CN107208071B

CN107208071B - 用于流感病毒的减弱活疫苗

Info

Publication number: CN107208071B
Application number: CN201580061643.XA
Authority: CN
Inventors: 陈鸿霖; 郑敏; 袁国勇
Original assignee: Versitech Ltd
Current assignee: Versitech Ltd
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: CN107208071A; WO2016074644A1; EP3218470A4; HK1244506A1; US9827304B2; AU2015345579B2; EP3218470B1; AU2015345579A1; EP3218470A1; US20160136261A1

Abstract

本发明涉及减弱流感病毒，以及相关的疫苗和方法，其包含遗传上修饰的病毒基因组。所述遗传上修饰的病毒基因组包含非‑结构(NS1)编码段中的中断和基质膜蛋白编码段中的一个或多个碱基置换。所述遗传修饰导致丧失NS1功能性但依然能够复制的病毒。

Description

用于流感病毒的减弱活疫苗

与相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年11月13日提交的美国临时专利申请序列号62/079,227的权益，所述临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明背景

由于并发症，流感(flu)的年度流行病和大流行在全球引起显著的疾病负担和超额死亡率。认为接种flu疫苗是减轻流感引起的疾病负担和死亡率以及预防未来在人类中大流行的最有效方式。当前市场上存在两种类型的flu疫苗，裂解疫苗（split fluvaccine）和冷适应减弱疫苗。两种疫苗的缺陷早已得到公认。当前的裂解flu疫苗具有低免疫原性并且不能响应于迅速出现的毒株，例如引起2009大流行的H1N1毒株，在短时间内准备好。对于裂解疫苗弱免疫原性已广为人知，特别是在老年人和幼儿之中。另一方面，冷减弱疫苗仅允许在2-49岁的人群中使用。这些问题限制了flu疫苗对最需要它们的人群的益处。低成本、丰富和有效疫苗(能够诱发更稳健的免疫应答)的快速生产对于流感，特别是幼儿和老人中的季节性流感的干预和预防是理想的。

自从1997年在香港出现人类感染禽H5N1病毒以来，人类感染禽流感病毒的其它亚型，包括H9N2、H7N7、H6N1、H7N9、H5N6和H10N8，已在家禽中传播这些禽流感病毒亚型的国家报道。在这些新出现的流感病毒之中，至今已从16个国家鉴定了650例人类感染H5N1病毒，其中386例为致死的(参见，环球网站：who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20140124CumulativeNumberH5N1cases.pdf

ua=1)。最近，2013年H7N9病毒在中国的出现已导致450个人类病例，其中165例为致死的(http://www.who.int /influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/riskassessment_h7n9_27june14.pdf)。

在中国还报道了人类感染其它新的禽流感病毒亚型，例如H10N8和H5N6。令人担心的是这些亚型中的一些可在人类中获得进一步的适应或成为与季节性flu病毒的重配株并引起新的大流行。H1N1 2009大流行的经历显示制备用于人类接种的疫苗从病毒出现到可用于公众之前需要6个月以上。当前的flu疫苗开发将不满足大流行流感迅速传播的性质的需求。可以肯定未来将有新的大流行；然而，预测时间和病毒亚型是不可能的。

新的减弱活流感(flu)疫苗将满足季节性和大流行疫苗的需求。与裂解或灭活疫苗相比减弱活flu疫苗具有若干优点。第一，减弱活疫苗能够在接受者中诱发更好的免疫应答；第二，减弱活疫苗使用更少的疫苗免疫；最后，减弱活flu疫苗可通过鼻腔给予容易地应用。

发明概述

开发新疫苗技术以满足大流行预备状态的需求极其重要。因此，本发明提供可快速和容易生产的减弱流感病毒和疫苗配方。

在一个方面，本发明提供包含遗传上修饰的病毒基因组的减弱流感病毒。所述遗传上修饰的病毒基因组包含非-结构(NS1)编码段中的中断和基质膜（matrix membrane）蛋白编码段中的一个或多个碱基置换。

在另一个方面，本发明提供包含减弱流感病毒和药学上可接受的载体的疫苗配方，所述病毒包含病毒基因组的NS1编码段中的中断和病毒基因组的基质膜蛋白编码段中的一个或多个碱基置换。

在另一个方面，本发明提供用于产生减弱流感病毒的方法，包括：将中断的流感病毒NS1基因编码序列引入细胞或卵中；将流感病毒的基质膜编码序列引入细胞或卵中，其中所述基质膜编码序列包含一个或多个碱基置换并且所述细胞或卵包含产生流感病毒颗粒所需的其余流感病毒基因段和病毒蛋白；和培养细胞或卵，在其中减弱流感病毒被复制。

