CN110573613A - 流感b病毒突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了涉及突变体病毒、特别是突变体流感病毒的组合物和方法。本文公开的突变体病毒包含突变体BM2序列，并且可用于免疫原性组合物、例如作为疫苗的免疫原性组合物中。本文还公开了用于繁殖病毒突变体的方法、组合物和细胞，以及涉及接种疫苗的方法、装置和组合物。

Description

流感B病毒突变体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月27日提交的美国申请第62/463,994号的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。
背景技术
流感是美国成年人死亡的主要原因。每年约有36,000人死于流感，并且超过200,000人住院。流感是高度传染性疾病，其通过咳嗽、打喷嚏以及与携带病毒的物体(诸如门把手和电话)直接物理接触而传播。流感的症状包括发烧、极度疲劳、头痛、发冷和身体疼痛；大约50％的感染者没有症状但仍具有传染性。只要正在流行的病毒株的抗原性与疫苗的抗原性相匹配，免疫接种在65岁以下的健康人群中在预防流感方面50％至60％有效。
接种疫苗是预防流感的主要方法，并且目前可用的是减毒活病毒疫苗和灭活(杀灭)病毒疫苗。通常鼻内施用的活病毒疫苗激活免疫系统的所有阶段，并可以刺激对多种病毒抗原的免疫应答。因此，活病毒的使用克服了在制备灭活的病毒疫苗期间可能发生的病毒抗原破坏的问题。此外，活病毒疫苗产生的免疫力通常比灭活疫苗诱导的免疫力更持久、更有效且交叉反应更强，并且活病毒疫苗的生产成本低于灭活病毒疫苗。然而，减毒病毒的突变通常是不明确的，并且回复(reversion)是一个问题。
发明内容
在一方面，本发明提供了具有突变体BM2基因的重组流感B病毒，所述突变体BM2基因包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。在一些实施方式中，BM2基因中的突变导致病毒不能表达BM2蛋白，或导致病毒表达截短的BM2蛋白。在一些实施方式中，在体外宿主细胞系统中至少10代，突变体BM2基因不回复为编码功能性BM2蛋白的野生型序列或非野生型序列，其中，宿主细胞经修饰以产生功能型的突变体基因，从而向病毒反向地提供基因产物。在一些实施方式中，重组病毒在感染有病毒的哺乳动物中引发免疫应答。在一些实施方式中，重组病毒对于感染有病毒的哺乳动物是非致病性的。在一些实施方式中，体外细胞系统包括马丁达比犬肾(Madin-Darby Canine Kidney，MDCK)细胞或Vero细胞。
在一方面，本公开提供了组合物，包含：具有突变体BM2基因的重组流感B病毒，所述突变体BM2基因包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5。在一些实施方式中，BM2基因的突变导致病毒不能表达BM2蛋白，或导致病毒表达截短的BM2蛋白。在一些实施方式中，病毒在感染有所述病毒的哺乳动物中引发免疫应答。在一些实施方式中，病毒对于感染有所述病毒的哺乳动物是非致病性的。在一些实施方式中，组合物还包含佐剂。
在一方面，本公开提供了用于繁殖重组流感B病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的重组流感病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞经修饰以产生功能型的流感BM2基因，从而向所述病毒反向地提供基因产物。在一些实施方式中，该方法还包括分离子代病毒颗粒。在一些实施方式中，该方法还包括将病毒颗粒配制为疫苗。在一些实施方式中，病毒不能表达BM2蛋白，或表达截短的BM2蛋白。在一些实施方式中，病毒在感染有病毒的哺乳动物中引发免疫应答。在一些实施方式中，病毒对于感染有所述病毒的哺乳动物是非致病性的。在一些实施方式中，在宿主细胞中至少10代，突变体BM2基因不回复为编码功能性BM2蛋白的野生型序列或非野生型序列持续。在一些实施方式中，宿主细胞是MDCK细胞或Vero细胞。
在一方面，本公开提供了用于繁殖重组流感A病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:33的重组流感A病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育所述宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生野生型的流感BM2基因从而向所述病毒反向地提供BM2基因产物的MDCK细胞。
在一方面，本公开提供了用于繁殖重组流感A病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:33的重组流感A病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生选自由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的嵌合型的流感A M2基因和流感B BM2基因从而向所述病毒反向地提供嵌合的M2:BM2基因产物的Vero细胞。
在一方面，本公开提供了用于繁殖重组流感A病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:33的重组流感A病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生包含SEQ ID NO:27的密码子优化型的BM2基因从而向所述病毒反向地提供BM2基因产物的Vero细胞。
在一方面，本公开提供了包含突变体BM2蛋白的重组流感A病毒。
在一方面，本公开提供了用于繁殖重组流感病毒的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生由选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的cDNA序列编码的基因产物的Vero细胞。在一些实施方式中，重组流感病毒是包含如SEQ ID NO:33中所示的突变体M2基因的流感A病毒。在一些实施方式中，重组流感病毒是包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所示的突变体BM2基因的流感B病毒，并且其中，Vero细胞经修饰以产生由SEQ ID NO:27编码的基因产物。
附图说明
图1是描绘BM2离子通道在流感病毒生命周期中的作用的图，其中，(1)流感病毒附着于细胞表面上的唾液酸受体；(2)病毒内化到细胞内；(3)BM2离子通道在病毒表面上表达；(4)BM2离子通道打开以允许质子进入，导致释放病毒RNA，该病毒RNA进入细胞核、被复制并导致病毒蛋白质合成；和(5)病毒组分被包装成病毒体并被释放(6)。
图2是野生型(WT)和6种突变体BM2基因(BM2SR(也称为BM2SR-0)、BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4、BM2SR-5)中B/FL/04/2006的流感基因组区段7的示意图。五核苷酸翻译终止-起始区域由TAATG表示。BM2SR-0和BM2SR-1突变体两者均包含BM2开放阅读框(ORF)的完全缺失。BM2SR-2突变体包含BM2缺失，其中M1翻译调节元件完整。BM2SR-3突变体包含BM2 ORF和M1 M86V突变的完全缺失。BM2SR-4突变体包含部分BM2缺失，其中M1翻译调节元件完整。BM2SR-5突变体包含部分BM2缺失(其中M1翻译调节元件完整)和M1 M86V突变。
图3显示了使用MFold RNA折叠算法建模的流感B区段7mRNA五核苷酸区域的折叠模型。五核苷酸翻译终止-起始区域由括号表示。野生型模型包括B/FL/04/2006的流感基因组区段7。BM2SR-1突变体包含BM2开放阅读框(ORF)的完全缺失。BM2SR-2突变体包含BM2缺失，其中M1翻译调节元件完整。
图4是显示流感B蛋白表达的蛋白质印迹。野生型(WT)Vero细胞用流感B病毒突变体感染，并且感染复数(MOI)大于1/个细胞。B/Lee/1940和B/Florida/4/2006用作野生型对照。感染后6小时提取细胞质蛋白，然后进行SDS-PAGE并转移至PVDF印迹。通过蛋白质分析用三种对以下有特异性的抗血清依序测试印迹：1)流感B HA蛋白(上图)；2)流感B M1蛋白(中图)；和3)哺乳动物GAPDH蛋白上样对照(下图)。
图5A和图5B是显示在BM2Vero细胞中具有B/Brisbane/60HA:NA基因和B/WI/01HA:NA基因的BM2SR突变体病毒的生长曲线的图表。通过BM2Vero培养物上清液的TCID50滴定来测试在BM2Vero细胞(表达BM2蛋白的Vero细胞)中生长的流感B BM2SR病毒培养物的病毒复制。在BM2CK细胞(表达BM2的马丁达比犬肾(MDCK)细胞)中进行滴定。测试了表达来自B/Brisbane/60/2008(B/Bris/60)的HA和NA的六种BM2SR突变体病毒：#7、#8、#9、#15、#21和#33；以及表达B/Wisconsin/01/2010(B/WI/01)的HA和NA的六种BM2SR病毒：#10、#11、#12、#16、#23和#24。相对于突变体病毒#21、#22、#23和#24，突变体病毒#7、#8、#9、#11和#12含有较大的缺失(即较短的mRNA序列)并且表现较慢生长。
图6A和图6B是显示BM2CK和MDCK细胞中BM2SR-WI01(即，表达B/Wisconsin/01/2010的HA和NA的BM2SR)的稳定性的图表。
图7是显示用BM2SR-0变体(具有包含SEQ ID NO:6的突变体BM2基因的BM2SR-Bris60和BM2SR-WI01)接种后小鼠体重变化的图表。
图8A和图8B是显示在具有包含SEQ ID NO:6的突变体BM2基因的BM2SR-0变体(BM2SR-Bris60和BM2SR-WI01)接种的小鼠中的抗HA IgG抗体应答的图表。在初免接种后第7天、第14天和第21天和在第28天第二次免疫后第35天、第42天和第49天采集血清样品。
图9是显示表达M2的MDCK细胞底物和表达BM2的MDCK细胞底物(M2CK和BM2CK)中M2缺陷型流感A M2SR(A/CA/07M2SR和A/Brisbane/10M2SR)株和BM2缺陷型流感B M2SR(B/WI/01BM2SR和B/Brisbane/60BM2SR)株的生长的图表。
图10是显示流感A M2和流感B M2(BM2)嵌合融合构建体的示意图。
图11是显示M2和BM2嵌合体支持拯救BM2缺陷型流感B(BM2SR)病毒的能力的图表。通过标准流感拯救技术，使用质粒在293T细胞中瞬时提供嵌合形式的M2，产生BM2缺陷型病。通过WHO HA测定法测定由293T流感B BM2SR RG上清液有效感染的BM2CK TC96孔的百分比。
图12显示了密码子优化的野生型BM2蛋白和嵌合M2蛋白的蛋白质印迹分析。所有M2蛋白在所用的SDS-PAGE系统中表现出改变的迁移率，其出现比计算的分子量(MW)大了约5,000道尔顿。突变体ABB、突变体AAB、突变体AA2FB含有较大的流感A胞外域，并因此在SDS-PAGE中以相应较大的表观MW迁移。
图13是显示用流感A/Brisbane/10M2SR和流感B/Brisbane/60M2SR M2缺陷型病毒感染后6天表达流感A M2:流感B M2(AM2:BM2)嵌合蛋白的Vero细胞底物中M2缺陷型流感ACA/07/HlNlpdm M2SR的病毒滴度的图表。
图14是显示M2缺陷型流感A CA/07/HlNlpdm M2SR在表达M2的M2CK和表达BM2的Vero细胞底物中生长的图表。
图15A是流感A基质Ml免疫印迹。
图15B是显示在表达M2的M2CK细胞底物和表达BM2的BM2 Vero细胞底物中产生的流感A M2SR病毒的M2蛋白含量和特性的蛋白质印迹。
图16A至图16D是显示M2SR和BM2SR突变体在多价制剂中引发针对流感A病毒和流感B病毒的抗体应答的图表。代表性的M2SR和BM2SR构建体：A/MA15是H1N1M2SR；A/HK4801是H3N2 M2SR；B/CA12是B Yamagata BM2SR-4；B/Bris46是B Victoria BM2SR-4。四价(“quad”)制剂是所有四种的混合物。三价(“tri”)是所示的三种病毒的制剂。
图16E至图16F是分别显示在用单价BM2SR、三价制剂和四价制剂接种后的致死剂量流感B攻击后小鼠体重变化和存活率的图表。
图17A和图17B是系统发育树，显示对于BM2蛋白(图17A)和BM1蛋白(图17)的B/Lee/40与现代流感B病毒之间的进化关系。
图18是显示在BM2SR和四价疫苗中针对流感A抗原和流感B抗原引发的酶联免疫吸附测定(ELISA)滴度的图表。
图19A是显示在BM2SR和四价疫苗中针对流感A抗原和流感B抗原引发的血细胞凝集抑制(HAI)滴度的图表。
图19B是显示在接种后第35天在汇集的血清中引发针对BM2SR和四价疫苗的HAI滴度的表。
图20是显示流感A攻击后第1天、第3天、第5天和第7天的鼻洗液病毒滴度的图表。
图21A是显示流感A攻击后第3天鼻甲组织中病毒滴度的图表。
图21B是显示流感A攻击后第3天气管组织中病毒滴度的图表。
图21C是显示流感A攻击后第3天肺组织中病毒滴度的图表。
图22A是显示Vero(WT Vero)细胞系、表达M2的Vero(M2VeroA)细胞系以及表达BM2的Vero(BM2Vero)细胞系以0.001的MOI进行的野生型流感A/Hong Kong/2014(H3N2)和M2SRA/Hong Kong/2014(H3N2)病毒感染的结果的图表。在接种后的时间点(t＝1天、2天、3天、4天)取出培养物上清液的等分试样并将其冷冻。通过TCID50测定在M2CK细胞中测试等分试样的病毒复制。将没有可检测的复制的样品绘制为log10 TCID50＝1.50。测定检测限值log10TCID50＝1.67以虚线显示。
图22B是显示Vero(WT Vero)细胞系、表达M2的Vero(M2VeroA)细胞系和表达BM2的Vero(BM2Vero)细胞系以0.001的MOI进行的野生型流感B/CA/12/2015(YL)和BM2SR4 B/CA/12/2015病毒感染的结果的图表。在接种后的时间点(t＝1天、2天、3天、4天)取出病毒培养物上清液的等分试样并将其冷冻。通过TCID50测定在BM2CK细胞中测试等分试样的病毒复制。将没有可检测的复制的样品绘制为log10 TCID50＝1.50。测定检测限值log10TCID50＝1.67以虚线显示。
具体实施方式
I.定义
本文使用以下术语，提供其定义用于指导。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”表示单数和复数，除非明确指出仅指定单数。
无论是否由术语约限定，术语“约”和范围的使用一般而言意味着所理解的数字不限于本文所述的确切数字，并且旨在表示基本上在引用范围内的范围，而不脱离本发明的范围。如本文所用，“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上根据其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在其使用的上下文中对于本领域普通技术人员是不明确的，则“约”将意味着高达特定术语的正负10％。
