JP2011505863A - 修飾インフルエンザウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｍ遺伝子のＮ末端に近接する少なくとも１つのヌクレオチド、より具体的にはＭ遺伝子の２６５〜２９４位のヌクレオチド位置のいずれか１つに修飾を有するＢ型インフルエンザウイルスのＭ遺伝子、および前記修飾Ｍ遺伝子を含むＢ型インフルエンザウイルスを提供する。さらには、ワクチン製造のための前記修飾Ｍ遺伝子の使用、および前記修飾インフルエンザウイルスを製造する方法も開示する。

Description

本発明は、Ｍ遺伝子のＮ末端に近接する少なくとも１つのヌクレオチド、より具体的にはＭ遺伝子の２６５〜２９４位のヌクレオチド位置のいずれか１つに修飾を含むＢ型インフルエンザウイルスのＭ遺伝子、および前記修飾Ｍ遺伝子を含むＢ型インフルエンザウイルスを対象とする。

ウイルス性疾患により引き起こされる流行病および汎発流行病は、今もなお人命を奪い、世界経済に影響を与えている。インフルエンザは、世界中で何百万もの労働日数の損失や医師への受診、ならびに何十万人もの入院のほか（Ｃｏｕｃｈ １９９３，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ６８５；８０３）、何万人もの超過死亡数（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＆ Ｌｅｈｍａｎｎ １９５３ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ ２１３：１；Ｇｌｅｚｅｎ １９８２ Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ７７：７１２）、何億ユーロの医療費（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０８：６１６）を生じる原因となっている。Ａ型およびＢ型のインフルエンザウイルスはいずれも、過去にヒトにおけるこれらの流行の原因となっていたため、Ａ型インフルエンザウイルスだけでなくＢ型インフルエンザウイルスの表面抗原も、インフルエンザ罹患率の低減に有効なワクチンの重要な成分である。インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科ファミリーに属し、それぞれ合計サイズが１３．６〜１４．６ｋｂになる分節マイナス鎖ＲＮＡゲノムによって特徴づけられる。ウイルスが伝播するには、ゲノムのウイルスＲＮＡがウイルス粒子にパッケージされなければならない。子孫ウイルス粒子が組み立てられ、粒子の組み立て中にタンパク質間での相互作用が生じる過程は、ＲＮＡウイルス内でほぼ同じである。ウイルス粒子が形成されることにより、単一の宿主内または種々の宿主生物間における宿主細胞間のＲＮＡゲノムの効果的な伝播が達成される。インフルエンザウイルス粒子は、一本鎖ＲＮＡゲノムを含む内部リボヌクレオタンパク質コア（らせん形のヌクレオカプシド）と、内側が基質タンパク質（Ｍ１）で覆われた外側のリポタンパク質エンベロープで構成されている。Ａ型インフルエンザウイルスの分節ゲノムは、線状で負極性の一本鎖ＲＮＡの分子８個から構成され、１１個（一部のＡ型インフルエンザ株では１０個）のポリペチドをコードする。これらのポリペチドには、ヌクレオカプシドを形成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ）ならびに核タンパク質（ＮＰ）；基質膜タンパク質（Ｍ１、Ｍ２またはＢＭ２）；エンベロープを含む脂質から突出する２つの表面糖タンパク質、すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；非構造タンパク質（ＮＳ１）および核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）が含まれる。また、ほとんどのＡ型インフルエンザ株は、アポトーシス促進特性を有すると考えられる１１番目のタンパク質（ＰＢ１−Ｆ２）をコードするのに対して、Ｂ型インフルエンザウイルスだけが、ウイルスの毒性に寄与する可能性のあるＮＢタンパク質を発現する（Ｈａｔｔａ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７，６０５０−６０５４）。さらにＡ型とＢ型のインフルエンザウイルスの間には、ウイルスのＮＡ遺伝子とＭ遺伝子のセグメントによりコードされる遺伝子産物の発現方法にわずかな違いがある（Ｌａｍｂ ａｎｄ Ｈｏｒｖａｔｈ，１９９１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：２６１−２６６）。Ｂ型インフルエンザウイルスはほとんどヒトにのみ封じ込められていることにより、有意な生物学的および疫学的違いが示されているが、Ｂ型インフルエンザウイルスをアザラシから分離し、より大規模な別の生物の保有体が存在する可能性もあることを示唆した試験がすでに行われている。Ａ型インフルエンザウイルスは、多くの鳥類や哺乳類の種内にきわめて広範に及ぶ保有体を有している。

ゲノムの転写および複製は核内で行われ、原形質膜からの出芽により組立てが行われる。ウイルスは混合感染中に遺伝子を再集合することができる。インフルエンザウイルスは、ＨＡを介して細胞膜糖タンパク質と糖脂質中のシアリルオリゴ糖に吸着する。ウイルス粒子のエンドサイトーシスの後、ＨＡ分子の構造的な変化が、膜融合を促進する細胞のエンドソーム中で生じ、脱殻を誘発する。ヌクレオカプシドは核に移動し、そこでウイルスｍＲＮＡが転写される。ウイルスｍＲＮＡの転写は、ウイルスのエンドヌクレアーゼが細胞の異種ｍＲＮＡからキャップ化５’末端を切断した後、これらのｍＲＮＡがウイルスのトランスクリプターゼによるウイルスＲＮＡ鋳型転写のプライマーとして機能するという独特の機序により行われる。転写物は、その鋳型の末端から１５〜２２塩基の部位で終結し、ここでオリゴ（Ｕ）配列がポリ（Ａ）トラクト添加のシグナルとして機能する。このようにしてＡ型インフルエンザ複製中に産生される８個のウイルスＲＮＡ分子の内の６個は、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰならびにウイルスポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ）になるタンパク質に直接翻訳されるモノシストロニックなメッセージであり、その他２個の転写物は、スプライシングを受けて、それぞれが２個のｍＲＮＡを生じ、これらがＭ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＥＰを産生する異なるリーディングフレームで翻訳される。換言すると、８個のウイルスＲＮＡの分節が１１個のタンパク質、すなわち９個の構造タンパク質と２個の非構造タンパク質（ＮＳ１および最近同定されたＰＢ１−Ｆ２）タンパク質をコードしている。Ｂ型インフルエンザは、２つのタンパク質（すなわちＮＢとＢＭ２）に異なるコード方法を用いている。前者は、ＮＡ遺伝子の重なり合うリーディングフレームから翻訳され、後者は、Ｍ遺伝子から重なり合う終止−開始コドンを介して発現される。

現在のところ、ワクチン接種が、インフルエンザからヒトを保護する最良の方法と考えられている。健常成人が予防注射を受けた場合、現在利用できるワクチンでは、７０〜９０％の症例で臨床的疾患を予防することができる。このレベルは、６５歳を超える健常成人では３０〜７０％に低下し、さらに老人ホームで暮らす６５歳を超える健常成人ではなお一層低下する（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ２００１：Ｔｈｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｍａｒｋｅｔ．Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ．ｐ．５９）。さらには、ウイルス抗原が頻繁に変化することも、たとえ毎年ワクチン接種しても防御を保証できるわけではないことから、死亡者の多くなる原因となっている。

ワクチン接種は、市販の化学的に不活化（殺菌）したインフルエンザウイルスワクチンか、または生弱毒化インフルエンザウイルスワクチンで達成される。残念なことに、弱毒化ワクチンでは交叉防御免疫をほとんど誘導することができない。したがってワクチン株は将来の未知の汎発流行株の抗原特性と正確に適合しなければならない。

複製欠損性Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルス排泄の点から見て安全性の問題を克服するはずであり、これらは、ＮＳ１タンパク質の欠失したＡ型インフルエンザ変異株であってもよい。ＮＳ１タンパク質が欠如すると、ワクチン接種した哺乳動物の気道でこのウイルスの複製が欠損する。鼻腔内投与すると、このワクチンウイルスは、ウイルス排泄作用を持つことなく、粘膜組織で不稔感染を開始することができる。それと同時に、このウイルスは、局所的サイトカイン応答を刺激し、Ｂ細胞およびＴ細胞介在性防御免疫応答を誘起する。

