JP2020508076A - インフルエンザbウイルス変異体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ワクチン接種はインフルエンザ予防の主要な方法であり、生弱毒化および不活化(死滅)ウイルスワクチンの両方が現在利用可能である。生ウイルスワクチン(典型的には鼻内投与される)は免疫系の全ての相を活性化し、多数のウイルス抗原に対する免疫応答を刺激することができる。したがって、生ウイルスの使用は、不活化ウイルスワクチンの調製時に生じ得るウイルス抗原の破壊の問題を克服する。加えて、生ウイルスワクチンによって生じる免疫は、概して不活化ウイルス誘発免疫よりも持続性、有効性および交差反応性が高く、かつ生ウイルスワクチンは不活化ウイルスワクチンよりも製造コストが低い。しかしながら、弱毒化ウイルスの変異はしばしば不明確で復帰が懸念される。
ある特徴では、本開示は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5を含む変異BM2遺伝子を有する組換えインフルエンザBウイルスを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様では、BM2遺伝子における変異は、ウイルスのBM2タンパク質発現の失敗をもたらすか、またはウイルスに切詰めBM2タンパク質を発現させる。いくつかの実施態様では、ウイルスは、当該ウイルスに感染する哺乳動物で免疫応答を引き出す。いくつかの実施態様では、ウイルスは当該ウイルスに感染する哺乳動物に対し非病原性である。いくつかの実施態様では、組成物はさらにアジュバントを含む。
ある特徴では、本開示は組換えインフルエンザAウイルスを増殖させる方法を提供し、前記方法は、宿主細胞を配列番号:33を含む組換えインフルエンザAウイルスと接触させる工程;および当該宿主細胞を十分な時間およびウイルス複製に適切な条件下でインキュベートする工程を含み、ここで、当該宿主細胞は、インフルエンザA M2並びに配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31および配列番号:32から成る群から選択されるインフルエンザB BM2遺伝子のキメラバージョンを生成するように改変され、それによってウイルスにキメラM2:BM2遺伝子生成物をトランス態様で提供するベロ細胞である。
ある特徴では、本開示は組換えインフルエンザAウイルスを増殖させる方法を提供し、前記方法は、宿主細胞を配列番号:33を含む組換えインフルエンザAウイルスと接触させる工程;および当該宿主細胞を十分な時間およびウイルス複製に適切な条件下でインキュベートする工程を含み、ここで、当該宿主細胞は、配列番号:27を含むBM2遺伝子のコドン最適化バージョンを生成するように改変され、それによってウイルスにBM2遺伝子生成物をトランス態様で提供するベロ細胞である。
ある特徴では、本開示は変異BM2タンパク質を含む組換えインフルエンザAウイルスを提供する。
ある特徴では、本開示は、組換えインフルエンザウイルスを増殖させるための宿主細胞を提供し、ここで、当該宿主細胞は、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31および配列番号:32から成る群から選択されるcDNA配列によってコードされる遺伝子生成物を生成するように改変されるベロ細胞である。いくつかの実施態様では、組換えインフルエンザウイルスは、配列番号:33に示される変異M2遺伝子を含むインフルエンザAウイルスである。いくつかの実施態様では、組換えインフルエンザウイルスは、配列番号:4または配列番号:6に示される変異BM2遺伝子を含むインフルエンザBウイルスであり、ここで、当該ベロ細胞は配列番号:27によってコードされる遺伝子生成物を生成するように改変される。
以下の用語が本明細書で用いられ、それらの定義が指針のために提供される。
本明細書で用いられるように、単数形“a”、“an”および“the”は、単数のみを指すと明確に表明されないかぎり単数および複数の両方を指す。
“about(約)”という用語および一般的に範囲の使用(約という用語によって修飾されているか否かにかかわらない)は、包含される数が本明細書に指示される数そのものに限定されず、実質的に当該引用された範囲内の範囲を指すことが意図されるが、ただし本発明の範囲から逸脱しない。本明細書で用いられるように、“約”は当業者には理解され、当該用語が用いられる文脈にしたがってある程度変動するであろう。当業者にとって不明瞭に当該用語が使用されている場合、その用語が用いられている文脈を条件として、“約”はまさにその用語のプラスまたはマイナス10%までを指すであろう。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、多数の形態で投与されるために処方することができる(すなわち哺乳動物への“暴露”のために処方される)。例えば、いくつかの実施態様では、免疫原性組成物は、経口、肺、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、鼻、または外用投与のために調製される。組成物はまた特別な投薬形態のために処方することができる。例えば、いくつかの実施態様では、免疫原性組成物は、液体、ゲル、エーロゾル、軟膏、クリーム、凍結乾燥処方物、散剤、ケーキ、錠剤、またはカプセルとして処方することができる。他の実施態様では、免疫原性組成物は、制御放出処方物、徐放性処方物、長期放出処方物、拍動放出処方物、および混合即時放出処方物として処方される。いくつかの実施態様では、免疫原性組成物は液体として提供される。他の実施態様では、免疫原性組成物は凍結乾燥形で提供される。
本明細書で用いられるように、“vRNA”という用語はウイルスゲノムを含むRNAを指し、前記には分断化または非分断化ウイルスゲノムがプラス鎖およびマイナス鎖のウイルスゲノムとともに含まれる。vRNAは、完全に内因性で“野生型”であってもよく、および/または組換え体および/または変異体配列を含んでいてもよい。
A.概論
インフルエンザはアメリカ人成人の主要な死因である。インフルエンザの原因因子はオルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のウイルスであり、前記にはインフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、およびインフルエンザCウイルスが含まれ、インフルエンザBが人間でほぼ独占的に循環している。
インフルエンザBウイルスは、エンベロープを有するマイナス鎖RNAウイルスである。インフルエンザBウイルスのゲノムは8つの一本鎖(対を持たない)RNAに収納され、その相補鎖は11のタンパク質をコードする。これらのタンパク質のうち、以下の9つはインフルエンザAウイルスでもまた見出される:3つのRNA依存RNAポリメラーゼサブユニット(PB1、PB2およびPA)、ヘマグルチニン(HA)、核タンパク質(NP)、ノイラミニダーゼ(NA)、マトリックスタンパク質(M1またはBM1)、および2つの非構造タンパク質(NS1およびNS2(NEPとしても知られる))。2つのタンパク質(NBおよびBM2)はインフルエンザBウイルスに固有である。総ゲノムサイズは約14,500塩基である。ゲノム分断化の特性は、細胞が共同で生存するときに異なるウイルス株間での全遺伝子の交換(再集合として知られるプロセス)を可能にする。8つのRNAセグメント(長さが減少する順に番号が振られている)は以下のとおりである:セグメント1、2および3はPB1、PB2およびPAをそれぞれコードし、前記はRNAポリメラーゼサブユニットである。セグメント4はHA(ヘマグルチニン)をコードする。セグメント5はNP(核タンパク質)をコードする。セグメント6はNB(NBタンパク質(その機能は不明である))およびNAの両方をコードする。セグメント7は、二シストロン性mRNA(その翻訳方法は固有である)によってBM1(マトリックスタンパク質)およびBM2(イオンチャネル)の両方をコードする。BM2開始コドンはBM1終止コドンとオーバーラップする(TAATG、終了-開始ペンタヌクレオチドモチーフ)。BM2タンパク質は、インフルエンザAウイルスのM2タンパク質(スプライシングされたmRNAから翻訳される)とは異なりこの終了-開始翻訳メカニズムによって翻訳される。セグメント8は、同じRNAセグメントに由来する異なるリーディングフレームを用いることによってNS1およびNEPの両方をコードする。
インフルエンザウイルスは標準的命名法を有し、前記はウイルス型、当該ウイルスが単離された種(非ヒトの場合)、それが単離された場所、単離株番号、単離年、並びにインフルエンザAウイルスの場合のみHAおよびNA亜型を含む。したがって、B/Yamagata/16/88は、1988年に山形(日本)で採取されたヒトインフルエンザBウイルスの単離株番号16であった。
インフルエンザウイルスの生活環は、おおざっぱに言って細胞表面受容体への付着、細胞への侵入およびウイルス核酸の脱外被、その後に続く細胞内でのウイルス遺伝子の複製を含む。ウイルスタンパク質および遺伝子の新しいコピーの合成後、これらの成分は子孫ウイルス粒子に組み立てられ、前記粒子は続いて細胞から出ていく。種々のウイルスタンパク質がこれらの工程の各々で役割を果たす。
インフルエンザB粒子は、ウイルスコアを被包する脂質エンベロープで構成される。エンベロープの内側はマトリックスタンパク質(M1)で裏打ちされ、一方、外側表面は2つのタイプの糖タンパク質スパイク(ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA))によって特徴付けられる。BM2(トランスメンブレンイオンチャネルタンパク質)もまた脂質エンベロープの部分である(例えば図1を参照されたい)。
ノイラミニダーゼ(NA)(テトラマー性II型膜タンパク質)はシアリダーゼであり、前記は、宿主細胞の糖複合化物並びにHAおよびNAから末端シアル酸残基を切断し、したがって受容体破壊酵素として認識される。このシアリダーゼ活性は、宿主細胞表面の子孫ビリオンの効率的放出とともに、ウイルスHAの他の糖タンパク質との結合活性による子孫の凝集の防止に必要である。したがって、HAの受容体結合活性とNAの受容体破壊活性はおそらく拮抗的に働き、インフルエンザの効率的な複製を可能にする。
