EA024036B1 - Рекомбинантный ген m вируса гриппа b, кодирующий белок m1 с мутацией m86v - Google Patents

Abstract

Изобретение обеспечивает ген М вируса гриппа В (РНК-сегмент 7), кодирующий белок M1 с мутацией M86V, и рекомбинантный вирус гриппа В, содержащий белок M1 с мутацией M86V. Мутация M86V приводит к увеличению скорости роста вируса гриппа В. Предложенный рекомбинантный вирус гриппа В может быть использован при изготовлении вакцины для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа B.

Description

Изобретение относится к гену М вируса гриппа В, включающего модификацию по меньшей мере одного нуклеотида, расположенного вблизи Ν-конца гена М, в частности, в любом одном из положений от 265 до 294 нуклеотидной последовательности гена М, а также к вирусу гриппа В, включающего указанный модифицированный ген М.

Уровень техники

Эпидемии и пандемии, вызываемые вирусными заболеваниями, все еще уносят человеческие жизни и сотрясают мировую экономику. Миллионы потерянных рабочих дней и посещений докторов, сотни тысяч госпитализаций во всем мире (СоисЬ 1993, Αηη. ΝΥ. Асаб. 8с1 685;803,), десятки тысяч дополнительных смертей (СоШпк & ЬеЬтапп 1953 РиЬйс Неа1!Ь МоподгарЬк 213:1; О1е/еп 1982 АтЭ.РиЫю Неа1!Ь 77:712) и миллиарды евро в переводе на расходы по здравоохранению, все это происходит благодаря гриппу (^бйатк е! а1. 1988, Апп. 1п1ет. Меб. 108:616). Оба вируса А и В в прошлом вызывали такие эпидемии у людей, поэтому помимо поверхностных антигенов вируса А важным компонентом любой вакцины, эффективной для снижения заболеваемости гриппом, также являются и поверхностные антигены вируса В. Вирусы гриппа принадлежат семейству ОгЛотухоушбае и характеризуются сегментированными геномами, представленными негативными цепями ΚΝΑ, общие размеры которых составляют от 13,6 до 14,6 т.п.о., соответственно. Геномные вирусные ΚΝΑ для передачи вируса должны быть упакованы в вирусные частицы. Для ΚΝΑ-содержащих вирусов способ, с помощью которого собираются вирусные частицы потомства и возникают белок/белковые взаимодействия, является сходным. Образование вирусных частиц обеспечивает эффективный перенос ΚΝΑ-генома от одной клетки хозяина к другой в одном хозяине или в различных организмах хозяина. Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового ядра (спиралеобразного нуклеокапсида), содержащего геном, состоящий из одноцепочечной ΚΝΑ, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной внутри матриксным белком (М1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул линейных одноцепочечных ΚΝΑ негативной полярности, которые кодируют одиннадцать (некоторые штаммы гриппа А - десять) полипептидов, включающих ΚΝΑ-зависимые ΚΝΑ-полимеразные белки (РВ2, РВ1 и РА) и нуклеопротеин (ΝΡ), который образует нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (М1, М2 или ВМ2); два поверхностных гликопротеина, которые составлены из оболочки, содержащей липид: гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ΝΑ); неструктурный белок (Ν81) и белок, обеспечивающий экспорт в ядро (ΝΕΡ). Большинство штаммом гриппа А также кодируют одиннадцатый белок (РВ1-Р2), который, как считают, обладает проапоптотическими свойствами, тогда как только вирусы гриппа В экспрессируют белок ΝΒ, который может давать вклад в вирулентность вируса (На!!а апб Ка\уаока. 2003, 1. Уиок, 77, 6050-6054). Существуют и дополнительные небольшие различия между вирусами гриппа А и В в стратегиях экспрессии их генных продуктов, кодируемых вирусными сегментами генов ΝΑ и М (ЬатЬ апб НогуаЛ, 1991, Тгепбк Оепе!. 7:261-266). Показаны значительные биологические и эпидемиологические различия, заключающиеся в практически полном удерживании вирусов гриппа В у людей, хотя уже были исследования по выделению вируса гриппа В из тюленей, которые указывают на то, что также могут существовать более крупные резервуары различных организмов. Вирусы гриппа А имеют очень широкий спектр носителей инфекции, включающий многих птиц и видов млекопитающих.

Транскрипция и репликация генома происходит в ядре, а сборка осуществляется путем отпочковывания от плазматической мембраны. Вирусы могут пересортировывать гены во время смешанных инфекций. Вирус гриппа адсорбируется через НА сиалилолигосахаридами гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона внутри клеточной эндосомы происходит конформационное изменение в молекуле НА, которое облегчает слияние мембран, инициирующее, таким образом, снятие оболочки. Нуклеокапсид перемещается в ядро, где происходит транскрибирование вирусной тΚNΑ. Вирусная тΚNΑ транскрибируется с помощью уникального механизма, в котором вирусная эндонуклеаза отщепляет кэппированный 5'-конец от клеточных гетерологичных тΚNΑ, которые затем служат в качестве праймеров для транскрипции матриц вирусной ΚΝΑ с помощью вирусной транскриптазы. Транскрипты терминируются на участках от 15 до 22 оснований от концов их матриц, где последовательности олиго(И) служат сигналами для присоединения участков поли(А). Из восьми молекул вирусных ΚΝΑ, получаемых таким образом во время репликации гриппа А, шесть являются моноцистронными сигналами, которые транслируются непосредственно в белки, представленные НА, ΝΑ, ΝΡ и вирусными полимеразными белками, РВ2, РВ1 и РА. Другие два транскрипта подвергаются сплайсингу, приводящему к получению двух молекул тΚNΑ от каждого транскрипта, которые транслируются в различных рамках считывания, чтобы образовать М1, М2, Ν81 и ΝΕΡ. Другими словами, восемь сегментов вирусных ΚΝΑ кодируют одиннадцать белков: девять структурных и два неструктурных белка (Ν81 и недавно описанный РВ1-Р2). Грипп В использует различную стратегию кодировки для 2 белков, а именно ΝΒ и ВМ2. Первый из них транслируется из перекрывающейся рамки считывания гена ΝΑ, а последний экспрессируется через перекрывающийся стоп-старт кодон гена М.

В настоящее время вакцинация считается лучшим способом защиты людей от гриппа. Если здоровых взрослых людей иммунизируют, то современные вакцины предотвращают клиническое заболевание в 70-90% случаев. Этот уровень снижается до 30-70% у людей старше 65 и снижается еще ниже у людей

- 1 024036 старше 65, проживающих в домах престарелых (81га1едю РегересЬуе 2001: ТЬе АиЬу1га1 Магке1. Эа1атоп11ог. р. 59). Частые изменения вирусных антигенов вносят дополнительный вклад в большой список умерших, так как даже ежегодная вакцинация не может гарантировать защиту.

Вакцинацию проводят с помощью имеющихся в продаже химически инактивированных (убитых) или живых аттенуированных противогриппозных вакцин. К сожалению, инактивированные вакцины едва ли могут вызывать перекрестную защитную иммунную реакцию и, поэтому, вакцинный штамм должен точно соответствовать антигенным свойствам будущего неизвестного пандемического штамма.

Считают, что вирусы гриппа, дефектные по репликации, преодолевают проблемы безопасности, связанные с раздеванием вируса. Это могут быть мутанты вируса гриппа А, имеющие делеции белка N81. Отсутствие белка N81 делает этот вирус дефектным по репликации в дыхательных путях вакцинированных млекопитающих. После интраназального введения вакцинный вирус способен запускать абортивную инфекцию в тканях слизистых оболочек без эффекта раздевания вируса. В то же время вирус стимулирует локальный цитокиновый ответ и вызывает защитную иммунную реакцию, опосредованную В- и Т-клетками.

Для вирусов гриппа В необходима главным образом трудоемкая и требующая много времени адаптация для достижения значительного роста на клетках Уего. Мутанты гриппа В N81, которые способны реплицироваться с высокими титрами на клетках Уего и которые помимо этого обладают интерферончувствительным фенотипом вследствие уничтожения функции N81, в литературе описаны не были. В настоящее время опубликована только одна работа, относящаяся к вирусу гриппа В с полной потерей N81 ОКТ, который неэффективно реплицируется в клетках Уего (титры, составляющие 1,7-2,5-10² БОЕ/мл, с использованием множественности заражения 0,1, и отсутствие детектируемых титров при множественности заражения 0,001, соответственно. ИаиЬег е1. а1; 1оигиа1 оГ Уио1оду. РеЬ. 2004, р. 18651872). Делеционный мутант вируса гриппа В N81, состоящий из 16 концевых аминокислот, также является высокоаттенуированным в отношении репликации с максимальными титрами, составляющими примерно 10⁴ БОЕ/мл.(На1 е1. а1; 1оита1 оГ Упо1оду ; №у2008, р. 10580-90).

Ввиду необходимости разработки вакцинных композиций высокой безопасности, содержащих антигенные соединения вируса гриппа В, существует огромная потребность в усовершенствовании штаммов вирусов гриппа В, которые аттенуированы вследствие уничтожения функции N81, но которые все еще демонстрируют способность к быстрому росту в клеточной культуре.

Раскрытие изобретения

Для клинических изолятов вирусов гриппа В обычно необходима трудоемкая и требующая много времени адаптация, чтобы достичь значительного роста на клетках Уего. В случае вирусов гриппа А не только вирусы дикого типа, но также и мутанты, экспрессирующие укороченный белок N81, состоящий, например, из 38 аминокислот, или мутанты, полностью утратившие N81 ОКТ, способны к репликации с высокими титрами на клетках Уего, дефицитных по интерферону. Эту находку использовали для того, чтобы получить живую аттенуированную вакцину против вируса гриппа А, дефектную по репликации.

До настоящего времени эту концепцию не применяли в отношении вирусов гриппа В из-за неспособности мутантов с нефункциональным белком N81 расти с высокими титрами в тканевой культуре.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что способность к росту может быть значительно увеличена с помощью модификации выбранных нуклеотидов, находящихся вблизи №концевой части гена М генома вируса гриппа В. Ген М вирусов гриппа В имеет приблизительную длину, составляющую 1,076 т.п.о., и включает ОКТ для М1 и ВМ2.

Изобретение также охватывает рекомбинантные вирусы гриппа В, включающие указанный выше модифицированный ген М. Предпочтительно вирусы гриппа В являются дефектными по репликации или, по меньшей мере, являются аттенуированными, например, из-за делеций в белке N81.

В частности, настоящее изобретение охватывает рекомбинантный штамм вируса гриппа В, включающий модификацию в любой одной из аминокислот в положении 82-90, предпочтительно в любой одной из аминокислот в положении 85-87, предпочтительно в аминокислоте в положении 86 в белке М1, модифицированный сегмент N81, кодирующий N81, утративший функциональный КЛА-связывающий домен и С-концевой домен, и необязательно молчащую мутацию в нуклеотиде в положении 950 гена М.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает вакцинные композиции, содержащие вирус по изобретению и способы профилактического лечения гриппа, а также охватывает способы изготовления вируса, по изобретению.

Настоящее изобретение также охватывает выделенную в чистом виде нуклеиновую кислоту, кодирующую ген М по изобретению вируса гриппа, и ее получение.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - схематический профиль трансляции генов N8 вируса гриппа В дикого типа, N8-14, N8-38, N8-57 и N8-80 (а) и дикого типа и ΔΚ81 (Ь).

Фиг. 2 - продукты КТ-РСК гена N8 указанных вирусов, экспрессирующих белок N81, состоящий из 14, 38, 57, 80 аминокислот, или N81 дикого типа, соответственно.

Фиг. 3 - рост вирусов гриппа В/Ма1ау51а, экспрессирующих белок N81, состоящий из 14, 38, 57 или

- 2 024036 аминокислот, или N81 дикого типа, соответственно, на клетках Уего (а) и А549 (Ь).

Фиг. 4 - титры мутантов вирусов гриппа В/Ма1ау81а с белками N81, состоящими из 38 или 80 аминокислот, или с белком N81 дикого типа, содержащим ген М дикого типа или ген М1-М86У, через 6 дней после трансфекции (а) и мутантов В/Нопба. содержащих ген ΔΝ81, или с белками N81, состоящими из 38 или 80 аминокислот, или с белком N81 дикого типа, содержащим ген М дикого типа или ген М1-М86У, через 5 дней после трансфекции (Ь).

Фиг. 5 - сравнение аминокислот, кодируемых геном М, исходного смыва В/Ма1ау81а/2506/04подобного вируса, с геном М1-М86У и другими последовательностями, опубликованными в базе СепеЬапк.

Фиг. 6 - рост вирусов гриппа В/Иопба, содержащих ген Δ№1, содержащий мутацию М1-М86У, или вирусов гриппа В дикого типа, содержащих ген N81 дикого типа, на клетках Уего (а) и А549 (Ь).

Фиг. 7 - аминокислотная последовательность белка В/У1еппа/33/06 М1, содержащего мутацию М86У (отмеченную полужирным шрифтом, 8ЕЦ ГО №. 1) (а) и белка В/ТНиг1пдеп/02/06 М1, содержащего мутацию М86У (отмеченную полужирным шрифтом, 8ЕЦ ГО №. 2) (Ь).

Фиг. 8 - краткое описание сконструированных мутантов N8 гриппа В. Генетическая композиция всех сконструированных мутантов гриппа В (а); нуклеотидная последовательность гена М1-М86У В/У1епиа/33/06 М, 8ЕЦ ГО №. 3 (Ь); нуклеотидная последовательность гена М1-М86У В/У1еппа/33/06 М и С950Т, 8ЕО ГО №. 4 (с); нуклеотидная последовательность гена М1 дикого типа В/ТЬигш§еп/02/06 М, 8ЕО ГО №. 5 (б); нуклеотидная последовательность гена М1-М86У В/ТЬигш§еп/02/06 М, 8ЕЦ ГО №. 6 (е); нуклеотидная последовательность гена М1-С950Т В/У1еппа/33/06 М, 8ЕЦ ГО №. 7 (ί); нуклеотидная последовательность гена N8 для N814 В/У^еηηа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 8 (д); нуклеотидная последовательность гена N8 для N838 В/У^еппа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 9 (Н); нуклеотидная последовательность гена N8 для N857 В/У^еппа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 10, (ί); нуклеотидная последовательность гена N8 для N864 В/У^еппа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 11 (]); нуклеотидная последовательность гена N8 для N880 В/У^еииа/33/06. 8ЕО ГО №. 12 (к); нуклеотидная последовательность гена N8 для Δ№1-Β В/У^еииа/33/06. 8ЕЦ ΙΌ №. 13 (1); нуклеотидная последовательность гена N8 для Δ№1-Β В/ТЬигшдеп/02/06, 8ЕЦ ГО №. 14 (т);

Фиг. 9 - схематический профиль трансляции 1Ь2-экспрессирующих векторов гриппа В с белками N81, состоящими из 38, 80, 104 и 145 аминокислот, соответственно (а); генетическая композиция всех сконструированных 1Ь2-экспрессирующих векторов гриппа В (Ь); нуклеотидная последовательность гена N8 для N81-3802 В/У^еииа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 15 (с); нуклеотидная последовательность гена N8 для N81-8002 В/У^еииа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 16 (б); нуклеотидная последовательность гена N8 для N81-10402 В/У^еηηа/33/06. 8ЕЦ ГО №. 17 (е); нуклеотидная последовательность гена N8 для N81-145102 В/У^епиа/33/06, 8ЕЕ) ГО №. 18 (ί).

Фиг. 10 - продукты КТ-РСК гриппа В/№1 дикого типа, вирусов В/№1-38 и В/№1-38О2 после 5 пассажей на клетках Уего.

Осуществление изобретения

Изобретение обеспечивает изменение нуклеотидной последовательности гена М вируса гриппа В, которая может увеличить способность к росту штамма гриппа В. Такие изменения могут включать делеции и замены. Авторами изобретения было успешно продемонстрировано, что, по меньшей мере, изменение одной единственной аминокислоты в белке М1 гриппа В может приводить к свойствам быстрого роста в клеточной культуре, в частности, в клетках Уего. Это, в свою очередь, может обеспечивать сохранение вирусов, экспрессирующих белки N81, имеющие длину, укороченную по сравнению с белками N81 дикого типа, или мутантов, несущих в своем составе полную делецию N81 ОКР.

В частности, ген М вируса гриппа В в соответствии с настоящим изобретением включает модификацию, по меньшей мере, одного нуклеотида в любом одном из положений 265-294 нуклеотидной последовательности гена М, предпочтительно, по меньшей мере, одного нуклеотида в любом одном из положений 277-285 нуклеотидной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере одного нуклеотида в любом одном из положений 280-282 нуклеотидной последовательности.

В частности, модифицированный ген М содержит нуклеотиды ОТО в положениях 280-282 вместо АТС соответствующей последовательности выделенного вируса. Альтернативно модифицированный ген М может также содержать нуклеотиды СТА, СТС, СТТ в положениях 280-282. Конечно же, воплощение также охватывает соответствующие кодоны КNА, СИС, СИА, СИС, СИИ.

