EA018174B1

EA018174B1 - Вирус гриппа с нарушенной репликацией для экспрессии гетерологичных последовательностей

Info

Publication number: EA018174B1
Application number: EA201000077A
Authority: EA
Inventors: Маркус Волшек; Андрей Егоров; Михаэль Бергманн; Томас Мустер; Христиан Киттель
Original assignee: Авир Грин Хилз Байотекнолоджи Рисерч Дивелопмент Трейд Аг
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-26
Publication date: 2013-06-28
Also published as: AU2008274360A1; EA201000077A1; US9187732B2; EP2048237A1; NZ582099A; CA2690317A1; EP2171070A2; CN101796190A; US20140045245A1; WO2009007244A2; WO2009007244A3; US20100136052A1

Abstract

Настоящее изобретение охватывает новый вирус гриппа с нарушенной репликацией, включающий модифицированный NS1 сегмент, кодирующий NS1 белок, утративший функциональный домен связывания РНК и функциональный эффекторный домен, и гетерологичную последовательность, вставленную между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS сегмента гена. Дополнительно изобретение охватывает применение вируса в качестве вектора для экспрессии различных белков, таких как хемокины, цитокины или антигенные структуры, способы получения вирусных частиц с применением указанного вирусного вектора, а также его применение для производства вакцин. Изобретение также охватывает составной белок, включающий часть N-конца NS1 белка и сигнальную последовательность, присоединенную к С-концу указанного NS1 белка.

Description

Настоящее изобретение относится к вирусу гриппа с нарушенной репликацией, включающему модифицированный N81 сегмент, кодирующий N81 белок, утративший функциональный домен связывания РНК и функциональный эффекторный домен, и гетерологичную последовательность, помещенную между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга N8 сегмента. Указанная гетерологичная последовательность может экспрессироваться с открытой рамкой считывания N81 или с другой открытой рамкой считывания, отличной от открытой рамки считывания N81.

Дополнительно изобретение относится к терапевтическим средствам, содержащим указанный вирус гриппа с нарушенной репликацией, и его применению, а также к способу получения указанного вируса.

Вирионы гриппа состоят из внутренней рибонуклеопротеиновой сердцевины (спиральный нуклеокапсид), содержащей одноцепочечную геномную РНК, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной изнутри матричным белком (М1). Сегментированный геном вируса гриппа А и В состоит из восьми (из семи - в случае вируса гриппа С) линейных отрицательно заряженных одноцепочечных РНК, кодирующих одиннадцать (у некоторых штаммов вируса гриппа десять) полипептидов, включающих белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ2, РВ1 и РА) и нуклеопротеин (ЯР), образующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (М1, М2 или ВМ2 для вируса В соответственно); два поверхностных гликопротеина, выступающие из оболочки, содержащей липид: гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (КА); неструктурный белок (N81) и белок ядерного экспорта (КЕР). Вирус гриппа типа В кодирует также КВ, мембранный белок, который может обладать активностью ионного канала, а большинство штаммов вирусов типа А кодируют также одиннадцатый белок (РВ1-Е2), обладающий, как считается, проапоптическими свойствами.

Транскрипция и репликация генома происходит в ядре, и сборка происходит путем почкования на плазматической мембране. Вирусы могут обмениваться генами при смешанных инфекциях. Вирус гриппа присоединяется через НА к сиалилолигосахаридам гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. Вслед за эндоцитозом вирусной частицы происходит конформационное изменение молекулы НА внутри клеточной эндосомы, которое облегчает слияние мембран, запуская таким образом снятие вирусной оболочки. Нуклеокапсид перемещается в ядро, где происходит транскрипция вирусной мРНК. Вирусная мРНК транскрибируется и процессируется с помощью уникального механизма, при котором вирусная эндонуклеаза отщепляет модифицированный 5'-конец от клеточных гетерологичных мРНК, которые далее служат в качестве праймеров при транскрипции вирусных РНК матриц с помощью вирусной транскриптазы. Продукты транскрипции заканчиваются на уровне 15-22 оснований от концов соответствующих матриц, где последовательности олиго(И) действуют как сигналы для добавления участков поли(А). Из восьми молекул вирусной РНК вируса гриппа А, полученных таким образом, шесть являются моноцистронными, которые транслируются непосредственно с получением белков, представляющих собой НА, NА, № и белки вирусных полимераз, РВ2, РВ1 и РА. Два другие продукта транскрипции подвергаются сплайсингу, в результате чего каждый дает две молекулы мРНК, которые транслируются с применением различных рамок считывания с получением белков М1, М2, N81 и НЕР. У большинства вирусов гриппа А сегмент 2 кодирует также второй белок (РВ1-Е2), который экспрессируется с применением перекрывающейся рамки считывания. Таким образом, восемь сегментов вирусных РНК кодируют одиннадцать белков: девять структурных и два неструктурных белка (N81 и недавно идентифицированный РВ1-Е2).

Применение вирусных векторов для доставки чужеродных белков и биологически активных молекул является заманчивым подходом в генной терапии для лечения рака и предотвращения инфекционных заболеваний. Вирусы гриппа особенно подходят в качестве потенциальных векторов для вакцин. В отличие от других векторов, таких как аденовирусы или ретровирусы, вирус гриппа не содержит ДНК интермедиата и не способен таким образом к интеграции в геном (хромосомы) хозяина. Имеется несколько вариантов изменения генома вируса гриппа в зависимости от поставленных задач и возможностей получения рекомбинантных вирусов. Эти стратегии включают вставку чужеродных белков в гликопротеины поверхности NА и НА (Ми81ет Т. е! а1., 1994, 1. νίτοί., 68, 4031-4034; Регсу N. е! а1., 1994, 1. νίτοί., 68, 4486-4492), создание дополнительных геномных фрагментов (Ейск В. апб НоЬот С., 1999, νίτοίο^, 262, 93-103; \Уа1апаЬе Т., е! а1., 2003, 1. νίτοί., ΊΊ, 10575-10583) и изменение неструктурного N81 белка (ΤεΛο В. е! а1., 2001, 1. νίτοί., 8899-8908; Такакика N. е! а1., 2002, Vасс^пе, 20, 1579-1585). Вирусный белок N81 обладает рядом преимуществ в качестве точки приложения генной инженерии, поскольку он, повидимому, не влияет на структуру вирионов, однако синтезируется в больших количествах в инфицированных клетках и выдерживает длинные вставки, вплоть до нескольких сотен нуклеотидов.

Поскольку N81 экспрессируется только внутриклеточно и менее открыт для взаимодействия с гуморальной частью иммунной системы, развитие иммунного ответа на N81 белок или на белки, присоединенные к N81, ограничено, в основном, индукцией СЭ8' Т-клеток. Очевидно, что для индукции ответа В-клеток или экспрессии биологически активных молекул необходима эффективная доставка рекомбинантного белка к клеточной поверхности.

Вакцинация в настоящее время рассматривается как наилучший способ защиты человека от гриппа. Ежегодные эпидемии гриппа среди людей (вызванные вирусами гриппа типа А или В) проявляются как высокоинфекционные острые респираторные заболевания с высокой заболеваемостью и значительной

- 1 018174 смертностью. Вакцинацию проводят с помощью имеющихся в продаже инактивированных химическим способом (убитых) или живых ослабленных вакцин против вируса гриппа. Концепция современных живых ослабленных вакцин основана на получении чувствительного к температуре ослабленного исходного штамма (шак!ег δίταίη). адаптированного к росту при 25°С (адаптация к холоду). Живые адаптированные к холоду (СА) и инактивированные вирусные вакцины стимулируют иммунную систему различным образом, хотя в обоих случаях дефицит необходимой иммуногенности, особенно у престарелых больных, является одним из наиболее важных недостатков вакцинации от гриппа.

Хотя живые СА вакцины от гриппа считаются достаточно безопасными, точный генетический и молекулярный механизмы их ослабления не вполне понятны. Считается, что природа безопасности СА вакцин от гриппа заключается в большом числе точечных мутаций, распределенных во внутренних сегментах гена. Однако только небольшое число картированных мутаций, находящихся в генах полимеразы, отвечает за ослабление вирусных СА штаммов, которые не способны к репликации при нормальной температуре тела (Нег1осйег М.Ь., С1ауо А.С. аиб МааккаЬ Н.Р., 1996, Уник, Век. 42:11-25; Небосйег М.Ь.Н.Р. е! а1., 1993, Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А, 90:6032-6036). Фактически, генетическая стабильность штаммов живой вакцины часто находится под вопросом, поскольку вирусы, повторно изолированные из вакцинированных хозяев, проявляют дополнительные точечные мутации, которые в конечном счете могут функционировать как супрессоры мутаций, приводя к усиленной репликации и возможной утрате чувствительного к температуре фенотипа у ревертантного вируса (Небосйег М.Ь.Н.Р. е! а1., 1993, Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 90:6032-6036, Тгеапог ЬМ. е! а1., 1994, 1. Упо1. 68:7684-7688).

В связи с потенциальным риском адаптированных к холоду живых ослабленных вакцин против вируса гриппа и ввиду низкой стабильности, часто сочетающейся с низкой скоростью экспрессии чужеродных белков в векторах вируса гриппа, по-прежнему имеется большая потребность в создании вектора на основе полностью ослабленного вируса гриппа, включающего клеточную и/или гуморальную иммуногенность и стабильно экспрессирующего большие количества чужеродных белков.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что вектор на основе вируса гриппа, разработанный согласно изобретению, удовлетворяет этим требованиям, т.е. представляет собой вектор вируса гриппа, обладающий высокой безопасностью благодаря полному ослаблению и демонстрирующий стабильную экспрессию чужеродных генов, включенных в вирусный вектор. Предпочтительно чужеродные гены проявляют высокую скорость экспрессии при размещении в вирусном векторе согласно изобретению.

Хотя предпринимались различные попытки преодоления низкой генетической стабильности и низкой скорости экспрессии белков или пептидов в ослабленных вирусных векторах, ни одна из таких конструкций пока что не была достаточно эффективной.

К1йе1 е! а1. (У1го1оду, 2004, 324, 67-73) описывают вирус гриппа типа А, состоящий из N81 размеров в 125 аминокислотных остатков (примерно половина размера N81 белка дикого типа) и экспрессирующий зеленый флуоресцирующий белок (ОРР) в той же рамке считывания, что и N81, который реплицируется у нокаутных мышей РКВ. В интерферонкомпетентных клетках вирус не проявляет стабильной экспрессии ОРР, напротив, он утрачивает способность к генерации флуоресценции из-за появления различных делеций в последовательности ОРР.

Стратегия бицистронной экспрессии, основанная на вставке кассеты с перекрывающимися стоп- и старт-кодонами в N8 ген для экспрессии ОРР, раскрыта в Кй!е1 е! а1. (2005, 1. У1го1., 79, 10672-10677). При наличии генетической стабильности уровень экспрессии ОРР при такой рамке считывания был значительно ниже, чем полученный в случае вектора на базе вируса гриппа, экспрессирующего ОРР с открытой рамкой считывания N81 (К1!!е1 е! а1. см выше).

Регко е! а1. описывают не вирус с нарушенной репликацией, а адаптированный к холоду вирус гриппа, экспрессирующий человеческий интерлейкин-2 (1. У1го1., 2006, 11621-11627). Так, генетическую стабильность и безопасность адаптированного к холоду вируса следует поставить под вопрос из-за генетической структуры, приводящей к чувствительности к температуре (Небосйег М.Ь.Н.Р. е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 1993, 90:6032-6036). Дополнительно уровни экспрессии 1Ь-2 оказываются низкими.