インフルエンザウイルスの生活環は、宿主細胞表面のシアル酸含有受容体とHAとの結合により開始し、その後に受容体媒介エンドサイトーシスが続く(図1)。後期エンドソームの低pHはHAの配座シフトを始動させ、それによってHA2サブユニット(いわゆる融合ペプチド)のN-末端を露出させる。前記融合ペプチドはウイルス膜とエンドソーム膜との融合を開始し、マトリックスタンパク質(M1)およびRNP複合体が細胞質中に放出される。RNPは、核タンパク質(NP)(前記はvRNAをキャプシド被包する)、およびウイルスポリメラーゼ複合体(PA、PB1およびPB2タンパク質によって形成される)から成る。RNPは核に輸送され、核で転写及び複製が行われる。RNAポリメラーゼ複合体は3つの異なる反応を触媒する:(1)5’キャップおよび3’ポリA構造を有するmRNAの合成、(2)完全長相補性RNA(cRNA)の合成、および(3)鋳型としてcDNAを用いるゲノムvRNAの合成。新規に合成されたvRNA、NPおよびポリメラーゼタンパク質を続いてRNPに組み立て、核から搬出し、形質膜へ輸送し、形質膜で子孫ウイルス粒子の出芽が生じる。ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、したがって新規に組み立てられたビリオンを細胞表面から放出し、さらにウイルス粒子の自己凝集を防止することによって感染後期に役割を果たす。ウイルスの組立てはタンパク質-タンパク質相互作用およびタンパク質-vRNA相互作用を必要とするが、これら相互作用の本質はほとんど不明のままである。
上記に記載したように、3つのタンパク質(ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)およびBM2)がウイルス膜を跨いでいる。インフルエンザAに関しては、HAおよびNAの細胞外ドメイン(エクトドメイン)にはかなりの変動性があるが、M2のエクトドメインはインフルエンザAウイルス間で本質的に不変である。理論に拘束されないが、インフルエンザAウイルスでは、M2タンパク質(イオンチャネル活性を有する)は、宿主細胞貫通およびウイルスRNA脱外被の間のウイルス生活環の初期に機能すると考えられる。いったんビリオンがエンドサイトーシスを受けたら、ビリオン結合M2イオンチャネル(ホモテトラマーヘリックス束)は、プロトンがエンドソームからビリオン内部に流れることを可能にして、酸に不安定なM1タンパク質-リボヌクレオタンパク質複合体(RNP)相互作用を破壊し、それにより細胞質へのRNP放出を促進すると考えられている。加えて、HAが細胞内で切断されるいくつかのインフルエンザ株(例えばA/fowl plagues/Rostock/34)では、M2イオンチャネルは、トランスゴルジ網のpHを高め、この区画内の低pH条件に起因するHAの配座変化を防ぐと考えられる。M2トランスメンブレンドメインそれ自体がイオンチャネルとして機能できるということもまた示された。M2タンパク質イオンチャネル活性は、インフルエンザウイルスの生活環で必須であると考えられる。なぜならば、アマンタジン塩酸塩(M2イオンチャネル活性を遮断する)がウイルス複製を阻害することが示されたからである。
インフルエンザAウイルスM2タンパク質に対するインフルエンザBウイルスの機能的対応物は、BM2として知られるIII型トランスメンブレンタンパク質である。その翻訳のためのメカニズムは、下記に記載する、連結終了/再開始事象を必要とする。
ある特徴では、変異BM2 vRNA配列を保持するインフルエンザBウイルスが開示される。典型的には、そのような変異体はBM2イオンチャネル活性を持たず、in vivoで弱毒化された増殖特性を示し、感染性子孫を生産できず、感染対象動物で非病原性であるかまたは緩和された病原性を示す。変異ウイルスは免疫原性であり、ワクチンとして用いられるときは、対応する野生型および/または他の病原性ウイルスによる感染に対して防御を提供する。加えて、本明細書に開示するBM2変異体は安定であり、用いられる宿主細胞にかかわらず、変異して機能的BM2ポリペプチドを発現することはない。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、これら変異体のBM1タンパク質はその機能に検出可能な変更を生じることなく生成される。いくつかの実施態様では、変異BM2核酸配列を保持するウイルスは宿主細胞で複製することができない(当該宿主細胞で野生型ウイルスは増殖し得よう)。制限ではなく例示として、いくつかの実施態様では、野生型ウイルスは、培養MDCK細胞、CHO細胞および/またはベロ細胞で増殖、繁殖および複製でき、一方、変異BM2配列を保持する対応するウイルスは、同じタイプの細胞で1サイクルを超えては増殖、複製または繁殖できない。
いくつかの実施態様では、BM2変異体は1つ以上の核酸置換および/または欠失を含む。いくつかの実施態様では、変異は、BM2タンパク質の細胞外ドメイン、BM2タンパク質のトランスメンブレンドメイン、および/またはBM2タンパク質の細胞質テールの1つ以上をコードする核酸に局在する。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、1つ以上の核酸変異はBM2ペプチドの1つ以上の終止コドンおよび/または1つ以上のアミノ酸欠失を生じる。いくつかの実施態様では、変異BM2核酸を持つウイルスは非機能性BM2ポリペプチドを生成する。いくつかの実施態様では、変異BM2核酸を持つウイルスはBM2ポリペプチドを生成しない。いくつかの実施態様では、変異BM2核酸を持つウイルスは切詰めBM2ポリペプチドを生成する。
ウイルス複製におけるBM2の要求は、109アミノ酸のBM2 ORFに正確な欠失を有するインフルエンザBウイルスを構築することによって明らかにされた。このウイルスはM2CK細胞(構成的にBM2タンパク質を発現するMDCK細胞)で複製できる。このMD欠失構築物はMDCK系統細胞での複製を可能にするが、一方、全体の欠失は調節エレメント部分を除去し、これは特に、ウイルスの産生に影響を及ぼし得る他の因子によって制限を受けるときはM1タンパク質の発現に有害に影響し得よう。例えば、インフルエンザBウイルスはMDCK細胞では高力価で増殖するが、一方、それらウイルスは、部分的にはM1タンパク質の低発現によってベロ細胞では高度に制限される(Nakamura, 1981)。したがって、Mセグメントの操作はM1発現にうかつに更なる影響を及ぼすことがある。
これらの欠点に対処するために、B/Florida/4/2006のセグメント7を土台にする一連の新規な5つのBM2ヌル変異体構築物(BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4およびBM2SR-5)(図2)を設計し、続いて二本鎖DNAフラグメントとして合成した。前記フラグメントは、当業界で公知の標準的技術を用いる標準的なin vitro遺伝子アッセンブリーのために適切である。当該構築物の一本鎖mRNAまたはプラスセンスDNAヌクレオチド配列を表1に提供する:BM2SR-1(配列番号:1)、BM2SR-2(配列番号:2)、BM2SR-3(配列番号:3)、BM2SR-4(配列番号:4)、BM2SR-5(配列番号:5)、およびBM2SR-0(配列番号:6)。
太字下線でBM1およびBM2コード配列並びにペンタヌクレオチドモチーフを示す野生型インフルエンザBセグメント7を表2に提供する。
インフルエンザBウイルスの抗原的および遺伝的に別個の2つの系統が同時に循環し、少なくとも1988年以来人間で疾患を引き起こしている。ビクトリア系統のインフルエンザウイルスが1980年代に世界的に循環した優勢なB型株で、ヤマガタ系統は1990年代初期に優勢なB型ウイルスとなった。1991年以来、ビクトリア系統のウイルスがしばしば単離され、ほぼ完全に東アジアに限定されている。ビクトリアウイルスは2002年に再出現し、それ以来ヤマガタ系統とビクトリア系統の両方が共存している。1940年から2016年に単離されたインフルエンザBウイルスの進化的関係は、現代単離株のBM1およびBM2タンパク質は互いにB/Lee/40よりも近縁であることを示している。系統発生的関係を図17Aおよび17Bに示す。
BM2SR-4構築物(配列番号:4)にはわずかに90bpのより小さなM2の欠失があり、前記欠失は、ゲノムRNAのセグメントサイズの変化はウイルスセグメントの安定性に負の影響を有し得るという観察に基づく。これは、ゲノムRNAの5’末端近くの配列(ウイルスタンパク質のコード領域内に存在する)に起因する(Hatta et al., 2009)。これはおそらくゲノムセグメント7の5'末端(mRNAの3’末端)近位に位置するM2 ORFの事例であろう。セグメントの不安定性は、あるセグメントを欠く欠陥ウイルス粒子の数を増加させ、ウイルス増殖の減少およびウイルス力価の低下を引き起こし得る(Hutchinson et al., J.Virol.82:11869-11879, 2008)。BM2SR-4における90bpの欠失は、セグメント7の自然のままの全長(1190bp)の8%未満である。
BM2SR-5構築物(配列番号:5)は以下のセグメント7の改善の全ての組合せである:セグメントの安定性のためのM2におけるより小さな欠失、M1発現のためのM1翻訳調節、およびベロ細胞基材でのウイルス力価および増殖を改善するためのM1 M86V変異。
BM2SR-1およびBM2SR-3変異体はBM2ポリペプチドを発現しない。BM2SR-2、BM2SR-4およびBM2SR-5変異体は、BM2タンパク質の最初の11アミノ酸を含む切詰めポリペプチドを潜在的に発現し得るが、しかしながら前記ペプチドは未だに提示されていない。
A.“第一世代”変異ウイルスの生成およびウイルス逆遺伝学