在又一个方面，本发明提供用于诱发对流感病毒的免疫应答的方法，包括给予受试者有效量的包含经基因工程改造的减弱流感病毒和药学上可接受的载体的疫苗配方，其中所述经基因工程改造的减弱流感病毒的基因组编码中断的NS1蛋白和一个或多个具有一个或多个错义突变的基质膜蛋白。

在所提供方面的一些实施方案中，NS1编码段中的中断为导致敲除所编码的NS1蛋白的缺失。所述减弱流感病毒可从流感病毒毒株，例如但不限于H7N9、H1N1和H5N1产生。在所提供的病毒、配方和方法的一些实施方案中，所述碱基置换选自G917A置换、A14U置换和其组合。

本文所描述的方法和组合物可与药学、医学和兽医应用，以及基础科学研究和方法学结合使用，如当阅读本公开内容时将对技术人员显而易见的。当考虑附图以及详述时本发明的这些和其它对象、特征和优势将变得更清楚。

附图简述

为了更全面理解本发明的性质，应参考结合附图所作的下列详述。

图1显示证实与野生型(WSN-WT)相比NS1-del重组病毒(WSN-DelNS1)中NS1基因的缺失的DNA琼脂糖凝胶结果。

图2显示表明在细胞中若干传代后NS1缺失的H1N1 (A/Wisconsin/1/33)毒株的M段中的置换的测序数据。在细胞中传代H1N1 NS1-del病毒并在传代病毒稳定后测序病毒基因组。在NS1-del H1N1病毒的M段中鉴定到单一置换，A14U。

图3显示表明在细胞中若干传代后NS1缺失的H7N9病毒的M段中的置换的测序数据。在细胞中传代H7N9 NS1-del病毒并在传代病毒稳定后测序病毒基因组。在NS1-delH7N9病毒的M段中鉴定到单一置换，G917A。

图4为显示H1N1 NS1-del和野生型H1N1病毒在Vero细胞中的生长性质的图。评估H1N1 NS1-del病毒的生长能力并与野生型病毒(WSN-WT)比较。WSN-delNS1-M-WT、WSN-delNS1-A14U和WSN-delNS1-M-CA2为分别包含具有WT、A14U和CA2置换的M段的NS1缺失病毒。CA2用作参考毒株，因为其先前在PR8病毒中已有描述(Wielink等人，2012, J. Virol 86(22): 12341.)。在本实验中，分别用WSN WT或多种NS1-缺失突变体(以0.001 MOI)感染Vero细胞。使用MDCK细胞通过噬菌斑测定在不同的时间点(感染后天数)评估病毒滴度(pfu)。如图中所示，我们发现WSN-delNS1-A14U病毒在Vero细胞中比delNS1-M-WT和WSN-delNS1-M-CA2复制更高的滴度。

图5为显示NS1-del和野生型H7N9病毒在Vero细胞中的生长性质的图。评估H7N9NS1-del病毒(ZJ1-DelNS1-M-G917A)的生长能力并与野生型病毒(ZJ1-WT)比较。

图6为显示NS1-del病毒(WSN-DelNS1-M-A14U)不能抑制受感染细胞中干扰素β表达的图。

图7显示表明与野生型M段(表示为WSN-DelNS1-M-WT)相比NS1-del病毒(表示为WSN-DelNS1-M-A14U)的M段中的突变增强M2但下调M3从M段转录的图。

图8显示小鼠模型中NS1-del和野生型病毒的致病性检验的结果图。按照说明用5x 10⁴的每种病毒或3 μg的裂解H7N9疫苗的接种物接种6只小鼠的组群。每日观察小鼠的体重变化持续14天(第0天-第14天)。丧失超过其感染前体重的25%的动物依照动物伦理学的方案安乐死并计入致死性结果。

图9显示对于标明的感染后天数小鼠中的平均体重变化百分数的图，其表明接种NS1-del疫苗保护小鼠免于H7N9病毒的致死剂量攻击。从图8中所示的实验存活的小鼠然后用1 x 10⁵ pfu的H7N9 WT病毒攻击。每日观察小鼠的体重变化持续14天(第0天到第14天)。丧失超过其感染前体重的25%的动物依照动物伦理学的方案安乐死并计入致死性结果。截至H7N9病毒攻击后实验的第10天用PBS接种的所有小鼠死亡。用裂解疫苗接种的小鼠显示明显的体重丧失但能够从感染恢复。用WSN-delNSA-M-A14U接种的小鼠在感染开始时显示体重轻微下降并迅速恢复。用WT H7N9病毒攻击后在用H7N9-delNS1-M-G917A或H7N9-delNS1-M-G917A-A14U接种的小鼠之中未观察到症状或体重丧失。

图10显示DelNS1 H1N1病毒交叉保护高致病性禽H5N1病毒攻击。小鼠用一剂(10⁴PFU) WSN-DelNS1-M-A14U、2009H1N1-DelNS1、2009 H1N1-冷适应病毒接种或用PBS模拟接种持续两周，然后用100 MLD₅₀的A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒攻击。H5N1病毒攻击之后记录小鼠的体重丧失(A)和(B)存活率持续14天。