Ｂ型インフルエンザウイルスは、ほとんどの場合、Ｖｅｒｏ細胞で十分な増殖を達成するのに厄介で時間のかかる適応が必要となる。ＮＳ１の機能が阻害されたことによるインターフェロン感受性の表現型に加えて、Ｖｅｒｏ細胞で高い力価に至るまで複製することができるＢ型インフルエンザＮＳ１変異株は、文献には記載されていない。現在のところ、ＮＳ１ ＯＲＦを完全に欠失する公開された唯一のＢ型インフルエンザウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞で効果的に複製しない（それぞれ、０．１ｍｏｉを用いた力価は１．７〜２．５＊１０² ＦＦＵ／ｍＬ、０．００１ｍｏｉの力価は検出不能。Ｄａｕｂｅｒ ｅｔ．ａｌ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．２００４，ｐ．１８６５−１８７２）。アミノ末端の１６個のアミノ酸から構成されるＢ型インフルエンザＮＳ１欠失変異株もまた、約１０⁴ ＦＦＵ／ｍＬの最大力価を伴う複製で非常に弱毒化する（Ｈａｉ ｅｔ．Ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；Ｎｏｖ２００８，ｐ．１０５８０−９０）。

Ｂ型インフルエンザの抗原化合物を含む安全性の高いワクチン製剤を開発する必要性を受けて、ＮＳ１の機能が阻害されたために弱毒化されても、なお細胞培養で高い増殖特性を示すＢ型インフルエンザ株を開発することが大いに求められている。

Ｂ型インフルエンザウイルスの臨床分離株は、通常、Ｖｅｒｏ細胞で高い増殖を達成するのに厄介で時間のかかる適応を必要とする。Ａ型インフルエンザウイルスの場合は、野生型ウイルスだけでなく、例えば３８個のアミノ酸が短縮したＮＳ１タンパク質を発現する変異株、またはＮＳ１ ＯＲＦを完全に欠失する変異株が、インターフェロン欠損Ｖｅｒｏ細胞で高い力価に至るまで複製することができる。この所見は、複製欠損弱毒化Ａ型インフルエンザ生ワクチンを製造するのに使用された。

これまで、この考え方は、非機能性ＮＳ１タンパク質を有する変異株が組織培養で高い力価に至るまで増殖するのに不適合であったため、Ｂ型インフルエンザウイルスに適用することができなかった。

今や驚くべきことに、本発明者らは、Ｂ型インフルエンザウイルスゲノムのＭ遺伝子のＮ末端ドメインに近接する選択されたヌクレオチドを修飾することによって、増殖能力を大幅に高めることができることを明らかにした。Ｂ型インフルエンザウイルスのＭ遺伝子は、長さが約１，０７６ｂｐであり、Ｍ１およびＢＭ２のＯＲＦを含んでいる。

さらに、本発明はまた、前記修飾Ｍ遺伝子を含む組換え型Ｂ型インフルエンザウイルスも対象とする。前記Ｂ型ウイルスは複製欠損性であるか、または例えばＮＳ１タンパク質中の欠失によりたとえば弱毒化されているのが好ましい。

具体的には、Ｍ１タンパク質の８２〜９０位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８５〜８７位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８６位のアミノ酸位置における修飾と、機能性ＲＮＡ結合ドメインおよびカルボキシ末端ドメインを欠失するＮＳ１タンパク質をコードする修飾ＮＳ１セグメントと、場合によりＭ遺伝子の９５０位のヌクレオチド位置におけるサイレント突然変異とを含む組換え型Ｂ型インフルエンザ株が本発明の対象となる。

さらには、本発明のウイルスを含有するワクチン製剤、およびインフルエンザの予防的治療方法、ならびに本発明のウイルスを作製する方法も対象となる。

本発明はまた、本発明のインフルエンザウイルスＭ遺伝子をコードする分離した核酸、および前記核酸の製造も対象とする。

図１ 野生型、ＮＳ１４、ＮＳ３８、ＮＳ５７およびＮＳ８０のＢ型インフルエンザＮＳ遺伝子（ａ）、ならびに野生型およびΔＮＳ１（ｂ）の模式的翻訳プロフィール。

図２ １４個、３８個、５７個、８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質、または野生型ＮＳ１を発現する所定ウイルスのＮＳ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物。

図３ Ｖｅｒｏ細胞（ａ）およびＡ５４９細胞（ｂ）における、１４個、３８個、５７個または８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質または野生型ＮＳ１をそれぞれ発現するインフルエンザＢ／マレーシアウイルスの増殖。

図４ トランスフェクション後６日目における、３８個もしくは８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質またはｗｔ ＮＳ１を有し、ｗｔ Ｍ遺伝子またはＭ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子を含むインフルエンザＢ／マレーシア変異株のウイルス力価（ａ）、ならびにトランスフェクション後５日目における、ΔＮＳ１遺伝子を含むＢ／フロリダ変異株、または３８個もしくは８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質またはｗｔ ＮＳ１を有し、ｗｔ Ｍ遺伝子またはＭ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子を含むＢ／フロリダ変異株のウイルス力価（ｂ）。

図５ 最初のＢ／マレーシア／２５０６／０４様スワブＭ遺伝子と、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子およびｇｅｎｅｂａｎｋで公開された他の配列とのアミノ酸の比較。

図６ Ｖｅｒｏ細胞（ａ）およびＡ５４９細胞（ｂ）における、ΔＮＳ１遺伝子または野生型ＮＳ１を含むインフルエンザＢ／フロリダウイルスの増殖。

図７ Ｍ８６Ｖ突然変異（太字で記載、配列番号１）を含むＢ／ウィーン／３３／０６のＭ１タンパク質のアミノ酸配列（ａ）、およびＭ８６Ｖ突然変異（太字で記載、配列番号２）を含むＢ／チューリンゲン／０２／０６のＭ１タンパク質のアミノ酸配列（ｂ）。

図８ 構築したＢ型インフルエンザＮＳ変異株の概要。構築したすべてのＢ型インフルエンザ変異株の遺伝的構成（ａ）；Ｂ／ウィーン／３３／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｍ８６Ｖのヌクレオチド配列（配列番号３）（ｂ）；Ｂ／ウィーン／３３／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｍ８６ＶおよびＣ９５０Ｔのヌクレオチド配列（配列番号４）（ｃ）；Ｂ／チューリンゲン／０２／０６のＭ遺伝子Ｍ１−ｗｔのヌクレオチド配列（配列番号５）（ｄ）；Ｂ／チューリンゲン／０２／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｍ８６Ｖのヌクレオチド配列（配列番号６）（ｅ）；Ｂ／ウィーン／３３／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｃ９５０Ｔのヌクレオチド配列（配列番号７）（ｆ）；ＮＳ１４のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）（ｇ）；ＮＳ３８のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）（ｈ）；ＮＳ５７のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）（ｉ）；ＮＳ６４のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１１）（ｊ）；ＮＳ８０のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１２）（ｋ）；ΔＮＳ１−ＢのＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１３）（Ｉ）；ΔＮＳ１−ＢのＢ／チューリンゲン／０２／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１４）（ｍ）。

図９ それぞれ３８個、８０個、１０４個および１４５個のアミノ酸長のＮＳ１タンパク質を有するＩＬ２発現Ｂ型インフルエンザベクターの模式的翻訳プロフィール（ａ）；構築されたすべてのＩＬ２発現Ｂ型インフルエンザベクターの遺伝的構成（ｂ）；ＮＳ１−３８ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）（ｃ）；ＮＳ１−８０ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１６）（ｄ）；ＮＳ１−１０４ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１７）（ｅ）；ＮＳ１−１４５ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１８）（ｆ）。

図１０ Ｖｅｒｏ細胞での５回の継代後における、インフルエンザＢ／ＮＳ１−ｗｔ、Ｂ／ＮＳ１−３８およびＢ／ＮＳ１−３８ＩＬ２ウイルスのＲＴ−ＰＣＲ産物。

本発明は、Ｂ型インフルエンザ株の増殖能力を増大させることができる、Ｂ型インフルエンザウイルスのＭ遺伝子のヌクレオチド配列の変更を提供する。このような変更には、欠失および置換が含まれてもよい。Ｂ型インフルエンザのＭ１タンパク質において少なくとも１回単一アミノ酸を変更することにより、細胞培養、とりわけＶｅｒｏ細胞において高い増殖特性がもたらされることを、本発明者らは明らかにすることに成功した。これにより、具体的にはｗｔ ＮＳ１タンパク質、またはＮＳ１のＯＲＦに完全な欠失が見られる変異株と比べて、長さが短いＮＳ１タンパク質を発現するウイルスをレスキューすることができる。