Настоящее изобретение относится к разработке вируса гриппа с нарушенной репликацией, включающего модифицированный сегмент N8, кодирующий белок N81, утративший функциональный домен связывания РНК и функциональный эффекторный домен, и гетерологичную последовательность, помещенную между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга N81 сегмента гена. Согласно изобретению гетерологичная последовательность может экспрессироваться с рамкой считывания N81 или с другой открытой рамкой считывания.

Хотя патент \УО 07/016715 описывает вирус гриппа, где N8 ген (иногда называемый также N81 геном) включает делеции и где вирус может применяться для экспрессии иммуностимуляторного цитокина, в патенте отсутствует раскрытие конкретного вектора вируса гриппа, который мог бы успешно экспрессировать чужеродные белки.

В противоположность этому авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что гетерологичные последовательности, которые могут быть даже больше природного интрона, могут стабильно экспрессироваться на высоком уровне в N8 сегмента, если они расположены между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, предоставленная

- 2 018174 эффективность сплайсинга регулируется согласно размеру вставки.

Это не было ни показано, ни отмечено в \УО 06/088481 и \УО 01/64680.

Согласно предпочтительному осуществлению изобретения функциональный донорный участок сплайсинга и акцепторный участок сплайсинга сегмента N8 гена представляют собой природный участок сплайсинга.

Согласно изобретению гетерологичные последовательности можно выбирать из последовательности любого биологически активного белка или пептида или антигенных структур.

Антигенные пептиды или белки характеризуются наличием эпитопов, которые могут приводить к иммуномодуляторным активностям, таким как связывание антител или антителоподобных структур, или индукции клеточных иммунных ответов.

Предпочтительно белки или пептиды выбирают из группы, состоящей из антигенов, предпочтительно бактериальных антигенов, таких как Е8АТ6, ростовых факторов, цитокинов, таких как интерлейкины, лимфокинов и хемокинов и их фрагментов или производных, более предпочтительно из МусоЬас1егшт 1иЬсгси1о515. СМ-С8Е, ССЬ-3, ССЬ-20, интерлейкина-2, интерлейкина-15 или их фрагментов или производных.

Настоящее изобретение дополнительно относится к терапевтическим средствам, предпочтительно вакцинным средствам, содержащим указанные вирусы гриппа с нарушенной репликацией. Для примера, такие средства можно применять для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний или рака.

Дополнительно раскрыты способы получения вируса гриппа согласно изобретению путем трансфекции клеточных линий (например, Уего клеток, МОСК клеток и т.д.) и экспрессии вирусных частиц.

Краткое описание фигур

Фиг. 1(а-|) - нуклеотидные последовательности различных конструкций вектора:

a) последовательность бе№81-1Е-2-10 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 1),

b) последовательность бе№81-1Е-2-11 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 2),

c) последовательность бе№81-1Е-2-14 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 3),

ά) последовательность бе№81-1Е-2-13 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 4),

е) последовательность бе№81-1Е-2-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 5),

ί) последовательность ώάΝ81-ΙΡ-2-17 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 6),

д) последовательность бе№81-[Е-15-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 7),

11) последовательность бе№81-СМ-С8Е-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 8),

ί) последовательность бе№81-ССЕ-3-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 9),

_)) последовательность бе№81-ССЕ-20-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 10),

k) последовательность бе№81-Е8АТ-65-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 67),

l) последовательность бе№81-Е8АТ-61-21 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 68),

т) последовательность ώάΝ81-ΙΡ-2-23 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 78), η) последовательность ά^Ν81-ΙΕ-2-24 сегмента (8Еф ΙΌ Νο. 79);

фиг. 2 - схематическое представление Ν8 сегмента дикого типа вируса гриппа А и трех химерных ΙΕ-2-Ν8 сегментов ά^Ν81-ΙΕ-2-10, ае№8ЫЬ-2-11 и ά^Ν81-ΙΕ-2-14;

фиг. 3 - уровни человеческого ΙΕ-2 в супернатантах Уего клеток, инфицированных ΟΗΒ-ΙΕ-2-10, 6ΗΒ-ΙΕ-2-11 и ΟΗΒ01;

фиг. 4 - анализ с помощью ПЦР в реальном времени (КТ-РСК) Ν8 сегмента после пяти пассажей на Уего клетках;

фиг. 5 - уровни человеческого ΙΕ-2 в супернатантах Уего клеток, инфицированных ΟΗΒ-ΙΕ-2-11, ΟΗΒ-ΙΕ-2-13, ΟΗΒ-ΙΕ-2-14 и 6ΗΒ-ΙΕ-2-21;

фиг. 6 - сплайсинг мРНК ώάΝ81-ΙΡ-2 можно изменять путем модификации последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга, или последовательности от 5' к акцепторному участку сплайсинга;

фиг. 8 - схематическое представление конструкций для экспрессии ΙΕ-2. ОКЕ (открытая рамка считывания) укороченного Ν81 включает нуклеотиды 45-158; ОКЕ человеческого ΙΕ-2 включает нуклеотиды 161-619; 5'-граница интрона находится между нуклеотидами 77 и 78; 3'-граница интрона находится между нуклеотидами 657 и 658;

фиг. 9 - нуклеотидная последовательность ώάΝ81-38ΙΡ-2 (8Еф ΙΌ Νο. 77).

Изобретение представляет вирусы гриппа с нарушенной репликацией, включающие модифицированный Ν8 сегмент, кодирующий Ν81 белок, включающий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию между положениями 1-73, приводящую к полной утрате его функционального участка связывания РНК, и модификацию по меньшей мере одной аминокислоты между положением 74 и Сконцевым аминокислотным остатком, конкретно до положения 167, приводящую к полной утрате эффекторной функции, и гетерологичную последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, помещенным в Ν8 сегменте гена.

Предпочтительно вирус гриппа получен из вируса гриппа типа А, вируса гриппа типа В или вируса гриппа типа С. Векторы, основанные на или полученные из вирусов гриппа типа А или вирусов гриппа типа В, являются предпочтительными.

- 3 018174

Вирусы гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению можно применять в качестве вирусного вектора для иммунизации против любых патогенов или антигенных структур для индукции иммунного ответа против гетерологичных структур, экспрессируемых указанным вирусным вектором. Иммунный ответ может включать клеточный иммунный ответ и/или гуморальный иммунный ответ. Применяя гетерологичные последовательности, экспрессирующие иммуномодулирующие белки или пептиды, можно дополнительно укрепить иммунный ответ против вируса гриппа, что приводит к улучшенному составу для вакцины против гриппа. Это особенно относится к вакцинации престарелых лиц или лиц с подавленным иммунитетом.

Вирус, выбранный для применения согласно изобретению, включает модифицированный N8 ген, что приводит к ослабленному вирусу гриппа, т.е. вирусу, который является инфекционным и может реплицироваться ίη νίνο в интерферондефицитных клетках или клеточных системах, но не может реплицироваться в интерферонкомпетентных клетках. Согласно изобретению термин нарушенная репликация определяется как скорость репликации в интерферонкомпетентных клетках хозяина, составляющая по меньшей мере менее 5%, предпочтительно менее 1%, предпочтительно менее 0,1% таковой у дикого типа вируса гриппа, как определено с помощью метода гемагглютинации, ТСШ50 метода или анализа бляшкообразования, хорошо известных в данной области техники.

Сегмент N8 гена согласно изобретению должен содержать функциональный донорный участок сплайсинга и функциональный акцепторный участок сплайсинга.

Согласно конкретному осуществлению изобретения сегменты генов вируса гриппа можно получать из различных штаммов вируса гриппа, пандемических или интерпандемических (циркулирующих между пандемиями). Это может приводить к появлению вирусов гриппа, претерпевших генный обмен (реассортацию), которые сочетают гены поверхностных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и/или нейраминидазы (ΝΑ) существующих интерпандемических вирусов с пятью, шестью или семью сегментами РНК, кодирующими другие белки из ослабленного исходного штамма (сочетание 6/2) или реассортанты (продукты реассортации) 7/1, или реассортанты 5/3, содержащие НА, ΝΑ и М сегменты циркулирующего штамма соответственно.

Авторы изобретения применяют обратную генетическую систему на Уего клетках для получения реассортантов и/или экспрессии модифицированных штаммов вируса гриппа. Этот подход уже хорошо известен в данной области техники (Р1ексйка 8. е! а1., 1996, 1. У1го1., 70(6), 4188-4192, №итапп апб Катаока, 1999, Α6ν. У1гик Век., 53, 265-300, Нойтапп е! а1. 2000, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А. 97:6108-13). Альтернативно для получения реассортантов можно применять подход, основанный на ΡΝΡκ, как описано Епат1 апб Епат1 (1. У1го1., 2000, 74, 12, 5556-5561).

Белок N81 вируса гриппа типа А является многофункциональным белком, состоящим приблизительно из 230 аминокислотных остатков, и синтезируется на ранней стадии инфекции и в большом количестве. Он противодействует клеточным антивирусным активностям и является фактором вирулентности. Активность С-концевого района N81 белка проявляется в ингибировании механизма процессинга мРНК хозяина. Во-вторых, N81 белок облегчает предпочтительную трансляцию вирусной мРНК путем прямого взаимодействия с клеточным фактором инициации трансляции. В-третьих, путем связывания с бкРНК и взаимодействия с предполагаемой клеточной киназой(ами) N81 белок способен предотвращать активацию индуцируемой интерфероном (ЮТ) бкРНК-активируемой киназы (РКВ), 2'5'олигоаденилатсинтазной системы и факторов транскрипции цитокина. В-четвертых, Юконцевая часть N81 связывается с КЮ-1 и ингибирует последующую активацию ΙΚΕ-3, предотвращая транскрипционную индукцию 1ЮТ-р. Поэтому N81 белок ингибирует экспрессию генов ЮТ-α или ЮТ-β, задерживает развитие апоптоза в инфицированных клетках и предотвращает развитие антивирусного состояния в соседних клетках. Вирусы гриппа, содержащие модификации в N81 белке, известны в данной области техники. Например, \¥О 99/64571 описывает полный нокаут сегмента N8 гена. \¥О 99/64068 описывает частичные делеции различных сегментов N8 гена, но ни одна из описанных модификаций не раскрывает вектор вируса гриппа согласно настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению модификация N81 белка может быть делецией, вставкой или заменой по меньшей мере одной аминокислоты, приводящей к вирусу гриппа с нарушенной репликацией.

Предпочтительно модифицированный N81 белок включает делецию по меньшей мере 50% аминокислотных остатков N81, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 90%.

Альтернативно функциональность N81 белка может быть полностью подавлена.

N81 белок вектора вируса гриппа согласно настоящему изобретению лишен функционального домена связывания РНК. Первичная функция этого домена, связанная с ^концом N81 белка (аминокислотные остатки 1-73, аминокислотная последовательность дикого типа прилагается как 8ЕО ΙΌ №. 80), представляет собой связывание бкРНК и ингибирование 2'3'олиго(А)-синтазы/РНКазы Ь пути (Мт 1. е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8ск, 2006, 103, 7100-7105, СЫеп е! а1., Вюсйетщйу. 2004 РеЬ. 24; 43(7):1950-62), а также активацию цитоплазматической РНК-хеликазы, ВЮ-1, индуцируемого ретиноевой кислотой белка I (Уопеуата М. е! а1., №1. 1ттипо1., 2004, 5, 730-737).