変異ウイルス、例えば変異BM2核酸を有するものは、Neumannらが記載したプラスミド系逆遺伝学によって作製できる(Neumann et al., Generation of influenza A viruses entirely from clone cDNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350, 1999)。簡単に記せば、真核宿主細胞に8つのウイルスRNA(8つのインフルエンザBセグメントに対応する)をコードする1つ以上のプラスミドをトランスフェクトする。各ウイルスRNA配列は、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびRNAポリメラーゼIターミネーターによってフランキングされる。特に、BM2タンパク質をコードするウイルスRNAは変異BM2核酸配列を含む。加えて、宿主細胞は、ウイルスタンパク質(例えばポリメラーゼ、核タンパク質および構造タンパク質)(野生型BM2タンパク質を含む)をコードする1つ以上の発現プラスミドをトランスフェクトされる。宿主細胞のウイルスRNAプラスミドによるトランスフェクションは、8つのインフルエンザウイルスRNAの全ての合成をもたらし、それらウイルスRNAの1つは変異BM2配列を有する。コトランスフェクトされたウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質はウイルスRNAを機能的なvRNAに組み立て、前記vRNAは複製され転写され、最終的に、変異BM2核酸配列を有するがなおウイルス脂質エンベロープに取り込まれる機能的BM2ポリペプチドを有する感染性インフルエンザウイルスを形成する。
表4に記載する12のBM2不完全インフルエンザB BM2SR変異ウイルスを構築した。表4に示すB/Lee/40-0、B/FL/04/2006-1、B/FL/04/2006-2、B/FL/04/2006-3、B/FL/04/2006-4、およびB/FL/04/2006-5は、それぞれBM2SR-0、BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4、およびBM2SR-5に対応する。
Luytjesらによって示されたように、ウイルスRNAはin vitroで合成され、RNA転写物は、トランスフェクト細胞で生物学的に活性なRNPとして機能するウイルスヌクレオタンパク質(NP)およびポリメラーゼタンパク質で被覆される(Luytjes et al., Cell 59:1107-1113, 1989)。
RNPトランスフェクション方法は4つの工程に分割することができる:1)RNAの調製:インフルエンザウイルスセグメントをコードするプラスミドDNAは、in vitro転写反応でマイナスセンスRNAに転写される;2)RNAのキャプシド被包:転写されたRNAを続いてグラジエント精製NPおよびポリメラーゼタンパク質(破壊したインフルエンザウイルスから単離)と混合し、生物学的に活性なRNP複合体を形成する;3)トランスフェクションおよびキャプシド被包RNAのレスキュー:人工リボヌクレオキャプシドを細胞にトランスフェクトする。前記細胞は、レスキューされるウイルスに由来する種々の遺伝子を含むヘルパーインフルエンザウイルスで前もって感染されてあり、ヘルパーウイルスはトランスフェクトされたRNAを増幅するであろう;4)トランスフェクトされた遺伝子の選別:ヘルパーウイルスおよびレスキューされる遺伝子を含むトランスフェクタントの両方が培養上清に存在するので、抗体を用いる適切な選別系がトランスフェクトされた遺伝子を保有するウイルスの単離のために必要である。
この選別系は、特殊な生物学的分子的特徴を有する新規なトランスフェクタントインフルエンザウイルスの生成を可能する。続いて、標的とする表面タンパク質に対する抗体選別を正または負の選別に用いることができる。
制限希釈によってトランスフェクタントウイルスをマルチウェルプレートのBM2発現細胞で増殖させ、続いてレプリカプレートを作成することによって識別およびクローニングすることができる。例えば、増殖ウイルスを含むマルチウェルプレートの与えられたウェルの1/2アリコットを用いてMDCK細胞に感染させ、他の半分をBM2タンパク質発現MDCK細胞(すなわちBMCK細胞)に感染させることができる。トランスフェクタントウイルスおよびヘルパーウイルスの両方がBM2タンパク質発現MDCK細胞で増殖するであろう。しかしながら、ヘルパーウイルスのみが標準MDCK細胞で増殖し、トランスフェクタントを含むマルチウェルプレートのウェルの識別を可能にするであろう。トランスフェクタントウイルスはさらに、BM2タンパク質を発現する細胞でプラーク精製することができる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載するウイルス変異体は宿主細胞で維持および継代される。制限ではなく例示として、インフルエンザウイルス変異体(例えばインフルエンザBウイルス変異体)の増殖に適切な例示的宿主細胞には多数の真核細胞、例えば以下が含まれる(ただしそれらに限定されない):メイディン-ダービーイヌ腎細胞(MDCK細胞)、サル細胞(例えばアフリカミドリザル細胞(例えばベロ細胞)、CV-1細胞およびアカゲザル腎細胞(例えばLLcomk.2細胞))、ウシ細胞(例えばMDBK細胞)、ブタ細胞、フェレット細胞(例えばミンク肺細胞)、BK-1細胞、げっ歯類細胞(例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞)、ヒト細胞、例えば胎児ヒト腎細胞(例えばPER-C6(商標))、293Tヒト胎児腎細胞、並びにトリ細胞(胎児線維芽細胞を含む)。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、真核宿主細胞は、例えば宿主細胞のウイルス感染を強化することにより、および/またはウイルス増殖速度を強化することにより改変されてウイルス生産が強化される。例えば、いくつかの実施態様では、宿主細胞は改変されて、2,6-結合シアル酸を発現するかまたはその発現が増強され、変異体または野生型インフルエンザBウイルスによるこれら細胞のより効率的およびより効果的な感染を可能にする。例えば米国特許公開No.2010−0021499および米国特許7,176,021号を参照されたい。したがって、いくつかの例示的実施態様では、2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子(ST6GAL 1)の少なくとも1つのコピーを発現するように改変されたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)および/またはベロ細胞が用いられる。制限ではなく例示として、ホモサピエンス(Homo sapiens)ST6ベータ-ガラトサミド(beta-galatosamide)アルファ-2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子配列(アクセッション番号BC040009.1によって示される)は、CHO細胞に組み込まれ発現され得るST6Gal遺伝子の一例である。機能的なST6GalI遺伝子生成物をコードする1コピー以上のポリヌクレオチドを細胞中に操作することができる。すなわち、ST6GalI遺伝子の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12を超えるコピーを発現するように安定的に形質転換されてある細胞を用いることができる。単一発現カセットは発現され得るST6GalI遺伝子の1つ以上のコピーを含むことができる。前記遺伝子は、調節エレメント(例えばプロモーター、エンハンサーおよびターミネーター)およびポリアデニル化シグナルに作動できるように連結され、ST6GalI遺伝子またはそのコピーの発現を促進することができる。また別には、単一発現カセットが1コピーのST6GalI遺伝子を発現するように操作し、複数の発現カセットを宿主細胞ゲノムに組み入れることができる。したがって、いくつかの実施態様では、少なくとも1つのST6GalI遺伝子が宿主細胞のゲノムに取り込まれ、当該細胞はST6GalI遺伝子およびその酵素タンパク質生成物を発現することができる。コピー数に応じて、単一宿主細胞は多くの機能的なST6GalI遺伝子タンパク質を発現することができる。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、変異ウイルス遺伝子の野生型バージョンを生産するように真核宿主細胞が改変され、それによってウイルスにtrans態様で当該遺伝子が提供される。例えば、変異BM2タンパク質を有するウイルス株は、野生型BM2タンパク質を生産する宿主細胞で継代されるとき、強化された増殖速度(例えばより大量のウイルス生産)を示すことができる。いくつかの実施態様では、変異BM2タンパク質を有するウイルス株は、野生型BM2遺伝子を発現しない細胞では増殖または複製することができない。加えて、そのような宿主細胞は、機能的BM2配列へのウイルス復帰が遅いかまたは復帰を妨げることができる。なぜならば、例えばそのような宿主では復帰の選択圧が存在しないからである。
発現ベクターおよび改変宿主細胞の両方の作製方法は当業界で周知である。例えば、BM2発現ベクターは、下記のBM2核酸配列(BM2 ORF配列;すなわち“野生型”BM2の開始コドンから終止コドンまで(表5))を真核細胞発現ベクターに配置することによって作製することができる。
いくつかの実施態様では、細胞およびウイルス変異体を培養して当業界で周知の方法によって増殖させる。制限ではなく例示として、いくつかの実施態様では、宿主細胞は10%ウシ胎児血清を補充したMEMの存在下で増殖させる。BM2を発現する細胞に、PBS洗浄後にウイルスを37℃で吸着させることによって0.01のMOIで感染させる。いくつかの実施態様では、トリプシン/TPCKを含むウイルス増殖培地を添加し、細胞変性効果が観察されるまで細胞を2−3日間インキュベートする。
長期貯蔵のために、変異体ウイルスは凍結ストックとして保存することができる。
A.BM2発現細胞基材でのM2不完全インフルエンザAおよびBM2不完全インフルエンザB株の増殖
上記で述べたように、BM2は、インフルエンザBビリオンのエンベロープに組み入れられる必須の膜タンパク質である。BM2はインフルエンザAウイルスのM2タンパク質の対応物としてプロトン(H+)イオンチャネル活性を有することが、電気生理学的研究によって示された(Mould, et al., Dev.Cell 5:175-184, 2003)。インフルエンザM2タンパク質はインフルエンザAおよびインフルエンザBウイルスの双方で複製のために必要である(Watanabe, S., et al.J.Virol.83:5947-5950, 2009)。インフルエンザAまたはインフルエンザBゲノムRNAセグメント7内のM2イオンチャネルをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の欠失または変異は、一切の感染細胞の子孫粒子の放出を阻止するウイルス成熟不全を引き起こす。
