KR20190123298A - 인플루엔자 ｂ 바이러스 변이체들과 그것들의 용도들 - Google Patents

인플루엔자 ｂ 바이러스 변이체들과 그것들의 용도들 Download PDF

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KR20190123298A
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Abstract

본 발명은 변이체 바이러스들, 그리고 특히 변이체 인플루엔자 바이러스들에 관련된 조성물들과 방법들에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 변이체 바이러스들은 변이체 BM2 시퀀스들을 포함하고, 예컨대 백신들로서 면역원성 조성물들에서 유용하다. 본 명세서에서는 바이러스 변이체들을 전파시키기 위한 방법들, 조성물들 및 셀들이 개시되어 있고, 예방 접종과 관련된 방법들, 장치들 및 조성물들이 또한 개시된다.

Description

인플루엔자 Ｂ 바이러스 변이체들과 그것들의 용도들
본 출원은 전문이 본 명세서에 참조로 통합되어 있고, 2017년 2월 27일 출원된 미국 출원 62/463,994호의 우선권의 이익을 주장한다.
인플루엔자는 미국 성인들의 주요 사망 원인이다. 매년 약 3만 6천 명이 인플루엔자로 사망하고 20만 명 이상이 입원한다. 독감은 기침, 재채기, 그리고 문 손잡이와 전화기 같은 바이러스를 옮기는 물체와 직접 신체 접촉을 통해 퍼지는 전염성이 강한 질병이다. 인플루엔자의 증상은 발열, 극심한 피로, 두통, 오한, 그리고 몸살을 포함한다; 약 50퍼센트의 감염자들은 아무런 증상도 없지만 여전히 전염성이 있다. 면역법은 순환하는 바이러스 균주의 항원이 백신의 그것과 일치하는 한 65세 미만의 건강한 사람들의 인플루엔자 예방에 50-60% 효과적이다.
백신은 인플루엔자를 예방하는 주요 방법이며, 현재 실시간 약독화된 및 비활성(살해) 바이러스 백신을 모두 이용할 수 있다. 일반적으로 내성적으로 투여되는 살아있는 바이러스 백신은 면역 시스템의 모든 단계를 활성화시키고 여러 개의 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 살아있는 바이러스의 사용은 활성화되지 않은 바이러스 백신을 준비하는 동안 발생할 수 있는 바이러스 항원의 파괴 문제를 극복한다. 또한, 살아있는 바이러스 백신에 의해 생산된 면역성은 일반적으로 비활성 백신에 의해 유발된 것보다 더 내구성이 좋고, 효과적이며, 상호 반응성이 더 높으며, 살아있는 바이러스 백신은 비활성 바이러스 백신에 비해 생산 비용이 덜 든다. 그러나 약독화 바이러스의 변이체는 종종 잘못 정의되어 있고, 반전이 우려된다.
일 양태에서, 본 개시물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 제공한다. 일부 실시예들에서, BM2 유전자에서의 변이체는 BM2 단백질을 발현하기 위해 바이러스의 장애(failure)를 초래하거나 상기 바이러스로 하여금 절단된 BM2 단백질(truncated BM2 protein)을 발현하게 한다. 일부 실시예들에서, 변이체 BM2 유전자는 시험관 내 호스트 셀 시스템(in vitro host cell system)에서 적어도 10개의 통로(passage)들을 위한 기능성 BM2 단백질을 암호화하는 야생형(wild-type) 시퀀스 또는 비야생형 시퀀스로 되돌리지 않고, 상기 호스트 셀은 상기 변이체 유전자의 기능성 버전(functional version)을 생성하기 위해 변형됨으로써 상기 바이러스에 유전자 생성물(gene product)을 트랜스 방식으로(in trans) 제공한다. 일부 실시예들에서, 재조합 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에서의 면역 반응을 이끌어낸다. 일부 실시예들에서, 재조합 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에 대해 비병원성(non-pathogenic)이다. 일부 실시예들에서, 시험관 내 셀 시스템은 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 셀들 또는 베로 셀(Vero cell)들을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시물은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시예들에서, BM2 유전자의 돌연변이는 상기 BM2 단백질을 발현하기 위해 상기 바이러스의 장애를 초래하거나, 상기 바이러스로 하여금 절단된 BM2 단백질을 발현하게 한다. 일부 실시예들에서, 이러한 바이러스는 그러한 바이러로 감염되는 포유동물에서의 면역 반응을 이끌어낸다. 일부 실시예들에서, 그러한 바이러스는 바이러스로 감염되는 포유동물에 대해 비병원성이다. 일부 실시예들에서, 조성물은 보조제(adjuvant)를 더 포함한다.
일 양태에서, 본 개시물은 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 전파하기 위한 방법을 제공하고, 이러한 방법은 호스트 셀과 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고, 상기 호스트 셀은 상기 인플루엔자 BM2 유전자의 기능성 버전을 생성하기 위해 변형됨으로써 상기 바이러스에 유전자 생성물을 트랜스 방식으로 제공한다. 일부 실시예들에서, 이러한 방법은 자 바이러스 입자(progeny virus particle)들을 격리시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 이러한 방법은 바이러스 입자들을 백신으로 제형화하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 바이러스는 상기 BM2 단백질을 발현하는데 장애를 일으키거나, 절단된 BM2 단백질을 발현하는데 장애를 일으킨다. 일부 실시예들에서, 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에서의 면역 반응을 이끌어낸다. 일부 실시예들에서, 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에 대해 비병원성이다. 일부 실시예들에서, 변이체 BM2 유전자는 상기 호스트 셀의 적어도 10개의 통로들을 위한 기능성 BM2 단백질을 암호화하는 야생형 시퀀스 또는 비야생형 시퀀스로 되돌리지 않는다. 일부 실시예들에서, 호스트 셀은 MDCK 셀 또는 베로 셀이다.
일 양태에서, 본 개시물은 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 전파하기 위한 방법을 제공하고, 이러한 방법은 호스트 셀과 SEQ ID NO: 33을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고, 상기 호스트 셀은 상기 인플루엔자 BM2 유전자의 야생형 버전을 생성하기 위해 변형됨으로써 상기 바이러스에 BM2 유전자 생성물을 트랜스 방식으로 제공한다.
일 양태에서, 본 개시물은 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 전파하기 위한 방법을 제공하고, 이러한 방법은 호스트 셀과, SEQ ID NO: 33을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고, 상기 호스트 셀은 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, 및 SEQ ID NO: 32로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 A M2 및 인플루엔자 B BM2 유전자의 키메릭 버전(chimeric version)을 생성함으로써 키메릭 M2:BM2 유전자 생성물을 상기 바이러스에 트랜스 방식으로 제공하게 변형되는 베로 셀이다.
일 양태에서, 본 개시물은 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 전파하기 위한 방법을 제공하고, 이러한 방법은 호스트 셀과, SEQ ID NO: 33을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고, 상기 호스트 셀은 SEQ ID NO: 27을 포함하는 BM2 유전자의 코돈 최적화되는 버전(codon-optimized version)을 생성함으로써 BM2 유전자 생성물을 상기 바이러스에 트랜스 방식으로 제공하게 변형되는 베로 셀이다.
일 양태에서, 본 개시물은 변이체 BM2 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시물은 재조합 인플루엔자 바이러스를 전파하기 위한 호스트 셀을 제공하고, 이러한 호스트 셀은 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, 및 SEQ ID NO: 32로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 cDNA 시퀀스에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 생성하기 위해 변형되는 베로 셀이다. 일부 실시예들에서, 재조합 인플루엔자 바이러스는 SEQ ID NO: 33에 발현되는 바와 같은 변이체 M2 유전자를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스이다. 일부 실시예들에서, 재조합 인플루엔자 바이러스는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6에 발현되는 바와 같은 변이체 BM2 유전자를 포함하는 인플루엔자 B 바이러스이고, 상기 베로 셀은 SEQ ID NO: 27에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 생성하기 위해 변형된다.
도 1은 도 1은 인플루엔자 바이러스 라이프 사이클에서의 BM2 이온 채널의 역할을 묘사하는 그림으로서, (1) 이러한 인플루엔자 바이러스는 셀 표면 상의 시알산 수용기들에 들러 붙고; (2) 그러한 바이러스는 셀 내로 내화되며; (3) M2 이온 채널은 바이러스 표면 상에서 발현되고; (4) M2 이온 채널은 핵으로 들어가는 바이러스 RNA이 방출을 가져오는 양성자가 진입하는 것을 허용하기 위해 열리고, 복제되며, 바이러스 단백질 합성을 초래하며; (5) 바이러스 성분들은 비리온(virion)들로 포장되어 방출된다(6).
도 2는 야생형(WT) B/FL/04/2006의 인플루엔자 게놈 세그먼트 7와 6개의 변이체 BM2 유전자들(BM2SR(BM2SR-0이라고도 함), BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, BM2SR-5)의 개략도이다. 펜타뉴클레오티드 변환 정지-시작(start-stop) 영역은 TAATG로 표시된다. BM2SR-0과 BM2SR-1 변이체는 모두 BM2 개방형 판독 프레임(ORF)을 완전한 삭제를 포함한다. BM2SR-2 변이체는 M1 변환 조절 요소들을 손대지 않츤 채 BM2 삭제를 포함한다. BM2SR-3 변이체는 BM2 ORF와 M1 M86V 변이체를 완전히 삭제하는 것을 포함한다. BM2SR-4 변이체는 부분적인 BM2 삭제을 포함하며 M1 변환 조절 요소는 손대지 않은 채로 유지된다. BM2SR-5 변이체는 M1 변환 조절 요소를 손대지 않은 채로 둔 부분적인 BM2 삭제와 M1 M86V 변이체를 포함한다.
도 3은 MFold RNA 접이식 알고리즘을 사용하여 모델링한 인플루엔자 B 세그먼트 7 mRNA 펜타뉴클레오티드 영역의 접이식 모델을 보여준다. 펜타뉴클레오티드 변환 정지-시작 영역은 브래킷으로 표시된다. 야생형 모델은 B/FL/04/2006의 인플루엔자 게놈 세그먼트 7을 포함한다. BM2SR-1 변이체는 BM2 개방형 판독 프레임(ORF)을 완전히 삭제하는 것을 포함한다. BM2SR-2 변이체는 M1 변환 조절 요소를 손대지 않은 채로 둔 BM2 삭제를 포함한다.
도 4는 인플루엔자 B 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블록(western blot)이다. 야생형(WT) 베로 셀들은 셀당 2개 이상의 MOI(multiplicity-of-infection)에서 인플루엔자 B 바이러스 변이체에 감염되었다. B/Lee/1940 및 B/Florida/4/2006은 야생형 대조 표준들로 사용되었다. 세포질 단백질은 감염 후 6시간 동안 추출한 후 SDS-PAGE를 받아 PVDF 블롯(blot)들로 옮겨졌다. 블롯은 웨스턴 분석에 의해, 1) 인플루엔자 B HA 단백질(상단 패널), 2) 인플루엔자 B M1 단백질(중단 패널), 3) 포유류 GAPDH 단백질 부하 제어(하단 패널)에 대해 특정된 3가지 항혈청으로 순차적으로 테스트되었다.
도 5a 및 도 5b는 B/Brisbane/60 및 B/WI/01 HA를 사용하는 BM2SR 변이체 바이러스들의 성장 곡선을 보여주는 차트들이다. BM2 베로 셀들(BM2 단백질을 발현하는 베로 셀들)에서 성장한 인플루엔자 B BM2SR 바이러스들의 배양액이 BM2 베로 배양 상청액의 TCID50 적정화에 의해 바이러스 복제에 대해 시험되었다. 적정화는 BM2CK 셀들(BM2를 발현하는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 셀들)에서 수행되었다. B/Brisbane/60/2008(B/Bris/60): #7, #8, #9, #15, #21, 및 #33으로부터 HA 및 NA를 발현하는 6개의 BM2SR 변이체 바이러스들과, B/Wisconsin/01/2010(B/WI/01): #10, #11, #12, #16, #23, 및 #24의 HA와 NA를 발현하는 6개의 BM2SR 바이러스들이 테스트되었다. 변이체 바이러스들 #21, #22, #23, 및 #24에 대해서는, 변이체 바이러스들 #7, #8, #9, #11, 및 #12가 더 큰 삭제(즉, 더 짧은 mRNA 시퀀스들)를 함유하고 있으며 더 느린 성장을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 BM2CK 및 MDCK 셀들에서의 BM2SR-WI01(즉, B/Wisconsin/01/2010의 HA 및 NA를 발현하는 BM2SR)의 안정성을 보여주는 차트들이다.
도 7은 SEQ ID NO: 6을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 BM2SR-0 변종들(BM2SR-Bris60 및 BM2SR-WI01)을 접종한 후 생쥐 체중의 변화를 보여주는 차트이다.
도 8a 및 도 8b는 SEQ ID NO: 6을 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 BM2SR-0 변종들(BM2SR-Bris60, BM2SR-WI01)을 접종한 생쥐에서의 항-HA IGg 항체 반응들을 보여주는 차트들이다. 프라임 접종 후 7일, 14일, 21에, 그리고 28일째에서의 2차 예방 주사 후 35일, 45일, 및 49일에 혈청 샘플이 채취되었다.
도 9는 M2- 및 BM2-발현 MDCK 셀 기질(M2CK 및 BM2CK)에서의 M2-결핍 인플루엔자 A M2SR(A/CA/07 M2SR 및 A/Brisbane/10 M2SR)과 BM2-결핍 인플루엔자 B M2SR(B/WI/01 BM2SR 및 B/Brisbane/60 BM2SR) 균주들의 성장을 보여주는 차트이다.
도 10은 인플루엔자 A M2와 인플루엔자 B M2(BM2) 키메릭(chimeric) 융합 구조들을 보여주는 개략도이다.
도 11은 BM2-결핍 인플루엔자 B(BM2SR) 바이러스의 구출(rescue)을 지원하기 위한 M2 및 BM2 키메라들(chimeras)의 능력을 보여주는 차트이다. BM2 결핍 바이러스는 플라스미드들을 사용하여 293T 셀들에서 M2의 키메릭 형태들을 일시적으로 공급하는 표준 인플루엔자 구조 기법들에 의해 생성되었다. 293T 인플루엔자 BM2SR RG 상청액에 의해 생산적으로 감염되는 BM2CK TC96 웰(well)들의 백분율은 WHO HA 분석에 의해 결정되었다.
도 12는 코돈에 최적화된 야생형 BM2와 키메릭 M2 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 모든 M2 단백질은 계산된 분자량(MW)보다 큰 약 5,000개의 달톤(Dalton)으로 나타내게 사용된 SDS-PAGE 시스템에서 변형된 이동성을 보인다. ㅂ변이체들인 ABB, AAB, AA2FB는 더 큰 인플루엔자 A 엑토도메인(ectodomain)을 함유하므로 그에 상응하여 더 큰 명백한 MW에서 SDS-PAGE로 이동한다.
도 13은 인플루엔자 A/Brisbane/10 M2SR 및 인플루엔자 B/Brisbane/60 M2SR M2-결핍 바이러스들에 감염된 지 6일 후에 인플루엔자 A M2: 인플루엔자 B M2(AM2:BM2) 키메릭 단백질들을 발현하는 베로 셀 기질들에서의 M2-결핍 인플루엔자 A CA/07/H1N1pdm M2SR의 바이러스 역가(titer)를 보여주는 차트이다.
도 14는 M2-발현 M2CK와 BM2-발현 베로 셀 기질들에서 M2-결핍 인플루엔자 A CA/07/H1N1pdm M2SR의 성장을 보여주는 차트이다.
도 15a는 인플루엔자 A 매트릭스 M1 면역 블록(immunoblot)이다.
도 15b는 M2-발현 M2CK와 BM2-발현 BM2 Vero 세포 기질들에서 생성된 인플루엔자 A M2SR 바이러스의 M2 단백질 함량과 아이덴티티(identity)를 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 16a 내지 도 16d는 M2SR과 BM2SR 변이체가 다가 제형들로 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스에 대항하여 항체 반응을 이끌어내는 것을 보여주는 차트들이다. 대표적인 M2SR 및 BM2SR 구성들은: A/MA15는 H1N1 M2SR, A/HK4801은 H3N2 M2SR, B/CA12는 B Yamagata BM2SR-4, B/Bris46은 B Victoria BM2SR-4이다. 4가("quad") 제형은 네 가지 모두를 혼합한 것이다. 3가("tri")는 표시된 3가지 바이러스들의 제형이다.
도 16e 내지 도 16f는 각각 치사량 인플루엔자 B 공격(challenge) 후, 1가 BM2SR, 3가, 및 4가 제형들로의 접종 후의 생쥐 체중 변화 및 생존을 보여주는 차트들이다.
도 17a 및 도 17b는 BM2 단백질(도 17a)과 BM1 단백질(도 17)에 대한 B/Lee/40과 최근의 인플루엔자 B 바이러스들 사이의 진화 관계를 보여주는 계통수들이다.
도 18은 BM2SR과 4가 백신들에서 인플루엔자 A와 B 항원들에 대해 이끌어내진 효소연계 면역측정기(ELISA)를 보여주는 차트이다.
도 19a는 BM2SR 및 4가 백신에서 인플루엔자 A와 B 항원들에 대해 이끌어내어진 혈구응집반응 억제(HAI)를 보여주는 차트이다.
도 19b는 접종 후 35일차에 풀링된(pooled) 혈청들에서 BM2SR 및 4가 백신들에 대해 이끌어내어진 HAI 역가들을 보여주는 표이다.
도 20은 인플루엔자 A 공격 후 1, 3, 5, 및 7일째의 세비액 바이러스 역가들을 보여주는 차트이다.
도 21a는 인플루엔자 A 공격 후 3일째의 비갑개 조직에서의 바이러스 역가를 보여주는 차트이다.
도 21b는 인플루엔자 A 공격 후 3일째의 기관 조직에서의 바이러스 역가를 보여주는 차트이다.
도 21c는 인플루엔자 A 공격 후 3일째의 폐 조직에서의 바이러스 역가를 보여주는 차트이다.
도 22a는 0.001의 MOI에서 베로(WT-Vero), M2-발현 베로(M2VeroA), 및 BM-2-발현(BM2Vero) 베로 셀 라인들의 야생형 인플루엔자 A/Hong Kong/2014(H3N2) 및 M2SR AHong Kong/2014(H3N2) 바이러스 감염의 결과들을 보여주는 차트이다. 배양 상청액의 부분 표본들은 접종 후 시점(t=1, 2, 3, 4일)에서 철회되어 동결되었다. 부분 표본들은 M2CK 셀들에서 TCID50 검사에 의해 바이러스 복제에 대한 테스트를 받았다. 검출 가능한 복제가 없는 샘플들은 log10 TCID50 = 1.50으로 표시된다. 검출 log10 TCID50 = 1.67의 평가 한계는 점선과 같이 도시되어 있다.
도 22b는 0.001의 MOI에서 베로(WT-Vero), M2-발현 베로(M2VeroA), 및 BM-2-발현(BM2Vero) 베로 셀 라인들의 야생형 인플루엔자 B/CA/12/2015(YL) 및 BM2SR4 B/CA/2015 바이러스 감염의 결과들을 보여주는 차트이다. 배양 상청액의 부분 표본들은 접종 후 시점(t=1, 2, 3, 4일)에서 철회되어 동결되었다. 부분 표본들은 BM2CK 셀들에서 TCID50 검사에 의해 바이러스 복제에 대한 테스트를 받았다. 검출 가능한 복제가 없는 샘플들은 log10 TCID50 = 1.50으로 표시된다. 검출 log10 TCID50 = 1.67의 평가 한계는 점선과 같이 도시되어 있다.
Ⅰ. 정의들(Definitions)
다음의 용어들이 본 명세서에서 사용되고, 이들의 정의가 지침(guidance)을 위해 제공된다.
본 명세서에서 사용된 것처럼, 단수 형태들인 "a", "an" 및 "the"는 단수형만을 가리키기 위해 일부러 표기되지 않는 한, 단수형태와 복수형태 모두를 가리킨다.
약(about)이라는 용어에 의해 한정되거나 한정되지 않건 간에, "약(about)"이라는 용어와 그 사용 범위들은 일반적으로 파악되는 숫자가 여기에 표현된 정확한 숫자로 제한되지 않고, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 실질적으로 인용된 범위 내에 있는 범위들을 가리키는 것으로 의도되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, "약"은 당업자들에 의해 이해될 것이고, 그것이 사용되는 상황(context)에서 어느 정도까지는 다양하게 사용될 것이다. 만약 당업자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 그것이 사용되는 상황이 주어지는 경우 존재한다면, "약"은 그 특별한 용어의 ±10%까지 의미하게 될 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바이러스와 함께 사용된 "약독화된(attenuated)"이라는 용어는, 아직 여전히 생명력 있거나 살아 있는 약독화되지 않은 대응물에 비해, 독성 또는 병원성이 감소한 바이러스를 가리킨다. 통상적으로, 약독화는 바이러스와 같은 감염원(infectious agent)을 약독화되지 않은 바이러스에 비해 감염된 대상체에 덜 유해하거나 유독성이 덜하게 한다. 이는 죽거나 완전히 비활성화된 바이러스와는 대비된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유효한 양" 또는 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약제학적으로 유효한 양"이라는 용어들은 바라는 치료학적 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양을 가리키는데, 예컨대 질병, 상태 및/또는 그것의 증상(들)의 방지를 가져오는 양을 가리킨다. 치료학적 또는 예방학적 적용의 상황에서는, 대상체에 투여된 조성물의 양은 질병의 유형과 심각도 및 종합적인 건강 상태, 나이, 성별, 체중 및 조성 약물(composition drug)들에 대한 내성과 같은 개개인의 특징들에 의존하게 된다. 그것은 또한 질병이나 질병의 정도, 심각성, 종류에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이러한 요인과 다른 요인에 따라 적절한 복용량을 결정할 수 있을 것이다. 일부 실시예들에서는 다량의 선량이 투여된다. 또한 또는 대안으로 일부 실시예들에서는 복수의 치료 조성물 또는 화합물(예: 백신과 같은 면역원성 조성물)을 투여한다.
본 명세서에서 사용된 것처럼, "호스트 셀(host cell)"이라는 용어는 바이러스와 같은, 병원체가 복제할 수 있는 셀을 가리킨다. 일부 실시예들에서는 호스트 셀들은 체외, 배양된 세포들(예컨대, CHO 셀들, 베로 셀들 및 MDCK 셀들 등)이다. 추가적으로 또는 대체적으로, 일부 실시예들에서는 호스트 셀들이 생체 내에 있다(예: 조류나 포유류와 같은 감염된 척추동물의 세포). 일부 실시예들에서는 예컨대, 호스트 셀의 바이러스 감염 및/또는 바이러스 성장률을 향상시키는 것과 같이 바이러스 생성을 향상시키기 위해, 호스트 셀들이 변형될 수 있다. 예를 들어, 제한에 의한 것은 아니지만, 전형적인 호스트 셀 변형은 호스트 셀의 세포 표면에 있는 2-6 링크된(linked) 시알산 수용기들의 재조합식 발현, 및/또는 병원체나 바이러스에 없거나 비효과적인 것으로 밝혀진 호스트 셀들의 단백질의 재조합식 발현을 포함한다.
여기서 "면역원성 조성물"이란 용어는 그러한 조성물에 노출된 포유동물에서 면역 반응을 이끌어낼 조성물을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 5개의 BM2-결핍 인플루엔자 B BM2SR 변이체들(예컨대, BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, BM2SR-5) 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에서 설명된 면역원성 조성물은 다수의 형태들로 투여를 위해 제형화될 수 있다(즉, 포유동물로의 "노출(exposure)"을 위해 제형화된). 예를 들면, 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 구강, 폐, 정맥, 근육 내, 피하, 경막, 비강 또는 국부적 투여를 위해 마련된다. 조성물들은 또한 특정 투여량 형태들 대해서도 제형화될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에서 면역원성 조성물은 액체, 젤, 에어로졸, 연고, 크림, 동결 건조된 제형, 파우더, 케이크, 태블릿 또는 캡슐로 제형화될 수 있다. 다른 실시예들에서는 면역원성 조성물이 제어된 방출 제형, 지연된 방출 제형, 확장된 방출 제형, 맥동성 방출 제형 및 혼합된 즉시 방출 제형으로서 제형화된다. 일부 실시예들에서는 면역원성 조성물이 액체로서 제공된다. 다른 실시예들에서는 면역원성 조성물이 동결 건조된 형태로서 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "감염된(infected)"이라는 용어는 질병 또는 바이러스와 같은 병원균을 숨겨두는 것을 말한다. 감염은 바이러스나 병원체를 투여하는 것(예: 백신 접종에 의한 것)에 의한 것과 같이 의도적일 수 있거나, 한 유기체에서 다른 유기체로 또는 오염된 표면으로부터 유기체로 병원균이 자연적으로 이동하는 것에 의한 것과 같이 의도적이지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "격리된(isolated)" 및/또는 "정화(purified)"라는 용어는 핵산(예: 벡터 또는 플라스미드), 폴리펩타이드, 바이러스 또는 세포의 체외 준비, 격리 및/또는 정화를 의미하며, 이것이 생체 내 원치 않는 물질과 관련이 없거나, 정상적으로 발생하는 생체 내 물질로부터 실질적으로 정화된 것이다. 예를 들어, 일부 구현에서는 체외 배양과 전파에 의해 격리된 바이러스 준비가 얻어지며, 다른 감염물질로부터 실질적으로 자유롭다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 자유로운"은 해당 화합물 또는 작용제에 대한 표준 검출 방법을 사용하는 원하지 않는 핵산, 단백질, 세포, 바이러스, 전염성 물질 등과 같은 특정 화합물에 대한 검출 수준 이하를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "변이체(mutant)", "변이체(mutation)", "변종(variant)"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 야생형 배열과 다른 핵산 또는 폴리펩타이드 염기서열을 가리킨다. 일부 실시예에서는 변이체 또는 변종 시퀀스가 자연적으로 발생하고 있다. 다른 실시예에서는 변이체 또는 변종 시퀀스가 재결합하여 또는 화학적으로 도입된다. 일부 실시예에서 핵산 변이체는 RNA 및/또는 DNA 서열에 대한 변형(예: 추가, 삭제, 대체)을 포함한다. 일부 실시예에서 변형은 화학 변형(예: 메틸화)을 포함하며 자연 및/또는 비자연 뉴클레오티드의 대체 또는 첨가를 포함할 수 있다. 핵산 변이체들은 무성 변이체(예를 들어 야생형 배열과 동일한 아미노산에 대해 코드화하는 핵산이 하나 이상 변경됨)이거나 암호화된 아미노산이 변질되어 코돈이 멈추거나, 스플라이싱 결함이나 스플라이싱 변화를 일으킬 수 있다. 코딩 시퀀스에 대한 핵산 변이체는 또한 보수적이거나 비보수적인 아미노산 변화를 초래할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 바이러스"라는 용어는 재조합 핵산 기술을 사용하여 바이러스 게놈의 변화를 도입하거나 바이러스 단백질에 변화를 도입하기 위해 시험관에서 조작한 바이러스를 말한다. 예를 들어, 일부 구현에서 재조합 바이러스는 야생형, 내생성, 핵산 염기서열들과 변이체 및/또는 외생성 핵산 염기서열들을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대체적으로, 재조합형 바이러스는 변이체 또는 변형 행렬, 헤마글루틴, 뉴라미니다아제, 핵단백질, 비구조성 및/또는 중합효소 단백질과 같은 변형된 단백질 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 셀" 또는 "변형 셀"이라는 용어는 재조합 핵산 기법을 사용하여 셀에 핵산을 도입하거나 세포핵산을 변형하기 위해 시험관에서 조작한 셀을 말한다. 재조합 셀의 예로는 외생 플라스미드, 표현 벡터 등을 운반하는 원핵 또는 진핵 셀 및/또는 세포핵산(예: 세포 게놈으로의 대체, 변이체, 삽입, 삭제 등)의 변형을 포함하는 셀이 있다. 전형적인 재조합 셀은 바이러스 M2 단백질과 같은 외부 단백질을 안정적으로 발현하기 위해 체외에서 조작된 셀이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단일 복제(SR) 바이러스"라는 용어는 호스트 셀의 바이러스 입력이나 호스트 셀로부터의 방출에 기능하는 바이러스 단백질에 결함이 있는 바이러스를 말한다. 예를 들어, M2SR은, 본 문서에 기술된 바와 같이, 고전적인 살아있는 약독화된(live attenuated) 인플루엔자 백신과는 대조적으로, SR(단일 복제) 바이러스 백신의 새로운 클래스에 속한다. SR 바이러스는 바이러스 게놈 복제에 영향을 주지 않지만 바이러스 성장에 없어서는 안 되는 독감 M2 이온 채널 단백질과 같이 바이러스 유입이나 방출에 기능하는 바이러스 단백질에 결함이 있다. 이와는 대조적으로, 기존의 약독화된 살아있는 바이러스 백신은 바이러스 복제 기계에 여러 가지 변이체를 포함하고 있어 발현이 매우 약독화된다. 그러므로 SR 백신 바이러스 메커니즘은 약독화된 살아있는 백신과는 대조적으로 바이러스 감염 운동학 및 항원 생산에 영향을 주지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대상체(object)"와 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 예를 들어 척추동물 종에 속하는 동물을 가리킨다. 본 개시된 주제의 방법과 구성은 포유류와 새를 포함한 온혈 척추동물에게 특히 유용하다. 전형적인 주제들은 멸종위기로 인해 중요하고, 경제적으로 중요한(인간이 소비하기 위해 농장에서 기르는 동물) 및/또는 인간에 대한 사회적으로 중요한(애완동물로 기르거나 동물원에 있는 동물) 포유류와 조류들 뿐만 아니라 인간들과 같은 포유류를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서는 그 주제가 인간이다. 일부 실시예들에서는 그 주제가 인간이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바이러스와 함께 사용하는 "유형"과 "스트레인"이라는 용어는 서로 바꾸어 사용되며, 일반적으로 다른 특성을 가진 바이러스를 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스와는 다른 유형이다. 마찬가지로 인플루엔자 A H1N1은 인플루엔자 A H2N1, H2N2와 H3N2와는 다른 종류의 바이러스다. 추가적으로 또는 대체적으로, 일부 실시예들에서는 인플루엔자 A H2N1, H2N2 및 H3N2와 같은 다른 유형의 바이러스를 견인(tow) 바이러스 트랜스멤브레인 단백질, 헤마글루틴(HA), 뉴라미니다아제(NA)의 항원차이에 기초한 "서브타입(subtype)들"이라고 부를 수 있다. 사람에게서 거의 독점적으로 순환되는 인플루엔자 B 바이러스는 서브타입들로 분류되지 않는다. B형 바이러스(B/Victoria와 B/Yamagata)의 밀접한 관련이 있는 2개의 혈통들이 인간에서 순환하는 인플루엔자 B형 바이러스들의 예이다.
본 명세서에서 "백신"이라는 용어는 특정 질병에 대한 면역력을 생산하거나 증가시키기 위해 대상자에게 투여되는 성분을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시예들에서 백신은 임상적으로 허용되는 보조제 및/또는 치료적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "vRNA"는 양성과 음성의 스트랜드 바이러스 게놈들뿐만 아니라 분할된 또는 비분할된 바이러스 게놈들을 포함한 바이러스 게놈을 포함하는 RNA를 의미한다. vRNA는 완전히 내생적이며 "야생형"일 수 있으며/또는 재조합 및/또는 변이체 시퀀스를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR-1"은 그것이 사용되는 상황에 따라서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:1을 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO:1를 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 변이체들을 설명시, "BM2SR-1"은 SEQ ID NO:1을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR-2"는 그것이 사용되는 상황에 따라서 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:2를 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO:2를 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 변이체들을 설명시, "BM2SR-2"는 SEQ ID NO:2를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR-3"은 그것이 사용되는 상황에 따라서, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3을 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO:3을 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 변이체들을 설명시, "BM2SR-3"은 SEQ ID NO:3을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR-4"는 그것이 사용되는 상황에 따라서, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:4를 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO:4를 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 변이체들을 설명시, "BM2SR-4"는 SEQ ID NO:4를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR-5"는 그것이 사용되는 상황에 따라서, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:5를 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO:5를 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 변이체들을 설명시, "BM2SR-5"는 SEQ ID NO:5를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "BM2SR-0"은 그것이 사용되는 상황에 따라서, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:6을 포함하는 바이러스, 또는 SEQ ID NO:6을 포함하는 바이러스를 포함하는 백신을 지칭한다. 예를 들면, 본 명세서에서 증명된 BM2 유전자의 변이체들을 설명시, "BM2SR-0"은 SEQ ID NO:6을 지칭한다. 다르게 지시되지 않는 한, "BM2SR"은 BM2SR-0FMF 지칭한다.
Ⅱ. 인플루엔자 B 바이러스
A. 총괄적인(General)
인플루엔자는 미국 성인들의 주요 사망 원인이다. 인플루엔자의 원인 물질은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 및 인플루엔자 C 바이러스를 포함하는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 패밀리(family)의 바이러스들이고, 인플루엔자 B는 거의 독점적으로 인간들에서 순환한다.
인플루엔자 B 바이러스는 또한 싸여 있고 음성이 강한 RNA 바이러스다. 인플루엔자 B 바이러스의 게놈은 8개의 단일(페어링되지 않은) RNA에 포함되어 있으며, 11개의 단백질에 대해 어떤 코드의 보완을 한다. 이들 단백질 중 인플루엔자 A 바이러스에서, 3개의 RNA 의존성 RNA 중합효소 서브유닛들(PB1, PB2, PA), 혈구응집소(HA), 핵단백질(NP), 뉴라미니다아제(NA), 매트릭스 단백질(M1 또는 BM1), 및 2개의 비구조성 단백질(NS1 그리고 NEP라고도 알려진 NS2) 총 9개가 또한 발견된다. NB와 BM2라는 2개의 단백질은 인플루엔자 B 바이러스에 독특하다. 총 게놈 크기는 약 14,500개의 염기서열이다. 게놈의 분할된 성질은 세포 동거 동안 서로 다른 바이러스 균주들 사이의 전체 유전자의 교환을 가능하게 하는데, 이것은 재분배라고 알려진 과정이다. 길이 감소순으로 번호가 매겨진 8개의 RNA 세그먼트는 다음과 같다. 세그먼트 1, 2, 3은 각각 RNA 중합효소 서브유닛인 PB1, PB2, PA를 암호화한다. 세그먼트 4는 HA(hemagglutinin)를 암호화한다. 세그먼트 5는 NP(핵단백질)를 암호화한다. 세그먼트 6은 NB(NB 단백질, 그 기능은 알려져 있지 않음)와 NA(뉴라미니다아제)를 모두 인코딩한다. 세그먼트 7은 BM1(매트릭스 단백질)과 BM2(이온 채널) 모두를 바이시스토닉 mRNA에 의해 암호화하며, 그 변환 전략은 독특하다. BM2 개시 코돈은 BM1 종단 코돈(TAATG, 스톱-스타트 펜타튜클레오티드 모티브)과 겹친다. BM2 단백질은 인플루엔자 A 바이러스의 M2 단백질과는 달리 이 스톱-스타트 변환 메커니즘에 의해 번역되고, 이 단백질은 혼합된 mRNA에서 변환된다. 세그먼트 8은 동일한 RNA 부분의 다른 판독 프레임들을 사용함으로써 NS1과 NEP를 모두 암호화한다.
인플루엔자 A와 B는 모두 항원성 표류 과정에 의해 항원적으로 진화하는데, 이 과정에서 혈구응집소(HA) 단백질에 대한 변이체는 바이러스가 기존의 인간의 면역성을 벗어나고 인구를 지속시킨다. 인플루엔자 A에는 몇 가지 서브타입(subtype)이 있는데, H 번호(혈구응집소의 종류)와 N 번호(뉴라미니다아제 종류)에 따라 이름이 지어진다. 현재 알려진 H 항원은 16개(H1~H16개)이고, 알려진 N 항원은 9개(N1~N9)이다. 각 바이러스 서브타입은 일부는 한 종으로, 일부는 다른 종으로, 일부는 여러 종으로, 병원성 프로파일이 서로 다른 다양한 변종으로 변질되었다. 사람에게서 확인된 전형적인 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로는 "스페인 독감"과 2009년 돼지 독감을 일으킨 H1N1, 1950년대 후반 "아시아 독감"을 일으킨 H2N2, 1960년대 후반 홍콩 독감을 일으킨 H3N2, 2000년대 중반에 그것의 전파를 통해 세계적인 유행성 독감을 위협한 H5N1; 인간과 돼지에 현재 특정되는 H7N7; H1N2; 및 H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, H10N7이 있다. 인플루엔자 B는 서브타입들로 나누어지지 않지만, 현재 인간에게는 B/Victoria/2/87과 B/Yamagata/16/88의 이름을 딴 두 개의 항유전자와 유전적으로 구별되는 혈통들인 Victoria와 Yamagata가 순환한다.
인플루엔자 바이러스는 바이러스 유형, 격리된 종(인간 아닌 경우), 격리된 위치, 격리 수, 격리 연도 및 인플루엔자 A 바이러스의 경우에만 HA 및 NA 서브타입을 포함하는 표준 명명법을 가지고 있다. 이에 따라 B/Yamagata/16/88은 1988년 Yamagata(일본)에서 복용한 인간 인플루엔자 B 바이러스의 격리 숫자(16)이었다.
B. 라이프 사이클과 구조
인플루엔자 바이러스들의 라이프 사이클은 일반적으로, 세포 표면 수용체에 대한 부착, 세포에 대한 진입 및 바이러스 핵산의 코팅 해제를 수반하며, 그 다음에 세포 내부의 바이러스 유전자의 복제가 수반된다. 바이러스 단백질과 유전자의 새로운 복사본이 합성된 후, 이러한 성분들은 자손 바이러스 입자로 결합되어 세포에서 나온다. 각기 다른 바이러스 단백질들이 이 단계들에서 역할을 한다.
인플루엔자 B 입자는 바이러스 핵을 캡슐화하는 지질막으로 이루어져 있다. 엔빌로프의 안쪽은 매트릭스 단백질(BM1)로 정렬되어 있고, 바깥쪽 표면은 헤마그글루틴(HA)과 뉴라미니다아제(NA)의 두 가지 유형의 글리코프로테인 스파이크가 특징이다. 트랜스멤브레인 이온 채널 단백질인 BM2도 지질 엔빌로프의 일부분이다. 예: 도 1 참조.
트리머릭 타입 I 멤브레인 단백질인 HA 단백질은 호스트 세포 표면 글리코프로테인 또는 글리콜리피드에서 시알릴리골리고사카라이드(갈락토스에 연결된 단자 시알릭산을 함유한 올리고당)에 대한 결합을 담당한다. 이 단백질은 또한 내시경증에 의한 바이러스 내부화에 이어 바이러스 셀막과 호스트 셀막 사이의 융합을 담당한다.
뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA)는 테트라머 타입 II 멤브레인 단백질로, 호스트 셀과 HA, NA의 글리코콘주게이트에서 말단 시알산 잔류물을 분쇄하는 시알리다아제로서 수용체 파괴 효소로 인식된다. 이 시알리다제 활동은 다른 글리코프로테인과 바이러스 HA의 결합 활동으로 인한 자손 통합의 예방뿐만 아니라 호스트 셀 표면에서 자손 바이러스를 효율적으로 방출하기 위해 필요하다. 따라서, HA의 수용체 결합 활동과 NA의 수용체 파괴 활동은 인플루엔자의 효율적인 복제가 가능하게 하여 균형을 이루는 역할을 할 가능성이 있다.
게놈 부문은 바이러스 입자의 핵심으로 포장되어 있다. RNP(RNA+뉴클레오프로틴, NP)는 3개의 바이러스성 중합효소 폴리펩타이드가 각 세그먼트와 연관된 나선형 형태다.
인플루엔자 바이러스 라이프 사이클은 HA를 호스트 셀의 표면에 있는 시알산 함유 수용체에 결합하는 것으로 시작하여 수용체 매개 내시세포 분열이 뒤따른다(도 1). 후기 내염소체의 낮은 pH는 HA의 순응적 변화를 유발하여 HA2 하위유닛( 이른바 퓨전 펩타이드)의 N-단자를 노출시킨다. 융합 펩타이드가 바이러스막과 내염소체막의 융합을 시작하고, 매트릭스 단백질(M1)과 RNP 복합체가 세포질에 방출된다. RNP들은 vRNA를 캡슐화하는 뉴클레오프로틴(NP)과 PA, PB1, PB2 단백질로 구성된 바이러스성 중합효소 복합체로 구성된다. RNP는 전사와 복제가 이루어지는 핵으로 운반된다. RNA 중합효소 복합체는 (1) 5' Cap과 3' PolyA 구조를 가진 mRNA의 합성 (2) 완전 길이 보완 RNA(cRNA), 및 (3) cDNA를 템플릿으로 사용하는 게놈 vRNA의 세 가지 다른 반응을 촉매한다. 새로 합성된 vRNA들, NP, 및 중합효소 단백질을 RNP로 조립하여 핵에서 내보낸 후, 혈장막으로 운반하는데, 여기에서 자손 바이러스 입자의 싹이 생긴다. 뉴라미니다아제(NA) 단백질은 시알릭산을 시알릴롤리고사카리드에서 제거하여 세포 표면에서 새로 조립된 바이러스를 방출하고 바이러스 입자의 자기집합을 방지함으로써 감염에 늦는 역할을 한다. 비록 바이러스 어셈블리는 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용을 포함하지만, 이러한 상호작용의 성격은 대부분 알려지지 않고 있다.
C. BM2 단백질의 역할
전술한 바와 같이, 바이러스막에 걸치는 것은 헤마글루틴(HA), 뉴라미미다아제(NA), BM2의 3가지 단백질이다. 인플루엔자 A에 대해서는, HA와 NA의 세포외 영역(ectodomain)들은 상당히 가변적인 반면, M2의 세포외 영역은 기본적으로 인플루엔자 A 바이러스 사이에 불변성이 있다. 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 인플루엔자 A 바이러스에서는 이온 채널 활동을 가지고 있는 M2 단백질이 호스트 셀 침투와 바이러스 RNA의 코팅 해제 사이의 바이러스 수명 주기 초기에 기능하는 것으로 생각된다. 일단 바이러스가 내분비를 거치게 되면, 바이러스 관련 M2 이온 채널은, 동미분자 나선 묶음인 이온은 양성자가 내분자에서 바이러스 내부로 흘러들어 불안정한 산의 M1 단백질-리보핵단백질 복합체(RNP) 상호작용을 방해하게 하여, RNP가 세포질로 방출되는 것을 촉진하는 것으로 여겨진다. 또한, HA가 세포내부로 분해되는 일부 인플루엔자 균주들(예: A/fowl platues/Rostock/34) 중에서, M2 이온 채널은 골기 네트워크의 pH를 상승시켜 이 컴파트먼트의 낮은 pH로 인한 HA의 순응적 변화를 방지하는 것으로 생각된다. 또한 M2 트랜스멤브레인 영역 자체가 이온 채널로서 기능할 수 있다는 것이 밝혀졌다. M2이온 채널 활동을 차단하는 아만타딘 염산염은 바이러스 복제를 억제하는 것으로 나타났기 때문에 M2 단백질 이온 채널 활동은 인플루엔자 바이러스의 라이프 사이클에서 필수적인 것으로 생각된다.
인플루엔자 B 바이러스들에서의 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 기능적 대안은 BM2로 알려진 타입 III 트랜스멤브레인 단백질이다. 변환을 위한 메커니즘은 아래에 설명된 결합된 종료/재시작 이벤트를 수반한다.
Ⅲ. BM2 바이러스 변이체들
일 양태에서, 변이체 BM2 vRNA 시퀀스를 숨기는 인플루엔자 B 바이러스가 공개된다. 일반적으로 이러한 변이체들은 BM2 이온 채널 활성도가 없으며, 생체 내 성장속성이 저하되고, 감염성 유전자가 생성되지 않으며, 비병원성 또는 감염 피험자 내 병원 생성이 감소한다. 이러한 변이체 바이러스들은 면역성이 있으며, 백신으로 사용될 경우 야생형 및/또는 다른 병원성 바이러스로 감염으로부터 보호된다. 추가적으로, 본 명세서에서 공개된 BM2 변이체는 안정적이며, 사용된 호스트 셀에 관계 없이 기능적인 BM2 폴리펩타이드로 발현하기 위해 변이체를 일으키지 않는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시예에서는 이러한 변이체들의 BM1 단백질이 기능에 대한 검출 가능한 변경 없이 생성된다. 일부 실시예에서 변이체 BM2 핵산 시퀀스를 포함하는 바이러스들은 해당 야생형 바이러스가 전파될 수 있는 호스트 셀에서 증가될 수 없다. 예를 들면, 하지만 제한적이지 않게, 일부 실시예에서는 야생형 바이러스가 MDCK 셀들, CHO 셀들 및/또는 Vero 셀들의 배양시 재배, 전파 및 복제될 수 있는 반면, 변이체 BM2 시퀀스를 숨기는 해당 바이러스는 동일한 유형의 셀들에서 1 사이클 이상 성장, 복제 또는 전파될 수 없다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 실시예들에서는 BM2 변이체 바이러스가 안정적이며, 호스트 셀에서 기능적인 BM2 단백질을 암호화하는 야생형 또는 비와일드형 시퀀스로 변형하거나 복귀하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예에서 BM2 변이체 바이러스는 호스트 셀에서 2개의 통로, 3개의 통로, 5개의 통로, 10개의 통로, 12개의 통로, 15개의 통로, 20개의 통로, 25개 이상의 통로에 대해 안정적이다. 일부 실시예에서, 호스트 셀은 변형되지 않은 호스트 셀이다. 일부 실시예에서, 호스트 셀은 BM2 단백질을 발현하는 MDCK 셀과 같이 변형된 호스트 셀이다.
일부 실시예들에서, BM2 변이체들은 하나 이상의 핵산 대체 및/또는 삭제(deletion)가 포함된다. 일부 실시예에서 변이체들은 BM2 단백질의 세포외 영역, BM2 단백질의 트랜스멤브레인 영역 및/또는 BM2 단백질의 세포질 꼬리 중 하나 이상을 코드화하는 핵산에서 국부화된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시예에서 하나 이상의 핵산 변이체는 BM2 펩타이드의 하나 이상의 정지 코돈 및/또는 하나 이상의 아미노산 삭제들을 초래한다. 일부 실시예에서는 변이체 BM2 핵산을 운반하는 바이러스들이 비기능성 BM2 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시예에서는 변이체 BM2 핵산을 운반하는 바이러스들이 BM2 폴리펩타이드를 생성하지 않는다. 일부 실시예에서는 변이체 BM2 핵산을 운반하는 바이러스들이 절단된(truncated) BM2 폴리펩티드를 생성한다.
위에서 언급된 바와 같이, 인플루엔자 B 게놈 세그먼트 7은 복제에 필요한 두 가지 주요 폴리펩타이드인 BM1 매트릭스 단백질과 BM2 양성자 채널을 발현한다. BM1과 BM2 폴리펩타이드의 발현은 부분적으로 BM1 ORF과 BM2 ORF 사이의 접합부에 위치하는 펜타뉴클레오티드 모티프의 변환 슬리피지에 의해 규정된다. 펜타뉴클레오티드 모티프인 TAATG는 M1 변환의 종료를 위한 TAA 스톱 코돈과 대체-1 판독 프레임에서 M2의 시작을 위한 ATG 스타트 코돈 모두를 포함한다. 이 펜타뉴클레오티드 모티프와 플랭킹 시퀀스는 M1 단백질의 발현 규정을 위해 중요한 것으로 밝혀졌다. BM2 단백질은 RNA 세그먼트 7에서 전사된 쌍성 mRNA의 중첩하는 스톱-스타트 펜타뉴클레오티드에서 결합된 변환 종료-재시작 메커니즘에 의해 합성된다. RNA 세그먼트 7로부터 전사된 mRNA에는, BM2 단백질에 대한 AUG 개시 코돈이 M1 단백질에 대한 종료 코돈과 중첩하는 펜타뉴클레오티드 잔류물 769±773이 존재한다(Horvath 등의, EMBO Journal 9:2639-2647(1990)). BM2 단백질은 업스트림 m1 단백질의 시작 및 종료에 의존하는 펜타뉴클레오티드에서의 결합된 변환 종료±재시작 메커니즘에 의해 합성된다(Horvath 등 1990). 이러판 프로세스는 18S rRNA의 나선 26에 대한 상보성을 가지고 베이스(base)들의 기능적으로 필수적인 스트레치(stretch)를 vhg마하는 종료-시작 위치(site)의 mRNA 업스트림의 규정된 영역과 종료 및 재시작 코돈의 근접성을 요구한다. 이러한 상보적 영역은 종단 리보솜에 인접한 헤어핀 구조의 루프 내에 위치하며, BM2 단백질의 발현을 위한 재조립 과정에서 역할을 할 수 있다. 이 2차 구조는 세그먼트 7 mRNA의 안정화에 추가적인 역할을 할 수 있고 따라서, 헤어핀 구조에 지장을 주거나 영향을 미치는 BM2 변이체들은 BM2 발현(expression)의 원하는 부족(lack) 외에 M1 단백질 발현을 감소시켰을 수 있다.
모든 8개의 게놈 세그먼트들의 복제 및 패킹(packing)을 위해 요구된 또 다른 영역은 게놈 RNA의 5' 비-코딩 구역(5'NCR)이다. 인플루엔자가 음의 균주 RNA 바이러스이기 때문에 게놈 5'NCR은 mRNA와 cDNA의 3'NCR을 나타낸다. 더욱이, 5'NCR에 대한 구조적 요건은 단백질 ORF 자체로 확장될 수 있다. 이는 인플루엔자 A에 대해 입증되었다. 즉, 코돈을 변경하지만 HA의 아미노산 성분이 아닌 세그먼트 4(HA)의 mRNA(또는 게놈 5'NCR 부근의)의 3'엔드 부근의 무성 단백질 코딩 돌연변이들이 바이러스 복제를 완전히 차단할 수 있다. 따라서, M2의 COOH 종점 내의 영역들은 구조적으로 그리고 비루온으로의 효율적인 게놈 패킹을 위해 중요할 수 있다.
바이러스 복제에서의 BM2에 대한 요구 사항은 109-아미노산 BM2 ORF의 정밀한 삭제로 인플루엔자 B 바이러스를 구성함으로써 증명되었다. 이러한 바이러스는 BM2 단백질을 구성되게 발현하는 MDCK 셀들인 M2CK 셀들에서의 복제할 수 있다. 이러한 M2 삭제 구성이 MDCK 혈통 셀들에서의 복제를 허용하는데 반해, 총 삭제는 조절 요소들의 부분들을 제거하고, 이러한 조절 요소들은 특히 다른 요인들에 의해 제한될 때 바이러스의 생산에 영향을 미칠 수 있는 M1 단백질 발현에 역으로 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 B 바이러스들이 MDCK 셀들에서 높은 역가들까지 성장하는데 반해, 그것들은 M1 단백질의 낮은 발현에 의해 부분적으로 베로 셀들에서 크기 제한된다(Nakamura, 1981). 그러므로 M 세그먼트의 조작은 M1 발현에 부주의하게 더 영향을 미칠 수 있다.
이러한 단점들을 해결하기 위해 B/Florida/4/2006 세그먼트 7(도 2)에 기초한, 일련의 5개의 새로운 BM2 널(null) 변이체 구조들(BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-4, 및 BM2SR-5)이 설계되었고 관련 분야에서 알려진 표준 기술들을 사용하는 표준 시험관 내 유전자 조립 절차들에 알맞은 이중 가닥(double-stranded) DNA 조각(fragment)들로서 합성되었다. 구조물들의 단일 가닥 mRNA 또는 플러스-센스(plus-sense) DNA 뉴클레오티드 시퀀스들, 즉 BM2SR-1(SEQ ID NO: 1), BM2SR-2(SEQ ID NO: 2), BM2SR-3(SEQ ID NO: 3), BM2SR-4(SEQ ID NO: 4), BM2SR-5(SEQ ID NO: 5), 및 BM2SR-0(SEQ ID NO: 6)이 표 1에서 제공된다.
표 1
M segment 7 sequences of BM2SR influenza viruses containing null mutations in BM2 genes.
BM2SR-1 (SEQ ID NO: 1) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + total BM2 deletion of 329 bp (indicated by -) (mRNA sense).5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATAA-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-2 (SEQ ID NO: 2) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + partial BM2 deletion of 296 bp (indicated by -) + insertion of stop codons in 3 frames. (mRNA sense).
5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATAATGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGTtagAtagC------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------taaATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT

BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-3 (SEQ ID NO: 3) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + BM1 M86V mutation + partial BM2 deletion of 296 bp (indicated by -) + insertion of stop codons in 3 frames. (mRNA sense). 5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGA gTG GGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATA A TGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGT tagAtagC------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------taaATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT

Bold Underline Mixed Case = BM1 M86V Mutation Codon
BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF remnant
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-4 (SEQ ID NO: 4) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + partial BM2 deletion of 90 bp (indicated by -) + insertion of 3 stop codons in 3 frames. (mRNA sense).5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGAATGGGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATA A TGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGT tagAtagCtaa---------------------------------------------------------------------------AAGGGGCCAAATAAAGAGACAATAAACAGAGAGGTATCAATTTTGAGACACAGTTACCAAAAAGAAATCCAGGCCAAAGAAGCAATGAAGGAAGTACTCTCTGACAACATGGAGGTATTGAGTGACCACATAGTAATTGAGGGGCTTTCTGCTGAAGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTAGAAGAATTGCAT TAA ATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAA-CTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT

BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF remnant
BOLD UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF Stop Codon
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-5 (SEQ ID NO: 5) influenza B/FL/4/2006 Segment 7 with intact BM1 + BM1 M86V mutation + partial BM2 deletion of 90 bp (indicated by -) + insertion of 3 stop codons in 3 frames. (mRNA sense).5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGACATACAGAAAGCACTAATTGGCGCCTCTATCTGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCCTATCAGGA gTG GGGACAACAGCAACAAAAAAGAAGGGCCTGATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTCCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGTTACTATATTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTGTGCGAAAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGGGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTTCAAAAACTGGCAGAAGAACTGCAAAGCAACATTGGAGTATTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATA A TGCTCGAACCATTTCAGATTCTTTCAATTTGT tagAtagCtaa---------------------------------------------------------------------------AAGGGGCCAAATAAAGAGACAATAAACAGAGAGGTATCAATTTTGAGACACAGTTACCAAAAAGAAATCCAGGCCAAAGAAGCAATGAAGGAAGTACTCTCTGACAACATGGAGGTATTGAGTGACCACATAGTAATTGAGGGGCTTTCTGCTGAAGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTAGAAGAATTGCAT TAA ATTCAATTTTTACTGTACTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGCAAATAAA-CTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
Bold Underline Mixed Case = BM1 M86V Mutation Codon
BOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF remnant
bold lower case= Inserted BM2 Stop Codons
BOLD UNDERLINE UPPERCASE = BM2 ORF Stop Codon
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-0 (SEQ ID NO: 6) influenza B/Lee/1940 Segment 7 with intact BM1 + total BM2 deletion of 329 bp (indicated by -) (mRNA sense).
5'AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCACTAATAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCTGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGATTCTGCTTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGGTGCCTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAAGAAAGAAAAAGGAGATTCATCACAGAGCCCCTGTCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAGAAGAAAGGCCTAATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTAAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCACGAAAGCTCAGCATTACTATATTGTCTTATGGTCATGTACCTAAACCCTGAAAACTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTATGCGAGAAACAAGCATCGCACTCGCATAGAGCCCATAGCAGAGCAGCAAGGTCTTCGGTACCTGGAGTAAGACGAGAAATGCAGATGGTTTCAGCTATGAACACAGCAAAGACAATGAATGGAATGGGAAAGGGAGAAGACGTCCAAAAACTAGCAGAAGAGCTGCAAAACAACATTGGAGTGTTGAGATCTCTAGGAGCAAGTCAAAAGAATGGAGAAGGAATTGCCAAAGATGTAATGGAAGTGCTAAAACAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAGGAAATACTTATAA-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GCCCAATTTTCACTGTATTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGTGAATAAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACTBOLD UPPER CASE = BM1 ORF Stop Codon
- = designates deleted nucleotides
BM2SR-0, BM2SR-1 및 BM2SR-3 변이체들은 BM2 폴리펩티드를 발현하지 않는다. BM2SR-2, BM2SR-4, 및 BM2SR-5 변이체들은 잠재적으로 BM2 단백질의 첫 11개의 아미노산을 포함하는 절단된 폴리펩타이드(polypptide)를 발현할 수 있지만, 이것은 아직 증명되지 않았다.
표 2에는 BM1과 BM2 코딩 시퀀스들과 굵은 밑줄의 펜타뉴클레오티드 모티프를 보여주는 야생형 인플루엔자 B 세그먼트 7이 제공된다.
표 2
Wild-type BM1 and BM2 coding sequences.
BM1/BM2 coding sequence (SEQ ID NO: 7) influenza B/Lee/40 Segment 7.AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCACTAATAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCTGAAAAATTACACTGTTGGTTCGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGATTCTGCTTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGGTGCCTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAAGAAAGAAAAAGGAGATTCATCACAGAGCCCCTGTCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAGAAGAAAGGCCTAATTCTAGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTAAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCACGAAAGCTCAGCATTACTATATTGTCTTATGGTCATGTACCTAAACCCTGAAAACTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTATGCGAGAAACAAGCATCGCACTCGCATAGAGCCCATAGCAGAGCAGCAAGGTCTTCGGTACCTGGAGTAAGACGAGAAATGCAGATGGTTTCAGCTATGAACACAGCAAAGACAATGAATGGAATGGGAAAGGGAGAAGACGTCCAAAAACTAGCAGAAGAGCTGCAAAACAACATTGGAGTGTTGAGATCTCTAGGAGCAAGTCAAAAGAATGGAGAAGGAATTGCCAAAGATGTAATGGAAGTGCTAAAACAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAGGAAATACTTA TAATG CTCGAACCACTTCAGATTCTTTCAATTTGTTCTTTCATTTTATCAGCTCTCCATTTCATGGCTTGGACAATAGGGCATTTGAATCAAATAAGAAGAGGGGTAAACCTGAAAATACAAATAAGGAATCCAAATAAGGAGGCAATAAACAGAGAGGTGTCAATTCTGAGACACAATTACCAAAAGGAAATCCAAGCCAAAGAAACAATGAAGAAAATACTCTCTGACAACATGGAAGTATTGGGTGACCACATAGTAGTTGAAGGGCTTTCAACTGATGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTGGAAGAATTGCAATGAGCCCAATTTTCACTGTATTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGTGAATAAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
표 3에는 야생형 BM1과 BM2의 아미노산 염기서열과 BM1 M86V 변이체에 대한 아미노산 염기서열이 제공된다.
표 3
Amino acid sequences of segment 7 encoded proteins of wild-type influenza B viruses.
BM1 influenza B/Lee/1940 (SEQ ID NO: 8)NH2-MSLFGDTIAYLLSLIEDGEGKAELAEKLHCWFGGKEFDLDSALEWIKNKRCLTDIQKALIGASICFLKPKDQERKRRFITEPLSGMGTTATKKKGLILAERKMRRCVSFHEAFEIAEGHESSALLYCLMVMYLNPENYSMQVKLGTLCALCEKQASHSHRAHSRAARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQKLAEELQNNIGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSSMGNSALVRKYL
-COOH
BM1 influenza B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 9)NH2-MSLFGDTIAYLLSLTEDGEGKAELAEKLHCWFGGKEFDLDSALEWIKNKRCLTDIQKALIGASICFLKPKDQERKRRFITEPLSGMGTTATKKKGLILAERKMRRCVSFHEAFEIAEGHESSALLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSHRAHSRAARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQKLAEELQSNIGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSSMGNSALVKKYL
-COOH
BM1 M86V influenza B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 10)NH2-MSLFGDTIAYLLSLTEDGEGKAELAEKLHCWFGGKEFDLDSALEWIKNKRCLTDIQKALIGASICFLKPKDQERKRRFITEPLSG V GTTATKKKGLILAERKMRRCVSFHEAFEIAEGHESSALLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSHRAHSRAARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQKLAEELQSNIGVLRSLGASQKNGEGIAKDVMEVLKQSSMGNSALVKKYL
-COOH
BOLD UNDERLINE = Mutant M86V Residue
BM2 influenza B/Lee/1940 (SEQ ID NO: 11)NH2-
MLEPLQILSICSFILSALHFMAWTIGHLNQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ
-COOH
BM2 influenza B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 12)
NH2-
MLEPFQILSICSFILSALHFVAWTIGHLNQIKRGVNMKIRIKGPNKETINREVSILRHSYQKEIQAKEAMKEVLSDNMEVLSDHIVIEGLSAEEIIKMGETVLEVEELH
-COOH
BM2SR-1(SEQ ID NO: 1)이라고 부르는 첫 번째 구조는 Hatta, 등에 의해, J. Vrol. 83(11): 5939-5942(2009)에서 이전에 보고한 것과 같이 BM2SR-0(SEQ ID NO: 6)에 대응하는 BM2 ORF를 완전히 삭제한 것이지만 B/Lee/1940의 BM1이 아닌 최근 단백질(modern protein)을 암호화한다.
인플루엔자 B 바이러스들의 두 가지 항원적, 유전적으로 구별되는 혈통들은 적어도 1988년 이후 인간에게 공동 순환되어 질병을 일으켰다. 빅토리아 혈통의 인플루엔자 바이러스들은 1980년대에 세계적으로 순환하는 지배적인 B형 균주들이었고, 야마가타 혈통은 1990년대 초에 우세한 B형 바이러스가 되었다. 1991년 이후 빅토리아 혈통 바이러스들은 드물게 격리되었고 거의 전적으로 동아시아에 국한되었다. 2002년에 빅토리아 바이러스들이 재조명되었고, 그 이후 야마가타와 빅토리아 혈통이 공존하였다. 1940년부터 2016년까지 격리된 인플루엔자 B 바이러스의 진화적 관계들은 최신 격리체들의 BM1 단백질과 BM2 단백질이 B/Lee/40보다 서로 더 밀접하게 연관되어 있음을 나타낸다. 도 17a 및 도 17b에 계통발생학적 관계가 나타나 있다.
BM2SR-2 구성(SEQ ID NO: 2)은 BM1-BM2 펜타뉴클레오티드 정지-시작 위치와 네이티브(native) 3'-시퀀스 컨텍스트(context)를 복원하여 BM1 발현 및 규정을 개선한다. FluB mRNA에서의 5개의 뉴클레오티드 시퀀스인, TAATG는 업스트림 BM1 ORF의 정지 코돈 TAA와 다운스트림 프레임-시프트된 BM2 ORF의 시작 코돈 ATG 모두를 함유하는 펜타뉴클레오티드 정지 시작 위치라고 불리는 리보솜 슬리피지(robosome slippage) 시퀀스를 암호화한다. 이 시퀀스의 네이티브 RNA 시퀀스 컨텍스트인 5'와 3'은 모두 BM1 단백질 발현의 번역을 조절하는 요소들을 함유한다. 펜타뉴클레오타이드의 복원은 BM2 시작 코돈과 네이티브 컨텍스트에서의 복원이 필요하다. 따라서 BM2 ATG 위치에서 번역이 다시 시작될 것으로 예상된다. 해당 영역의 임의의 시퀀스 3'의 발현을 차단하기 위해, 세로로 1열이 되어 3개의 정지 코돈들을 ㅇ아암호화하는 BM2SR-2 내로 각각의 잠재적인 번환 개방 판독 프레임 다운스트림에 하나씩, 인공 시퀀스가 삽입되었다.
B/Florida/4/2006 야생형 세그먼트 7과 BM2SR-1 및 BM2SR-2는 MFold RNA 폴딩 알고리즘을 사용하여 모델화되었다. BM2SR-2 펜타뉴클레오티드를 둘러싸는 영역은 야생형과 유사한 RNA 구조로 접힐 것으로 예측된 반면, 펜타뉴클레오티드의 2 bp를 포함하는, 완전한 BM2 ORF 삭제를 갖는 BM2SR-1 변이체는 그렇지 않았다(도 3). 따라서, 정상적인 RNA 구조를 촉진하기 위해, 열역학 MFold 모델에 의해 BM2SR-2 구조에 32 bp를 첨가하는 것이 예측된다.
BM2SR-3 구성(SEQ ID NO: 3)은 단일 돌연변이가 있는 BM2SR-2와 동일한데, 즉 인플루엔자 B M1 유전자(M1 M86V)에서의 아미노산 86에 절대 보존된 메티오닌 대신 발린을 통합하는 것이다. M86V의 대체는 세로 셀들에서 야생형 인플루엔자 B 균주들의 성장을 개선하는 것으로 알려져 있다(N. Wressnigg 등, Vaccine 27:2851-2857(2009)).
BM2SR-4 구성(SEQ ID NO: 4)은 게놈 RNA들의 세그먼트 크기들을 변경하면 바이러스 세그먼트의 안정성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 관측에 기초해 오직 90bp의 M2로부터 약간 삭제된 것이다. 이는 바이러스 단백질들의 코딩 영역 내에 속하는 게놈 RNA의 5' 끝 부근의 시퀀스들에 기인한다(Hatta 등. (2009)). 이는 게놈 세그먼트 7의 5' 끝(mRNA의 3' 끝)에 근접하게 위치한 M2 ORF에 관한 경우가 될 수 있다. 세그먼트 불안정성은 약독화된 바이러스 성장과 감소된 최종 바이러스 역가를 갖는 주어진 세그먼트가 결여된 결함 있는 바이러스 입자들의 개수를 증가시킬 수 있다(Hutchinson 등, J. Virol. 82:11869-11879(2008)). BM2SR-4로부터의 90bp 삭제는 세그먼트 7에 관한 1190bp인 총 네이티브 길이인 8% 미만을 나타낸다.
BM2SR-5 구성(SEQ ID NO: 5)은 베로 셀 기질에서의 바이러스 역가와 성장을 개선하기 위해, 세그먼트 안정성을 위한 M2로부터 더 작은 삭제, M1 발현에 대한 M1 변환 조절, 및 M1 M86V 돌연변이 등 모든 세그먼트 7개 개선 사항들의 조합이다.
BM2SR-1과 BM2SR-3 변이체들은 BM2 폴리펩티드를 발현하지 않는다. BM2SR-2, BM2SR-4, 및 BM2SR-5 변이체들은 BM2 단백질의 첫 11개의 아미노산을 포함하는 절단된 폴리펩티드를 잠재적으로 발현할 수 있지만, 이것은 아직 증명되지 않았다.
Ⅳ. 셀-기반 바이러스 생성 시스템(Cell-based virus production system)
A. "1세대" 변이체 바이러스들의 생성과 바이러스 역유전학
변이체 BM2 핵산을 운반하는 바이러스와 같은 변이체 바이러스는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350(1999)에 Neumann 등에 의해 설명된 플라스미드 기반의 역유전학에 의해 발생될 수 있다. 간단히 말해서, 진핵 호스트 셀들은 8개의 인플루엔자 B 세그먼트들 각각에 대응하는 8개의 바이러스 RNA를 암호화하는 하나 이상의 플라스미드로 감염된다. 각 바이러스 RNA 시퀀스는 RNA 중합효소 I 프로모터와 RNA 중합효소 I 종료기에 의해 측면 처리된다(flanked). 특히, BM2 단백질을 암호화하는 바이러스 RNA는 변이체 BM2 핵산 시퀀스를 포함한다. 호스트 셀은 야생형 BM2 단백질을 포함하여 바이러스 단백질들(예: 중합체, 핵단백질, 및 구조 단백질)을 암호화하는 하나 이상의 발현 플라스미드들로 추가적으로 감염된다. 바이러스 RNA 플라스미드를 갖는 호스트 셀의 감염은 8개의 인플루엔자 바이러스 RNA가 모두 합성되는데, 그 중 하나는 변이체 M2 시퀀스를 숨긴다. 공동 감염된 바이러스 중합체들 및 뉴클레오프로틴들은 바이러스 RNA들을 복제 및 전사되는 기능적 vRNP들로 결합하여 궁극적으로 변이체 BM2 핵산 시퀀스를 가지는 전염성 인플루엔자 바이러스를 형성하지만, 바이러스 지질 엔빌로프에 통합된 기능적 BM2 폴리펩타이드를 가지지 않는다.
예를 들면, B/FL/04/2006 세그먼트 7 및 B/Lee/1940 대조군에 기초한 BM2SR 변이체들에서는 표준 인플루엔자 역유전학 플라스미드 벡터들에 BM2-삭제된 세그먼트 7이 삽입되었고 최신 빅토리아와 야마가타 혈통 세그먼트 4와 6의 HA와 NA 조합으로 백신-후보 인플루엔자 B 바이러스들을 생성하는 데 사용하였다. PB1, PB2, PA, NP, NS1, 및 NS2를 포함하되 이에 국한되지 않는 내부 유전자 생성물들을 암호화하는 세그먼트 1, 2, 3, 5, 8은 B/Lee/40에서 도출되었다. 재조합 바이러스들은 293T 셀들로의 화학적으로 매개된 감염에 의해 생성되었다. 293T 생성된 BM2-결핍 돌연변이 바이러스들의 복구가 BM2 단백질을 구성하게 발현시키는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 셀들에서 수행되었다(즉, BM2CK 셀들).
표 4에 설명된 12개의 BM2-결핍 인플루엔자 B BM2SR 변이체 바이러스들이 만들어졌다. 표 4에 도시된 바와 같이 B/Lee/40-0, B/FL/04/2006-1, B/FL/04/2006-2, B/FL/04/2006-3, B/FL/04/2006-4, 및 B/FL/04/2006-5가 BM2SR-0, BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, 및 BM2SR-5에 각각 대응한다.
표 4
Influenza B BM2SR Mutant Virus Genotypes
세그먼트
(번호) 		HA:NA
(4, 6) 		BM2SR
(7) 		내부 유전자들
(1, 2, 3, 5, 8)
B/Brisbane/60/2008 B/Lee/40-0 B/Lee/40
B/FL/04/2006-1
B/FL/04/2006-2
B/FL/04/2006-3
B/FL/04/2006-4
B/FL/04/2006-5
B/Wisconsin/01/2010 B/Lee/40-0
B/FL/04/2006-1
B/FL/04/2006-2
B/FL/04/2006-3
B/FL/04/2006-4
B/FL/04/2006-5
"제1세대" 변이체 바이러스를 생산하는 대체 방법들로는 J. Virol. 65(5):2711-2713(1991)에서 Enami와 Palese에 의해 설명한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 유전자를 체외 생성 재조합형 RNA 분자로 대체할 수 있는 리보뉴클레오프로틴(RNP) 트랜스펙션 시스템을 들 수 있다.
바이러스 RNA는 체외에서 합성되며, RNA 트랜스크립트(transcript)는 Cell 59:1107-1113에 Luytjes 등에 의해 입증된 바와 같이 감염된 셀에서의 생물학적으로 활성 RNP 역할을 하는 바이러스 뉴클레오프로틴(NP)과 중합효소 단백질들로 코팅된다.
RNP 형질주입 방법은 4단계로 나눌 수 있다. 즉, 1) RNA 준비: 인플루엔자 바이러스 세그먼트에 대한 플라스미드 DNA 코딩이 체외 전사 반응에서 음감(negative-sense) RNA로 기록되고, 2) RNA의 캡슐화: 그 후, 생물학적으로 활동적인 RNP 콤플렉스를 형성하기 위해, 전술한 RNA는 분열된 인플루엔자 바이러스로부터 격리된 구배 정제된 NP 및 중합효소 단백질들 혼합된다. 3) 캡슐화된 RNA의 감염과 구조: 인공 리보핵캡시드는 이전에 구조되는 사람과는 다른 유전자를 포함하고 있던 도우미(helper) 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포로 전염된다; 도우미 바이러스는 전염된 RNA를 증폭시킬 것이다; 4) 전염된 유전자의 선택: 구조된 유전자를 포함하고 있는 도우미 바이러스와 트랜스펙턴트 모두 배양상층액에 있기 때문에, 감염된 유전자를 가진 바이러스를 격리시키기 위해 항체를 이용한 적절한 선택 시스템이 필요하다.
그러한 선택 시스템은 특정한 생물학적, 분자적 특성을 가진 새로운 전염성 인플루엔자 바이러스를 생성할 수 있게 해준다. 표적 표면 단백질에 대한 항체 선택은 양 또는 음의 선택에 사용될 수 있다.
추가적으로 또는 대체적으로, 도우미 바이러스를 '포획'하고 트랜스펙턴트의 농축을 허용하기 위해 동일한 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체는 조직 배양 접시의 바닥에 코팅하는 데 사용될 수도 있고, 상청액이나 용출액에서 트랜스펙턴트에게 농축이 가능하도록 칼럼 매트릭스에 사용될 수도 있다.
트랜스펙턴트 바이러스는 BM2에서 제한 희석에 의해 다중 웰 플레이트의 세포를 발현하여 배양한 다음, 예를 들어 복제판을 만들어 식별하고 복제할 수 있다. 예를 들어, 성장한 바이러스를 포함하고 있는 멀티-웰(multi-well) 플레이트의 주어진 웰 반쪽은 BM2 단백질을 발현하는 MDCK 셀들을 감염시키는 데 사용될 수 있다(즉, BM2CK 셀들). 트랜스펙턴트 바이러스와 도우미 바이러스는 모두 BM2 단백질을 발현하는 MDCK 셀들에서 자랄 것이다. 그러나 표준 MDCK 셀들에는 오직 도우미 바이러스만이 자라 트랜스펙턴트를 함유하는 멀티-웰 플레이트의 웰을 식별할 수 있게 된다. 이 전염성 바이러스는 BM2 단백질을 발현하는 셀들에서 추가로 정제된 플라크가 될 수 있다.
B. 바이러스 변이체들을 전파
일부 실시예에서는 여기에 설명된 바이러스 변이체가 호스트 셀에 유지되고 전달된다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 변이체들과 같은 인플루엔자 바이러스 변이체의 성장에 적합한 전형적인 호스트 셀(예: 인플루엔자 바이러스 변이체)는 마딘-다르비 카닌 신장 셀들(MDCK 셀들), 아프리카 녹색 원숭이 셀들(예: 베로 셀들), CV-1 셀들 및 레수스(rhesus) 원숭이 신장 셀들(예: LLcomk.2 셀들)과 같은 시미안(simian) 셀들, 보빈(bovine) 셀들(예: MDBK 셀들), 돼지 셀들, 페렛(fetter) 셀들(예: 밍크 폐 셀들) BK-1 셀들, 설치류 셀들(예: 중국 햄스터 난소 셀들), 예컨대 배아 인간 망막 셀들과 같은 인간 셀들(예: PER-C6
Figure pct00001
), 293T 인간 배아 신장 셀들 및 배아 섬유아세포들을 포함하는 조류 셀들을 포함하되 이에 국한되지 않은 임의의 개수의 진핵 생물 셀들을 포함한다.
추가적으로 또는 대체적으로 일부 실시예들에서는, 예를 들어, 호스트 셀의 바이러스 감염을 증가시키거나 바이러스 성장률을 높임으로써, 진핵 호스트 셀은 바이러스 생성을 향상시키기 위해 변형된다. 예를 들어, 일부 실시예에서는 호스트 셀을 변형하여 세포 표면에 2,6 링크된 시알산을 발현하거나 발현을 증가시켜 변이체 또는 야생형 인플루엔자 B 바이러스에 의한 이러한 세포의 보다 효율적이고 효과적인 감염을 가능하게 한다. 예컨대, 미국 특허 출원 번호 2010-0021499 및 미국 특허 7,176,021호를 참조하라. 따라서 일부 예시적 실시예에서는 2,6-시알릴전달효소 유전자(ST6GAL 1)의 최소한 한 카피(copy)를 발현하기 위해 변형된 중국 햄스터 난포 셀들(CHO 셀들) 및/또는 베로 셀들을 사용한다. 예를 들어, 제한에 의한 것은 아니지만, 접근 번호 BC040009.1로 나타내는 호모 사피엔스 ST6 베타-갈라토사미드 알파-2,6-시알릴 트랜스퍼페라제 유전자 염기서열은 CHO 세포에 통합되어 발현할 수 있는 ST6Gal Ⅰ유전자의 한 예다. 기능성 ST6Gal I 유전자 생성물을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 카피를 셀로 만들 수 있다. 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 12개 를 초과하는 ST6Gal I 유전자를 발현하기 위해 안정적으로 변형된 세포가 사용될 수 있다. 단일 발현식 카세트는 발현될 ST6Gal I 유전자의 사본을 하나 이상 포함할 수 있는데, 이 유전자는 발기인, 강화인, 터미네이터 및 폴리아데닐레이션 신호 시퀀스와 같은 규제 요소와 작동하여 ST6Gal I 유전자 또는 그 카피의 발현을 용이하게 할 수 있다. 또는, 단일 발현식 카세트는 ST6Gal I 유전자의 한 카피와 호스트 셀 게놈에 통합된 다중 발현식 카세트를 발현하도록 설계될 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에서는 적어도 하나의 ST6Gal I 유전자가 호스트 셀의 게놈에 통합되어 셀이 ST6Gal I 유전자와 그 효소 단백질 제품을 발현한다. 카피 번호에 따라, 단일 호스트 셀은 많은 기능성 ST6Gal I 유전자 단백질들을 발현할 수 있다.
복제, 전염, 안정적이고 변형된 세포 라인을 생산하는 데 적합한 벡터들은 관련 분야에서 공지되어 있다. 한 가지 제한되지 않는 예는 pcDNA3.1 벡터(인비트로겐)를 포함한다.
추가적으로 또는 대체적으로, 일부 실시예들에서는 진핵 호스트 셀이 변이체 바이러스 유전자의 야생형 버전을 생산하기 위해 변형되어, 그 유전자를 트랜스 방식으로 바이러스에 공급한다. 예를 들어 변이체 BM2 단백질을 포함하는 바이러스 균주는 야생형 M2 단백질을 생성하는 호스트 셀에 침투할 때 증강된 성장율(예: 바이러스 생성량 증가)을 보일 수 있다. 일부 실시예에서 변이체 M2 단백질을 숨기는 바이러스 균주는 야생형 M2 유전자를 발현하지 않는 셀에서 자라거나 복제되지 않을 수 있다. 또한, 그러한 호스트 셀은 예를 들어, 그러한 호스트에는 반전에 대한 선택적 압력이 없기 때문에, 기능적 M2 시퀀스로의 바이러스 반환을 늦추거나 방지할 수 있다.
발현 벡터들과 변형된 호스트 셀들 모두를 만드는 방법은 관련 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, BM2 발현 벡터는 아래 진핵식 발현 벡터에서 M2 핵산 시퀀스(M2 ORF 시퀀스; 즉 코돈(표 5)을 중지하기 위한 "와일드형" M2 시작 코돈)를 배치하여 만들 수 있다.
표 5
Wild-type BM2 nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 13)
ATGCTCGAACCACTTCAGATTCTTTCAATTTGTTCTTTCATTTTATCAGCTCTCCATTTCATGGCTTGGACAATAGGGCATTTGAATCAAATAAGAAGAGGGGTAAACcTGAAAATACAAATAAGGAATCCAAATAAGGAGGCAATAAACAGAGAGGTGTCAATTCTGAGACACAATTACCAAAAGGAAATCCAAGCCAAAGAAACAATGAAGAAAATACTCTCTGACAACATGGAAGTATTGGGTGACCACATAGTAGTTGAAGGGCTTTCAACTGATGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTGGAAGAATTGCAATGAGCCCAATTTTCACTGTATTTCTTACTATGCATTTAAGCAAATTGTAATCAATGTCAGTGAATAAAACTGGAAAAAGTGCGTTGTTTCTACT
호스트 셀(예: MDCK 셀들, 베로 셀들)는 예를 들어, TransIT
Figure pct00002
LT1(Mirus Bio, Madison, WI)와 같이 상업적으로 이용 가능한 시약과 키트를 사용하는 것과 같이, 관련 분야에 공지된 방법에 의해 전염될 수 있다. 예를 들어, 하지만 제한적이지 않게, 검출 가능한 마커 또는 선택 가능한 마커(예: 저자극 저항성)로 동시형질주입에 의한 것 및/또는 예를 들면 M2 항체를 사용한 간접 면역 체계에 의한 스크리닝에 의해 BM2 발현에 대해 셀들이 선택되고 테스트될 수 있다. BM2 발현은 간접 면역, 유동 세포측정학 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시예들에서, 셀들과 바이러스 변이체들은 관련 분야에서 공지된 방법들에 의해 배향되고 전파된다. 예를 들면, 하지만 제한적이지 않게 일부 실시예들에서는 호스트 셀들이 10%의 태아 종아리 혈청으로 보충된 MEM 앞에서 성장한다. BM2를 발현하는 셀들은 PBS로 씻은 후 37℃에서 흡착 바이러스가 발생하여 0.001의 MOI에서 감염된다. 일부 실시예들에서는 트립신/TPCK을 함유하는 바이러스성 성장 매체를 첨가하고 세포질 효과가 관찰될 때까지 2~3일 동안 세포를 배양한다.
이러한 라인들을 따라, 일회용 생체 반응기 시스템은 바이러스가 있든 없든 포유류 세포를 위해 개발되었으며, 이점에는 더 빠른 시설 설치와 교차 오염의 위험 감소 등이 포함된다. 예를 들어, 여기에 설명된 셀은 스테딤(Stedium), SAFC 생물과학의 바이오아제 백(Bioeaze bag)들, Cellexus Biosytems로부터의 HybridBagTM 또는 HyClone의 단일 사용 바이오리엑터 또는 Lonza의 Celltainer로부터의 것들과 같은 과 같은 일회용 백들에서 배양될 수 있다. 바이오리엑터들은 1L, 10L, 50L, 250L, 1000L 크기 형식들이 될 수 있다. 일부 실시예에서는 동물성 생성물이 없는 혈청 없는 최적화된 매체로 셀이 정지 상태로 유지된다. 이 시스템은 예를 들어 1L에서 10L로 단일 백에서 배양이 확장될 수 있는 페드-배치(fed-batch) 시스템이거나, 동시에 배양 배지에서 잠재적으로 독성이 있는 부산물이 축적되는 것을 방지하면서 영양분을 지속적으로 공급할 수 있는 관류(perfusion) 시스템일 수 있다.
장기간 보관을 위해, 변이체 바이러스는 동결된 스톡(stock)들로서 저장될 수 있다.
Ⅴ. BM2-발현 셀 라인들
A. BM2-발현 셀 기재에서의 M2-결핍 인플루엔자 A 및 BM2-결핍 인플루엔자 B 균주들의 성장
전술한 바와 같이, BM2는 인플루엔자 B 비리온 엔빌로프들로 통합되는 인테그랄(integral) 멤브레인 단백질이다. 전기생리학적 연구는 BM2가 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 기능적 대안으로 양성자(H+) 이온 채널 활성을 가지고 있다는 것을 입증했다. Mould등의, Dev. Cell 5:175-184(2003). 인플루엔자 M2 단백질은 인플루엔자 A 바이러스와 인플루엔자 B 바이러스 모두의 복제에 필요하다(와타나베, S, 등의 J. Virol. 83:5947-5950(2009)). 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 게놈 RNA 세그먼트 7 내에서 M2 이온 채널을 암호화하는 개방된 판독 프레임(ORF)의 삭제 또는 돌연변이는 임의의 감염된 세포로부터의 자손 입자들의 방출을 완전히 차단하는 바이러스 성숙의 실패를 야기한다.
M2에서 돌연변이를 활성화하는 것은 인플루엔자 A나 인플루엔자 B M2 cDNA들을 안정적으로 발현하도록 설계된 셀 라인들의 게놈 내에 암호화된 M2 단백질들에 의해 트랜스 방식으로 보완될 수 있다. 야생형 A/PR/8/1934 M2(SEQ ID NO: 23)와 B/Lee/40 BM2(SEQ ID NO: 24) cDNA들의 발현은 M2-결핍 변이체 A 바이러스들(M2SR)과 BM2-결핍 변이체 B 바이러스들(BM2SR)이 복제하는 것을 허용한다. 예를 들어, M2CK(FluA) 셀들로 알려진 변형된 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 셀 라인들과 강력한 합성 CAG 프로모터(미야자키, J; 다카키, S; 아라키, K. 타시노, F; 토미나가, A; 타카츠 K; 야마무라, K(1989년 7월 15일)를 채용하는 BM2CK (FluB) 셀들에서 입증될 수 있다. "치킨 베타-액틴 프로모터에 기초한 발현 벡터 시스템은 인터루킨-5의 효율적인 생산을 지시한다". 유전자 79(2): 269-77) A/PR/8 M2 및 B/Lee/40 BM2 단백질들의 고수준 구성 발현을 각각 구동한다. 인플루엔자 A M2 및 인플루엔자 B M2 단백질들 M2 결핍 인플루엔자 A 및/또는 BM2 결핍 B 바이러스들을 보완할 수 있는지 여부를 판단하기 위해, 관련 분야에서 공지된 방법들에 따라 표준 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50) 검사(WHO)가 사용될 수 있다.
따라서 일부 실시예들에서, 본 개시물은 BM2 결핍 인플루엔자 B 바이러스ㄷ들(즉, BM2SR 바이러스들)과 M2 결핍 인플루엔자 A 바이러스들(즉, M2SR 바이러스들)의 성장을 모두 지원하는 BM2CK 셀 라인을 제공한다. 일부 실시예에서는 M2에서 결핍된 변종 인플루엔자 A 변이체들이 BM2가 트랜스 방식으로 보충되는 BM2CK 셀들에서 성장한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에서 설명된 BM2CK 셀들은 인플루엔자 A M2-결핍 M2SR 바이러스 균주들의 성장을 보완하고 지원한다.
일부 실시예들에서, BM2가 부족한 인플루엔자 B 변이체들은 M2가 트랜스 방식으로 보충되는 M2CK 셀들에서 성장한다. 일부 실시예들에서, 본 명세서에서 설명된 M2CK 셀들은 인플루엔자 B M2-결핍 BM2SR 바이러스 균주들의 성장을 보완하고 지원한다.
B. 키메릭(Chimeric) M2 단백질들
역유전학(RG)에 의한 인플루엔자 B BM2 결핍 BM2SR 바이러스들의 구출을 위해서는 BM2 단백질이 수신 세포 기질 내에서 트랜스 방식으로 공급되어야 한다. 그러나 고효율 RG에 가장 많이 사용되는 293T 셀에는 BM2 발현이 부족하다. 따라서 BM2SR 바이러스들은 일반적으로 앞서 설명한 바와 같이 독감 복제제(4)와 게놈 RNA(8)들을 암호화하는 표준 12 플라스미드 인플루엔자 RG 시스템과 함께 BM2 단백질을 암호화하는 13번째 플라스미드를 공급하여 293T에서 생성된다. 예: Neumann 등에 의해, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350(1999)에 실린 Hatta & Kawaoka, J. Virol. 77:6050-6054(2003)을 참조하라.
M2 단백질은 1) 세포외 또는 엑토도메인, 2) TM(transmembrane) 영역; 및 3) 세포내 세포질 또는 엔도도메인(도 10)의 세 영역으로 나눌 수 있다.
인플루엔자 A M2의 세포외 영역은 길이가 약 24 내지 27인 아미노산들이며, 알려진 구조를 가지고 있으며, 항원성이거나 잘 정의된 구조를 가지고 있지 않은 것으로 알려진 BM2 영역의 잔류물 6 내지 9개에 비하여 14C2 에피토프(epitope)를 암호화한다(Cross, Nature Structural & Molecular Biology 16:1207-1209(2009)). 인플루엔자 A M2 세포외 영역의 초기 9개의 아미노산은 M2를 만들기 위해 상이하게 스플라이싱되는 공유된 엑손(exon)에서 암호화되기 때문에 M1 단백질의 N-터미누스(terminus)와 동일하다. 따라서 이 배열은 인플루엔자 B에는 존재하지 않으므로 BM1과 BM2는 단백질 시퀀스 아이덴티티를 공유하지 않는다.
인플루엔자 A와 B 모두에서의 트랜스멤브레인(TM) 영역들은 채널 기능에 필요한 것으로 나타난 동일한 간격의 히스티딘과 트립토판 잔류물을 갖는 정규의 19개 아미노산 구조를 함유하는 약 22 내지 24개의 잔류물 길이를 갖는 pH에 의존적인 양성자 채널들을 암호화한다. 인플루엔자 A M2의 TM 영역은 치료용 채널 억제제인 아만타딘의 표적이지만 BM2는 그렇지 않다.
BM2의 엔도메인은 인플루엔자 A M2의 경우 약 47 내지 51에 비해 길이가 약81 내지 83개 아미노산이 더 크다. 2개의 엔도메인 모두 공간적으로 고충전 산성과 기본 영역들이 분리되어 있는 극소수성이다. 실제로, BM2 엔도메인은 단백질에 대해 여태 보고된 가장 큰 쌍극성 모멘트들 중 하나를 가진다.
일부 실시예들에서, 본 개시물은 도 10에서 도시된 바와 같이 다양한 순열들로 인플루엔자 A M2와 인플루엔자 B BM2로부터 3개의 영역들의 키메릭 융합(fusion)들을 제공한다. 일부 실시예에서 인플루엔자 A TM 도메인은 셀 표면과 TM 도메인의 나머지 부분 가까이에 있는 아만타딘 결합 사이트를 암호화하는 하위 도메인들로 분할될 수 있다. 이들 변이체들에 대한 도메인 구조들은 도 10에 제시되어 있다. 일부 실시예들에서는 각각 BM2 H+-채널 활동을 폐지하는 것으로 밝혀진 2개의 아미노 대체물인 S12L과 H19C를 결합하는 BM2 채널-널(BM2 null; BBB null) 변이체가 제공된다.
표 6에는 인플루엔자 A/PR/8 M2, 인플루엔자 B/Lee/40 BM2 및 그것들의 키메릭 융합 단백질들 대한 야생형 및 키메릭 아미노산 시퀀스들이 제공된다.
표 6
M2 and Chimeric M2 protein amino acid sequences: Influenza A/PR/8 M2, influenza B/Lee/40 BM2 and chimeric fusion proteins thereof.
A/PR/8 M2 (SEQ ID NO: 14) 97 amino acid wild-type influenza A/Puerto Rico/1934 (H1N1) M2 protein.MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDPLTIAANIIGILHLTLWILDRLFFKCIYRRFKYGLKGGPSTEGVPKSMREEYRKEQQSAVDADDGHFVSIELE