Утрата функционального домена связывания РНК определяется согласно настоящему изобретению

- 4 018174 как полное отсутствие способности связывать б&РНК, в результате чего вирус гриппа не может реплицироваться в интерферон-компетентных клетках.

Согласно изобретению эффекторный домен N81 белка вектора вируса гриппа является нефункциональным. Эффекторный домен взаимодействует с клеточными белками для ингибирования выхода мРНК из ядра. Эффекторный домен расположен в С-концевой части N81 белка. Согласно 8ο1ιι.ι11ζ с1 а1., эффекторный домен конкретно расположен между аминокислотными остатками 117 и 161, другие источники располагают эффекторный домен между остатками 134 и 161. Эффекторный домен N81 может быть изъят полностью или частично, а также аминокислотные остатки могут быть заменены или вставлены и функциональность полученного эффекторного домена можно тестировать, как описано в данной области техники (8с1ш1М-С11еггу е1 а1., 1. У1го1., 2001, 7875-7881).

Согласно изобретению С-концевые аминокислотные остатки, имеющие отношение к активности связывания эффектора, модифицируют с целью ингибирования эффекторной функции. Конкретно модифицируют аминокислотные остатки в положениях 74-230, более конкретно в положениях 116-161, более конкретно в положениях 134-161. Согласно предпочтительному осуществлению модификация представляет собой делецию указанных аминокислотных остатков.

Гетерологичная последовательность согласно настоящему изобретению может быть любой последовательностью любого биологически активного белка, или пептида, или антигенной структуры.

Например, антигенные структуры могут быть белками или углеводными структурами, которые могут узнаваться иммунной системой, т.е. антитела или подобные антителам структуры могут связываться с такими структурами. Эти структуры эпитопа могут содержать сигнальные пептиды или могут быть непосредственно связаны с модифицированным N81 белком. Например, чужеродный эпитоп можно получить из других патогенов, из связанных с опухолями антигенов или ретровирусных эпитопов, экспрессируемых на поверхности опухолевых клеток. Углеводные антигены часто обладают весьма слабой иммуногенностью. Их иммуногенность можно улучшить путем конъюгации углевода с белковым носителем. Белки или пептиды также можно присоединять к последовательностям трансмембранного домена, предпочтительно содержащим участки (цепочки) гидрофобных аминокислот или другим лидерным последовательностям, как известно, необходимым для переноса белка/пептида через барьер клеточной мембраны. Трансмембранный домен обычно означает одиночную трансмембранную α-спираль трансмембранного белка. В мембране α-спираль может быть собрана независимо от остального белка сходно с доменами водорастворимых белков. Трансмембранный домен может быть любой трехмерной белковой структурой, которая термодинамически стабильна в мембране. Это может быть одиночная α-спираль, стабильный комплекс из нескольких трансмембранных α-спиралей, трансмембранная β-структура (бочонок), β-спираль грамицидина А или любая другая структура.

Трансмембранные спирали обычно характеризуются длиной примерно в 20 аминокислотных остатков, хотя они могут быть гораздо длиннее или короче.

Например, это могут быть НА трансмембранные последовательности или любые другие известные вирусные трансмембранные домены.

Биологически активный белок согласно настоящему изобретению может включать сигнальный пептид. Сигнальный пептид может быть любой сигнальной последовательностью, встречающейся в природе или синтетической. Например, он может быть природной сигнальной последовательностью гетерологичной последовательности. Альтернативно он также может быть получен из антитела, предпочтительно из κ-цепи иммуноглобулина (1дК), более предпочтительно из сигнального пептида κ-цепи иммуноглобулина. Предпочтительно κ-цепь иммуноглобулина получают из мышиной κ-цепи иммуноглобулина.

Согласно предпочтительному осуществлению изобретения гетерологичная последовательность экспрессирует цитокины или хемокины или их фрагменты или производные.

Цитокины представляют собой малые секретируемые белки, опосредующие и регулирующие иммунитет, воспаление и гематопоэз. Самую обширную группу цитокинов представляют те, которые способствуют пролиферации и дифференциации иммунных клеток. В состав этой группы входят интерлейкины, которые являются цитокинами, производимыми лейкоцитами, и интерфероны, которые могут продуцироваться различными типами клеток.

Интерфероны (ЮТ) представляют собой семейство природных гликопротеинов, продуцируемых клетками иммунной системы позвоночных, включая млекопитающих, птиц, рептилий и рыб, в ответ на введение таких агентов, как бактерии, вирусы, паразиты и опухолевые клетки. У людей наличествуют три основных класса интерферонов. Тип I интерферонов включает 14 подтипов ЮТ-α и одиночные изоформы интерферонов ЮТ-β, -ω, -κ и -ε. Интерфероны типа II состоят из ЮТ-γ, а недавно открытый третий класс интерферонов состоит из ЮТ-λ, в трех разных изоформах.

Т111 клетки синтезируют в основном 1Ь-2, ЮТ-γ и ΤΗΡ-β. тогда как Т112 клетки, относящиеся к гуморальным иммунным ответам, секретируют цитокины, такие как 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Б-10. Цитокины Т112 типа опосредуют гиперчувствительные ответы замедленного типа на внутриклеточные патогены и ингибируют Т111 ответы.

Хемокины, исходно полученные из цитокинов хемоаттрактантов, реально включают более 50 чле

- 5 018174 нов и представляют семейство небольших индуцибельных и секретируемых белков с низким молекулярным весом (6-12 кДа в мономерной форме), которые играют решающую роль в процессах иммунного надзора и воспаления. В зависимости от их функции в иммунитете и воспалении их можно разделить на два класса. Воспалительные хемокины продуцируются клетками большого числа разных тканей, а также иммигрирующими лейкоцитами в ответ на бактериальные токсины и воспалительные цитокины типа 1Ь1, ΤΝΡ и интерфероны. Их основной функцией является вовлечение лейкоцитов в защитный ответ хозяина и в процесс воспаления. Направляющие (йоттд) хемокины, с другой стороны, экспрессируются конститутивно в определенных областях лимфоидной ткани. Они направляют движение и перемещение к месту назначения лимфоцитов и дендритных клеток в иммунной системе. Эти хемокины, как проиллюстрировано с помощью ВСА-1, 8ΌΡ-1 или 8ЬС, контролируют перемещение и рециркуляцию лимфоцитов при созревании, дифференциации, активации и обеспечивают их правильное размещение во вторичных лимфоидных органах.

Согласно настоящему изобретению показано, что биологически активные цитокины, или хемокины, или их фрагменты или производные могут стабильно и эффективно экспрессироваться с применением открытой рамки считывания, отличной от ОВР, применяемой при экспрессии N81 белка. Альтернативно к цитокинам или хемокинам можно присоединять дополнительные лидерные последовательности, отличные от природных сигнальных пептидов, которые могут дополнительно поддерживать эффективную секрецию белка и демонстрировать высокоэффективную индукцию иммунного ответа ίη νίνο.

Оказалось, что хемокины и цитокины могут также эффективно экспрессироваться, когда аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому цитокину/хемокину, присоединена к части N81 белка через аминокислотную последовательность, выступающую в роли сигнального пептида. Например, это может быть часть сигнального пептида мышиного 1дК.

Согласно настоящему изобретению гетерологичная последовательность предпочтительно кодирует интерлейкин-2 (1Ь-2), или его фрагмент, или производное. 1Ь-2 включает последовательность секреторного сигнала и представляет собой иммуномодуляторную молекулу, продуцируемую Т-клетками, необходимую для экспансии клона активированных антигеном Т-клеток. Секреция 1Ь-2 СЭ4' Т-лимфоцитами оказывает множественные биологические воздействия, такие как индукция пролиферации Т-хелперных клеток и Т-киллерных клеток и стимуляция Т-клеток для продукции других цитокинов. Дополнительно 1Ь-2 может также активировать В-клетки, ΝΚ-клетки и макрофаги. Когда 1Ь-2 экспрессируется при участии рекомбинантных вирусов, инфицировавших нелимфоидные клетки, его секреция может значительно понижать патогенность вирусной инфекции и модифицировать иммунный ответ. Известно также, что 1Ь-2 действует в качестве иммунного вспомогательного вещества.

Согласно настоящему изобретению включен любой фрагмент или производное цитокинов и хемокинов, которые еще сохраняют биологическую активность, т.е. проявляют иммуномодуляторные активности.

Альтернативно цитокины/хемокины можно также выбирать из группы, состоящей из 1Ь-15, 6МС8Р, ССЬ3 или ССЬ20 или их фрагментов или производных.

Альтернативно он может быть любым эпитопом или иммуномодуляторным районом, полученным из МусоЬасГегшт 1иЬсгси1о5ит. например Е8АТ-6.

Альтернативно гетерологичные последовательности могут также включать химерные белки, являющиеся цитокинами или хемокинами или их фрагментами или производными, присоединенными к антигенным белкам или антигенным пептидам. Присоединение может быть непосредственным или через последовательности пептидных линкеров длиной по меньшей мере из 4 аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере из 5 аминокислотных остатков. Например, последовательности линкеров согласно изобретению представляют собой ООО8 или 60008.

Примеры химерных белков с 1Ь-2 известны в данной области техники. Например, это может быть 1Ь-2-РЕ40 (где РЕ является экзотоксином А из Ркеийотопак), ΌΆΒ389-ΙΕ-2 (где ΌΆΒ является дифтерийным токсином) или 1Ь-2 Вах (где Вах является проапоптическим белком человеческого происхождения) (Адейап В. е! а1., Вюсйет. 1., 2003, 129-140).

Согласно настоящему изобретению нуклеотидные последовательности гетерологичных последовательностей, внесенные в вирус гриппа с нарушенной репликацией, демонстрируют по меньшей мере 80% идентичности со своими природными последовательностями, предпочтительно по меньшей мере 85% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности. Любая оптимизация нуклеотидной последовательности с точки зрения употребления кодонов при этом включена.