いくつかの実施態様では、BM2が不完全なインフルエンザB変異体は、M2がトランス態様で補充されるM2CK細胞で増殖される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載するM2CK細胞は、インフルエンザB M2不完全BM2SRウイルス株の増殖を補完および支援する。
逆遺伝学(RG)によるインフルエンザB BM2不完全BM2SRウイルスのレスキューは、レシピエント細胞基材内でBM2タンパク質がトランス態様で供給されることを必要とする。しかしながら、高効率RGにもっとも頻繁に利用される293T細胞はBM2発現を欠く。したがって、BM2SRウイルスは典型的には、以前の記載にしたがって用いられる、レプリカーゼ(4)およびゲノムRNA(8)をコードする標準的12プラスミドインフルエンザRG系とともにBM2タンパク質をコードする13番目のプラスミドを供給することによって293Tで生成される。例えば以下を参照されたい:Hatta & Kawaoka, J.Virol.77:6050-6054, 2003;Neumann et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9345-9350, 1999。
インフルエンザA M2の細胞外ドメインは長さが約24から27アミノ酸であって公知の構造を有し、BM2ドメインのわずか6から9残基と比較して14C2エピトープをコードする(前記ドメインが抗原性であるかまたは明瞭に規定された構造を有するかは不明である(Cross, Nature Structural & Molecular Biology 16:1207-1209, 2009))。インフルエンザA M2細胞外ドメインの最初の9アミノ酸は、それらはM2を形成するために弁別的にスプライスされる共有エクソンでコードされるので、M1タンパク質のN-末端と同一である。このようなアレンジメントはインフルエンザBには存在せず、したがってBM1およびBM2はタンパク質配列の同一性を共有しない。
BM2のエンドドメインは、インフルエンザA M2の約47から51と比較して大きく81から83アミノ酸の長さである。両者のエンドドメインは極めて親水性で、空間的に離れた高度に荷電された酸性および塩基性領域を有する。実際、BM2エンドドメインは、タンパク質でこれまで報告された最大の双極子モーメントの1つを有する。
発現プラスミドおよび改変宿主細胞(例えば改変ベロ細胞)の作製方法はともに当業界では周知である。例えば、キメラM2融合タンパク質発現プラスミドは、M2融合タンパク質の核酸配列(例えばコドン最適化BBA(配列番号:32))を真核細胞発現プラスミドに配置することによって作製できる。
インフルエンザウイルスの迅速な高力価の複製を支援するMDCK細胞の能力のゆえに、当該細胞が典型的にインフルエンザの研究および発展のために利用される。しかしながら、MDCK細胞に由来するいずれの生物学的製品についても規制庁の承認を得ることは困難である。なぜならば、当該細胞それ自体が新形成性/腫瘍原性であることが示されたからである。他方、ベロ細胞は細胞ベースワクチンの製造用に(例えばポリオおよびMMRワクチンで)1960年代から承認されている。
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(配列番号:34)。
いくつかの実施態様では、本開示は以下を提供する:例えばA/Brisbane/10(配列番号:33)由来HAおよびNAを発現するインフルエンザA M2SRバックボーンを含むインフルエンザA M2SR(インフルエンザA M2タンパク質を発現できないがBM2タンパク質を含む)、および下記実施例に示される前記ウイルスを生成する方法。いくつかの実施態様では、BM2ベロ細胞は、コドン最適化cDNA(配列番号:27)から野生型B/Lee/40BM2タンパク質を発現するBM2Vero4細胞である。
A.免疫原性組成物/ワクチン
種々の異なるタイプのワクチンが存在し、それらは本明細書に開示する細胞ベースウイルス生産系から作製できる。本開示は以下を含む(ただしそれらに限定されない):生弱毒化ウイルスワクチンの製造および生成、一回複製ワクチン、複製欠陥ワクチン、ウイルスベクターワクチン、不活化ウイルスワクチン、全ウイルスワクチン、分割ウイルスワクチン、ヴィロソームウイルスワクチン、ウイルス表面抗原ワクチンおよび前記の組合せ。したがって、種々のインフルエンザウイルスに特異的な防御免疫応答をもたらすことができる多数のワクチンが存在し、これらワクチンタイプのいずれかの適切な処方物が免疫応答、例えば全身性免疫応答をもたらすことができる。生弱毒化ウイルスワクチンはまた、気道の局所粘膜免疫を刺激できるという利点を有する。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の組成物で使用されるワクチン抗原は“直接的”抗原である。すなわち、それらはDNAとして投与されるのではなく、抗原そのものである。そのようなワクチンには以下が含まれ得る:全ウイルスまたはウイルスの部分のみ、例えば限定されないがウイルス多糖類(単独であれ担体成分(例えば担体タンパク質)との複合物であれ)、生弱毒化全微生物、不活化微生物、組換えペプチドおよびタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポペプチド、合成ペプチド、または“分割”ワクチンと称されるワクチンの場合の破壊微生物。
いくつかの実施態様では、サブユニットワクチンが提供され、前記は精製された糖タンパク質を含む。そのようなワクチンは以下のように調製できる:洗剤で処理してフラグメント化したウイルス懸濁物を用い、表面抗原を例えば超遠心分離によって精製する。したがってサブユニットワクチンは主としてHAタンパク質およびNAもまた含む。用いられる洗剤は、陽イオン洗剤(例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム)、陰イオン洗剤(例えばデオキシコール酸アンモニウム)、または非イオン性洗剤(例えばTRITON X100の名称で商業化されたもの)であり得る。ヘマグルチニンはまた、プロテアーゼ(例えばブロメリン)によるビリオンの処理後に単離し、続いて標準的な方法で精製してもよい。
いくつかの実施態様では、弱毒化は、公知の方法にしたがって、弱毒化ドナーウイルスの弱毒化遺伝子を単離株または再編成ウイルスへ移転させることによって単一工程で達成される(例えば以下を参照されたい:Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract. 2, 174, 1993)。いくつかの実施態様では、ウイルスは、1つ以上のウイルス核酸配列の変異によって弱毒化され、変異ウイルスを生じる。例えば、いくつかの実施態様では、変異ウイルス核酸配列は、欠陥のあるタンパク質生成物をコードする。いくつかの実施態様では、タンパク質生成物は低下機能を有するか、または機能を持たない。他の実施態様では、タンパク質生成物は変異ウイルス核酸からは生成されない。
いくつかの実施態様では、ワクチンは、BM2SR-1(配列番号:1)、BM2SR-2(配列番号:2)、BM2SR-3(配列番号:3)、BM2SR-4(配列番号:4)、またはBM2SR-5(配列番号:5)変異を含むウイルスを、他のウイルス成分および/または他のウイルス成分を発現する遺伝子と一緒に含む。いくつかの実施態様では、ワクチン(例えば、BM2SR-1(配列番号:1)、BM2SR-2(配列番号:2)、BM2SR-3(配列番号:3)、BM2SR-4(配列番号:4)、またはBM2SR-5(配列番号:5)変異を含むウイルス)は、他のウイルス株由来の遺伝子(例えば他のウイルス株由来のHAおよびNA遺伝子を含むが、ただし前記に限定されない)を含む。いくつかの実施態様では、ワクチンは、例えばB/Florida/04/2006、B/Brisbane/60/2008、B/Wisconsin/01/2010、またはB/Lee/1940ウイルス由来のHAおよびNA遺伝子を含む。
組成物はまた、変動し得るが少量の内毒素フリーホルムアルデヒドおよび保存料を含むことができ、前記物質は、安全であり本発明の組成物が投与される生物での望ましくない作用に寄与しないことが見出されてある。
本明細書に開示する免疫原性組成物(例えばワクチン)は、ワクチンについて通常的に用いられるか、または推奨されるルート(非経口ルート、粘膜ルート)のいずれかを介して投与でき、さらに多様な形態(注射可能または噴霧可能な液体、または凍結乾燥されてあるか霧化若しくは風乾により乾燥されてある処方物など)であり得る。ワクチンは、筋肉内、皮下または皮内注射用の注射器または無針注入器を用いて投与することができる。ワクチンはまた、鼻、肺、膣または直腸に関係なく粘膜に乾燥粉末または液状噴霧をデリバリーできるネブライザーを用いることによって投与できる。
かぜ(flu)生ワクチンは慣例的には鼻内デリバリーされ、自然の感染経路を模倣して自然のウイルス感染の免疫応答に類似する応答を促進する。代替として、本明細書では皮内デリバリーの方法が開示される。前記方法は、新規なマイクロ針装置の使用を必要とし皮内デリバリーの免疫学的利点を活用する。いくつかの実施態様では、弱毒化ウイルス(例えばBM2ウイルス変異体)が皮内投与用ワクチン組成物で用いられる。いくつかの実施態様では、BM2ウイルス変異体(感染性子孫ウイルスを生じない)がワクチンとして提供される。したがって、野生型循環インフルエンザウイルスとの再編成の可能性は実質的にはいっさい排除される。
さらに、ワクチンは装置のマイクロ針列から皮膚にデリバリーされるので、意図しない針刺しリスクが軽減され、通常的な針と注射器による筋肉内注射と比較して、マイクロ針列による皮内ワクチンデリバリーは比較的痛みが少ない。
BM2ウイルス変異体の作製