В соответствии с альтернативным воплощением настоящего изобретения ген М вируса гриппа В включает по меньшей мере одну модификацию нуклеотида, которая приводит по меньшей мере к одной аминокислотной замене в любом одном из положений аминокислот 82-90, предпочтительно в любом одном из положений аминокислот 85-87, предпочтительно в положении аминокислоты 86 в белке М1. Замененная аминокислота может быть любой аминокислотой; неполярная, гидрофобная аминокислота является предпочтительной. В частности, изменение аминокислоты приводит к замене метионина на валин в положении 86.

Конечно же, изобретение охватывает белок М1, включающий, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в любом одном из положений аминокислот 82-90, предпочтительно в любом одном из

- 3 024036 положений аминокислот 85-87, предпочтительно в положении аминокислоты 86 в белке М1. Замененная аминокислота может быть любой аминокислотой, но предпочтительно неполярной, гидрофобной аминокислотой. В частности, изменение аминокислоты приводит к замене метионина на валин в положении 86. Белок М1 может быть создан с помощью любого метода, известного в этой области техники.

Термин аминокислотная замена относится к присутствию модифицированной или другой аминокислоты в определенном положении в исходной аминокислотной последовательности этой молекулы. Аминокислотная замена происходит относительно любой другой аминокислоты, которая могла бы находиться в этом положении. Полипептид, который получается в результате изменения аминокислотной последовательности, может включать изменения в посттрансляционных модификациях, таких как гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования или любые другие модификации аминокислот, а также аминокислотную замену.

Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантный вирус гриппа В, включающий М ген вируса гриппа, по изобретению.

В других аспектах вирусы гриппа, дефектные по репликации, содержащие модифицированный ген М в соответствии с изобретением, могут дополнительно содержать модификацию в гене N8, в частности, утрату части или полную утрату белка N81 (ΔΝ81). Вследствие укорачивания или потери экспрессии белка N81 такие вирусы могут реплицироваться только в клетках, дефицитных по интерферону, но теряют свою способность расти в обычных носителях или организмах.

Белок N81 вируса гриппа А представляет собой полифункциональный белок, который состоит приблизительно из 230 аминокислот и рано и в большом количестве синтезируется при инфекции. Он противодействует противовирусным активностям клетки и является фактором вирулентности. С помощью активности своего С-концевого участка белок N81 способен ингибировать механизмы процессирования тКNА хозяина. Во-вторых, он облегчает предпочтительную трансляцию вирусной тКNА путем прямого взаимодействия с клеточным фактором инициации трансляции. В-третьих, путем связывания с άδΚNΑ и взаимодействия с предполагаемой клеточной киназой (киназами) белок N81 способен предотвращать активацию интерферон (IΡN-) индуцибельной ά8КNА-активируемой киназы (РКК), 2'5'-олигоаденилатсинтетазной системы и цитокиновых транскрипционных факторов. В-четвертых, ^концевая часть N81 связывается с ΚΙΟ-Ι и ингибирует последующую активацию ΙΡΡ-3, предотвращая транскрипционную индукцию ГР№р. Таким образом, белок N81 ингибирует экспрессию генов ЮТ-а или ШР-(Т задерживает развитие апоптоза в инфицированных клетках и препятствует возникновению антивирусного состояния в соседних клетках.

Вирусы гриппа В экспрессируют из несплайсированного транскрипта вирусного сегмента N8 неструктурный белок, состоящий из 281 аминокислот, называемый №1-В, который вместе со своим партнером №1-А обладает способностью связываться с теми же ΚNΑ-мишенями и ингибировать активацию РКК ίη νίίτο. В противоположность гриппу А, N81 гриппа В не ингибирует сплайсинг рге-щ^А, но связывается с продуктом интерферон-стимулируемого гена 15 (Ι8Ο15) и ингибирует его слияние с клеточными мишенями.

Вирусы гриппа А, содержащие модификации в белке N81, известны в этой области техники. Например, в патенте \УО 99/64571 описан полный нокаут сегмента гена N81, \УО 99/64068 раскрывает сегменты гена N81, которые были частично делетированы. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки. В настоящее время известны только несколько вирусов гриппа В, содержащих модификации белка N81, и ни один из этих вирусов, имеющих интерферон-чувствительный фенотип вследствие утраты функции N81, не растет с высокими титрами на клетках Уего. В настоящем описании описано конструирование таких вирусов с модификациями в белке N81.

В соответствии с настоящим изобретением модификация в белке N81 может быть делецией, вставкой или заменой по меньшей мере одной аминокислоты, приводящей к дефектному по репликации вирусу гриппа.

Предпочтительно модифицированный белок N81 гриппа В включает делецию по меньшей мере 50% аминокислот N81, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 90%. Альтернативно функциональность белка N81 может быть полностью устранена.

Белок N81 вируса гриппа в соответствии с изобретением может утратить функциональный КNАсвязывающий домен. Первичная функция этого домена, локализованного на №конце белка N81 (аминокислоты 1-93), состоит в связывании ά8КNА и подавлении активации РКК (ЛанЬег е1 а1, ί Уно1. 2006 Оес;80(23):11667-77).

В соответствии с изобретением термин функциональный С-концевой домен может включать участок белка N81, который обеспечивает ингибирование механизмов процессирования тКNА хозяина, то есть его активность подавляет 1Ж-ответ клеток хозяина.

N81 гриппа В, видимо, утрачивает С-концевой эффекторный домен с функцией, сходной с N81 гриппа А. С-концевой домен белка N81 (положения аминокислот 84-281) вируса гриппа В в основном отвечает за ингибирование ответа ΙΕ^α/β (ЛанЬег е1 а1, ί Уйо1. 2006 Эес;80(23):11667-77).

В соответствии с изобретением С-концевой домен белка N81 гриппа В может стать нефункцио- 4 024036 нальным. Этот домен может быть полностью или частично делегированным, а также могут быть заменены или вставлены аминокислоты, а оставшийся домен может быть проанализирован на функциональность, как описано в этой области техники (ЭаиЬег е! а1, I Уио1. 2006 Эес;80(23):11667-77).

Мутация гена М, по изобретению, обеспечивает генерацию мутантов гриппа В, которые экспрессируют укороченный белок N81 (например, состоящий менее чем из 80 аминокислот), таким образом несущий чувствительный к интерферону фенотип. Такие мутанты можно было бы особо использовать в качестве живых аттенуированных вакцинных штаммов, обладающих высокой безопасностью и эффективностью.

Модификация в гене М по изобретению может, в частности, усиливать способность к росту указанного дефектного по репликации гриппа В. Например, вирус гриппа В, экспрессирующий белок N81, состоящий из 80 аминокислот (N81-80), содержащий мутацию М1-М86У, достигал титров в диапазоне от 5-10⁵ до 5-10⁷ ТСГО50, тогда как сходный вирус с белком М1 дикого типа растет только до значений ТСГО50 3-10³-3 -10⁵. Вирусы, содержащие белок N81, который состоит менее чем из 80 аминокислот, например, 14, 38, 57 или 64 аминокислот, были сохранены только с помощью модификации в гене М по изобретению и росли до титров, составляющих диапазон 1-10⁴-3-10⁸ ТСГО⁵⁰. Мутацию М1-М86У также можно было вводить в другой базовый вирус гриппа В другого генетического подтипа (например, аналогичного Лаидзи/10/03), чтобы подтвердить, что улучшенная способность к росту, в особенности у укороченных мутантов N81 является скорее универсальным, а не специфичным к штамму свойством. Мутация М1-М86У, по изобретению, в этом базовом вирусе обеспечивает генерацию вируса Д№1-В с полностью делетированной N81 ОРР, растущего в клетках Уего до высоких титров в диапазоне от 10⁷ до 10⁸ ТСГО50/мл.

В соответствии со специфическим воплощением изобретения рекомбинантный вирус гриппа может включать:

a) модифицированную аминокислоту в положении 86 белка М1;

b) модифицированный сегмент N81, кодирующий белок N81, утративший функциональный РУАсвязывающий домен и функциональный С-концевой домен; и

c) необязательно молчащую мутацию в положении 950 последовательности нуклеотидов гена М.

В альтернативном воплощении изобретения рекомбинантный дефектный по репликации вирус гриппа В также можно применять в качестве средства для экспрессии гетерологичных последовательностей, например, для экспрессии хемокинов или цитокинов, или их фрагментов.

В частности, это может быть рекомбинантный вируса гриппа, включающий:

a. модифицированную аминокислоту в положении 86 белка М1;

b. модифицированный сегмент N81, кодирующий белок N81, утративший функциональный РNАсвязывающий домен и функциональный С-концевой домен; и

c. гетерологичную последовательность, вставленную между донорным сайтом сплайсинга и акцепторным сайтом сплайсинга сегмента гена N81.

б. необязательно молчащую мутацию в положении 950 последовательности нуклеотидов гена М.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения гетерологичная последовательность экспрессирует цитокины или хемокины, или их фрагменты или производные.

Цитокины представляют собой небольшие секретируемые белки, которые опосредуют и регулируют иммунный ответ, воспаление и гемопоэз. Самая большая группа цитокинов стимулирует пролиферацию и дифференцировку иммунных клеток. В эту группу включены интерлейкины, которые являются цитокинами, продуцируемыми лейкоцитами, и интерфероны, которые могут продуцироваться различными типами клеток. Интерфероны (IΡN) представляют собой семейство встречающихся в природе гликопротеинов, продуцируемых клетками иммунной системы позвоночных, включающих млекопитающих, птиц, рептилий и рыб, в ответ на инфицирование агентами, такими как бактерии, вирусы, паразиты и опухолевые клетки. У людей существует три основных класса интерферонов. Интерфероны, относящиеся к типу I, включают 14 подтипов ШЫ-альфа и единственные изоформы ШЫ-бета, омега, каппа и эпсилон. Интерфероны, относящиеся к типу II, состоят из ГРН-гамма, а недавно открытый третий класс состоит из ГРН-лямбда с тремя различными изоформами.

Клетки ТЫ секретируют в основном ГО-2, 1РЫ-у и ТМР-в, тогда как клетки ТЬ2, которые важны в гуморальных иммунных реакциях, секретируют цитокины, такие как ГО-4, ГО-5 и ГО-10. Цитокины, относящиеся к типу ТЬ2, опосредуют ответы гиперчувствительности замедленного типа, направленные на внутриклеточные патогены, и ингибируют ответы ТЫ.

Хемокины, исходно происходящие из хемоаттрактантных цитокинов, на самом деле включают более чем 50 участников и представляют собой семейство небольших, индуцибельных, секретируемых белков с небольшой молекулярной массой (6-12 1ГОа в своей мономерной форме), которые играют решающую роль во время иммунного надзора и воспалительных процессов. В зависимости от своей функции в иммунитете и воспалении, они могут подразделяться на два класса. Воспалительные хемокины продуцируются многими клетками различных тканей, а также лейкоцитами, мигрирующими в ответ на бактериальные токсины и воспалительные цитокины, подобные ГО-1, ТОТ¹ и интерферонам. Их основная

- 5 024036 функция состоит в рекрутировании лейкоцитов для защиты хозяина и в процессе воспаления. Хоминговые хемокины, с другой стороны, конститутивно экспрессируются в определенных участках лимфоидных тканей. В иммунной системе они управляют перемещением и хомингом лейкоцитов и дендритных клеток. Эти хемокины, как показано для ВСА-1, 8ΌΡ-1 или §ЬС, контролируют перемещение и рециркуляцию лимфоцитов в контексте созревания, дифференцировки, активации и обеспечивают их правильный хоминг во вторичных лимфоидных органах.

В соответствии с настоящим изобретением было показано, что биологически активные цитокины или хемокины, или производные, или их фрагменты могут стабильно и эффективно экспрессироваться, используя открытую рамку считывания, отличающуюся от ОКЕ, экспрессирующей белок N51. Альтернативно, дополнительные лидерные последовательности, отличающиеся от природных сигнальных пептидов, могут быть слиты с цитокинами или хемокинами, которые затем могут поддерживать эффективную секрецию белка и демонстрировать высокоэффективную индукцию иммунного ответа ίη νίνο.

Неожиданно было обнаружено, что хемокины и цитокины также могут быть эффективно экспрессированы, если аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому цитокину/хемокину слита с частью белка N51 через аминокислотную последовательность, функционирующую в качестве сигнального пептида, например, это может быть частью мышиного сигнального пептида 1д-каппа.

В соответствии с настоящим изобретением гетерологичная последовательность предпочтительно кодирует интерлейкин 2 (1Ь-2) или его фрагмент или производное. 1Ь-2 включает секреторные сигнальные последовательности и является иммуномодулирующей молекулой, происходящей из Т-клеток, необходимой для клональной экспансии антиген-активируемых Т-клеток. Секреция 1Ь-2 СЭ4+ Тлимфоцитами обладает множественными биологическими эффектами, такими как индукция пролиферации Т-хелперных и Т-киллерных клеток и стимуляция Т-клеток для продукции других цитокинов. Кроме того, 1Ь-2 также может активировать В-клетки, ΝΚ-клетки и макрофаги. Если 1Ь-2 экспрессируется рекомбинантными вирусами, инфицирующими нелимфоидные клетки, его секреция может значительно уменьшить патогенез вирусной инфекции и модифицировать иммунный ответ. Также известно, что 1Ь-2 действует как иммуностимулятор.

В соответствии с настоящим изобретением в объем изобретения включен любой фрагмент или производное цитокинов и хемокинов, которые все еще являются биологически активными, то есть демонстрируют иммуномодулирующие активности.

Альтернативно, цитокины/хемокины также можно выбирать из группы, состоящей из 1Ь-15, СМС8Р, ССЬ3 или ССЬ20, или их производных или фрагментов.

Альтернативно, это также может быть любым эпитопом или иммуномодулирующим участком из МусоЬасЮпит 1иЬегси1о818, например, Е5АТ-6.

Альтернативно гетерологичные последовательности также могут включать химерные белки, являющиеся цитокинами или хемокинами или их фрагментами или производными, слитыми с антигенными белками или антигенными пептидами. Слияние может происходить как непосредственно, так и с помощью последовательностей пептидных линкеров, имеющих протяженность по меньшей мере из 4 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 5 аминокислот, например, линкерными последовательностями в соответствии с изобретением являются ССС5 или СССС5.

Примеры химерных белков 1Ь-2 известны в этой области техники. Например, это может быть 1Ь-2РЕ40 (где РЕ является экзотоксином А РкеиДотопак), ΌΑΒ389-ΙΕ-2 (где ΌΑΒ является дифтерийным токсином) или 1Ь-2 Вах (где Вах является проапоптотическим белком человека) (Ас|еНап К. е! а1., Βίοсйет.1, 2003, 129-140).

В соответствии с настоящим изобретением нуклеотидные последовательности гетерологичных последовательностей, которые вводят в вектор вируса гриппа, дефектного по репликации, демонстрируют по меньшей мере 80% идентичности с их нативными последовательностями, предпочтительно по меньшей мере 85% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности. Таким образом, изобретение включает любую оптимизацию нуклеотидной последовательности с точки зрения использования кодонов.

Альтернативно, гетерологичная последовательность может включать эпитопы В-клеток или Тклеток, например, эпитоп В-клеток гемагглютинина (НАТВ) вируса гриппа, например, эпитоп А-петли гемагглютинина (НА) вируса гриппа или его части, или пептиды, представленные одним из иммунодоминантных эпитопов НА, соответствующих аминокислотной последовательности 150-159 (Са!оп е! а1., 1982, Се11, 417-427).

Эпитоп также может принадлежать ассоциированному с меланомой эндогенному ретровирусу (МЕРА), как описано в патенте АО 06/119527.

В соответствии со специфическим воплощением сегмент гена N51 может содержать функциональные природные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, то есть донорные и акцепторные сайты сплайсинга сохраняются как природные сайты, то есть нуклеотиды не модифицируют с помощью искусственных способов.

Любые модификации нуклеотидов в сайтах сплайсинга, встречающихся в природе из-за модификаций вирусов гриппа вследствие адаптаций к окружающей среде или естественного развития штаммов,

- 6 024036 являются природными модификациями и не попадают под термин синтетические или искусственные модификации.

Альтернативно могут быть изменены последовательности, окружающие донорный сайт сплайсинга и/или расположенные выше акцепторного сайта сплайсинга в направлении против хода транскрипции. Предпочтительно можно проводить изменение или модификацию в пределах 3 нуклеотидов 5'-конца и/или 8 нуклеотидов З'-конца в области 5'-границы интрона N8, а также 100 нуклеотидов 5'-конца и/или 2 нуклеотидов З'-конца в области З'-границы интрона N8. Преимущественным для модификации активности сплайсинга является подход с включением синтетических последовательностей.