具体的には、本発明のＢ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子は、Ｍ遺伝子の２６５〜２９４位のヌクレオチド位置のいずれか１つの少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは２７７〜２８５位のヌクレオチド位置のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチド、より好ましくは２８０〜２８２位のヌクレオチド位置のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む。

具体的には、修飾Ｍ遺伝子は、分離したウイルスの対応する配列のＡＴＧの代わりに、２８０〜２８２位にヌクレオチドＧＴＧを含む。あるいは、修飾Ｍ遺伝子はまた、２８０〜２８２位にヌクレオチドＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＴも含んでもよい。当然ながら、当該実施形態は、それぞれのＲＮＡコドン、ＧＵＧ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＵも対象とする。

本発明の別の実施形態によれば、Ｂ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子は、Ｍ１タンパク質の８２〜９０位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８５〜８７位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８６位のアミノ酸位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を生じる少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。置換されるアミノ酸はいずれのアミノ酸であってもよく、非極性で疎水性のアミノ酸が好ましい。具体的には、アミノ酸の変更は、８６位のアミノ酸位置においてメチオニンからバリンへの変更を生じる。

当然ながら、Ｍ１タンパク質の８２〜９０位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８５〜８７位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８６位のアミノ酸位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＭ１タンパク質が、本発明の対象となる。置換されるアミノ酸はいずれのアミノ酸であってもよく、非極性で疎水性のアミノ酸が好ましい。具体的には、アミノ酸の変更は、８６位のアミノ酸位置においてメチオニンからバリンへの変更を生じる。前記Ｍ１タンパク質は、当該技術分野で既知のいずれの方法でも作成することができる。

「アミノ酸置換」という用語は、当該分子の親の（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）アミノ酸配列の特定位置に、修飾されたまたは異なるアミノ酸が存在することを指す。アミノ酸置換は、当該位置を占めることができたであろうその他いずれのアミノ酸に対しても生じる。アミノ酸配列の変更によって生ずるポリペチドは、グリコシル化、アセチル化、リン酸化またはその他いずれかのアミノ酸修飾ならびにアミノ酸置換などの翻訳後修飾の変更を含むことができる。

本発明のインフルエンザウイルスＭ遺伝子を含む組換え型Ｂ型インフルエンザウイルスも、本発明の対象となる。

他の態様において、本発明の修飾Ｍ遺伝子を含む複製欠陥インフルエンザウイルスは、さらにＮＳ遺伝子内に修飾も、具体的にはＮＳ１タンパク質の一部の欠失またはＮＳ１タンパク質全体の欠失（ΔＮＳ１）を含むこともできる。このようなウイルスは、ＮＳ１タンパク質が短縮または発現欠如しているため、インターフェロン欠損細胞でのみ複製することができるが、共通の宿主および生物中で増殖する能力を失っている。

Ａ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質は、約２３０個のアミノ酸からなる多機能性タンパク質であり、感染で初期に多量に合成される。前記タンパク質は、細胞の抗ウイルス活性に対抗し、病原性因子である。ＮＳ１タンパク質は、そのカルボキシ末端領域の活性により、宿主ｍＲＮＡのプロセシング機構を阻害することができる。第二に、前記タンパク質は、細胞の翻訳開始因子との直接的な相互作用により、ウイルスｍＲＮＡの選択的な翻訳を促進する。第三に、ＮＳ１タンパク質は、ｄｓＲＮＡに結合することと、推定上の細胞のキナーゼとの相互作用によって、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性ｄｓＲＮＡ活性化キナーゼ（ＰＫＲ）、２’５’オリゴアデニレート合成酵素系、およびサイトカイン転写因子の活性化を阻止することができる。第四に、ＮＳ１のＮ末端部分が、ＲＩＧ−Ｉに結合し、ＩＲＦ−３の下流の活性化を阻害して、ＩＦＮ−βの転写誘導を阻止する。したがって、ＮＳ１タンパク質は、ＩＮＦ−αまたはＩＮＦ−β遺伝子の発現を阻害し、感染細胞におけるアポトーシスの発現を遅延させ、隣接細胞における抗ウイルス状態の形成を阻止する。Ｂ型インフルエンザウイルスは、同じＲＮＡ標的を結合してｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＫＲ活性化を阻害する能力を対応物であるＮＳ１−Ａと共有している、ＮＳ１−Ｂと呼ばれる２８１個のアミノ酸からなる非構造タンパク質を、ウイルスＮＳセグメントのスプライスされていない転写物から発現する。Ａ型インフルエンザとは対照的に、Ｂ型インフルエンザＮＳ１は、プレｍＲＮＡのスプライシングを阻害しないが、インターフェロン活性化遺伝子１５（ＩＳＧ１５）産物に結合して、細胞標的への結合を阻害する。
ＮＳ１タンパク質内に修飾を含むＡ型インフルエンザウイルスは、当該技術分野で既知である。例えば、ＷＯ９９／６４５７１には、ＮＳ１遺伝子セグメントの完全なノックアウトが記載しており、ＷＯ９９／６４０６８には、部分的に欠失した各種のＮＳ１遺伝子セグメントが開示されている。これらの刊行物は、参考としてすべてが本明細書で援用されている。ＮＳ１タンパク質に修飾を含むごくわずかなＢ型インフルエンザウイルスのみが現在のところ知られており、ＮＳ１の機能が阻害されたためにインターフェロン感受性表現型を有するこれらのウイルスはいずれも、Ｖｅｒｏ細胞で高い力価に至るまで増殖しない。以下ではＮＳ１タンパク質に修飾を有するこのようなウイルスの構造について記載する。

本発明によれば、ＮＳ１タンパク質内の修飾は、複製欠損インフルエンザウイルスを生じる少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換であってもよい。

好ましくは、修飾Ｂ型インフルエンザのＮＳ１タンパク質は、ＮＳ１アミノ酸の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％の欠失を含む。あるいは、ＮＳ１タンパク質の機能を完全に減弱させることもできる。本発明のインフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質は、機能性ＲＮＡ結合ドメインを欠失することができる。ＮＳ１タンパク質のアミノ末端にあるこのドメイン（１〜９３位のアミノ酸）の主要機能は、ｄｓＲＮＡを結合してＰＫＲの活性化を阻害することである（Ｄａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；８０（２３）：１１６６７−７７）。

本発明によれば、機能性カルボキシ末端ドメインという用語は、宿主ｍＲＮＡのプロセシング機構を阻害することができるＮＳ１タンパク質内の領域を含むことができ、すなわち、その活性によって宿主細胞のＩＦＮ応答が抑制される。

Ｂ型インフルエンザのＮＳ１は、Ａ型インフルエンザ−のＮＳ１よりも、同様の機能を有するカルボキシ末端エフェクタードメインを欠失すると考えられる。Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質のＣ末端ドメイン（８４〜２８１位のアミノ酸位置）は、主にＩＦＮ−α／β応答の阻害を担っている（Ｄａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；８０（２３）：１１６６７−７７）。

本発明によれば、インフルエンザＢ型ＮＳ１タンパク質のカルボキシ末端ドメインは、機能しない状態にさせてもよい。当該技術分野で開示されている通り、このドメインを完全にまたは部分的に欠失することができるだけでなく、アミノ酸を置換または挿入することもでき、また残存ドメインの機能を試験することもできる（Ｄａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；８０（２３）：１１６６７−７７）。

本発明のＭ遺伝子の突然変異により、短縮した（例えば、８０個のアミノ酸よりも短い）ＮＳ１タンパク質を発現し、したがってインターフェロン感受性表現型を有するＢ型インフルエンザ変異株の作成が可能となる。このような変異株は、安全性と有効性の高い生弱毒化ワクチン株としてとりわけ使用することができると考えられる。