UPPER CASE = M2 Protein
UNDER LINE = Transmembrane Domain
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
B/Lee/40 BM2 (SEQ ID NO: 15) 109 amino acid wild-type influenza B/Lee/1940 BM2 protein.MLEPLQILS ICSFILSALHFMAWTIGHL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

BOLD UPPER CASE = BM2 Protein
BOLD UNDER LINE = BM2 Transmembrane Domain
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
BM2 Null (SEQ ID NO: 16) 109 amino acid influenza B/Lee/1940 BM2 protein with Null Channel Mutation.MLEPLQILS ICSFILSAL C FMAWTIGHL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

BOLD UPPER CASE = BM2 Protein
BOLD UNDER LINE = BM2 Transmembrane Domain
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
GREY SHADING ITALICS = His19Cys Proton Channel Null Mutation
ABB influenza M2 (SEQ ID NO: 17) Chimeric 127 amino acid M2 protein: influenza A M2 Ectoplasmic Domain + influenza B M2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDPLS ICSFILSALHFMAWTIGHL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

UPPER CASE = Influenza A M2 Protein
BOLD UNDER LINE = BM2 Transmembrane Domain
BOLD UPPER CASE = BM2 Protein
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
AAB influenza M2 (SEQ ID NO: 18) Chimeric 127 amino acid M2 protein: influenza A M2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDPLTIAANIIGILHLTLWILDRL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

UPPER CASE = Influenza A M2 Protein
UNDER LINE = Influenza A Transmembrane Domain
BOLD UPPER CASE = BM2
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
AA'B influenza M2 (SEQ ID NO: 19) Chimeric 127 amino acid M2 protein: influenza A M2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain Portion + influenza BM2 Transmembrane Domain Portion + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDPLTIAANIIGILH FMAWTIGHL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

UPPER CASE = Influenza A M2 Protein
UNDER LINE = A M2-BM2 Chimeric Transmembrane Domain
BOLD UPPER CASE = BM2
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
BAB influenza M2 (SEQ ID NO: 20) Chimeric 109 amino acid M2 protein: influenza B M2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.
MLEPLQILT IAANIIGILHLTLWILDRL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

UPPER CASE = Influenza A M2 Protein
UNDER LINE = Influenza A M2 Transmembrane Domain
BOLD UPPER CASE = BM2
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
BBA influenza M2 (SEQ ID NO: 21) Chimeric 79 amino acid M2 protein: influenza BM2 Ectoplasmic Domain + influenza BM2 Transmembrane Domain + influenza A M2 Cytoplasmic Domain.
MLEPLQILS ICSFILSALHFMAWTIGHL FFKCIYRRFKYGLKGGPSTEGVPKSMREEYRKEQQSAVDADDGHFVSIELE

UPPER CASE = Influenza A M2 Cytoplasmic Domain
BOLD UPPER CASE = Influenza BM2 Protein
BOLD UNDER LINE = Influenza BM2 Transmembrane Domain
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
BA'B influenza M2 (SEQ ID NO: 22) Chimeric 109 amino acid M2 protein: influenza B M2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.
MLEPLQILT IAANIIGILH FMAWTIGHL NQIRRGVNLKIQIRNPNKEAINREVSILRHNYQKEIQAKETMKKILSDNMEVLGDHIVVEGLSTDEIIKMGETVLEVEELQ

UPPER CASE = Influenza A M2 Protein
UNDER LINE = Influenza A M2 Transmembrane Domain Portion
BOLD UNDER LINE = Influenza BM2 Transmembrane Domain Portion
BOLD UPPER CASE = BM2
GREY SHADING = Canonical Proton Channel Residues
일부 실시예들에서, 본 개시물은 코돈-최적화된 M2, BM2, 및 키메릭 M2 단백질들을 제공한다. 표 7에는 인플루엔자 A/PR/8 M2, 인플루엔자 B/Lee/40 BM2, 코돈 최적화 인플루엔자 A/PR8/M2, 코돈 최적화 인플루엔자 B/Lee/40 BM2, 및 그것들의 코돈 최적화된 키메릭 융합 단백질들을 암호화하는 야생형 및 키메릭 cDNA 시퀀스들이 제공된다.
표 7
cDNA sequences encoding M2 and Chimeric M2 protein amino acid sequences: Influenza A/PR/8 M2, influenza B/Lee/40 BM2, codon-optimized Influenza A/PR/8 M2, codon-optimized influenza B/Lee/40 BM2, and codon-optimized chimeric fusion proteins thereof.
A/PR/8 M2 (SEQ ID NO: 23) wild-type influenza A/Puerto Rico/1934 (H1N1) M2 cDNA.5'ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGATCCTCTCACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGtaa

UNDER LINE = Start Codon
Small Case= Stop Codon
B/Lee/40 BM2 (SEQ ID NO: 24) wild-type influenza B/Lee/1940 BM2 cDNA.5' ATG CTCGAACCACTTCAGATTCTTTCAATTTGTTCTTTCATTTTATCAGCTCTCCATTTCATGGCTTGGACAATAGGGCATTTGAATCAAATAAGAAGAGGGGTAAACCTGAAAATACAAATAAGGAATCCAAATAAGGAGGCAATAAACAGAGAGGTGTCAATTCTGAGACACAATTACCAAAAGGAAATCCAAGCCAAAGAAACAATGAAGAAAATACTCTCTGACAACATGGAAGTATTGGGTGACCACATAGTAGTTGAAGGGCTTTCAACTGATGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTGGAAGAATTGCAAtaa

BOLD UNDER LINE = BM2 Start Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
B/Lee/40 BM2 (SEQ ID NO: 25) channel null mutant influenza B/Lee/1940 BM2 cDNA.5' ATG CTCGAACCACTTCAGATTCTTTCAATTTGTCTTTTCATTTTATCAGCTCTC tgt TTCATGGCTTGGACAATAGGGCATTTGAATCAAATAAGAAGAGGGGTAAACCTGAAAATACAAATAAGGAATCCAAATAAGGAGGCAATAAACAGAGAGGTGTCAATTCTGAGACACAATTACCAAAAGGAAATCCAAGCCAAAGAAACAATGAAGAAAATACTCTCTGACAACATGGAAGTATTGGGTGACCACATAGTAGTTGAAGGGCTTTCAACTGATGAGATAATAAAAATGGGTGAAACAGTTTTGGAGGTGGAAGAATTGCAAtaa

BOLD UPPER CASE UNDER LINE = BM2 Start Codon
bold lowercase under line = His19Cys Channel Mutation Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
A M2 OPT (SEQ ID NO: 26) codon-optimized wild-type influenza A/Puerto Rico/1934 (H1N1) M2 cDNA.5'ATGTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACTCCTATTAGAAACGAGTGGGGCTGTAGATGTAACGGCTCAAGCGACCCTCTGACCATTGCTGCCAACATCATTGGCATCCTGCACCTGACCCTGTGGATTCTGGACCGACTGTTCTTTAAGTGCATCTACCGGAGATTCAAGTATGGACTGAAAGGAGGACCAAGCACAGAGGGAGTGCCTAAATCCATGAGGGAGGAATACCGCAAAGAGCAGCAGAGCGCCGTGGACGCAGATGATGGACATTTCGTGAGCATTGAACTGGAAtga

UNDER LINE = Start Codon
Small Case= Stop Codon
BM2 OPT (SEQ ID NO: 27) codon-optimized wild-type influenza B/Lee/1940 BM2 cDNA.5' ATG CTGGAACCACTGCAGATCCTGAGTATTTGCTCTTTTATCCTGAGCGCACTGCACTTTATGGCCTGGACTATCGGGCACCTGAACCAGATCAGAAGGGGCGTGAACCTGAAGATCCAGATCAGAAACCCAAACAAGGAGGCCATCAACCGCGAAGTGAGCATCCTGAGACACAATTACCAGAAGGAGATCCAGGCTAAAGAAACCATGAAGAAAATCCTGTCTGACAATATGGAGGTGCTGGGCGATCACATCGTGGTGGAAGGACTGAGCACCGACGAAATCATCAAAATGGGCGAGACTGTCCTGGAAGTGGAAGAACTGCAGtaa

BOLD UNDER LINE = BM2 Start Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
ABB M2 OPT (SEQ ID NO: 28): cDNA Encoding Codon-Optimized, Chimeric M2 protein: influenza A M2 Ectoplasmic Domain + influenza BM2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.ATGTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACTCCTATTAGAAACGAGTGGGGCTGTAGATGTAACGGCTCAAGCGACCCTCTGACCATTGCTGCCAACATCATTGGCATCCTGCACCTGACCCTGTGGATTCTGGACCGACTGAACCAGATCAGAAGGGGCGTGAACCTGAAGATCCAGATCAGAAACCCAAACAAGGAGGCCATCAACCGCGAAGTGAGCATCCTGAGACACAATTACCAGAAGGAGATCCAGGCTAAAGAAACCATGAAGAAAATCCTGTCTGACAATATGGAGGTGCTGGGCGATCACATCGTGGTGGAAGGACTGAGCACCGACGAAATCATCAAAATGGGCGAGACTGTCCTGGAAGTGGAAGAACTGCAGtaa

UPPER CASE = Codon-optimized A M2 cDNA
BOLD UPPER CASE = Codon-optimized BM2 cDNA
UNDER LINE = A M2 Start Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
AAB M2 OPT (SEQ ID NO: 29): cDNA Encoding Codon-Optimized, Chimeric M2 protein: influenza A M2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.ATGTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACTCCTATTAGAAACGAGTGGGGCTGTAGATGTAACGGCTCAAGCGACCCTCTGACCATTGCTGCCAACATCATTGGCATCCTGCACCTGACCCTGTGGATTCTGGACCGACTGAACCAGATCAGAAGGGGCGTGAACCTGAAGATCCAGATCAGAAACCCAAACAAGGAGGCCATCAACCGCGAAGTGAGCATCCTGAGACACAATTACCAGAAGGAGATCCAGGCTAAAGAAACCATGAAGAAAATCCTGTCTGACAATATGGAGGTGCTGGGCGATCACATCGTGGTGGAAGGACTGAGCACCGACGAAATCATCAAAATGGGCGAGACTGTCCTGGAAGTGGAAGAACTGCAGtaa

UPPER CASE = Codon-optimized A M2 cDNA
BOLD UPPER CASE = Codon-optimized BM2 cDNA
UNDER LINE = A M2 Start Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
AA2FB M2 OPT (SEQ ID NO: 30): cDNA Encoding Codon-Optimized, Chimeric M2 protein: influenza A M2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain with 2F longer + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.5'ATGTCCCTGCTGACCGAAGTGGAAACTCCTATTAGAAACGAGTGGGGCTGTAGATGTAACGGCTCAAGCGACCCTCTGACCATTGCTGCCAACATCATTGGCATCCTGCACCTGACCCTGTGGATTCTGGACCGACTGTTCTTTAACCAGATCAGAAGGGGCGTGAACCTGAAGATCCAGATCAGAAACCCAAACAAGGAGGCCATCAACCGCGAAGTGAGCATCCTGAGACACAATTACCAGAAGGAGATCCAGGCTAAAGAAACCATGAAGAAAATCCTGTCTGACAATATGGAGGTGCTGGGCGATCACATCGTGGTGGAAGGACTGAGCACCGACGAAATCATCAAAATGGGCGAGACTGTCCTGGAAGTGGAAGAACTGCAGtaa

UPPER CASE = Codon-optimized A M2 cDNA
BOLD UPPER CASE = Codon-optimized BM2 cDNA
UNDER LINE = A M2 Start Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
BAB M2 OPT (SEQ ID NO: 31): cDNA Encoding Codon-Optimized, Chimeric M2 protein: influenza BM2 Ectoplasmic Domain + influenza A M2 Transmembrane Domain + influenza BM2 Cytoplasmic Domain.5' ATG CTCGAACCACTTCAGATTCTTACTATTGCTGCCAACATCATTGGCATCCTGCACCTGACCCTGTGGATTCTGGACCGACTGAACCAGATCAGAAGGGGCGTGAACCTGAAGATCCAGATCAGAAACCCAAACAAGGAGGCCATCAACCGCGAAGTGAGCATCCTGAGACACAATTACCAGAAGGAGATCCAGGCTAAAGAAACCATGAAGAAAATCCTGTCTGACAATATGGAGGTGCTGGGCGATCACATCGTGGTGGAAGGACTGAGCACCGACGAAATCATCAAAATGGGCGAGACTGTCCTGGAAGTGGAAGAACTGCAGtaa