如本文所用，与病毒一起使用的术语“减毒的”是指与非减毒的对应物相比具有降低的毒力或致病性的、但仍然存活或是活的病毒。通常，与非减毒的病毒相比，减毒使得感染因子(诸如病毒)对受感染的对象的危害较小或毒性较小。这与杀灭的或完全失活的病毒相反。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”是指足以实现所期望的治疗效果和/或预防效果的量，例如，导致预防疾病、病症和/或其症状的量。在治疗或预防应用的背景下，向对象施用的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，诸如一般健康状况、年龄、性别、体重和对组合物药物的耐受性。它还将取决于疾病或病症的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些因素和其他因素确定合适的剂量。在一些实施方式中，施用多个剂量。另外地或替选地，在一些实施方式中，施用多种治疗组合物或化合物(例如免疫原性组合物，诸如疫苗)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指其中病原体(诸如病毒)可以复制的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是体外培养的细胞(例如，CHO细胞、Vero细胞、MDCK细胞等)。另外地或替选地，在一些实施方式中，宿主细胞是体内的(例如，经感染的脊椎动物、诸如禽类或哺乳动物的细胞)。在一些实施方式中，宿主细胞可以诸如通过增强宿主细胞的病毒感染和/或通过增强病毒生长速率被修饰以例如增强病毒产生。以举例的方式但不以限制的方式，示例性宿主细胞修饰包括2-6-连接的唾液酸受体在宿主细胞的细胞表面上的重组表达，和/或宿主细胞中的蛋白的重组表达，其已被认为在病原体或病毒中是缺失或无效的。
术语“免疫原性组合物”在本文中用于指在已经暴露于组合物的哺乳动物中引发免疫应答的组合物。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含五种BM2缺陷型流感B BM2SR突变体(例如，BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4、BM2SR-5)中的至少一种。
在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物可以以多种形式配制用于施用(即，经配制用于“暴露”于哺乳动物)。例如，在一些实施方式中，制备免疫原性组合物用于经口、经肺、静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、经鼻或局部施用。还可以配制组合物用于特定剂型。例如，在一些实施方式中，可以将免疫原性组合物配制成液体、凝胶剂、气溶胶、软膏剂、乳膏剂、冻干制剂、粉剂、饼剂、片剂或胶囊剂。在其他实施方式中，免疫原性组合物被配制成控释制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂和混合立即释放制剂。在一些实施方式中，免疫原性组合物以液体形式提供。在其他实施方式中，免疫原性组合物以冻干形式提供。
如本文所用，术语“感染的”是指携带疾病或病原体(诸如病毒)。感染可以是有意的，诸如通过施用病毒或病原体(例如，通过接种疫苗)，或无意的，诸如通过病原体从一生物体到另一生物体，或从污染的表面到生物体的自然转移。
如本文所用，术语“分离的”和/或“纯化的”是指体外制备、分离和/或纯化核酸(例如载体或质粒)、多肽、病毒或细胞，使其与不需要的体内物质不相关联，或使其基本上从其通常存在的不需要的体内物质中纯化。例如，在一些实施方式中，经分离的病毒制剂通过体外培养和繁殖获得，并且基本上不含其他致病因子。如本文所用，“基本上不含”意指使用用于此化合物或试剂的标准检测方法，低于具体化合物(诸如不需要的核酸、蛋白、细胞、病毒、致病因子等)的检测水平。
如本文所用，术语“突变体”、“突变”和“变体”可互换使用，并且是指与野生型序列不同的核酸或多肽序列。在一些实施方式中，突变体序列或变体序列是天然存在的。在其他实施方式中，重组地和/或化学地引入突变体序列或变体序列。在一些实施方式中，核酸突变包括对RNA和/或DNA序列的修饰(例如，添加、缺失、取代)。在一些实施方式中，修饰包括化学修饰(例如，甲基化)，并且还可以包括天然核苷酸和/或非天然核苷酸的取代或添加。核酸突变可以是沉默突变(例如，编码与野生型序列相同的氨基酸的一个或多个核酸变化)或可以导致编码的氨基酸的变化、产生终止密码子，或者可以引入剪接缺陷或剪接变化。编码序列的核酸突变也可以导致保守或非保守的氨基酸变化。
如本文所用，术语“重组病毒”是指例如使用重组核酸技术已经在体外操作以引入病毒基因组的变化和/或引入病毒蛋白的变化的病毒。例如，在一些实施方式中，重组病毒可以包括野生型、内源性、核酸序列和突变体和/或外源核酸序列。另外地或替选地，在一些实施方式中，重组病毒可以包括经修饰的蛋白组分，诸如突变体或变体基质、血球凝集素、神经氨酸酶、核蛋白、非结构和/或聚合酶蛋白。
如本文所用，术语“重组细胞”或“经修饰的细胞”是指已经例如使用重组核酸技术在体外操作以将核酸引入细胞和/或修饰细胞核酸的细胞。重组细胞的实例包括携带外源质粒、表达载体等的原核细胞或真核细胞，和/或包括对其细胞核酸的修饰(例如，取代、突变、插入、缺失等至细胞基因组中)的细胞。示例性重组细胞是已经在体外操作以稳定地表达外源蛋白(诸如病毒BM2蛋白)的细胞。
如本文所用，术语“单一复制(SR)病毒”是指在病毒体蛋白中有缺陷的病毒，其在宿主细胞的病毒进入或从宿主细胞释放中起作用。例如，与经典的减毒活流感疫苗相反，如本文所述的M2SR属于新类别的单一复制(SR)病毒疫苗。SR病毒在病毒进入或释放中起作用的病毒体蛋白(诸如流感M2离子通道蛋白，其不影响病毒基因组复制但是对于病毒生长是必不可少的)中是有缺陷的。相比之下，传统的减毒活病毒疫苗在病毒复制机制中含有多个突变，产生高度减毒的表型。因此，与减毒活疫苗相比，SR疫苗病毒机制不影响病毒感染动力学和抗原产生。
如本文所用，“对象”和“患者”可互换使用并且指动物(例如，任何脊椎动物物种的成员)。本发明公开的主题的方法和组合物特别可用于温血脊椎动物，包括哺乳动物和鸟类。示例性对象可以包括哺乳动物(诸如人)，以及由于濒危而具有重要性、具有对人的经济重要性(在农场饲养以供人食用的动物)和/或具有社会重要性(作为宠物或在动物园中饲养的动物)的哺乳动物和鸟类。在一些实施方式中，对象是人。在一些实施方式中，对象不是人。
如本文所用，如与病毒一起使用的术语“类型”和“株”可互换使用，并用于通常指代具有不同特征的病毒。例如，流感A病毒是与流感B病毒不同类型的病毒。同样，流感AH1N1是与流感A H2N1、H2N2和H3N2不同类型的病毒。另外地或替选地，在一些实施方式中，基于两种病毒跨膜蛋白(血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA))的抗原差异，可以将不同类型的病毒(诸如流感A H2N1、H2N2和H3N2)称为“亚型”。不将几乎仅在人中传播的流感B病毒归类至亚型。B型病毒的两种密切相关的谱系(B/Victoria和B/Yamagata)是在人中流行的流感B病毒的实例。
术语“疫苗”在本文中用于指向对象施用以产生或增加对特定疾病的免疫力的组合物。在一些实施方式中，疫苗包含药学上可接受的佐剂和/或药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“vRNA”是指包含病毒基因组的RNA，该病毒基因组包括分段或非分段的病毒基因组、以及正链和负链病毒基因组。vRNA可以是完全内源的和“野生型”和/或可以包括重组和/或突变体序列。
如本文所用，“BM2SR-1”是指SEQ ID NO:1、包含SEQ ID NO:1的病毒或包含含有SEQ ID NO:1的病毒的疫苗，这取决于使用它的上下文。例如，在描述本文证明的BM2基因的突变时，“BM2SR-1”是指SEQ ID NO:1。如本文所用，“BM2SR-2”是指SEQ ID NO:2、包含SEQID NO:2的病毒或包含含有SEQ ID NO:2的病毒的疫苗，这取决于使用它的上下文。例如，在描述本文证明的BM2基因的突变时，“BM2SR-2”是指SEQ ID NO:2。如本文所用，“BM2SR-3”是指SEQ ID NO:3、包含SEQ ID NO:3的病毒或包含含有SEQ ID NO:3的病毒的疫苗，这取决于使用它的上下文。例如，在描述本文证明的BM2基因的突变时，“BM2SR-3”是指SEQ ID NO:3。如本文所用，“BM2SR-4”是指SEQ ID NO:4、包含SEQ ID NO:4的病毒或包含含有SEQ ID NO:4的病毒的疫苗，这取决于使用它的上下文。例如，在描述本文证明的BM2基因的突变时，“BM2SR-4”是指SEQ ID NO:4。如本文所用，“BM2SR-5”是指SEQ ID NO:5、包含SEQ ID NO:5的病毒或包含含有SEQ ID NO:5的病毒的疫苗，这取决于使用它的上下文。例如，在描述本文证明的BM2基因的突变时，“BM2SR-5”是指SEQ ID NO:5。如本文所用，“BM2SR-0”是指SEQID NO:6、包含SEQ ID NO:6的病毒或包含含有SEQ ID NO:6的病毒的疫苗，这取决于使用它的上下文。例如，在描述本文证明的BM2基因的突变时，“BM2SR-0”是指SEQ ID NO:6。除非另有说明，否则“BM2SR”是指BM2SR-0。
II.流感B病毒
A.概述
流感是美国成年人死亡的主要原因。流感的致病因子是正粘病毒(Orthomyxoviridae)科的病毒，包括流感A病毒、流感B病毒和流感C病毒，其中流感B几乎仅在人类中传播。
流感B病毒是有包膜的负链RNA病毒。流感B病毒的基因组包含在8条单个(非配对)RNA链上，其互补序列编码11种蛋白。在这些蛋白中，9种也在流感A病毒中发现：三种RNA依赖性RNA聚合酶亚单位(PB1、PB2和PA)、血球凝集素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1或BM1)和两种非结构蛋白(NS1和NS2，也称为NEP)。两种蛋白(NB和BM2)是流感B病毒独有的。总基因组大小约为14,500个碱基。基因组的分段性质允许在细胞共栖期间在不同病毒株之间交换整个基因，该过程称为重配。以长度递减的顺序编号的八个RNA区段如下。区段1、区段2和区段3分别编码PB1、PB2和PA，它们是RNA聚合酶亚单位。区段4编码HA(血球凝集素)。区段5编码NP(核蛋白)。区段6编码NB(NB蛋白，其功能未知)和NA(神经氨酸酶)。区段7由双顺反子mRNA编码BM1(基质蛋白)和BM2(离子通道)，其翻译策略是独特的。BM2起始密码子与BM1终止密码子(TAATG，终止-起始五核苷酸基序)重叠。BM2蛋白通过这种终止-起始翻译机制翻译，这不同于流感A病毒的M2蛋白，其从剪接的mRNA翻译而来。区段8通过使用来自相同RNA区段的不同阅读框来编码NS1和NEP两者。
流感A和流感B两者都通过抗原漂移的过程在抗原性方面进化，其中血球凝集素(HA)蛋白的突变允许病毒逃避现有的人免疫性并持续存在于人群中。有几种流感A的亚型，根据H数(对于血球凝集素的类型)和N数(对于神经氨酸酶的类型)命名。目前，存在已知的16种不同的H抗原(H1至H16)和已知的9种不同的N抗原(N1至N9)。每种病毒亚型已经突变成具有不同致病性特征的各种株；一些对一个物种而不是其他物种有致病性，一些对多个物种有致病性。已经在人中证实的示例性流感A病毒亚型包括但不限于导致“西班牙流感”和2009年猪流感爆发的H1N1；引起20世纪50年代后期的“亚洲流感”的H2N2；引起20世纪60年代后期的香港流感的H3N2；H5N1，通过其在2000年代中期的传播被认为是全球流感大流行威胁；H7N7；目前在人和猪中流行的H1N2；以及H9N2、H7N2、H7N3、H5N2、H10N7。流感B不分为亚型；然而，两种抗遗传和遗传不同的谱系(以株B/Victoria/2/87和B/Yamagata/16/88命名的Victoria和Yamagata)目前在人中流行。
流感病毒具有标准命名法，其包括病毒类型；从其中分离该病毒的物种(如果是非人的)；从其中分离该病毒的位置；分离物编号；分离物年份；以及(仅对于流感A病毒)HA和NA亚型。因此，B/Yamagata/16/88是1988年在山形(日本)采集的人流感B病毒的第16号分离物。
B.生命周期和结构
流感病毒的生命周期通常涉及附着于细胞表面受体、进入细胞和病毒核酸的脱壳，然后在细胞内复制病毒基因。在病毒蛋白和基因的新拷贝合成后，这些组分组装成子代病毒颗粒，所述子代病毒颗粒然后离开细胞。不同的病毒蛋白在这些步骤中的每一步骤中起作用。
流感B颗粒由包封病毒核心的脂质包膜组成。包膜的内侧由基质蛋白(BM1)填满，而外表面的特征在于两种类型的糖蛋白刺突(spike)：血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。BM2是跨膜离子通道蛋白，也是脂质包膜的一部分。参见例如图1。
HA蛋白是三聚体I型膜蛋白，负责与宿主细胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸寡糖(含有与半乳糖连接的末端唾液酸的寡糖)结合。该蛋白还负责病毒和宿主细胞膜之间的融合，之后病毒体通过内吞作用内化。
神经氨酸酶(NA)是四聚体II型膜蛋白，是唾液酸酶，其从宿主细胞与HA和NA的糖缀合物(glycoconjugate)切割末端唾液酸残基，并因此被认为是受体破坏酶。该唾液酸酶活性对于从宿主细胞表面有效释放子代病毒体以及防止由于病毒HA与其他糖蛋白的结合活性导致的子代聚集是必需的。因此，HA的受体结合活性和NA的受体破坏活性可能起到平衡作用，从而允许流感的有效复制。
将基因组区段包装到病毒颗粒的核心中。RNP(RNA加核蛋白，NP)呈螺旋形式，其中三个病毒聚合酶多肽与每个区段相关联。
流感病毒生命周期始于HA与宿主细胞表面上的含唾液酸的受体结合，然后是受体介导的内吞作用(图1)。晚期核内体中的低pH触发HA中的构象转变，从而暴露HA2亚单位(所谓的融合肽)的N-末端。融合肽启动病毒和内体膜的融合，并且基质蛋白(BM1)和RNP复合物释放到细胞质中。RNP由包壳vRNA的核蛋白(NP)和由PA、PB1和PB2蛋白形成的病毒聚合酶复合物组成。RNP被转运到细胞核中，在细胞核中发生转录和复制。RNA聚合酶复合物催化三种不同的反应：(1)合成具有5’帽和3’聚A结构的mRNA，(2)全长互补RNA(cRNA)，和(3)基因组vRNA，使用cDNA作为模板。然后将新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白组装成RNP、从细胞核输出并转运到质膜，在质膜发生子代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白通过从唾液酸寡聚糖中除去唾液酸而在感染后期起作用，从而从细胞表面释放新组装的病毒体并防止病毒颗粒的自聚集。虽然病毒组装涉及蛋白-蛋白和蛋白-vRNA相互作用，但这些相互作用的性质在很大程度上仍然是未知的。
C.BM2蛋白的作用
如上所述，跨越病毒膜的是三种蛋白质：血球凝集素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)和BM2。关于流感A，HA和NA的细胞外结构域(胞外域)是相当可变的，而M2的胞外域结构域在流感A病毒中基本上是不变的。不希望受理论束缚，在流感A病毒中，具有离子通道活性的M2蛋白被认为在宿主细胞穿透和病毒RNA的脱壳之间的病毒生命周期中的早期状态起作用。一旦病毒体经历内吞作用，病毒体相关的M2离子通道(同源四聚体螺旋束)被认为允许质子从核内体流入病毒体内部以破坏酸不稳定的M1蛋白-核糖核蛋白复合物(RNP)相互作用，从而促进RNP释放到细胞质中。此外，在其HA在细胞内被切割的一些流感株(例如，A/禽疫/Rostock/34)中，M2离子通道被认为提高了反向高尔基体网络的pH值，防止了由于该隔室中的低pH条件导致的HA中的构象变化。还显示M2跨膜结构域本身可以起离子通道的作用。M2蛋白离子通道活性被认为在流感病毒的生命周期中是必不可少的，因为已经显示阻断M2离子通道活性的盐酸金刚烷胺抑制病毒复制。
流感B病毒中的流感A病毒M2蛋白的功能性对应物是称为BM2的III型跨膜蛋白。翻译机制涉及下面描述的耦合终止/重新发起事件。
III.BM2病毒突变体
在一方面，公开了携带突变体BM2 vRNA序列的流感B病毒。通常，此类突变体不具有BM2离子通道活性，在体内展现出减毒的生长性质，不能产生受感染的子代，并且在受感染的对象中是非致病性的或显示出减少的发病。突变体病毒是免疫原性的，并且当用作疫苗时，提供对抗对应物野生型和/或其他致病性病毒的感染保护。另外，本文公开的BM2突变体是稳定的，并且不突变以表达功能性BM2多肽，无论使用什么宿主细胞。另外地或替选地，在一些实施方式中，产生这些突变体的BM1蛋白而没有对其功能有可检测的改变。在一些实施方式中，携带突变体BM2核酸序列的病毒不能在宿主细胞中复制，其中可以繁殖相应的野生型病毒。以举例的方式但不以限制的方式，在一些实施方式中，野生型病毒可以在培养MDCK细胞、CHO细胞和/或Vero细胞中生长、繁殖和复制，而携带突变体BM2序列的相应病毒不能生长，复制超过一个周期，或在相同类型的细胞中繁殖。