B/Florida/4/2006のセグメント7を土台にする一連の新規な5つのBM2ヌル変異体構築物(BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4およびBM2SR-5)(図2)を設計し、続いて二本鎖DNAフラグメントとして合成した。前記フラグメントは、当業界で公知の標準的技術を用いる標準的なin vitro遺伝子アッセンブリーのために適切である。BM2SR-1(配列番号:1)、BM2SR-2(配列番号:2)、BM2SR-3(配列番号:3)、BM2SR-4(配列番号:4)、およびBM2SR-5(配列番号:5)の一本鎖mRNAまたはプラスセンスDNAヌクレオチド配列は表1に提供される。
BM2変異ウイルスの作製および培養
本実施例は、B/Florida/04/2006セグメント7を土台とするBM2SR変異体(BM2SR-1(配列番号:1)、BM2SR-2(配列番号:2)、BM2SR-3(配列番号:3)、BM2SR-4(配列番号:4)またはBM2SR-5(配列番号:5)を含む)、およびB/Lee/1940コントロール、BM2欠失セグメント7を土台とするBM2SR変異体の培養を示す。変異ウイルス(例えば変異BM2核酸を保持するもの)をNeumannらが記載したプラスミド系逆遺伝学によって作製することができる(Neumann et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9345-9350, 1999)。簡単に記せば、8つのインフルエンザBセグメントの各々に対応する、8つのウイルスRNAをコードする1つ以上のプラスミドを293T宿主細胞にトランスフェクトした。各ウイルスRNA配列は、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびRNAポリメラーゼIターミネーターによってフランキングされていた。特に、BM2タンパク質をコードするウイルスRNAは変異BM2核酸配列を含む。加えて、ウイルスタンパク質(例えばポリメラーゼ、核タンパク質および構造タンパク質)(野生型BM2タンパク質を含む)をコードする1つ以上の発現プラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。
プラスミドをトランスフェクション試薬(DNA1μgに付き2μLのTransIT(商標)LT1(Mirus Bio, Madison, WI))と混合し、室温で15−30分インキュベートし、1x106 293T細胞に添加した。48時間後に、上清中のウイルスを段階希釈し、BM2CK細胞に接種した。接種から2−4日後に、ストックウイルスの生成のために、明瞭な細胞変性効果(CPE)を示す最終希釈のウェルの上清ウイルスをBM2CK細胞に接種した。生じたウイルスのM遺伝子の配列を決定して当該遺伝子および意図した変異を確認し、さらに望ましくない変異が存在しないことを担保した。
12のBM2不完全インフルエンザB BM2SR変異ウイルス(表4に記載)を構築した。表4に示すB/FL/4/2006-1、B/FL/4/2006-2、B/FL/4/2006-3、B/FL/4/2006-4、およびB/FL/4/2006-5は、それぞれBM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4、およびBM2SR-5に対応する。
BM2SRウイルスタンパク質の発現
本実施例は、表4に記載の12のBM2不完全インフルエンザB BM2SRウイルスによって発現されるタンパク質を示す。
ベロ細胞(200,000)を10%ウシ胎児血清(FCS)補充MEM培地で24時間TC-12プレートのウェルで培養した。D-PBSで2回洗浄した後、構築した12のB/Florida/4/2006 BM2SR-1からBM2SR-5およびB/Lee/40 BM2SR変異ウイルスを2つの野生型ウイルスコントロールB/Lee/1940およびB/Florida/4/2006とともに、1.0の高い感染多重度で前記ベロ細胞に感染させた。一巡複製を可能にするために35°Cで5%CO2雰囲気下で6時間インキュベートした後、サンプルをウェスタン分析のために採集した。
タンパク質は、2つのインフルエンザB抗原HAおよびM1、並びに細胞基材コントロールタンパク質グリセロアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して特異的な抗血清によって、1%NFDM PBS-T中で検出した。インフルエンザB M1は、3つの1000:1希釈モノクローナル抗体(sc-101353、sc-101408、sc-101409;Santa Cruz Biotechnology)の一次抗体カクテルおよび2000:1希釈抗マウスIgG二次抗体-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合物によって検出した。インフルエンザBヘマグルチニンタンパク質(HA)は、2000:1のヤギ抗HAポリクローナル一次血清(NR-3120, BEI)および2000:1の二次抗ヤギIgG抗体-HRP複合物によって検出した。コントロールGAPDHは、GAPDHに対するポリクローナル一次抗血清(NB100-56875, Novusbio)および2000:1の二次抗ウサギIgG-HRP複合物によって検出した。特異的バンドは、発色性HRP基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を用いて検出した。
BM2SRウイルス複製
本実施例は、表4に記載の12のBM2不完全インフルエンザB BM2SRウイルスの増殖カイネティクスを示す。
構築したインフルエンザBM2SRウイルスのウイルス増殖カイネティクスをBM2Vero(B/Lee/40 BM2タンパク質を持続的に発現するベロ由来細胞株)で試験した。10%ウシ胎児血清(FCS)を含むMEM培地でBM2Vero細胞をP-060ディッシュで24時間培養した。1マイクログラム/mLのトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン処理トリプシン(T-TPCK)を添加し、0.001のMOIで12のウイルスのウイルス感染を三複製(triplicate)で実施した。さらに、T-TPCKを1日に1回3日間(感染後1、2、3日目)(合計添加4μg/mL)添加した。感染物を5%CO2、35°Cインキュベートした。2日間隔で(感染後2、4、6、8日目)、分泌されたインフルエンザBウイルスを含む感染ベロ細胞組織培養上清を無菌的にサンプル採取し、アリコットを-80℃で凍結保存した。増殖曲線が終了した後で、BM2CK細胞(BM2タンパク質を発現するMDCK細胞)を用い標準的な50%組織培養阻害用量(TCID50)を決定することによって凍結アリコットの力価を測定した。標準的な世界保健機構ヘマグルチニンアッセイ分析(WHO HAアッセイ)を用いて、与えられた希釈の生産性感染を決定した。各時点における各ウイルスの三複製TCID50測定の平均および標準偏差を計算した。結果は図5Aおよび5Bに提供される。
B/Wisconsin/01/2010のHAおよびNAを有するインフルエンザB株の増殖はより均一であった(図5B)。約10^0.5 TCID50/mLの繊細な改善が、増殖曲線の4日目でBM2SR-2、BM2SR-3およびBM2SR-4変異体について認められた。6日目までにこの相違は失われ、最終力価は実質的に類似した。したがって、B/Wisconsin/01/2010のHAおよびNAを含むウイルスの関係では、操作されたBM2SR構築物(特にBM2SR-4およびBM2SR-5)はほんのわずかウイルス増殖カイネティクスを改善できるが、最終的なウイルス収量ではより小さな影響を示した。与えられたウイルスの性能は当該株のHAおよびNAの構成に左右される。
BM2SR変種の安定性
野生型細胞におけるBM2SR変種のBM2遺伝子の安定性を試験するために、BM2SR変種を野生型MDCK細胞(BM2タンパク質発現を欠く)とともにBM2CK細胞(BM2タンパク質発現MDCK細胞である)で継代した。全てのBM2SR変種および野生型インフルエンザBウイルス(WT B/WI01)が、少なくとも10継代まで全く変異を生じないでBM2CK細胞で継代できた(図6A)。しかしながら、BM2SR変種は野生型MDCK細胞では継代できなかった(図6B)。
BM2変異ウイルスはin vivoで弱毒化される
BM2SR変異ウイルスはin vivoで弱毒化されることを示すために実験を行った。6週齢のBALB/c雌マウスに以下の変異体の1つを鼻内に接種した:BM2SR Bris60およびBM2SR Wisc01(前記はともに配列番号:6に示されるB/Lee/40由来変異Mセグメントを含む(BM2SR-0))。前記変異体を1.2x106 TCID50/マウスの用量で投与した。コントロールマウスグループにはPBSを投与した。体重の変化および感染徴候について、これらのマウスを接種後14日間観察した。
図7に示すように、BM2SRウイルスおよびPBSを接種したマウスは感染の臨床徴候を一切示さず、14日間にわたって体重も全く低下しなかった。グループ間の体重の変化は14日間にわたって類似していた。総合すれば、臨床徴候の欠如および体重低下の欠如は、BM2SR変異ウイルスは弱毒化されマウスで非病原性であることを示す。
BM2変異体はインフルエンザBウイルスチャレンジに対する抗体を誘発する
上記に記載したマウスの血清サンプル中の2つのインフルエンザB系統(ヤマガタおよびビクトリア)に対する抗体力価を決定するために、試験を実施した。プライム接種後7、14および21日目に、さらに28日目の第二の免疫後35、42および49日目に血清サンプルを採取した。当該血清サンプルの抗HA IgG抗体を、B/Wisconsin/01/2010およびB/Brisbane/60/2008に対する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定した。液性応答を図8A−8Bに示す。前記図は、両BM2SR変異体(M2の欠失を有するB/Lee/40由来Mセグメントを含む(配列番号:6;BM2SR-0))は、両抗原に対してPBSコントロールグループよりも高く抗インフルエンザウイルス抗体を上昇させたことを示す。BM2SR変異ウイルスをブースター投与されたマウスは、プライム投与後のレベルよりも高いレベルの抗インフルエンザHA抗体を第二の免疫後に有した。