UPPER CASE = Codon-optimized A M2 cDNA
BOLD UPPER CASE = Codon-optimized BM2 cDNA
BOLD UNDER LINE = BM2 Start Codon
Bold Small Case = BM2 Stop Codon
BBA M2 OPT (SEQ ID NO: 32): cDNA Encoding Codon-Optimized, Chimeric M2 protein: influenza BM2 Ectoplasmic Domain + influenza BM2 Transmembrane Domain + influenza A M2 Cytoplasmic Domain.5' ATG CTGGAACCACTGCAGATCCTGAGTATTTGCTCTTTTATCCTGAGCGCACTGCACTTTATGGCCTGGACTATCGGGCACCTGTTCTTTAAGTGCATCTACCGGAGATTCAAGTATGGACTGAAAGGAGGACCAAGCACAGAGGGAGTGCCTAAATCCATGAGGGAGGAATACCGCAAAGAGCAGCAGAGCGCCGTGGACGCAGATGATGGACATTTCGTGAGCATTGAACTGGAAtga
UPPER CASE = Codon-optimized A M2 cDNA
BOLD UPPER CASE = Codon-optimized BM2 cDNA
BOLD UNDER LINE = BM2 Start Codon
small case = A M2 Stop Codon
본 명세서에서 설명된 것처럼 일부 실시에들에서는, 베로 셀들이 야생형 A M2 단백질(SEQ ID NO: 14), 야생형 BM2 단백질(BBB(SEQ ID NO: 15)), 또는 BM2 키메릭 단백질(예컨대, ABB(SEQ ID NO: 17), AAB(SEQ ID NO: 18), AA'B(SEQ ID NO: 19), BAB(SEQ ID NO: 20), BBA(SEQ ID NO: 21), 및 BA'B (SEQ ID NO: 22))을 생성하기 위해 변형된다.
변형된 베로 세포들과 같은, 발현 플라스미드들과 변형된 호스트 셀들 모두를 생성하는 방법들은 관련 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 키메릭 M2 핵융합 단백질 발현 플라스미드는 M2 융합 단백질 핵산 시퀀스(예컨대, 코돈 최적화된 BBA(SEQ ID NO: 32)를 진핵성 발현 플라스미드에 배치하여 만들 수 있다.
그런 다음 베로 셀들은, 예컨대 TransIT® LT1(Mirus Bio, Madison, WI)와 같이 상업적으로 이용 가능한 시약과 키트를 사용하는 것과 같이 관련 분야에서 알려진 방법에 의해 전염될 수 있다. 예를 들어, 제한에 의한 것이 아니라 검출 가능한 마커 또는 선택 가능한 마커(예컨대, 저자극 저항성)로 동시형질주입에 의하고/의하거나 예를 들어, BM2 항체를 사용하는 간접 면역체 검사를 통해 BM2 발현에 대해 셀들이 선택되고 테스트될 수 있다. BM2 발현은 간접 면역, 유동 세포측정학 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시예들에서, M2 결핍 인플루엔자 A M2SR과 BM2 결핍 BM2SR 백신 바이러스들의 생산을 위한 베로 호스트 셀들의 성능은 상이한 세로형(serotype)들, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B로부터의 M2 유전자들의 키메릭 융합들을 포함하여 설계된 M2 단백질들 사용과 발현에 의해 개선될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예들에서, A M2 및 BM2 키메릭 단백질들(예: ABB(SEQ ID NO: 17), AAB(SEQ ID NO: 18), BAB(SEQ ID NO: 20), BBA(SEQ ID NO: 21)을 발현하는 베로 셀들은, 인플루엔자 A M2SR 변이체들의 성장을 지원한다. 일부 실시예들에서는 야생형 BM2 단백질(BBB(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 베로 셀들이 인플루엔자 A M2SR 변이체들의 성장을 지원한다. 일부 실시예에서는 야생형 BM2 단백질(BBB(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 베로 셀들이 인플루엔자 BM2SR 변이체들의 성장을 지원한다.
C. BM2 베로 셀들이 인플루엔자 A M2SR 변이체들의 성장을 지원한다
높은 역가(titer)까지 인플루엔자 바이러스의 빠른 복제를 지원하는 능력 때문에, MDCK 셀들은 일반적으로 인플루엔자 연구와 개발에 사용된다. 하지만, 셀 자체가 신소성/유전자성인 것으로 나타났기 때문에 MDCK 셀들에서 파생된 임의의 생물학적 산물들에 대해서는 규제 승인을 얻기가 어렵다. 반면 베로 셀들은 1960년대이후로 소아마비 백신과 MMR 백신과 같은 셀 기반의 백신 제조를 승인받았다.
일부 실시예들에서, 본 개시물은 M2 결핍 인플루엔자 A 바이러스의 제조를 위한 생산 셀들로서 역할을 할 수 있는 베로 셀 라인을 제공한다. 일부 실시예에서 베로 셀 라인은 BM2 단백질을 발현하는 코돈 최적화된 야생형 인플루엔자 B/Lee/40 BM2 뉴클레오티드 시퀀스(SEQ ID NO: 27)을 포함한다. 이러한 베로 셀 라인은 여기에서 BM2Vero4로 지칭된다. 일부 실시예들에서 M2 결핍 인플루엔자 A 바이러스는 A/California/07/2009pdm H1N1 M2SR(A/CA/07)이며, 이는 A/California/07/2009pdm의 H1 및 N1 세그먼트를 함유한다. 인플루엔자 A M2 바이러스 변이체에 대한 cDNA 시퀀스는 아래 표 8에 제공된다. 일부 실시예에서, BM2Vero4 셀들은 M2 단백질의 인플루엔자 A 버전을 발현하는 MDCK 셀들의 것과 실질적으로 동등한 수준에서 인플루엔자 A H1N1 M2SR 바이러스를 생산한다.
표 8
Influenza A M2 (SEQ ID NO: 33) M2 ectodomain + 2 stop codons + TM deletion (PR8 M segment + 2 stops (786-791) without 792-842 (TM)); also known as "M2KOTMdel," "M2KO△TM."
3'AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGatgagtcttctaaccgaggtcgaaacGTACGTACTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGgcctatcagaaacgaatgggggtgcagatgcaacggttcaagtgat TAATAG gatcgtctttttttcaaatgcatttaccgtcgctttaaatacggactgaaaggagggccttctacggaaggagtgccaaagtctatgagggaagaatatcgaaaggaacagcagagtgctgtggatgctgacgatggtcattttgtcagcatagagctggagtaaAAAACTACCTTGTTTCTACTLower case letters = M2 sequence
UPPER CASE LETTERS = M1 sequence
BOLD, UNDERLINE = Mutant sequence (e.g., stop codons)
이 변이체로부터 생성된 M2 폴리펩타이드 시퀀스는 다음과 같다: MSLLTEVETPIRNEWGCRCRCNGSSD(SEQ ID NO: 34).
D.BM2 베로 셀들에 의해 생성된 인플루엔자 M2SR 비리온의 M2 단백질 내용물(content)
일부 실시예들에서, 본 개시물은 바이러스가 인플루엔자 A M2 단백질을 발현하지 못하지만, BM2 단백질을 함유하는 (예: A/Brisbane/10(SEQ ID NO: 33)에서 HA 및 NA를 발현하는 인플루엔자 A M2SR 백본을 포함하는 인플루엔자 A M2SR 바이러스와, 아래 예들에서 설명한 것과 동일한 제조 방법들을 제공한다. 일부 실시예들에서 BM2 베로 셀들은 코돈 최적화된 cDNA로부터 야생형 B/Lee/40 BM2 단백질을 발현하는 BM2Vero4 셀들이다(SEQ ID NO: 27).
Ⅵ. 백신들 및 투여 방법
A. 면역원성 조성물들/백신들
여기에 공개된 세포 기반의 바이러스 생산 시스템에서 만들어질 수 있는 다양한 종류의 백신이 있다. 본 개시물은 실시간 약독화 바이러스 백신, 단일 복제 백신, 복제 결함 백신, 바이러스 벡터 백신, 비활성된 바이러스 백신, 전체 바이러스 백신, 분할 바이러스 백신, 비로좀(virosomal) 바이러스 백신, 바이러스 표면 항원 백신 및 이들의 혼합물의 제조 및 생산에 국한되지 않는다. 따라서 이러한 백신 유형의 적절한 조성이 면역반응(예: 체계적 면역반응)을 생성할 수 있는 다양한 인플루엔자 바이러스에 특정한 보호 면역반응을 생산할 수 있는 수많은 백신이 있다. 살아있는 약독화 바이러스 백신 또한 호흡기의 국소 점막 면역성을 자극할 수 있다는 장점이 있다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에서 설명된 조성물들에서 사용된 백신 항원들은 "직접" 항원, 즉 DNA로 투여되는 것이 아니라 항원 그 자체다. 이러한 백신들은 바이러스성 다당류 하지만 이것에 국한되지 않은 전체 바이러스 또는 바이러스의 부분만을 포함할 수 있고, 이는 그것들이 단독이거나 캐리어 단백질, 살아있는 약독화된 전체 미생물, 비활성된 미생물, 재조합 펩타이드 및 단백질, 글리코프로틴, 글리콜리피드들, 리포펩타이드들, 합성 펩타이드들, 또는 "분할" 백신이라고 하는 백신의 경우에서의 파열된 미생물과 같이, 캐리어 요소들에 접합된 것인지는 관계 없다.
일부 실시예들에서는, 완전한 비리온 백신에 제공된다. 완전한 비리온 백신은 초정밀화에 의해 농축된 다음 지역 원심분리기 또는 크로마토그래피로 정화할 수 있다. 전형적으로, 그러한 비리온은 예를 들어 포르말린이나 베타-프로피올락톤을 사용하여 정화하기 전이나 후에 비활성화된다.
일부 실시예들에서는 서브유닛 백신이 제공되고, 이러한 서브유닛 백신은 정제된 글리코프로틴들을 포함한다. 그러한 백신은 다음과 같이 마련될 수 있는데, 즉 예를 들어, 세제로 치료하여 분해한 바이러스 중단제를 사용하여 표면 항원을 정제한다. 따라서 그러한 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질과 NA를 함유한다. 사용되는 세제는 헥사데실 트리메틸 암모늄 브롬화물과 같은 양이온성 세제, 디옥시콜산암모늄과 같은 음이온성 세제 또는 TRITON X100이라는 이름으로 상용화된 것과 같은 비이온성 세제일 수 있다. 혈구응집소는 또한 브로멜린과 같은 프로테아제로 바이러스를 처리한 후 표준적인 방법으로 정제될 수 있다.
일부 실시예들에서는 분리 백신이 제공되는데, 이 백신은 지질을 용해하는 물질로 치료를 받아온 바이러스들로 구성되어 있다. 분리 백신은 다음과 같이 준비될 수 있다: 위와 같이 얻은 정제된 바이러스의 수용성 서스펜션은 활성화되지 않았든 활성화되지 않았든 저으면서 세제와 관련된 에틸 에테르나 클로로포름과 같은 지질 용제에 의해 처리된다. 바이러스 엔빌로프 지질의 용해들은 바이러스 입자의 분열을 초래한다. 수용성 상은 원래 지질 환경이 제거된 혈구응집소와 뉴라미니다아제로 주로 구성된 분할 백신과, 코어 또는 그것의 분해 산물을 함유하여 회복된다. 그러면 이것이 이미 행해지지 않았다면 잔류 감염 입자들이 비활성화된다.
일부 실시예들에서는, 비활성화된 인플루엔자 바이러스 백신들이 제공된다. 일부 실시예들에서는, 비활성화된 백신들은 포르말린이나 ß프로피올락톤 처리와 같은 하지만 이것에 국한되지 않는 알려진 방법을 사용하여 바이러스를 비활성화함으로써 만들어진다. 발명에 사용될 수 있는 비활성 백신 종류는 전체 바이러스(WV) 백신이나 SV(Subvirion) (분할) 백신들을 포함할 수 있다. WV 백신은 온전하고 비활성된 바이러스를 포함하고 있으며, SV 백신은 지질 함유 바이러스 엔빌로프를 용해하는 세제로 인해 교란된 정제된 바이러스를 함유하고 있으며, 그 다음 화학적인 잔류 바이러스 비활성화가 이어진다.
추가적으로 또는 대체적으로 일부 실시예들에서는, 살아있는 감쇠된 인플루엔자 바이러스 백신이 제공된다. 이러한 백신은 알려진 방법 단계들에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시예들에서는, 약독화는 감약 기증자 바이러스의 감쇠된 유전자를 알려진 방법에 따라 격리 또는 재분배된 바이러스로 전송함으로써 한 번에 이루어진다(예: Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2, 174 (1993). 일부 실시예들에서는 바이러스가 하나 이상의 바이러스 핵산 시퀀스의 변이체에 의해 감쇠되어 변이체 바이러스가 발생한다. 예를 들어, 일부 실시예에서는 결함이 있는 단백질 제품의 변이체 바이러스 핵산 시퀀스 코드. 일부 실시예에서는 단백질 제품이 기능이 저하되었거나 기능이 저하되지 않았다. 다른 실시예에서는 변이체 바이러스 핵산으로부터 단백질 생산물이 생산되지 않는다.
그러므로 바이러스는 동물(예: 조류 및/또는 포유류)의 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물(예: 백신)으로서 알려진 방법들에 따라 약독화되거나 비활성화, 제형화 및 투여될 수 있다. 이러한 약독화된 또는 비활성된 백신이 임상 격리 또는 거기서 파생된 고성장 변종과 유사한 항원을 유지하는지 여부를 결정하는 방법은 관련 분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 알려진 방법에는 기증자 바이러스의 항원결정자를 발현하는 바이러스를 제거하기 위한 항체 또는 항체의 사용, 화학적 선택(예: 아만타딘 또는 리모티딘), HA 및 NA 활동 및 억제, 항원결정자를 인코딩하는 기증자의 유전자를 확인하기 위한 DNA 검사(예: 프로브 하이브리드화 또는 PCR)가 포함된다. 감쇠된 바이러스에는 HA 또는 NA 유전자) 또는 기타 변이체 시퀀스(예: M2)가 존재하지 않는다. 예를 들어, Robertson 등에 의한, Giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29, 4(1988); Kilbourne, Bull. M2 세계 보건 기구, 41, 643(1969); 및 로버트슨 등의 생물학(Biologicals), 20, 213(1992)를 참조하라.
일부 실시예들에서는, 백신이 기능성 BM2 단백질의 발현이 결여되는 단일 복제 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 일부 실시예들에서, 변이체 바이러스는 BM2 단백질을 발현하는 셀에서 잘 복제되지만, 해당 야생형 셀들에서는 전염성 자손 비리온들 바이러스를 생성하지 않고 바이러스 단백질들을 발현한다.
피부내 투여, 접종 또는 비경구 투여 또는 경구 투여에 적합한 현재 기술의 제약학적 조성물들은 감쇠 또는 비활성 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 선택적으로 무균 수용성 또는 비수용성 용액들, 서스펜션들 및 에멀전들을 포함할 수 있다. 그러한 조성물들은 관련 분야에서 공지된 바와 같이 보조제 또는 흥분제를 포함할 수 있다. 예를 들어, Berkow 등에 의한, The Merck Manual, 15판, Merck and Co, Rahway, N.J.(1987), Goodman 등에 의한, eds, Goodman 및 Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y.(1990); 에이버리의 약물 치료: 임상 약학과 치료의 원칙과 실천, 제3판, ADIS Press, LTD, 윌리엄스와 윌킨스, 볼티모어, Md. (1987); 및 Katzung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, 제5판, Appleton and Lange, Norwalk, Conn. (1992)을 참조하라.
일부 실시예들에서는, 비경구적 투여를 위한 준비물에는 불임 수용성 또는 비유해 해결책, 일시 중단 및/또는 에멀젼이 포함되며, 관련 분야에서 알려진 보조제 또는 흥분제를 포함할 수 있다. 비수성 용제의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 등의 식물성 오일, 에틸 올레산염과 같은 주입식 유기 에스테르 등이 있다. 캐리어들 또는 밀폐된 드레싱을 사용하여 피부 투과성을 높이고 항원 흡수를 강화할 수 있다. 구강 투여를 위한 액체 투여 형태는 일반적으로 액체 투여 형태를 함유하는 지질 용액으로 구성될 수 있다. 리포좀들을 서스펜드하기에 적합한 형태로는 정제수와 같이 일반적으로 기술에서 사용되는 불활성 희석제를 함유한 유화제, 중단제, 용액, 시럽 및 유막이 있다. 불활성 희석제 외에도, 그러한 성분에는 애주분, 습윤제, 유화제 및 부유제, 또는 감미료, 향미료 또는 향료제가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물이 개인에 대한 투여를 위해 사용될 때, 그것은 추가로 조성물의 효능을 향상시키기 위해 바람직한 소금, 완충제, 보조제 또는 기타 물질로 구성될 수 있다. 면역원성 조성물들 또는 백신의 경우, 특정 면역 반응을 증가시키는 물질인 보조제를 사용할 수 있다. 일반적으로 보조제와 조성물은 면역체계에 제시하기 전에 혼합되거나, 별도로 제시되지만, 면역되는 유기체의 동일한 부위로 나타난다.
일부 실시예들에서, 본 명세서에서 개시된 면역성 조성물들(예: 백신들)은 다수의 상이한 유형의 바이러스 또는 바이러스 항원들을 포함하며, 그 중 적어도 하나는 변이체 BM2 유전자(예컨대, BM2SR-1(SEQ ID NO: 1), BM2SR-2(SEQ ID NO: 2), BM2SR-3(SEQ ID: NO: 3), BM2SR-4(SEQ ID: NO: 4), 또는 BM2SR-5(SEQ ID: NO: 5) 변이체)를 포함한다.
일부 실시예들에서, 백신은 다른 바이러스 성분들 및/또는 다른 바이러스 성분들을 발현하는 유전자들과 함께 BM2SR-1(SEQ ID NO: 1), BM2SR-2(SEQ ID NO: 2), BM2SR-3(SEQ ID: NO: 3), BM2SR-4(SEQ ID: NO: 4), 또는 BM2SR-5(SEQ ID: NO: 5) 변이체를 포함하는 바이러스를 포함한다. 일부 실시예들에서, 백신(예컨대, BM2SR-1(SEQ ID NO: 1), BM2SR-2(SEQ ID NO: 2), BM2SR-3(SEQ ID: NO: 3), BM2SR-4(SEQ ID: NO: 4), 또는 BM2SR-5(SEQ ID: NO: 5) 변이체를 포함하는 바이러스)은, 예를 들면 다른 바이러스 균주들로부터의 HA 및 NA 유전자들을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 다른 바이러스 균주들로부터의 유전자들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 백신은 예를 들면 B/Florida/04/2006, B/Brisbane/60/2008, B/Wisconsin/01/2010, 또는 B/Lee/1940 바이러스들로부터의 HA 및 NA 유전자들을 포함한다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물은 또한 또는 추가적으로 예컨대 유전자 치료의 경우, 면역억제제, 항염증제 또는 면역억제제, 또는 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 하이드록시벤지미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α, 티오스미카르바존(tiosmicarbarzones), 메티사존, 리팜빈, 리바비린, 피리미딘 아날로그, 퓨린 아날로그, 포스카르넷, 인산, 아시클로비르, 디데옥시뉴클레오시드들, 프로테아제 억제제, 또는 산사이클로비르를 포함하지만 이들에 국한되지 않는 항바이러스제 등 적어도 하나의 화학요법 화합물을 포함할 수 있다.
그러한 조성물은 또한 가변적이지만 소량의 엔도톡신이 없는 포름알데히드와, 본 발명의 조성물이 투여되는 유기체에서 안전하며 바람직하지 않은 효과에 기여하지 않는 보존제가 포함될 수 있다.
B. 투여
본 명세서에 공개된 면역원성 조성물(예: 백신)은 통상적으로 백신에 사용되거나 권장되는 경로 중 하나를 통해 투여될 수 있는데, 즉 주입식 또는 분무식 액체, 분무식 또는 분무식 건조된 제조 또는 공기 건조 등 다양한 형태가 있을 수 있다. 백신은 주사기를 사용하거나 근육 내, 피하 또는 피부 내 주입용 바늘이 없는 주사기를 사용하여 투여할 수 있다. 백신은 또한 비강, 폐, 질 또는 직장 등 점막에 마른 분말이나 액체 스프레이를 전달할 수 있는 분무기를 사용하여 투여할 수 있다.
본 명세서에 공개된 백신은 수동적 예방접종 또는 능동적 예방접종에 의해 하나 이상의 인플루엔자 변종에 대한 내성을 부여할 수 있다. 액티브 면역에서는 활성화되지 않거나 감쇠된 살아있는 백신 구성을 숙주(예: 포유류)에게 예방적으로 투여하고, 투여에 대한 숙주의 면역 반응은 감염 및/또는 질병으로부터 보호한다. 패시브 예방접종을 위해, 도출된 항진제를 회복하여 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발된 감염을 의심받는 환자에게 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의한 감염과 같은 질병이나 장애를 예방하거나 약화시키는 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 백신은 투여 시 병의 증상이나 상태에 대한 전체 또는 부분 감쇠(즉, 억제) 또는 개인의 전체 또는 부분 면역이 발생할 경우 질병을 예방하거나 약독화시킨다고 한다.
본 발명의 적어도 하나의 활성화되지 않거나 약독화된 인플루엔자 바이러스 또는 그 조성물은 전술한 바와 같이 의약품 조성물을 사용하여 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 그러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피부 내, 근육 내, 복강 내, 비강 내, 경구 또는 외피 경로들 같은 다양한 비경구 경로들 의해 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 볼루스(bolus) 주입에 의해 또는 시간이 지남에 따라 점진적인 관류를 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시예들에서, 본 명세서에서 공개된 바와 같은 면역원성 조성물은 근육 내 또는 피하적 적용(application)에 의해 이루어진다.
일부 실시예들에서, 인플루엔자 바이러스와 관련된 병리학을 예방, 억제 또는 치료하기 위한 요법은 단일 치료로서 투여되거나 또는 1주와 약 24개월들 사이를 포함하여 최대 1주 내지 24개월 동안 또는 임의의 범위 또는 값으로 복용량들을 감화하거나 끌어올림으로 반복되는, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 효과적인 양의 백신 조성물의 투여를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 명세서에서 개시된 인플루엔자 백신은 매년 투여된다.
본 발명의 기술에 따르면, 백신 조성물의 "유효량"은 바라는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 일부 실시예에서는 유효량이 수령자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 동시치료의 종류, 만약 있다면 치료 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 따라 좌우되는 것으로 이해된다. 아래에 제공된 유효 선량의 범위들은 제한되는 것으로 의도되지 않으며 전형적인 선량(dose) 범위를 나타낸다. 따라서 일부 실시예에서 용량은 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이, 개별 주제에 맞게 조정될 것이다. 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 투여량은 약 101 내지 1010 플라크(plaque) 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예들에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 102 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 103 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 104 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 105 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서, 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 106 내지 1010 플라크 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 107 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 108 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 109 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 약 109 내지 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 또는 그것의 임의의 범위 또는 값에서 구할 수 있다. 일부 실시예에서 포유류(예: 인간) 성인을 위한 약독화된 바이러스 백신의 복용량은 1010 플라그 형성 단위(PFU)/kg 보다 클 수 있다. 비활성화된 백신의 선량은 예컨대 혈구응집소 단백질의 50㎍과 같이 약 1 내지 200의 범위에 있을 수 있다. 하지만, 그러한 선량은 시작 점으로서 기존의 백신들을 사용하여 종래의 방법들에 의해 결정된 것과 같이 안전하고 효과적인 양이어야 한다.
C. 피부내 방출(Intracutaneous delivery)
살아 있는 독감 백신은 전통적으로 자연적인 감염 경로를 모방하고 자연적인 바이러스 감염과 유사한 면역 반응을 촉진하기 위해 내부로 전달된다. 대안으로, 본 명세서에 공개된 것은 피부내 방출의 면역학적 이점을 활용하기 위해 새로운 마이크로니들 장치를 사용하는 것과 관련된 피부내 방출 방법들이다. 일부 실시예에서는 약독화된 바이러스(예: BM2 바이러스 변이체)가 피부 내 투여를 위한 백신 조성물에서 사용된다. 일부 실시예에서는 감염성 자손 바이러스를 생성하지 않는 BM2 바이러스 변이체가 백신에서 제공된다. 따라서 야생형 순환성 인플루엔자 바이러스들과의 재분류의 임의의 가능성은 사실상 제거된다.
본 명세서에서 개시된 실시예들에서는, 피부 내 방출(피내)가 백신을 피부에 투여한다. 일부 실시예들에서는 마이크로니들 전달 장치를 사용하여 피부내 방출을 수행한다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 피부내 방출은 많은 장점을 가지고 있다. 예를 들어, 백신의 면역성은 피부 면역 체계의 면역학적 잠재력을 촉발시킴으로써 강화된다. 이러한 백신은 피부의 유력한 항원 전달 수지상 셀들, 즉 표피 랑게르한스 셀들과 피부 수지상 셀들에의 직접적인 접근을 가진다. 피부 셀들은 피부를 통해 유입된 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 염증전 신호들을 생성한다. 또한 피부 면역 체계는 항원 특유의 항체와 세포 면역 반응들을 만들어낸다. 피부 내 방출은 백신 투여량을 줄이는 것(sparing)을 허용하는데, 즉 위 요인들에 비추어 볼 때 피부 내에 방출될 때 더 낮은 양의 항원 투여량이 효과적일 수 있다.
그리고, 백신이 장치의 마이크로니들 배열을 통해 피부에 방출되기 때문에, 의도되지 않은 니들 찌름(needle-stick)들의 위험이 감소되고, 마이크로니들 배열을 통한 피부 내 백신 방출은 종래의 니들 및 주사기를 이용하는 근육 내 주사들에 비해 상대적으로 아프지 않다.