如上所述，在一些实施方式中，在宿主细胞中，BM2突变体病毒是稳定的，并且不突变或不回复为编码功能性BM2蛋白的野生型序列或非野生型序列。例如，在一些实施方式中，BM2突变体病毒在宿主细胞中稳定2代、3代、5代、10代、12代、15代、20代、25代或超过25代。在一些实施方式中，宿主细胞是未经修饰的宿主细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是经修饰的宿主细胞，诸如表达BM2蛋白的MDCK细胞(即BM2CK细胞)。
在一些实施方式中，BM2突变体包含一种或多种核酸取代和/或缺失。在一些实施方式中，突变位于核酸中，所述核酸编码BM2蛋白的细胞外结构域、BM2蛋白的跨膜结构域和/或BM2蛋白的细胞质尾中的一种或多种。另外地或替选地，在一些实施方式中，一种或多种核酸突变产生BM2肽的一种或多种终止密码子和/或一种或多种氨基酸缺失。在一些实施方式中，携带突变体BM2核酸的病毒产生非功能性BM2多肽。在一些实施方式中，携带突变体BM2核酸的病毒不产生BM2多肽。在一些实施方式中，携带突变体BM2核酸的病毒产生截短的BM2多肽。
如上所述，流感B基因组区段7表达病毒复制所需的两个主要多肽，即BM1基质蛋白和BM2质子通道。BM1和BM2多肽的表达部分地受位于BM1和BM2ORF之间的接合处的五核苷酸基序翻译滑动位点的调节。五核苷酸基序TAATG含有在备选-1阅读框中用于终止M1翻译的TAA终止密码子和用于M2起始的ATG起始密码子。已显示该五核苷酸基序和侧翼序列对于调节M1蛋白的表达是重要的。BM2蛋白通过在从RNA区段7转录的双顺反子mRNA中的重叠终止-起始五核苷酸处的耦合翻译终止-重新起始机制合成。在从RNA区段7转录的mRNA中，存在五核苷酸，残基769±773，其中BM2蛋白的AUG起始密码子与M1蛋白的终止密码子重叠(Horvath等人，EMBO Journal 9:2639-2647(1990))。BM2蛋白通过五核苷酸处的耦合翻译终止±起始机制合成，其依赖于上游M1蛋白的起始和终止(Horvath等人，1990)。该过程需要终止和重新起始密码子与终止-起始位点的上游的mRNA的限定区域紧密接近，所述限定区域包括与18S rRNA的螺旋26互补的功能上必需的碱基段。该互补区位于与终止核糖体相邻的发夹结构的环内，并且可以在用于表达BM2蛋白的重新起始过程中起到作用。该二级结构可以在稳定区段7mRNA中具有额外的作用，因此破坏或影响发夹结构的BM2突变体除了期望的BM2表达缺乏之外还可以具有降低的M1蛋白表达。
复制和包装所有8个基因组区段所需的另一个区域是基因组RNA的5’非编码区(5’NCR)。因为流感是负链RNA病毒，基因组5’NCR代表mRNA和cDNA的3’NCR。此外，5’NCR的结构要求可以延伸到蛋白ORF本身中。对于流感A已经证明了这一点；在区段4(HA)的mRNA的3’末端附近(或基因组5’NCR附近)的改变密码子但不改变HA的氨基酸组成的沉默蛋白编码突变可以完全阻断病毒复制。因此，M2的COOH末端内的区域在结构上可能是重要的并且对于将有效基因组包装至病毒体中可能是重要的。
通过构建具有精确缺失109-氨基酸BM2 ORF的流感B病毒来证明对病毒复制中BM2的需求。该病毒可以在M2CK细胞中复制，所述M2CK细胞是组成型表达BM2蛋白的MDCK细胞。尽管该M2缺失构建体确实允许在MDCK谱系细胞中复制，但总缺失除去了可能对M1蛋白表达产生不利影响的调节元件的部分，特别是当受到可能影响病毒产生的其他因素的限制时。例如，虽然流感B病毒在MDCK细胞中生长至高滴度，但它们在Vero细胞中部分受到M1蛋白的低表达的高度限制(Nakamura，1981)。因此，M区段的操纵可能无意中进一步影响M1表达。
为了解决这些缺点，设计基于B/Florida/4/2006区段7的一系列五种新型BM2无效(null)突变体构建体(BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4和BM2SR-5)(图2)，并且然后使用本领域已知的标准技术将其合成为适合于标准体外基因-组装程序的双链DNA片段。表1中提供了构建体的单链mRNA或正义DNA核苷酸序列，BM2SR-1(SEQ ID NO:1)、BM2SR-2(SEQID NO:2)、BM2SR-3(SEQ ID NO:3)、BM2SR-4(SEQ ID NO:4)、BM2SR-5(SEQ ID NO:5)和BM2SR-0(SEQ ID NO:6)。
BM2SR-0突变体、BM2SR-1突变体和BM2SR-3突变体不表达BM2多肽。BM2SR-2突变体、BM2SR-4突变体和BM2SR-5突变体可能潜在地表达包含BM2蛋白的前11个氨基酸的截短的多肽；然而，这尚未得到证实。
表2中提供了野生型流感B区段7，其显示了BM1编码序列和BM2编码序列和粗体下划线的五核苷酸基序。
表3中提供了用于野生型BM1和BM2的氨基酸序列和用于BM1 M86V突变体的氨基酸序列。
称为BM2SR-1(SEQ ID NO:1)的第一构建体是BM2 ORF的完全缺失，如先前由Hatta等人，J.Virol.83(11):5939-5942(2009)报道，其对应于BM2SR-0(SEQ ID NO:6)，但是编码现代蛋白而不是B/Lee/1940的BM1。
至少从1988年开始，流感B病毒的两种抗原性和遗传性不同的谱系在人中共同传播并引起疾病。Victoria谱系的流感病毒是20世纪80年代在全球流行的占优势的B型株，Yamagata谱系成为在20世纪90年代早期占优势的B型病毒。自1991年以来，Victoria谱系病毒很少被分离，并且几乎完全限制在东亚。Victoria病毒于2002年重新出现，并且Yamagata和Victoria谱系自此以后共存。从1940年到2016年分离的流感B病毒的进化关系表明现代分离物的BM1和BM2蛋白彼此之间的关系比B/Lee/40更密切。系统发育关系在图17A和图17B中所示。
BM2SR-2构建体(SEQ ID NO:2)回复BM1-BM2五核苷酸终止-起始位点和天然3’-序列背景以改善BM1表达和调节。FluB mRNA中的5个核苷酸序列TAATG编码称为五核苷酸终止-起始位点的核糖体滑动序列，其含有上游BM1ORF的终止密码子TAA和下游移码BM2 ORF的起始密码子ATG两者。该序列的5’和3’的天然RNA序列背景含有调节BM1蛋白表达翻译的元件。五核苷酸的回复必需回复BM2起始密码子和在天然背景中。因此，预计翻译将在BM2ATG位点处重新起始。为了阻断该区域的3’处的任何序列的表达，将人工序列插入BM2SR-2中，该BM2SR-2串联编码3个终止密码子，下游每个潜在的翻译开放阅读框中有一个终止密码子。
使用MFold RNA折叠算法对B/Florida/4/2006野生型区段7以及BM2SR-1和BM2SR-2建模。BM2SR-2五核苷酸周围的区域被预测折叠成类似于野生型的RNA结构，而具有完整BM2 ORF缺失的BM2SR-1突变体(包括2个碱基对的五核苷酸)不被预测折叠成类似于野生型的RNA结构(图3)。因此，通过热力学MFold模型预测向BM2SR-2构建体添加32个碱基对以促进正常RNA结构。
BM2SR-3构建体(SEQ ID NO:3)与具有单一突变的BM2SR-2相同：在流感B M1基因(M1 M86V)中的氨基酸86处掺入缬氨酸代替绝对保守的甲硫氨酸。已知M86V的取代改善Vero细胞中野生型流感B株的生长(N.Wressnigg等人，Vaccine 27:2851-2857(2009))。
BM2SR-4构建体(SEQ ID NO:4)是来自M2的仅90个碱基对的较小缺失，这是基于观察到基因组RNA的区段大小的改变可以对病毒区段的稳定性具有负面影响。这归因于位于病毒蛋白编码区内的基因组RNA的5’末端附近的序列(Hatta等人(2009))。这可能是位于基因组区段7的5’末端(mRNA的3’末端)附近的M2 ORF的情况。区段不稳定性可以导致具有减毒的病毒生长和降低的最终病毒滴度的缺乏给定区段的缺陷型病毒颗粒的数量增加(Hutchinson等人，J.Virol.82:11869-11879(2008))。来自BM2SR-4的90个碱基对缺失占区段7的总天然长度1190个碱基对的小于8％。
BM2SR-5构建体(SEQ ID NO:5)是所有区段改善的组合：用于区段稳定性的M2的较小缺失，用于M1表达的M1翻译调节，以及用于改善Vero细胞基质中的病毒滴度和生长的M1M86V突变。
BM2SR-1突变体和BM2SR-3突变体不表达BM2多肽。BM2SR-2突变体、BM2SR-4突变体和BM2SR-5突变体可能潜在地表达包含BM2蛋白的前11个氨基酸的截短的多肽；然而，这尚未得到证实。
IV.基于细胞的病毒产生系统
A.产生“第一代”突变体病毒和病毒反向遗传学
突变体病毒(诸如携带突变体BM2核酸的那些)可以通过基于质粒的反向遗传学产生，如Neumann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9345-9350(1999)所述。简而言之，将真核宿主细胞用一种或多种编码八种病毒RNA的质粒转染，该病毒RNA对应于八种流感B区段中的每一者。每个病毒RNA序列侧接有RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子。值得注意的是，编码BM2蛋白的病毒RNA包括突变体BM2核酸序列。宿主细胞另外用一种或多种编码病毒蛋白(例如聚合酶、核蛋白和结构蛋白)的表达质粒转染，该病毒蛋白包括野生型BM2蛋白。用病毒RNA质粒转染宿主细胞导致所有八种流感病毒RNA的合成，其中一种流感病毒RNA携带突变体BM2序列。共转染的病毒聚合酶和核蛋白将病毒RNA组装成功能性vRNP，其被复制和转录，最终形成具有突变体BM2核酸序列的感染性流感病毒，但具有掺入病毒脂质包膜中的功能性BM2多肽。
例如，在基于B/FL/04/2006区段7和B/Lee/1940对照的BM2SR突变体中，将BM2-缺失的区段7插入标准流感反向遗传学质粒载体中并用于用来自现代Victoria和Yamagata谱系区段4和区段6的HA和NA组合产生疫苗-候选流感B病毒。编码内部基因产物(包括但不限于PB1、PB2、PA、NP、NS1和NS2)的区段1、区段2、区段3、区段5和区段8衍生自B/Lee/40。重组病毒通过化学介导的转染进入293T细胞来产生。在组成型表达BM2蛋白的马丁达比犬肾(MDCK)细胞(即BM2CK细胞)中进行293T-产生的BM2-缺陷型突变体病毒的回收。
构建了表4中描述的十二种BM2缺陷型流感B BM2SR突变体病毒。如表4中所示的B/Lee/40-0、B/FL/04/2006-1、B/FL/04/2006-2、B/FL/04/2006-3、B/FL/04/2006-4和B/FL/04/2006-5分别对应于BM2SR-0、BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4和BM2SR-5。
产生“第一代”突变体病毒的替选方法包括核糖核蛋白(RNP)转染系统，其允许用体外产生的重组RNA分子替换流感病毒基因，如Enami和Palese,J.Virol.65(5):2711-2713(1991)所述。
在体外合成病毒RNA，并且将RNA转录物用病毒核蛋白(NP)和聚合酶蛋白包被，其在转染细胞中充当生物活性RNP，如Luytjes等人，Cell 59:1107-1113(1989)所证明的。
RNP转染方法可以分为四个步骤：1)RNA的制备：编码流感病毒区段的质粒DNA在体外转录反应中转录为负义RNA；2)RNA的壳体化：然后将转录的RNA与梯度纯化的NP和聚合酶蛋白(从破坏的流感病毒中分离)混合，形成生物活性RNP复合物；3)转染和拯救经壳体化的RNA：将人工核糖核衣转染至先前感染了含有与拯救基因不同的基因的辅助流感病毒的细胞；辅助病毒将扩增转染的RNA；4)转染基因的选择：因为辅助病毒和转染子(含有拯救基因)都在培养上清液中，使用抗体的适当选择系统是分离携带转染的基因的病毒所必需的。
选择系统允许产生具有特定生物学和分子特征的新型转染子流感病毒。然后可以将针对靶表面蛋白的抗体选择用于阳性或阴性选择。
另外地或替选地，相同的抗体可以用于‘捕获’辅助病毒并允许富集转染子。例如，抗体可以用于涂覆组织培养皿的底部或可以用于柱基质中以允许富集上清液或洗脱液中的转染子。
转染子病毒可以通过有限稀释在多孔板内的表达BM2的细胞中生长，然后例如通过产生复制子板来鉴定和克隆。例如，含有生长的病毒的多孔板的给定孔的等分试样的一半可以用于感染MDCK细胞，并且另一半用于感染表达BM2蛋白的MDCK细胞(即BM2CK细胞)。转染子病毒和辅助病毒都将在表达BM2蛋白的MDCK细胞中生长。然而，只有辅助病毒将在标准MDCK细胞中生长，才允许识别含有转染子的多孔板中的孔。转染子病毒可以在表达BM2蛋白的细胞中噬菌斑纯化。
B.繁殖病毒突变体
在一些实施方式中，本文所述的病毒突变体在宿主细胞中维持和传代。以举例的方式但不以限制的方式，适合于流感病毒突变体(诸如流感B病毒突变体)生长的示例性宿主细胞包括任何数量的真核细胞，包括但不限于马丁达比犬肾细胞(MDCK细胞)、猿猴细胞诸如非洲绿猴细胞(例如Vero细胞)、CV-1细胞和恒河猴肾细胞(例如LLcomk.2细胞)、牛细胞(例如MDBK细胞)、猪细胞、雪貂细胞(例如，水貂肺细胞)BK-1细胞、啮齿动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)、人细胞例如胚胎人视网膜细胞(例如，PER-)、293T人胚胎肾细胞和禽类细胞包括胚胎成纤维细胞。
另外地或替选地，在一些实施方式中，修饰真核宿主细胞以增加病毒产生，例如通过增加宿主细胞的病毒感染和/或通过增加病毒生长速率。例如，在一些实施方式中，修饰宿主细胞以在细胞表面上表达或增加表达2,6-连接的唾液酸，从而允许通过突变体或野生型流感B病毒更高效和有效地感染这些细胞。参见，例如，美国专利公开第2010-0021499号和美国专利第7,176,021号。因此，在一些说明性实施方式中，使用经修饰以表达至少一个拷贝的2,6-唾液酸转移酶基因(ST6GAL 1)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和/或Vero细胞。以举例的方式但不以限制的方式，由登录号BC040009.1表示的智人(Homo sapiens)ST6β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶基因序列是可以整合到CHO细胞中和由CHO细胞表达的ST6Gal基因的一个实例。可以将编码功能性ST6Gal I基因产物的一个或多个拷贝的多核苷酸工程化到细胞中。即，可以使用已经稳定转化以表达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或12个以上拷贝的ST6Gal I基因的细胞。单个表达盒可以包括一个或多个拷贝的待表达的ST6Gal I基因，其可操作地连接至调节元件(诸如启动子、增强子和终止子和多腺苷酸化信号序列)以促进ST6Gal I基因或其拷贝的表达。替选地，可以将单个表达盒工程化以表达一个拷贝的ST6Gal I基因，并将多个表达盒整合到宿主细胞基因组中。因此，在一些实施方式中，将至少一个ST6Gal I基因掺入宿主细胞的基因组中，使得该细胞表达ST6Gal I基因及其酶促蛋白质产物。根据拷贝数，单个宿主细胞可以表达许多功能性ST6Gal I基因蛋白。
用于克隆、转染和产生稳定的经修饰的细胞系的合适载体是本领域熟知的。一个非限制性实例包括pcDNA3.1载体(英杰(Invitrogen))。
另外地或替选地，在一些实施方式中，将真核宿主细胞修饰以产生野生型形式的突变体病毒基因，从而反向地向病毒提供基因。例如，当在产生野生型BM2蛋白的宿主细胞中传代时，携带突变体BM2蛋白的病毒株可以表现出增强的生长速率(例如，更高的病毒产生)。在一些实施方式中，携带突变体BM2蛋白的病毒株在不表达野生型BM2基因的细胞中可能不生长或不复制。此外，此类宿主细胞可以减缓或阻止病毒回复到功能性BM2序列，因为例如在这种宿主中没有选择性的回复压力。
用于产生表达载体和经修饰的宿主细胞两者的方法是本领域熟知的。例如，可以通过将以下的BM2核酸序列(BM2 ORF序列；即，“野生型”BM2的起始密码子至终止密码子(表5))定位于真核表达载体中来制备BM2表达载体。