本発明のＭ遺伝子内の修飾は、具体的には、前記複製欠陥Ｂ型インフルエンザの増殖能力を増大させることができる。例えば、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異を含む８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質（ＮＳ１−８０）を発現するＢ型インフルエンザウイルスは、５＊１０⁵〜５＊１０⁷ ＴＣＩＤ₅₀の範囲の力価を達成したのに対して、ｗｔ Ｍ１タンパク質を有する同様のウイルスは、わずか３＊１０³〜３＊１０⁵ ＴＣＩＤ₅₀までにしか増殖しない。８０個のアミノ酸よりも短い、すなわち１４個、３８個、５７個または６４個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質を含むウイルスは、本発明のＭ遺伝子の修飾を用いてしかレスキューされず、１＊１０⁴〜３＊１０⁸ ＴＣＩＤ₅₀の範囲の力価にまで増殖した。また、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異は、とりわけＮＳ１短縮変異株の増強された増殖能力が株に特異的なものであるというより、むしろ普遍的なものであることを立証するために、遺伝的サブタイプの異なる別のＢ型インフルエンザウイルス（例えば、江蘇／１０／０３様）の骨格にも導入することができる。この骨格において、本発明のＭ１−Ｍ８６Ｖ突然変異は、ＮＳ１ ＯＲＦを完全に欠失しており、Ｖｅｒｏ細胞で１０⁷〜１０⁸ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの範囲の高い力価にまで増殖した、ΔＮＳ１−Ｂウイルスの作成を可能にした。

本発明の特定の実施形態によれば、組換え型インフルエンザウイルスは、
ａ） Ｍ１タンパク質の８６位のアミノ酸位置における修飾と、
ｂ） 機能性ＲＮＡ結合ドメインおよび機能性カルボキシ末端ドメインを欠失するＮＳ１タンパク質をコードする修飾ＮＳ１セグメントと、
ｃ） 場合によりＭ遺伝子の９５０位のヌクレオチド位置におけるサイレント突然変異と
を含むことができる。

本発明の別の実施形態として、組換え型複製欠陥Ｂ型インフルエンザウイルスはまた、異種配列を発現する、例えばケモカインもしくはサイトカインまたはこれらのフラグメントを発現するための媒介体としても使用することができる。

より具体的には、前記ウイルスは、
ａ． Ｍ１タンパク質の８６位のアミノ酸位置における修飾と、
ｂ． 機能性ＲＮＡ結合ドメインおよび機能性カルボキシ末端ドメインを欠失したＮＳ１タンパク質をコードする修飾ＮＳ１セグメントと、
ｃ． ＮＳ１遺伝子セグメントのスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位の間に挿入された異種配列と、
場合によりＭ遺伝子の９５０位のヌクレオチド位置におけるサイレント突然変異と
を含む、組換え型インフルエンザウイルスであってもよい。

本発明の好適な実施形態によれば、前記異種配列は、サイトカインもしくはケモカインまたはこれらのフラグメントもしくは誘導体を発現する。サイトカインは、免疫、炎症および造血を媒介し調節する小さな分泌タンパク質である。最も大きなサイトカインのグループは、免疫細胞の増殖と分化を促進するグループである。このグループ内には、白血球により産生されるサイトカインであるインターロイキン、および種々の細胞型により産生されるインターフェロンが含まれる。

インターフェロン（ＩＦＮ）は、細菌、ウイルス、寄生虫および腫瘍細胞などの因子による攻撃に応答して、哺乳動物、鳥類、爬虫類および魚類を含む脊椎動物の免疫系の細胞によって産生される天然の糖タンパク質のファミリーである。ヒトには３つの主要なインターフェロンのクラスがある。タイプＩインターフェロンは、１４種類のＩＦＮ−アルファサブタイプと、１種類のＩＦＮ−ベータ、オメガ、カッパーおよびイプシロンのアイソフォームを含む。タイプＩＩインターフェロンはＩＦＮ−ガンマからなり、最近発見された第３のクラスは、３種類のアイソフォームを有するＩＦＮ−ラムダからなる。

Ｔｈ１細胞は主にＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βを分泌するのに対して、体液性免疫応答に関連するＴｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０などのサイトカインを分泌する。Ｔｈ２タイプのサイトカインは、細胞内病原体に対する遅延型過敏応答を媒介し、Ｔｈ１応答を阻害する。

本来は化学遊走物質のサイトカインに由来するケモカインは、実際には５０を超えるメンバーを含み、免疫監視と炎症の過程において決定的な役割を果たす低分子量（単量体の形態で６〜１２ｋＤａ）の小さな誘導性の分泌タンパク質のファミリーを表す。これらは、免疫と炎症における機能に応じて、２つのクラスに区別することができる。炎症性ケモカインは、多くの異なる組織細胞により産生されるほか、細菌毒素ならびにＩＬ−１、ＴＮＦおよびインターフェロンなどの炎症性サイトカインに応答して白血球を遊走させることにより産生される。このケモカインの主要な機能は、宿主防御の目的や炎症過程で白血球を補充することである。一方、ホーミングケモカインは、リンパ系組織の所定の領域で構成的に発現する。ホーミングケモカインは、免疫系内のリンパ球および樹状細胞のトラフィックとホーミングを指揮する。ＢＣＡ−Ｉ、ＳＤＦ−１またはＳＬＣで例示されるこれらのケモカインは、成熟、分化、活性化の状況下におけるリンパ球の再配置と再循環を制御し、第２のリンパ系臓器内でリンパ球が適切にホーミングできるようにする。

本発明によれば、生物活性を有するサイトカインもしくはケモカインまたはこれらの誘導体もしくはフラグメントは、ＮＳ１タンパク質を発現するＯＲＦとは異なるオープンリーディングフレームを使用して、安定的かつ効果的に発現することができることが明らかにされている。あるいは、タンパク質の効率的な分泌をさらに支援し、ｉｎ ｖｉｖｏできわめて効率的な免疫応答の誘導を示す、天然のシグナルペプチド以外の別のリーダー配列を、サイトカインまたはケモカインに融合することもできる。驚くべきことに、成熟したサイトカイン／ケモカインに対応するアミノ酸配列を、シグナルペプチドとして機能するアミノ酸配列を介してＮＳ１タンパク質の一部に融合した場合にも、ケモカインおよびサイトカインを効率的に発現することができる。例えば、これはマウスＩｇカッパーシグナルペプチドの一部であってもよい。

本発明によれば、異種配列は、好ましくは、インターロイキン２（ＩＬ−２）またはそのフラグメントもしくは誘導体をコードする。ＩＬ−２は、分泌シグナル配列を含み、抗原で活性化されたＴ細胞のクローン増殖に必要となる免疫調節性のＴ細胞由来分子である。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球によるＩＬ−２の分泌は、Ｔヘルパー細胞およびＴキラー細胞の増殖の誘導、ならびに他のサイトカインを産生させるＴ細胞への刺激などの多様な生物学的効果を有する。さらにまたＩＬ−２は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージも活性化することができる。ＩＬ−２が非リンパ性細胞を感染させた組換え型ウイルスから発現された場合は、このＩＬ−２の分泌により、ウイルス感染の病原性を著しく減少させ、免疫応答を変更することができると考えられる。また、ＩＬ−２は免疫アジュバントとして機能することも知られている。

本発明によれば、依然として生物活性を有する、すなわち免疫調節活性を示す、サイトカインおよびケモカインのいずれのフラグメントまたは誘導体も含まれる。

あるいは、サイトカイン／ケモカインはまた、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ３もしくはＣＣＬ２０またはこれらの誘導体もしくはフラグメントからなる群から選択することもできる。

あるいは、これは、結核菌（例えば、ＥＳＡＴ−６）に由来するいずれのエピトープまたは免疫調節領域であってもよい。

あるいは、異種配列はまた、抗原タンパク質または抗原ペプチドに融合されたサイトカインもしくはケモカインまたはこれらのフラグメントもしくは誘導体であるキメラタンパク質を含むこともできる。融合は直接的なものであっても、あるいは長さが少なくとも４個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸であるペプチドリンカー配列を介したものであってもよい。例えば、本発明のリンカー配列は、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳである。