Если, например, вставка гетерологичной последовательности увеличивает размер интрона N8, то чтобы повысить эффективность сплайсинга и, таким образом увеличить генетическую стабильность рекомбинантного сегмента N8, может быть предпочтительным модифицировать последовательности, окружающие донорные и/или акцепторные сайты сплайсинга.

Например, их можно модифицировать так, чтобы изменялась последовательность, окружающая донорный сайт сплайсинга для повышения гомологии с 5'-концом И1 кпКИА человека, и/или последовательность, расположенную выше акцепторного сайта сплайсинга в направлении против хода транскрипции, содержащую точку ветвления (1о1сП с1 а1. 1986, Ргос №ιΐ1 Асай 8с1 И8А. 83:5444-8; №шегоГГ с1 а1. 1992, Мо1 Се11 ΒίοΙ. 12:962-70) и пиримидиновый участок, заменяют последовательностью, которая усиливает сплайсинг сегмента N8.

Для оптимизации сплайсинга предпочтительная последовательность, вводимая с 5'-конца акцепторного сайта сплайсинга, включает лариатную консенсусную последовательность и пиримидиновый участок.

С точки зрения стабильности вирусного вектора и скорости экспрессии гетерологичной последовательности может быть важным вводить синтетическую/модифицированную последовательность, содержащую лариатную консенсусную последовательность и пиримидиновый участок в специфическом положении в гене N8, например, непосредственно на участке, расположенном выше акцепторного сайта сплайсинга в направлении против хода транскрипции.

Кроме того, для того чтобы модифицировать уровень сплайсинга сегмента N8, может быть необходимым варьировать расстояние между лариатной консенсусной последовательностью и пиримидиновым участком, (Р1о1сП 8. апй Кгид К., 1986, Ргос.№ц1.Асай.8сг. 83, 5444-5448; №тего£Г М. е1 а1., 1992, Мо1.Се11.Вю1., 962-970).

Например, рекомбинантный штамм гриппа В может включать аминокислотную последовательность, показанную в виде 8ЕЦ ГО. №. 1 или 2, или нуклеотидную последовательность, показанную в виде любой из последовательностей 8ЕЦ ГО №8. 3-18, или их производное, имеющее по меньшей мере 98% идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 99,5%.

В соответствии с изобретением термин рекомбинантный должен охватывать все штаммы гриппа, которые были получены с помощью рекомбинантных технологий, например, с помощью метода обратной генетики. Поэтому штаммы гриппа в соответствии с изобретением содержат модификацию в гене М, но не нуждаются в каких-либо дополнительных модификациях в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, если сравнивать с исходным штаммом.

Также изобретение охватывает вакцинную композицию, включающую иммуногенно индуцирующее эффективное количество вируса в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Также в композиции могут содержаться адьюванты.

В соответствии с изобретением термин иммуногенный означает, что вирус способен вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа. Иммуногенная структура также является антигенной. Иммуногенно индуцирующее эффективное количество вируса вызывает гуморальный или клеточный иммунный ответ и предпочтительно оба ответа, если его вводят животному, предпочтительно человеку.

Вакцинную композицию можно применять для профилактики заболевания гриппом, включающей введение пациенту-человеку, нуждающемуся в лечении, иммуногенно индуцирующее эффективное количество композиции.

Вакцинные композиции могут содержать полный вирус гриппа В в соответствии с изобретением, но также реассортантные штаммы, в которых часть вирусных сегментов происходит из различных штаммов и сегментов вируса гриппа В, в особенности белок М1 происходит из рекомбинантного вируса гриппа В в соответствии с изобретением. Мутацию М1-М86У по изобретению можно затем вводить в любой другой штамм гриппа В.

Композиции могут быть использованы в методах или в качестве лекарственных средств для предупреждения, оказания помощи, обезвреживания, лечения и/или облегчения инфекции вирусом гриппа. Конечно, изобретение включает применение молекулы М вируса гриппа в соответствии с изобретением при изготовлении лекарственного средства для лечения инфекции вирусом гриппа.

Иммуногенные композиции могут включать как живой, так и инактивированный вирус гриппа В, относящийся к изобретению. Вирус может быть инактивирован с помощью методов, хорошо известных

- 7 024036 специалистам в этой области техники. В традиционных методах для инактивации применяют формалин и нагревание.

Живая иммуногенная композиция может быть предпочтительной вследствие повышенной иммуногенности. Получение таких живых рекомбинантных иммуногенных композиций может быть выполнено с помощью общепринятых методов, включающих выращивание вируса в клеточной культуре или в оплодотворенных яйцах (например, в оплодотворенных куриных яйцах) с последующей очисткой.

Термин фармацевтически приемлемый означает одобренный органом управления федерального правительства или правительства штата или зарегистрированный в США.

Термин носитель относится к разбавителю, адьюванту, эксипиенту или среде, вместе с которыми вводят фармацевтическую композицию (например, иммуногенную или вакцинную композицию). В качестве жидких носителей, в особенности для инъецируемых растворов, также можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина. Подходящие эксипиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, натрия стеарат, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т. д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в книге РетьпдЬоп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек Ъу Е.^. Магйп. Композицию следует выбирать в соответствии со способом введения. Специфическая композиция может зависеть также от того, является ли вирус живым или он инактивирован.

Термин адьювант относится к соединению или смеси, которая усиливает иммунный ответ на антиген.

Профилактический и/или терапевтический эффект иммуногенных композиций по изобретению частично основан на обеспечении или индукции иммунного ответа (например, гуморального иммунного ответа). В одном аспекте иммуногенные композиции индуцируют возникновение детектируемого титра антител к антигенам вируса гриппа В в сыворотке крови как у субъекта, так и в модели гриппа на животных (например, в моделях на мышах, хорьках, крысах или собаках). Титр антитела в сыворотке крови можно определить, используя методики, известные специалисту в этой области техники, например, с помощью иммуноанализов, таких как ЕЬ18А, или с помощью тестов ингибирования гемагглютинина.

В соответствии с изобретением также включен способ создания вируса, где способ включает применение рекомбинантной экспрессионной системы, которая экспрессирует молекулу М вируса гриппа, по изобретению. В соответствии с настоящим изобретением экспрессионная система может быть любой полезной плазмидой, например, описанной в работе НоГГтапп е! а1. ((НоГГтапп е! а1. 2000, Ргос ЫаЙ Асай 8с1 И8А. 97:6108-13), или линейной экспрессионной конструкцией в соответствии с ЕР07450177.

Для развития реассортантов и/или экспрессии модифицированных штаммов вируса гриппа может быть использована система обратной генетики в клетках Уего. Технология уже хорошо известна в этой области техники (Р1ексйка 8. е! а1., 1996, 1. У1го1., 70(6), 4188-4192, №итаии апй Ка\уаока. 1999, Айу. νίгик Рек., 53, 265-300, НоГГтапп е! а1. 2000, Ргос ЫаИ Асай 8а И8А. 97:6108-13).

Клетки, используемые для культивирования вирусов с помощью среды для культивирования, могут быть любыми клетками, которые растут ίη уйго в синтетической среде, и могут быть использованы для выращивания вирусов. В настоящем изобретении термин клетки означает культивирование индивидуальных клеток, тканей, органов, клеток насекомых, птичьих клеток, клеток млекопитающих, клеток гибридом, первичных клеток, стабильных клеточных линий и/или клеток, созданных с помощью генноинженерных методов, таких как рекомбинантные клетки, экспрессирующие вирус. Они могут быть, например, клетками В8С-1, клетками ЬЬС-ΜΚ, клетками С^1, клетками СНО, клетками СО8, мышиными клетками, клетками человека, клетками НеЬа, клетками 293, клетками νΕΡΟ, клетками ΜΌΒΚ, клетками МИСК, клетками ΜΌΟΚ, клетками СРЕК, клетками РАР, клетками ТСМК, клетками ЕЬС-РК, клетками РК15, клетками ^1-38, клетками МРС-5, клетками Т-ЕЬУ, клетками ВНК, клетками 8Р2/0, N80, РегС6 (клетки сетчатки человека), эмбриональными клетками цыплят или производными, клетками оплодотворенных яиц, клетками оплодотворенных куриных яиц или их производными. Предпочтительно клеточная линия является линией клеток νΕΡΟ.

Среда для культивирования, применяемая для получения вирусов, может быть любой средой, известной в предшествующем уровне техники, которую применяют для культивирования вирусов. Предпочтительно среда является синтетической средой. Это может быть, например, основная среда, такая как модифицированная среда Игла МЕМ, минимальная незаменимая среда МЕМ, среда Игла в модификации Дюльбекко Ό-МЕМ, среда И-МЕМ-Р12, Е-среда Вильямса, среда РРМ1 и их аналоги и производные. Это также может быть специальной средой для культивирования клеток и роста вирусов, такой как VР-8ЕΜ, ОрЦРго™ 8ЕМ, среда А1М V®, НуЦ 8ЕМ4Меда^г™, ЕХ-СЕЬЬ™ V его 8ЕМ, ЕР18ЕРЕ, Рго\ его, любая среда для клеток 293 или СНО и их аналоги и производные. Эти среды могут быть дополнены любыми добавками, известными в предшествующем уровне техники, которые применимы для культивирования клеток и вирусов, например, сывороткой крови животных и ее фракциями или аналогами, аминокислотами, факторами роста, гормонами, буферами, микроэлементами, трипсином, натрия пируватом, витаминами, Ь-глутамином и биологическими буферами. Предпочтительно среда является ОрйРРО™ 8ЕМ, дополненной Ь-глутамином и трипсином.

- 8 024036

С помощью модификации гена М по изобретению скорость роста мутантов гриппа В с укороченным N81 может быть увеличена, по меньшей мере, примерно в 100-1000 раз, как показано для вируса N81-38, где вирусные титры (ТСГО₅₀) немодифицированных и улучшенных генов М могут быть сравнимыми по величине. Для вирусов гриппа В, экспрессирующих белок N81, состоящий из 14, 57 или 80 аминокислот, соответственно, мутация в гене М совершенно необходима для размножения таких вирусов. Такие вирусы могут расти вплоть до титров, составляющих примерно 10⁶-10⁸ ТСГО₅₀.

Еще одно воплощение изобретения представляет собой полученную в чистом виде нуклеиновую кислоту, кодирующую ген М вируса гриппа, по изобретению, и/или рекомбинантный вирус гриппа В, содержащий модифицированный ген М.

Кроме того, изобретение включает способ получения указанной нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением, где способ включает введение нуклеотидной последовательности в вектор, кодирующий молекулу М изобретения.

Если применяют ΌΝΆ-вектор, то указанный вектор представляет собой систему транскрипции для минус-смысловой ΚΝΆ вируса гриппа. Например, он может быть вектором, который был применен в работе Нойтапп е! а1., 2000, Ргос ΝαΟ Асай 8с1 И8Л. 97:6108-13.

Описание, приведенное ниже, будет полностью понятным путем отсылки к следующим примерам. Такие примеры, однако, являются иллюстрацией способов осуществления одного или нескольких воплощений настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Вирусы гриппа В, экспрессирующие укороченные белки N81, для применения в качестве дефектной по репликации живой аттенуированной противогриппозной вакцины.

Создавали систему обратной генетики для конструирования адаптированного к клеткам Уего штамма вируса гриппа В (В/У1епиа/33/06, субтипированного как В/Ма1ау§1а/2506/04) как представителя линии В/Ую1опа/2/87 (НоГГтапп е!. а1. 2000, РNА8 97(11):6108-13). НА и NА клонировали из вируса гриппа В/ТЬигшдеп/02/06 (В/Дап§8и/10/03-Ике). Путем введения кодирующей мутации в белке М1 (замена метионина на валин в положении 86 аминокислотной последовательности), можно получить мутанты вируса гриппа, экспрессирующие укороченный вариант белка N81, состоящего из 14, 38, 57 и 80 аминокислот, которые были названы В/Ма1ау81а N81-14, N81-38, N81-57 или N81-80, соответственно. Трансляцию N81 прекращали с помощью двух последовательных стоп-кодонов в рамке считывания и удаляли нетранслируемую часть, расположенную ниже стоп-кодонов по ходу транскрипции до сигнальной последовательности сплайсинга №Р (фиг. 1а). Из-за различного размера гена N8 вирусы, содержащие белки N81 различной длины можно было различать в соответствии с их размером с помощью КТ-РСК (фиг. 2). Все созданные мутанты реплицировались с высокими титрами на дефицитных по интерферону клетках Уего (фиг. 3а), но были аттенуированы на интерферон-компетентных клетках А549 (фиг. 3Ь).

Модификация в гене М по изобретению может, в частности, усиливать способность к росту указанных дефектных по репликации вирусов гриппа В. Например, по результатам анализа, проведенного через 6 дней после трансфекции ,вирус гриппа В, экспрессирующий белок N81, состоящий из 80 аминокислот (N81-80), содержащий мутацию М1-М86У, растет с титрами, составляющими примерно 5,62-10⁴ ТСГО50, в противоположность титрам, составляющим примерно 1,33-10⁴ ТСГО50, сходного вируса, который не содержит какую-либо модификацию в М1 (фиг. 4а). Вирус гриппа В, экспрессирующий белок N81, состоящий из 38 аминокислот (N81-38), вообще не может быть сохранен без адаптивной мутации М1, но растет до средних титров, составляющих примерно 3,16-10² ТСГО50, если введена мутация М1-М86У (фиг. 4а). Этот эффект был еще более выражен при втором пассаже после трансфекции, что отражено в титрах (табл. 1). Такую же эффективность сохранения наблюдали в случае вирусов гриппа В, экспрессирующих белок N81, состоящий из 14 или 57 аминокислот, соответственно, которые сохранялись только в присутствии мутации М1-М86У (данные не приведены). Последующие адаптивные пассажи на клетках Уего приводили к высоким титрам всех мутантов N81 в диапазоне величин 1од ТСГО50, равным 6,5-8,5, которые необходимы для эффективного получения вакцин (фиг. 3а). Мутация, по изобретению, может иметь лишь небольшой эффект на рост вирусов с N81 дикого типа или не обладать никаким эффектом вовсе. Спустя 6 дней после трансфекции, вирус гриппа В с N81 дикого типа, содержащий немодифицированный ген М, растет даже с немного более высокими титрами, чем аналогичный вирус, содержащий мутацию М1-М86У (табл. 1). Это можно объяснить вариациями роста между различными пассажами, как показано для случаев роста в первом пассаже после трансфекции (ТСШ50 1,78*10⁷) для гена М дикого типа, в сравнении с ТСГО50, составляющим 2,82-10⁷, для М1-М86У, оба вируса содержали ген N8 дикого типа).

Таблица 1

ТСП>5о, 2-ой пассаж после трансфекции
	М1 дикого типа	М1-М86У
N8 дикого типа	Ι,ΟΟΕ+07	1,0ОЕ+06
N51-80	ЗД6Е+05	1.78Е+07
N81-38	Ο,ΟΟΕ+ΟΟ	2,31Е+04

- 9 024036

Титры вирусов (ТСГО₅о) гриппа В с N880 дикого типа или №38-белком N81 в комбинации либо с геном М дикого типа, либо с М1-М86У геном М спустя 4 дня после трансфекции анализировали во 2-ом пассаже после трансфекции.

Таким образом, только эта новая мутация обеспечивает размножение мутантов вируса гриппа В, которые экспрессируют укороченный белок N81 (то есть, включающий менее 80 первых ^концевых аминокислот) с нефункциональным N81, который, следовательно, несет чувствительный к интерферону фенотип. Такие мутанты могли бы применяться в качестве вакцинных штаммов. Эта мутация никогда не была описана ранее и не была обнаружена в базе данных секвенирования №В8С. Фиг. 5 демонстрирует сравнение последовательности гена М исходного смыва штамма, подобного В/Ма1ау81а/2506/04, с геном М1-М86У и другой последовательности, опубликованной в базе данных ОеиеЬаик.

Пример 2. Мутация в белке М1 (М86У), по изобретению, обеспечивает размножение вирусов гриппа В с укороченными белками N81 на клетках Уего в различных линиях гриппа В.