예를 들면, 공표된 미국 특허 출원들인 2012/0109066, 2011/0172645, 2011/0172639, 2011/0172638, 2011/0172637, 및 2011/0172609에서 설명된 바와 같은 마이크로니들 장치들이 관련 분야에 알려져 있다. 마이크로니들 장치들은, 예를 들면 웨트 에칭(wet etching)에 의해 스테인리스강 시트들(예: 트리니티 브랜드 공업, 조지아; SS 304; 50㎛의 두께)로부터의 제작에 의해 만들어질 수 있다. 일부 실시예에서 개별 마이크로니들들의 길이는 예컨대 약 750㎛와 같이 약 500㎛와 1000㎛ 사이에 있고, 폭은 예컨대 약 약 200㎛와 같이 100㎛ 내지 500㎛ 사이의 범위에 있다. 그럴 경우 백신은 코팅으로서 마이크로니들에 도포될 수 있다. 예를 들어 하지만 제한적이지 않게, 코팅 용액에는 1%(w/v) 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 염(낮은 점도, USP grad, Carbo-Mer, San Diego CA), 0.5%(w/v) Lutrol F-68 NF(BASF, Mt. Olive, NJ) 및 항원(예컨대, 5ng/㎖의 용해 가능한 HA 단백질; 본 명세에서 설명된 M2 및 BM2 변이체 바이러스와 같은 살아 있는 약독화된 바이러스 등). 더 높은 백신 농도에 도달하기 위해 코팅 용액은 상온(~23℃)에서 5 내지 10분 동안 증발될 수 있다. 코팅은 딥(dip) 코팅 프로세스에 의해 수행될 수 있다. 마이크로니들들의 열(row) 당 백신의 양은 마이크로니들들을 200㎕의 인산염 완충된 식염수(PBS)에 5분 동안 잠근 후 관련 분야에서 알려진 방법들에 의해 항원에 대한 검사를 하여 결정할 수 있다.
일부 실시예들에서는 마이크로니들 장치는 주로 간단한 스냅 핏(snap fit)들과 히트 씰(heat seal)들과 함께 맞추어지는 폴리프로필렌과 스테인리스 스틸 1차 컷 피스(piece)들로 만들어진다. 일부 실시예에서 장치는 완전히 자가 수용되며 백신, 펌프 메커니즘, 활성화 메커니즘 및 마이크로니들 유닛을 포함한다. 이들 성분들은 플라스틱 커버 안에 숨겨져 있다. 이러한 장치를 가지고, 백신 주입은 작동 버튼을 눌러 시작된다. 버튼을 동시에 누르면 마이크로니들들이 피부에 삽입되어 1차 약품 용기에 압력을 가하는 펌핑 메커니즘이 시작된다. 스프링 메커니즘이 백신 저장장치에 충분한 압력을 가하면, 백신은 마이크로니들 어레이를 통해 피부 속으로 흐르기 시작한다. 일부 실시예들에서는 백신 선량을 투여하는 것이 장치의 작동 후 약 2분 이내에 완료된다. 주입이 완료된 후, 장치는 피부에서 서서히 제거된다.
일부 실시예들에서는, 마이크로니들 장치를 사용하여 면역원성 조성물(예: 백신)의 피부내 투여를 위한 방법이 제공된다. 일부 실시예에서 마이크로니들 장치는 구멍 뚫기 메커니즘과, 피부에 구멍을 뚫을 수 있고 면역원성 조성물을 피부 내로 투여할 수 있는 복수의 마이크로니들을 포함하는 면역원성 조성물 층을 포함한다. 일부 실시예들에서, 그 방법은 구멍 뚫기 메커니즘을 낮추는 것을 포함한다. 일부 실시예에서 면역원성 조성물(예: 백신)은 발현되는 변이체 BM2 단백질 또는 발현되지 않은 변이체 BM2 단백질을 암호화하는 핵산 염기서열을 포함하는 바이러스를 포함하고, 여기서 발현된 변이체 BM2 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 5로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 암호화된 아미노산 시퀀스를 포함하거나 그러한 아미노산 시퀀스로 이루어진다. 일부 실시예들에서, 마이크로니들 어레이는 처음에 장치 하우징 안에 위치하며, 레버가 작동하면 마이크로니들이 장치 바닥을 통해 확장되고 피부에 삽입되어 백신 액체가 피부 내로 주입되는 것을 허용한다.
본 명세서에서 설명된 전달 장치는 원하는 물질을 전달하기 위해 이용될 수 있다. 일 실시예에서 전달될 물질은 약이며, 전달 장치는 약물을 대상자에게 전달하도록 구성된 약물전달장치다. 여기서 "약물"이라는 용어는 치료 목적, 예방적 또는 의약적 목적(예: 백신, 의약품, 영양소, 건강 기능 식품 등)을 위해 대상자에게 전달되는 임의의 물질을 포함하는 것으로 의도된다. 일 실시예에서, 약물 전달 장치는 대상자에게 선량의 백신을 전달하도록 구성된 백신 전달 장치다. 일 실시예에서, 전달 장치는 독감 백신을 전달하도록 구성되어 있다. 본 명세서에서 논의된 실시예들은 주로 물질을 피부를 통해 전달하도록 구성된 장치와 관련이 있다. 일부 실시예에서 장치는 피부 이외의 장기에 직접 물질을 전달하도록 구성될 수 있다.
예들
이어지는 예들은 그림으로만 제공되며, 제한적이지 않다. 당업자는 본질적으로 동일하거나 유사한 결과들을 산출하기 위해 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 비임계(non-critical) 매개변수를 쉽게 인식할 것이다. 이러한 예들은 첨부된 청구항들에 의해 규정된 본 발명의 기술의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
예 1: BM2 바이러스 변이체들의 생성
표 1에는 B/Florida/4/2006 세그먼트 7(도 2)에 기초한 일련의 5개의 새로운 BM2 널 변이체 구조들(BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, BM2SR-5)이 설계된 다음, 관련 분야에 알려진 표준 기술들을 사용하여 표준 시험관내 유전자 조립 절차들 적합한 이중 가닥 DNA 조각들로서 합성되었다. 구조들(BM2SR-1(SEQ ID NO: 1) BM2SR-2(SEQ ID NO: 2) BM2SR-3(SEQ ID NO: 3) BM2SR-4(SEQ ID NO: 4), 및 BM2SR-5(SEQ ID: NO: 5)의 단일-표준 mRNA 또는 플러스-감지(plus-sense) DNA 뉴클레오티드 시퀀스들이 제공된다.
예 2: BM2 유전자 바이러스의 생성 및 배양
이 예는 BM2SR-1(SEQ ID NO: 1) BM2SR-2(SEQ ID NO: 2) BM2SR-3(SEQ ID NO: 3) BM2SR-4(SEQ ID NO: 4), 또는 NOM2-5SE ID(NO-SE) 변이체 및 B/Lee/1940 제어군, BM2-삭제된 세그먼트 7을 포함하는 B/Florida/04/2006 7 세그먼트에 기초한 BM2SR 변이체들을 배양하는 것을 증명한다. 변이체 BM2 핵산을 운반하는 것들과 같은 변이체 바이러스들은, 노이만 등에 의해, Proc Natl. Acad.. Sci. USA 96:9345-9350(1999)에서 설명된 바와 같이 플라스미드 기반의 역유전학에 의해 발생될 수 있다. 간략하게 293T 호스트 셀들은 8개의 인플루엔자 B 세그먼트들 각각에 해당하는 8개의 바이러스 RNA들을 암호화하는 1개 이상의 플라스미드로 감염되었다. 각 바이러스 RNA 시퀀스들은 RNA 중합효소 I 프로모터와 RNA 중합효소 I 터미네이터에 의해 측면 처리되었다. 특히, BM2 단백질을 암호화하는 바이러스 RNA는 변이체 BM2 핵산 시퀀스를 포함한다. 호스트 셀은 추가적으로 야생형 BM2 단백질을 포함하는 바이러스 단백질들(예컨대, 중합체, 뉴클레오단백질 및 구조 단백질들)을 암호화하는 1개 이상의 발현 플라스미드들로 감염된다.
플라스미드들은 DNA μg당 형질주입 시약(2 μL의 트랜스 IT® LT-1(Mirus, Madison, Wis.)을 혼합하여 상온에서 15 내지 30분 동안 배양한 후 1×106 293T 셀들에 첨가하였다. 48시간 후, 상청액에서의 바이러스는 연속적으로 희석되어 BM2CK 셀들에 접종되었다. 접종 후 2 내지 4일 후, 셀들이 선명한 세포성 효과(CPE)를 보여주는 마지막 희석 웰의 상청액에서의 바이러스들은 스톡(stock) 바이러스의 생산을 위해 BM2CK 셀들 내로 주입되었다. 생성된 바이러스들의 M 유전자들은 유전자와 의도된 변이체들의 존재를 확인하고 원치 않는 변이체들이 존재하지 않음을 보장하기 위해 나열되었다.
변이체 BM2 바이러스들은 성장하여 다음과 같이 통과되었다. BM2CK 호스트 셀들은 10%의 태아 종아리 혈청을 보충한 MEM의 존재시 성장했다. 셀들은 PBS로 씻은 후 37℃에서 흡착 바이러스가 발생하여 0.001 MOI에서 감염되었다. 트립신/TPCK가 함유된 바이러스 성장 매체를 첨가하고 세포 변성 효과가 관찰될 때까지 2 내지 3일 동안 셀들을 배양했다.
표 4에 설명된 12개의 BM2 결핍 인플루엔자 B BM2SR 변이체 바이러스들이 만들어졌다. 표 4에 도시된 바와 같은 B/FL/4/2006-1, B/FL/4/2006-2, B/FL/4/2006-3, B/FL/4/2006-4, B/FL/4/2006-5는 각각 BM2SR-1, BM2SR-2, BM2SR-3, BM2SR-4, 및 BM2SR-5에 해당한다.
예 3: BM2SR 바이러스 단백질 발현
이 예는 표 4에 설명된 12개의 BM2 결핍 인플루엔자 B BM2SR 바이러스에 의해 발현된 단백질들을 보여준다.
베로 셀들(200,000개)은 TC-12 플레이트 휄들에서 24시간 동안 10%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 MEM 매체에 배양되었다. D-PBS로 두 번의 세척 후, 베로 셀들은 2개의 야생형 바이러스 대조군들인 B/Lee/1940 및 B/Florida/2006과 마찬가지로 12개의 구성된 B/Florida/4/2006 BM2SR-1 내지 BM2SR-5와 B/Lee/40 BM2SR 변이체 바이러스들로 1.0의 높은 다수의 감염율로 감염되었다. 한 번의 복제가 가능하도록 5%의 CO2 대기의 35℃에서 6시간 배양한 후, 웨스턴 분석을 위해 샘플들이 채취되었다.
감염된 세포들은 프로테아제 억제제를 사용하여 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100에서 조심스럽게 용해되었다 핵 및 불용성 파편들은 원심분리 ay 14,000×G에 의해 작은 알로 뭉쳐졌다. 맑게 된 상청액은 MES 버퍼(인비트로겐)의 4-12% 구배 아크릴아미드 겔에서 나트륨 도데실 황산염 폴리아크릴아미드 겔 전기 이동(SDS-PAGE) 이전에 변성 및 감소되었다. 용해된 단백질들은 반건조 기구에 의해 7분 동안 폴리비닐리디엔 디플루오라이드(PVDF) 막으로 전달되었다. PVDF는 3% 무지방 건유(NFDM)를 함유한 0.1% Tween 20(PBS-T)으로 인산염 완충된 식염수에서 차단되었다.
단백질들은 2개의 인플루엔자 B 항원링 HA와 M1에 특화된 항균제 및 세포 기질 제어 단백질 글리세랄데히드 3인산 탈수소효소(GAPDH)에 의해 1% NFDM, PBS-T에서 검출되었다. 인플루엔자 B M1은 3개의 1000:1 희석 단일 클론 항체들(sc-101353, sc-101408, sc-101409, sc-101409, 산타크루즈 생물공학) 및 2000:1 희석 2차 항-생쥐 IgG-HRP(horse radish peroxidase)) 콘주게이트의 1차 항체 칵테일에 의해 검출되었다. 인플루엔자 B 헤마글루틴 단백질(HA)은 2000:1 1차 폴리클론 염소 안티-HA 혈청(NR-3120, BEI)과 2000:1 2차 안티-염소 IgG-HRP 콘주게이트에 의해 검출되었다. 대조군 GAPDH는 GAPDH(NB100-56875, Novusbio)g로의 1차 폴리클론 항혈청 및 2000:1 이차 안티-래빗(anti-rabbit) IgG-HRP 콘주게이트에 의해 검출되었다. 색을 내는 HRP 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 특정 밴드들이 검출되었다.
도 4에 제시된 결과는 인플루엔자 B/Lee/40 M1과 HA 발현이 B/FL/4/2006보다 작음을 나타낸다. 마찬가지로 B/Lee/40 BM2SR 바이러스는 B/Brisbane/60/2008 및 B/WI/01/2010 HA:NA 배경들 모두에서 낮은 수준들 또는 감지 불가능한 M1 및 HA 단백질들을 발현한다. BM2SR 세그먼트를 BM2SR-1에서 B/Lee/1940에서 B/Florida/4/2006으로 변경하면 M1과 HA 단백질들 모두의 양이 증가하는 것으로 나타난다. BM2SR-2 돌연변이로부터 어떠한 증가도 관찰되지 않았다. BM2SR-3 돌연변이 M1 M86V는 M1과 HA 발현 모두를 증가시키는 매우 큰 효과를 가진다. BM2SR-4 돌연변이는 또한 B/Lee/40 대조군에 비해 발현을 개선한다. BM2SR-5에서의 돌연변이들의 최종 조합은 또한 완전한 삭제 균주에 비해 M1과 HA 발현에 있어서의 큰 개선을 만들어낸다. 이들 결과는 또한 도 2의 구조에 따른 BM2 발현의 붕괴가 BM1 단백질 발현 붕괴할 수 있음을 증명한다.
예 4: BM2SR 바이러스 복제
이 예는 표 4에 설명된 12개의 BM2 결핍 인플루엔자 B BM2SR 바이러스들의 성장 동역학들을 증명한다.
구성된 인플루엔자 BM2SR 바이러스들의 바이러스 성장 동역학은 B/Lee/40 BM2 단백질을 발현하는 베로 유도된 셀 라인인 BM2Vero에서 테스트되었다. BM2Vero 셀들은 P-060 디시(dish)들에서 24시간 동안 10%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 MEM 매체에서 배양되었다. 1마이크로그램/mL의 T-TPCK(tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone-treated trypsin)을 추가한 12개 바이러스들에 대해 0.001의 MOI에서 3배수의 바이러스 감염들이 수행되었다. 총 4마이크로그램/mL를 추가하기 위해 3일(감염 후 1일, 2일, 3일) 동안 매일 한번 T-TPCK가 추가되었다. 감염은 35℃ 5% CO2에서 배양되었다. 2일 간격으로(감염 후 2, 4, 6, 8일) 분비된(secreted) 인플루엔자 B 바이러스가 함유된 감염된-베로-셀 조직 배양 상청액을 -80℃에서 무균 샘플링하여 등분하여 동결 저장하였다. 성장 곡선을 완료한 후, BM2CK 세포(BM2 단백질을 발현하는 MDCK 셀들)를 이용한 표준 50% 조직 배양 억제 용량(TCID50) 결정에 의해 동결된 알리코트(aliquot)들이 적정량으로 주어졌다. 주어진 희석액으로부터의 생산적 감염은 표준 세계보건기구 적혈청응집반응 평가 및 분석(WHO HA 평가)을 사용하여 결정되었다. 각 시점에서의 각 바이러스에 대한 3배의 TCID50 결정들의 평균 및 표준 편차를 계산했다. 그 결과는 도 5a 및 도 5b에 주어진다.
도 5a에서 주어진 B/Brisbane/60/2008로부터의 HA와 NA를 발현하는 6개 바이러스의 성장 곡선은 거의 전체 길이 변이체인 BM2SR-4, 그리고 특히 M1 M86V 변이체들인 BM2SR-3 및 BM2SR-5가 더 빠른 바이러스 성장을 지시하고 더 높은 최종 역가에 도달했음을 나타낸다. M1 M86V 돌연변이는 변이체 BM2SR-3에서의 BM2SR-2 변이체와 결합하고 BM2SR-5 변이체에서의 BM2SR-4 돌연변이와 결합하면 BM2Vero4 셀 기질의 바이러스 성장을 개선하는 것으로 보였다. 최상의 변이체 균주, BM2SR-5는 BM2Vero 셀 기질에서 7.50 log10 ± 0.1 log10 TCID50 등가물들/mL의 최종 역가에 도달했다. B/FL/04 2006 BM2SR-3, -4, -5 돌연변이들은 B/Brisbane/60 HA 및 NA와 결합했을 때, mL당 2.42 log10 ± 0.39 log10 TCID50 등가물들의 B/Lee/1940 BM2SR 균주 TCID50 값에 비해 수득률에 있어서 2log10으로부터 최대 5 log10 보다 많은 개선을 준다.
B/Wisconsin/01/2010로부터의 HA와 NA를 가진 인플루엔자 B 균주들의 성장은 더 균일했다(도 5b). 성장곡선 4일째에 BM2SR-2, BM2SR-3 및 BM2SR-4 변이체들에 대해 약 10^0.5 TCID50/mL의 미묘한 개선을 주목할 수 있었다. 6일째가 되자 그 차이는 사라지고 최종 역가들은 통계적으로 비슷해졌다. 따라서, B/Wisconsin/01/2010로부터의 HA와 NA를 함유하는 바이러스들의 상황에서, 설계된 BM2SR 구성들, 특히 BM2SR-4와 BM2SR-5는 바이러스 성장 동역학을 약간 개선할 수 있을 뿐 최종 바이러스 수득률에 미치는 효과는 적었다. 주어진 바이러스의 성능은 주어진 균주의 HA 및 NA 배열에 따라 달라진다.
예 5: BM2SR 변종들의 안정성
야생형 세포들에서 BM2SR 변종들의 BM2 유전자의 안정성을 시험하기 위해 BM2SR 변종들은 BM2 단백질 발현이 부족한 야생형 MDCK 셀들에서 BM2-단백질-발현 MDCK 세포들인 BM2CK 셀과 함께 전달되었다. 모든 BM2SR 변종들 및 야생형 인플루엔자 B 바이러스들(WT B/WI01)는 적어도 통로 10까지 임의의 돌연변이들 없이 BM2CK 셀들에서 통행이 가능했다(도 6a). 그러나 BM2SR 변종들은 야생형 MDCK 셀들에서 통과할 수 없었다(도 6b).
예 6: BM2 변이체 바이러스들은 생체 내에서 약독화된다
BM2SR 변이체 바이러스들이 생체내에서 약독화된다는 것을 증명하기 위한 실험을 수행했다. 생후 6주 된 BALB/c, 암컷 생쥐에게 다음 변이체들, 즉 BM2SR Bris60과 BM2SR Wisc01(둘 다 SEQ ID NO: 6(BM2SR-0)에 명시된 바와 같은 B/Lee/40으로부터의 변이체 M 세그먼트를 함유하고 있는) 중 하나를 비강 내에 접종했다. 변이체들은 생쥐 1마리당 1.2×106 TCID50의 용량으로 투여되었다. 생쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 이 생쥐들은 체중의 변화와 감염 증상에 대한 접종 후 14일 동안 관찰되었다.
도 7에 도시된 바와 같이, BM2SR 바이러스와 PBS를 접종한 생쥐는 14일 동안 어떠한 임상적인 감염 증상도 보이지 않았고 체중도 줄어들지 않았다. 그룹들 간의 체중 변화는 14일 동안 비교될 수 있었다. 종합해 보면 임상 증상의 부족과 체중 감소의 부족은 생쥐에서 BM2SR 변이체 바이러스들이 약독화되고 병원성이 없음을 나타낸다.
예 7: BM2 변이체들은 인플루엔자 B 바이러스 공격에 대항하여 항체들을 이끌어낸다
위에서 설명한 생쥐로부터의 혈청 샘플들에서 2개의 인플루엔자 B 혈통들인 야마가타와 빅토리아에 대한 항체 역가들 결정하기 위해 테스트를 수행했다. 혈청 샘플은 프라임 접종 후 7, 14, 21일에, 그리고 28일에 두 번째 접종 후 35, 42, 49일에 채취되었다. 혈청 샘플에서 나온 항-HA IgG 항체 역가들은 B/Wisconsin/01/2010 및 B/Brisbane/60/2008에 대한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정되었다. 도 8a 및 도 8b에는 M2(SEQ ID NO: 6; BM2SR-0)를 삭제한 B/Lee/40로부터의 M 세그먼트를 포함하는 BM2SR 변이체들이 두 항원에 대해 조절 PBS 그룹보다 높은 항 인플루엔자 바이러스 항체들을 상승시킨 것을 보여주는 체액 반응이 도시된다. BM2SR 변이체 바이러스들에 의해 촉진된(boosted) 생쥐는 원시 선량 후의 수준보다 두 번째 면역화 후 더 높은 수준의 항 인플루엔자 HA 항체들을 가지고 있었다.
예 8: BM2-발현 셀 기질에서의 M2-결핍 인플루엔자 A 및 BM2-결핍 인플루엔자 B의 성장
표준 50% TCID50(tissue culture infectious dose) 평가(WHO)를 사용하여 M2-결핍 인플루엔자 A(모두 SEQ ID NO: 33에서 전개된 바와 같은 M2 변이체를 포함하는 A/CA/07 M2SR 및 A/Brisbane/10 M2SR)와 B(B/WI/01 BM2SR-0 및 B/Brisbane/60 BM2SR-0) 바이러스들을 보충하기 위한 인플루엔자 A M2와 인플루엔자 BM2의 능력을 시험하기 위한 실험이 수행되었다. 96개의 웰 조직 배양 플레이트들에 준비된 M2CK와 BM2CK 셀들의 합류하는 단일층들이 인플루엔자 A M2SR로부터 제조된 희석 2개와 인플루엔자 BM2SR 바이러스 균주들로부터의 2개인 10배 희석액인 일련의 4개의 인플루엔자 바이러스들로부터 0.2 mL로 4배 이상 감염되었다. 35℃에서 4일 동안 배양한 후, 5% CO2 대기, 세포질 효과, 및 적혈구 형구응집반응 평가(HA)(WHO)가 엔드 포인트에서 사용되어 인플루엔자 복제를 위한 배양 상청액을 테스트했다. 각 복제 감염으로부터의 인플루엔자 복제가 관찰된 최고 희석 인자들이 사용되어 도 9에 도시된 4개의 바이러스를 가진 2개의 셀 라인의 각 감염에 대한 log10 TCID50 값들을 결정했다.
놀랍게도, BM2CK 세포 기질은 세로타입 매치된 M2CK 셀뿐만 아니라 인플루엔자 A M2 결핍 M2SR 바이러스 균주들을 균등하게 보충할 수 있었다(도 9). 인간 인플루엔자의 일반적인 HA NA 서브타입들인 H1N1과 H3N2 모두로부터 파생된 표면 항원을 함유하는 M2SR 바이러스는 둘 다 약 7.0의 동등한 log10 TCID50 값으로 복제할 수 있었다. 반대로, M2CK 셀들의 인플루엔자 A M2 단백질은 시험한 BM2-결핍 인플루엔자 B BM2SR 균주들의 복제를 오직 빈약하게 지원하여, BM2CK 세포와 일치하는 타입이 제공한 것보다 약 3 log10 적게 TCID50 역가를 산출한다. 이것은 인플루엔자 B M2 단백질이 인플루엔자 A 단백질을 대체할 수 있고 2개의 서브타입에서 인플루엔자 A 바이러스의 복제를 지원할 수 있음을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 인플루엔자 A M2 단백질은 인플루엔자 B 복제의 경우 BM2 단백질을 대체할 수 있는 것으로 보이지 않는다.
예 9: 키메릭 M2 단백질들
키메릭 M2 단백질의 기능을 시험하기 위해, 전형적인 유전자 조립 절차들에 의해 CMV IE 프로모터와 배양 내 포유류 셀들의 고수준 발현에 대한 보빈 성장 호르몬 폴리-아데닐레이션 전사 제어 시퀀스들을 함유하는 표준 플라스미드들로의 융합 구조들이 삽입되었다. 야생형 M2와 BM2 cDNA 발현 플라스미드들도 제작되었다. 또한, 야생형 BM2 cDNA 시퀀스를 pCAGGS 프로모터 터미네이터 플라스미드에 삽입하여 CMV보다 훨씬 더 큰 가장 높은 가능한 수준의 발현을 하도록 하였다. 플라스미드들은 인플루엔자 B BM2SR 바이러스의 역유전학(RG)에서 M2 기능을 공급하기 위해 사용되었다. RG의 효율성은 293T-RG-생산된 바이러스의 1%를 BM2-결핍 자손의 회복을 위해 수신자 BM2CK 셀들의 96개의 독립적인 웬들에 접종하여 추정하였다. BM2CK 배양 상청액은 35℃에서, 5% CO2로 4일간 배양한 후, 표준 혈구응집반응 평가(WHO HA)에 의해 바이러스 복제에 대해 검사했다. WHO HA-양성이 된 웰들의 백분율이 도 11에 나와 있다.
BM2 널 돌연변이는 인플루엔자 복제시 M2 양성자 채널 활동 요건을 확인하는RG를 지원하지 않는다. 야생형 인플루엔자 A M2도 복제를 지원하지 않았다. 인플루엔자 A M2 엑토도메인(M2e)을 함유하는 키메릭 M2 단백질들, ABB 및 AA'B는 야생형 BM2나 M2e가 부족한 BA'B 변이체들뿐만 아니라 RG를 거의 지원하지 않아 인플루엔자 A 엑토도메인 도메인이 억제된다는 것을 시사한다. 결합된 데이터는 인플루엔자 B의 복제를 위해 인플루엔자 B 엔도도메인이 필요한 반면, 인플루엔자 A 트랜스멤브레인(TM) 도메인은 BM2의 TM을 대체할 수 있다는 것을 나타낸다. 표준 CMV 프로모터에 비해 pCAGGS 벡터로부터의 증가된 발현은 야생형 BM2 cDNA의 성능을 개선하였으며, 이는 BM2의 총 발현 수준이 또한 RG로 제한될 수 있음을 나타낸다.
예 10: BM2 단백질을 발현하기 위한 야생형 및 키메릭 M2 단백질들의 용량
M2 단백질은 셀 기질 게놈에서 발현되었을 때 M2 결핍과 BM2 결핍 바이러스 성장을 지원하는 용량에 대해 테스트되었다. 베로 셀들은 단백질 합성의 아미노글리코사이드 억제제인 G418에 저항을 전달하는 네오마이신 인산기전이효소(neo) 유전자와 M2를 암호화하는 플라스미드 및 키메릭 변이체들로 화학적으로 전염되었다.
배양 이틀 후, 전염된 세포들은 분리되어 G418을 함유하는 매체로 다시 배양기로 배양되었다. 셀들은 플라스미드 DNA를 무작위로 셀 라인 게놈에 통합한 클론들에 관한 선택을 위해, G418 선정 하에 몇 주 동안 배양되었다. G418 내성 클론들의 일부 부분에는 M2 키메릭 변이체 트랜스젠의 기능적 통합 복사본이 포함되어 있다. 그런 다음 이러한 기능 클론들을 바이러스 선택을 지원하는 용량에 대해 테스트할 수 있다. 복제는 대량으로 선택한 G418 내성 클론 풀들이나 표준 희석 복제 한계(LDC) 절차들을 사용하여 선택 및 격리되는 개별 클론들로부터 테스트할 수 있다. 클론 풀들의 분석은 성장 후 몇 주 이내에 구성물의 성능을 측정하는 반면, LDC는 훨씬 더 오래 걸린다. 하지만, 인체에서 사용할 백신의 조절된 생산에 적합한 셀 기질들을 격리하기 위해서는 여러 차례의 LDC가 요구된다는 점이 중요하다.
야생형 및 변이체 cDNA 플라스미드를 모두 사용하여 여러 차례 선택 및 LDC를 수행한 후, 높은 수준의 BM2를 발현하는 적절한 클론은 분리되지 않았다(데이터가 표시되지 않음). 웨스턴 분석은 배양 셀들의 각 통과 후 검출된 BM2의 양들이 급격히 감소하는 것을 보여주었다. 초기 통로 클론 풀 M2SR과 BM2SR 바이러스 복제 데이터는 그 구조들이 기능적이었지만, 셀 게놈으로부터의 구성들의 안정적인 발현은 베로 세포들에서 확립되지 않음을 암시하였다. 인플루엔자 암호화된 유전자 염기서열의 분석은, 그것들이 A-T가 60%였으며 바이러스 코돈 사용 편향은 호스트 베로와 크게 달랐다는 것을 나타내었다. 또한, 전사를 침묵시키거나 억제할 수 있는 다중 시퀀스 모티프들이 토종(native) 바이러스 유전자 코딩 영역 내에서 확인되었다. 이 현상은 한 유기체의 유전자가 다른 유기체로 옮겨질 때 흔하지만 인플루엔자 바이러스에 대해서는 과소평가될 수 있다. 비록 바이러스가 인간 셀들에서 복제되어야 하지만, 인플루엔자는 숙주와 동일한 코돈 사용 패턴을 채택하지 않는다.
야생형 M2, BM2 및 키메릭 변이체들의 발현을 증가시키기 위해, 코딩 시퀀스들의 코돈 최적화를 수행하여 음의 조절 모티프들을 제거하고, cDNA를 약 50% A-T로 만들고, 인플루엔자로부터 베로 셀 코돈 편향으로 유전자를 변경했다. 이러한 구조는 화학적으로 매개된 베로 셀들의 감염에 의해 전염되었다. 전염 이틀 후 단백질의 과도 발현을 평가하였다. 총 셀 단백질 추출물들은 BM2에 특유한 폴리클로날 항혈청들을 이용하는 면역 블롯으로 분석되었다. 도 12에서의 데이터는 이전에 토종 시퀀스들에서 얻은 과도 분석에서 얻었던 것보다 설계된 트랜스젠들에서 얻은 단백질 발현이 훨씬 더 높다는 것을 보여준다(토종은 도시되지 않음). 물론, 항-BM2 항혈청이 BM2 엔도도메인에 대항하여 향했기 때문에 BBA 변이체는 검출될 수 없었다.
예 11: M2-결핍 및 BM2-결핍 바이러스 성장을 지원하기 위한 키메릭, 코돈-최적화된 M2 단백질들의 용량을 시험하는 것
Codon 최적화 키메릭 M2 단백질을 M2 결핍 바이러스 및 BM2 결핍 바이러스 성장을 지원하는 용량에 대해 테스트했다. 베로 셀들은 단백질 합성의 아미노글리코사이드 억제제인 G418에 저항을 주는 네오마이신 인산기전이효소(neo) 유전자와 코돈 최적화된 M2 키메릭 변이체들을 암호화하는 플라스미드들로 화학적으로 전염되었다. 배양 이틀 후, 전염된 셀들은 분리되어 G418을 함유하는 매체로 다시 배양기로 배양되었다. 셀들은 플라스미드 DNA를 무작위로 셀 라인 게놈에 통합한 클론들에 관한 선택을 위해, G418 하에 2주 동안 배양되었다. G418 내성 클론들의 일부 부분에는 M2 키메릭 변이체 트랜스젠의 기능적 통합 복사본이 또한 함유될 것이다. BM2와 키메라들로 감염되어 대량으로 선택된 클론 풀들은 MOI 0.01에서 인플루엔자 A/Brisbane/10 M2SR(SEQ ID NO: 33에 명시된 M2 변이체를 포함하는)과 인플루엔자 B/Brisbane/60 BM2SR-0(SEQ ID NO: 6에 명시된 M2 변이체를 포함하는) M2 결핍 바이러스들에 감염되었다. 감염 후 6일째에 표준 TCID50 절차들을 사용하여 배양 상청액의 바이러스 역가를 측정했으며, 이 데이터는 도 13에 제시되어 있다.
