 항에 기재된 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자를 인코딩한 핵산으로 뉴클레오티드 서열을 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 제조방법.
제 1 항에 기재된 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자로서:
인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방의 약제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자.
제 1 항에 기재된 인플루엔자 B 바이러스 M 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료용 약제의 제조방법.