Альтернативно гетерологичная последовательность может включать эпитопы Т-клеток или Вклеток, например эпитоп В-клеток из гемагглютинина гриппа (НАТВ), например эпитоп А-петли гемагглютинина вируса гриппа (НА) или их части или пептиды, представляющие один из иммунодоминантных эпитопов НА, соответствующих аминокислотной последовательности 150-159 (СаГоп е1 а1., 1982, Се11., 417-427). Эпитоп может быть также получен из связанного с меланомой эндогенного ретровируса (МЕВУ), как описано в \УО 06/119527. Это может быть эпитоп, полученный из дад, ро1 или ет^г белка вируса, предпочтительно из епу белка. Предпочтительно это может быть один из следующих пептидов:

- 6 018174

ΕΜΟΒΚΑΡΡΒΒΒΒΗΒΝΒΑ (8Εζ) ГО. Νο 12);

КМКЕРЗТККАЕРРТАУАф (8Εφ Ιϋ. Νο 13); ΤΚΚΑΕΡΡΤνΑφΕΚΚΕΤφ (8Εφ ГО. Νο 14); ΜΡΑίϊΑ А Α ΑΝΥΤΥΑΥΑΥΥΡ (8ΕΟ ГО. Νο 15); Р11)ОРСРАКРЕЕЕ()ММ1 (8Εφ ГО. Νο 16); УРРГСЕОВАРССЕМРАУ (8Εφ ΤΟ. Νο 17); ΥφΕδίΚΡΕΡΚΟΚΡΌΡΚΕ (8Εφ ГО. Νο 18); РКРК6КРСРКЕ1РКЕ8К (8Εφ ГО. Νο 19); ΟΚΡΕΡΚΕΙΡΚΕδΚΝΤΕν (8Εζ) ГО. Νο 20); αΤΙΙΟ\νΑΡΚΟΟΕΥΗΝ€,8 (8Εφ ΙΟ. Νο 21); Κ,ΟφΡΥΗΝΌδΟφΤφδΌΡδ (8Εφ ГО. Νο 22); ОЬТЕЗЬОКНКНККЬфЗР (8Εφ ГО. Νο 23); ΡΨΟΨ6ΕΚΟΙ8ΤΡΚΡΚΐν (8ΕΟ ГО. Νο 24); РК1У8РУ8СРЕНРЕЬ\¥В(8Еф ГО. Νο 25); РЮ/ОТЬС)ОЕ80В8ЕКЕ (8Εφ ГО. Νο 26); ΚνΝΥΕφϋΡ8ΥφΚ8ΕΚΡΒ(8Εφ ГО. Νο 27); νΝΥΕφΟΡδΥφΒδΕΚΓΚΡ (8Εφ ГО. Νο 28); νΝΥΕΕ)ΠΓ8ΥφΚ8ΕΚΓΕ8Ρ(8Εφ ГО. Νο 29); ΝΥΙφΠΡδ ΥΟΚ8ΕΚΡΚΡΚ (8Εφ ГО. Νο 30); ΥΕφΟΡ8Υζ)Κ8ΕΚΓΒΡΚΕί (8Ε0 ГО. Νο 31); Ε0ΟΡ8ΥρΚ8ΕΚΓΚΡΚ6Κ (8Εφ ГО. Νο 32); φΟΡ8ΥφΒ8ΕΚΓΒΡΚΟΚΡ (8ΕΟ ГО. Νο 33); ОР8УфК8ЕКРКРКОКРС (8Εφ ГО. Νο 34); Р8УфК.8ЕКГКРКСКРСР (8Εφ ГО. Νο 35); 8УфК8ЕКРВРКОКРСРК(ЗЕф ГО. Νο 36); УфВЗЕКРВРКОКРСРКЕ (8Εφ ГО. Νο 37); 0В.8ЕКГКРК6КРСРКЕ1 (8Εφ Ιϋ. Νο 38); В8ЕКЕКРКОКРСРКЕ1Р (8Ε0 ГО. Νο 39); 8ЕКРКРКОКРСРКЕ1РК (8Εφ ГО. Νο 40),ЕКГВРКСКРСРКЕ1РКЕ (8Εφ ГО. Νο 41); КРКРКСКРСРКЕ1РКЕ8 (8Εφ ΙΟ. Νο 42); РКРКСКРСРКЕ1РКЕ8К (8Εφ ГО. Νο 43); ΚΡΚΟΚΡΟΡΚΕΙΡΚΕδΚΝ (8ΕΟ ГО. Νο 44); ΡΚΟΚΡσΡΚΕΙΡΚΕδΚΝΤ (8Εφ ГО. Νο 45); К6КРСРКЕ1РКЕ8КИГЕ (8Εφ ГО. Νο 46); Γ>ΚΡ€ΡΚΕΙΡΚΕ8ΚΝΤΕν (8Εφ ГО. Νο 47); ΚΡΕΡΚΕΤΡΚΕΑΚΝΤΕνΤ. (8Εφ ΙΟ. Νο 48); РСРКЕРКЕЗКИТЕУБУ (8ΕΟ ΙΟ. Νο 49); ϋΡΚΕ1ΡΚΕ8ΚΝΤΕνΕν\ν (8Εφ ГО. Νο 50); ΡΚΕΤΡΚΕ8ΚΝΤΕνΐ,ν\νΕ (8Εφ Ιϋ. Νο 51); 8ΥφΚ5Τ.ΚΓΚΡΚΰΚΡ€ΡΚΕΤΡ ΓδΓ.φ ГО. Νο 52).

Согласно альтернативному осуществлению изобретения гетерологичная последовательность экспрессируется с открытой рамкой считывания (ОВР), отличной от ОВР N81. Другой способ получения второй ОВР состоит во включении элемента внутреннего участка посадки рибосомы (Сагйа-Зайгс А. е! а1., 1999, 1. νίτοί., 75, 9029-9036) или удвоения последовательностей промоторов вируса гриппа (Маейабо А. е! а1., 2003, νύοίο^γ, 313, 235-249).

Согласно настоящему изобретению впервые показано, что даже если первые приблизительно 12 аминокислотных остатков N81 белка все еще присутствуют, секреция гетерологичной последовательности не запрещена.

Поэтому согласно настоящему изобретению вирусный вектор может содержать по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, предпочтительно до 30 аминокислотных остатков, предпочтительно до 20 аминокислотных остатков, предпочтительно до 14 аминокислотных остатков на Ν-конце N81 белка и сигнальный пептид или его часть, присоединенный к С-концу N81 белка. С-концевая сигнальная последовательность предпочтительно присутствует в том случае, когда N81 белок содержит не более 30 аминокислотных остатков на №конце.

Применяя эту конкретную конструкцию, т.е. составной белок, включающий сигнальный пептид или его часть и указанные аминокислотные остатки Оконца N81 белка, можно функционально модифицировать получаемый таким образом N81 белок, чтобы он действовал в качестве сигнального пептида. Экспрессия гетерологичных последовательностей с помощью указанных составных пептидов может увеличить секреторные характеристики указанных гетерологичных последовательностей.

Согласно предпочтительному осуществлению настоящего изобретения трансляция N81 белка завершается с помощью по меньшей мере одного стоп-кодона и экспрессия указанной гетерологичной последовательности инициируется с помощью старт-кодона. Например, стоп- и старт-кассету с последовательностью ИААИС (8ЕО ГО N0. 53) можно вставить в кодирующую последовательность N8 гена вируса гриппа с последующей вставкой гетерологичной последовательности. Из-за краткости последовательности стоп- и старт-кодонов и ограниченной способности вируса экспрессировать вставки с длинными последовательностями при непосредственном присоединении к N8 или посттрансляционном отщеплении от N81, стоп- и старт-системы обладают большими преимуществами по сравнению со вставкой длинных последовательностей, например элемента внутреннего участка посадки рибосомы. Стоп- и старт-кодоны можно вставлять по любому положению внутри N8 гена между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга без модификации нуклеотидных последовательностей функциональных участков сплайсинга.

В альтернативном осуществлении стоп- и старт-кодоны вставляют в такое положение, при котором экспрессируются по меньшей мере 4 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов (более предпочтительно по меньшей мере 8 нуклеотидов, расположенных ниже) 5'-донорного участ

- 7 018174 ка сплайсинга N8 гена. 5' и 3' границы N8 интрона определены как точка разрыва между первым экзоном и интроном и точка разрыва между интроном и вторым экзоном. В случае вируса гриппа типа А вставка старт- и/или стоп-кодона может находиться в любом положении внутри N81 гена так, чтобы экспрессировались по меньшей мере 10 Ν-концевых аминокислотных остатков N81 белка, альтернативно, чтобы экспрессировались по меньшей мере 12 №концевых аминокислотных остатков N81 белка. Альтернативно открытая рамка считывания гетерологичной последовательности может также, по меньшей мере, частично перекрываться с открытой рамкой считывания N81.

В осуществлении изобретения трансляция с рамкой считывания гетерологичной последовательности инициируется с помощью оптимизированной последовательности инициации трансляции, предпочтительно последовательность инициации трансляции является консенсусной последовательностью Козак (Ко/ак М., №.1с1е1с Лаб Яекеагсй, 1984, 12, 857-872). Эта консенсусная последовательность может включать по меньшей мере часть последовательности ССЯСССАИСС, где Я может быть А или С (8ЕЭ ГО N0. 54). Положения -3 (т.е. на 3 нуклеотида выше АТС кодона) и +4 оказывают сильнейшее влияние на трансляцию (Кохак М., ШсШс Ас1б Яекеагсй, 1987, 15, 8125-8148). Так, консенсусной последовательностью может также быть ЯХХАиСС, ХХАИСС или ЯХХАИС.

Дополнительно согласно настоящему изобретению N8 сегмент гена содержит функциональный донорный и/или акцепторный участок сплайсинга. Согласно изобретению донорный участок сплайсинга и акцепторный участок сплайсинга N8 гена состоят из двух нуклеотидов 3'-5' границы интрона и двух нуклеотидов 5'-3' границы интрона.

Гомологию и1 8иРНК или пиримидиновой цепочке также можно протестировать и изменить для улучшения функциональных участков сплайсинга.

Согласно конкретному осуществлению N8 сегмент гена содержит функциональные природные донорный и акцепторный участки сплайсинга, т.е. донорный и акцепторный участки сплайсинга сохранены в виде природных участков, т.е. нуклеотиды не модифицированы с помощью искусственных подходов.

Любые модификации нуклеотидов на участках сплайсинга, происходящие в естественных условиях благодаря модификациям вируса гриппа, основанным на приспособлении к окружающей среде или развитии природных штаммов, являются естественными модификациями и не входят в определение синтетических или искусственных модификаций.

Альтернативно последовательности, окружающие донорный участок сплайсинга и/или выше акцепторного участка, можно изменять. Предпочтительно изменение или модификацию можно проводить в пределах 3 нуклеотидов от 5' и/или 8 нуклеотидов от 3' до 5' границы N8 интрона, а также 100 нуклеотидов от 5' и/или 2 нуклеотидов от 3' до 5' границы N8 интрона. Это осуществляется предпочтительно путем введения синтетических последовательностей для модификации активности сплайсинга.

Если при этом гетерологичная последовательность увеличивает размер N8 интрона, может быть предпочтительным модифицировать последовательности, окружающие донорный и/или акцепторный участки сплайсинга для увеличения эффективности сплайсинга и таким образом генетической стабильности рекомбинантного N8 сегмента.

Например, модификация может быть такой, что изменяется последовательность, окружающая донорный участок сплайсинга для увеличения гомологии с 5'-концом И1 киРНК человека и/или последовательностью выше акцепторного участка сплайсинга, содержащая точку разветвления (Р1о1с11 е! а1., 1986, Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 83:5444-8; №тего££ е! а1., 1992, Мо1. Се11. Βίο1. 12:962-70) и пиримидиновая цепочка заменяется последовательностью, усиливающей сплайсинг N8 сегмента.

Например, последовательность, окружающую 5'-участок сплайсинга, можно изменить с САС/СТАСАТТС (как обнаружено в РЯ8 N8 сегмента, 8ЕЭ ГО N0. 55) на САС/СТААСТАТ (нуклеотиды, комплементарные 5'-концу И1 киРНК человека, показаны жирным курсивом, донорный участок сплайсинга отмечен косой чертой /, 8ЕЭ ГО N0. 56).

Для оптимизации сплайсинга предпочтительная вставленная последовательность^ 5'-акцепторного участка сплайсинга включает петлеобразную (1ала1) консенсусную последовательность и пиримидиновую цепочку. Например, последовательность выше синтетического акцепторного участка сплайсинга может быть следующей:

ТАСТААССТТСТТСТСТТТСТТСТССТСАСАС/ (8Е(Э ГО N0. 57).