M2不完全インフルエンザAおよびBM2不完全インフルエンザB株のBM2発現細胞基材での増殖
インフルエンザA M2およびインフルエンザB BM2がM2不完全インフルエンザA(A/CA/07 M2SRおよびA/Brisbane/10 M2SR(前記はともに配列番号:33に示されるM2変異体を含む))およびB(B/WI/01 BM2SR-0およびB/Brisbane/60 BM2SR-0)ウイルスを補完する能力を試験するために実験を行った。標準的な50%組織培養感染用量(TCID50)アッセイ(WHO)を用いた。96ウェルの組織培養プレートで調製したM2CKおよびBM2CK細胞のコンフルエントな単層に、4つのインフルエンザウイルスの10倍連続希釈から0.2mLを用い四複製で感染させた。前記4つのウイルスのうち、2つの希釈はインフルエンザA M2SRから調製され、2つはインフルエンザB BM2SRウイルス株から調製された。35°C、5%CO2雰囲気で4日間インキュベートした後、細胞変性効果および赤血球凝集アッセイ(HA)(WHO)を終末点で用いて、培養上清をインフルエンザの複製について試験した。インフルエンザの複製が複製感染物の各々から観察される最高希釈因子を用い、図9に示す4ウイルスによる2つの細胞株の各感染におけるlog10 TCID50値を決定した。
キメラM2タンパク質
キメラM2タンパク質の機能を試験するために、典型的な遺伝子アッセンブリー手順によって融合構築物を標準的なプラスミドに挿入した。前記標準的プラスミドは、培養哺乳動物細胞での高レベル発現のために、CMV IEプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化転写制御配列を含んでいる。野生型M2およびBM2 cDNA発現プラスミドもまた構築した。加えて、CMVさえも超える可能な最高レベルの発現のために、野生型BM2 cDNA配列をpCAGGSプロモーターターミネータープラスミドに挿入した。前記プラスミドを用いて、インフルエンザB BM2SRウイルスの逆遺伝学(RG)でM2機能を供給した。RGの効率は、BM2不完全子孫の回収のために、293T-RG産生ウイルスの1%を96の独立ウェルのレシピエントBMCK細胞に接種することによって概算した。35°C、5%CO2下で4日間インキュベートした後、BM2CK培養上清を標準的血球凝集アッセイ(WHO HA)によってウイルス複製について試験した。WHO HA陽性となったウェルのパーセンテージを図11に示す。
野生型およびキメラM2タンパク質のBM2タンパク質を発現する能力
細胞基材ゲノムから発現されたとき、M2不完全およびBM2不完全ウイルスの増殖を支援する能力についてM2タンパク質を試験した。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子(タンパク質合成のアミノグリコシド阻害剤(G418)に対する耐性を付与する)とともにM2およびキメラ変異体をコードするプラスミドを、ベロ細胞に化学的にトランスフェクトした。
2日間培養した後、トランスフェクト細胞を分離しG418を含む培地に再プレートした。細胞をG418選別下で数週間培養し、プラスミドDNAが細胞株ゲノムにランダムに組み込まれたクローンを選別した。G418耐性クローンのいくらかの部分はまた、組み込まれたM2キメラ変異体トランスジーンの機能的コピーを含んでいるであろう。続いてこれらの機能的なクローンをウイルス選別を支援する能力について試験することができる。複製は、一括選別したG418耐性クローンプールによって、または標準的な限界希釈クローニング(LDC)手順を用いて選別および単離した個々のクローンによって試験することができる。クローンプールの分析は構築物の性能について数週間以内に測定を提供し、一方、LDCははるかに長期間を要する。しかしながら、人間で使用するために規制を受けるワクチン生産に適切な細胞基材を単離するためには、数巡のLDCが要求される。
M2不完全およびBM2不完全ウイルスの増殖を支援するコドン最適化キメラM2タンパク質の能力を試験する
M2不完全およびBM2不完全ウイルスの増殖を支援する能力について、コドン最適化キメラM2タンパク質を試験した。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子(タンパク質合成のアミノグリコシド阻害剤(G418)に対する耐性を付与する)とともにコドン最適化M2キメラ変異体をコードするプラスミドを、ベロ細胞に化学的にトランスフェクトした。2日間培養した後、トランスフェクト細胞を分離しG418を含む培地に再プレートした。細胞をG418下で2週間培養し、プラスミドDNAが細胞株ゲノムにランダムに組み込まれたクローンを選別した。G418耐性クローンのいくらかの部分はまた、組み込まれたM2キメラ変異体トランスジーンの機能的コピーを含んでいるであろう。BM2およびキメラをトランスフェクトされ一括選別されたクローンプールに、インフルエンザA/Brisbane/10 M2SR(配列番号:33に示されるM2変異体を含む)およびインフルエンザB/Brisbane/60 BM2SR-0(配列番号:6に示されるBM2変異体を含む)M2不完全ウイルスをMOI 0.01で感染させた。感染6日後に標準的なTCID50手順を用い、培養上清のウイルス力価を測定した。データは図13に提示される。
したがって、M2不完全インフルエンザA M2SRウイルスおよびBM2不完全BM2SRワクチンウイルスを産生する細胞基材の性能は、完全に異なる血清型インフルエンザAおよびインフルエンザBに由来するM2遺伝子のキメラ融合物を含むM2操作タンパク質を使用し、これを発現させることによって改善することができる。
BM2発現ベロ細胞基材におけるM2不完全インフルエンザA/California/07/H1N1pdm M2SRの増殖
A/California/07/2009pdm H1N1 M2SR(A/CA/07)はA/California/07/2009pdmのH1およびN1セグメントを含むM2不完全インフルエンザAウイルスであり、配列番号:33に示されるM2変異体を含む。正常細胞では複製不能のこのワクチン候補ウイルスを用いて、2つのM2タンパク質型を構成的に発現する2つの細胞株に感染させた。第一のM2細胞基材はMDCK系統の標準的な細胞株M2CKであり、前記はA/PR8 M2タンパク質を発現する(前記タンパク質は配列番号:23に示されるヌクレオチド配列によってコードされる)。MDCK細胞は、インフルエンザウイルスの高力価への迅速な複製を培養で支援することが知られているので、典型的にはインフルエンザの研究開発に用いられる。残念ながら、MDCK細胞はそれ自体が発癌性であることが示されたので、MDCKに由来するいずれの生物製剤も規制庁の承認を得ることは困難である。第二の細胞株、BM2Vero4は、コドン最適化野生型インフルエンザB/Lee/40 BM2タンパク質(配列番号:27に示されるヌクレオチド配列によってコードされる)を含むが、前記はベロ(アフリカミドリザル腎細胞株)から誘導された。ベロ細胞基材は、承認された細胞系ワクチン製造に1960年代から用いられている(ポリオおよびMMRワクチン)。
予想したように、インフルエンザA/CA/07/2009pdm M2SRはM2CK細胞で良好に複製し、2日目の時点で迅速にピーク力価に達した。ベロ系統での力価はピークに達するまで5−6日を要した。A/CA/07は、M2CK細胞で得られたlog10 7.00および6.33の力価と比較して、BM2Vero細胞ではlog10 5.67および6.00の力価に増殖した。前記は、MDCK細胞と比較してインフルエンザ複製についてパーミッシブ性がはるかに低いベロ細胞に由来するBM2Vero4にもかかわらず観察された。
したがって、ベロ細胞でコドン最適化インフルエンザB/Lee/40 BM2タンパク質(配列番号:27に示されるヌクレオチド配列によってコードされる)は、M2タンパク質のインフルエンザA形を発現するR&D品質MDCK細胞のレベルとほとんど等価のレベルでインフルエンザA H1N1 M2SRウイルス産生を達成する。
インフルエンザBM2タンパク質はキメラインフルエンザA M2SRウイルスにウイルス脱外被に必要なイオンチャネル活性を提供できる
M2SRはM2タンパク質を発現せず、したがって子孫ビリオンを生成できないが、M2SRはde novoタンパク質合成を行い正常細胞でウイルス抗原を生成する。本実施例は、インフルエンザBM2タンパク質は、キメラインフルエンザA M2SRウイルスにウイルス脱外被に必要なイオンチャネル活性を提供できることを示す(すなわち、補完性BM2細胞株で生成されたインフルエンザA M2SRはウイルス膜に取り込まれるBM2をもたらす)。
前記を実際に示すために、インフルエンザA M2SR Hong Kong/4801/2014(H3N2)ウイルスをA M2発現M2VeroA細胞で3回継代し、キメラM2SR Hong Kong/4801/2014(H3N2)をインフルエンザB BM2発現BM2Vero細胞で3回継代した。続いて、ヒトA549、イヌMDCKまたはアフリカミドリザルベロ細胞にM2SRまたはキメラM2SRウイルスをMOI 4で接種し、トリプシンを含まない培地で培養してウイルスがただ1回の生活環を完結することを担保した。
補完性BM2細胞株で生成されたキメラインフルエンザA M2SRウイルスではインフルエンザB BM2タンパク質のみが検出され、インフルエンザA M2タンパク質は検出されなかった
M2SRは、インフルエンザA M2タンパク質またはインフルエンザB BM2タンパク質を発現する支援性細胞株で増殖させないかぎり、M2SRはM2タンパク質を発現できないので子孫ビリオンを生成することができない。本実施例は、補完性BM2細胞株で生成されたキメラインフルエンザA M2SRウイルスは当該ウイルス膜に取り込まれたBM2タンパク質のみを生じることを示す。補完性M2細胞株で増殖させたM2SRウイルスはM2タンパク質のみを含む。