Чтобы проанализировать мутацию М1-М86У в других штаммах вируса гриппа В, создавали систему обратной генетики для размножения вируса гриппа В/ТЬштидеи/02/06 (подобного В/Лаи§8и/10/03) как представителя линии В/Уатада!а/16/88, и вводили описанную мутацию в белок М1 (М86У). В соответствии с рекомендациями \УНО, касающихся вакцинных штаммов гриппа, предназначенных для сезона 2008/2009 в северном полушарии, применяли НА и NΑ вируса, подобного В/Ноп0а/04/06. Были получены мутанты вируса гриппа В, экспрессирующие укороченный вариант белка N81, состоящего из 38 и 80 аминокислот, или мутант с полной делецией в N81 ОКТ (Д^ЬВ) (фиг. 1Ь), в котором К82/ЛЕР экспрессируется в виде моноцистройной КЫА, которые были названы В/Нопба N81-38, N81-80 или АХ81-В, соответственно. Как было в случае мутантов В/Ма1ау81а, представителя линии В/У1с1опа/2/87, мутация М1-М86У оказывала лишь небольшое воздействие на способность к сохранению вирусов В/ИогМа N8180 и N81 дикого типа, представителей линии Уашада1а (фиг. 4Ь). Это было продемонстрировано с помощью немного повышенных титров спустя 5 дней после трансфекции по сравнению с мутантами, содержащими ген М дикого типа (фиг. 4Ь). Вирусные титры мутанта N81-38, содержащего мутацию М1М86У, были примерно выше на 4 порядка, чем у аналогов с М1 дикого типа. Из-за мутации М1-М86У нам удалось сохранить вирус АХ81-В, который достигал титров, составляющих 4 1од спустя 5 дней после трансфекции (фиг. 4Ь).

Чтобы продемонстрировать дефектный по репликации фенотип вируса АХ81-В, мы исследовали его способность расти на ГТЫ-дефицитных клетках Уего (фиг. 6а) и ШЫ-компетентных клетках А549 (фиг. 6Ь) в сравнении с соответствующим вирусом дикого типа. Оба вируса демонстрировали сравнимую кинетику роста на клетках Уего и достигали титров в диапазоне 10⁷-10⁸ ТСГО50/мл. Репликация вируса АХ81-В была полностью ограничена в ШХ-компетентных клетках А549, которые демонстрировали отсутствие роста выше предела детекции, составляющего 2х10² ТСГО50/мл, тогда как вирус с N81 дикого типа реплицировался с высокими титрами, составляющими 3,15х10⁸ ТСГО5₀/мл. Мутантные вирусы N8180 и N81-38 демонстрировали промежуточную способность к репликации (данные не приведены).

Эти результаты показывают, что адаптивная мутация М1 не только обладает эффектом, оптимизирующий рост, в одном штамме вируса, но видимо также эффективна в других линиях вируса гриппа В. Кроме того, результаты показывают, что эта мутация необходима для сохранения вируса АХ81-В, растущего с высокими титрами на клетках Уего, у которого полностью удалена N81 ОКТ. Таким образом, это универсальная концепция для размножения дефектных по репликации вирусов гриппа В, механизм аттенуации которых основан на удалении N81, главного антагониста интерферона.

Пример 3. Вектор вируса гриппа В из гена N8, экспрессирующий интерлейкин 2 человека с помощью стратегии бицистронной экспрессии, в качестве потенциальной живой аттенуированной противогриппозной вакцины с улучшенной иммуногенностью, в особенности для пожилых людей.

Кассету (ТААТО), перекрывающую стоп-старт кодон, а затем последовательность, кодирующую 1Ь2 человека, вставляли после положений 38, 80, 104 или 145 аминокислот белка N81 вируса гриппа В, соответственно. Кроме того, синтетическая последовательность из 29 нуклеотидов, включающая лариатную консенсусную последовательность, за которой следует оптимизированный сайт сплайсинга, удлиненный участок, состоящий из 20 пиримидиновых оснований (ор1. крЛсе), заменяет часть между стопкодоном 1Ь2 и акцепторным сайтом сплайсинга N82 (ЕР7450176.8) (фиг. 9а).

С помощью введения мутации белка М1 (М86У), по изобретению, нам удалось сохранить вирус В/Х81-381Ь2 гриппа В в базовом вирусе гриппа В/ТЬигшдеп/02/06 (подобного В/Лаи§8и/10/03). Без модификаций, по изобретению, в белке М1 такой вирус нежизнеспособен. Хотя рост В/М81-381Ь2 был слегка снижен по сравнению с пустым вектором В/Х81-38, был достигнут титр, превышающий 6 1од10 ТСГО5₀/мл (табл. 2). Этот исходный материал затем пассировали пять раз на клетках Уего, чтобы контролировать генетическую стабильность. Не было обнаружено появление мутантов с делецией, как было показано по присутствию полос в КТ-РСК с ожидаемым размером гена N8 без появления более низкомолекулярных полос РСК, которые потенциально отражают присутствие делеционных мутантов (фиг. 10).

Клетки Уего, инфицированные В/М81-381Ь2, секретировали высокий уровень, составляющий более чем 2,5 мкг/мл 1Ь2, в противоположность недетектируемому уровню 1Ь2 в неинфицированных клетках

- 10 024036 (имитация), клетках, инфицированных Β/Ν81-38 или Β/Ν81 дикого типа (табл. 2). Такие векторы можно было бы использовать в качестве живых противогриппозных вакцин с повышенной иммуногенностью, в особенности для пожилых людей, как уже было показано для вируса гриппа Α (Регко, 1<П1е1 е! а1 2006).

Таблица 2. Репликация в клетках Уего и уровни экспрессии 1Ь2 человека для указанных вирусов

Вирус	Титр [ТСГО50/МЛ]	Нитап 1Ь2 ЕЫЗА [пкг/мл]
Β/Ν81 дикого типа	2,88Е+07	<19
Β/Ν81-38	1,78Е+08	<19
В/И81-381Ь2	2,31Е+06	2687
Имитация	-	<19

Мы исследовали иммуногенность созданных вирусов во всех 3 примерах. Из этих результатов мы сделали вывод, что мутация М1-М86У, по изобретению, не оказывает негативного влияния на иммуногенность сконструированных вирусов, как было показано с помощью результатов по сравнительной иммуногенности соответствующих вирусов гриппа А.

Список последовательностей <110> ΑνίΚ ΟΚΕΕΝ Н1ЬЬ5 ВЮТЕСНИОЬООУ КЕ5ЕАКСН ΡΕνΕίΟΡΜΕΝΤ ΤΚΑϋΕ АС <120> мобтТтеб шЛиепга νιπΐ5 <130> Р1ив/РСТ <160> 18 <170> Ратепып уегзтоп 3.3 <210> 1 <211> 248 <212> ΡΚΤ <213> тПиепга в утгиз <400> 1

мег 1

зег ьеи

РЬе о!у Азр ТЬг 11е А1а туг ьеи ьеи зег ьеи ТЬг с1и

5

10

15

А5Р 01V

О1и

01 у

ЬУ5

А1а

О1и

ьеи

А1а

О1и

ЬУ5

Ьеи

НТЗ

СУ5

тгр

РЬе

20

25

30

с!у с!у

Ьуз

с!и

РЬе

Азр

ьеи

Азр

Зег

А1а

ьеи

С1и

ТГр

Не

ьуз

АЗП

35

40

45

Ьуз

Агд

Суз

Ьеи

тНг

Азр

Не

Οίη

ьуз

А1а

ьеи

Не

с!у

А1а

5ег

Пе

50

55

60

СУ5 65

РЬе

ьеи

ьуз

РГО

ьуз 70

АЗр

О1п

О1и

Агд

ьуз 75

Агд

Агд

РЬе

Не

ТЬг 80

С1и

РГО

ьеи

зег

С1у

Уа1

01 у

ТЬг

ТЬг

А1а

ТЬг

ьуз

ьуз

ьуз

01 у

Ьеи

85

90

95

11е

ьеи

А1а

01и

Агд

ьуз

мет

Агд

Агд

Суз

Уа1

зег

РКе

Нтз

С1и

А1а

100

105

110

РЬе

о1и

11е

А1а

О1и

О1у

НТ5

О1и

зег

зег

А1а

ьеи

ьеи

туг

Су 5

ьеи

115

120

125

Μβΐ

Уа1

мег

туг

ьеи

АЗП

РГО

О1у

Азп

туг

зег

мег

Οίη

Уа1

ьуз

ьеи

130

135

140

с1у 145

ТЬг

Ьеи

Суз

А1а

Ьеи 150

Суз

О1и

Ьуз

Οίη

А1а 155

Зег

Нтз

Зег

Нт 3

Агд 160

А1а

НТЗ

5ег

Агд

А1а 165

А1а

Агд

5ег

Зег

Уа! 170

Рго

О1у

Уа1

Агд

Агд 175

О1и

мет

С1п

мет

Уа1

5ег

А1а

Мег

АЗП

ТКг

А1а

ьуз

ТЬг

мес

Азп

01 у

мет

180

185

190

- 11 024036

С1у

ьуз

С1у 195

б!и

А5р

Уа!

61η

ЬУ5 200

ьеи

д1а

с! и

С! и

ьеи 205

с1п

Зег

Азп

ιΐβ

б1у

Уа!

ьеи

Агд

Зег

Ьеи

б1у

д!а

зег

б1п

Ьуз

АЗП

б!у

с! и

б!у

210

215

220

Не

а! а

Ьуз

дзр

уа!

мет

б1и

уа!

Ьеи

ьуз

о! η

зег

зег

мет

С! у

АЗП

225

230

235

240

5ег

а! а

ьеи

Уа!

ьуз

Ьуз

туг

ьеи

245 <210> 2 <211> 248

<212> РКТ

<213> тЛиепга в утгиз

<400> 2

мет

Зег

ьеи

РЬе

е!у

АЗр

ТЬг

Не

А! а

туг

ьеи

Ьеи

Зег

ьеи

ТЬг

С1и

1

5

10

15

Азр

е!у

е!и

б1у

ьуз

А! а

б!и

ьеи

А1а

С1и

ьуз

Ьеи

нт 5

Суз

тгр

РЬе

20

25

30

с! у

б!у

Ьуз

С! и

РЬе

Азр

ьеи

Азр

Зег

а! а

ьеи

б1и

тгр

1!е

ьуз

АЗП

35

40

45

Ьу5

Агд 50

Су5

ьеи

тЬг

А5р

11е 55

б1п

ьуз

А1а

ьеи

Не 60

б1у

А1а

Зег

ι! е

суг

РЬе

Ьеи

ьуз

Рго

ьуз

Азр

б!п

с! и

Агд

ьуз

Агд

Агд

РЬе

Не

ТЬг

65

70

75

80

б!и

рго

ьеи

зег

с! у 85

Уа1

с! у

ТЬг

ты

а! а 90

ТЬг

ьуз

ьуз

ьуз

с! у 95

Ьеи

Не

ьеи

д1а

61 и

Агд

ьуз

меТ

Агд

ьуз

Суз

Уа1

Зег

РЬе

НТ 5

61 и

А1а

100

105

110

рНе

с1и

Не

А! а

с! и

е1у

Нт 5

с! и

Зег

5ег

А! а

Ьеи

Ьеи

Туг

Суз

Ьеи

115

120

125

мет

Уа1

МеТ

Туг

Ьеи

Азп

Рго

б1у

Азп

Туг

Зег

МеТ

6ΐη

Уа1

Ьуз

Ьеи

130

135

140

С1у

ТЬг

Ьеи

Суз

А1а

Ьеи

Суз

б1и

Ьуз

С1п

А1а

5ег

Нт 5

5ег

НТ 5

Агд

145

150

155

160

а! а

НТЗ

Зег

Агд

а! а 165

а! а

Агд

5ег

зег

Уа! 170

РГО

С1у

уа1

Агд

Агд 175

С1и

мет

С1п

мет

Уа!

5ег

а! а

Мет

Азп

ТЬг

А! а

Ьуз

ТЬг

Мет

Азп

С! у

МеТ

- 12 024036

180

185

190

01у

Ьуз

О1у 195

01 и

Азр

уа!

01 п

Ьуз 200

ьеи

А1а

С1и

01 и

ьеи 205

01 п

5ег

Азп

11е

с1у

Уа!

Ьеи

Агд

зег

Ьеи

с1у

а! а

зег

οίη

ьуз

АЗП

б!у

01 и

01 у

210

215

220

11е

А1а

ьуз

Азр

Уа1

мех

с! и

Уа1

Ьеи

ьуз

01 η

Зег

Зег

мех

01 у

АЗП

225

230

235

240

Зег

А1а

Ьеи

Уа!

ьуз

ьуз

туг

Ьеи

245

<210> 3 <211> 1189 <212> ϋΝΑ <213> 1п^1иепга в νϊι-ιΐ5 <400> 3

адсадаадса	сдсасхххсх	хаааахдхсд	схдхххддад	асасааххдс	схассхдсхх	60
хсаххдасад	аадахддада	аддсааадса	даасгадсад	аааааххаса	схдххддххх	120
ддхдддааад	аахххдассх	адасхсхдсс	ххддаахдда	хаааааасаа	аадахдсхха	180
асхдахахас	ааааадсасх	ааххддхдсс	хсхахахдсх	ХХХХаааасс	сааадассад	240
дааадааааа	даадаххсах	сасададссс	ХХаХсаддад	хдддаасаас	адсаасаааа	300
аадаааддсс	ХдаХХсХддс	Хдададаааа	ахдадаадах	дхдхдадсхх	хсахдаадса	360
хххдааахад	садааддсса	хдааадсхса	дсдсхасхах	асхдхсхсах	ддхсахдхас	420
схдаахссхд	даааххаххс	аахдсаадха	ааасхаддаа	сдехсхдхдс	ХХХаХдсдад	480
ааасаадсах	сасаххсаса	садддсхсах	адсададсад	сдадахсххс	адхдссхдда	540
дхдадасдад	ааахдсадах	ддхсхсадсх	ахдаасасад	сааааасаах	даахддаахд	600
ддааааддад	аадасдхсса	ааадххддса	даададсгдс	ааадсаасах	хддадхдсхд	660
адахсхсххд	дддсаадХса	ааадаахддд	даадддаххд	саааддахдх	аахддаадхд	720
схааадсада	дсхссахддд	аааххсадсх	сххдхдаада	аахахсхаха	ахдсхсдаас	780
сахххсадах	хсхххсаахх	хдххсхххха	хсххахсадс	хсхссахххс	ахддсххдда	840
саахадддса	хххдаахсаа	ахааааадад	даахааасах	даааахасда	ахааааддхс	900
сааасааада	дасаахааас	адададдхах	сааххххдад	асасадххас	сааааадааа	960
хссаддссаа	адааасаахд	ааддаадхас	хсхсхдасаа	сахддаддха	ХХдадХдасс	1020
асахаахаах	хдаддддсхх	хсхдссдаад	адахаахааа	аахдддхдаа	асадххххдд	1080
адахадаада	аххдсаххаа	аххсаахххх	асхдхахххс	ххасхахдса	ХХХаадсааа	1140
ххдхаахсаа	ХдХсадсааа	хааасхддаа	ааадхдсдхх	дхххсхасх		1189

<210> 4 <211> 1189

- 13 024036 <212> ϋΝΑ <213> шЛиепга в утгиз

<400> 4 адсадаадса	сдсасХХХсХ	ХааааХдХсд	сХдХХХддад	асасааххдс	схассхдсхх	60
хсаххдасад	аадахддада	аддсааадса	даасхадсад	аааааххаса	схдххддххх	120
ддхдддааад	аахххдассх	адасХсХдсс	ххддаахдда	хаааааасаа	аадахдсхха	180
асхдахахас	ааааадсасх	ааххддхдсс	хсхахахдсх	ххххаааасс	сааадассад	240
дааадааааа	даадаХХсаХ	сасададссс	ХХаХсаддад	Хдддаасаас	адсаасаааа	300
аадаааддсс	хдаххсхддс	Хдададаааа	аХдадаадаХ	дХдХдадсХХ	ХсаХдаадса	360
хххдааахад	садааддсса	Хдааадсхса	дсдсХасХаХ	асХдХсХсаХ	ддХсаХдХас	420
схдаахссхд	даааххаххс	аахдсаадха	ааасхаддаа	сдсхсхдхдс	хххахдсдад	480
ааасаадсах	сасаХХсаса	садддсХсаХ	адсададсад	сдадахсххс	адхдссхдда	540
дхдадасдад	ааахдсадах	ддхсхсадсх	ахдаасасад	сааааасаах	дааХддаахд	600
ддааааддад	аадасдхсса	ааадххддса	даададсхдс	ааадсаасах	^эдадхдсхд	660
адахсхсххд	дддсаадхса	ааадаахддд	даадддаххд	саааддахдх	аахддаадхд	720
сХааадсада	дсХссаХддд	аааХХсадсх	сххдхдаада	аахахсхаха	ахдсхсдаас	780
саХХХсадаХ	ХсХХХсааХХ	ХдХХсХХХХа	ХсХХаХсадс	ХсХссаХХХс	аХддсХХдда	840
саахадддса	хххдаахсаа	ахааааадад	даахааасах	даааахасда	аХааааддХс	900
сааасааада	дасаахааас	адададдхах	сааххххдад	асасадххах	сааааадааа	960
хссаддссаа	адааасаахд	ааддаадхас	хсхсхдасаа	сахддаддха	ххдадхдасс	1020
асахааХааХ	хдаддддсХХ	ХсХдссдаад	адахааХааа	ааХдддхдаа	асадХХХХдд	1080
адахадаада	аххдсаххаа	аххсаахххх	асхдхахххс	ххасхахдса	хххаадсааа	1140
ххдхаахсаа	хдхсадсааа	хааасхддаа	ааадхдсдхх	дхххсхасх		1189