Петлеобразная консенсусная последовательность подчеркнута, пиримидиновая цепочка показана жирным шрифтом, 3' граница интрона отмечена косой чертой /.

Для стабильности вирусного вектора и скорости экспрессии гетерологичной последовательности может быть важным ввести синтетическую/модифицированную последовательность, содержащую петлеобразную консенсусную последовательность и пиримидиновую цепочку в конкретное положение внутри N8 гена, например непосредственно выше акцепторного участка сплайсинга.

Дополнительно может быть необходимым варьировать расстояние между петлеобразной консенсусной последовательностью и пиримидиновой цепочкой для модификации скорости сплайсинга N8 сегмента (Р1о1с11 8. апб Кгид Я., 1986, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 83:5444-8; №тего££ М. е! а1., 1992, Мо1. Се11. Вю1., 962-970).

В предпочтительном осуществлении вирус гриппа с нарушенной репликацией согласно изобрете

- 8 018174 нию включает нуклеотидную последовательность, как показано на фиг. 1(а-)), или по меньшей мере на 96% гомологичную последовательность, альтернативно по меньшей мере на 98% гомологичную.

В дополнительном осуществлении заявляется также комбинация по меньшей мере двух вирусов гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению, включающих по меньшей мере одну биологически активную молекулу или ее производное или фрагмент и по меньшей мере одну антигенную структуру. Такая комбинация, включающая разные гетерологичные последовательности, может давать преимущества в плане дополнительного повышения гуморальной, а также клеточной иммуногенности. Например, один из векторов может содержать цитокин, или его фрагмент, или производное, как 1Ь-2, и второй вирусный вектор может содержать антигенный пептид или полипептид.

Альтернативно гетерологичные последовательности могут также включать составные белки, в которых цитокины, или хемокины, или их фрагменты или производные присоединены к антигенным белкам или антигенным пептидам или связаны непосредственно или через последовательность линкера с производным N81 белка.

Настоящее изобретение охватывает сигнальный пептид, включающий часть Ν-концевых аминокислотных остатков N81 белка, например 10-12 аминокислотных остатков с Ν-конца N81 белка, и сигнальный пептид или его часть, присоединенные к С-концу указанного N81 белка. Указанный сигнальный пептид может состоять из 8-30, предпочтительно до 50 аминокислотных остатков.

Сигнальную последовательность можно получать из легкой цепи антитела, предпочтительно из 1дК цепочки, более предпочтительно из мышиной 1дК цепочки. Согласно альтернативному осуществлению 1дК цепь может включать по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, например включать последовательность \1РТ1)ТРРР\\'\ТРР\\'\РС,8ТС11) (8РО ГО. N0. 11) или \1РТ1)ТРРР\\'\ТРР\\'\РР8116 (8РР) ГО N0. 82) или их части.

Состав вакцины, включающей вектор вируса гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению, также охвачен изобретением.

Согласно изобретению вирус гриппа с нарушенной репликацией можно применять для получения лекарственного средства для терапевтического применения у больных, например, для лечения инфекционных заболеваний или рака.

Способы введения включают, не ограничиваются этим, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, интраназальный, эпидуральный или оральный пути. Введение через нос предпочтительнее.

В предпочтительном осуществлении может быть желательно вводить лекарственное средство в легкие любым подходящим способом. Пульмонарное введение можно также осуществлять с помощью, например, ингалятора или небулайзера или смешивать лекарственное средство с аэрозольным агентом.

Фармацевтическую смесь можно также доставлять с помощью системы с контролируемым высвобождением, например, насоса.

Лекарственное средство согласно настоящему изобретению может включать терапевтически эффективное количество вируса с нарушенной репликацией и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый означает одобренный уполномоченными инстанциями, такими как ΕΏΆ или ЕМЕА. Термин носитель относится к растворителю, вспомогательному средству, наполнителю или средству доставки, вместе с которыми вводят лекарственное средство. Можно применять физиологические растворы, растворы декстрозы и глицерина в качестве жидких носителей или вспомогательные вещества, такие как глюкоза, лактоза, сахароза или любые другие вспомогательные вещества, известные в данной области техники как применимые в фармацевтических смесях. Дополнительно можно включать стабилизирующие агенты для увеличения срока годности лекарственного средства.

Предпочтительно предоставляется готовый к употреблению раствор для инфузий. Альтернативно лекарственное средство можно готовить в виде порошка, который растворяют в подходящем водном растворе непосредственно перед введением.

Количество фармацевтической композиции согласно изобретению, эффективное для лечения конкретного нарушения или состояния, будет зависеть от природы нарушения или состояния и может определяться с помощью стандартных клинических подходов. Дополнительно при необходимости можно применять анализы ίη νίίτο для помощи при определении границ оптимальной дозы. Точная доза, включенная в состав, также будет зависеть от пути введения и серьезности заболевания или нарушения и должна быть установлена в соответствии с решением практикующего врача и состоянием каждого пациента. Однако подходящие интервалы дозировок для введения обычно составляют примерно 10⁴-5х 10⁷ рГи (единиц бляшкообразования) и могут вводиться однократно или несколько раз с интервалами по необходимости. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, включающие 10⁴-5х10⁷ рГи мутантного вируса с нарушенной репликацией можно вводить интраназально, внутримышечно или подкожно. Эффективные дозы можно определять экстраполяцией по кривым зависимости ответа от дозы, полученным ίη νίίτο или в моделях тестирования на животных.

Дополнительно изобретение охватывает вектор, включающий нуклеотидную последовательность,

- 9 018174 кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией, согласно настоящему изобретению.

Если применяется ДНК вектор, указанный вектор является системой транскрипции для антисмысловой вирусной РНК. Например, это может быть вектор, примененный Нойтапп с1 а1., 2000, Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А, 97:6108-13. Альтернативно можно применять РНК, включающую последовательность, кодирующую вирус с нарушенной репликацией согласно изобретению. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению, включающий следующие этапы: трансфекция клеток, предпочтительно Уего клеток, по меньшей мере одним вектором, включающим последовательность вируса согласно изобретению, инкубацию трансфицированных клеток для обеспечения развития потомства вируса, содержащего гетерологичный белок, также, естественно, охвачен областью притязаний изобретения.

Альтернативно предоставляется также способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией, включающий следующие этапы: трансформация клеток, предпочтительно Уето клеток, вектором, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению предпочтительно вместе с очищенным препаратом ΚΝΡ комплекса вируса гриппа, инфицирование выбранных клеток вспомогательным вирусом гриппа, инкубация инфицированных клеток для обеспечения развития потомства вируса и отбор трансформированных клеток, экспрессирующих модифицированный N8 ген и гетерологичную последовательность.

Вышеприведенное описание понятно в большей полноте с помощью нижеследующих примеров. Такие примеры, однако, являются только представительными для практического проведения одного или более осуществлений и их не следует рассматривать как ограничивающие область притязаний изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Экспрессия человеческого интерлейкина-2 с помощью отдельной открытой рамки считывания.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий 1Ь-2, вставляют в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо Й1со/8/34. который не кодирует функциональный N81 белок. N81 белок оканчивается после аминокислотного остатка 21 с помощью искусственно вставленного стоп-кодона и не содержит ни домена связывания РНК, ни эффекторного домена.

Для обеспечения трансляции 1Ь-2 искусственно вставленный стоп-кодон для N8 белка перекрывается со старт-кодоном для 1Ь-2 с образованием последовательности ТААТС (8ЕО ГО №. 81). Получены две конструкции (см. фиг. 2).

В обеих конструкциях (беШ81-1Ь-2-10 и беШ81-1Ь-2-11) сДНК 1Ь-2, включающая перекрывающийся стоп- и/или старт-кодон, заменяет нуклеотиды 90-345 дикого типа N8 сегмента, соответствующие аминокислотным остаткам 22-106 N81 белка.

Конструкция беШ81-1Ь-2-10 таким образом включает природный акцепторный участок сплайсинга, природную точку разветвления на 20 нуклеотидов выше акцепторного участка сплайсинга (Р1о1с11 е1 а1. 1986, Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И8А, 83:5444-8; №тетой е1 а1., 1992, Мо1. Се11. Вю1. 12:962-70), а также природную пиримидиновую цепочку из 11 нуклеотидов дикого типа N8 сегмента. Петлеобразная консенсусная последовательность (СТКАУ или У№УУКАУ), обнаруживаемая на 72 нуклеотида выше 3' участка сплайсинга в N8 сегменте дикого типа, также присутствует в сегменте беШ81-1Ь-2-10.

Дополнительно в сегменте беШ81-1Ь-2-11 синтетическая последовательность из 29 нуклеотидов, включающая петлеобразную консенсусную последовательность и следующую за ней пиримидиновую цепочку, заменяет нуклеотиды 361-525 N8 сегмента дикого типа, соответствующие аминокислотным остаткам 112-166 N81 белка. Таким образом, природная точка разветвления, пиримидиновая цепочка, а также петлеобразная консенсусная последовательность, находящиеся на 72 основания выше 3' участка сплайсинга в сегменте N8 заменены.

Дополнительно в обоих химерных 1Ь-2 N8 сегментах последовательность ниже 5' границы интрона изменена для достижения 100% комплементарности с 5'-концом человеческой киРНК И1 (т.е. /СТАСАТТС, находящаяся в N8 сегменте дикого типа, заменена на СТААСТАТ). Дополнительно метионин, присутствующий в случае альтернативной рамки считывания в положении 76 N8 сегмента дикого типа, заменен на валин.

Таким образом, аминокислотная последовательность укороченного N81 белка следующая:

МПР№ТУ88ЕрУ81ЕЕАКУККК (буквы, показанные жирным шрифтом с подчеркиванием, отмечают изменения по сравнению с последовательностью дикого типа (8ЕО ГО №. 59).

Описание беШ81-1Ь-2-10 сегмента, как приведено на фиг. 1а: ОКЕ состоит из укороченного N81, т.е. нуклеотидов 27-92, ОКЕ человеческого 1Ь-2 состоит из нуклеотидов 92-553; 5' граница интрона находится между нуклеотидами 56 и 57; 3' граница интрона находится между нуклеотидами 739 и 740 (8ЕО ГО №. 1).

Описание беШ81-1Ь-2-11 сегмента, как приведено на фиг. 1Ь: ОКЕ укороченного N81 состоит из нуклеотидов 27-92, ОКЕ человеческого 1Ь-2 состоит из нуклеотидов 92-553; донорный участок сплайсинга находится между нуклеотидами 56 и 57; акцепторный участок сплайсинга находится между нуклеотидами 603 и 604 (8ЕО ГО №. 2).

- 10 018174

Конструкция плазмид

В качестве основы для создания химерной конструкции из человеческого 1Ь-2 и N8 сегмента применяют плазмиду рКА2000. рКА2000 получают путем делеции СМУ промотора в рНА2000 (НоГГтап е! а1., 2000 Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. И8А, 97:6108-13). Так, при трансфекции происходит транскрипция только νΡΗΚ с производных рКА2000.

Сегменты беШ81-1Ь-2-10 и 6ο1Ν81-ΙΕ-2-11 получают с помощью стандартных способов ПЦР и клонируют в рКА2000 с получением плазмид рКА-беШ81-1Ь-2-10 и рКА-беШ81-1Ь-2-11 соответственно. Аналогичным образом создают производные рКА2000, содержащие РВ8 беШ8 сегмент (Саг51а-8а51ге е! а1., 1998, У1го1оду, 252:324-30) (рКА-беШ81).