테스트한 모든 M2 클론 풀은 베로 셀들에서 성장 인플루엔자 A M2SR을 지원했다. 오직 야생형 BM2 (BBB) 클론 풀만이 인플루엔자 BM2SR의 성장을 지지했다. 따라서 3개의 BM2 도메인은 모두 베로 셀들에서의 인플루엔자 BM2SR 복제에 특정되어 있는 것으로 보인다. 인플루엔자 A M2e와 트랜스멤브레인(TM) 도메인이 부족하지만 M2 엔도도메인을 함유하는 BBA 변이체를 발현하는 클론 풀이 인플루엔자 A M2SR 성장을 가장 잘 지원하는 것으로 밝혀졌다. BM2 엔도도메인은 그다지 효과적이지 못하여 이는 M2 엔도도메인이 어느 정도 인플루엔자 A에 특정된 것으로 진화했음을 시사한다. ABB와 AAB 키메릭 변이체들은 BAB와 BBA 구성보다 더 나쁜 성능을 보였고, 이는 인플루엔자 A 자체에서도 인플루엔자 A 엑토도메인이 바이러스 성장을 억제할 수 있음을 보여준다. M2e를 포함하지만 이에 국한되지 않는 억제 영역은 제거될 수 있고 복제와 역가를 증가시키는 변형된 도메인들이을 추가될 수 있다.
그러므로 M2 결핍 인플루엔자 A M2SR 바이러스 및 BM2 결핍 BM2SR 백신 바이러스의 생산을 위한 셀 기질들의 성능은 완전히 상이한 세로타입들 인플루엔자 A와 인플루엔자 B로부터의 M2 유전자들의 키메릭 융합들을 포함하는 설계된 M2 단백질들의 사용과 발현에 의해 개선될 수 있다.
예 12: BM2-발현 베로 셀 기질에서의 M2-결핍 인플루엔자 A/California/07/H1N1pdm M2SR의 성장
A/California/07/2009pdm H1N1 M2SR(A/CA/07)은 M2 결핍 인플루엔자 바이러스로, A/California/07/2009pdm의 H1 및 N1 세그먼트를 함유하고 있으며, SEQ ID NO: 33에 발현된 M2 변이체를 포함한다. 정상 셀들에서 복제가 불가능한 이 백신 후보 바이러스는 2가지 유형의 M2 단백질을 구성되게 발현하는 2개의 셀 라인을 감염시키기 위해 사용되었다. 첫 번째 M2 셀 기질은 A/PR8 M2 단백질을 발현하는 MDCK 혈통 표준 세 라인인 M2CK였다(SEQ ID NO: 23에 발현된 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 암호화됨). MDCK 셀들은 일반적으로 인플루엔자 연구와 개발에 사용되는데, 왜냐하면 그것들은 배양에서 높은 역가에 인플루엔자 바이러스의 빠른 복제를 지원하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 불행히도, MDCK 셀들 자체가 발암성이 있는 것으로 밝혀졌기 때문에 MDCK에서 파생된 생물학적 생성물들에 대한 규제 승인을 얻기는 어렵다. 두 번째 셀 라인인 BM2Vero4는 코돈에 최적화된 야생형 인플루엔자 B/Lee/40 BM2 단백질(SEQ ID NO: 27에 발현된 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 암호화됨)을 함유하고 있으나 아프리카 녹색 원숭이 신장 셀 라인인 Vero에서 파생되었다. 베로 셀 기질은 1960년대 이후 승인된 셀 기반 백신 제조에 활용되어 왔다(polio & MMR 백신들).
바이러스 감염은 감염(MOI) 레벨들의 2배수치인 0.01과 0.001에서 0.3% BSA와 1.0 마이크로 g/mL Trypsin-TTPK로 보충된 미니멀 에센셜 미디어(MEM)에서 수행되었다. 알리쿼트들은 접종 후 2일부터 6일까지 매일 철수되었다. 세포 배양 상청액 샘플들에 함유된 실행 가능한 인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 A의 농도는 M2SR 허용 M2CK 셀들과 BM2Vero4 셀들로 4일 동안 35℃에서 5% CO2로 배양된 표준 TCID50 평가를 사용하여 검사되었다. 결과는 도 14에 제시되어 있다.
예상대로, 인플루엔자 A/CA/07/2009pdm M2SR은 M2CK 셀들에서 잘 복제되어 2일차 시점에서 빠르게 피크 역가에 도달했다. Vero 혈통에서의 역가는 최고점에 도달하는데 5 내지 6일이 걸렸다. A/CA/07은 M2CK 셀들로 얻은 log10 7.00과 6.33의 바이러스성 역가들과 비교하여 BM2Vero 셀들에서 log10 5.67과 6.00의 역가들로 성장했다. 이는 BM2Vero4가 MDCK 셀들에 비해 인플루엔자 복제에 대한 허용도가 훨씬 낮은 베로 셀 라인에서 파생되었음에도 불구하고 관찰되었다.
그러므로 베로 셀들에서 코돈에 최적화된 인플루엔자 B/Lee/40 BM2 단백질(SEQ ID NO: 27에 발현된 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 암호화됨)의 발현은 M2 단백질의 인플루엔자 A 형태를 발현하는 R&D 품질 MDCK 셀 기질의 것에 거의 동등한 수준에서 인플루엔자 A H1N1 M2SR 바이러스 생성을 달성한다.
예 13A: 인플루엔자 BM2 단백질은 키메릭 인플루엔자 A M2SR 바이러스에 대한 바이러스 코팅 해제시 필요한 이온 채널 활동을 제공할 수 있다
비록 M2SR은 M2 단백질을 발현하지 못하여 자손 비리온들을 생산할 수 없지만, M2SR은 드 노보(de novo) 단백질 합성을 거쳐 정상 셀들에서 바이러스 항원을 생성한다. 이 예는 인플루엔자 BM2 단백질이 키메릭 인플루엔자 A M2SR 바이러스(즉, 바이러스 막에 BM2 단백질이 결합되는 BM2 셀 라인을 보충하여 생성된 인플루엔자 A M2SR 바이러스)에 바이러스 코팅되지 않는 데 필요한 이온 채널 활동을 제공할 수 있음을 증명한다.
이를 증명하기 위해 독감 A M2SR Hong Kong/4801/2014(H3N2) 바이러스는 인플루엔자 A M2-발현 M2VeroA 셀들에서 3회, 키메릭 M2SR Hong Kong/4801/2014(H3N2)은 인플루엔자 B BM2-발현 BM2Vero 셀들에서 3회 통과되었다. 그런 다음 인간 A549, Canine MDCK 또는 아프리카 녹색 원숭이 베로 셀들을 M2SR 또는 키메릭 M2SR 바이러스를 4의 MOI로 접종하고 바이러스들이 하나의 라이프 사이클만을 완료하는 것을 보장하기 위해 트립신(trypsin) 없이 매체에서 배양했다.
셀들의 조잡한 세포질 추출물이 감염 후 6시간, 9시간, 12시간(p.i)에서 수행되었다. 셀들은 50mM Tris HCl, pH = 8.0, 150mM NaCl, 1% Triton X-100에서 용해되었고, 15,000 x G에서 원심분리 되었다. 상청액에서의 용해 가능한 단백질은 LDS 샘플 버퍼(Thermo Fisher Science, Waltham, MA) 및 5 mM TCEP와 결합되어 10분간 70℃지 가열하여 변성된다. 단백질은 MES 버퍼의 Bis-Tris NuPAGE 폴리아크릴라마이드 겔(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 변성시키는 4-12%로 분리되어 PVDF 막들로 전달되었다. 크기 비교를 위해 미리 얼룩진 단백질 분자량 기준을 실행했다. 멤브레인들은 1%(w/v) 무지방 건유에서 차단되고 2000:1 희석시 1차 항인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 폴리클로날 염소 항혈청 NR-3134(BEI Resources, NIAID, NIH)로 배양되며, 그 다음 3000:1 희석시 2차 홀스-라디쉬 페록시다아제-콘주게이트된 항-염소 IgG(H+L)(SeraCare KPL, Milford, MA)이 이어졌다. 밴드들은 TMB 멤브레인 과산화효소 기질을 사용하여 시각화되었다(SeraCare KPL, Milford, MA). M1 매트릭스 단백질에 대한 폴리클로날 항혈청은 M2SR과 키메릭 M2SR 바이러스들에 대한 28 kDal 분자량 단백질의 매우 유사한 발현을 검출하며, 시험한 3개의 셀 라인 모두에서 약 9시간의 거의 동일한 유도 운동학으로 이루어진다(도 15A).
예 13B: 보충하는 BM2 셀 라인에서 생성된 키메릭 인플루엔자 A M2SR 바이러스에서는 인플루엔자 B BM2 단백질만 검출할 수 있으며, 어떠한 인플루엔자 A M2 단백질도 검출될 수 없다
M2SR은 M2SR이 M2 단백질을 발현할 수 없기 때문에 인플루엔자 A M2 단백질이나 인플루엔자 B BM2 단백질을 발현하는 지지 셀 라인에서 바이러스가 전파되지 않는 한 자손 비리온들을 생산할 수 없다. 이 예는 BM2 셀 라인을 보충하는 과정에서 생성된 키메릭 인플루엔자 A M2SR 바이러스가 바이러스 멤브레인에 BM2 단백질들만 결합한다는 것을 증명한다. 보충하는 M2 셀 라인에서 성장한 M2SR 바이러스는 M2 단백질만 함유한다.
이를 증명하기 위해 인플루엔자 A M2SR Brisbane/10/2008(H3N2) 바이러스가 인플루엔자 A M2-발현 M2CK 셀들에서 통과되었고, 키메릭 M2SR Brisbane/10/2008(H3N2)은 0.3%의 BSA를 함유하는 MEM 매체에서 인플루엔자 B BM2-발현 BM2Vero 셀들에서 3회 통과하였다. 배양 상청액은 원심분리법으로 맑게 되었다. 맑게 된 배양 매체를 벤조나아제(Novagen EMD, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 또는 SAN(Articzymes, Tromso, Norway) 뉴클레아제 처리하여 잔류 셀 기질 DNA를 제거하여 점도를 줄였다. 뉴클레아제 처리된 배양 배지는 10만 개의 공칭 분자량 차단(cut-off) 재생된 셀룰로스 멤브레인들(Amicon, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 원심 농축기를 사용하여 60배 집중되었다. 상청액의 바이러스 단백질들은 LDS 샘플 버퍼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 및 5 mM TCEP와 결합되고 10분간 70℃로 가열하여 변성시켰다. 단백질들은 MES 버퍼에서의 Bis-Tris NuPAGE 폴리아크릴아미드 겔(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 4-12% 변성시 3배로 분리되고, 3개의 PVDF 멤브레인들로 전달되었다. 크기 비교를 위해 미리 얼룩진 단백질 분자량 기준들이 실행되었다. 멤브레인들은 1%(w/v) 무지방 건유에 의해 차단되었고 3개의 상이한 1차 및 항체 쌍들으로 배양되었다. 첫 번째 멤브레인은 2000:1 희석시 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질 모노클로날 생쥐 항혈청 14C2(산타 크루즈 생명공학, 달라스, TX)로 배양되었고, 그 다음 000:1 희석시 2차 홀스라디쉬 페록시다아제 콘주게이트된 항 생쥐 IgG(H+L)(SeraCare KPL, Milford, MA)로 배양되었다. 두 번째 멤브레인은 2000:1 희석시 인플루엔자 B 바이러스 BM2 단백질 폴리클로날 래빗 항혈청(Hatta-M, et al, J. Virol, 78(11): 5576-5583. 2004)으로 배양한 후, 3000:1 희석시 2차 홀스라디쉬 페록시다제-콘주게이트된 항 래빌 IgG(H+L)(SeraCare KPL, Milford)에서 배양되었다. 세 번째 멤브레인은 2000:1 희석시 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 폴리클로날 염소 항혈청 NR-3134(BEI Resources , NIAID, NIH)로 배양한 후, 3000:1 희석시 2차 홀스라디쉬 페록시다아제-콘주게이트된 항 염소 IgG(SeraCare KPL, Milford, MA)로 배양되었다. 밴드들은 TMB 멤브레인 페록시다제 기질(SeraCare KPL, Milford, MA)을 사용하여 시각화되었다. 모노클로날 항-M2 항체가 인플루엔자 A M2SR 바이러스 준비에서 M2를 검출하였고, 키메릭 M2SR 준비에서는 어떠한 인플루엔자 A M2 단백질도 검출되지 않았다. 반대로 폴리클로날 항-BM2 혈청은 키메릭 바이러스의 엔빌로프에서 BM2를 검출했고 표준 M2SR 바이러스에서는 어떠한 BM2도 검출되지 않았다. M1 매트릭스 단백질에 대한 폴리클로날 항혈청은 M2SR과 키메릭 M2SR 바이러스 모두에서 28 kDal 분자량 PR8 M1 단백질을 검출하였다(도 15b).
예 14: 개별 BM2 변이체들을 백신으로 사용한다
BM2 변이체 바이러스들이 생쥐에서 항체 반응을 이끌어낼 수 있는지를 테스트하기 위해, 인플루엔자 A H1N1 또는 H3N2 M2SR 백신들을 가지는 1가, 3가 또는 4가 백신으로서 BM2 변이체 바이러스들(B/Yamagata 및 B/Victoria 혈통을 대표하는 BM2SR-4 바이러스들)이 제형화되었다. 생후 6주 된 BALB/c 암컷 생쥐는 106 내지 107 TCID50/마우스 용량으로 1가, 3가 또는 4가 백신들로 비강 내로 접종되었다. 생쥐의 대조군은 PBS를 받았다. 혈청 샘플들은 프라임 접종 후 14일째에 채취되었다. 혈청 샘플에서 나온 항-HA IgG 항체 역가들은 B/Victoria 혈통 및 B/Yamagata 혈통을 대표하는 항원에 대해 ELISA에 의해 결정되었다. 추가적으로, 혈청 샘플들에서 나온 항-HA IgG 항체 역가들은 인플루엔자 A H1N1 및 H3N2 항원들에 대한 ELISA에 의해 결정되었다(도 16a 및 도 16b). BM2SR 백신 성분들(B/Victoria 혈통과 B/Yamagata 혈통을 나타내는)은 다가 제형들로 2개의 인플루엔자 B 혈통들을 나타내는 인플루엔자 B 항원들에 대해 제어 PBS 그룹보다 높은 항-인플루엔자 바이러스 항체들을 상승시켰다(도 16c 및 도 16d). 이러한 결과는 BM2SR 백신들이 의도된 HA에 대한 항체 반응을 생성하며, 다가 백신들로 제형화될 때 1가 성분들 사이에 간섭이 없음을 증명한다. 면역 반응들은 다가 제형들로 각각의 1가 성분에 대해 생성된다.
BM2SR 변이체들이 치명적인 인플루엔자 B 바이러스 공격으로부터 생쥐를 1가, 3가, 또는 4가 제형들로서 보호하는 것을 보여주기 위해, 접종 22일 후 B/Malaysia/2706/2004 바이러스(20마우스 50% 치사량(MLD50)와 같은 이단성(heterosubtypic) 인플루엔자 B 바이러스의 치사량으로 공격되었다. BM2SR, 3가 백신, 4가 백신을 접종한 모든 생쥐는 공격에 살아남아 체중을 잃지 않았다(도 16e와 도 16f). 그러나 PBS만 투여받은 대조군 생쥐는 체중을 잃었고, 공격 일로부터 7일이 지나도 살아남지 못했다. 이들 결과는 BM2SR 바이러스들이 백신 성분과 일치하지 않을 때에도 인플루엔자 B 바이러스의 공격에 대항하여 보호한다는 것을 나타낸다. 이러한 보호는 1가 제형들뿐만 아니라 다가 제형들로 된 BM2SR 바이러스들에 의해 제공된다.
예 15: 1가 및 4가 백신 제형들에서 BM2SR에 의해 도출된 면역 반응 및 흰담비 모델에서의 보호 효험.
A. 요약
이 예는 BM2SR 백신이 1가 또는 다가 제형 모두에서 흰담비 모델에서의 면역 반응들을 이끌어낼 수 있다는 것을 증명한다. 즉, BM2SR에 이끌어내진 보호 면역 빈응들은 4가로 제형화될 때 BM2SR이 다른 성분들의 면역 반응들과 간섭하지 않기 때문에 다른 백신 성분들로부터의 간섭을 받지 않는다(즉, 면역 반응을 지배하지 않는다). BM2SR 후보 바이러스들은 1×107 TCID50(1가) 또는 4×107 TCID50(4가)의 선량 수준에서 12마리의 수컷 흰담비에 비강 내로 투여되었다. 대조군으로서, 한 그룹의 흰담비들에는 위약(placebo) 제어로 OPTI-MEMTM이 투여되었다. 각 치료 그룹에 대해 최고 수준의(prime-boost) 예방접종 요법을 활용했다. 흰담비에는 프라임 백신(0일차)과 28일 후 증강 백신(28일차)을 투여했다. 각 예방접종 후 사망에 대한 접종 후 14일 동안 흰담비가 관찰되었으며, 체중, 체온, 임상 징후가 매일 측정되었다. 혈청은 백신접종 후 모든 흰담비에서 21일, 35일, 56일에 채취되어 시간이 지남에 따라 항체 레벨들을 평가하였다.
모든 동물은 70일차에 A/California/07/2009(H1N1pdm)의 1×106 PFU로 비강재로 공격을 받았다. 공격 후에, 흰담비들은 사망에 대한 접종 후 14일 동안 관찰되었고, 체중, 체온, 임상 징후는 매일 측정되었다. 세비액들은 각 그룹의 흰담비들(N=8)로부터 바이러스 역가들에 대해 1일차, 3일차, 5일차, 7일차에 수집되었다. 또한 분석을 위해 생존한 흰담비에서 공격 후(82일차) 혈청을 채취하였다. 공격 후 3일차(73일)에 그룹당 4개의 흰담비에 대해 부검이 수행되었다. 공격 후 바이러스 부하(역가들)의 결정을 위해 장기들을 수집했다.
5개 그룹 중 백신과 관련된 부작용은 관찰되지 않았다. 공격 후, 위약 대고군은 체중 감소(~15%)를 보였다. 또한, 항원적으로 일치하지 않는 1가 BM2SR 백신 접종된 그룹들에서 체중 감소가 관찰되었지만, 감소(~5-8%)는 위약 그룹에서 관찰된 것보다 적었다. 4가 M2SR은 공격 후 어떠한 상당한 체중 감소도 나타내지 않았다.
B. 재료들과 방법들
백신 바이러스 접종. 흰담비들은 표 9(Table 9)에 도시된 것처럼, 1×107 TCID50의 선량으로 1가의 BM2SR 백신의 2개의 선량들로 비강내 접종되거나 4×107 TCID50의 선량으로 4가의 M2SR의 2개의 선량들로 비강내 접종되었다. 동결된 스톡(stock) 한 병을 실온에서 최소한 10분 동안 해동한 다음 사용할 때까지 냉장 보관(또는 젖은 얼음 위에 보관)했다. 흰담비들은 케타민/자일라진으로 마취되었고 바이러스 선량은 500μL(네어(nare)당 250μL)의 비강 내로 투여되었다. 각 예방접종 후 7일 동안 동물들이 매일 관찰되었다. 체중, 체온, 임상 징후 등을 7일간 관찰했다.
Figure pct00003
1 비강 내로 접종된
2 검시를 위해 할당되지 않은 동물들로부터 수집된 세비액들
3 바이러스 역가 분석을 위해 그룹 당 4마리의 흰담비들로부터 수집된 장기들(비갑개, 기관, 폐(좌측 및 우측 두개골 및 뒤엽들))
4 후 예방 접종 혈청 수집물들
BM2SR 바이러스는 기능적 BM2 단백질을 발현하지 않는 재조합 인플루엔자 B바이러스로, SEQ ID NO: 1를 포함하는 M2SR-1 변이체를 포함하고, B/Brisbane/60/2008(Victoria) 또는 B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)의 HA 및 NA를 암호화한다. 4가 M2SR은 H1N1, H3N2, B/Victoria, B/Yamagata HA 및 NA용으로 암호화하는 2개의 M2SR과 2개의 BM2SR 바이러스로 구성되어 있다.
동물들과 동물 보호. 수컷 흰담비들을 트리플 F 팜(Farm)들에서 구입하였으며 그러한 흰담비들 중 48마리가 연구되었다. 연구 개시 당시 동물들은 대략 생후 4개월이었다. 이 동물들은 공급자로부터 건강하며 전염병에 대한 항체가 없다는 인증을 받았다. 도착하자마자 그 동물들은 매달려 있는 와이어 케이지(wire cate)들에서 슬래트 바닥들이 있는 단일 통에 담겨 있었고, 종이로 된(paper-lined) 웨이스트 팬(waste pan)들 위에 매달려 있었다. 동물 보호 시설(room)과 우리(cage)들은 동물 수령 전에 허용된 동물 보호 절차와 관련 표준 운영 절차에 따라 청소하고 소독했다. 공인된 Teklad Global Ferret Diet #2072(Teklad Diets, Madison WI)와 시카고 시 수돗물은 임의로 제공되었고 최소 일주일에 3번 다시 공급되었다. 동물실의 형광등은 12시간의 밝은/어두운 주기로 유지되었다. 동물실 온도 및 상대습도는 각각의 프로토콜 한계들 내에 있었고, 20.0℃와 25.0동물과 동물 보호. 남성 페렛 80개를 트리플 F 팜에서 구입하였으며 72개의 페렛을 연구하였다. 연구 개시 당시 동물들은 대략 4개월이었다. 이 동물들은 공급자로부터 건강하며 전염병에 대한 항체가 없다는 인증을 받았다. 도착하자마자 그 동물들은 매달려 있는 철사 통에 슬래트 바닥이 있는 단일 통에 담겨 있었고, 종이로 된 휴지통 위에 매달려 있었다. 동물 보호 시설과 우리들은 동물 수령 전에 허용된 동물 보호 절차와 관련 표준 운영 절차에 따라 청소하고 위생했다. Teklad Global Ferret Diet #2072(Teklad Diets, Madison WI)와 시카고 시 수돗물은 애드리비툼으로 제공되었고 최소 일주일에 3번 이상 개운했다. 동물실의 형광등은 12시간의 조명/어두운 주기로 유지되었다. 동물실 온도 및 상대습도는 각 프로토콜 한계 이내였고, 연구 중 그 범위는 각각 20.0°C와 25.0°C 사이와 30%와 63% 사이의 범위에 있었다.
동물 검역 및 무작위화. 흰담비들은 무작위화되기 전 7일간 격리되어 매일 관찰되었다. 동물들의 일반적인 건강상태를 나타내는 매일의 관찰에 근거하여 흰담비들은 무작위화 및 검사를 위해 격리 상태로부터 방출되었다. 격리 후 흰담비들은 유사한 그룹 평균 값들을 생성한 체중들에 기초한 전산화된 무작위화 절차를 사용하여 체중 측정이 이루어졌고 치료 그룹들에 할당되었다[ToxData® 버전 2.1.E.11(PDS Pathology Data Systems, Inc., 스위스 바젤)]. 그룹 내에서, 모든 체중은 그것들 평균의 20% 이내였다. 연구를 위해 선택된 동물들은 이어 태그(ear tag)와 트랜스폰더로 영구적인 식별 번호를 받고, 개별적인 케이지 카드들 또한 개별적인 번호와 그룹으로 연구동물을 식별했다. 할당된 식별 번호들은 연구 내에서 고유한 것이었다.
실험 설계(Experimental Design). 백신 면역원성과 효험을 평가하기 위해, 흰담비들은 각 BM2SR 또는 4가 M2SR 바이러스에 면역되거나 매체(OPTI-MEMTM)에 의해 모의 면역되었다. 흰담비 체중, 체온, 임상 증상을 모니터링하고 면역 반응을 평가했다. 연구 개시시 생후 4개월된 48마리의 수컷 흰담비(Triple F Farms, Sayre PA)가 연구에 활용되었다. 모든 동물 절차들은 IIT 연구소의 동물 보호 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜들에 따라 동물 바이오세이프티(biosafety) 수준-2 시설에서 수행되었다. 접종에 앞서 3일간 흰담비들을 관찰해 체중을 측정하고 기준(baseline) 체온을 설정했다. 온도 판독값은 각 흰담비에서 피하 이식된 트랜스폰더(바이오메딕 데이터 시스템즈, Seaford, DE)를 통해 매일 기록되었다. 혈액은 연구 시작 전에 채취되었고, 혈청은 인플루엔자 항체들에 대해 검사했다. 예방접종 전 혈청 샘플은 수용체 파괴 효소(RDE)로 처리하여 비특정 억제제를 제거한 후 연속적으로 희석하여 규정된 양의 인플루엔자 바이러스 A/California/07/2009-like(H1N1pdm), A/Switzerland/9715293/2013(H3N2), 인플루엔자 B 바이러스, B/Brisbane/60/2008(Victoria 혈통) 및 B/Wisconsin/01/2010(Yamagata 혈통)에 대해 테스트되었고, 0.5%의 칠면조 적혈구들 또는 0.75-1.0%의 기니피그 적혈구들과 혼합되었다. 항체 역가들은 적혈구 응집반응의 억제를 유발하는 가장 낮은 혈청 희석에 의해 규정된다. 본 연구에서는 40 미만의 HAI(Heagglutination적혈구응집반응 억제) 역가들 있는 흰담비들만 혈청 반응 음성으로 간주하여 사용하였다. 연구동물들은 무작위로 분류되어 표 9에 도시된 바와 같이 4개의 그룹들(12개의 흰담비/그룹들)로 나누었다.
흰담비들은 0일과 28일에 BM2SR 바이러스의 1×107 TCID50 1회 용량 또는 0일과 28일에 4가 M2SR의 4×107 TCID50 1회 용량으로 비강 내로 접종되었다. 대조군은 0일과 28일에 OPTI-MEMTM으로 비강 내로 모의 접종했다. 접종 후 흰담비 체온, 체중, 임상 증상이 14일 동안 매일 관찰되었다. 세비액 샘플들은 -65℃로 보관되었다. 혈액은 접종 전(3일 전부터 5일전까지)과 21, 35, 56일에 수집되었고, 혈청은 ELISA와 HAI 평가에 의해 항체 역가를 측정할 때까지 -65℃로 유지되었다.
C. 결과들
혈청 샘플들로부터의 항-HA IgG 항체 역가들은 A/Brisbane/10/2007(H3N2), A/California/07/2009(H1N1pdm), B/Wisconsin/01/2010(Yamagata 혈통), 및 B/Brisbane/60/2008(Victoria 혈통)에 대해 ELISA에 의해 결정되었다. 간략하게, ELISA 플레이트(plate)들은 각 변종의 재조합 HA 단백질에 의해 코팅되었고, BSA(bovine serum albumin)에 의해 차단되었으며, 샘플들이 적용되었다. 흰담비 IgG 항체들은 항-흰담비 IgG-염소 항체들(KPL, Inc., Gaithersburg, MD)와 SureBlue TMB(KPL, Inc.) 기질로 라벨이 붙여진 홀스라디시 페록시다제에 의해 검출되었다.
예상된 것처럼, 면역력이 있는 그룹들 각각에서의 흰담비들은 그것의 각각의 항원에 대한 혈청에서의 항-HA 항체의 상당한 상승을 보여주었다. BM2SR 면역화된 그룹들로부터의 혈청은 예상된 특이성을 증명하였고, 인플루엔자 A 항원들(CA07-H1N1, Bris10-H3N2)에 대해 반응하지 않았다. 더 중요하게는, 4가 M2SR 그룹들이 4개의 항원(도 18) 모두에 대한 혈청에서의 항-HA 항체의 상당한 상승이 4가 백신으로서 제형화될 때 BM2SR이 면역원성이고, 다가 제형의 성분들 사이에 간섭이 존재하지 않음을 가리킨다는 것을 증명하였다. 이러한 데이터는 BM2SR 및 4가 M2SR 바이러스들이 흰담비들에서 상당한 면역 반응들을 이끌어낸다는 것을 암시한다.
혈청 샘플들은 HAI 평가에 의해, ELISA가 검출한 항체들의 기능적 활동을 증명하기 위해 분석되었다. 혈청 샘플들은 비특정 적혈구응집반응의 억제제들을 제거하기 위해, 수용체 파괴 효소(RDE)(Denka Seiken, Tokyo, Japan)로 처리되었다. RDE는 제조업체 지침에 따라 재구성되었다. 혈청은 RDE에서 1:3으로 희석되었고 37℃±2℃의 물 욕조에 18-20시간 배양되었다. 동등한 부피의 2.5%(v/v)의 구연산나트륨을 첨가한 후 샘플들이 56±2℃의 물욕탕(water bath)에서 30±5분간 배양되었다. RDE 처리 후 1:10의 최종 혈청 희석액에 0.85% NaCl이 각각의 샘플에 첨가되었다. 희석된 샘플들은 인산염 완충된 식염수(PBS)에 중복하여 4개의 2배(two-fold) 희석액(1:10 내지 1:80)으로 희석된 후 A/Brisbane/10/2007(H3N2), A/Californal/07/2009(H1N1Pdm), B/Wisconsin01/10(Yaagata 혈통) 및 B/Brisbane/60/2008(Victoria 혈통) 인플루엔자 바이러스들의 4개의 적혈구 응집 유닛들로 배양되었다. 배양 후 각각의 샘플에 0.5%의 조류 적혈구들이 추가되어 30±5분간 배양하였다. 그 후 적혈구 응집반응의 존재 또는 부재가 기록되었다.
도 19a 및 도 19b에 도시된 바와 같이, 모든 면역화된 흰담비들은 그것들 각각의 테스트 바이러스에 대한 상당한 HAI 항체 역가들을 증명하였다. 4가 M2SR은 모든 4개의 테스트 바이러스들에 대한 상당한 HAI 항체 역가들을 증명하였다. CDC는 40의 혈청 HAI 항체 역가들이 개체군들에서 인플루엔자 감염이나 질병에 대한 위험을 최소 50% 감소시키는 것과 관련이 있다고 밝혔다. 따라서 이러한 결과는 BM2SR 바이러스들이 인플루엔저 A M2SR 바이러스들과 4가 백신으로 함께 제조되었을 때 유지되는 보호 면역 반응들을 이끌어낸다는 것을 암시한다.
A/California/09/2009(H1N1pdm)로 공격한 후 BM2SR 면역 접종된 동물들에서 6일째 공격 후 5 내지 8%의 체중 감소가 관찰되었다. OPTI-MEMTM 흰담비들(위약 그룹)이 가장 많은 체중(15%)을 잃어버렸다. 백신 접종된 흰담비들 중에서의 체중 감량은 백신의 항원에 좌우되었다. 4가 M2SR(H1N1pdm M2SR을 함유하는)을 받은 흰담비들은 임의의 상당한 체중 감소를 나타내지 않았다. BM2SR 백신들을 받은 흰담비들은 5 내지 8%의 체중 감소를 나타냈다.
세비액 샘플들은 모든 흰담비로부터 1, 3, 5, 7일 공격시에 채취되었으며, MDCK 셀들에서의 플라크 평가에 의한 공격 바이러스의 존재 여부를 평가하였다. 도 20은 4가 M2SR이 공격 바이러스 복제를 제어했음을 보여준다. 위약과 BM2SR 1가 백신들은 감염 후 5일까지 최소 5건(log)의 바이러스가 검출되면서 공격 바이러스를 제어하지 못했다. BM2SR 백신은 인플루엔자 A 공격 바이러스를 제어하지는 않았지만 위약군보다 체중 감소가 덜한 것으로 입증된 질병 진행시 감속 효과(tempering effect)를 가져왔다(데이터가 표시되지 않음).