然后可以例如使用可商购获得的试剂和试剂盒，诸如LT1(Mirus Bio，威斯康星州麦迪逊)通过本领域已知的方法转染宿主细胞(例如，MDCK细胞，Vero细胞)。以举例的方式但不以限制的方式，可以通过用可检测的标记或可选择的标记(例如，潮霉素-抗性)共转染和/或通过例如使用BM2抗体用间接免疫染色进行筛选来选择和测试细胞的BM2表达。BM2表达可以通过间接免疫染色、流式细胞术或ELISA测定。
在一些实施方式中，通过本领域熟知的方法培养和繁殖细胞和病毒突变体。以举例的方式但不以限制的方式，在一些实施方式中，宿主细胞在补充有10％胎牛血清的MEM存在下生长。通过用PBS洗涤然后在37℃下吸附病毒，以0.001的MOI感染表达BM2的细胞。在一些实施方式中，加入含有胰蛋白酶/TPCK的病毒生长培养基，并将细胞孵育2天至3天直至观察到细胞病变效应。
沿着这些系(line)，在有或没有病毒的情况下，已经开发了用于哺乳动物细胞的一次性生物反应器系统，其益处包括更快的设施设置和降低的交叉污染的风险。本文所述的细胞例如可以在一次性袋中培养，该一次性袋诸如来自斯泰迪(Stedim)的那些、来自SAFC生物科学(SAFC Biosciences)的Bioeaze袋、来自Cellexus生物系统(CellexusBiosytems)的HybridBagTM、或来自HyClone的一次性生物反应器或来自龙沙(Lonza)的Celltainer。生物反应器可以是1L、10L、50L、250L、1000L尺寸形式。在一些实施方式中，将细胞维持在不含动物产品的优化的无血清培养基内的混悬液。该系统可以是补料分批系统(其中培养物可以在例如1L至10L的单个袋中扩展)，或是灌注系统(其允许持续供应营养物同时避免潜在有毒副产物在培养基中的积累)。
对于长期储存，突变体病毒可以作为冷冻储存物储存。
V.表达BM2的细胞系
A.在表达BM2的细胞底物中M2缺陷型流感A株和BM2缺陷型流感B株的生长
如上所述，BM2是掺入流感B病毒体包膜中的膜内在蛋白。电生理学研究表明，BM2具有质子(H+)离子通道活性作为流感A病毒M2蛋白的功能性对应物。Mould等人，Dev.Cell5:175-184(2003)。流感M2蛋白在流感A病毒和流感B病毒中都是复制所需要的(Watanabe,S.,等人.J.Virol.83:5947-5950(2009))。编码流感A或流感B基因组RNA区段7内的M2离子通道的开放阅读框(ORF)的缺失或突变导致病毒成熟失败，其完全阻断子代颗粒从任何感染细胞中释放。
M2中的失活突变可以通过在经工程化以稳定表达流感A或流感B M2 cDNA的细胞系的基因组内编码的M2蛋白反向地补充。野生型A/PR/8/1934 M2(SEQ ID NO:23)和B/Lee/40BM2(SEQ ID NO:24)cDNA的表达允许M2缺陷型突变体A病毒(M2SR)和BM2缺陷型突变体B病毒(BM2SR)复制。例如，这可以在称为M2CK(FluA)细胞的经修饰的马丁达比犬肾(MDCK)细胞系和采用强合成CAG启动子的BM2CK(FluB)细胞中证实(Miyazaki,J；Takaki,S；Araki,K；Tashiro,F；Tominaga,A；Takatsu,K；Yamamura,K(1989年7月15日)).“Expression vectorsystem based on the chicken beta-actin promoter directs efficient productionof interleukin-5.”.Gene.79(2):269-77)以分别驱动A/PR/8M2和B/Lee/40BM2蛋白的高水平组成型表达。为了确定流感A M2蛋白和流感B M2蛋白是否可以补充M2缺陷型流感A病毒和/或BM2缺陷型B病毒，可以根据本领域已知的方法使用标准的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定(WHO)。
因此，在一些实施方式中，本公开提供了BM2CK细胞系，其支持BM2缺陷型流感B病毒(即BM2SR病毒)和M2缺陷型流感A病毒(即M2SR病毒)的生长。在一些实施方式中，M2中的流感A突变体缺陷型在BM2CK细胞中生长，其中BM2反向地补充。在一些实施方式中，本文所述的BM2CK细胞补充并支持流感A M2缺陷型M2SR病毒株的生长。
在一些实施方式中，BM2中有缺陷的流感B突变体在M2CK细胞中生长，其中M2反向地补充。在一些实施方式中，本文所述的M2CK细胞补充并支持流感B M2缺陷型BM2SR病毒株的生长。
B.嵌合M2蛋白
通过反向遗传学(RG)拯救流感B BM2缺陷型BM2SR病毒需要在接受者细胞底物内反向地提供BM2蛋白。然而，最常用于高效RG的293T细胞缺乏BM2表达。因此，通过提供编码BM2蛋白的第13个质粒以及编码流感复制酶(4)和如前所述使用的基因组RNA(8)的标准12质粒流感RG系统，通常在293T中产生BM2SR病毒。参见，例如，Hatta和Kawaoka，J.Virol.77:6050-6054(2003)；Neumann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9345-9350(1999)。
M2蛋白可以分为三个结构域：1)细胞外或胞外域；2)跨膜(TM)结构域；和3)细胞内细胞质或胞内域(图10)。
流感A M2的细胞外结构域长度为约24个至27个氨基酸，具有已知结构，并且编码14C2表位，相较之下对于未知有抗原性或具有明确定义的结构的BM2结构域仅有6个至9个残基(Cross，Nature Structural&Molecular Biology 16:1207-1209(2009))。流感A M2细胞外结构域的初始9个氨基酸与M1蛋白的N末端相同，因为它们在经差异剪接以产生M2的共有外显子中编码。这种排列不存在于流感B中，因此BM1和BM2不共享蛋白序列同一性。
流感A和B中的跨膜(TM)结构域编码约22个至24个残基长的pH依赖性质子通道，其含有典型的(canonical)19个氨基酸结构，其中具有相同间距的组氨酸和色氨酸残基已被证明是通道功能所需的。流感A M2的TM结构域是治疗性通道抑制剂金刚烷胺的靶标，而BM2不是。
BM2的胞内域长度为约81个至83个氨基酸，长于约47个至51个氨基酸的流感A M2。两种胞内域都是极其亲水的，具有空间上分开的高电荷酸性和碱性区域。实际上，BM2胞内域具有有史以来对蛋白报道的最大偶极矩之一。
在一些实施方式中，本公开提供了如图10所示的呈各种排列的来自流感A M2和流感B BM2的三个结构域的嵌合融合。在一些实施方式中，流感A TM结构域可以分成编码靠近细胞表面的金刚烷胺结合位点的子结构域，和TM结构域的其余部分。这些突变体的结构域结构在图10中给出。在一些实施方式中，提供了组合两种氨基取代S12L和H19C的BM2通道无效(BM2无效；BBB无效)突变体，其已经各自显示消除BM2 H+-通道活性。
表6中提供了用于流感A/PR/8M2、流感B/Lee/40BM2及其嵌合融合蛋白的野生型和嵌合氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开提供了密码子-优化的M2、BM2和嵌合M2蛋白。编码流感A/PR/8M2、流感B/Lee/40BM2、密码子-优化的流感A/PR8/M2、密码子-优化的流感B/Lee/40BM2和其密码子-优化的嵌合融合蛋白的野生型和嵌合cDNA序列提供于表7中。
如本文所述，在一些实施方式中，Vero细胞经修饰以产生野生型A M2蛋白(SEQ IDNO:14)、野生型BM2蛋白(BBB(SEQ ID NO:15))、或BM2嵌合蛋白(例如，ABB(SEQ ID NO:17)、AAB(SEQ ID NO:18)、AA’B(SEQ ID NO:19)、BAB(SEQ ID NO:20)、BBA(SEQ ID NO:21)和BA’B(SEQ ID NO:22))。
用于产生表达质粒和经修饰的宿主细胞(诸如经修饰的Vero细胞)的方法是本领域熟知的。例如，嵌合M2融合蛋白表达质粒可以通过将M2融合蛋白核酸序列(例如，密码子-优化的BBA(SEQ ID NO:32))定位在真核表达质粒中来制备。
然后可以例如使用可商购获得的试剂和试剂盒诸如LT1(Mirus Bio，威斯康星州麦迪逊)通过本领域已知的方法转染Vero细胞。以举例的方式但不以限制的方式，可以通过用可检测的标记或可选择的标记(例如，潮霉素-抗性)共转染和/或通过例如使用BM2抗体用间接免疫染色进行筛选来选择和测试细胞的BM2表达。BM2表达可以通过间接免疫染色、流式细胞术或ELISA测定。
在一些实施方式中，Vero宿主细胞用于产生M2缺陷型流感A M2SR和BM2缺陷型BM2SR疫苗病毒的性能可以通过使用和表达经工程化的M2蛋白来改善，包括来自不同血清型流感A和流感B的M2基因的嵌合融合。例如，在一些实施方式中，表达A M2和BM2嵌合蛋白(例如，ABB(SEQ ID NO:17)、AAB(SEQ ID NO:18)、BAB(SEQ ID NO:20)、BBA(SEQ ID NO:21))的Vero细胞支持流感A M2SR突变体的生长。在一些实施方式中，表达野生型BM2蛋白(BBB(SEQ ID NO:15))的Vero细胞支持流感A M2SR突变体的生长。在一些实施方式中，表达野生型BM2蛋白(BBB(SEQ ID NO:15))的Vero细胞支持流感BM2SR突变体的生长。
C.BM2 Vero细胞支持流感A M2SR突变体的生长
由于它们支持流感病毒快速复制到高滴度的能力，MDCK细胞通常用于流感研究和开发。然而，由于细胞本身已被证明是肿瘤的/致瘤性的，因此难以获得对源自MDCK细胞的任何生物产物的监管批准。另一方面，自20世纪60年代以来，Vero细胞已被批准用于基于细胞的疫苗制造，诸如脊髓灰质炎和MMR疫苗。
在一些实施方式中，本公开提供了Vero细胞系，其可以用作制造M2缺陷型流感A病毒所用的产生细胞。在一些实施方式中，Vero细胞系包含表达BM2蛋白的密码子-优化的野生型流感B/Lee/40BM2核苷酸序列(SEQ ID NO:27)。该Vero细胞系在本文中称为BM2Vero4。在一些实施方式中，M2缺陷型流感A病毒是A/California/07/2009pdm H1N1 M2SR(A/CA/07)，其含有A/California/07/2009pdm的H1和N1区段。流感A M2病毒突变体的cDNA序列在下表8中提供。在一些实施方式中，BM2Vero4细胞产生流感A H1N1 M2SR病毒，其水平基本上等于表达流感A型的M2蛋白的MDCK细胞的水平。
由该突变体产生的M2多肽序列如下：
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD(SEQ ID NO:34)。
D.由BM2 Vero细胞产生的流感A M2SR病毒体的M2蛋白含量
在一些实施方式中，本公开提供了流感A M2SR病毒，其包含从(例如，A/Brisbane/10(SEQ ID NO:33))表达HA和NA的流感A M2SR骨架，其中该病毒不能表达流感A M2蛋白，但含有BM2蛋白，以及其制备方法，如下面的示例中所述。在一些实施方式中，BM2 Vero细胞是从密码子-优化的cDNA(SEQ ID NO:27)表达野生型B/Lee/40BM2蛋白的BM2Vero4细胞。
VI.疫苗和施用方法
A.免疫原性组合物/疫苗
存在各种不同类型的疫苗，其可以由本文公开的基于细胞的病毒产生系统制成。本公开包括但不限于制造和产生减毒活病毒疫苗、单复制疫苗、复制-缺陷型疫苗、病毒载体疫苗、灭活病毒疫苗、全病毒疫苗、分裂病毒疫苗、病毒体病毒疫苗、病毒表面抗原疫苗及其组合。因此，有许多疫苗能够产生对不同流感病毒有特异性的保护性免疫应答，其中这些疫苗类型中的任一种的适当制剂能够产生免疫应答，例如全身性免疫应答。减毒活病毒疫苗具有能够刺激呼吸道内局部粘膜免疫性的优点。
在一些实施方式中，用于本文所述组合物中的疫苗抗原是“直接”抗原，即它们不以DNA而是以抗原本身的形式施用。此类疫苗可以包括整个病毒或仅是病毒的一部分，诸如但不限于病毒多糖，无论它们是单独的还是与载体元件缀合的，该载体元件诸如载体蛋白、减毒活的整个微生物、灭活的微生物、重组肽和蛋白、糖蛋白、糖脂、脂肽、合成肽或破裂的微生物(在疫苗的情况下称为“分裂”疫苗)。
在一些实施方式中，提供了完整的病毒体疫苗。可以将完整的病毒体疫苗通过超滤浓缩，然后通过区带离心或色谱法纯化。通常，使用例如福尔马林或β-丙内酯在纯化之前或之后使病毒体失活。
在一些实施方式中，提供了亚单位疫苗，其包含纯化的糖蛋白。此类疫苗可以如下制备：使用通过用清洁剂处理片段化的病毒混悬液，通过例如超速离心纯化表面抗原。因此，亚单位疫苗主要含有HA蛋白，也含有NA。所用的清洁剂可以是例如阳离子清洁剂(诸如十六烷基三甲基溴化铵)，阴离子清洁剂(诸如脱氧胆酸铵)；或非离子清洁剂(诸如以名称TRITON X100商业化的清洁剂)。血球凝集素也可以在用蛋白酶(诸如菠萝蛋白酶)处理病毒体后分离，然后用标准方法纯化。
在一些实施方式中，提供了分裂疫苗，其包含已经用溶解脂质的试剂处理的病毒体。可以如下制备分裂疫苗：将灭活或未灭活的如上获得的纯化的病毒的含水混悬液在搅拌下用与清洁剂相关的脂质溶剂(诸如乙醚或氯仿)处理。病毒包膜脂质的溶解导致病毒颗粒的片段化。回收含有分裂疫苗的水相，其主要由原始脂质环境被除去的血球凝集素和神经氨酸酶以及核心或其降解产物组成。然后，如果还没有进行灭活，则灭活残留的感染性颗粒。
在一些实施方式中，提供了灭活的流感病毒疫苗。在一些实施方式中，通过使用已知方法(诸如但不限于福尔马林或β-丙内酯处理)灭活病毒来制备灭活的疫苗。可以用于本发明的灭活的疫苗类型可以包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒体(SV)(分裂)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有用溶解含脂质的病毒包膜的清洁剂破坏的纯化病毒，然后化学灭活残留的病毒。
另外地或替选地，在一些实施方式中，提供了减毒活流感病毒疫苗。根据已知的方法步骤，此类疫苗可以用于预防或治疗流感病毒感染。
在一些实施方式中，通过根据已知方法将减毒的基因从减毒的供体病毒转移至分离物或重配的病毒，在一个步骤中实现减毒(参见，例如，Murphy，Infect.Dis.Clin.Pract.2:174(1993))。在一些实施方式中，病毒通过一种或多种病毒核酸序列的突变而减毒，从而产生突变体病毒。例如，在一些实施方式中，突变体病毒核酸序列编码有缺陷的蛋白产物。在一些实施方式中，蛋白产物具有减弱的功能或没有功能。在其他实施方式中，从突变体病毒核酸不产生蛋白产物。
因此，根据已知方法，病毒可以作为免疫原性组合物(例如，作为疫苗)来减毒或灭活、配制和施用以在动物(例如禽类和/或哺乳动物)中诱导免疫应答。用于确定这种减毒疫苗或灭活疫苗是否保持与临床分离物或由其衍生的高生长株的抗原性相似的抗原性的方法是本领域众所周知的。此类已知方法包括使用抗血清或抗体来消除表达供体病毒的抗原决定簇的病毒；化学选择(例如，金刚烷胺或金刚乙胺)；HA和NA活性和抑制；和DNA筛选(诸如探针杂交或PCR)以确认编码抗原决定簇的供体基因(例如HA或NA基因)或其他突变体序列(例如M2)不存在于减毒的病毒中。参见，例如Robertson等人，Giornale di lgiene eMedicina Preventiva，29A(1988)；Kilbourne，Bull.M2 World Health Org.，41:643(1969)；和Robertson等人，Biologicals，20，213(1992)。
在一些实施方式中，疫苗包含缺乏功能性BM2蛋白表达的重组流感病毒。在一些实施方式中，突变体病毒在表达BM2蛋白的细胞中复制良好，但在相应的野生型细胞中，表达病毒蛋白，不产生感染性子代病毒体。