РА, РВ1, РВ2, НА, ΝΑ, М и ΝΡ сегменты, полученные из адаптированного к Уего клеткам штамма вируса гриппа А Η1Ν1 (СНВ01), клонируют в рНА2000.

Все плазмиды секвенируют для подтверждения отсутствия нежелательных мутаций.

Получение вирусов

Уего клетки поддерживают на среде ΌΜΕΜ/Ρ12, содержащей 10% сыворотки плода коровы и 1% С1и!атах-1 при 37°С.

Для получения вируса применяют семь производных рКА2000, содержащих сегменты РА, РВ1, РВ2, НА, NΑ, М и №, полученные из СНВ01, а также две плазмиды для экспрессии белка, кодирующие РВ8 N81 белок вируса гриппа А (рСАСС8Ч81(8АМ): (8аКа1оге е! а1., 2002, 1. У1го1., 76:1206-12) и ПР (рс^NΑ-NΕΡ), применяют вместе с рКА-беШ8-1Ь-2-10, рКА-беШ8-1Ь-2-1 или рКА-беШ81 для совместной трансфекции Уего клеток. Вслед за трансфекцией для поддержания репликации вируса Уего клетки культивируют в среде без сыворотки (Орб-Рго; бкйгодеп) в присутствии 5 мкг/мл трипсина. Через три дня после трансфекции наблюдается 50-100% СРЕ и высвобожденные вирусы замораживают или дополнительно амплифицируют в Уего клетках. Дополнительно вирусы, экспрессирующие химерный 1Ь-2, однократно очищают по способу бляшкообразования. После амплификации в Уего клетках несколько бляшек замораживают для дальнейшего анализа.

Полученные вирусы обозначают СНВ-1Ь-2-10, СНВ-1Ь-2-11 и СНВ01.

Анализ экспрессии интерлейкина-2

Уего клетки инфицируют при множественности инфекции 0,1 СНВ-беШ81, СНВ-1Ь-2-10 или СНВΙΠ-2-11 и инкубируют в течение 16 ч при 37°С на среде без сыворотки в присутствии 1 мкг/мл трипсина. Затем добавляют сыворотку плода коровы (конечная концентрация 10%) и ингибитор трипсина из соевых бобов (конечная концентрация 100 мкг/мл) и продолжают инкубацию при 37°С в течение еще 24 ч.

Супернатанты анализируют на наличие секреции 1Ь-2 с помощью ЕЬ18А.

Показано, что экспрессия 1Ь-2 примерно в 5 раз выше в случае вируса СНВ-1Ь-2-10 по сравнению с вирусом СНВ-1Ь-2-11 (см. фиг. 3). Как и ожидалось, 1Ь-2 не детектируется в супернатантах культур, инфицированных вирусом СНВ01, лишенным сДНК 1Ь-2.

Уровень экспрессии человеческого 1Ь-2 в Уего клетках составляет приблизительно 2600 пг/мл в случае СНВ-1Ь-2-10 и примерно 500 пг/мл в случае СНВ-1Ь-2-11. В отличие от этого уровень экспрессии, известный в данной области техники, составляет 250-350 пг/мл (К111е1 е! а1., 2005, см.выше).

Анализ стабильности вирусов

Вирусы с химерными 1Ь-2, полученные непосредственно после трансфекции или после одного цикла очистки по способу бляшкообразования, последовательно пассируют пять раз на Уего клетках. РНК экстрагируют с применением набора Упа1Атр (О|;щеп) и подвергают обратной транскрипции. Целые N8 сегменты амиплифицируют с помощью ПЦР и подвергают электрофорезу в агарозном геле для оценки присутствия делеций.

Как показано на фиг. 4, полоски результатов делеций обнаружены для всех образцов вирусов СНВ-ΙΕ2-10 независимо от очистки по способу бляшкообразования. В отличие от этого, продукты ПЦР, полученные с образцами вируса СНВ-1Ь-2-11, мигрируют в соответствии с ожидаемым размером (см. фиг. 4).

Пример 2. Экспрессия человеческого интерлейкина-2 с открытой рамкой считывания N81.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий 1Ь-2, вставляют в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо Ктсо/8/34, который не кодирует функциональный N81 белок. В отличие от примера 1 1Ь-2 непосредственно присоединяют к укороченному (12 аминокислотных остатков) N81 белку. Так, 1Ь-2 экспрессируется с открытой рамкой считывания N81 (см. фиг. 1с, беШ811Ь-2-14).

Для обеспечения секреции 1Ь-2 зрелый 1Ь-2, присоединяют к первым 12 аминокислотным остаткам N81 белка через модифицированный сигнальный пептид 1дК, получая следующую аминокислотную последовательность :

ΜΡΡΝΤ У88РфУ8-£££ ИТ'£££ ИТРОЛ'/Сг·ΑΡΤ888ΤΚΚΤΟΕΟΕΕΗΕΕΕΡΕΟΜΙΕΝΟΙΝΝΥΚΝΡΚΕΤΚΜΕΤΡΚΡΥΜΡΚΚΑΤΕΕΚΗΕΟ€Ε ΕΕΕΕΚΡΕΕΕνΕΝΕΑΟ8ΚΝΡΗΕΚΡΚΡΕΙ8ΝΙΝνΐνΕΕΕΚα8ΕΤΤΡΜϋΕΥΑΡΕΤΑΤΐνΕΓΕΝΚ \У1ТРСО8П8ТЕТ (8Еф ΙΡ Νο.60)

Первые 12 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укоро

- 11 018174 ченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного ЦК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому 1Ь-2.

Описание сегмента беШ81-1Ь-2-14: ОВЕ составной последовательности Ν81-Ι§Κ-ΙΕ-2: нуклеотиды 27-509. Донорный участок сплайсинга находится между нуклеотидами 56 и 57; акцепторный участок сплайсинга между нуклеотидами 559 и 560 (фиг. 1с).

Получение вируса и анализ экспрессии ЕБ-2 проводят, как описано в примере 1. Полученные вирусы названы ОНВ-1Ь-2-14.

Обнаружено, что экспрессия 1Ь-2 примерно в 17 раз выше, чем в случае беШ814Б-2-11 (см. фиг. 5). Таким образом, высокий уровень экспрессии с открытой рамкой считывания жирным шрифтом является реальностью.

Пример 3. Влияние последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга, на экспрессию 1Ь-2.

Для анализа влияния последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга, на экспрессию 1Ь-2 последовательности беШ814Б-2-11 и беШ814Б-2-14 дополнительно модифицируют.

беШ814Б-2-13 получают из беШ814Б-2-11 путем замены 8 нуклеотидов, расположенных ниже 5' границы интрона с /СТААСТАТ на /СТАОАТТО, как найдено в РВ8 N8 сегменте дикого типа (нуклеотиды, комплементарные 5' концу киРНК человеческого И1, показаны жирным курсивом, 5' граница интрона помечена знаком /). Последовательность бе1Ж14Б-2-13 показана на фиг. 16.

Сходным способом получают беШ814Б-2-21 из беШ814Б-2-14 путем замены последовательности /СТААСТСТ на /СТАТТТОС (нуклеотиды, комплементарные 5' концу киРНК человеческого И1, показаны жирным курсивом, 5' граница интрона помечена знаком /).

Последовательность беШ814Б-2-21 показана на фиг. 1е.

Таким образом, в обеих конструкциях гомология 5'-концу киРНК Ш уменьшена по сравнению с конструкциями-предшественниками.

Для беШ814Б-2-13 аминокислотная последовательность укороченного N81 белка следующая: \П)Р\ТУ881Т)У1)СТ1.\\'ВУВКВ (81 (С) ΙΌ Νο. 61)

Для беШ814Б-2-21 аминокислотная последовательность составного белка №1-сигнального пептида 1§К-1Ь-2 следующая:

ΜΟΡΝΤνδ ν-ΡΑ£1 ΠΚί,Ζ,Ζ. ΗΡΡ6Λ7ΪΕ

ΑΡΤ838ΊΚΚΤ0Ε()ΕΕΗΕΕΕΕΕ0ΜΙΕΝ('ίίΝΝΥΚΝΡΚΕΤΚΜΕΓΡΚ.ΡΥΜΡΚΚ₄Χ.ΤΕΕΚΕΙΕ0ΕΈ ΕΕΕΕΚΡΕΕΕνΕΝΕΑρδΚΝΓΗΕΚΡΒβΕΙδΝΙΝνίνΕΕΕΚΟδΕΤΤΓΜΟΕΥΑΟΕΤΑΤίνΕΡΕΝΚ ΨΠΤεΟδΙΙδΊΈΤ (8ΕΟ ΙΟ Νο.62)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного ЦК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому 1Ь-2.

Получение вирусов и анализ экспрессии 1Ь-2 проводят, как описано в примере 1. Полученные вирусы названы СНВ-1Ь-2-13 и СНВ-1Ь-2-21. Генетическую стабильность беШ814Б-2-13 и беШ814Б-2-21 сегментов анализируют после 5 последовательных пассажей на Уето клетках, как описано в примере 1.

Обнаружено, что уровни экспрессии ЕБ-2 выше у соответствующих конструкций, имеющих более низкую гомологию с 8пРНК и1 в районе донорного участка сплайсинга (см. фиг. 5). Обнаружено, что уровни экспрессии в случае СНВ-1Ь-2-13 примерно в 13 раз выше, чем в случае соответствующего вируса, проявляющего высокую гомологию с кпРНК и1 (СНВ-1Ь-2-13; 9,4 нг/мл по сравнению с 0,7 нг/мл; фиг. 5). Сходным образом обнаружено, что уровни 1Ь-2 в случае СНВ4Б-2-21 примерно в 2,6 раза выше, чем в случае СНВ-1Ь-2-14 (31,1 нг/мл по сравнению с 12,1 нг/мл; фиг. 5).

Таким образом, модифицируя последовательность в районе донорного участка сплайсинга N8, можно влиять на уровни экспрессии ЕБ-2.

В случае обоих вирусов беШ814Б-2-13 и беШ8 Ι-ΙΠ-2-21 полоски с результатами делеций не обнаружены после пяти последовательных пассажей, что указывает на генетическую стабильность.

Пример 4. Экспрессия ΙΤ-2 с отдельной открытой рамкой считывания: инициация трансляции с помощью консенсусной последовательности Козак.

Последовательность стоп- и старт-кодонов в бе№814Б-2-11 заменяют на консенсусную последовательность Козак (т.е. ТААТО замещен на ТААССССССАССАТС, стоп- и старт-кодоны помечены жирным шрифтом с подчеркиванием, 8ЕЦ ΙΌ N0. 63) с получением сегмента беШ814Б-2-17.

Нуклеотидная последовательность сегмента беШ814Б-2-17 показана на фиг. 11.

Получение вирусов и анализ экспрессии ГБ-2 для СНВ-[Б-2-17 проведены, как описано в примере 1. Обнаружено, что уровни экспрессии ЕБ-2 примерно в два раза выше, чем для СНВ4Б-2-11 (данные не приведены).