ＩＬ−２キメラタンパク質の例は、当該技術分野で既知である。例示すると、これは、ＩＬ−２−ＰＥ４０（ＰＥはシュードモナスエキソトキシンＡである）、ＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＤＡＢはジフテリアトキシンである）、またはＩＬ−２ Ｂａｘ（Ｂａｘはヒト由来のアポトーシス促進タンパク質である）であると考えられる（Ａｑｅｉｌａｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２００３，１２９−１４０）。

本発明によれば、複製欠損インフルエンザベクターに導入される異種配列のヌクレオチド配列は、その天然配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を示す。これには、コドンの使用を考慮したヌクレオチド配列のいずれの最適化も含まれる。

あるいは、異種配列は、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープ、例えばインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡＴＢ）由来のＢ細胞エピトープ、例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）由来のＡループエピトープもしくはその一部、または１５０〜１５９位のアミノ酸配列に対応するＨＡの免疫優性エピトープの１つを示すペプチドを含むこともできる（Ｃａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｃｅｌｌ，４１７−４２７）。

このエピトープはまた、ＷＯ０６／１１９５２７に記載のメラノーマ関連内在性レトロウイルス（ＭＥＲＶ）に由来してもよい。

特定の実施形態によれば、ＮＳ１遺伝子セグメントは、機能性の天然スプライスドナー部位およびアクセプタースプライス部位を含むことができる。すなわち、スプライスドナーおよびアクセプター部位は天然の部位として確保されており、すなわち、ヌクレオチドは人工的な技法によって修飾されていない。

環境適応または天然の株発生に基づくインフルエンザウイルスの修飾により天然に生じるスプライス部位におけるヌクレオチド修飾はいずれも、天然の修飾であり、合成的または人工的修飾という用語に該当しない。

あるいは、スプライスドナーの周囲および／またはアクセプター部位の上流の配列を変更することもできる。好ましくは、変更または修飾は、ＮＳイントロンの５’境界の３ヌクレオチド５’側および／または８ヌクレオチド３’側、ならびにＮＳイントロンの３’境界の１００ヌクレオチド５’側および／または２ヌクレオチド３’側内で実施することが可能である。これは、好ましくは、スプライシング活性を変更するために合成配列を導入することによって行われる。

例えば、異種配列の挿入によりＮＳイントロンのサイズが拡大する場合は、スプライス効率を向上させることで組換え型ＮＳセグメントの遺伝的安定性を向上させるために、スプライスドナーおよび／またはアクセプター部位の周囲の配列を変更するのが好ましいと考えられる。

例えば、これは、ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡの５’末端に対する相同性が向上するように、スプライスドナー部位の周囲の配列、および／または分岐点を含むスプライスアクセプター部位の上流の配列のいずれかを変更し（Ｐｌｏｔｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．８３：５４４４−８；Ｎｅｍｅｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：９６２−７０）、ＮＳセグメントのスプライシングを増強する配列でピリミジン領域を置換することにより、修飾することができる。

スプライシングを最適化するために、スプライスアクセプター部位の５’に導入された好適な配列は、ラリアットコンセンサス配列およびピリミジン領域を含む。ウイルスベクターの安定性および異種配列の発現率を考えると、ＮＳ遺伝子中の特定の位置、例えばスライスアクセプター部位のすぐ上流に、ラリアットコンセンサス配列およびピリミジン領域を含む合成／修飾配列を導入するのが重要である可能性がある。

さらには、ＮＳセグメントのスプライシング率を変更するために、ラリアットコンセンサス配列とピリミジンドメインの間の距離を変更することが必要な場合もある（Ｐｌｏｔｃｈ Ｓ． ａｎｄ Ｋｒｕｇ Ｒ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３，５４４４−５４４８；Ｎｅｍｅｒｏｆｆ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９６２−９７０）。

例えば、組換え型Ｂ型インフルエンザ株は、配列番号１もしくは２に示すようなアミノ酸配列、または配列番号３〜１８のいずれか１つに示すようなヌクレオチド配列、または少なくとも９８％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性、好ましくは少なくとも９９，５％の配列同一性を有する前記配列の誘導体を含むことができる。

本発明によれば、「組換え型」という用語は、例えば逆遺伝学技術のような組換え技術を使用して作成されたすべてのインフルエンザ株を包含する。したがって、本発明のインフルエンザ株は、Ｍ遺伝子内に修飾を含むが、親株と比べて、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中にそれ以上の修飾を含まなくてもよい。

また医薬的に許容される担体と混合された、免疫原性を誘導する有効量のウイルスを含むワクチン組成物も包含される。また組成物中にアジュバントが含まれてもよい。

本発明によれば、「免疫原性」という用語は、ウイルスが、体液性または細胞性免疫応答、好ましくはこれらの両方を誘発することができることを意味する。免疫原性の本質は抗原性でもある。免疫原性を誘導する有効量のウイルスは、動物、好ましくはヒトに投与した場合に、体液性もしくは細胞性免疫応答またはこれらの両方を誘発する。

前記ワクチン組成物は、治療を必要とするヒト患者に免疫原性を誘導する有効量の組成物を投与することを含む、インフルエンザ疾患の予防的治療に使用することもできる。

ワクチン組成物は、本発明の完全なＢ型インフルエンザウイルスを含むことができるが、ウイルスセグメントの一部が別のＢ型インフルエンザ株に由来する、とりわけＭ１タンパク質が本発明の組換え型Ｂ型インフルエンザウイルスに由来するリアソータント株も含むことができる。さらに、本発明のＭ１−Ｍ８６Ｖ突然変異をその他いずれかのＢ型インフルエンザ株に導入することもできると考えられる。

前記組成物は、インフルエンザウイルスの感染を予防、管理、無力化、治療および／または改善する方法でまたは薬剤として使用することもできる。当然ながら、インフルエンザウイルス感染治療薬の製造における本発明のインフルエンザウイルスＭ分子の使用も含まれる。前記免疫原性組成物は、本発明の生または不活化いずれかのＢ型インフルエンザウイルスを含むこともできる。ウイルスは、当業者に周知の方法で不活化することができる。一般的な方法では、不活化にホルマリンおよび熱が使用される。

免疫原性が増強されるため、生の免疫原性製剤が好ましいと考えられる。このような生の組換え型免疫原性製剤の製造は、細胞培養または孵化卵（例えば、有胚鶏卵）でウイルスを増殖させた後に精製を行うことを含む従来の方法を使用して達成することができる。

「医薬的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されているか、米国で上市されていることを意味する。

「担体」という用語は、医薬組成物（例えば、免疫原性もしくはワクチン製剤）と併用投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒介体を指す。また、食塩水、デキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、液体担体として、具体的には注射液として使用することができる。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。適切な医薬担体の例については、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著の"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"に記載されている。前記製剤は投与様式に応じて選択する必要がある。また特定の製剤は、ウイルスが生ウイルスか不活化ウイルスかによって異なる場合もある。

アジュバントという用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。

本発明の免疫原性製剤の予防的および／または治療的効果は、免疫応答（例えば、体液性免疫応答）を達成または誘導することに部分的に基づいている。一態様において、免疫原性製剤は、被験者またはその動物モデル（例えば、マウス、フェレット、ラットもしくはイヌのモデル）のいずれかにおいてＢ型インフルエンザウイルスの抗原に対する抗体の検出可能な血清力価を誘導する。抗体の血清力価は、当業者に既知の技法、例えばＥＬＩＳＡまたはヘマグルチニン阻害試験などのイムノアッセイを使用して測定することができる。

また、本発明によれば、本発明のインフルエンザウイルスＭ分子を発現する組換え型発現系を使用することを含むウイルス作成方法もまた対象とする。本発明によれば、前記発現系は、例えばＨｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９７：６１０８−１３）に記載のような、いずれの有用なプラスミドであっても、ＥＰ０７４５０１７７に記載の線状発現構築物であってもよい。