适用于真皮内施用、接种或用于肠胃外或经口施用的本发明的药物组合物包含减毒流感病毒或灭活流感病毒，并且还可以任选地包含无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。该组合物还可以包含如本领域已知的辅助剂或赋形剂。参见，例如Berkow等人，TheMerck Manual，第15版，Merck and Co.，纽约州拉威(1987)；Goodman等人编辑，Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第八版，Pergamon Press，Inc.，纽约州埃尔姆斯福德(1990)；Avery’s Drug Treatment:Principles and Practiceof Clinical Pharmacology and Therapeutics，第三版，ADIS Press，LTD.，Williams andWilkins，马里兰州巴尔的摩(1987)；和Katzung编辑，Basic and Clinical Pharmacology，第五版，Appleton and Lange，康涅狄格州诺沃克(1992)。
在一些实施方式中，用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和/或乳液，其可以含有本领域已知的辅助剂或赋形剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。载体或封闭敷料可以用于增加皮肤渗透性和增强抗原吸收。用于经口施用的液体剂型可以一般包含含有液体剂型的脂质体溶液。悬浮脂质体的适合形式包括含有本领域常用的惰性稀释剂(诸如纯净水)的乳液、混悬液、溶液、糖浆和酏剂。除惰性稀释剂外，此类组合物还可以包含佐剂、润湿剂、乳化剂和助悬剂，或甜味剂、调味剂或芳香剂。
当本发明的组合物用于对个体施用时，它还可以包含盐、缓冲剂、佐剂或其他对提高组合物功效所期望的物质。对于免疫原性组合物或疫苗，可以使用佐剂(增强特定免疫应答的物质)。通常，佐剂和组合物在呈递给免疫系统之前混合，或单独呈递，但进入被免疫的生物体的相同位点。
在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物(例如疫苗)包含多种不同类型的病毒或病毒抗原，其中至少一种包含突变体BM2基因(例如，包含BM2SR-1(SEQ ID NO:1)、BM2SR-2(SEQ ID NO:2)、BM2SR-3(SEQ ID NO:3)、BM2SR-4(SEQ ID NO:4)或BM2SR-5(SEQID NO:5)突变的病毒)。
在一些实施方式中，疫苗包含病毒，所述病毒包含BM2SR-1(SEQ ID NO:1)、BM2SR-2(SEQ ID NO:2)、BM2SR-3(SEQ ID NO:3)、BM2SR-4(SEQ ID NO:4)或BM2SR-5(SEQ ID NO:5)突变以及其他病毒组分和/或表达其他病毒组分的基因。在一些实施方式中，疫苗(例如，包含BM2SR-1(SEQ ID NO:1)、BM2SR-2(SEQ ID NO:2)、BM2SR-3(SEQ ID NO:3)、BM2SR-4(SEQ ID NO:4)或BM2SR-5(SEQ ID NO:5)突变的病毒)包含来自其他病毒株的基因，包括但不限于例如来自其他病毒株的HA和NA基因。在一些实施方式中，疫苗包含例如来自B/Florida/04/2006、B/Brisbane/60/2008、B/Wisconsin/01/2010或B/Lee/1940病毒的HA和NA基因。
根据本发明的药物组合物可以进一步或另外包含至少一种化学治疗化合物(例如用于基因疗法)、免疫抑制剂、抗炎剂或免疫刺激剂，或抗病毒剂，包括但不限于γ球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦酰乙酸、阿昔洛韦、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。
该组合物还可以含有可变但少量的无内毒素的甲醛和防腐剂，已发现所述甲醛和防腐剂是安全的并且不会对施用本发明的组合物的生物体产生不良作用。
B.施用
如本文公开的免疫原性组合物(例如，疫苗)可以经由常规使用或推荐用于疫苗的任何途径施用：肠胃外途径，粘膜途径，并且可以呈各种形式：可注射或可喷雾的液体，已经冷冻干燥或通过雾化或风干等干燥的制剂等。疫苗可以通过用于肌内、皮下或真皮内注射的注射器或无针注射器施用。疫苗还可以通过雾化器施用，所述雾化器能够将干粉或液体喷雾递送至粘膜，无论它们是经鼻、经肺、经阴道还是经直肠。
如本文所公开的疫苗可以通过被动免疫或主动免疫赋予对一种或多种流感株的抗性。在主动免疫中，将灭活疫苗组合物或减毒活疫苗组合物预防性地施用给宿主(例如哺乳动物)，并且宿主对施用的免疫应答保护其免受感染和/或疾病。对于被动免疫，可以回收引发的抗血清并将其施用给疑似患有由至少一种流感病毒株引起的感染的接受者。
因此，本发明包括用于预防或减轻疾病或病症(例如至少一种流感病毒株的感染)的方法。如本文所用，如果疫苗的施用导致疾病的症状或病症全部或部分减弱(即，抑制)或者个体对疾病的全部或部分免疫，则称疫苗预防或减轻疾病。
本发明的至少一种灭活流感病毒或减毒流感病毒或其组合物可以通过使用如前所述的药物组合物达到预期目的的任何方式施用。例如，此类组合物的施用可以通过各种肠胃外途径，诸如皮下、静脉内、真皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经口或透皮途径进行。肠胃外施用可以通过团注注射或通过逐渐输注随时间推移进行。在一些实施方式中，如本文所公开的免疫原性组合物通过肌内或皮下施加进行。
在一些实施方式中，用于预防、抑制或治疗流感病毒相关的病理的方案包括在多达并包括一周至约24个月或其中的任何范围或值的一段时间内施用有效量的如本文所述的疫苗组合物，作为单一治疗施用，或作为增强或加强剂量重复施用。在一些实施方式中，每年施用如本文公开的流感疫苗。
根据本发明，疫苗组合物的“有效量”是足以实现所期望生物效应的量。据了解，在一些实施方式中，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康和体重，同时治疗的种类(如果有的话)，治疗频率以及所想要效果的性质。下面提供的有效剂量范围不意在是限制性的，并且代表示例性剂量范围。因此，在一些实施方式中，剂量将为个体对象定制，如本领域技术人员所理解和确定的。用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约101个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约102个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约103个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约104个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约105个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约106个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约107个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约108个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约109个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是约109个至1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg，或其中的任何范围或值。在一些实施方式中，用于哺乳动物(例如人)成年的减毒的病毒疫苗的剂量可以是大于1010个噬菌斑形成单位(PFU)/kg。灭活疫苗的剂量的范围可以为约0.1μg至200μg、例如50μg血球凝集素蛋白。然而，使用现有的疫苗作为起点，如通过常规方法测定的所述剂量应该是安全且有效的量。
C.皮内递送
活的流感疫苗传统上是鼻内递送的，以模拟天然的感染途径并促进与天然的病毒感染的免疫应答类似的免疫应答。作为替代方案，本文公开了真皮内递送方法，其涉及使用新型微针装置以利用真皮内递送的免疫学益处。在一些实施方式中，减毒的病毒(例如，BM2病毒突变体)用于真皮内施用的疫苗组合物中。在一些实施方式中，在疫苗中提供了不产生感染性子代病毒的BM2病毒突变体。因此，几乎消除了与野生型流行流感病毒重配的任何潜力。
在本文公开的实施方式中，真皮内递送(皮内)将疫苗施用至皮肤。在一些实施方式中，使用微针递送装置进行真皮内递送。如本文所公开的，真皮内递送具有许多优点。例如，通过触发皮肤免疫系统的免疫潜力来增强疫苗的免疫原性。疫苗直接进入皮肤的有效抗原呈递树突细胞，即表皮朗格汉斯细胞和真皮树突细胞。皮肤细胞产生促炎信号，其增强对通过皮肤引入的抗原的免疫应答。此外，皮肤免疫系统产生抗原特异性抗体和细胞免疫应答。真皮内递送允许疫苗剂量节省，即，当皮内地递送时，根据上述因素，较低剂量的抗原可以是有效的。
并且，由于疫苗通过装置的微针阵列递送至皮肤，因此减少了意外针刺的风险，并且与使用传统针头和注射器的肌内注射相比，经由微针阵列的皮内疫苗递送相对无痛。
微针装置是本领域已知的，是本领域已知的，包括例如在公开的美国专利申请2012/0109066、2011/0172645、2011/0172639、2011/0172638、2011/0172637和2011/0172609中描述的那些。微针装置可以例如通过湿法蚀刻由不锈钢板(例如，三一品牌产业(Trinity Brand Industries)，乔治亚洲；SS 304；50μm厚)制造来制成。在一些实施方式中，各个微针的长度在约500μm至1000μm之间，例如约750μm，并且宽度在约100μm至500μm之间，例如约200μm。然后可以将疫苗作为涂层施加到微针上。以举例的方式但不以限制的方式，涂层溶液可以包括1％(w/v)羧甲基纤维素钠盐(低粘度，USP级；Carbo-Mer，加州圣地亚哥)、0.5％(w/v)Lutrol F-68NF(BASF，纽约州橄榄山)和抗原(例如，5ng/ml的可溶性HA蛋白；减毒活病毒，诸如本文所述的M2和BM2突变体病毒等)。为了达到更高的疫苗浓度，可以在室温(约23℃)下将涂层溶液蒸发5分钟至10分钟。涂覆可以通过浸涂工艺进行。每排微针的疫苗量可以通过将微针浸入200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中5分钟并通过本领域已知的方法测定抗原来确定。
在一些实施方式中，使用主要由通过简单的卡扣配合和热密封件配合在一起的聚丙烯和不锈钢第一切割件制成的微针装置。在一些实施方式中，所述装置是完全独立的并且包括疫苗、泵机构、激活机构和微针单元。这些组件隐藏在塑料盖内。使用该装置，通过按下致动按钮启动疫苗输注。同时按下按钮将微针插入到皮肤中并启动对主药物容器施加压力的泵送机构。当弹簧机构在疫苗贮存器上施加足够的压力时，疫苗开始流过微针阵列并进入皮肤。在一些实施方式中，在装置制动后约2分钟内完成疫苗剂量的递送。输注完成后，将该装置从皮肤轻轻取出。
在一些实施方式中，提供使用微针装置的用于皮内施用免疫原性组合物(例如疫苗)的方法。在一些实施方式中，微针装置包括穿刺机构和包括多个微针的免疫原性组合物层，所述微针能够穿刺皮肤并允许皮内地施用免疫原性组合物。在一些实施方式中，该方法包括按压穿刺机构。在一些实施方式中，免疫原性组合物(例如疫苗)包含病毒，所述病毒包含编码经表达的突变体BM2蛋白或者未表达的突变体BM2蛋白的核酸序列；其中，经表达的突变体BM2蛋白包含以下或由以下组成：由选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方式中，微针阵列最初定位在装置壳体内部，并且在致动控制杆后允许微针延伸穿过装置底部并插入皮肤中，从而允许将疫苗流体输注至皮肤中。
本文所述的递送装置可以用于递送任何可能期望的物质。在一个实施方式中，待递送的物质是药物，并且递送装置是配置成将药物递送至对象的药物递送装置。如本文所用，术语“药物”旨在包括为了任何治疗、预防或医学目的而递送给对象的任何物质(例如，疫苗、药物、营养物、营养品等)。在一个此类实施方式中，药物递送装置是配置成向对象递送一剂疫苗的疫苗递送装置。在一个实施方式中，递送装置配置成递送流感疫苗。本文讨论的实施方式主要涉及配置成透皮递送物质的装置。在一些实施方式中，该装置可以配置成将物质直接递送到除皮肤之外的器官。
实施例
提供以下实施例仅是为了说明而不是为了限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相同或相似结果。所述实施例绝不应该被解释为限制由所附权利要求限定的本技术的范围。
实施例1：BM2病毒突变体的产生
基于B/Florida/4/2006区段7(图2)设计了一系列五种新型BM2无效突变体构建体(BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4和BM2SR-5)，然后将其使用本领域已知的标准技术合成为适合于标准体外基因-组装程序的双链DNA片段。构建体BM2SR-1(SEQ ID NO:1)、BM2SR-2(SEQ ID NO:2)、BM2SR-3(SEQ ID NO:3)、BM2SR-4(SEQ ID NO:4)和BM2SR-5(SEQID NO:5)的单链mRNA或正义DNA核苷酸序列提供于表1中。
实施例2：BM2突变体病毒的产生和培养
该实施例证明了基于包含BM2SR-1(SEQ ID NO:1)、BM2SR-2(SEQ ID NO:2)、BM2SR-3(SEQ ID NO:3)、BM2SR-4(SEQ ID NO:4)或BM2SR-5(SEQ ID NO:5)突变的B/Florida/04/2006区段7和B/Lee/1940对照、BM2-缺失的区段7来培养BM2SR突变体。突变体病毒(诸如携带突变体BM2核酸的那些)可以通过如Neumann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:9345-9350(1999)描述的基于质粒的反向遗传学来产生。简而言之，用编码八种病毒RNA(对应于八种流感B区段中的每一种)的一种或多种质粒转染293T宿主细胞。每个病毒RNA序列侧接有RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子。值得注意的是，编码BM2蛋白的病毒RNA包括突变体BM2核酸序列。宿主细胞另外用一种或多种编码病毒蛋白(例如聚合酶、核蛋白和结构蛋白，包括野生型BM2蛋白)的表达质粒转染。
将质粒与转染试剂(2μL的Trans LT-1(Mirus，威斯康星州麦迪逊)/μg DNA)混合，在室温下孵育15分钟至30分钟，并加入到1x106个293T细胞。48小时后，将上清液中的病毒连续稀释并接种到BM2CK细胞中。接种后2天至4天，将其中细胞显示清楚的细胞病变效应(CPE)的最后一个稀释孔的上清液中的病毒接种到BM2CK细胞中以产生储备病毒。对所产生的病毒的M基因测序，以确认所述基因和预期突变的存在，并确保不存在不需要的突变。
将突变体BM2病毒如下生长和传代。将BM2CK宿主细胞在补充有10％胎牛血清的MEM存在下生长。通过用PBS洗涤，然后在37℃下吸附病毒，以0.001的MOI感染细胞。加入含有胰蛋白酶/TPCK的病毒生长培养基，并将细胞孵育2天至3天直至观察到细胞病变效应。
构建表4中描述的十二种BM2缺陷型流感B BM2SR突变体病毒。如表4所示的B/FL/4/2006-1、B/FL/4/2006-2、B/FL/4/2006-3、B/FL/4/2006-4和B/FL/4/2006-5分别对应于BM2SR-1、BM2SR-2、BM2SR-3、BM2SR-4和BM2SR-5。
实施例3：BM2SR病毒蛋白表达
该实施例证明了由表4中描述的12种BM2缺陷型流感B BM2SR病毒表达的蛋白。
将Vero细胞(200,000)在含有10％胎牛血清(FCS)的MEM培养基中在TC-12平板孔中培养24小时。用D-PBS洗涤两次后，将Vero细胞以1.0的高感染复数用12个构建的B/Florida/4/2006BM2SR-1至BM2SR-5和B/Lee/40BM2SR突变体病毒连同两个野生型病毒对照B/Lee/1940和B/Florida/4/2006感染。在35℃，5％CO2气氛中孵育6小时以允许单轮复制后，收获样品用于蛋白质分析。