このことを実際に示すために、インフルエンザA M2SR Brisbane/10/2008(H3N2)ウイルスをインフルエンザA M2発現M2CK細胞で継代し、キメラM2SR Brisbane/10/2008(H3N2)をインフルエンザB BM2発現BM2Vero細胞で0.3%BSA含有MEM培地で3回継代した。培養上清を遠心分離によって清澄化した。清澄化培養液をベンゾナーゼ(Novagen EMD, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)またはSAN(Articzymes, Tromso, Norway)ヌクレアーゼで処理し、残留細胞基材DNAを除去することによって粘度を低下させた。ヌクレアーゼ処理培養液を遠心分離濃縮装置(100,000名目分子量カットオフ再生セルロース膜(Amicon, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)使用)を用いて60倍に濃縮した。上清のウイルスタンパク質をLDSサンプル緩衝液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)および5mM TCEPと一緒にし、70°Cで10分間加熱して変性させた。タンパク質をMES緩衝液中の4−12%変性Bis-Tris NuPAGEポリアクリルアミドゲル(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)で分離し、3枚のPVDF膜に移した。予め染色したタンパク質分子量標準物をサイズ比較のために泳動させた。膜を1%(w/v)脱脂粉乳で封鎖し、3つの異なる一次および二次抗体対とともにインキュベートした。第一の膜は、2000:1希釈のインフルエンザAウイルスM2タンパク質モノクローナルマウス抗血清14C2(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)とともにインキュベートし、続いて3000:1希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG(H+L)二次抗体(SeraCare KPL, Milford, MA)とインキュベートした。第二の膜は、2000:1希釈のインフルエンザBウイルスBM2タンパク質ポリクローナルウサギ抗血清(Hatta-M, et al, J.Virol, 78(11): 5576-5583, 2004)とともにインキュベートし、続いて3000:1希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG(H+L)二次抗体(SeraCare KPL, Milford, MA)とインキュベートした。第三の膜は、2000:1希釈のインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質ポリクローナルヤギ抗血清NR-3134(BEI Resources , NIAID, NIH)とともにインキュベートし、続いて3000:1希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギIgG(H+L)二次抗体(SeraCare KPL, Milford, MA)とインキュベートした。TMB膜ペルオキシダーゼ基質(SeraCare KPL, Milford, MA)を用いてバンドを可視化した。モノクローナル抗M2抗体はインフルエンザA M2SRウイルス調製物中のM2を検出し、インフルエンザA M2タンパク質はキメラM2SR調製物では検出されなかった。逆に、ポリクローナル抗BM2血清はキメラウイルスのエンベロープでBM2を検出し、標準的M2SRウイルスではBM2は検出されなかった。M1マトリックスタンパク質に対するポリクローナル抗血清は、M2SRおよびキメラM2SRウイルスの両方で28kDalの分子量のPR8 M1タンパク質を検出した(図15B)
個々のBM2変異体のワクチンとしての使用
BM2変異ウイルスがマウスで抗体応答を引き出すことができるか否かを試験するために、BM2変異ウイルス(B/YamagataおよびB/Victoriaを表すBM2SR-4ウイルス)をインフルエンザA H1N1またはH3N2 M22SRワクチンとともに一価、三価または四価ワクチンとして処方した。6週齢BALB/c雌マウスの鼻内に一価、三価、または四価ワクチンを106から107 TCID50/マウスの範囲の用量で接種した。コントロールマウスグループにはPBSを投与した。血清サンプルをプライム接種後14日目に採取した。B/Victoria系統およびB/Yamagata系統を表す抗原に対する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって、血清サンプルの抗HA IgG抗体力価を決定した。加えて、インフルエンザA H1N1およびH3N2抗原に対する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって、血清サンプルの抗HA IgG抗体力価を決定した(図16Aおよび16B)。両BM2SRワクチン成分(B/Victoria系統およびB/Yamagata系統を表す)が、2つのインフルエンザB系統を表すインフルエンザB抗原に対してコントロールPBSグループよりも高い抗インフルエンザウイルス抗体を多価処方物で上昇させた(図16Cおよび16D)。これらの結果は、BM2SRワクチンは目的のHAに対して抗体応答を生じること、および多価ワクチンとして処方されるとき一価成分の間で干渉は存在しないことを示している。多価処方物で、免疫応答は一価成分の各々に対して生じる。
フェレットモデルで一価および四価ワクチン処方物のBM2SRによって引き出される免疫応答および防御有効性
概要
本実施例は、BM2SRワクチンがフェレットモデルで一価または多価処方物で免疫応答を引き出すことができることを示す。すなわち、BM2SRによって引き出される防御免疫応答は、四価として処方されるとき他のワクチン成分の干渉を受けず、BM2SRも他の成分の免疫応答に干渉しない(すなわち免疫応答を抑制しない)。12匹の雄のフェレットにBM2SR候補ウイルスを1x107 TCID50(一価)または4x107 TCID50(四価)の用量レベルで鼻内投与した。コントロールとして、1つのフェレットグループにプラセボとしてOPTI-MEMTMを投与した。各処置グループに対してプライム-ブーストワクチン接種レジメンを用いた。フェレットにプライムワクチン(0日目)および28日後にブーストワクチン(28日目)を投与した。各ワクチン接種に続いて、フェレットを接種後14日間死亡率について観察し、体重、体温および臨床徴候を毎日測定した。全てのフェレットからワクチン接種後21、35および56日目に血清を収集し、時間経過における抗体レベルを査定した。
70日目に、全ての動物を1x106 PFUのインフルエンザAウイルスA/California/07/2009(H1N1pdm)で鼻内チャレンジした。チャレンジに続いて、フェレットを接種後14日間死亡率について観察し、体重、体温および臨床徴候を毎日測定した。チャレンジ後1、3、5および7日目に鼻洗浄物を各グループのフェレット(N=8)からウイルス力価のために収集した。加えて、チャレンジ後(82日目)に生存フェレットから分析のために血清を収集した。チャレンジから3日後に(73日目)、各グループにつき4匹のフェレットで剖検を実施した。ウイルス量(力価)の決定のために、チャレンジ後に器官を収集した。
5グループでワクチン関連の有害な事象は観察されなかった。チャレンジ後、プラセボコントロールグループは体重の減少(〜15%)を示した。体重低下はまた抗原的に一致しない一価BM2SRワクチン接種グループで観察されたが、減少はプラセボグループで観察されたものよりも少なかった(〜5−8%)。四価M2SRは、チャレンジ後有意な体重低下を全く示さなかった。
ワクチンウイルスの接種:表9に示すように、一価BM2SRワクチン(1用量1x107 TCID50)の2回投与または四価M2SRワクチン(1用量4x107 TCID50)の2回投与によりフェレットに鼻内接種した。凍結ウイルスストックを室温で少なくとも10分間解凍し、続いて使用まで冷蔵(または氷上)保存した。フェレットをケタミン/キシラジンで麻酔し、500μLの体積(250μL/鼻孔)で鼻内に当該ウイルス用量を投与した。各ワクチン接種後7日間毎日動物を観察した。体重、体温および臨床徴候を7日間モニターした。
フェレットの鼻内に、BM2SRの1回用量1x107 TCID50を0日目および28日目に、または四価M2SRの1回用量4x107 TCID50を0日目および28日目に投与した。コントロールグループにはOPTI-MEMTMを鼻内に0日目および28日目に擬似接種した。接種後14日間、フェレットの体温、体重および臨床徴候を毎日モニターした。鼻洗浄サンプルは-65℃で保持した。血液を接種前(-3および-5日目)並びに21、35および56日目に収集し、血清をELISAおよびHAIアッセイによる抗体力価測定まで-65℃で保持した。
血清サンプルの抗HA IgG抗体力価を、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/California/07/2009(H1N1pdm)、B/Wisconsin/01/2010(ヤマガタ系統)、およびB/Brisbane/60/2008(ビクトリア系統)に対して酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定した。簡単に記せば、ELISAプレートを各株の組換えHAタンパク質で被覆し、ウシ血清アルブミン(BSA)で封鎖してサンプルを適用した。フェレットIgG抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗フェレットIgGヤギ抗体(KPL, Inc., Gaithersburg, MD)およびSureBlue TMB(KPL, Inc.))基質で検出した。
予想したように、それぞれの免疫グループのフェレットが、対応する抗原に対して血清の抗HA抗体の有意な上昇を示した。BM2SR免疫グループの血清は予想した特異性を示し、インフルエンザA抗原(CA07-H1N1、Bris10-H3N2)とは反応しなかった。より重要な事に、四価M2SRグループは、4つ全ての抗原に対して血清の抗HA抗体の有意な上昇を提示し(図18)、BM2SRは、四価ワクチンとして処方されるときに免疫原性であり、多価処方物の成分間で干渉は存在しないことを示した。これらのデータは、BM2SRおよび四価M2SRウイルスは有意な免疫応答をフェレットで引き出すことを示唆する。