Пример 5. Экспрессия человеческого ΙΠ-15 с открытой рамкой считывания N81.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий ΙΠ-15, вставляют в модифицированный N8

- 12 018174 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо К1со/8/34, который не кодирует функциональный N81 белок. Для обеспечения секреции сДНК, кодирующую зрелый 1Б-15. присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) N81 белку, не меняя рамки считывания через модифицированный сигнальный пептид мышиного 1дК, получая следующую аминокислотную последовательность:

МОРКТУЗЗГОУ-ЕЛ££ ИТ£££ Ц'УРКХНСΝν.·Ά·*Νν[3ΟΕΚΚΤΓ:ηΤ.Ι03ΜΙΤΐηΑΤΤ.ΥΤΕ3ϋ\'ΊΙΡ8€ΚνΤΛΜΚ(::ΕΕΓΕΤ.0νί3ΕΕ3ΟϋΛ3ΙΗ □ΤνΕΝΠΙΕΑΝΝ8Ε88ΝΟΝνΤΕ3€ΓθΚΕίΈΕΕΕΕΚΝ1Κ.ΕΕΕ08Ε'νΗΐνθΜΕ1ΝΤ8 (ЗЕО ГО Νο.69)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного 1дК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому ΣΠ-15.

Полученный химерный сегмент 1Ь-15 N8 назван беШ81-1Ь-15-21.

Последовательность нуклеотидов беШ81-1Ь-15-21 показана на фиг. 1д.

Получение вируса проводят, как описано в примере 1.

Уровни экспрессии 1Ь-15 в супернатантах инфицированных Уего клеток анализируют с помощью ЕЬ18А и показывают, что они находятся в интервале 1-2 нг/мл.

Пример 6. Экспрессия человеческого СМ-С8Е с открытой рамкой считывания N81.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий СМ-С8Е, вставляют в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо Ктсо/8/34, который не кодирует функциональный N81 белок. Для обеспечения секреции зрелый СМ-С8Е присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) N81 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного 1дК, получая следующую аминокислотную последовательность:

М ОРУТ У88РфУ-Р А£ £ Й1££ / И1/>/?Л7/йАРАР8Р8Р8ТфР’Л'ЕНХТ\А1С)ЕАШ<ЕЬПЬ5№ТААЕМПЕТ\'ЕУ15ЕМЕОЬфЕРТСЬОТКЬЕ ЕУКфОЬК08ЬТКЬК6РЬТММА8НУКфНСРРТРЕТ8САТфПТРЕ8Р1Ж4ЬКОРЬЬУ1РРОС ХУВРУфЕ (8Еф Ю Νο.64)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного 1дК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому СМ-С8Р.

Полученный химерный сегмент 6М-С8Р и N8 назван беШ81-6М-С8Р-21. Последовательность нуклеотидов беШ81-6М-С8Р-21 показана на фиг. 111.

Пример 7. Экспрессия человеческого ССЬ-3 с открытой рамкой считывания N81.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий ССЬ-3 (М1Р-1а), вставляют в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо К1со/8/34, который не кодирует функциональный N81 белок.

Для обеспечения секреции зрелый ССЬ-3 присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) N81 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного 1дК, получая следующую аминокислотную последовательность:

ΜϋΡΝΤνδδΕφ У-РА££ ЯУ1.1К 9УУРЯ5НСАРЬААОТРТАССР8УТ8Кф1РфМР1АПУРЕТ88фС8КР8У1РЬТККОК.фУСАОР8ЕЕХУУфК УУ8Г)ЬЕЬ8А (8Еф ΙΟ Νο.65)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного 1дК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому ССЬ-3.

Полученный химерный сегмент ССЬ-3 N8 назван беШ81-ССЬ-3-21. Последовательность нуклеотидов беШ81-ССЬ-3-21 показана на фиг. 11.

Пример 8. Экспрессия человеческого ССЬ-20 с открытой рамкой считывания N81.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий ССЬ-20 (М1Р-3а), вставляют в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо Ктсо/8/34, который не кодирует функциональный N81 белок.

Для обеспечения секреции зрелый ССЬ-20 присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) N81 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного 1дК, получая следующую аминокислотную последовательность:

- 13 018174

ΜΟΡΝΤν88Ρ9ν-Κ4££»ν£££»νΡ1ϊ5ΗσΑ8ΝΕΠεθΕαΥΤΟΚΙΕΗΡΚΡΐν6ΡΤΚρΕΑΝΕ6ϋΟΙΝΆΙΙΕΗΤΚΚΚΕ8νθΑΝΡΚρΤ\ννΚΥΐν

ШЖЗККУККМ (8Ε0 ШΝο.66)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного 1дК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому ССЬ-20.

Полученный химерный сегмент ССЬ-20 N8 назван беШ81-ССЬ-20-21. Последовательность нуклеотидов беШ81-ССЬ-20-21 показана на фиг. 1ф

Уровни экспрессии ССЬ-20 в супернатантах инфицированных Уего клеток анализируют с помощью ЕЬ18Л и показывают, что они составляют примерно 25 нг/мл.

Пример 9. Экспрессия секретируемого Е8АТ-6 из МусоЬас1епит 1иЬегси1о818 с открытой рамкой считывания N81.

Последовательность сДНК, кодирующую Е8АТ-6 из МусоЬас1епиш 1иЬегси1о818, вставляют в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа А штамма Риейо Ктсо/8/34, который не кодирует функциональный N81 белок.

Для обеспечения секреции Е8АТ-6 присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) N81 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного 1дК, получая следующую аминокислотную последовательность:

ΜϋΡΝΤνδδΡφ У-ΡΑΖΖ, НПП. 1ТР85НСΜΤΕφφ\νΝΡΑ<3ΙΕΑΑΑ8ΑΙφΟΝνΤ8ΙΗ8ΕΕΟΕ<3Κφ8ΕΤΚΕΑΑΑΨΟ68Ο8ΕΑΥφθνφφΚ.

ΨΟΑΤΑΤΕΕΝΝΑΕφΝΕΑΚΤΙ8ΕΑΟφΑΜΑ8ΤΕ6ΝνΤΟΜΡΑ (8Еф ГО Νο.70)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного 1дК, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует Е8АТ-6.

Полученный химерный сегмент Е8АТ-6 N8 назван йе1Л81-Е8ЛТ-68-21. Последовательность нуклеотидов беШ81-Е8АТ-6б-21 показана на фиг. 1к.

Пример 10. Внутриклеточная экспрессия Е8АТ-6 из МусоЬас1епиш 1иЬегси1о818 с открытой рамкой считывания N81.

В отличие от примера 9 Е8АТ-6 прямо присоединяют (т.е. без аминокислотной последовательности, выступающей в роли сигнального пептида) к укороченному (11 аминокислотных остатков) N81 белку с получением следующей аминокислотной последовательности:

ΜΌ?^τν53Έ0ννΑΜΤΕΰβίνΝΡΑΰΙΕΑΑΑ8ΑΙΰΰΝνΤ5ΙΗ811βΕβΚΰείΤΚΡΑΑΑ»'ΰ(35 β^ΕΑΥρΰΡββΚΙΕΟΑΤΑΤΕίΝΝΑΙβΝΙΑΙΙΤΙΙΙΕΑΰβΑΜΑ^ΤΕαΝΡΤβΜΕΑ ОШ ГО Νο.71)

Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному N81 белку, аминокислотная последовательность, показанная жирным курсивом, соответствует Е8АТ-6.

Полученный химерный сегмент Е8АТ-6 N8 назван беШ81-Е8АТ-61-21. Последовательность нуклеотидов бе1Н81-Е8АТ-6|-21 показана на фиг. 11.

Пример 11. Экспрессия 1Ь-2 с открытой рамкой считывания N81 с применением альтернативных последовательностей сигнальных петидов.

Сегмент беШ81-1Ь-2-21 (пример 3) модифицируют путем замены части последовательности мышиного сигнального пептида 1дК другими последовательностями. Для получения йе1Л81-1Ь-2-23 аминокислотную последовательность ЬЬ\УУЬЬЬ\УУРС8ТС (8ЕС Ш №. 58) в йе!Л81-1Ь-2-21 заменяют последовательностью ^УЬЕ1ЬЬЬЕЬЕЬРВ8НС (8ЕС Ш №. 72) с получением аминокислотной последовательности

ΜΏΡΝΤν85Ρ(}νΡΑ ν/νίΡ I ΕΕΕΡΕΓΕΡΚ.ΞΗ6

ΑΡΤ888ΤΚΚΤ^^^^ΕΗ^^^^^^ΜI^N^INNΥΚNΡΚ^ΤΚΜ^ΤΡΚΡΥΜΡΚΚΑΤΕ^ΚΗ^^С ΕΕΕΕΕΚΡΕΕΕνΕΝΕΑφ5ΚΝΡΗΕΚΡΚΓ>ΕΙ5ΝΙΝνΐνΕΕΕΚ08ΕΤΤΡΜΟΕΥΑΟΕΤΑΤΐνΕΡ ΕΝΚ.ΨΙΤΡΟφ8Π8ΤΕΤ (5Ε(} ГО Νο. 73).

Нуклеотидная последовательность беШ81-!Ь-2-23 показана на фиг. 1т.

- 14 018174

Для получения 60^81-^-2-24 аминокислотную последовательность ЕЕ^'УЕЕЕ^У^ГРС8ТС (8ЕО Ш №. 58) в 62^81-^-2-21 заменяют последовательностью АСААЬЬАЬЬААЬЬРА8ВА (8Е0 Ш №. 74), полученной из сигнального пептида человеческого эпидермального ростового фактора (БЕСЕ) (МИР8СТАСААЕЕАБЕААЕСРА8ИА (8Е0 Ш №. 75)) с получением аминокислотной последовательности

МОРМТУ88РфУРААОААЕЬАЬЬААЕЕРА8КААРТ888ТККТрЬрЬЕНЬЬЬОЬфМ1ЬК ΟΙΝΝΥΚΝΡΚΕΤΚΜΕΤΡΚΡΥΜΡΚΚΑΤΕΕΚΗΕφεΕΕΕΕΕΚΡΕΕΕνΓΝΕΑφδΚΝΡΗΕΚΡΒ ΏΕΙδΝΙΝνίνΕΕΕΚΟδΕΤΤΡΜεΕΥΑΠΕΤΑΤίνΕΡΕΝΒΨΙΤΡΟΟδΙΙδΤΕΤ (8Ер ГО Νο.76).

Нуклеотидная последовательность 6е1Ы81-1Е-2-24 показана на фиг. 1п.

Получение вирусов проводят, как описано в примере 1.

Уровни экспрессии 1Ь-2 в супернатантах инфицированных Vе^ο клеток исследуют с помощью ЕБ18А.

Таким образом, часть сигнального пептида мышиного 1§К может быть заменена другими последовательностями, действующими в качестве сигнального пептида.

Пример 12. Модификация последовательностей, окружающих донорный и акцепторный участки сплайсинга, влияет на эффективность сплайсинга N8.

Для анализа влияния последовательностей, окружающих границы интрона, на эффективность сплайсинга, последовательность 6е1Ы81-1Е-2-10 (см. пример 1) дополнительно модифицируют. 6еШ811Ь-2-12 получают из бе1Ы81-1Е-2-10 путем замены 8 нуклеотидов, расположенных ниже 5' границы интрона с 1СТААСТАТ на /СХАСА7ТС, как обнаружено в РВ8 N8 сегменте дикого типа (нуклеотиды, комплементарные 5'-концу кпРНК человеческого И1, показаны жирным курсивом, 5' граница интрона помечена знаком /). В остальном нуклеотидная последовательность 6е1Ы81-1Е-2-12 идентична последовательности 6е1Ы81-1Е-2-10.