<210> 5 <211> 1190

<212> ϋΝΑ
<213> ктНиепга в νϊπΐ5
<400> 5 адсадаадса	сдсасхххсх	хаааахдхсд	схдхххддад	асасааххдс	схассхдсхх	60
хсаххдасад	аадахддада	аддсааадса	даасхадсад	аааааххаса	схдххддххс	120
ддхдддааад	ааХХХдассХ	адасХсХдсс	ХХддааХдда	Хаааааасаа	аадаХдсХХа	180
асхдахахас	адааадсасх	ааххддхдсс	хсхахсхдсх	ххххаааасс	сааадассад	240
дааадааааа	даадаххсах	сасададссс	схахсаддаа	хдддаасаас	адсаасаааа	300
аадаадддсс	хдаххсхадс	Хдададаааа	ахдадаааах	дхдхдадсхх	ссахдаадса	360
хххдааахад	садааддсса	хдааадсхса	дсдххасхах	аххдхсхсах	ддхсахдхас	420
схдаахссхд	даааххаххс	аахдсаадха	ааасхаддаа	сдсхсхдхдс	хххдхдсдаа	480
ааасаадсах	сасаххсаса	садддсХсаХ	адсададсад	сдадаХсХХс	адХдсссдда	540

- 14 024036 дХдадасддд аааХдсадаХ ддХсХсадсХ аХдаасасад сааааасаах даахддаахд 600 ддааааддад аадасдХсса аааасхддса даадаасхдс ааадсаасаХ ХддадХаХХд 660 адаХсХсХХд дддсаадхса ааадаахддд дааддааХХд саааддаХдх ааХддаадХд 720 схааадсада дсхсхахддд аааххсадсх сххдхдаада ааХассХаХа ахдсхсдаас 780 сахххсадах хсхххсаахх хдххсхххха ххххахсадс хсхссахххс ахддсххдда 840 саахаддаса хххааахсаа ахааааадад дадхааасах даааахасда ахаааддддс 900 саааХааада дасааХааас адададдХаХ сааХХХХдад асасадххас сааааадааа 960

ХссаддсХаа адаадсааХд ааддаадХас ХсХсХдасаа саХддаддХа ХХдадХдасс 1020 асаХадхаах хдаддддсХХ ХсХдсХдаад адаХааХааа ааХдддХдаа асадХХХХдд 1080 аддХадаада ахххсаххаа аххсаахххх ХасхдХасХХ сХХасХаХдс ахххаадсаа 1140 аххдхаахса ахдхсадсаа ахааасхдда аааадхдсдх хдхххсхасх 1190 <210> 6 <211> 1190 <212> ϋΝΑ <213> тЛиепга 8 \Нги5 <400> 6

адсадаадса	сдсасхххсх	хаааахдхсд	сХдХХХддад	асасааХХдс	схассхдсхх	60
хсаххдасад	аадахддада	аддсааадса	даасхадсад	аааааххаса	схдххддххс	120
ддхдддааад	аахххдассх	адасхсхдсс	ххддаахдда	Хаааааасаа	аадахдсхха	180
асхдахахас	адааадсасх	ааххддхдсс	хсхахсхдсх	ххххаааасс	сааадассад	240
дааадааааа	даадаХХсаХ	сасададссс	схахсаддад	хдддаасаас	адсаасаааа	300
аадаадддсс	хдаХХсХадс	Хдададаааа	ахдадаааах	дхдхдадсхх	ссахдаадса	360
хххдааахад	садааддсса	Хдааадсхса	дсдххасхах	аххдхсхсах	ддхсахдхас	420
схдаахссхд	даааххаххс	аахдсаадха	ааасхаддаа	сдсхсхдхдс	хххдхдсдаа	480
ааасаадсаХ	сасаххсаса	садддсХсаХ	адсададсад	сдадаХСХХс	адХдсссдда	540
дХдадасддд	аааХдсадаХ	ддХсХсадсХ	аХдаасасад	сааааасаах	даахддаахд	600
ддааааддад	аадасдХсса	аааасХддса	даадаасХдс	ааадсаасаХ	ХддадХаХХд	660
адахсхсххд	дддсаадхса	ааадаахддд	дааддааХХд	саааддаХдх	аахддаадхд	720
схааадсада	дсхсхахддд	аааххсадсх	сХХдХдаада	ааХассХаХа	аХдсХсдаас	780
саХХХсадаХ	хсхххсаахх	ХдХгсХХХХа	ХХХХаХсадс	ХсХссаХХХс	ахддсххдда	840
саахаддаса	ХХХаааХсаа	ахааааадад	дадхааасах	даааахасда	ахаааддддс	900
саааХааада	дасааХааас	адададдХаХ	сааХХХХдад	асасадххас	сааааадааа	960
ХссаддсХаа	адаадсаахд	ааддаадХас	ХсХсХдасаа	саХддаддХа	ХХдадХдасс	1020
асахадхаах	хдаддддсхх	хсхдсхдаад	адахаахааа	аахдддхдаа	асадххххдд	1080
аддХадаада	ахххсаххаа	аххсаахххх	хасхдхасхх	сххасхахдс	ахххаадсаа	1140

- 15 024036

аххдхаахса	ахдхсадсаа ахааасхдда аааадхдсдх хдхххсхасх	1190
<210> 7 <211> 1189 <212> ϋΝΑ <213> тЛиепга в νίπΐδ <400> 7 адсадаадса сдсасХХХсХ хаааахдхсд схдхххддад асасааххдс схассхдсхх	60
хсаххдасад	аадахддада аддсааадса даасхадсад аааааххаса схдххддххх	120
ддХдддааад	аахххдассх адасХсХдсс ххддаахдда хаааааасаа аадахдсхха	180
асХдаХаХас	ааааадсасх ааГХддХдсс хсхахахдсх ххххаааасс сааадассад	240
дааадааааа	даадаххсах сасададссс ххахсаддаа Хдддаасаас адсаасаааа	300
аадаааддсс	хдаххсхддс хдададаааа ахдадаадах дхдхдадсхх хсахдаадса	360
ХХХдаааХад	садааддсса хдааадсхса дсдсХасХаХ асхдХсХсаХ ддХсаХдХас	420
схдаахссхд	даааххаххс аахдсаадха ааасхаддаа сдсхсхдхдс хххахдсдад	480
ааасаадсах	сасаххсаса садддсхсах адсададсад сдадахсххс адхдссхдда	540
дХдадасдад	аааХдсадаХ ддхсХсадсх аХдаасасад сааааасааХ дааХддааХд	600
ддааааддад	аадасдхсса ааадххддса даададсхдс ааадсаасах ХддадХдсХд	660
адаХсХсХХд	дддсаадхса ааадааХддд даадддаххд саааддахдх ааХддаадхд	720
схааадсада	дсхссахддд аааХХсадсх сххдхдаада аахахсхаха ахдсхсдаас	780
сахххсадах	ХсХХХсааХХ ХдХХСХХХХа ХсСХаХсадс ХсХссаХХХс аХддсХХдда	840
саахадддса	хххдаахсаа ахааааадад даахааасах даааахасда ахааааддхс	900
сааасааада	дасаахааас адададдхах сааххххдад асасадххах сааааадааа	960
хссаддссаа	адааасаахд ааддаадхас хсхсхдасаа сахддаддха ххдадхдасс	1020
асахааХаах	ХдаддддсХХ хсхдссдаад адахаахааа ааХдддХдаа асадХХХХдд	1080
адаХадаада	аххдсаххаа аХХсааХХХХ асХдХахххс ХхасХаХдса ХХХаадсааа	1140
ххдхаахсаа	хдхсадсааа хааасхддаа ааадхдсдхх дхххсхасх	1189

<210> 8 <211> 558 <212> ϋΝΑ <213> 1пГ1иеп2а в νίπΐ5

<400> 8 адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааххдаддхд	ддхссдхдах	дасссаахдд	ахасаадхсс	ххахсаасхс	120
ХдсаХадахх	дааХдсаХаХ	дассададХд	дааддсХХдХ	ХдсХааасХХ	дххдссасхд	180
аХдаХсХХас	адхддаддах	даадаадаХд	дссаХсддаХ	ссхсаасхса	сХсхХсдадс	240
дхсххаахда	аддасаХХса	аадссааХХс	дадсадсхда	аасхдсддхд	ддадхсххах	300
сссааХХХдд	Хсаададсас	сдаХХаХсас	садаададдд	адасааХХад	асХддХсасд	360

- 16 024036

даадаасххх ахсххххаад хаааадаахх дахдахааса хаххаххсса	саааасадха	420
ахадсхааса дсхссахаах адсхдасахд дххдхахсах хахсаххахх	адааасаххд	480
ХаХдаааХда аддаХдХддХ ХдаадХдХас адсаддсадХ дсХХдХдааХ	ХХааааХааа	540
аахссхсххд ххасхасх		558

<210> 9 <211> 630 <212> ΟΝΑ <213> 1п61иепга В утгиз

<400> 9 адсадаадса даддаХХХдХ ххадхсасхд дсааасадда	аааааХддсд аасаасаХда	60
ссасаасаса ааххдаддхд ддхссдддад саассаахдс	сассахааас хххдаадсад	120
дааххсхдда дхдсхахдаа аддсхххсах ддсааадахд	ахдасссаах ддахасаадх	180
ссххахсаас ХсХдсаХада ХХдааХдсаХ аХдассадад	ХддааддсХХ дХХдсХааас	240
ххдххдссас хдахдахсхх асадХддадд аХдаадаада	хддссахсдд ахссхсаасх	300
сасхсххсда дсдхсххаах дааддасахх сааадссаах	хсдадсадсх дааасхдсдд	360
хдддадхсхх ахсссааххх ддхсаададс ассдаххахс	ассадаадад ддадасаахх	420
адасХддХса сддаадаасХ ХхаХсХХХХа адХаааадаа	ххдахдахаа сахаххаххс	480
сасаааасад хаахадсхаа садсхссаха ахадсхдаса	хддххдхахс аххахсахха	540
ххадааасах хдхахдааах дааддахдхд дххдаадхдх	асадсаддса дхдсххдхда	600
ахххааааха аааахссхсх Хдххасхасх		630

<210> 10 <211> 687 <212> ϋΝΑ <213> ТпПиепга в νΐπΐδ

<400> 10 адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	аааааХддсд	аасаасаХда	60
ссасаасаса	ааххдаддхд	ддхссдддад	саассаахдс	сассахааас	хххдаадсад	120
дааххсхдда	дхдсхахдаа	аддсхххсах	ддсааададс	ссххдасхас	ссхддхсаад	180
ассдссхааа	садасхааад	адааааххад	адхсахдахд	асссаахдда	хасаадхссх	240
хахсаасхсх	дсахадаХХд	ааХдсаХаХд	ассададХдд	ааддсххдхх	дсХааасХХд	300
ххдссасхда	хдахсххаса	9199аддахд	аадаадахдд	ссахсддахс	схсаасхсас	360
ХсХХсдадсд	ХсХХааХдаа	ддасаХХсаа	адссааХХсд	адсадсхдаа	асхдсддХдд	420
дадхсххахс	ссаахххддх	саададсасс	даххахсасс	адаададдда	дасааХХада	480
схддхсасдд	аадаасххха	хсххххаадх	аааадааххд	ахдахаасах	аххаххссас	540
аааасадхаа	хадсхаасад	схссахааха	дсхдасахдд	ххдхахсахх	ахсаххахха	600
дааасаххдх	ахдааахдаа	ддахдхддхх	даадхдхаса	дсаддсадхд	сххдхдаахх	660
хаааахаааа	ахссхсххдх	хасхасх				687

- 17 024036

<210> 11
<211> 708 <212> ϋΝΑ <213> ХпПиепга в νίτυϊ
<400> 11 адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааХХдаддХд	ддХссдддад	саассаахдс	сассаХааас	хххдаадсад	120
дааххсхдда	дхдсхахдаа	аддсхххсах	ддсааададс	ссххдасхас	ссхддхсаад	180
ассдссхааа	садасхааад	адааааххад	адХсаадааХ	ааадасХсас	аасаааХдаХ	240
дасссаахдд	ахасаадхсс	ххахсаасхс	хдсахадахх	даахдсахах	дассададхд	300
дааддсххдХ	хдсхааасхх	дххдссасхд	ахдахсххас	адхддаддах	даадаадаХд	360
дссахсддах	ссхсаасхса	схсххсдадс	дхсххаахда	аддасаххса	аадссааххс	420
дадсадсХда	аасХдсддХд	ддадХсХХаХ	сссаахххдд	Хсаададсас	сдаХХаХсас	480
садаададдд	адасааххад	асхддхсасд	даадаасххх	ахсххххаад	хаааадаахх	540
даХдаХааса	хаххаххсса	саааасадха	ахадсХааса	дсхссахаах	адсХдасаХд	600
дххдхахсах	хахсаххахх	адааасаххд	хахдааахда	аддахдхддх	хдаадхдхас	660
адсаддсадх	дсХХдХдааХ	ххаааахааа	аахссхсххд	ХХасХасХ		708
<210> 12 <211> 756 <212> ϋΝΑ <213> ТпПиепга в νϊπΐδ
<400> 12 адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааХХдаддХд	ддХссдддад	саассаахдс	сассахааас	хххдаадсад	120
дааххсхдда	дхдсхахдаа	аддсхххсах	ддсааададс	ссххдасхас	ссхддхсаад	180
ассдссхааа	садасХааад	адааааХХад	адХсаадааХ	ааадасХсас	аасаааадхд	240
адссгдааад	хааааддахд	хсссххдаад	ададаааадс	аахххдахда	сссаахддах	300
асаадХссХХ	аХсаасХсХд	саХадаХХда	аХдсаХахда	ссададХдда	аддсххдххд	360
схааасххдх	хдссасхдах	дахсххасад	хддаддахда	адаадахддс	сахсддахсс	420
хсаасхсасх	сххсдадсдх	сххаахдаад	дасаХХсааа	дссааХХсда	дсадсХдааа	480
схдсддхддд	адхсххахсс	саахххддхс	аададсассд	аххахсасса	даададддад	540
асааХХадас	ХддХсасдда	адаасХХХаХ	сххххаадха	ааадааххда	хдахаасаха	600
ххаххссаса	ааасадХаах	адсхаасадс	хссахаахад	схдасахддх	хдхахсахха	660
хсаххаххад	ааасаХХдХа	ХдаааХдаад	даХдХддХХд	аадХдХасад	саддсадХдс	720
ххдхдааххх	аааахааааа	хссхсххдхх	асхасх			756
<210> 13 <211> 443 <212> ϋΝΑ

- 18 024036 <213> юЛиепга в νι гиз <400> 13

адсадаадса	даддаХХХдХ	ХХадхсасХд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааххдадХдд	аддахдаада	адаХддссаХ	сддаХссХса	асХсасХсХХ	120
сдадсдхсхх	аахдааддас	аххсааадсс	ааххсдадса	дсхдааасхд	сддхдддадх	180
сххахсссаа	ХХХддХсаад	адсассдаХХ	аХсассадаа	дадддадаса	аххадасхдд	240
Хсасддаада	асхххахсхх	ххаадхаааа	дааххдахда	ХаасаХаХХа	ХХссасаааа	300
садхаахадс	хаасадсхсс	ахаахадсхд	асахддххдх	ахсаххахса	ххаххадааа	360
саххдхахда	ааХдааддаХ	дХддХХдаад	ХдХасадсад	дсадхдсХХд	хдааХХХааа	420
ахааааахсс	ХсХХдХХасХ	асХ				443

<210> 14 <211> 442 <212> ΟΝΑ <213> ТпЛиепга В νϊ гиз <400> 14 адсадаадса даддаХХХдХ ХХадхсасХд дсааасадда аааахддсдд асаахахдас 60 сасаасасаа аххдадХдда ддаХдаадаа даХддссаХс ддаХссХсаа ХХсасХсХХс 120 дадсдхсхха ахдааддаса ххсааадсса аххсдадсад схдааасхдс ддхдддадхс 180 ххахсссаах ХХддХсаада дсассдаХХа Хсассадаад адддадасаа ххадасхддх 240 сасддаадаа схххахсххх Хаадхаааад ааххдахдах аасахаххдх Хссасаааас 300 адхаахадсх аасадсхсса хаахадсхда сахддххдха хсаххахсах хаххадааас 360 аххдхахдаа ахдааддахд хддххдаадх дхасадсадд садхдсххдх дааХХХаааа 420 ХаааааХссХ сххдххасха сх 442 <210> 15 <211> 1023 <212> βΝΑ <213> тТТиепга В νΐ ги5 <400> 15 адсадаадса даддаХХХдХ ХХадХсасХд дсааасадда ааааахддсд аасаасахда 60 ссасаасаса ааХХдаддХд ддХссдддад саассааХдс сассаХааас хххдаадсад 120 дааххсхдда дхдсхахдаа аддсхххсах ддсааадаха ахдхасадда хдсаасхссх 180 дхсххдсахх дсасхаадхс ххдсасххдх сасааасадх дсассхасхх сххсдхсдас 240 ааадааааса садсхасаас хддадсаХХХ асХдсХддаХ ХХасадаХда ххххдаахдд 300 ааххаахаах хасаадаахс ссааасхсас саддахдсхс асахххаадх хххасахдсс 360 саадааддсс асадаасхда аасахсххса дхдхсхадаа даадаасхса аассхсхдда 420 ддаадхдсха аахххадсхс ааадсааааа схххсасхха адасссаддд асххаахсад 480 саахахсаас дхаахадххс хддаасхааа дддахсхдаа асаасаххса хдхдхдааха 540