4마리의 흰담비에서 3일째에 감염 후의 수확한 호흡 기관들은 또한 공격 바이러스의 제어를 증명했다. 쿼드 M2SR은 도 21a, 도 21b 및 도 21c에 도시된 바와 같이 공격 바이러스가 상부 및 하부 호흡 조직들(비갑개, 기관, 폐 조직들)에서 복제하는 것을 전혀 허용하지 않았다. 이와는 대조적으로, 그러한 공격 바이러스는 다른 그룹들의 상부 호흡 조직들(비갑개와 기관들)에 있는 높은 역가들로 성장했다. 하부 호흡 계통(폐)에서, 1가 BM2SR 백신들은 위약 그룹에 상대적인 공격 바이러스를 제어했다. 이러한 결과는 4가 M2SR이 인플루엔자 감염이 스스로 확립되는 것을 막고 BM2SR 백신들이 감염의 심각성(severity)을 감소시킨다는 것을 암시한다.
D. 결론
이 예는 BM2SR과 4가 M2SR 백신 바이러스의 흰담비들로의 비강 내 투여가 임의의 백신-관련된 부작용 사례들(예컨대, 상승된 체온, 체중 손실 또는 임상 증상들)과 연관되지 않았음을 보여주고, 비강 내 인플루엔자 백신으로서 유용하다. 이들 결과는 BM2SR이 흰담비에서 면역 반응을 이끌어내고, 4가 M2SR 바이러스로 제형화될 때 다가 제형에 함유된 각각의 균주에 대한 보호 면역 반응을 이끌어 낸다는 것을 보여준다.
예 16: 베로 셀들에서의 인플루엔자 AOF 성장
바이러스 생성. 앞서 설명한 대로 M2SR과 BM2SR-4 바이러스가 생성되었다. M2SR의 경우 인플루엔자 A/Puerto Rico/1934로부터의 바이러스 RNA 세그먼트들 1, 2, 3, 5, 8 및 M2SR 세그먼트 7과, 인플루엔자 A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)의 HA 및 NA 바이러스 RNA 세그먼트 4, 6이 사용되었다. BM2SR의 경우 인플루엔자 B/Yamagata/1973로부터의 인플루엔자 B 바이러스 RNA 세그먼트들 1, 2, 3, 5, 8과, 인플루엔자 B/Florida/2006로부터의 세그먼트 7 BM2SR-4 및 인플루엔자 B/California/12/2015(Yamagata 혈통)의 HA 및 NA 바이러스 RNA 세그먼트들 4, 6이 사용되었다. 인플루엔자 cDNA들은 RNA 중합효소 I 발현 카세트로 복제되었다. 결과 플라스미드는 바이러스성 중합효소, NP, M2 단백질 발현 플라스미드와 함께 BM2Vero 셀로 전염되었고 상청액으로 방출된 바이러스는 BM2Vero 셀들에서 증폭되었다.
세포와 바이러스 배양. MDCK 셀들이 MEM에 유지되었고, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)으로 보충되었다. 인플루엔자 A M2와 BM2 단백질들을 안정적으로 발현하는 M2CK 및 BM2CK 셀들, MDCK 셀 라인들은 각각 MEM에서 유지되었고, 37℃에서, 5% CO2에서 FBS 10%와 150μg/mL 히그로마이신(Hygromycin) B로 보충되었다. 베로(아프리카 녹색 원숭이 신장) 셀들은 MEM에서 배양되었으며, 제조자 권장사항(Invitria, Fort Collins, C)에 따라 제형화된 10% FBS 또는 동물 유래 없는(AOF) 매체인 OptiVero로 보충되었다. 인플루엔자 A M2와 인플루엔자 B BM2 단백질들을 안정적으로 발현하는 M2Vero A와 BM2Vero 셀들, 베로 셀 라인들은 각각 OptiVero 매체로 유지되었고, mL G418 황산염당 500 또는 1000 마이크로그램으로 보충되었다.
야생형 인플루엔자 A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)는 MDCK 셀들에서 성장하였고 야생형 인플루엔자 B/CA/12/2015는 MEM의 Vero 셀들에서 성장하였으며 0.3% BSA(Bovine Serum Album)와 mL Trypsin-TPCK 당 1마이크로그램으로 보충되었다. M2SR과 BM2SR-4 바이러스는 OptiVero 매체를 이용하는 M2VeroA 또는 BM2Vero 셀들에서, mL T-TPCK 당 1마이크로그램으로 성장하였다.
바이러스 성장 운동학을 직접 비교하기 위해, 바이러스 성장 곡선들은 다음과 같이 각 바이러스/셀 라인 조합에 대해 동일한 AOF 배양 조건을 사용하여 수행되었다. 기하급수적인 위상 증식 시 Vero, M2VeroA 또는 BM2Vero 셀들은 AOF 배지에서 60mm 조직 배양 접시마다 1,000,000개의 셀들로 배양기로 배양되었다. 37℃ 5% CO2에서 가습 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, Vero 셀 라인들은 AOF 매체의 3배에서 셀당 0.001 TCID50 단위의 다수의 감염(MOI)에서 테스트 바이러스에 감염되었다. 35℃, 5% CO2에서 120분간 배양한 후 바이러스 접종을 제거하고 mL Trypsin-TPCK당 1마이크로그램이 함유된 신선한 AOF 매체를 셀에 도포했다. 바이러스 배양은 35℃, 5% CO2에서 가습 인큐베이터에서 수행되었다. 매 24시간마다, 4일 동안, 바이러스 배양액에서 알리쿼트들이 제거되고 이후 역가 분석을 위해 -80℃에서 냉동 보관되었다. 배양 상청액의 바이러스 역가는 M2SR 바이러스에 대한 지지 M2CK 셀들과 BM2SR4 바이러스 샘플들에 대한 BM2CK 셀들을 사용한 50% 조직 배양 억제 선량(TCID50)에 의해 결정되었다. 야생형 바이러스 샘플들은 MDCK 또는 M2-발현 M2CK 및 BM2CK 셀들에 적정되었다. M2 결핍 M2SR(도 22a) 또는 야생형 베로 셀들에서 BM2 결핍 BM2SR4 바이러스 배양들(도 22b)에 대한 검출의 분석 한계(mL당 log10 TCID50 1.67) 이상에서는 바이러스 역가가 검출되지 않았다. 동족인 M2VeroA 셀들에서의 인플루엔자 A M2SR HK4801 웰(well)은 야생형 베로 셀들에서 각각 야생형 A/Hong Kong/2014(H3N2) 및 B/CA/12/2015에 필적하는 성장 곡선들을 가지고 BM2Vero 셀들에서 복제되었다. M2 또는 BM2의 과발현(over-expression)은 변형되지 않은 야생형 베로 셀 라인의 복제에 비해 야생형 인플루엔자 A 또는 B 바이러스 복제에 영향을 미치지 않았다.
M2VeroA 셀 라인에서 성장한 BM2SR-4 인플루엔자 B 바이러스에 대한 바이러스 복제는 관찰되지 않았다(도 22b). 대조적으로, 인플루엔자 A M2SR 바이러스는 M2VeroA 셀들의 인플루엔자 A M2SR 성장에 대해 나타난 것과 매우 유사한 운동학을 가진 BM2Vero 셀들에서 복제되었다(도 22a). 따라서, BM2Vero 셀 라인에서의 인플루엔자 BM2 단백질의 발현은 야생형 인플루엔자 A의 성장 운동학과 비교 가능한 인플루엔자 A M2 결핍 M2SR 바이러스 균주들 복제를 허용한다. 한편, 인플루엔자 A M2는 인플루엔자 B의 복제에서 BM2의 기능을 대신하지 않는다.
예 17: BM2Vero 셀 기질에서의 인플루엔자 A M2SR 유전 안정성
바이러스 생성. 인플루엔자 A는 M2VeroA 셀들에서 플라스미드 기반의 역유전학을 사용하여 생성되었다. 인플루엔자 A/Puerto Rico/1934로부터의 인플루엔자 A 바이러스 RNA 세그먼트 1, 2, 3, 5, 8 및 M2SR 세그먼트 7과, 인플루엔자 A/Hong/4801/2014(H3N2)의 HA 및 NA 바이러스 RNA 세그먼트 4, 6이 M2SR HK4801 바이러스를 생성하기 위해 사용되었다.
인플루엔자 세그먼트 cDNA들은 단방향 RNA 중합효소 I 발현 카세트로 복제되었다. 그 결과 8개의 RNA-발현 플라스미드가 3개의 바이러스성 중합효소 플라스미드, NP 플라스미드, M2 플라스미드를 포함하는 5개의 단백질 발현 플라스미드와 함께 M2VeroA 셀들로 공동 감염되었다. 상청액으로 방출된 바이러스는 3개의 바이러스 통과에 대해 신선한 M2Vero 셀들에서 증폭되었다. 3개의 통과 후에 바이러스 역가가 결정되었고, 전체 균주 게놈의 시퀀싱(sequencing)에 의해 유전적 정체성이 확인되었다. 간략하게, 인플루엔자 A 특정 PCR 프라이머들을 사용하여 인플루엔자 A 특정 cDNA 반응 생성물들이 증폭되었다. 8개 세그먼트 모두에서 증폭된 생성물은 세그먼트-특정된 내부 프라이머들을 사용하는 염료-단자(dye-terminator) 시퀀싱을 받았다. 그 후, 인플루엔자 A M2SR HK4801 바이러스는 BM2-단백질-발현 BM2Vero 셀 라인에서 추가로 10회 통과되었다. Vero 셀 라인의 총 13개 구간에 걸쳐 통과되었던 M2VeroA P3/BM2Vero P10 바이러스 균주는 완전한 게놈 뉴클레오티드 염기서열의 결정에 의해 다시 유전자 정체성 검사를 받았다. 역유전학에 의해 생성된 M2SR HK4801 M2VeroA P3 바이러스 균주의 게놈에서 얻은 뉴클레오티드 염기서열은 모두 8개의 바이러스 세그먼트 염기서열이 시작 cDNA 플라스미드의 염기서열과 동일하다는 것을 나타냈다. BM2Vero 셀 라인에서의 배양에서의 10회의 추가적인 통과 후, 바이러스는 매우 미묘한 적응(adaptation)을 겼었다. 총 4개의 뉴클레오티드 대체물이 2개의 균주들 사이에서 관찰되었다. 관찰된 모든 변화는 무성 돌연변이였으며, 이는 관찰된 모든 대체물이 적응된 세그먼트의 아미노산 코딩을 변화시킬 것으로 예측되지 않는다는 것을 의미한다(표 10). 따라서, 이러한 결과는 첫 번째로 Vero 셀들에서 역유전학에 의해 생성된 M2SR HK4801 바이러스가 Vero 셀 라인들에서 총 13회의 바이러스 증폭 후 13,588 염기 인플루엔자 A gRNA 게놈에서 단지 4개의 염기 대체가 관찰되었기 때문에 유전적으로 안정적이라는 것을 증명한다. 두 번째로, BM2 단백질을 발현하는 BM2Vero 셀 라인은 인플루엔자 A M2의 모든 필요한 기능을 제공하며, 게놈 시퀀스가 BM2 단백질에 의해서만 지지되는 10개의 바이러스 통과 후 안정된 상태를 유지하였기 때문에 인플루엔자 A M2SR 바이러스에 어떠한 과도한 선택도 가해지지 않는 것으로 보인다.
표 10. 베로 통과 후 M2SR HK4801의 게놈 뉴클레오티드 시퀀스
Nucleotide Sequence Results
Seg. Gene M2VeroA P3 M2VeroA P3/BM2Vero P10
1 PB2 Matches plasmid 2 silent mutations
2 PB1 Matches plasmid Matches plasmid
3 PA Matches plasmid 1 silent mutations
4 HA Matches plasmid 1 silent mutations
5 NP Matches plasmid Matches plasmid
6 NA Matches plasmid Matches plasmid
7 M Matches plasmid Matches plasmid
8 NS Matches plasmid Matches plasmid
<110> FLUGEN, INC. <120> INFLUENZA B VIRUS MUTANTS AND USES THEREFOR <130> 090248-0164 <140> PCT/US2018/019690 <141> 2018-02-26 <150> 62/463,994 <151> 2017-02-27 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 60 tcattgacag aagatggaga aggcaaagca gaactagcag aaaaattaca ctgttggttc 120 ggtgggaaag aatttgacct agactctgcc ttggaatgga taaaaaacaa aagatgctta 180 actgacatac agaaagcact aattggcgcc tctatctgct ttttaaaacc caaagaccag 240 gaaagaaaaa gaagattcat cacagagccc ctatcaggaa tggggacaac agcaacaaaa 300 aagaagggcc tgattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtgagctt ccatgaagca 360 tttgaaatag cagaaggcca tgaaagctca gcgttactat attgtctcat ggtcatgtac 420 ctgaatcctg gaaattattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttgtgcgaa 480 aaacaagcat cacattcaca cagggctcat agcagagcag cgagatcttc agtgcctgga 540 gtgagacggg aaatgcagat ggtctcagct 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<210> 18 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Pro Leu Thr Ile Ala Ala Asn Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Thr Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Asn Gln 35 40 45 Ile Arg Arg Gly Val Asn Leu Lys Ile Gln Ile Arg Asn Pro Asn Lys 50 55 60 Glu Ala Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Asn Tyr Gln Lys 65 70 75 80 Glu Ile Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Lys Ile Leu Ser Asp Asn Met 85 90 95 Glu Val Leu Gly Asp His Ile Val Val Glu Gly Leu Ser Thr Asp Glu 100 105 110 Ile Ile Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Leu Gln 115 120 125 <210> 19 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Pro Leu Thr Ile Ala Ala Asn Ile 20 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Asp Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Leu Gln 100 105 <210> 21 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Met Leu Glu Pro Leu Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Phe Phe Lys Cys 20 25 30 Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Gly Gly Pro Ser Thr Glu 35 40 45 Gly Val Pro Lys Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln Gln Ser 50 55 60 Ala Val Asp Ala Asp Asp Gly His Phe Val Ser Ile Glu Leu Glu 65 70 75 <210> 22 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Met Leu Glu Pro Leu Gln Ile Leu Thr Ile Ala Ala Asn Ile Ile Gly 1 5 10 15 Ile Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Arg 20 25 30 Arg Gly Val Asn Leu Lys Ile Gln Ile Arg Asn Pro Asn Lys Glu Ala 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Asn Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Lys Ile Leu Ser Asp Asn Met Glu Val 65 70 75 80 Leu Gly Asp His Ile Val Val Glu Gly Leu Ser Thr Asp Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Leu Gln 100 105 <210> 23 <211> 294 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 23 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgcct atcagaaacg aatgggggtg cagatgcaac 60 ggttcaagtg atcctctcac tattgccgca aatatcattg ggatcttgca cttgacattg 120 tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc atttaccgtc gctttaaata cggactgaaa 180 ggagggcctt ctacggaagg agtgccaaag tctatgaggg aagaatatcg aaaggaacag 240 cagagtgctg tggatgctga cgatggtcat tttgtcagca tagagctgga gtaa 294 <210> 24 <211> 330 <212> DNA <213> Influenza B virus <400> 24 atgctcgaac cacttcagat tctttcaatt tgttctttca ttttatcagc tctccatttc 60 atggcttgga caatagggca tttgaatcaa ataagaagag gggtaaacct gaaaatacaa 120 ataaggaatc caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac 180 caaaaggaaa tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta 240 ttgggtgacc acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa 300 acagttttgg aggtggaaga attgcaataa 330 <210> 25 <211> 330 <212> DNA <213> Influenza B virus <400> 25 atgctcgaac cacttcagat tctttcaatt tgtcttttca ttttatcagc tctctgtttc 60 atggcttgga caatagggca tttgaatcaa ataagaagag gggtaaacct gaaaatacaa 120 ataaggaatc caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac 180 caaaaggaaa tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta 240 ttgggtgacc acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa 300 acagttttgg aggtggaaga attgcaataa 330 <210> 26 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 atgtccctgc tgaccgaagt ggaaactcct attagaaacg agtggggctg tagatgtaac 60 ggctcaagcg accctctgac cattgctgcc aacatcattg gcatcctgca cctgaccctg 120 tggattctgg accgactgtt ctttaagtgc atctaccgga gattcaagta tggactgaaa 180 ggaggaccaa gcacagaggg agtgcctaaa tccatgaggg aggaataccg caaagagcag 240 cagagcgccg tggacgcaga tgatggacat ttcgtgagca ttgaactgga atga 294 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 atgctggaac cactgcagat cctgagtatt tgctctttta tcctgagcgc actgcacttt 60 atggcctgga ctatcgggca cctgaaccag atcagaaggg gcgtgaacct gaagatccag 120 atcagaaacc caaacaagga ggccatcaac cgcgaagtga gcatcctgag acacaattac 180 cagaaggaga tccaggctaa agaaaccatg aagaaaatcc tgtctgacaa tatggaggtg 240 ctgggcgatc acatcgtggt ggaaggactg agcaccgacg aaatcatcaa aatgggcgag 300 actgtcctgg aagtggaaga actgcagtaa 330 <210> 28 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 atgtccctgc tgaccgaagt ggaaactcct attagaaacg agtggggctg tagatgtaac 60 ggctcaagcg accctctgac cattgctgcc aacatcattg gcatcctgca cctgaccctg 120 tggattctgg accgactgaa ccagatcaga aggggcgtga acctgaagat ccagatcaga 180 aacccaaaca aggaggccat caaccgcgaa gtgagcatcc tgagacacaa ttaccagaag 240 gagatccagg ctaaagaaac catgaagaaa atcctgtctg acaatatgga ggtgctgggc 300 gatcacatcg tggtggaagg actgagcacc gacgaaatca tcaaaatggg cgagactgtc 360 ctggaagtgg aagaactgca gtaa 384 <210> 29 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 atgtccctgc tgaccgaagt ggaaactcct attagaaacg agtggggctg tagatgtaac 60 ggctcaagcg accctctgac cattgctgcc aacatcattg gcatcctgca cctgaccctg 120 tggattctgg accgactgaa ccagatcaga aggggcgtga acctgaagat ccagatcaga 180 aacccaaaca aggaggccat caaccgcgaa gtgagcatcc tgagacacaa ttaccagaag 240 gagatccagg ctaaagaaac catgaagaaa atcctgtctg acaatatgga ggtgctgggc 300 gatcacatcg tggtggaagg actgagcacc gacgaaatca tcaaaatggg cgagactgtc 360 ctggaagtgg aagaactgca gtaa 384 <210> 30 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 atgtccctgc tgaccgaagt ggaaactcct attagaaacg agtggggctg tagatgtaac 60 ggctcaagcg accctctgac cattgctgcc aacatcattg gcatcctgca cctgaccctg 120 tggattctgg accgactgtt ctttaaccag atcagaaggg gcgtgaacct gaagatccag 180 atcagaaacc caaacaagga ggccatcaac cgcgaagtga gcatcctgag acacaattac 240 cagaaggaga tccaggctaa agaaaccatg aagaaaatcc tgtctgacaa tatggaggtg 300 ctgggcgatc acatcgtggt ggaaggactg agcaccgacg aaatcatcaa aatgggcgag 360 actgtcctgg aagtggaaga actgcagtaa 390 <210> 31 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 atgctcgaac cacttcagat tcttactatt gctgccaaca tcattggcat cctgcacctg 60 accctgtgga ttctggaccg actgaaccag atcagaaggg gcgtgaacct gaagatccag 120 atcagaaacc caaacaagga ggccatcaac cgcgaagtga gcatcctgag acacaattac 180 cagaaggaga tccaggctaa agaaaccatg aagaaaatcc tgtctgacaa tatggaggtg 240 ctgggcgatc acatcgtggt ggaaggactg agcaccgacg aaatcatcaa aatgggcgag 300 actgtcctgg aagtggaaga actgcagtaa 330 <210> 32 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 atgctggaac cactgcagat cctgagtatt tgctctttta tcctgagcgc actgcacttt 60 atggcctgga ctatcgggca cctgttcttt aagtgcatct accggagatt caagtatgga 120 ctgaaaggag gaccaagcac agagggagtg cctaaatcca tgagggagga ataccgcaaa 180 gagcagcaga gcgccgtgga cgcagatgat ggacatttcg tgagcattga actggaatga 240 240 <210> 33 <211> 976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact 60 ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120 tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300 catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360 caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420 caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480 acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact 540 aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600 ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat 660 ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720 tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780 gtgattaata ggatcgtctt tttttcaaat gcatttaccg tcgctttaaa tacggactga 840 aaggagggcc ttctacggaa ggagtgccaa agtctatgag ggaagaatat cgaaaggaac 900 agcagagtgc tgtggatgct gacgatggtc attttgtcag catagagctg gagtaaaaaa 960 ctaccttgtt tctact 976 <210> 34 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 34 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20 <210> 35 <211> 113 <212> RNA <213> Influenza B virus <400> 35 aaggaauugc aaaggaugua auggaagugc uaaagcagag cucuauggga aauucagcuc 60 uugugaagaa auaccuauaa ugcucgaacc auuucagauu cuuucaauuu guu 113 <210> 36 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 ggauguaaug gaagugcuaa agcagagcuc uaugggaaau ucagcucuug ugaagaaaua 60 ccuauaaauu caauuuuuac uguacuucuu acuaugcauu u 101 <210> 37 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 aaggaauugc aaaggaugua auggaagugc uaaagcagag cucuauggga aauucagcuc 60 uugugaagaa auaccuauaa ugcucgaacc auuucagauu cuuucaauuu guu 113