在含有蛋白酶抑制剂的50mM Tris-HCl pH 8.0，300mM NaCl，1％Triton X-100中温和裂解经感染的细胞。通过以14,000×G离心来使核和不溶性碎片成丸。在含4％至12％梯度丙烯酰胺凝胶的MES缓冲液(英杰(Invitrogen))中，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)之前，使澄清的上清液变性并还原。通过半干燥装置将解析的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜7分钟。在具有含3％脱脂奶粉(NFDM)的0.1％吐温20(PBS-T)的磷酸盐缓冲盐水中封闭PVDF。
通过对两种流感B抗原HA和M1及细胞底物对照蛋白甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)具有特异性的抗血清，在1％NFDM，PBS-T中检测到蛋白。通过三种1000:1稀释的单克隆抗体(sc-101353，sc-101408，sc-101409；圣克鲁兹生物技术(Santa Cruz Biotechnology))和2000:1稀释的二级抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物的一级抗体混合物检测到流感B M1。通过2000:1一级多克隆山羊抗HA血清(NR-3120，BEI)和2000:1二级抗山羊IgG-HRP缀合物检测到流感B血球凝集素蛋白(HA)。通过GAPDH(NBlOO-56875，Novusbio)的一级多克隆抗血清和2000:1二级抗兔IgG-HRP缀合物检测到对照GAPDH。使用显色HRP底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)检测特异性条带。
图4中提供的结果表明流感B/Lee/40M1和HA表达小于B/FL/4/2006的表达。类似地，B/Lee/40BM2SR病毒在B/Brisbane/60/2008和B/WI/01/2010HA:NA背景中表达低水平或不可检测的M1和HA蛋白。在BM2SR-1中将BM2SR区段从B/Lee/1940改变为B/Florida/4/2006似乎增加了M1和HA蛋白两者的量。从BM2SR-2突变中未观察到增加。BM2SR-3突变M1 M86V具有非常大的作用，增加了M1和HA表达。与B/Lee/40对照相比，BM2SR-4突变也提高了表达。与完全缺失株相比，BM2SR-5中突变的最终组合还产生M1和HA表达的大提高。这些结果还表明，根据图2的方案破坏BM2表达可以破坏BM1蛋白表达。
实施例4：BM2SR病毒复制
该实施例证明了表4中描述的12种BM2缺陷型、流感B BM2SR病毒的生长动力学。
在BM2Vero(组成型表达B/Lee/40BM2蛋白的Vero来源的细胞系)中测试构建的流感BM2SR病毒的病毒生长动力学。将BM2Vero细胞在P-060培养皿内在含有10％胎牛血清(FCS)的MEM培养基中培养24小时。通过添加1微克/毫升甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮处理的胰蛋白酶(T-TPCK)对12种病毒进行一式三份的MOI为0.001的病毒感染。此外，每天加入T-TPCK一次，持续3天(感染后第1、2、3天)，总加入量为4微克/毫升。将感染物在35℃，5％CO2下孵育。以两天的间隔(感染后第2、4、6、8天)，对含有分泌的流感B病毒的感染的Vero细胞组织培养物上清液进行无菌取样，并将等分试样在-80℃下冷冻储存。在完成生长曲线后，使用BM2CK细胞(表达BM2蛋白的MDCK细胞)通过标准50％组织培养抑制剂量(TCID50)测定来滴定冷冻的等分试样。使用标准的世界卫生组织血细胞凝集测定和分析(WHO HA测定)确定来自给定稀释度的生产性感染。计算每个时间点的每种病毒的一式三份TCID50测定的平均值和标准偏差。结果在图5A和图5B中给出。
图5A中给出的表达来自B/Brisbane/60/2008的HA和NA的六种病毒的生长曲线表明几乎全长的突变体BM2SR-4，并且尤其是M1 M86V突变体BM2SR-3和BM2SR-5指导更快的病毒生长并达到更高的最终滴度。当与突变体BM2SR-3中的BM2SR-2突变和BM2SR-5突变体中的BM2SR-4突变组合时，M1 M86V突变似乎改善了BM2Vero4细胞底物中的病毒生长。最佳突变体株BM2SR-5在BM2Vero细胞底物中达到7.50log10±0.1log10 TCID50当量/mL的最终滴度。当与B/Brisbane/60HA和NA组合时，与B/Lee/1940BM2SR株TCID50值为2.42log10±0.39log10 TCID50当量/mL相比，B/FL/04 2006BM2SR-3、B/FL/04 2006BM2SR-4、B/FL/042006BM2SR-5突变赋予从2log 10增加至超过5log 10的产量改善。
具有来自B/Wisconsin/01/2010的HA和NA的流感B株的生长更均匀(图5B)。在生长曲线的第4天，可以注意到BM2SR-2、BM2SR-3和BM2SR-4突变体的约100.5TCID50/mL的细微改善。到第6天，差异消失，并且最终滴度在统计学上相似。因此，在含有来自B/Wisconsin/01/2010的HA和NA的病毒的情况下，工程化的BM2SR构建体、尤其是BM2SR-4和BM2SR-5仅能略微改善病毒生长动力学，但对最终病毒的产率影响较小。给定病毒的性能取决于给定株的HA和NA群集。
实施例5：BM2SR变体的稳定性
为了测试野生型细胞中BM2SR变体的BM2基因的稳定性，将BM2SR变体在缺乏BM2蛋白表达的野生型MDCK细胞中连同BM2CK细胞(其为表达BM2蛋白的MDCK细胞)一起传代。所有BM2SR变体和野生型流感B病毒(WT B/WI01)均在BM2CK细胞中可传代而没有任何突变，直到至少第10代(图6A)。然而，BM2SR变体不能在野生型MDCK细胞中传代(图6B)。
实施例6：BM2突变体病毒在体内是减毒的
进行实验以证明BM2SR突变体病毒在体内是减毒的。用以下突变体中的一者鼻内接种6周龄BALB/c雌性小鼠：BM2SR Bris60和BM2SR WiscO1(两者均含有来自如SEQ ID NO:6所示的B/Lee/40的突变体M区段(BM2SR-0))。突变体以每只小鼠1.2xl06 TCID50的剂量施用。向对照组小鼠给予PBS。在接种后持续14天观察小鼠的体重和感染症状的任何变化。
如图7所示，接种BM2SR病毒和PBS的小鼠在14天期间未显示任何临床感染症状，也未丧失任何体重。在14天的时间段内，各组之间体重的变化相当。总之，缺乏临床症状和缺乏体重减轻表明BM2SR突变体病毒在小鼠中是减毒的并且不是致病性的。
实施例7：BM2突变体诱导针对流感B病毒攻击的抗体
进行测试以确定来自上述小鼠的血清样品中针对两种流感B谱系Yamagata和Victoria的抗体滴度。在初免接种后第7天、第14天和第21天以及第28天第二次免疫后第35天、第42天和第49天采集血清样品。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)，针对B/Wisconsin/01/2010和B/Brisbane/60/2008测定血清样品中的抗HA IgG抗体滴度。体液应答如图8A至图8B所示，其显示包含来自B/Lee/40的M区段且具有M2的缺失的BM2SR突变体(SEQ ID NO:6；BM2SR-0)，将抗-流感病毒抗体提高至高于对照PBS组(针对两种抗原)。BM2SR突变体病毒加强的小鼠在第二次免疫后具有比初免剂量后更高水平的抗流感HA抗体。
实施例8：表达BM2的细胞底物中M2缺陷型流感A株和BM2缺陷型流感B株的生长
使用标准的50％组织培养感染剂量(TCID50)测定法(WHO)，进行实验以测试流感AM2和流感B BM2补充M2缺陷型流感A(A/CA/07M2SR和A/Brisbane/10M2SR，两者都包含如SEQID NO:33中所示的M2突变体)病毒和M2缺陷型流感B(B/WI/01BM2SR-0和B/Brisbane/60BM2SR-0)病毒的能力。在96孔组织培养板中制备的汇合的单层M2CK和BM2CK细胞一式四份地用来自10倍稀释系列的四种流感病毒的0.2mL感染：2种稀释液由流感A M2SR制备，并且2种稀释液由流感B BM2SR病毒株制备。在35℃，5％CO2气氛下孵育4天后，在终点使用细胞病变效应和红细胞血凝测定(HA)(WHO)来测试培养上清液的流感复制。然后使用其中从每个重复感染中观察到流感复制的最高稀释因子来确定具有图9中所示的四种病毒的两种细胞系的每种感染的log10 TCID50值。
令人惊讶的是，BM2CK细胞底物能够同样地补充流感A M2缺陷型M2SR病毒株以及血清型匹配的M2CK细胞(图9)。含有源自人流感H1N1和H3N2的两种常见HA NA亚型的表面抗原的M2SR病毒都能够复制至约7.0的相等log10 TCID50值。相比之下，M2CK细胞中的流感AM2蛋白仅不充分地支持所测试的BM2缺陷型流感B BM2SR株的复制，产生的TCID50滴度比类型匹配的BM2CK细胞提供的滴度低约3个log10。这表明流感B M2蛋白可以替代流感A蛋白，并且可以支持来自两种亚型的流感A病毒的复制。相比之下，流感A M2蛋白似乎不能代替BM2蛋白用于流感B复制。
实施例9：嵌合M2蛋白
为了测试嵌合M2蛋白的功能，通过典型的基因组装程序将融合构建体插入含有CMV IE启动子和牛生长激素多腺苷酸化转录控制序列的标准质粒中，用于在培养的哺乳动物细胞中高水平表达。还构建了野生型M2和BM2 cDNA表达质粒。此外，将野生型BM2 cDNA序列插入pCAGGS启动子终止子质粒中以获得尽可能最高的水平表达-甚至大于CMV。质粒用于在流感B BM2SR病毒的反向遗传学(RG)中提供M2功能。通过将1％的293T-RG-产生的病毒接种到受体BM2CK细胞的96个独立孔中以恢复BM2缺陷型子代来估计RG的效率。在35℃，5％CO2下孵育4天后，通过标准血细胞凝集测定(WHO HA)测试BM2CK培养物上清液的病毒复制。将成为WHO HA阳性的孔的百分比绘制在图11中。
BM2无效突变不支持RG，证实了在流感复制中对M2质子通道活性的需求。野生型流感A M2也不支持复制。嵌合M2蛋白(ABB和AA’B)含有流感A M2胞外域(M2e)，几乎与缺乏M2e的野生型BM2或BA’B突变体一样不支持RG，表明流感A胞外域结构域是抑制性的。组合数据表明流感B胞内域是流感B复制所必需的，而流感A跨膜(TM)结构域可以取代BM2的TM。与标准CMV启动子相比，从pCAGGS载体表达增加改善了野生型BM2 cDNA的性能，表明BM2的总表达水平也可以限制于RG。
实施例10：野生型和嵌合M2蛋白表达BM2蛋白的能力
当从细胞底物基因组表达时，测试M2蛋白的支持M2缺陷型和BM2缺陷型病毒生长的能力。用编码M2和嵌合突变体的质粒以及赋予对蛋白合成的氨基糖苷抑制剂G418的抗性的新霉素磷酸转移酶(neo)基因来化学转染Vero细胞。
培养两天后，将转染的细胞解离并重新涂铺于含有G418的培养基中。在G418选择下培养细胞数周，以选择将质粒DNA随机整合到细胞系基因组中的克隆。一部分G418-抗性克隆也将含有M2嵌合突变体转基因的功能性整合拷贝。然后可以测试这些功能性克隆支持病毒选择的能力。可以从批量选择的G418-抗性克隆池或从使用标准稀释克隆限制(LDC)程序来选择和分离的单个克隆中测试复制。克隆池的分析提供了在生长的几周内对构建体的性能的测量，而LDC需要长得多的时间。然而，重要的是需要几轮LDC来分离适合于人使用的疫苗的调节生产的细胞底物。
在使用野生型和突变体cDNA质粒两者多轮选择和LDC后，未分离出表达高水平BM2的合适克隆(数据未显示)。蛋白质分析显示在培养细胞每次传代后检测到的BM2的量迅速减少。早期传代克隆池M2SR和BM2SR病毒复制数据表明构建体是功能性的，但是在Vero细胞中未建立来自细胞基因组的构建体的稳定表达。对流感编码的基因序列的分析表明它们是60％A-T，并且病毒密码子使用偏倚与宿主Vero显著不同。此外，在天然病毒基因编码区内鉴定了可以沉默或遏制转录的多个序列基序。当将来自一种生物体的基因转移到另一种生物体中时，这种现象很常见，但对于流感病毒可能会被低估。虽然病毒必须在人细胞中复制，但流感不使用与宿主相同的密码子使用模式。
为了增加野生型M2、BM2和嵌合突变体的表达，进行编码序列的密码子优化以除去负调节基序，使cDNA为约50％A-T，并且将基因从流感改为Vero细胞密码子偏倚。通过化学介导的Vero细胞转染测试这些构建体。转染后两天，评价蛋白的瞬时表达。使用对BM2有特异性的多克隆抗血清通过免疫印迹来分析总细胞蛋白提取物。图12中的数据显示来自设计的转基因的蛋白表达比先前在天然序列(天然未显示)的瞬时测定中获得的高得多。值得注意的是，由于抗BM2抗血清针对BM2胞内域，因此无法检测到BBA突变体。
实施例11：测试嵌合的密码子-优化的M2蛋白支持M2缺陷型病毒生长和BM2缺陷型 病毒生长的能力
测试密码子优化的嵌合M2蛋白的支持M2缺陷型病毒生长和BM2缺陷型病毒生长的能力。用编码密码子-优化的M2嵌合突变体的质粒以及赋予对蛋白合成的氨基糖苷抑制剂G418的抗性的新霉素磷酸转移酶(neo)基因对Vero细胞化学转染。培养两天后，将转染的细胞解离并重新涂铺于含有G418的培养基中。将细胞在G418下培养2周，以选择将质粒DNA随机整合到细胞系基因组中的克隆。一部分的G418抗性克隆也将含有M2嵌合突变体转基因的功能性整合拷贝。将用BM2和嵌合体转染并批量选择的克隆池用流感A/Brisbane/10M2SR(包含如SEQ ID NO:33中所示的M2突变体)和流感B/Brisbane/60BM2SR-0(包含如SEQ IDNO:6中所示的BM2突变体)M2缺陷型病毒以0.01的MOI转染。感染后6天，使用标准TCID50程序测量培养物上清液中的病毒滴度，并且数据显示在图13中。
测试的所有M2克隆池支持Vero细胞中的流感A M2SR生长。只有野生型BM2(BBB)克隆池支持流感B BM2SR的生长。因此，所有三个BM2结构域似乎对Vero细胞中的流感B BM2SR复制具有特异性。发现表达缺乏流感A M2e和跨膜(TM)结构域但含有M2胞内域的BBA突变体的克隆池在支持流感A M2SR生长方面是最佳的。BM2胞内域不那么有效，这表明M2胞内域已经进化到有点流感A特异性。ABB和AAB嵌合突变体表现出比BAB和BBA构建体更差的表现，表明流感A胞外域可以抑制病毒生长，即使对于流感A本身也是如此。可以除去抑制区域，包括但不限于M2e，并且可以添加增加复制和滴度的经修饰的区域。
因此，通过使用和表达工程化的M2蛋白，包括来自完全不同的血清型流感A和流感B的M2基因的嵌合融合，可以改善用于产生M2缺陷型流感A M2SR病毒和BM2缺陷型BM2SR疫苗病毒的细胞底物的性能。
实施例12：M2缺陷型流感A/California/07/HlNlpdm M2SR在表达BM2的Vero细胞 底物中的生长
A/California/07/2009pdm H1N1 M2SR(A/CA/07)是含有A/California/07/2009pdm的H1和N1区段并且包含如SEQ ID NO:33中所述的M2突变体的M2缺陷型流感A病毒。在正常细胞中不能复制的该疫苗候选病毒用于感染组成型表达2种类型的M2蛋白的2种细胞系。第一种M2细胞底物是MDCK谱系标准细胞系M2CK，其表达A/PR8 M2蛋白(由SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列编码)。MDCK细胞通常用于流感研究和开发，因为已知它们支持流感病毒在培养中快速复制到高滴度。不幸的是，很难获得任何来自MDCK的生物产物的监管批准，因为MDCK细胞本身已显示是致癌的。第二种细胞系BM2Vero4含有密码子-优化的野生型流感B/Lee/40BM2蛋白(由SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列编码)，但它来源于非洲绿猴肾细胞系Vero。自20世纪60年代以来，Vero细胞底物已被用于批准的基于细胞的疫苗制造(脊髓灰质炎和MMR疫苗)。
病毒感染在补充有0.3％BSA和1.0微克/毫升胰蛋白酶-TTPK的最小必需培养基(MEM)中以两个感染复数(MOI)水平(0.01和0.001)进行。从接种后第2天至第6天每天取出等分试样。将细胞培养物上清液样品中包含的活流感A病毒的浓度使用标准TCID50测定法测定，在35℃，5％CO2下与流感A M2SR-允许的M2CK细胞和BM2Vero4细胞一起孵育4天。结果如图14所示。