ХдсХдаХдад асадсаасса ХХдХадааХХ ХсХдаасада ХддаХХассХ хххдхсааад 600

- 19 024036

сахсахсхса	асасхаасхх	дахаахасха	ассххсххсх	схххсххсхс	СХдасадХдд	660
аддаХдаада	адаХддссах	сддаХссХса	асХсасХсХХ	сдадсдхсХХ	аахдааддас	720
аххсааадсс	ааХХсдадса	дехдаааехд	еддХдддадХ	сХХаХсссаа	ХХХддХсаад	780
адсассдаХХ	аХсассадаа	дадддадаса	аХХадаеХдд	хсасддаада	асхххахсхх	840
ХХаадХаааа	дааХХдаХда	ХаасаХаХха	ххссасаааа	садхаахадс	хаасадсхсс	900
ахаахадехд	асахддххдх	ахсаххаХса	ххаххадааа	саххдхахда	аахдааддах	960
дхддххдаад	хдхасадсад	деадхдеххд	хдаахххааа	ахааааахсс	хсххдххасх	1020

асе 1023 <210> 16 <211> 1149

<212> ΡΝΑ <213> ТпПиепга в νίηΐ5
<400> 16 адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааххдаддхд	ддхссдддад	саассаахдс	сассахааас	хххдаадсад	120
дааххехдда	дхдехахдаа	аддеХХХеаХ	ддсааададс	ссххдасхас	ссхддхсаад	180
ассдссхааа	садасхааад	адааааххад	адХсаадаах	ааадасхсас	аасаааадХд	240
адссХдааад	хааааддаХд	ХсссХХдаад	ададаааадс	ааХХХааХдХ	асаддаХдса	300
асхссхдхсх	хдсаххдсас	ХаадхсХХдс	асххдхсаса	аасадхдсас	схасххсххс	360
дХсдасааад	аааасасадс	ХасаасХдда	деахххаехд	схддахгхас	адахдахххх	420
даахддаахх	аахааххаса	адаахсссаа	асхсассадд	ахдсхсасах	ххаадхххха	480
саХдсссаад	ааддссасад	аасХдаааса	ХеХХеадХдХ	сХадаадаад	аасХсааасс	540
ХсХддаддаа	дХдеХаааХХ	ХадсХсааад	сааааасХХХ	сасххаадас	ссадддасХХ	600
ааХсадсааХ	ахсаасдхаа	Хадххехдда	асхаааддда	Хсхдааасаа	саххсахдхд	660
хдаахахдех	дахдадасад	саассаХХдХ	адааХХХеХд	аасадаХдда	ХХассХХХХд	720
ХсааадсаХс	аХсХсаасас	хааеххдаха	аХасХаассХ	ХсХХсХсХХХ	сххсхссхда	780
садхддадда	гдаадаадах	ддссахсдда	хссхсаасхс	асхсххсдад	сдхсххаахд	840
ааддасаххс	ааадссаагх	сдадсадсхд	аааехдеддх	дддадхсхха	хсссаахххд	900
дхсаададса	ссдаххахса	ссадаададд	дадасаагха	дасхддхсас	ддаадааехх	960
хахсххххаа	дхаааадаах	хдахдахаас	ахаххаххсс	асаааасадх	аахадсхаас	1020
адсхссахаа	хадсхдасах	ддххдхахса	ххахсаххах	хадааасахх	дхахдааахд	1080
ааддаХдХдд	ХХдаадХдХа	садсаддсад	ХдеХХдХдаа	ХХХааааХаа	аааХссХсХХ	1140
дххасхасх						1149

<210> 17 <211> 1221 <212> ϋΝΑ

- 20 024036 <213> ШПиепга в утгиз <400> 17

адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааххдаддхд	ддхссдддад	саассаахдс	сассахааас	хххдаадсад	120
дааххсХдда	дХдсхаХдаа	аддсхххсах	ддсааададс	ссххдасхас	ссхддхсаад	180
ассдссхааа	садасхааад	адааааххад	адХсаадааХ	ааадасХсас	аасаааадХд	240
адссХдааад	ХааааддаХд	ХсссХХдаад	ададаааадс	ааххддадха	аааахдахда	300
аадхасхссх	ахххахдаах	ссдхсхдсхд	дааххдаадд	дхххдадсса	хасхдххаах	360
дхасаддахд	саасхссхдх	сххдсаххдс	асхаадхсхх	дсасххдхса	сааасадхдс	420
ассхасххсх	хсдхсдасаа	адаааасаса	дсхасаасхд	дадсахххас	хдсхддаххх	480
асадаХдаХХ	ХХдааХддаа	ХХааХааХХа	саадаахссс	ааасхсасса	ддахдсхсас	540
ахххаадххх	хасахдссса	адааддссас	адаасхдааа	сахсххсадх	дхсхадаада	600
адаасхсааа	ссхсхддадд	аадхдсхааа	хххадсхсаа	адсааааасх	ХХсасХХаад	660
асссадддас	ххаахсадса	ахахсаасдх	аахадххсхд	даасхааадд	дахсхдааас	720
аасаххсахд	хдхдаахахд	схдахдадас	адсаассахх	дхадаахххс	хдаасадахд	780
даххассххх	хдхсааадса	хсахсхсаас	асхаасххда	хаахасхаас	сххсххсхсх	840
ХХсХХсХссХ	дасадХддад	даХдаадаад	ахддссахсд	дахссхсаас	хсасхсххсд	900
адсдхсххаа	хдааддасах	Хсааадссаа	ХХсдадсадс	ХдааасХдсд	дХдддадХсХ	960
ХаХсссааХХ	ХддХсаадад	сассдаххах	сассадаада	дддадасаах	хадасхддхс	1020
асддаадаас	хххахсхххх	аадхаааада	аххдахдаха	асахаххахх	ссасааааса	1080
дхаахадсха	асадсхссах	аахадсхдас	ахддххдхах	саххахсахх	аххадаааса	1140
ххдхахдааа	хдааддахдх	ддххдаадхд	хасадсаддс	адхдсххдхд	аахххаааах	1200
аааааХссхс	ХХдххасХас	X				1221

<210> 18 <211> 1344 <212> ΟΝΑ <213> 1пПиепга в νιπίδ <400> 18

адсадаадса	даддахххдх	ххадхсасхд	дсааасадда	ааааахддсд	аасаасахда	60
ссасаасаса	ааххдаддхд	ддхссдддад	саассаахдс	сассахааас	хххдаадсад	120
дааххсХдда	дхдсхахдаа	аддсхххсах	ддсааададс	ссххдасхас	ссхддхсаад	180
ассдссхааа	садасхааад	адааааххад	адХсаадааХ	ааадасХсас	аасаааадХд	240
адссХдааад	ХааааддаХд	ХсссХХдаад	ададаааадс	ааХХддадХа	ааааХдаХда	300
аадхасхссх	ахххахдаах	ссдхсхдсхд	дааххдаадд	дхххдадсса	хасхдхахда	360
ааадххссхс	ааахадсаас	хдхасдааах	асааххддас	сдаххасссх	хсаасассад	420
ддаддхдссх	хдахдасаха	даадаадаас	сададдахдх	хдахддссса	асхдааахах	480

- 21 024036

аахдхасадд	ахдсаасхсс	хдхсххдсах	хдсасхаадх	сххдсасххд	хсасааасад	540
хдсассхасх	хсххсдхсда	сааадаааас	асадсхасаа	схддадсахх	хасхдсхдда	600
хххасадахд	аххххдаахд	дааххаахаа	ххасаадаах	сссааасхса	ссаддахдсх	660
сасахххаад	ххххасахдс	ссаадааддс	сасадаасХд	ааасаХсХХс	адХдХсХада	720
адаадаасхс	ааассхсхдд	аддаадхдсх	ааахххадсх	сааадсаааа	асхххсасхх	780
аадасссадд	дасххаахса	дсаахаХсаа	сдХааХадХХ	сХддаасХаа	адддаХсХда	840
аасаасаТТс	аХдХдХдааХ	аХдсХдаХда	дасадсаасс	аххдхадаах	ххсХдаасад	900
ахддаххасс	ххххдхсааа	дсахсахсхс	аасасХаасх	хдахаахасх	аассххсххс	960
ХСХХХсХХСХ	ссхдасадхд	даддахдаад	аадахддсса	ХсддаХссХс	аасХсасХсХ	1020
ХсдадсдХСХ	ХааХдаадда	саххсааадс	сааххсдадс	адсХдааасх	дсддХдддад	1080
хсххахссса	аХХХддХсаа	дадсассдаХ	ХаХсассада	ададддадас	ааххадасхд	1140
дХсасддаад	аасхххахсх	ХХгаадХааа	адааххдахд	ахаасахахх	аххссасааа	1200
асадхаахад	схаасадсхс	саХааХадсХ	дасаХддХХд	ХаХсаХХаХс	аХХаХХадаа	1260
асаХХдХаХд	аааХдаадда	ХдХддХХдаа	дХдХасадса	ддсадхдсхх	дхдаахххаа	1320
ааХаааааХс	сХсХХдХХас	хасх				1344

Claims (14)

1. Рекомбинантный ген М вируса гриппа В (РНК-сегмент 7), кодирующий белок М1, который включает замену по меньшей мере одного нуклеотида в триплете 280-282, которая приводит к замене метионина в положении 86 последовательности белка М1 на валин, где указанная замена в гене М обусловливает увеличенную скорость роста вирусов гриппа В, имеющих укороченные белки N81 и предназначенных для производства вакцин.

2. Ген М вируса гриппа В (РНК-сегмент 7) по п.1, включающий нуклеотиды ОТО, ОТА, ОТО, ОТТ, сие, ОИА, Оис, Оии в положениях 280-282.

3. Рекомбинантный вирус гриппа В, включающий белок М1, кодируемый геном по п.1.

4. Вирус гриппа В по п.3, где указанный вирус является реассортантным вирусом.

5. Вирус гриппа В по любому из пп.3 или 4, где вирус является аттенуированным или дефектным по репликации, предпочтительно полностью дефектным по репликации.

6. Вирус гриппа В по любому из пп.3-5, включающий модифицированный ген N81 (РНК-сегмент 8), кодирующий белок N81, утративший функциональный РНК-связывающий домен и функциональный С-концевой домен.

7. Вирус гриппа В по любому из пп.3-6, включающий молчащую мутацию в положении 950 нуклеотидной последовательности гена М (РНК-сегмента 7).

8. Вирус гриппа В по любому из пп.3-7, включающий гетерологичную последовательность, кодирующую хемокины, цитокины или их производные или фрагменты, вставленную между донорным сайтом сплайсинга и акцепторным сайтом сплайсинга гена N81 (РНК-сегмента 8).

9. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 3, 4, 7-12 или 15.

10. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий любую нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 6 или 16-18.

11. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий полипептид с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0:1 или ее производной, идентичной по меньшей мере на 98%.

12. Вирус гриппа В по любому из пп.3-8, включающий полипептид с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 2 или ее производной, идентичной по меньшей мере на 98%.

13. Вакцинная композиция для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа В, включающая иммуногенно индуцирующее эффективное количество вируса по любому из пп.3-12 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

14. Применение вируса гриппа В по любому из пп.3-12 для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции вируса гриппа В.

- 22 024036

Фиг. 1А

Фиг. 1Β

1000 Ьр

ЭООЬр

ВООЬр

700Ьр бООЬр

500Ьр

400Ьр

М N81-14 N51-38 N51-57 N51-80 N51Моек

Фиг. 2

- 23 024036

Фиг. 3В

РОСТ МУТАНТОВ Β/ΜΑΙΑΥ5ΙΑ N51 СПУСТЯ б ДНЕЙ ПОСЛЕ ТРАНСФЕКЦИИ (ЛИНИЯ В/УатадаХа/16/88)

10’1

ΔΝ51-38 ΔΝ51-80 ΔΝ51-νΛ

Фиг. 4А

РОСТ МУТАНТОВ В/ГШРЮА N51 СПУСТЯ 5 ДНЕЙ ПОСЛЕ ТРАНСФЕКЦИИ (ЛИНИЯ В/Уатада1а/16/88)

ΔΝ51-Β N51-38 N51-80 Ν51-ν4

Фиг. 4В

Фиг. 5

- 24 024036

Μ5Ι_ΡΟϋΤΙΑΥΙ-Ι_5Ι_ΤΕΟΟΕΟΚΑΕΙ-ΑΕΚ[-ΗθννΡΘΟΚΕΕΟΙ-ΟδΑΙ„ΕννΐΚΝΚΡΟΙΤΟΐαΚΑΙ-Ι СА31СЕ1_КРК00ЕРКРРЕ1ТЕР1-30УСТТАТКККС1Л-АЕРКМКРС\/5РНЕАЕЕ!АЕСНЕ 33ΑΕΙΥΟίΜνΜΥΕΝΡΘΝΥ3ΜθνΚίΟΤΙΟΑΙΟΕΚΟΑδΗ8ΚΡΑΗδΡΑΑΚ33νΡ6νΡΡΕΜ ΟΜνδΑΜΝΤΑΚΤΜΝΘΜΟΚΟΕΟνΟΚΙΑΕΕίΟδΝΙΟνίΡδίΟΑδΟΚΝΟΕΟΙΑΚΟνΜΕνίΚ 033Μ0Ν5ΑίνΚΚΥΙ_. {3ΕΟ ΙΟ. Νο 1)

Фиг. 7А

ΜδίΡΟΟΤΙΑΥίίδίΤΕΟΘΕΘΚΑΕίΑΕΚΙ-ΗΟννΡΘΟΚΕΡΟΙ-ΟδΑΙ-ΕννίΚΝΚΡίΟΙ-ΤΟΙΟΚΑυ еА31СРЕКРКООЕККРРР1ТЕРЬ56У6ТТАТКККеи1АЕККМККСУЗЕНЕАРЕ1АЕеНЕ 53ΑίΙ-ΥΟΙΐν,νΜΥ!-ΝΡ<3ΝΥ3ΜΟ\/Κυ3ΤΙ_€ΑΙ_ΟΕΚΟΑ5Η8ΗΡ!ΑΗ3ΡΑΑΒ35νΡ<3\/ΡΡίΕΜ 0Μν3ΑΜΝΤΑΚΤΜΝ0ΜΘΚΟΕ0ν0ΚίΑΕΕΙΟ3ΝΙΘνίΡ3ί6Α3ΟΚΝΟΕΘΙΑΚ0νΜΕνίΚ Ο35ΜΘΝ3Αί.νΚΚΥΙ_ (ЗЕО Ю. Νο 2)