図19Aおよび19Bに示すように、免疫された全てのフェレットが、それらの対応する試験ウイルスに対して有意なHAI抗体力価を示した。四価M2SRは、4つの試験ウイルス全てに対して有意なHAI力価を示した。プラセボ(ナイーブ)グループは、いずれのインフルエンザ特異抗体も引き出さなかった。CDCは、血清HAI抗体力価40は集団におけるインフルエンザ感染または疾患リスクの少なくとも50%減少を示すと明言している。したがって、これらの結果は、BM2SRウイルスは、これらウイルスがインフルエンザA M2SRウイルスとともに四価ワクチンとして処方されるときに維持される防御免疫応答を引き出すことを示唆する。
チャレンジ後1、3、5および7日目に鼻洗浄サンプルを全てのフェレットから収集し、MDCK細胞でプラークアッセイによってチャレンジウイルスの存在について評価した。図20は、四価M2SRはチャレンジウイルスの複製を制御したことを示す。プラセボおよび一価BM2SRはチャレンジウイルスを制御せず、感染後5日間少なくとも5 logのウイルスが検出された。BM2SRワクチンはインフルエンザAチャレンジウイルスを制御しなかったが、疾患の進行で緩和効果を示した(前記緩和効果はプラセボグループよりも体重低下が少ないことによって立証される(データは示されていない))。
本実施例は、フェレットへのBM2SRおよび四価M2SRワクチンウイルスの鼻内投与は、いずれのワクチン関連有害事象(例えば体温上昇、体重低下または臨床徴候)も伴わなかったこと、および鼻内インフルエンザワクチンとして有用であることを示す。これらの結果は、BM2SRはフェレットで免疫応答を引き出すこと、および四価M2SRウイルスに処方されたときには当該多価処方物に含まれる各株に対して防御免疫応答を引き出すことを示している。
ベロ細胞におけるインフルエンザAOFの増殖
ウイルス作製:以前に記載されたようにM2SRおよびBM2SR-4ウイルスを作製した。M2SRについては、インフルエンザA/Puerto Rico/1934由来のインフルエンザAウイルスRNAセグメント1、2、3、5、8およびM2SRセグメント7、並びにインフルエンザ A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)のHAおよびNAウイルスRNAセグメント4、6を用いた。BM2SRについては、インフルエンザB/Yamagata/1973由来のインフルエンザBウイルスRNAセグメント1、2、3、5、8およびB/Florida/2006由来のセグメント7 BM2SR-4、並びにインフルエンザB/California/12/2015(ヤマガタ系統)のHAおよびNAウイルスRNAセグメント4、6を用いた。インフルエンザcDNAをRNAポリメラーゼI発現カセットでクローニングした。得られたプラスミドをウイルスポリメラーゼ、NPおよびMPタンパク質発現プラスミドとともにBM2Vero細胞にトランスフェクトし、上清に放出されたウイルスをBM2Vero細胞で増幅させた。
野生型インフルエンザA/Hong Kong/4801/2014(H3N2)はMDCK細胞で増殖させ、野生型インフルエンザB/CA/12/2015は、0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)および1μg/mLトリプシン-TPCKを補充したMEMでベロ細胞で増殖させた。M2SRおよびBM2SR-4ウイルスは、OptiVero培地および1μg/mLT-TPCKを用いてM2VeroAまたはBM2Vero細胞で増殖させた。
BM2Vero細胞基材でのインフルエンザA M2SRの遺伝的安定性
ウイルス作製:インフルエンザA M2SRウイルスをM2VeroA細胞でプラスミド系逆遺伝学を用いて作製した。インフルエンザA/Puerto Rico/1934由来のインフルエンザAウイルスRNAセグメント1、2、3、5、8およびM2SRセグメント7、並びにインフルエンザA/Hong Kong/4801/2014(H3N2)のHAおよびNAウイルスRNAセグメント4、6を用いてM2SR HK4801ウイルスを作製した。
Claims (26)
- 配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5を含む変異BM2遺伝子を有する組換えインフルエンザBウイルス。
- 前記BM2遺伝子の変異が、ウイルスのBM2タンパク質発現の失敗をもたらすか、またはウイルスに切詰めBM2タンパク質を発現させる、請求項1に記載の組換えインフルエンザBウイルス。
- 前記変異BM2遺伝子が、in vitro宿主細胞系で少なくとも10継代の間に野生型または機能性BM2タンパク質をコードする非野生型配列に復帰せず、ここで、当該宿主細胞は変異遺伝子の機能性バージョンを生成するように改変され、それによってウイルスに遺伝子生成物をトランス態様で提供する、請求項1または2に記載の組換えインフルエンザBウイルス。
- 前記ウイルスに感染した哺乳動物で免疫応答を引き出す、請求項1−3のいずれか1項に記載の組換えウイルス。
- 前記ウイルスに感染した哺乳動物に対し非病原性である、請求項1−4のいずれか1項に記載の組換えウイルス。
- 前記in vitro細胞系が、メイディン-ダービーイヌ腎(MDCK)細胞またはベロ細胞を含む、請求項3に記載の組換えウイルス。
- 配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5を含む変異BM2遺伝子を有する組換えインフルエンザBウイルスを含む組成物。
- 前記BM2遺伝子の変異が、ウイルスのBM2タンパク質発現の失敗をもたらすか、またはウイルスに切詰めBM2タンパク質を発現させる、請求項7に記載の組成物。
- 前記ウイルスが、前記ウイルスに感染した哺乳動物で免疫応答を引き出す、請求項7または8に記載の組成物。
- 前記ウイルスが、前記ウイルスに感染した哺乳動物に対し非病原性である、請求項7−9のいずれか1項に記載の組成物。
- さらにアジュバントを含む、請求項7に記載の組成物。
- 組換えインフルエンザBウイルスを増殖させる方法であって、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、または配列番号:5を含む組換えインフルエンザウイルスと宿主細胞を接触させる工程;および当該宿主細胞を十分な時間およびウイルス複製に適切な条件下でインキュベートする工程を含み、ここで、当該宿主細胞は、インフルエンザBM2遺伝子の機能性バージョンを生成するように改変され、それによってウイルスに遺伝子生成物をトランス態様で提供する、前記方法。
- さらに子孫ウイルス粒子を単離する工程を含む、請求項12に記載の方法。
- さらにウイルス粒子をワクチンに処方する工程を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ウイルスがBM2タンパク質を発現できないか、または切詰めBM2タンパク質を発現する、請求項12に記載の方法。
- 前記ウイルスが、前記ウイルスに感染した哺乳動物で免疫応答を引き出す、請求項12に記載の方法。
- 前記ウイルスが、前記ウイルスに感染した哺乳動物に対し非病原性である、請求項12に記載の方法。
- 前記変異BM2遺伝子が、宿主細胞の少なくとも10継代の間に野生型または機能性BM2タンパク質をコードする非野生型配列に復帰しない、請求項12に記載の方法。
- 前記宿主細胞がMDCK細胞またはベロ細胞である、請求項12に記載の方法。
- 組換えインフルエンザAウイルスを増殖させる方法であって、宿主細胞を配列番号:33を含む組換えインフルエンザAウイルスと接触させる工程;および当該宿主細胞を十分な時間およびウイルス複製に適切な条件下でインキュベートする工程を含み、ここで、当該宿主細胞が、インフルエンザBM2遺伝子の野生型バージョンを生成するように改変され、それによってウイルスにBM2遺伝子生成物をトランス態様で提供するMDCK細胞である、前記方法。
- 組換えインフルエンザAウイルスを増殖させる方法であって、宿主細胞を配列番号:33を含む組換えインフルエンザAウイルスと接触させる工程;および当該宿主細胞を十分な時間およびウイルス複製に適切な条件下でインキュベートする工程を含み、ここで、当該宿主細胞が、インフルエンザA M2並びに配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31および配列番号:32から成る群から選択されるインフルエンザB BM2遺伝子のキメラバージョンを生成するように改変され、それによってウイルスにキメラM2:BM2遺伝子生成物をトランス態様で提供するベロ細胞である、前記方法。
- 組換えインフルエンザAウイルスを増殖させる方法であって、宿主細胞を配列番号:33を含む組換えインフルエンザAウイルスと接触させる工程;および当該宿主細胞を十分な時間およびウイルス複製に適切な条件下でインキュベートする工程を含み、ここで、当該宿主細胞が、配列番号:27を含むBM2遺伝子のコドン最適化バージョンを生成するように改変され、それによってウイルスにBM2遺伝子生成物をトランス態様で提供するベロ細胞である、前記方法。
- 変異BM2タンパク質を含む組換えインフルエンザAウイルス。
- 組換えインフルエンザウイルスを増殖させるための宿主細胞であって、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31および配列番号:32から成る群から選択されるcDNA配列によってコードされる遺伝子生成物を生成するように改変されるベロ細胞である、前記宿主細胞。
- 前記組換えインフルエンザウイルスが、配列番号:33に示される変異M2遺伝子を含むインフルエンザAウイルスである、請求項24に記載の宿主細胞。
- 前記組換えインフルエンザウイルスが、配列番号:4または配列番号:6に示される変異BM2遺伝子を含むインフルエンザBウイルスであり、当該ベロ細胞は配列番号:27によってコードされる遺伝子生成物を生成するように改変される、請求項24に記載の宿主細胞。
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