正如预期的那样，流感A/CA/07/2009pdm M2SR在M2CK细胞中充分地复制，在第2天时间点迅速达到峰值滴度。Vero谱系中的滴度需要5天到6天才能达到峰值。与用M2CK细胞获得的log107.00和6.33的病毒滴度相比，A/CA/07在BM2Vero细胞中增长至log10 5.67和6.00的滴度。尽管BM2Vero4来源于Vero细胞系，但与MDCK细胞相比，其对流感复制的允许程度要低得多，因此可以看到这种情况。
因此，在Vero细胞中表达密码子-优化的流感B/Lee/40BM2蛋白(由SEQ ID NO:27中所示的核苷酸序列编码)在几乎相当于表达流感A形式的M2蛋白的R&D品质MDCK细胞底物的水平下实现了流感A H1N1 M2SR病毒的产生。
实施例13A：流感BM2蛋白可以提供病毒脱壳至嵌合流感A M2SR病毒所必需的离子 通道活性。
虽然M2SR不表达M2蛋白并因此不能产生子代病毒体，但M2SR确实经历了从头蛋白合成并在正常细胞中产生病毒抗原。该实施例证明流感BM2蛋白可以提供病毒脱壳至嵌合流感A M2SR病毒(即，在互补BM2细胞系中产生的流感A M2SR病毒，导致BM2蛋白掺入病毒膜中)所必需的离子通道活性。
为了证明这一点，流感A M2SR Hong Kong/4801/2014(H3N2)病毒在表达流感A M2的M2VeroA细胞中传代3次，并且嵌合M2SR Hong Kong/4801/2014(H3N2)在表达流感B BM2的BM2Vero细胞中传代3次。然后将人A549、犬MDCK或非洲绿猴Vero细胞用M2SR或嵌合M2SR病毒以4的MOI接种，并在不含胰蛋白酶的培养基中培养，以确保病毒仅完成一个生命周期。
在感染后(p.i.)第6小时、第9小时和第12小时的时间点进行细胞的粗细胞质提取。将细胞在50mM Tris HC1，pH＝8.0，150mM NaCl，1％Triton X-100中裂解，然后以15,000x G离心。将上清液中的可溶性蛋白与LDS样品缓冲液(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)，马塞诸塞州沃尔瑟姆)和5mM TCEP合并，并通过加热至70℃10分钟使其变性。在MES缓冲液中，在4％至12％变性的Bis-Tris NuPAGE聚丙烯酰胺凝胶(赛默飞世尔科技，马塞诸塞州沃尔瑟姆)上分离蛋白质并将其转移到PVDF膜。将预染色的蛋白分子量标准品跑样以比较大小。将膜在1％(w/v)脱脂奶粉中封闭，并与一级抗流感病毒基质蛋白多克隆山羊抗血清NR-3134(BEI Resources，美国国立卫生研究院国立变态反应与传染病研究所)以2000:1稀释度一起孵育，然后与二级辣根过氧化物酶-缀合的抗山羊IgG(H+L)(SeraCareKPL，马塞诸塞州米尔德福)以3000:1稀释度一起孵育。使用TMB膜过氧化物酶底物(SeraCare KPL，马塞诸塞州米尔德福)使条带可视化。针对M1基质蛋白的多克隆抗血清检测到M2SR和嵌合M2SR病毒的28kDal分子量蛋白的非常相似的表达，在所测试的所有三种细胞系中具有几乎相同的约9小时的诱导动力学(图15A)。
实施例13B：在互补BM2细胞系中产生的嵌合流感A M2SR病毒中可以检测到仅流感 B BM2蛋白并检测不到流感A M2蛋白。
除非病毒在表达流感A M2蛋白或流感B BM2蛋白的支持细胞系中繁殖，否则M2SR不能产生子代病毒粒子，因为M2SR不能表达M2蛋白。该实施例证明，在互补的BM2细胞系中产生的嵌合流感A M2SR病毒导致在病毒膜中仅掺入BM2蛋白。在互补M2细胞系中生长的M2SR病毒仅含有M2蛋白。
为了证明这一点，将流感A M2SR Brisbane/10/2008(H3N2)病毒在表达流感A M2的M2CK细胞中传代，并且将嵌合M2SR Brisbane/10/2008(H3N2)在表达流感B BM2的BM2Vero细胞中传代3次(在含有0.3％BSA的MEM培养基中)。通过离心澄清培养物上清液。用Benzonase(Novagen EMD，Merck KGaA，德国达姆施塔特)或SAN(Articzymes，挪威特罗姆瑟)核酸酶处理澄清的培养基，来通过除去残留的细胞底物DNA来降低粘度。使用具有100,000标称分子量截止再生纤维素膜(Amicon，Merck KGaA，德国达姆施塔特)的离心浓缩器将核酸酶处理的培养基浓缩60倍。将上清液中的病毒蛋白与LDS样品缓冲液(赛默飞世尔科技，马塞诸塞州沃尔瑟姆)和5mM TCEP合并，并通过加热至70℃持续10分钟变性。将蛋白质在4％至12％变性的Bis-Tris NuPAGE聚丙烯酰胺凝胶(赛默飞世尔科技，马塞诸塞州沃尔瑟姆)上在MES缓冲液中一式三份分离，并转移至三个PVDF膜。将预染色的蛋白分子量标准品跑样以比较大小。将膜在1％(w/v)脱脂奶粉中封闭，并与三种不同的一级和抗体对孵育。将第一膜与流感A病毒M2蛋白单克隆小鼠抗血清14C2(圣克鲁斯生物技术，德州达拉斯)以2000:1稀释度一起孵育，然后与二级辣根过氧化物酶-缀合的抗小鼠IgG(H+L)(SeraCareKPL，马塞诸塞州米尔德福)以3000:1稀释度一起孵育。将第二膜与流感B病毒BM2蛋白多克隆兔抗血清(Hatta-M等人，J.Viro，78(11):5576-5583.2004)以2000:1稀释度一起孵育，然后与二级辣根过氧化物酶-缀合的抗兔IgG(H+L)(SeraCare KPL，马塞诸塞州米尔德福)以3000:1稀释度一起孵育。将第三膜与流感病毒基质蛋白多克隆山羊抗血清NR-3134(BEIResources，美国国立卫生研究院国立变态反应与传染病研究所)以2000:1稀释度一起孵育，然后与二级辣根过氧化物酶-缀合的抗山羊IgG(H+L)(SeraCare KPL，马塞诸塞州米尔德福)以3000:1稀释度一起孵育。使用TMB膜过氧化物酶底物(SeraCare KPL，马塞诸塞州米尔德福)使条带可视化。单克隆抗M2抗体在流感A M2SR病毒制备中检测到M2，并且在嵌合M2SR制备中未检测到流感A M2蛋白。相比之下，多克隆抗BM2血清在嵌合病毒的包膜中检测到BM2，并且在标准M2SR病毒中未检测到BM2。针对M1基质蛋白的多克隆抗血清在M2SR和嵌合M2SR病毒中检测到28kDal分子量PR8 M1蛋白(图15B)。
实施例14：各个BM2突变体作为疫苗的用途。
为了测试BM2突变体病毒是否可以在小鼠中引发抗体应答，将BM2突变体病毒(代表B/Yamagata和B/Victoria谱系的BM2SR-4病毒)配制成具有流感A H1N1或H3N2 M2SR疫苗的单价、三价或四价疫苗。将6周龄的BALB/c雌性小鼠用单价、三价或四价疫苗以范围为106至107TCID50/小鼠的剂量鼻内接种。向对照组小鼠给予PBS。在初免接种后第14天采集血清样品。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)针对代表B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系的抗原测定来自血清样品的抗HA IgG抗体滴度。另外，通过针对流感A H1N1和H3N2抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)测定来自血清样品的抗-HA IgG抗体滴度(图16A和图16B)。针对代表多价制剂中的两种流感B谱系的流感B抗原，两种BM2SR疫苗组分(代表B/Victoria谱系和B/Yamagata谱系)均提高了抗-流感病毒抗体高于对照PBS组(图16C和图16D)。这些结果表明BM2SR疫苗产生针对预期HA的抗体应答，并且当配制成多价疫苗时，单价组分之间没有干扰。对于多价制剂中的每种单价组分，产生免疫应答。
为了显示作为单价、三价或四价制剂的BM2SR突变体保护小鼠免受致死性流感B病毒攻击，在接种后22天将BALB/c雌性小鼠(N＝4只)用致死剂量的异源亚型流感B病毒(诸如B/Malaysia/2706/2004病毒)攻击(20只小鼠50％致死剂量(MLD50))。用BM2SR、三价和四价疫苗接种的所有小鼠在攻击中存活并且体重没有减轻(图16E和图16F)。然而，仅给予PBS的对照小鼠体重减轻并且在攻击日期后7天没有存活。这些结果表明，即使病毒与疫苗组分不匹配，BM2SR病毒防止流感B病毒攻击。BM2SR病毒以多价制剂以及单价制剂的形式提供保护。
实施例15：雪貂模型中的由单价和四价疫苗制剂中的BM2SR引发的免疫应答和保 护性功效。
A.概述
该实施例证明BM2SR疫苗可以在单价或多价制剂中在雪貂模型中引发免疫应答。也就是说，BM2SR引发的保护性免疫应答在配制成四价时不受其他疫苗组分的干扰，BM2SR也不干扰其他组分的免疫应答(即，不支配免疫应答)。将BM2SR候选病毒以剂量水平为1x107 TCID50(单价)或4xl07 TCID50(四价)鼻内施用至12只雄性雪貂。作为对照，向一组雪貂施用OPTI-MEMTM作为安慰剂对照。每个处理组使用初免-加强接种疫苗方案。给雪貂施用初免疫苗(第0天)和在28天后(第28天)施用加强接种疫苗。在每次接种疫苗后，在接种后14天观察雪貂的死亡率，每天测量体重、体温和临床体征。在第21天、第35天和第56天从接种疫苗后的所有雪貂收集血清以评价随时间推移的抗体水平。
在第70天，用1x106 PFU的流感A病毒A/California/07/2009(H1N1pdm)鼻内攻击所有动物。攻击后，在接种后监测雪貂14天的死亡率，每天测量体重，体温和临床体征。在攻击后第1天、第3天、第5天和第7天从每组中的雪貂(N＝8只)收集鼻洗液用于病毒滴度。另外，在攻击后(第82天)从存活的雪貂收集血清用于分析。在攻击后3天(第73天)对每组4只雪貂尸检。收集器官以确定攻击后的病毒载量(滴度)。
在5组中未观察到疫苗相关的不良事件。攻击后，安慰剂对照组表现出体重减轻(约15％)。在抗原错配的单价BM2SR接种疫苗组中也观察到重量减轻；然而，所述减轻(约5％至8％)小于在安慰剂组中观察到的减轻。四价M2SR在攻击后未显示任何显著的体重减轻。
B.材料和方法
疫苗病毒接种。用1x107 TCID50剂量的两剂单价BM2SR疫苗鼻内接种雪貂，或用4x107TCID50剂量的两剂四价M2SR疫苗鼻内接种雪貂，如表9所示。将小瓶冷冻储液在室温下解冻至少10分钟，然后冷藏存储(或在湿冰上)直至使用。将雪貂用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，并以500μL的体积鼻内施用病毒剂量(250μL/鼻孔)。在每次接种疫苗后每天观察动物持续7天。监测体重、体温和临床体征7天。
表9:接种疫苗和样品收集时间表
1鼻内接种
2从未分配于尸检的动物收集的鼻洗液。
3从每组4只雪貂中收集的器官(鼻甲、气管、肺(左右侧和尾叶))用于病毒滴度分析。
4接种疫苗后血清收集
BM2SR病毒是一种重组流感B病毒，其不表达功能性BM2蛋白，包含含有编码B/Brisbane/60/2008(Victoria)或B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)的HA和NA的SEQ ID NO:11的BM2SR-0突变体。四价M2SR由编码H1N1、H3N2、B/Victoria、B/Yamagata HA和NA的2个M2SR病毒和2个BM2SR病毒组成。
动物和动物护理。从Triple F Farms购买雄性雪貂，并将这些雪貂中的48只放置在研究中。在研究开始时动物大约4月龄。所述动物经供应商认证是健康的，并且不含针对传染病的抗体。抵达后，将所述动物单独饲养在带有板条底部的悬挂金属丝笼中，悬挂在纸衬里的废物盘上。根据公认的动物护理实践和相关的标准操作程序，动物室和笼子在动物收到之前已经被清洁和消毒。认证的Teklad Global Ferret Diet#2072(特克拉德饮食(Teklad Diets)，威斯康星州麦迪逊)和芝加哥市自来水随意提供，并每周至少补充三次。将动物室中的荧光照明保持12小时光/暗循环。动物室温度和相对湿度在各自的方案限值内，并且在研究期间内范围分别为20.0℃至25.0℃和30％至63％。
动物隔离和随机化。在随机化之前将雪貂隔离保持七天并且每天观察。根据表明动物的一般健康状况的每日观察结果，将雪貂从隔离中释放出来进行随机化和测试。在隔离之后，将雪貂称重并基于产生类似组平均值的体重使用计算机化随机化程序分配给治疗组[2.1.E.11版(PDS病理学数据系统有限公司(Pathology Data Systems，Inc.)，瑞士巴塞尔)]。在一组中，所有体重均在其平均值的20％之内。选择用于研究的动物通过耳标和响应器接收永久识别号码，并且各个笼卡还通过各个数字和组识别研究动物。分配的识别号码在研究中是唯一的。
实验设计。为了评估疫苗免疫原性和功效，将雪貂用每种BM2SR或四价M2SR病毒免疫或用培养基(OPTI-MEMTM)模拟免疫。监测雪貂体重、体温和临床症状并评价免疫应答。在研究开始时4月龄的48只雄性雪貂(Triple F Farms，宾西法尼亚州塞尔)用于该研究。根据IIT研究所动物护理和使用委员会批准的方案，所有动物程序均在动物生物安全2级设施中进行。在接种之前，监测雪貂3天以测量体重并建立基线体温。每天通过在每只雪貂皮下植入的响应器(BioMedic数据系统，特拉华州西福德)记录温度读数。在研究开始之前收集血液，并测试血清的流感抗体。用受体破坏酶(RDE)处理预接种疫苗的血清样品以除去非特异性抑制剂，然后连续稀释，针对规定量的流感病毒A/California/07/2009样(H1N1pdm)、A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)、流感B病毒、B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)和B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)测试，并与0.5％火鸡红血细胞或0.75％至1.0％豚鼠红血细胞混合。抗体滴度由引起红细胞凝集抑制的最低血清稀释度定义。只有具有低于40的HAI(血细胞凝集抑制)滴度的雪貂被认为是血清阴性的并且在本研究中使用。将研究动物随机化并分成4组(12只雪貂/组)，如表9所示。
将雪貂在第0天和第28天用单剂量的1x107 TCID50的BM2SR病毒鼻内接种或在第0天和第28天用单剂量的4xl07 TCID50的四价M2SR鼻内接种。在第0天和第28天用OPTI-MEMTM鼻内模拟接种对照组。在接种后每天监测雪貂体温、体重和临床症状，持续14天。将鼻洗液样品保持在-65℃。在接种前(第-3天至第-5天)和第21天、第35天和第56天收集血液，并将血清保持在-65℃直至通过ELISA和HAI测定法测量抗体滴度。
C.结果
通过针对A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/California/07/2009(H1N1pdm)、B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)和B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)的酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定来自血清样品的抗HA IgG抗体滴度。简而言之，将ELISA板用来自各株的重组HA蛋白涂覆，用牛血清白蛋白(BSA)封闭，并施加样品。通过辣根过氧化物酶标记的抗-雪貂IgG-山羊抗体(KPL，Inc.，马里兰州盖瑟斯堡)和SureBlue TMB(KPL，Inc.)底物检测雪貂IgG抗体。
如所预期的，每个免疫组中的雪貂显示血清中针对其各自抗原的抗HA抗体显著升高。来自BM2SR免疫组的血清显示出预期的特异性，并且不针对流感A抗原(CA07-H1N1，Bris10-H3N2)反应。更重要的是，四价M2SR组显示血清中针对所有四种抗原的抗HA抗体显著升高(图18)，表明当配制成四价疫苗时BM2SR是免疫原性的，并且多价制剂的组分之间不存在干扰。这些数据表明BM2SR和四价M2SR病毒在雪貂中引发显著的免疫应答。