Вирус получают, как описано в примере 1.

Генетическую стабильность сегмента 6е1Ы81-1Е-2-12 анализируют после пяти последовательных пассажей, как описано в примере 1. Обнаружены ясные полоски результатов делеций (данные не приведены).

Для анализа эффективности сплайсинга Vе^ο клетки инфицируют совместно четырьмя плазмидами, экспрессирующими белки РВ1, РВ2, РА и №, вместе с плазмидой, экспрессирующей уРНК 6е1Ы81-1Е-210, 6е1Ы81-1Е-2-11 (см. пример 1), беШ8 1-1Б-2-12 или 6е1Ы81-1Е-2-13 (см пример 3).

Через 24 ч мРНК экстрагируют из трансфицированных клеток и анализируют на наличие мРНК бе1Ы81-1Е-2 с прошедшим сплайсингом и без сплайсинга с помощью ПЦР в реальном времени.

В следующей таблице суммированы модификации последовательностей, проведенные от 3' до донорного участка сплайсинга или от 5' до акцепторного участка сплайсинга, а также генетическая стабильность и уровни экспрессии 1Ь-2 (уровни экспрессии 1Ь-2 в случае бе1Ы81-1Е-2-10 и 6е1Ы81-1Е-2-12 не приведены, поскольку оба сегмента оказались генетически нестабильными).

Сегмент	4е1№1-1Ь- 2-12	άβΙΝδΙ-Ιί-ί-ΙΟ	4е1К81-П_-2-13	®1Ν81-1Б-2-11
Последовательность от 3’ до донорного участка сплайсинга	ДИКОГО типа	модифицированная	дикого типа	модифицированная
Последовательность от 5’ до акцепторного участка сплайсинга	дикого типа	дикого типа	модифицированная	модифицированная
Генетическая стабильность	нет	нет	да	да
Экспрессия 1Ь-2	не определяли	не определяли	Янг	700 нг

Как показано на фиг. 7, сплайсинг мРНК 6е1Ы81-1Е-2 можно изменять путем модификации последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга или последовательности от 5' до акцепторного участка сплайсинга.

Оказалось также, что увеличение эффективности сплайсинга выше определенного порогового уровня, необходимое для достижения генетической стабильности, снижает экспрессию 1Ь-2 (см 6еШ811Б-2-13 по сравнению бе1Ы81-1Е-2-11).

Пример 13. Экспрессия человеческого интерлейкина-2 с отдельной рамкой считывания вируса гриппа типа В.

Последовательность сДНК, кодирующую человеческий 1Ь-2, помещают в модифицированный N8 сегмент вируса гриппа типа В штамма В№1еппа/33/06. Белок N81 заканчивается после аминокислотного остатка 38 путем введения искусственного стоп-кодона и таким образом не содержит ни домена связывания РНК, ни С-концевого домена N81.

Для осуществления трансляции !Ь-2 искусственно вставленный стоп-кодон для N81 перекрывается

- 15 018174 со стартовым кодоном для 1Б-2 с получением последовательности ТЛЛТС. Схема экспрессии представлена на фиг. 8. В этой конструкции ^N81-38^-2) сДНК 1Б-2, включая перекрывающийся стоп- и/или старт-кодон, замещает нуклеотиды 159-728 сегмента N8 дикого типа, соответствующие аминокислотным остаткам 38-228 белка N81.

В такой конструкции синтетическая последовательность из 29 нуклеотидов, включающая петлеобразную консенсусную последовательность с последующей пиримидиновой цепочкой из 20 нуклеотидов, замещает природный акцепторный участок сплайсинга плюс природную пиримидиновую цепочку по аналогии с конструкцией на основе вируса гриппа типа А беШ81-1Ь-2-11.

Описание сегмента АЫ81-381Ь-2, как показано на фиг. 8: ОКБ укороченного N81 состоит из нуклеотидов 45-158; ОКБ человеческого 1Б-2 состоит из нуклеотидов 161-619; 5' граница интрона находится между нуклеотидами 77 и 78, 3' граница интрона находится между нуклеотидами 657 и 658.

Получение плазмид и вирусов

Плазмиды для вируса гриппа типа В получают аналогично плазмидам гриппа типа А с применением стандартных техник клонирования. НА и NА, полученные из адаптированного к Уего клеткам вируса гриппа штамма В/Тйиппдеп/2/06 и сегменты РА, РВ1, РВ2 и ИР, полученные из адаптированного к Уего клеткам вируса гриппа штамма В/У1еииа/33/06, клонируют в рН\У2006. Все плазмиды секвенируют для подтверждения отсутствия нежелательных мутаций.

Вирус гриппа, экспрессирующий 1Б-2, получают, как описано для вируса гриппа типа А, и называют АN81-38I^2.

Анализ стабильности вируса

Химерные 1Б-2 вирусы гриппа, полученные прямо после трансфекции, последовательно пассируют четыре раза на Уего клетках. РНК экстрагируют с помощью набора У1га1 Атр (О1адеп) и проводят обратную транскрипцию. Целые N8 сегменты амплифицируют с помощью ПЦР и подвергают электрофорезу в агарозном геле для оценки присутствия делеций. Продукты ПЦР, полученные с образцами вируса Л\81-3811-2 после 1 и 4 пассажей, мигрируют соответственно ожидаемым размерам, что указывает на стабильность 1Б-2 экспрессирующего вектора.

Иммуногенность у мышей

Для исследования иммуногенного потенциала мышей иммунизируют дозой 1 х 10⁵ ТСШ50/мышь вирусом гриппа В дикого типа, Л\81-38112, ΔN81-38 (контрольный вирус, полученный по сходному €^N81-38^-2 способу, но без вставки 1Б-2) или РВ8 в качестве контроля. Через четыре недели после иммунизации мышам вводят инфицирующую дозу 1х10⁵ ТСШ50/мышь гомологичного вируса гриппа В дикого типа. Через три дня после инфицирования мышей забивают и исследуют репликацию вируса в легких и носовых раковинах. У мышей, которых иммунизировали вирусом гриппа дикого типа, легкие и носы защищены от инфекции, тогда как у контрольной группы мышей, получивших РВ8, титры вируса примерно 3 1о§5 обнаружены как в носовых, так и легочных тканях. При дозе 1х 10⁵ ТСШ₅₀/мышь ни одна из мышей, иммунизированных АЫ81-38, не была защищена от вируса гриппа дикого типа, демонстрируя носовые и легочные ткани, сравнимые с таковыми у неиммунизированных животных. В отличие от этого вирус нельзя было изолировать ни из одной мыши, иммунизированной Л\81-38112 в такой же дозе, что указывает на развитие у мышей защиты от вируса.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вирус гриппа с нарушенной репликацией, включающий:

а) модифицированный N8 сегмент, кодирующий N81 белок, включающий по меньшей мере 10 N концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, и

б) гетерологичную последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленную в N8 сегмент гена.
2. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.1, включающий до 14, предпочтительно до 30 аминокислотных остатков с №конца N81 белка.
3. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1 или 2, в котором удалены аминокислотные остатки 134-161 или аминокислотные остатки 117-161.
4. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-3, включающий сигнальный пептид или его часть, присоединенную к С-концу N81 белка.
5. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-4, в котором гетерологичная последовательность экспрессируется с открытой рамкой считывания N81 с другой открытой рамки считывания.
6. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-5, в котором гетерологичную последовательность выбирают из группы, состоящей из биологически активных белков, их антигенов или производных или фрагментов.
7. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-6, в котором гетерологичная после

- 16 018174 довательность представляет собой антиген, хемокин, цитокин или их производное или фрагмент, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из МусоЬас!егшш !иЬегси1ок1к, 1Ь-2, ОМ-С8Р, ЕЬ-15, М1Р1а и М1Р3а, Е8АТ-6 или их фрагмента или производного.
8. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.4-7, в котором гетерологичная последовательность включает сигнальный пептид, полученный из легкой цепи антитела, предпочтительно из κ-цепи иммуноглобулина (1дК), более предпочтительно из 1дК цепи мыши.
9. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.8, в котором сигнальный пептид 1дК включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, предпочтительно включает последовательность МЕТОТЬЬЬ^УЬЬЬ^УРС8ТСЭ (8ЕО Ш №. 11), или М1ЕТ1УП.ЕЕХУ УЕЕЕ\\'УРВ811С> (8ЕЕ) ГО №. 82), или ее часть.
10. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-9, в котором трансляция указанного N81 белка заканчивается с помощью по меньшей мере одного стоп-кодона и экспрессия указанной гетерологичной последовательности инициируется старт-кодоном.
11. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-10, в котором открытая рамка считывания гетерологичной последовательности, по меньшей мере, частично перекрывается с открытой рамкой считывания N81.
12. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-11, в котором трансляция с открытой рамки считывания гетерологичной последовательности инициируется последовательностью перекрывающихся стоп-старт-кодонов, которая предпочтительно представляет собой ТААТО (8ЕО Ш №. 81) или ИААИО (8ЕЕ) ГО №. 53).
13. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-12, содержащий измененную последовательность, расположенную после донорного участка сплайсинга и/или перед акцепторным участком сплайсинга в N8 сегменте.
14. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-13, включающий последовательность 8ЕО Ш №. 1-10, 67, 68 или по меньшей мере на 98% гомологичную им.
15. Вакцина, включающая вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14.
16. Применение вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для терапевтического лечения больных.
17. Вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14.
18. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии трансформации клеток, предпочтительно Уего клеток, вектором по п.17 предпочтительно вместе с очищенным препаратом В№ комплекса вируса гриппа, необязательно инфицирования трансфецированных клеток вспомогательным (хелперным) вирусом гриппа, инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса и отбора трансформированных клеток, которые экспрессируют модифицированный N8 ген и гетерологичную последовательность.
19. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии трансфецирования клеточной линии, предпочтительно линии Уего клеток, ДНК вектором, включающим модифицированный N8 ген, лишенный функционального домена связывания РНК, и гетерологичную последовательность, помещенную между функциональным донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга N8 гена;

отбора трансфецированных клеток, которые продуцируют вирус, экспрессирующий модифицированный N8 ген и гетерологичную последовательность, инфицирования отобранных клеток требуемым вирусом гриппа, инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса, содержащего гетерологичный белок, отбора и сбора указанного потомства вируса, содержащего гетерологичный белок.
20. Модифицированный N8 сегмент гена, кодирующий N81 белок, включающий по меньшей мере 10 ^концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, а гетерологичная последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленная в N8 сегмент гена, дополнительно содержит сигнальный пептид, присоединенный к С-концу указанного N81 белка, где указанный сигнальный пептид предпочтительно состоит из 8-50 аминокислотных остатков.
21. Модифицированный N8 сегмент по п.20, в котором сигнальный пептид получен из легкой цепи антитела, предпочтительно из κ-цепи иммуноглобулина, более предпочтительно из 1дК цепи мыши или

- 17 018174 ее производного, где предпочтительно указанный сигнальный пептид 1дК включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков и предпочтительно включает последовательность МЕТПТЬЬЬ^УЪЬЬ^УРС8ТСП (8ЕО ΙΌ №. 11), или \1ЕТ1)Т1.1.1.\\'\1.1.1.\\'УРН8НС1 (8ЕЕ) ΙΌ №. 82), или ее часть.