Claims (26)

  1. 재조합 인플루엔자 B 바이러스에 있어서,
    SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 BM2 유전자에서의 돌연변이는 상기 BM2 단백질을 발현하기 위해 상기 바이러스의 장애(failure)를 초래하거나 상기 바이러스로 하여금 절단된 BM2 단백질(truncated BM2 protein)을 발현하게 하는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
    상기 변이체 BM2 유전자는 시험관 내 호스트 셀 시스템(in vitro host cell system)에서 적어도 10개의 통로(passage)들을 위한 기능성 BM2 단백질을 암호화하는 야생형(wild-type) 시퀀스 또는 비야생형 시퀀스로 되돌리지 않고, 상기 호스트 셀은 상기 변이체 유전자의 기능성 버전(functional version)을 생성하기 위해 변형됨으로써 상기 바이러스에 유전자 생성물(gene product)을 트랜스 방식으로(in trans) 제공하는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에서의 면역 반응을 이끌어내는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에 대해 비병원성(non-pathogenic)인, 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
  6. 제3 항에 있어서,
    상기 시험관 내 셀 시스템은 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 셀들 또는 베로 셀(Vero cell)들을 포함하는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스.
  7. 조성물에 있어서:
    SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 변이체 BM2 유전자를 가지는 재조합 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 조성물.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 BM2 유전자의 돌연변이는 상기 BM2 단백질을 발현하기 위해 상기 바이러스의 장애를 초래하거나, 상기 바이러스로 하여금 절단된 BM2 단백질을 발현하게 하는, 조성물.
  9. 제7 항 또는 제8 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에서의 면역 반응을 이끌어내는, 조성물.
  10. 제7 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에 대해 비병원성인, 조성물.
  11. 제7 항에 있어서,
    보조제(adjuvant)를 더 포함하는, 조성물.
  12. 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법에 있어서:
    호스트 셀과, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고,
    상기 호스트 셀은 상기 인플루엔자 BM2 유전자의 기능성 버전을 생성하기 위해 변형됨으로써 상기 바이러스에 유전자 생성물을 트랜스 방식으로 제공하는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  13. 제12 항에 있어서,
    자손 바이러스 입자(progeny virus particle)들을 격리시키는 단계를 더 포함하는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    상기 바이러스 입자들을 백신으로 제형화하는 단계를 더 포함하는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  15. 제12 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 BM2 단백질을 발현하는데 장애를 일으키거나, 절단된 BM2 단백질을 발현하는데 장애를 일으키는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  16. 제12 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에서의 면역 반응을 이끌어내는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  17. 제12 항에 있어서,
    상기 바이러스는 상기 바이러스로 감염되는 포유동물에 대해 비병원성인, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  18. 제12 항에 있어서,
    상기 변이체 BM2 유전자는 상기 호스트 셀의 적어도 10개의 통로들을 위한 기능성 BM2 단백질을 암호화하는 야생형 시퀀스 또는 비야생형 시퀀스로 되돌리지 않는, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  19. 제12 항에 있어서,
    상기 호스트 셀은 MDCK 셀 또는 베로 셀인, 재조합 인플루엔자 B 바이러스의 전파 방법.
  20. 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 전파 방법에 있어서:
    호스트 셀과, SEQ ID NO: 33을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고,
    상기 호스트 셀은 상기 인플루엔자 BM2 유전자의 야생형 버전을 생성하기 위해 변형됨으로써 상기 바이러스에 BM2 유전자 생성물을 트랜스 방식으로 제공하는, 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 전파 방법.
  21. 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 전파 방법에 있어서:
    호스트 셀과, SEQ ID NO: 33을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고,
    상기 호스트 셀은 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, 및 SEQ ID NO: 32로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 A M2 및 인플루엔자 B BM2 유전자의 키메릭 버전(chimeric version)을 생성함으로써 키메릭 M2:BM2 유전자 생성물을 상기 바이러스에 트랜스 방식으로 제공하게 변형되는 베로 셀인, 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 전파 방법.
  22. 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 전파 방법에 있어서:
    호스트 셀과, SEQ ID NO: 33을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 접촉시키는 단계; 및 상기 호스트 셀을 충분한 시간 동안 그리고 바이러스 복제에 알맞은 상태 하에서 배양시키는 단계를 포함하고,
    상기 호스트 셀은 SEQ ID NO: 27을 포함하는 BM2 유전자의 코돈 최적화되는 버전(codon-optimized version)을 생성함으로써 BM2 유전자 생성물을 상기 바이러스에 트랜스 방식으로 제공하게 변형되는 베로 셀인, 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 전파 방법.
  23. 변이체 BM2 단백질을 포함하는 재조합 인플루엔자 A 바이러스.
  24. 재조합 인플루엔자 바이러스를 전파하기 위한 호스트 셀에 있어서,
    상기 호스트 셀은 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, 및 SEQ ID NO: 32로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 cDNA 시퀀스에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 생성하기 위해 변형되는 베로 셀인, 재조합 인플루엔자 바이러스를 전파하기 위한 호스트 셀.
  25. 제24 항에 있어서,
    상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 SEQ ID NO: 33에 발현되는 바와 같은 변이체 M2 유전자를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스인, 재조합 인플루엔자 바이러스를 전파하기 위한 호스트 셀.
  26. 제24 항에 있어서,
    상기 재조합 인플루엔자 바이러스는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6에 발현되는 바와 같은 변이체 BM2 유전자를 포함하는 인플루엔자 B 바이러스이고, 상기 베로 셀은 SEQ ID NO: 27에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 생성하기 위해 변형되는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 전파하기 위한 호스트 셀.
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