リアソータントの開発および／または修飾インフルエンザウイルス株の発現には、Ｖｅｒｏ細胞の逆遺伝学系を使用することができる。この技術はすでに当該技術分野で周知である（Ｐｌｅｓｃｈｋａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（６），４１８８−４１９２，Ｎｅｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ，１９９９，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，５３，２６５−３００，Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９７：６１０８−１３）。

培養培地を用いたウイルスの培養に使用される細胞は、合成培地中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖が可能で、ウイルスの増殖に使用できるいずれの細胞であってもよい。本発明の適用範囲内において、「細胞」という用語は、個々の細胞、組織、臓器、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞、ハイブリドーマ細胞、初代細胞、継代細胞系、および／またはウイルスを発現する組換え型細胞などの遺伝子操作細胞の培養を意味する。例えば、これらは、ＢＳＣ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０の細胞、ＮＳ０、ＰｅｒＣ６（ヒト網膜細胞）、ニワトリ胚細胞または派生株、孵化卵細胞、有胚鶏卵または有胚鶏卵の派生株であってもよい。好ましくは、細胞系はＶＥＲＯ細胞系である。

ウイルスの作成に使用される培養培地は、ウイルス培養に適用可能な、先行技術から既知であるいずれの培地であってもよい。好ましくは、前記培地は合成培地である。例えば、これは、改良イーグル培地（ＭＥＭ）」、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改良イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｄ−ＭＥＭ−Ｆ１２培地、ウィリアムＥ培地、ＲＰＭＩ培地ならびにこれらの類似物および派生物であってもよい。また、これらは、ＶＰ−ＳＦＭ、ＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地、ＨｙＱ ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ（商標）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）Ｖｅｒｏ ＳＦＭ、ＥＰＩＳＥＲＦ、ＰｒｏＶｅｒｏ、いずれかの２９３またはＣＨＯ培地ならびにこれらの類似物および派生物のような、専用の細胞培養培地およびウイルス増殖培地であってもよい。これらの培地は、例えば動物血清および動物分画またはこれらの類似物、アミノ酸、成長因子、ホルモン、緩衝液、微量成分、トリプシン、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、Ｌ−グルタミンならびに生物緩衝液のような、細胞およびウイルス培養に適用可能な、先行技術から既知であるいずれの添加物を補充してもよい。好ましい培地は、Ｌ−グルタミンとトリプシンを補充したＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭである。

本発明のＭ遺伝子の修飾を使用すると、修飾されていないＭ遺伝子と改良されたＭ遺伝子のウイルス力価（ＴＣＩＤ₅₀）を比較した場合に、Ｂ型インフルエンザＮＳ１短縮変異株の増殖率を、ＮＳ１−３８ウイルスで示されたように、少なくとも約１００〜１０００倍増加させることができる。それぞれ１４個、５７個または８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質を発現するＢ型インフルエンザウイルスの場合は、このようなウイルスを作成するために、Ｍ遺伝子内の突然変異が絶対的に必要となる。これらのウイルスは、約１０⁶〜１０⁸ ＴＣＩＤ₅₀の力価まで増殖することができる。

本発明のさらなる実施形態は、本発明のインフルエンザウイルスＭ遺伝子および／または修飾Ｍ遺伝子を含む組換え型Ｂ型インフルエンザウイルスをコードする分離した核酸である。

さらに、前記核酸を製造する方法であって、本発明のＭ分子をコードするベクターにヌクレオチド配列を導入することを含む方法。ＤＮＡベクターを使用する場合、前記ベクターは、マイナスセンスのインフルエンザＲＮＡの転写系である。例えば、前記ベクターは、Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９７：６１０８−１３において使用するベクターであってもよい。

上述の説明は、以下の実施例を参照することによってより詳細に理解されるであろう。但し、このような実施例は、単に本発明の１つ以上の実施形態を実施する方法の典型例を示したものにすぎず、本発明の適用範囲を限定するものとして解釈してはならない。

野生型、ＮＳ１４、ＮＳ３８、ＮＳ５７およびＮＳ８０のＢ型インフルエンザＮＳ遺伝子（ａ）、ならびに野生型およびΔＮＳ１（ｂ）の模式的翻訳プロフィール。 １４個、３８個、５７個、８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質、または野生型ＮＳ１を発現する所定ウイルスのＮＳ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物。 Ｖｅｒｏ細胞（ａ）およびＡ５４９細胞（ｂ）における、１４個、３８個、５７個または８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質または野生型ＮＳ１をそれぞれ発現するインフルエンザＢ／マレーシアウイルスの増殖。 トランスフェクション後６日目における、３８個もしくは８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質またはｗｔ ＮＳ１を有し、ｗｔ Ｍ遺伝子またはＭ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子を含むインフルエンザＢ／マレーシア変異株のウイルス力価（ａ）、ならびにトランスフェクション後５日目における、ΔＮＳ１遺伝子を含むＢ／フロリダ変異株、または３８個もしくは８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質またはｗｔ ＮＳ１を有し、ｗｔ Ｍ遺伝子またはＭ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子を含むＢ／フロリダ変異株のウイルス力価（ｂ）。 最初のＢ／マレーシア／２５０６／０４様スワブＭ遺伝子と、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子およびｇｅｎｅｂａｎｋで公開された他の配列とのアミノ酸の比較。 Ｖｅｒｏ細胞（ａ）およびＡ５４９細胞（ｂ）における、ΔＮＳ１遺伝子または野生型ＮＳ１を含むインフルエンザＢ／フロリダウイルスの増殖。 Ｍ８６Ｖ突然変異（太字で記載、配列番号１）を含むＢ／ウィーン／３３／０６のＭ１タンパク質のアミノ酸配列（ａ）、およびＭ８６Ｖ突然変異（太字で記載、配列番号２）を含むＢ／チューリンゲン／０２／０６のＭ１タンパク質のアミノ酸配列（ｂ）。 構築したＢ型インフルエンザＮＳ変異株の概要。構築したすべてのＢ型インフルエンザ変異株の遺伝的構成（ａ）；Ｂ／ウィーン／３３／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｍ８６Ｖのヌクレオチド配列（配列番号３）（ｂ）；Ｂ／ウィーン／３３／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｍ８６ＶおよびＣ９５０Ｔのヌクレオチド配列（配列番号４）（ｃ）；Ｂ／チューリンゲン／０２／０６のＭ遺伝子Ｍ１−ｗｔのヌクレオチド配列（配列番号５）（ｄ）；Ｂ／チューリンゲン／０２／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｍ８６Ｖのヌクレオチド配列（配列番号６）（ｅ）；Ｂ／ウィーン／３３／０６のＭ遺伝子Ｍ１−Ｃ９５０Ｔのヌクレオチド配列（配列番号７）（ｆ）；ＮＳ１４のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）（ｇ）；ＮＳ３８のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）（ｈ）；ＮＳ５７のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）（ｉ）；ＮＳ６４のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１１）（ｊ）；ＮＳ８０のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１２）（ｋ）；ΔＮＳ１−ＢのＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１３）（Ｉ）；ΔＮＳ１−ＢのＢ／チューリンゲン／０２／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１４）（ｍ）。 それぞれ３８個、８０個、１０４個および１４５個のアミノ酸長のＮＳ１タンパク質を有するＩＬ２発現Ｂ型インフルエンザベクターの模式的翻訳プロフィール（ａ）；構築されたすべてのＩＬ２発現Ｂ型インフルエンザベクターの遺伝的構成（ｂ）；ＮＳ１−３８ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）（ｃ）；ＮＳ１−８０ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１６）（ｄ）；ＮＳ１−１０４ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１７）（ｅ）；ＮＳ１−１４５ＩＬ２のＢ／ウィーン／３３／０６ＮＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１８）（ｆ）。 Ｖｅｒｏ細胞での５回の継代後における、インフルエンザＢ／ＮＳ１−ｗｔ、Ｂ／ＮＳ１−３８およびＢ／ＮＳ１−３８ＩＬ２ウイルスのＲＴ−ＰＣＲ産物。