Фиг. 7В

- 25 024036

Вирус Базовая основа Поверхностные гликопротеины НА И ΝΑ М N5 ΤΕιϋΓ-ΔΝ51-14 М1М86У+С950Т 6:2 ВЛДеппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т ΔΝ31-14 ΤήϋΓ-ΔΝ51-38 М1М86У 6:2 В/УЕеппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У ΔΝ51-38 ΤήϋΓ-ΔΝ31-38 М1М86У+С950Т 6:2 ВЛ/Ееппа/33/06 В/Тй11ппдеп/О2/О6 М1-М86У +С950Т ΔΝ51-38 ΤήϋΓ-ΔΝ31-57 М1М86У+С950Т 6:2 В/УЕеппа/33/06 В/ТЬйппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т ΔΝ31-57 ΤΗϋΓ-ΔΝ31-64 М1М86У+С950Т 6:2 ВЛ/1еппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т ΔΝ51-64 ΤΗϋΓ-ΔΝ31-80 Μ1ννΐ 6:2 ВЛ/Ееппа/33/06 В/ТЬйппдеп/02/06 М1-М ΔΝ31-80 ΤΚϋΓ-ΔΝ31-80 Μ1М86У 6:2 ВЛ/|еппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У ΔΝ31-80 ΤΤιϋΓ-ΔΝ51-80 Μ1С950Т 6:2 В/УЕеппа/33/06 В/ТЬилпдеп/02/06 М1-С950Т ΔΝ31-80 ΤΚϋΓ-ΔΝ31-80 Μ1М86У+С950Т 6:2 ВЛ/Ееппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т ΔΝ51-80 ΤΗΰΓ-Ν5-1ννΙ Μ1-νν4 6:2 ВЛ/Ееппа/33/06 Β/ΤΐΊϋπηρθη/02/06 Μ1-ννΐ N51 ννΐ ΤΚϋΓ-Ν31ννΙ Μ1М86У 6:2 В/УЕеппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У N31 Μ ΤίιϋΓ-Ν31-νΛΜ1С950Т 6:2 ВЛ/Ееппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-С950Т N31-νΛ ΤίιϋΓ-Ν51-«Λ Μ1М86У+С950Т 6:2 ВЛ/|еппа/33/06 В/ТЬиппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т N31- Μ Р1опба_М51-38 М1и4 В/ТЬиппдеп/02/ 06 В/Р1опба/04/06 М1-УЙ N51-38 В/Р1оп8аДЧ51-80 М1\лй В/ТЬиппдеп/02/ 06 В/РЕопба/04/06 Μ1-ννΙ N51-80 Β/ΡΙοη6θ_Ν51-ννί Μ1 \νί В/ТЬйппдеп/02/ 06 В/РЕопба/04/06 Μ1-νν( Ν51-νν1 В/РЕогШ 6βΙΝ5 Μ1 М86У В/ТЬиппдеп/02/ 06 В/Р1огЕба/04/06 М1-М86У ΔΝ51 В/Р1опба N51-38 М1М86У В/ТЬйппдеп/02/ 06 В/РЕогЕба/04/06 М1-М86У N51-38 В/Аопба N51-80 М1М86У В/ТЬиппдеп/02/ 06 В/РЕогЕба/04/06 М1-М86У N51-80 В/Р1опба N31 -Μ М1М86У В/ТЬйппдеп/02/ 06 В/Р1опба/04/06 М1-М86У N51 -νΛ

Фиг. 8А

А0СА6ААССАС6САСТТТСТТАААа1д(сдс(дй1ддадасасаайдсс1асс1дс1йсайдасадаад а1ддадааддсааадсадаас1адсадааааайасас!:дйддй1:дд(:дддааадаай1:дасс1адас1с1дссйдд аа1дда1аааааасаааада!дсйаас1да1а1:асааааадсас1аайдд1дсс1с1а1а1дсйШаааасссааада ссаддааадааааадаадайса1сасададоссйа(саддаС{дддаасаасадсаасаааааадаааддсс1 дайс1ддс1дададааааа1дадаада1д1д1дадсй1са1даадсай1дааа1адсадааддсса1дааадс1сад сдс1ас1а1ас1д1с1са(дд1са1д1асс1даа1сс1ддааайайсаа1дсаад1аааас(аддаасдс1с1д1дсй1а(д сдадааасаадса1сасайсасасадддс1са1адсададсадсдада(сйсад(дсс1ддад1дадасдадааа1 дсада1дд1с1садс1а1даасасадсааааасаа1даа1ддаа1дддааааддадаадасд1ссаааадйддсад аададс1дсааадсаасайддад(дс1дада(с1сйддддсаад1саааадаа(ддддаадддайдсааадда(д

1аа1ддаад1дс1:ааадсададс{сса1дддааайсадс(сйд1даадааа(а1с1а(аа1дс(сдаассай(садайс й1саай1дйсйНа1:сйа1садскЛссай1са1ддсйддасаа1адддсай1даа1:сааа1ааааададдаа1аааса (даааа1асдаа1аааадд1ссааасааададасаа1ааасадададд1а1сааййдадасасадйассааааад ааа£ссаддссааадааасаа(дааддаад1ас1с(с(дасааса(ддадд(айдад1дассаса(аа{аайдаддд дсй1с1дссдаадада1аа(ааааа1ддд1дааасадййддада1адаадаайдсайааАТТСААТТТТАСТ еТАТТТСТТАСТАТССАТТТААССАААТТбТААТСААТеТСАеСАААТАААСТеОААА

ААбТеСбТТСТТТСТАСТ (5ЕО ГО. Νο 3)

Фиг. 8В

- 26 024036

А6САОААССАСССАСТТТСТТАААа1д1сдс1дй1ддадасасааНдсс1асс1дс1Ксайдасадаад а1ддадааддсааадсадаас(адсадаааааНасас1дйдд1Ндд(дддааадааН1дасс{адас{с1дссйдд аа1дда(аааааасаааада1дсПаас1даЬа1асааааадсас1ааНдд1дсс1с1а1а1дсйН(аааасссааада ссаддааадааааадаадайса1сасададсссйа1саддаС1дддаасаасадсаасаааааадаааддсс1 дайс(ддс(дададааааа1дадаада1д(д1дадсй(са1даадсаШдааа1адсадааддсса1дааадс(сад сдс1ас1а1ас1д1с»са1дд1са1д1асс1даа(сс4ддааайайсаа1дсаад1аааас1аддаасдс1скд1дсй1акд сдадааасаадса1сасайсасасадддс1са1адсададсадодада1сйсад1дсс!ддад1дадасдадааа1 дсада1ддШ1садс{а1даасасадсааааасаа1даа4ддаа(дддааааддадаадасдЛсаааадИддсад аададс1дсааадсаасайддадкдс1дада1с(сйддддсаад1саааадаа1ддддаадддаНдсааадда1:д

1аа1ддаад1дйааадсададс1сса(дддааайсадс1сйд{даадааа1а1с1а1аа1дс1сдаасса1йсадайс

ШсааЛдйсййа{сйа(садс1с(ссаШса1ддсйддасаа1адддсаШдаа1сааа1ааааададдаа(аааса

1даааа1асдаа1аааадд1ссааасааададасаа1ааасадададдЫсааЙйдадасасадЙаТсааааа дааа4ссаддссааадааасаа1дааддаад1ас1сйЛдасааса1ддадд1айдад1дассаса1аа1аайдадд ддсй!с(:дссдаадада1аа1ааааа1ддд1дааасад(й(ддада(адаадаайдсайааАТТСААТТТТАС

ТеТАТТГСПАСТАТеСАТТТААССАААТТСТААТСААТСТСАеСАААТАААСТСбАА

АААСТесеТТСТТТСТАСТ (ЗЕО ГО Νο. 4)

Фиг. 8С

АССАеААеСАСОСАСТТТСТТААААТеТСеСТСТТТеСАбАСАСААТТСССТАССТ

ССТТТСАТТСАСАОААОАТОСАОААОССАААССАОААСТАССАСАААААТТАСАСТ

ОТТООТТСССТСООАААОААТТТСАССТАСАСТСТСССТТССААТССАТААААААС

ААААОАТОСТТААСТОАТАТАСАОАААССАСТААТТССТСССТСТАТСТОСТТТТТАА

ААСССАААСАССАССАААСАААААСААСАТТСАТСАСАСАОССССТАТСАСОААТС

СОААСААСАОСААСААААААОААООСССТОАТТСТАОСТСЗАбАОАААААТСАСААА

АТОТСТСАССТТССАТОААбСАТТТСАААТАСЗСАСААССССАТСАААССТСАСССТ

ТАСТАТАТТеТСТСАТССТСАТбТАССТбААТССТебАААТТАГГСААТеСААОТААА

АСТАССААСССТСТСТОСТТТОТСССАААААСААОСАТСАСАТТСАСАСАССССТС

АТАССАСА6СА6С6А6АТСТТСА6ТСССС0еАСТеАеАСееСАААТеСАеАТ66Т

СТСАОСТАТОААСАСАОСАААААСААТСААТССААТСССААААС6АСААСАССТСС

АААААСТСССАОААОААСТССАААеСААСАТТ(3(ЗА(ЗТАТТСА6АТСТСТТССеОСА

АСТСААААСААТСССОААССААТТССАААСОАТСТААТСОААСТССТАААОСАСАС

СТСТАТСебАААТТСАССТСТТетеААОАААТАССТАТААТеСТСОААССАТТТСАО

АТТСТТТСААТТТСТТСТТТТАТТТТАТСАССТСТССАТТТСАТ60СТТ66АСААТАС

САСАТТТАААТСАААТАААААСАССАСТАААСАТСААААТАСОААТАААССССССАА

АТАААОАСАСААТАААСАОАСА6ОТАТСААТТТТОАСАСАСАСТТАССАААААСААА

ТССАСССТАААСААССААТСААООААОТАСТСТСТСАСААСАТООАСОТАТТОАОТ

ОАССАСАТАбТААТТСАСССОСТТТСТССТОААСАОАТААТАААААТббОТОАААС

АеТТТТССАССТАСААбААТТТСАТТАААТТСААТТТТТАСТСТАСТТСТТАСТАТес

АТТТААеСАААТТеТААТСААТбТСАССАААТАААСТееАААААетесеТТОТТТСТА

СТ (ЗЕО ГО Νο. 5)

Фиг. 8Ό

АеСАСААвСАСеСАСТТТСТТААААТеТСССТСТТТССАСАСАСААТТСССТАССТ

ССТТТСАТТ6АСА6ААСАТССАСААСССАААССАСААСТАССАСАААААТТАСАСТ бТТббТТСебТбебАААбААТТТбАССТАбАСТСТбССТТбеААТбСАТААААААС

ААААОАТеСТТААСТбАТАТАСАОАААССАСТААТТООТОССТСТАТСТССТТТТТАА

ААСССАААСАССАСОАААСАААААСААОАТТСАТСАСАСАбССССТАТСАССАдТб (ЗОААСААСАССААСААААААСААСССССТСАТТСТАОСТСАСАСАААААТСАСААА

АТСТСТСАССТТССАТСААССАТТТеАААТАеСАСААбСССАТСАААССТСАССеТ

ТАСТАТАТТСТСТСАТООТСАТОТАССТСААТССТССАААТТАТТСААТССААСТААА

АСТАОСААСССТСТОТССТТТСТСССАААААСААССАТСАСАТТСАСАСАССеСТС

АТАесАбАесАбсеАеАтсттсАетбсссееАбтеАОАсеесАААтесАСАтеет

СТСА6СТАТСААСАСАССАААААСААТ6ААТССААТСССААААССАСАА6АССТСС

АААААСТОССАОААСААСТбСАААССААСАТТССАСТАТТСАСАТСТСТТСССССА

АеТСААААОААТеСеОААОеААТТОСАААООАТОТААТббААОТбСТАААССАОАО

СТСТАТОООАААТТСАССТСТТСТОААСАААТАССТАТААТССТСОААССАТТТСАС

АТТСТТТСААТТТеТТСТТТТАТТТТАТСАбСТСТССАТТТСАТеССТТеСАСААТАО еАСАТТТАААТСАААТАААААСАбОАСТАААСАТеААААТАССААТАААОбСеССАА

АТАААСАСАСААТАААСАСАеАССТАТСААТТТТСАОАСАСАСТТАССАААААОААА

ТССА6ССТАААСААССААТСААССАА0ТАСТСТСТСАСААСАТ6САССТАТТ6АСТ

САССАСАТАСТААТТСАСССССТТТСТССТСААСАСАТААТАААААТесеТСАААС

АОТТГГОСАООТАСААОААТТТСАТТАААТТСААТТТТТАСТСТАСТТСТТАСТАТОС

АТТТААбСАААТТбТААТСААТеТСАеСАААТАААСТеСАААААСТСССТТеТТТСТА

СТ (5Е<Э ГО Νο. 6)

Фиг. 8Е

- 27 024036

А6САОААССАС<ЗСАСТТТСТТАААа1д1сдс1д1йддадасасаайдсс1асс1дсй1сайдасадаад а1ддадааддсааадсадаас1адсадааааайасас1дйдд(:йдд1:дддааадаай1дасс1адас1с1дссйдд аа1дда(аааааасаааада(дсйаас(да1а1асааааадсас1аайдд{дсс(с1а(а(дс(ййаааасссааада ссаддааадааааадаадайса!сасададсссйа1саддаа1дддаасаасадсаасаааааадаааддсс1 дайс1ддс1дададааааа{дадаада{д1д1дадсй1са1даадсай1дааа1адсадааддсса1дааадс1сад сдс1ас(а1ас1д(с1са1дд1са1д1асс1даа1сс(ддааайайсаа(дсаад1аааас1аддаасдс1:с1д1дсм(а1д сдадааасаадса1сасайсасасадддс1са1адсададсадсдада1сйсад1дсс1ддад1дадасдадааа1:

дсада1дд1с1садс!а1даасасадсааааасаа1даа1ддаа1дддааааддадаадасд1ссаааадйддсад аададс1дсааадсаасайддад1дс1дада1с1сйддддсаад1саааадаа1ддддаадддайдсааадда1д

1аа1ддаад1дс1ааадсададс1сса1дддааайсадс1сйд1даадааа1а1с1а1аа1дс1сдаассай1:садаКс

Й1сааШдЙсййа1сМа1садс1с1ссаЙ1са1ддсНддасаа1адддсай1даа(сааа1ааааададдаа1аааса

1даааа1асдаа1аааадд1ссааасааададасаа1ааасадададд1а1сааййдадасасадйаТсааааа даааГссаддссааадааасаа1дааддаад(ас1с1с1дасааса1ддадд(айдад1дассаса1аа1аайдадд ддсйййдссдаадада(аа1ааааа(ддд1дааасадййддада1адаадааЙдса{(ааАТТСААТТТТАС

ТОТАТТТСТТАСТАТОСАТТТААССАААТТОТААТСААТОТСАОСАААТАААСТООАА

АААеТбССТТеТТТСТАСТ (ЗЕО Го Νο. 7)

Фиг. 8Р адсадаадсададдай1дИад1сас1ддсааасаддаааааАТесС0ААСААСАТСАССАСААСА

САААТТ6А66Т666ТССО1да1даСССААТ6ОАТАСААОТССТТАТСААСТСТ6САТА

САТТСААТССАТАТСАССАСАеТСеААееСТТСТТССТАААСТТеТТеССАСТСАТ

ОАТСТТАСАОТООАООАТОААОААОАТеОССАТСОбАТССТСААСТСАСТСТТСОА еССТСТТААТеААСОАСАТТСАААСССААТТСеАССАОСТОАААСТССОСТСООА

ОТСТТАТСССААТТТСОТСАА6АССАСССАТТАТСАССАСААСАООСАСАСААТТА бАСТООТСАСООААОААСТТТАТСТТТТААОТААААСААТТСАТОАТААСАТАТТАТТ

ССАСААААСАСТААТАОСТААСАССТССАТААТАССТеАСАТеСТТбТАТСАТТАТС

АТТАТТАОАААСАТТОТАТОАААТСААООАТСТССТТСААСТСТАСАССАСОСАСТ

0СТТ0Т<ЗАай1аааа1ааааа1сс1сйдйас(ас1 (ЗЕО ГО Νο. 8)

Фиг. 8С адсадаадсададдаШдШад(сас1ддсааасаддаааааАТССС6ААСААСАТСАССАСААСА

САААТТСАеОТеООТССебОАССААССААТеССАССАТАААСТТТеААеСАееААТ

ТСТССАСТССТАТСААА00СТТТСАТ00САААСА1да1даСССААТССАТАСАА0ТСС

ТТАТСААСТСТССАТАСАТТСААТССАТАТСАССАСАСТССААСССТТСТТбСТААА

СТТеТТОССАСТСАТеАТСТТАСАСТСеАСОАТСААбААеАТССССАТСССАТССТ

СААСТСАСТСТТССАССОТСТТААТеААССАСАТТСАААСССААТТССАССАОСТС

АААСтесеетеееАетсггАтсссААТттеетсААСАесАсссАТТАТСАССАОАА

6АСС6А6АСААТТАОАСТС36ТСАСООААОААСТТТАТСТТТТАА6ТААААСААТТОА

ТОАТААСАТАТТАТТССАСААААСАСТААТАССТААСАОСТССАТААТАССТСАСАТ

00ТТСТАТСАТТАТСАТТАТТА0АААСАТТСТАТ6АААТ0ААССАТСТ6СТТ0ААСТ

ОТАСАОСАСОСАСТ6СТТСТОАа1йаааа1ааааа1сс1сйдйас1ас1 (ЗЕС! ГО Νο. 9)