通过血细胞凝集抑制(HAI)测定分析血清样品，以证明通过ELISA检测的抗体的功能活性。用受体破坏酶(RDE)(日本生研，日本东京)处理血清样品以消除非特异性血细胞凝集抑制剂。根据制造商的说明复溶RDE。将血清在RDE中1:3稀释，并在37℃±2℃水浴中孵育18小时至20小时。加入等体积的2.5％(v/v)柠檬酸钠后，将样品在56±2℃水浴中孵育30±5分钟。在RDE处理后，向每个样品中加入0.85％NaCl至1:10的最终血清稀释度。然后将稀释的样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中一式两份稀释成四个两倍稀释液(1:10至1:80)，然后与A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/California/07/2009(H1N1pdm)、B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)和B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)流感病毒的4个血凝单元一起孵育。孵育后，向每个样品中加入0.5％禽红血细胞并孵育30±5分钟。然后对血细胞凝集的存在或不存在评分。
如图19A和图19B所示，所有免疫的雪貂都表现出针对其各自的测试病毒的显著HAI抗体滴度。四价M2SR表现出针对所有四种测试病毒的显著HAI滴度。安慰剂(未接种的)组未引发任何流感特异性抗体。CDC指出，血清HAI抗体滴度为40与流感感染或人群疾病风险降低至少50％相关。因此，这些结果表明BM2SR病毒引发当病毒被配制成具有流感A M2SR病毒的四价疫苗时维持的保护性免疫应答。
在用A/California/09/2009(H1N1pdm)攻击后，在BM2SR免疫动物中到攻击后第6天观察到5％至8％的体重减轻。OPTI-MEMTM雪貂(安慰剂组)体重减轻最多(15％)。接种疫苗的雪貂中的体重减轻取决于疫苗的抗原性。接收四价M2SR(含有H1N1pdm M2SR)的雪貂没有表现出任何显著的体重减轻。接受任一BM2SR疫苗的雪貂表现出约5％至8％的体重减轻。
在攻击后第1天、第3天、第5天和第7天从所有雪貂收集鼻洗液样品，并通过MDCK细胞中的噬菌斑测定评价其攻击病毒的存在。图20显示四价M2SR控制攻击病毒复制。安慰剂和BM2SR单价疫苗不控制激发病毒，其中在感染后多达5天检测到至少5个log的病毒。BM2SR疫苗不控制流感A攻击病毒，但确实对疾病进展有缓和作用，如安慰剂组体重减轻所证明的(数据未显示)。
在感染后第3天从4只雪貂进一步收获的呼吸器官证明了对攻击病毒的控制。如图21A、图21B和图21C所示，Quad M2SR根本不允许攻击病毒在上呼吸道组织和下呼吸道组织(例如，鼻甲、气管和肺组织)中复制。相比之下，攻击病毒在其他组的上呼吸道组织(鼻甲和气管)中生长至高滴度。在下呼吸道(肺)中，单价BM2SR疫苗相对于安慰剂组控制了攻击病毒。这些结果表明，四价M2SR防止了流感感染构建自身，并且BM2SR疫苗降低了感染的严重程度。
D.结论
该实施例表明，对雪貂鼻内施用BM2SR和四价M2SR疫苗病毒与任何疫苗相关的不良事件(例如，体温升高、体重减轻或临床体征)无关，并且可用作鼻内流感疫苗。这些结果表明BM2SR在雪貂中引发免疫应答，并且当配制成四价M2SR时，病毒引发针对多价制剂中包含的每种株的保护性免疫应答。
实施例16：Vero细胞中的流感AOF生长
病毒产生。如前所述产生M2SR和BM2SR-4病毒。对于M2SR，使用来自流感A/PuertoRico/1934的流感A病毒RNA区段1、区段2、区段3、区段5、区段8和M2SR区段7以及流感A/HongKong/4801/2014(H3N2)的HA和NA病毒RNA区段。对于BM2SR，使用来自流感B/Yamagata/1973的流感B病毒RNA区段1、区段2、区段3、区段5、区段8和来自B/Florida/2006的区段7BM2SR-4以及流感B/California/12/2015(Yamagata谱系)的HA和NA病毒RNA区段4、区段6。将流感cDNA克隆到RNA聚合酶I表达盒中。将得到的质粒与病毒聚合酶、NP和M2蛋白表达质粒一起转染到BM2Vero细胞中，并在BM2Vero细胞中扩增释放到上清液中的病毒。
细胞和病毒培养物。将马丁达比犬肾(MDCK)细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)的MEM中。将M2CK和BM2CK细胞(即分别稳定表达流感A M2和BM2蛋白的MDCK细胞系)在37℃，5％CO2下维持在补充有10％FBS和150μg/mL潮霉素B的MEM中。将Vero(非洲绿猴肾)细胞生长在补充有10％胎牛血清(FBS)的MEM或OptiVero(一种根据制造商推荐(Invitria，Fort Collins，C)配制的无动物源(AOF)培养基)中。M2VeroA和BM2Vero细胞(即分别稳定表达流感A M2和流感B BM2蛋白的Vero细胞系)维持在补充有500或1000微克/毫升G418硫酸盐的OptiVero培养基中。
将野生型流感A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)在MDCK细胞中生长，并且将野生型流感B/CA/12/2015在补充有0.3％牛血清白蛋白(BSA)和1微克/毫升胰蛋白酶-TPCK的MEM内的Vero细胞中生长。使用OptiVero培养基和1微克/毫升T-TPCK在M2VeroA或BM2Vero细胞中生长M2SR和BM2SR-4病毒。
为了直接比较病毒生长动力学，如下使用相同的AOF培养条件对每种病毒/细胞系组合进行病毒生长曲线。将指数期生长的Vero、M2VeroA或BM2Vero细胞以每600mm组织培养皿1,000,000个细胞涂铺在AOF培养基中。在37℃，5％CO2的潮湿孵育箱中培养24小时后，将Vero细胞系在AOF培养基中用测试病毒以0.001TCID50单位/细胞的感染复数(MOI)一式三份感染。在35℃，5％CO2下孵育120分钟后，除去病毒接种物，并将含有1微克/毫升胰蛋白酶-TPCK的新鲜AOF培养基施加至细胞。病毒培养在35℃，5％CO2的加湿孵育箱中进行。每24小时，连续4天，取出来自病毒培养物的等分试样并将其在-80℃下冷冻储存用于后续滴定分析。通过50％组织培养抑制剂量(TCID50)测定，使用支持性M2CK细胞(用于M2SR病毒)和BM2CK细胞(用于BM2SR4病毒样品)，测定培养物上清液的病毒滴度。将野生型病毒样品在MDCK或表达M2的M2CK和BM2CK细胞上滴定。对于野生型Vero细胞中的M2缺陷型M2SR病毒培养物(图22A)或BM2缺陷型BM2SR4病毒培养物(图22B)，未检测到在测定检测限值(log10TCID50/mL＝1.67)之上的病毒滴度。流感A M2SR HK4801孔在同源M2VeroA细胞中和流感BBM2SR4 CA12病毒在BM2Vero细胞中复制，其生长曲线分别与野生型Vero细胞中的野生型A/Hong Kong/2014(H3N2)和B/CA/12/2015相当。与未修饰的野生型Vero细胞系中的复制相比，M2或BM2的过表达对野生型流感A或B病毒复制没有影响。
对在M2VeroA细胞系中生长的BM2SR-4流感B病毒没有观察到病毒复制(图22B)。相比之下，流感A M2SR病毒确实在BM2Vero细胞中复制，其动力学非常类似于对M2VeroA细胞中流感A M2SR生长所见的动力学(图22A)。因此，流感BM2蛋白在BM2Vero细胞系中的表达允许流感A M2缺陷型M2SR病毒株的复制，其与野生型流感A的生长动力学相当。同时，流感AM2不代替BM2在流感B复制中的功能。
实施例17：BM2Vero细胞底物中的流感A M2SR遗传稳定性
病毒产生。在M2VeroA细胞中，流感A M2SR病毒使用基于质粒的反向遗传学产生。来自流感A/Puerto Rico/1934的流感A病毒RNA区段1、区段2、区段3、区段5、区段8和M2SR区段7以及流感A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)的HA和NA病毒RNA区段4、区段6用于产生M2SRHK4801病毒。
将流感区段cDNA克隆到单向RNA聚合酶I表达盒中。将得到的8个RNA表达质粒与5个蛋白质表达质粒共同转染到M2VeroA细胞中，所述质粒包括3个病毒聚合酶质粒、NP质粒和M2质粒。释放到上清液中的病毒在新鲜M2Vero细胞中扩增3次病毒传代。传代3次后，测定病毒滴度，并通过对整个株基因组测序来确认遗传同一性。简而言之，使用流感A特异性PCR引物扩增流感A特异性cDNA反应产物。使用区段特异性内部引物对来自所有8个区段的扩增产物进行染料-终止子测序。然后将流感A M2SR HK4801病毒在表达BM2蛋白的BM2Vero细胞系中再传代10轮。通过测定完整的基因组核苷酸序列再次测试已经在Vero细胞系中传代总共13代的M2VeroA P3/BM2Vero P10病毒株的遗传同一性。从通过反向遗传学产生的M2SRHK4801 M2VeroA P3病毒株的基因组获得的核苷酸序列表明，所有8个病毒区段序列与起始cDNA质粒的序列相同。在BM2Vero细胞系中再培养传代10次后，病毒经历了非常微小的适应。在两个株之间观察到总共四个核苷酸取代。所有观察到的变化都是沉默突变，意味着预测观察到没有取代改变适应区段的氨基酸编码(表10)。因此，这些结果表明，首先，Vero细胞中反向遗传学产生的M2SR HK4801病毒在遗传上是稳定的，因为在Vero细胞系中经过总共13轮病毒扩增后，在13,588个碱基的流感A gRNA基因组中仅观察到4个碱基取代。第二，表达BM2蛋白的BM2Vero细胞系提供了流感A M2的所有所需功能，并且似乎没有对流感AM2SR病毒施加任何过度选择，因为基因组序列在仅由BM2蛋白支持的10次病毒传代后保持稳定。
表10.Vero传代后M2SR HK4801的基因组核苷酸序列

Claims (26)

1.一种具有突变体BM2基因的重组流感B病毒，所述突变体BM2基因包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
2.根据权利要求1所述的重组流感B病毒，其中，所述BM2基因中的突变导致所述病毒不能表达BM2蛋白，或导致所述病毒表达截短的BM2蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的重组流感B病毒，其中，在体外宿主细胞系统中至少10代，所述突变体BM2基因不回复为编码功能性BM2蛋白的野生型序列或非野生型序列，其中，所述宿主细胞经修饰以产生功能型的所述突变体基因，从而向所述病毒反向地提供基因产物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组病毒，其中，所述病毒在感染有所述病毒的哺乳动物中引发免疫应答。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组病毒，其中，所述病毒对于感染有所述病毒的哺乳动物是非致病性的。
6.根据权利要求3所述的重组病毒，其中，所述体外细胞系统包括马丁达比犬肾(MDCK)细胞或Vero细胞。
7.一种组合物，包含：具有突变体BM2基因的重组流感B病毒，所述突变体BM2基因包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述BM2基因的突变导致所述病毒不能表达BM2蛋白，或导致所述病毒表达截短的BM2蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中，所述病毒在感染有所述病毒的哺乳动物中引发免疫应答。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的组合物，其中，所述病毒对于感染有所述病毒的哺乳动物是非致病性的。
11.根据权利要求7所述的组合物，还包含佐剂。
12.一种用于繁殖重组流感B病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的重组流感病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育所述宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞经修饰以产生功能型的流感BM2基因，从而向所述病毒反向地提供基因产物。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括分离子代病毒颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括将所述病毒颗粒配制为疫苗。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述病毒不能表达BM2蛋白，或表达截短的BM2蛋白。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述病毒在感染有所述病毒的哺乳动物中引发免疫应答。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述病毒对于感染有所述病毒的哺乳动物是非致病性的。
18.根据权利要求12所述的方法，其中，在所述宿主细胞中至少10代，所述突变体BM2基因不回复为编码功能性BM2蛋白的野生型序列或非野生型序列。
19.根据权利要求12所述的方法，其中，所述宿主细胞是MDCK细胞或Vero细胞。
20.一种用于繁殖重组流感A病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:33的重组流感A病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育所述宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生野生型的流感BM2基因从而向所述病毒反向地提供BM2基因产物的MDCK细胞。
21.一种用于繁殖重组流感A病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:33的重组流感A病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育所述宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生选自由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32组成的组的嵌合型的流感A M2基因和流感B BM2基因从而向所述病毒反向地提供嵌合的M2:BM2基因产物的Vero细胞。
22.一种用于繁殖重组流感A病毒的方法，包括：使宿主细胞与包含SEQ ID NO:33的重组流感A病毒接触；以及在适合于病毒复制的条件下孵育所述宿主细胞足够的时间，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生包含SEQ ID NO:27的密码子优化型的BM2基因从而向所述病毒反向地提供BM2基因产物的Vero细胞。
23.一种重组流感A病毒，包含突变体BM2蛋白。
24.一种用于繁殖重组流感病毒的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是经修饰以产生由选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的cDNA序列编码的基因产物的Vero细胞。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中，所述重组流感病毒是包含如SEQ ID NO:33中所示的突变体M2基因的流感A病毒。
26.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中，所述重组流感病毒是包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中所示的突变体BM2基因的流感B病毒，并且其中，所述Vero细胞经修饰以产生由SEQ ID NO:27编码的基因产物。
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