実施例１
複製欠損生弱毒化ワクチンとして使用することを目的とした、短縮ＮＳ１タンパク質を発現するＢ型インフルエンザウイルス。

Ｂ／ビクトリア／２／８７系統群の典型例としてＶｅｒｏ適応Ｂ型インフルエンザ株（Ｂ／マレーシア／２５０６／０４としてサブタイプしたＢ／ウィーン／３３／０６）を構築するための逆遺伝学系を作成した（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ２０００，ＰＮＡＳ ９７（１１）：６１０８−１３）。ＨＡおよびＮＡは、インフルエンザＢ／チューリンゲン／０２／０６（Ｂ／江蘇／１０／０３様）からクローニングした。Ｍ１タンパク質にコーディング突然変異を導入する（８６位のアミノ酸位置においてメチオニンをバリンに変更する）ことで、１４個、３８個、５７個および８０個のアミノ酸からなる短縮型のＮＳ１タンパク質を発現するインフルエンザ変異株を得ることができ、それぞれＢ／マレーシアＮＳ１−１４、ＮＳ１−３８、ＮＳ１−５７またはＮＳ１−８０と名づけた。ＮＳ１の翻訳は、２つの連続したインフレームの終止コドンにより終結させ、終止コドンの下流からＮＥＰのスプライシングシグナルまでの非翻訳部分を欠失させた（図１ａ）。ＮＳ遺伝子の長さが異なるため、異なる長さのＮＳ１タンパク質を含むウイルスは、そのサイズをもとに、ＲＴ−ＰＣＲによって識別することができる（図２）。作成したすべての変異株は、インターフェロン欠損Ｖｅｒｏ細胞で高い力価に至るまで複製したが（図３ａ）、インターフェロンコンピテントＡ５４９細胞では弱毒化した（図３ｂ）。

本発明のＭ遺伝子内の修飾は、具体的には、前記複製欠損Ｂ型インフルエンザウイルスの増殖能力を増大させることができる。例えば、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異を含む８０個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質（ＮＳ１−８０）を発現するＢ型インフルエンザウイルスは、トランスフェクション後６日目に分析すると、約５．６２＊１０⁴の力価に至るまで増殖したのに対して、Ｍ１に修飾を含まない類似のウイルスの力価は約１．３３＊１０⁴ ＴＣＩＤ₅₀であった（図４ａ）。３８個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質（ＮＳ１−３８）を発現するＢ型インフルエンザウイルスは、適応するＭ１突然変異なしでは全くレスキューすることができなかったが、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異を導入した場合には、約３．１６＊１０² ＴＣＩＤ₅₀の平均力価に至るまで増殖する（図４ａ）。この効果は、トランスフェクション後２回目の継代でさらに一層顕著になり、力価により反映された（第１表）。同じレスキュー効率は、それぞれ１４個または５７個のアミノ酸からなるＮＳ１タンパク質を発現するＢ型インフルエンザウイルスでも認められ、このウイルスは、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異の存在下においてのみレスキューされた（データ未掲載）。さらに、Ｖｅｒｏ細胞での適応継代により、すべてのＮＳ１変異株の効果的なワクチン製造に必要となる、６．５〜８．５ｌｏｇ ＴＣＩＤ₅₀の範囲の高い力価がもたらされた（図３ａ）。本発明の突然変異は、ｗｔ ＮＳ１ウイルスの増殖に対して全くまたはごくわずかしか影響を及ぼさないと考えられる。非修飾Ｍ遺伝子を含むｗｔ ＮＳ１ Ｂ型インフルエンザウイルスは、トランスフェクション後６日目（図４ａ）、およびトランスフェクション後２回目の継代で（第１表）、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異を含む類似のウイルスよりもわずかに高い力価に至るまで増殖した。これは、トランスフェクション後１回目の継代の増殖によって示されたように、異なる継代間の増殖の変動によって説明することができる（どちらもｗｔ ＮＳ遺伝子を含むｗｔ Ｍ遺伝子では１．７８＊１０⁷ ＴＣＩＤ₅₀であったのに対して、同じくｗｔ ＮＳ遺伝子を含むＭ１−Ｍ８６Ｖでは２．８２＊１０⁷ ＴＣＩＤ₅₀）。

第１表

ｗｔまたはＭ１−Ｍ８６ＶのいずれかのＭ遺伝子と組み合わせたｗｔ、ＮＳ８０またはＮＳ３８ ＮＳ１タンパク質を有するＢ型インフルエンザウイルスの、感染後４日目、トランスフェクション後２回目の継代で分析したウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）。

したがって、この新規の突然変異によってのみ、非機能性ＮＳ１を有する短い（すなわち、最初のＮ末端の８０個のアミノ酸よりも少ない数を含む）ＮＳ１タンパク質を発現し、したがってインターフェロン感受性表現型を有するＢ型インフルエンザ変異株の作成が可能となる。したがって、このような変異株は、ワクチン株として使用することができると考えられる。この突然変異はこれまで一度も報告されたことがなく、ＮＩＢＳＣ配列データベースにも存在しなかった。図５は、Ｍ遺伝子の最初のＢ／マレーシア／２５０６／０４様スワブの配列と、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ遺伝子およびｇｅｎｅｂａｎｋで公開された他の配列との比較を示す。

実施例２
本発明のＭ１タンパク質（Ｍ８６Ｖ）の突然変異により、種々のＢ型インフルエンザ系統群において、短縮ＮＳ１タンパク質を有するＢ型インフルエンザウイルスをＶｅｒｏ細胞で作成することが可能となる。

他のＢ型インフルエンザ株におけるＭ１−Ｍ８６Ｖ突然変異の影響を試験するため、Ｂ／山形／１６／８８系統群の典型例として、インフルエンザＢ／チューリンゲン／０２／０６（Ｂ／江蘇／１０／０３様）を作成するための逆遺伝学系を作成し、Ｍ１タンパク質内の既述の突然変異（Ｍ８６Ｖ）を導入した。北半球での２００８／２００９シーズンにおけるインフルエンザワクチン株に関するＷＨＯの推奨に従うため、Ｂ／フロリダ／０４／０６様ウイルスのＨＡおよびＮＡを使用した。３８個および８０個のアミノ酸からなる短縮型のＮＳ１タンパク質を発現するＢ型インフルエンザ変異株、またはモノシストロニックＲＮＡとしてＮＳ２／ＮＥＰを発現し、ＮＳ１のＯＲＦに完全な欠失が見られる変異株（ΔＮＳ１−Ｂ）（図１ｂ）を得て、それぞれＢ／フロリダＮＳ１−３８、ＮＳ１−８０またはΔＮＳＩ−Ｂと名づけた。Ｂ／ビクトリア／２／８７系統群の典型例であるＢ／マレーシアの変異株の場合と同じく、Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異は、山形系統群の典型例であるＢ／フロリダのＮＳ１−８０およびＮＳ１−ｗｔウイルスのレスキュー効果に対して、ごくわずかな影響しか及ぼさなかった（図４ｂ）。このことは、ｗｔ Ｍ遺伝子を含む変異株に比べてトランスフェクション後５日目にわずかしか力価が増加しなかったことにより示された（図４ｂ）。Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異を含むＮＳ１−３８変異株のウイルス力価は、ｗｔ Ｍ１類似体よりも約４ｌｏｇ高かった。Ｍ１−Ｍ８６Ｖ突然変異により、本発明者らは、トランスフェクション後５日目にほぼ４ｌｏｇの力価に達するΔＮＳ１−Ｂウイルスをレスキューすることができた（図４ｂ）。

ΔＮＳ１−Ｂウイルスの複製欠損表現型を示すため、本発明者らは、対応するｗｔウイルスと比較した、ＩＦＮ欠損Ｖｅｒｏ細胞（図６ａ）およびＩＦＮコンピテントＡ５４９細胞（図６ｂ）でのウイルスの増殖能力を調べた。いずれのウイルスが、Ｖｅｒｏ細胞での増殖動態はほぼ同じであり、１０⁷〜１０⁸ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの範囲の力価に達した。ＩＦＮコンピテントＡ５４９細胞では、ΔＮＳ１−Ｂウイルスの複製が完全に抑制され、２×１０² ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの検出限界を超える増殖は示されなかったが、ＮＳ１−ｗｔウイルスは、３．１５×１０⁸ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの高い力価に至るまで複製した。変異株ウイルスのＮＳ１８０およびＮＳ１−３８は、中間の複製能力を示した（データ未掲載）。