Фиг. 8Н адсадаадсададда1йдй1ад1:сас1ддсааасаддаааааАТООСОААСААСАТОАССАСААСА

САААТТОАООТООСТСССбСАеСААССААТОССАССАТАААСТТТОААССАССААТ

ТСТООАОТОСТАТОАААООСТТТСАТСОСАААОАССССТТОАСТАСССТОСТСААС

АСССССТАААСАСАСТААА0А0ААААТТА0А0ТСА(да1даСССААТС0АТАСААСТС

СТТАТСААСТСТОСАТАОАТТСААТОСАТАТОАССАОАСТееААСОСТТСТТОСТАА

АСГГОТТеССАСТбАТСАТСТТАСАОТООАОСАТСААОААОАТОСССАТСССАТСС

ТСААСТСАСТСТТССАСССТСТТААТСААООАСАТТСАААОССААТТССАОСАОСТ

САААСТССССТСееАбТСТТАТСССААТТТееТСААеАеСАССаАТТАТСАССАСА

АОАОООАОАСААТТАОАСТСОТСАСОСААОААСТТТАТСТТТТААОТААААСААТТО

АТ6АТААСАТАТТАТТССАСААААСА0ТААТАССТААСА0СТССАТААТА0СТСАСАТ

ООТТОТАТСАТТАТСАТТАТТАОАААСАТТОТАТСАААТСААССАТСТССТТСААСТ

СТАСА0САСССАСТССТТСТСАаЙ1аааа1ааааа1сс1:сНдЙас1ас1 (ЗЕО ГО Νο. 10)

Фиг. 81

- 28 024036 адсадаадсададдаЙ1д1Над1сас1ддсааасаддаааааАТССССААСААСАТСАССАСААСА

САААТТСАСеТСССТСССССАССААССААТеССАССАТАААСТТТеААССАСеААТ

ТСТССАСТеСТАТСАААеОСТТТСАТООСАААОАбСССТТОАСТАСССТСеТСААС

АСССССТАААСАОАСТАААСАОААААТТАСАСТСААСААТАААСАСТСАСААСААА1 да1даСССААТССАТАСААСТССТТАТСААСТСТССАТАСАТТСААТССАТАТСАССА

САСтееААсесттеттсстАААСттеттессАстоАТСАТсттАСАетесА(зеАте

ААСААСАТССССАТСССАТССТСААСТСАСТСТТССАСССТСТТААТСААССАСАТ

ТСАААбССААТТСОАССАОСТеАААСТесеСТеееАОТСТТАТСССААТТТееТСА

АСАССАСССАТТАТСАССАСААСАСССАСАСААТТАСАСТССТСАСССААСААСТТ

ТАТСТТТТААСТААААСААТТСАТСАТААСАТАТТАТТССАСААААСАСТААТАССТА

АСАССТССАТААТАССТСАСАТССТТСТАТСАТТАТСАТТАТТАСАААСАТТСТАТСА

ААТ СААСОАТ СТ ССТТСААОТСТАСАОСАСССАСТССТТ СТО АаШаааа1ааааа(сс1с1

1дйас1аШ (ЗЕО ГО Νο. 11)

Фиг. 81 адсадаадсададдай1дШад1сас1ддсааасаддаааааАТССССААСААСАТСАССАСААСА

САААГГСАСеТееСТССеССАОСААССААТеССАССАТАААСТТТСААССАеСААТ

ТСТССАСТССТАТСАААСССТТТСАТСССАААСАССССТТСАСТАСССТССТСААС

АСССССТАААСАСАСТАААСАСААААТТАСАСТСААСААТАААСАСТСАСААСАААА

СТСАСССТСАААСТААААССАТСТСССТТСААСАСАСААААССААТТ1да(даСССАА

ТСеАТАСААеТССТТАТСААСТСТеСАТАСАТТСААТеСАТАТСАССАСАСТеСААе

ССТТСТТеСТАААСТТеТТеССАСТеАТСАТСТТАСАСТееАССАТСААеААСАТС

СССАТСССАТССТСААСТСАСТСТТССАСССТСТТААТСААОСАСАТТСАААСССА

АТТССАССАССТСАААСТССССТССОАСТСТТАТСССААТТТеСТСААОАОСАССС

АТТАТСАССАОААОАСОСАСАСААТТАСАСТССТСАСССААСААСТТТАТСТТТТАА

СТААААСААТТСАТСАТААСАТАТТАТТССАСААААСАСТААТАОСТААСАССТССАТ

ААТАССТСАСАТОСТТОТАТСАТТАТСАТТАТТАСАААСАТТСТАТСАААТСААССАТ

СТ6СТТ0ААСТеТАСАССАСССАСТеСТТСТСАаН1аааа1ааааа1сс1сйд«ас1ас1 (ЗЕО

ΙϋΝο. 12)

Фиг. 8К

АССАСААССАСАС6АТТТСТТТА6ТСАСТСССАААСАССААААААТССССААСААС

АТСАССАСААСАСАААТТСАСТССАССАТСААСААСАТССССАТСССАТССТСААС

ТСАСТСТТССАСССТСТТААТСААССАСАТТСАААСССААТТССАССАССТСАААС

ТСССбТееСАеТСТТАТСССААТТТСеТСААСАССАСССАТТАТСАССАСААСАСб

ОАОАСААИадАСТООТСАСООААОААСТТТАТСТТТТААОТААААОААТТОАТСАТА

АСАТАТТАТТССАСААААСАСТААТАССТААСАССТССАТААТАССТСАСАТССТТО

ТАТСАТТАТСАТТАТТАСАААСАТТСТАТСАААТСААССАТСТССТТСААСТСТАСА

ССАСССАСТССТТСТСААТТТААААТАААААТССТСТТСТТАСТАСТ (ЗЕО ГО Νο.

13)

Фиг. 8Ь

АССАСААССАСАССАТТТСТТТАСТСАСТ6ССАААСАССАААААТ6ССССАСААТА

ТСАССАСААСАСАААТТСАСТССАССАТСААСААСАТССССАТСССАТССТСААТТ

САСТСТТССАСССТСТТААТСААССАСАТТСАААСССААТТССАССАССТСАААСТ

ССССТСССАСТСТТАТСССААТТТСеТСААСАССАСССАТТАТСАССАСААСАСС

САСАСААТТАСАСТССТСАСССААСААСТТГАТСТТТТААСТААААСААТТеАТСАТ

ААСАТАТТСТТССАСААААСАСТААТАССТААСАССТССАТААТАССТСАСАТССТТ

СТАТСАТТАТСАТТАТТАСАААСАТТСТАТСАААТСААОСАТОТССТТСААСТОТАС

АеСАСССАбТССТТСТСААТТТААААТАААААТССТСТТеТТАСТАСТ (ЗЕО ГО Νο.

14)

Фиг. 8М

- 29 024036

Вирус Базовая основа Поверхностные гликопротеины НА и НА М N5 ΤήϋΓ-Ν81 -38815111_2 М1- М86У+С950Т 6:2 ВЛАеппа/33/06 В/Тпилпдеп/02/06 М1-М86У/ +С950Т N81- 385151- ΙΙ 2 ΤΚϋΓ-Ν51-805151|1_2 М1- М86У+С950Т 6:2 ВЛАеппа/33/06 В/ТНйппдеп/02/06 М1-М86Х/ +С950Т N51- 805151- 11.2 ΤΙιϋΓ-Νδ1-1045151И2М1- М86\/+С950Т 6:2 ВЛАеппа/33/06 В/Тпиппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т N51104515111 2 ТЬиг-Νδ1-14551511Ι.2Μ1- М86У+С950Т 6:2 ВЛАеппа/33/06 В/ТИиппдеп/02/06 М1-М86У +С950Т N51145515111 2

Фиг. 9В адсадаадсададдай1дК1ад1сас1ддсааасаддаааааАТ56ССААСААСАТ6АССАСААСА

САААТТСАСОТОСОТСССССАССААССААТОССАССАТАААСТТТОААССАССААТ

ТСТСвАОТССТАТОАААС<ЗСТТТСАТ<ЗССАААОА1аа1д1асадда1дсаас1сс1д1сЙдсайдс ас1аад1сйдсаскд1сасааасад1дсасс1асйсйсд1сдасааздаааасасадс1асаас1ддадса1йас1д с1ддай1асада1даййдаа1ддаайаа1аайасаадаа1сссааас1сассадда1дс1сасай1аадййаса1дс ссаадааддссасадаас1даааса1сйсад1д1с1адаадаадаас1сааасс1с1ддаддаад1дс1ааа1йадс1 сааадсааааасй1сасйаадасссадддасйаа1садсаа1а1саасд1аа1ад11с1ддаас1аааддда1с1даа асаасайса1д1д1даа1а1дс1да1дадасадсаассайд1адаай1йдаасада1ддайассййд1сааадса1с а1с1саасас1аасйда1ааТАСТААССТТСТТСТСТТТСТТСТССТСАСАС1ддАССАТ<ЗААС

ААСЗАТеСССАТСССАТССТСААСТСАСТСТТСОАОССТСТТААТСААССАСАТТСА

ААЗССААТТСОАССАОСТСАААСТеСбСТбССАеТСТТАТСССААТТТСОТСААСА

ССАССОАТТАТСАССАСААОАССОАСАСААТТАСАСТОСТСАСССААСААСТТТАТ

СТТТТААбТААААСААТТОАТСАТААСАТАТТАТТССАСААААСАСТААТАССТААСА

ОСТССАТААТАССТОАСАТСбТТОТАТСАТТАТСАТТАТТАбАААСАТТОТАТОАААТ

СААССАТСТ60ТТСААСТ6ТАСАССАСССАСТОСГТОТОАай1аааа1ааааа1сс1сИдйа с1ас1 (8ЕО Ю Να. 15)

Фиг. 9С

- 30 024036 адсадаадсададдай1дй1ад1сас1ддсааасаддаааааАТЗЗСеААСААСАТСАССАСААСА

САААТТСАЗЗТЗбОТССЗЗОАЗСААССААТЗССАССАТАААСТТТЗААЗСАССААТ

ТСТебАСТССТАТбАААСОСТТТСАТСССАААСАССССТТеАСТАСССТСОТСААС

АССЗССТАААСАСАСТАААОАЗААААТТАСАЗТСААОААТАААСАСТСАСААСАААА

СТ0АСССТ0ААА0ТААААСбАТЗТСССТТСААСАСАСАААА0СААТТ1аа1д1асадда1 дсаас1сс{д1сйдсайдсас1аадй;йдсасйд1сасааасад1дсасс1асйсйсд1сдасааадаааасасадс

1асаас1ддадсаШас1дс1ддай1асада1даййдаа{ддаайаа1ааНасаадаа1сссааас4сассадда1д с1сасай1аадййаса1дсссаадааддссасадаас1даааса1сйсад1д1с1адаадаадаасйсааассйДд даддаад1дс1ааа1Йадс1сааадсааааасШсасйаадасссадддасЙаа1садсаа1а1саасд1аа1адйс

1ддаагёаааддда£с1дааасаасайса1д1:д1даа1а1дс1:да1дадасадсаассаНд1адаа1Кс1даасада1д дайассййд(сааадса1са1с1саасас1засйда1ааТАСТААССТТСТТСТСТТТСТТСТССТСА

САС1ддАССЗАТОАА5ААСАТ6СССАТСССАТССТСААСТСАСТСТТССАОССТСТТА

АТЗААЗЗАСАТТСАААЗССААТТССАССАЗСТЗАААСТССЗЗТЗСЗАЗТСТТАТСС

СААТТТССТСААСАОСАСССАТТАТСАССАОААСАЗССАСАСААТТАСАСТСОТСА

ССЗААЗААСТТТАТСТТТТААОТААААОААТТСАТСАТААСАТАТТАТТССАСААААС

АСТААТАОСТААСАЗСТССАТААТАССТСАСАТСЗТТСТАТСАТТАТСАТТАТТАСАА

АСАТТеТАТеАААТ0АА00АТ0ТСапеАА6ТЗТАСАЗСАС0СА0Т0СТТ0Т<ЗАаЙ1 аааа1ааааа(сс1сйдйас1ас{ ($Е<3 ГО Νο. 16)

Фиг. 9Ό адсадаадсададдаИд1Пад1сас1ддсааасаддаааааАТ<ЗОССААСААСАТ<ЗАССАСААСА

САААТТОАСОТСООТССОСОАССААССААТОССАССАТАААСТТТОААССАСОААТ

ТСТСбАСТССТАТСАААСесТТТСАТЗЗСАААСАЗСССТТЗАСТАСССТЗЗТСААС

АССЗССТАААСАСАСТАААОАСААААТТАСАОТСААЗААТАААОАСТСАСААСАААА

ОТЗАОССТСАААЗТААААСОАТЗТСССТТСААСАСАСААААЗСААТТССАСТАААА

АТСАТОАААЗТАСТССТАТТТАТОААТСССТСТОСТССААТТЗААЗеЗТТТСАЗССА

ТАСТЗТШа1д1асадда1дсаас1сс1д1сЙдсайдсас1аад1с№дсасНд1сасааасад1дсасс1асйсЙсд

1сдасааадгааасасадс1асаас1ддадса1йайдс(дда1йасада1даййдаа{ддаайаа1аайасаада а1сссааас1сассадда{дс1саса{йаадййаса1дсссаадааддссасадаас(даааса1:сйсад{д1йада адаадаас1сааассййддаддаад1дс1аааШадс1сааадсааааасй1сасйаадасссадддасйаай;а дсаа1а1саасд1аа1адйс1ддаас1аааддда1с{дааасаасайса1д1д1даа1а1дс1да1дадасадсаасса йд(адаа{ййдаасада1ддаЙассййд1сааадса1са1с1саасас1аасйда1ааТАСТААССТТСТТС

ТСТТТСТТСТССТСАСАО1ддА6САТСАА6АА6АТССССАТССЗАТССТСААСТСАС

ТСТТССАОСЗТСТТААТСААСОАСАТТСАААЗССААТТССАОСАССТЗАААСТССО еТЗЗЗАЗТСТТАТСССААТТТеЗТСААСАССАССЗАТТАТСАССАСААСАСЗСАСА

СААТТАСАСТССТСАСССААСМСТТТАТСТГТТААСТААААЗААТТеАТСАТААСАТ

АТТАТТССАСААААСАСТААТАССТААСАССТССАТААТАССТЗАСАТСЗТТСТАТС

АТТАТСАТТАТТАСАААСАТТСТАТСАААТЗААеСАТОТССТТСААСТЗТАСАССАС

ОСАСТССТТОТСАаМаааа1ааааа1сс1сйдйас1асЦ5Е(2 Ю Νο. 17)

Фиг. 9Е адсадаадсададдаН1дШад1:сас1ддсааасаддаааааАТС<ЗССААСААСАТ(ЗАССАСААСА

САААТТСАССТОССТССОССАОСААССААТОССАССАТАААСТТТСААССАССААТ

ТСТСОАвТбСТАТСАААСССТТТСАТСССАААОАССССТТеАСТАСССТеСТСААС

АСС6ССТАААСА6АСТААА0А6ААААТТАСАСТСАА6ААТААА6АСТСАСААСАААА

0ТСА6ССТСАААСТААААС6АТСЗТСССТТ6АА6А6АеААААСЗСААТТ6САСТАААА

АтоАтсАААетАстсстАтттАтеААтссетстестееААттеААсеетттеАессА

ТАСТеТАТОААААСТТССТСАААТАОСААСТОТАСОАААТАСААТТеСЗАССбАТТАС

ССТТСААСАССА6ООАе©ТСССТГСАТСАСАТАОАА0АА0ААССА<ЗАО<ЗАТ0ТТ6А

ТСбСССМСТ<ЗАААТА1аа1д1асадда1дсаас1сс1д1сКдсаНдсас1аад1сйдсасйд1сасааасад

1дсасс1асКсйсд1сдасааадаааасасадс(асаас(ддадсаШас1дс1ддайасада1даййдаа1ддаа1

1аайайасаадаа1оссааас1сассадда1дс1сасай1аадййаса(дсссаадааддссасадаас1дааас а1сйсад1д1с1адаадаадаас1сааасс1с(ддаддаад1дс1аааК1адс1сааадсзаааасГСсасйа8дасс садддасйаа1садсаа1а1саасд1аа1адКс4ддаас1аааддда1с(дааасаасаНса1д1д1даа1а1дс1дз1 дадасадсаассаКд1адааШ#даасада1ддайассйид1сааадса4са1с1саасас1аасйда1ааТАСТ

ААССТТСТТСТСТТТСТТСТССТСАСА61ддА00АТ0АА6ААСАТС0ССАТС(ЗвАТС

СТСААСТСАСТСТТССАОСеТСТТААТОААССАСАТТСАААОССААТТСОАбСАСС

ТСАААСТОСОеТСебАСТСТТАТСССААТТТСеТСААСАССАСССАТТАТСАССАб

АА6А0С0АСАСААТТА6АСТ6СТСАС06ААСААСТТТАТСТТТТААСТАААА0ААТТ

ОАТСАТААСАТАТТАТТССАСААААСАОТААТАОСТААСАССТССАТААТАОСТОАС

АТСОТТбТАТСАТТАТСАТТАТТАСАААСАТТеТАТбАААТОААСОАТСТебТТСАА

СТСТАСАССАС6СА6ТССТТСТСАай1аааа{ааааа4сс1сйдйас1ас1(8ЕО ΙΟ Νο, 18)

Фиг. 9Р

- 31 024036

ВЛЧ51- Β/Ν31-38 Β/Ν31 38 ΙΙ_2 Μ

Общая длина : 630 1 023 1098

Фиг. 10