これらのデータは、適応性Ｍ１突然変異が１つのウイルス株で増殖最適化効果を有するばかりでなく、他のＢ型インフルエンザ系統群においても有効であると思われることを示している。さらにデータは、この突然変異が、ＮＳ１ ＯＲＦを完全に欠失し、Ｖｅｒｏ細胞で高い力価に至るまで増殖するΔＮＳ１−Ｂウイルスをレスキューするのに不可欠であることを示している。したがって、これは、弱毒化機構が主要なインターフェロンアンタゴニストであるＮＳ１の除去に基づいている複製欠損Ｂ型インフルエンザウイルスを作成するための普遍的な発想である。

実施例３
とりわけ高齢者における免疫原性が増強された有望な生弱毒化インフルエンザワクチンとして、バイシストロニックな発現方法を用いてＮＳ遺伝子からヒトインターロイキン２を発現するＢ型インフルエンザウイルスベクター。

ヒトＩＬ２のコード配列が続いた、重なり合う終止−開始コドンカセット（ＴＡＡＴＧ）を、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質の３８位、８０位、１０４位または１４５位のアミノ酸位置の後にそれぞれ挿入された。さらに、最適化されたスプライス部位である２０塩基のピリミジン領域セグメント（最適化スプライス）が続いた、ラリアットコンセンサス配列を含む２９個のヌクレオチドの合成配列が、ＩＬ２の終止コドンとＮＳ２のスプライスアクセプター部位の間の部分を置換する（ＥＰ７４５０１７６．８）（図９ａ）。

本発明のＭ１タンパク質内の突然変異（Ｍ８６Ｖ）を導入することによって、本発明者らは、インフルエンザＢ／チューリンゲン／０２／０６（Ｂ／江蘇／１０／０３様）の骨格中のＢ型インフルエンザウイルスＢ／ＮＳ１−３８ＩＬ２をレスキューすることに成功した。本発明のＭ１タンパク質内の修飾がなければ、このウイルスはレスキューされなかった。「空のベクター」であるＢ／ＮＳ１−３８と比べて、Ｂ／ＮＳ１−３８ＩＬ２の増殖はわずかに低かったが、６ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬを超える力価が達成された（第２表）。この株をＶｅｒｏ細胞でさらに５回継代して、遺伝的安定性を調べた。欠失変異株を示す可能性があるより小さなＰＣＲバンドが出現することなく、ＮＳ遺伝子の予想したサイズのＲＴ−ＰＣＲバンドが存在することによって示されるように、欠失変異株の出現は認められなかった（図１０）。

Ｂ／ＮＳ１−３８ＩＬ２に感染したＶｅｒｏ細胞は、２．５μｇ／ｍＬを超える高レベルのＩＬ２を分泌したのに対して、非感染細胞（偽感染）、Ｂ／ＮＳ１−３８またはＢ／ＮＳ１−ｗｔに感染した細胞では、検出可能なレベルのＩＬ２は分泌されなかった。（第２表）。このようなベクターは、すでにＡ型インフルエンザで示されているように、とりわけ高齢者において免疫原性が増強された生インフルエンザワクチンとして使用することができると考えられる（Ｆｅｒｋｏ，Ｋｉｔｔｅｌ ｅｔ ａｌ ２００６）。

第２表 指定ウイルスのＶｅｒｏ細胞における複製およびヒトＩＬ２の発現レベル

本発明者らは、３つすべての実施例で作成したウイルスの免疫原性を調べた。これらのデータから、本発明者らは、それぞれのＡ型インフルエンザウイルスの同等の免疫原性データから示されているように、本発明のＭ１−Ｍ８６Ｖ突然変異が構築したウイルスの免疫原性に対して悪影響を及ぼすことはないと結論づける。

Claims (22)

1. Ｍ遺伝子の２６５〜２９４位のヌクレオチド位置のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチド、好ましくは２７７〜２８５位のヌクレオチド位置のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチド、より好ましくは２８０〜２８２位のヌクレオチド位置のいずれか１つにおける少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子。
2. ２８０〜２８２位にヌクレオチドＧＴＧ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＴ、ＧＵＧ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＵを含む、請求項１に記載のＢ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子。
3. Ｍ１タンパク質の８２〜９０位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８５〜８７位のアミノ酸位置のいずれか１つ、好ましくは８６位のアミノ酸位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を生じる少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子。
4. 前記置換されたアミノ酸が非極性で疎水性のアミノ酸である、請求項１から３のいずれか１項に記載のＢ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子。
5. 前記アミノ酸がバリンである、請求項１から４のいずれか１項に記載のＢ型インフルエンザウイルスＭ遺伝子。
6. 請求項１から５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスＭ遺伝子を含む、組換え型Ｂ型インフルエンザウイルス。
7. 前記ウイルスがリアソータントウイルスである、請求項６に記載の組換え型ウイルス。
8. 前記ウイルスが弱毒化されているかまたは複製欠損であり、好ましくは前記ウイルスが完全な複製欠損である、請求項６または７に記載の組換え型インフルエンザウイルス。
9. 前記ウイルスが前記ＮＳ遺伝子内に修飾を含む、請求項６から８のいずれか１項に記載の組換え型インフルエンザウイルス。
10. 前記ウイルスが、機能性ＲＮＡ結合ドメインおよび機能性カルボキシ末端ドメインを欠失したＮＳ１タンパク質をコードする修飾ＮＳ１セグメントを含む、請求項６から９のいずれか１項に記載の組換え型インフルエンザウイルス。
11. ａ． 前記Ｍ１タンパク質の８６位のアミノ酸位置における修飾と、
    ｂ． 機能性ＲＮＡ結合ドメインおよび機能性カルボキシ末端ドメインを欠失したＮＳ１タンパク質をコードする修飾ＮＳ１セグメントと、
    ｃ． 場合により前記Ｍ遺伝子の９５０位のヌクレオチド位置におけるサイレント突然変異と
    を含む、組換え型インフルエンザウイルス。
12. ａ． 前記Ｍ１タンパク質の８６位のアミノ酸位置における修飾と、
    ｂ． 機能性ＲＮＡ結合ドメインおよび機能性カルボキシ末端ドメインを欠失したＮＳ１タンパク質をコードする修飾ＮＳ１セグメントと、
    ｃ． 前記ＮＳ１遺伝子セグメントのスプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位の間に挿入された異種配列と、
    ｄ． 場合により前記Ｍ遺伝子の９５０位のヌクレオチド位置におけるサイレント突然変異とを含む、組換え型インフルエンザウイルス。
13. 配列番号３〜１８のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を含む、組換え型Ｂ型インフルエンザウイルス。
14. 配列番号１または２に示すアミノ酸配列、または少なくとも９８％の配列同一性を有する前記配列の誘導体を含む、組換え型Ｂ型インフルエンザウイルス。
15. 医薬的に許容される担体と混合された、請求項６から１４のいずれか１項に記載の免疫原性を誘導する有効量のウイルスを含む、ワクチン組成物。
16. 治療を必要とするヒト患者に、請求項１５に記載の免疫原性を誘導する有効量の組成物を投与することを含む、インフルエンザの予防的治療法。
17. 請求項６から１４のいずれか１項に記載のウイルスを作成する方法であって、逆遺伝学系において、請求項１から５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスＭ分子を発現する組換え型ベクターを導入することを含む、方法。
18. 複製欠損Ｂ型インフルエンザウイルスの増殖率を増加させる方法であって、前記Ｂ型インフルエンザウイルスが、請求項１から５のいずれか１項に記載のＭ遺伝子を含む、方法。
19. 請求項１から５のいずれか１項に記載のインフルエンザウイルスＭ遺伝子をコードする分離した核酸。
20. 請求項１９に記載の核酸を製造する方法であって、請求項１から５のいずれか１項に記載のＭ分子をコードする核酸にヌクレオチド配列を導入することを含む、方法。
21. インフルエンザウイルス感染の治療または予防において薬剤として使用する、請求項１から５のいずれかに記載のインフルエンザウイルスＭ分子。
22. インフルエンザウイルス感染治療薬の製造における、請求項１から５のいずれかに記載のインフルエンザウイルスＭ分子の使用。

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