图11显示DelNS1减弱活疫苗提供比冷适应疫苗更好的对H5N1病毒的高剂量攻击的交叉保护。小鼠用一剂(10⁴ PFU) 2009H1N1-DelNS1、H7N9De3NS1-G917A、2009 H1N1-冷适应病毒接种，或用PBS模拟接种，持续两周然后用1000 MLD₅₀的A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒攻击。H5N1病毒攻击之后记录小鼠的体重丧失(A)和(B)存活率持续14天。

图12显示稳定WSN-DelNS1病毒的构建和建立。(A) NS段转录物以及具有NS1缺失的NS突变体的示意图。DelNS1质粒通过缺失NS段中范围为nt 57-528的内含子区构建。NCR，非编码区。(B) 拯救的DelNS1病毒中NS1缺失的确认。从P1病毒提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增NS段并使用琼脂糖凝胶电泳分析。(C) DelNS1和野生型A/WSN/33病毒的噬菌斑尺寸。(D)每次传代后DelNS1病毒的滴度(PFU/ml)。(E) DelNS1病毒基因组的序列分析揭示M段非编码区中核苷酸14位处的A-U置换。非编码区用黑线标记，A14U突变用箭头指示。(F) 包含M-WT与M-A14U、M-A14U-CM15、M-A14C和M-A14G置换的WSN-DelNS1病毒的拯救效率比较。NR，未拯救到。(G) 包含M-WT或M-A14U的PR8-DelNS1病毒的拯救效率。DelNS1病毒在混合的HEK293T和MDCK细胞培养物中用标注的M-WT或M突变体质粒拯救，然后通过噬菌斑测定滴定。标绘的值为平均值(±标准差[SD]) (n = 3)并且代表来自至少5个独立实验的数据。

图13显示M-A14U-DelNS1病毒在MDCK和Vero细胞的生长动力学。(A和B) 使用柱-纯化的反向遗传WSN-WT、WSN-DelNS1-M-A14U和WSN-DelNS1-M-WT病毒以复合感染(MOI)0.1感染MDCK细胞(A)或Vero细胞(B)。在标明的时间点收集上清液并通过噬菌斑测定滴定病毒。(C) 使用柱-纯化的反向遗传PR8-WT和PR8-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染MDCK细胞(左侧面板)和Vero细胞(右侧面板)。感染后24 h收集上清液并通过噬菌斑测定滴定。标绘的值(平均值± SD；n = 3)为来自至少3个独立实验的代表性数据。

图14显示WSN-DelNS1病毒中IFN-β抑制活性的丧失。(A) 在用WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U以MOI 1或用阳性对照，SeV，以50 HA单位感染之前24小时用IFN- 报告基因质粒转染HEK293T细胞。24 h后，收集细胞并准备细胞裂解物用于评估荧光素酶活性。荧光素酶测定一式三份进行，并将值对海肾（Renilla）荧光素酶对照归一化。(B) MDCK细胞用WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U以MOI 0.1感染并培养16 h后通过qRT-PCR定量IFN-β和病毒NP mRNA水平。值对犬肌动蛋白归一化。(C) 通过非变性凝胶电泳分析用WSN-WT、WSN-DelNS1-M-A14U或SeV感染的HEK293T细胞中IRF3二聚作用的抑制。(D) 比较在用WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒感染的MDCK细胞中抑制IFN-β表达的活性。与对于面板B所描述的实验相似，MDCK细胞用标明的病毒以MOI 0.1感染，并在感染后16 h通过qPCR定量IFN-β和NP mRNA水平。值对犬肌动蛋白归一化。(E) 6-8周龄的6只 BALB/c小鼠的组群用5 x 10⁴ PFU的WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U突变体病毒鼻内接种，感染后每天监测体重持续14天。(F) 受感染小鼠的肺组织中病毒的复制效率。3只小鼠的组群用10⁴ PFU的WSN-WT、WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U突变体病毒感染，然后在感染后72 h安乐死，收集每一小鼠的肺组织并均质化用于使用MDCK细胞通过噬菌斑测定滴定病毒。统计显著性通过单向方差分析(ANOVA)或Student’s t检验分析(**, p < 0.01)。标绘的条显示平均值± SD (n = 3)，并且结果代表至少三个独立实验。

图15显示M-A14U突变对M1和M2蛋白表达的作用。(A) MDCK细胞用WSN-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 2感染。在标明的时间点收集细胞并通过蛋白质印迹用特异性抗体分析细胞裂解物，如材料与方法中所描述的。(B) MDCK细胞用WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染后16 h，收集细胞裂解物用于用特异性抗体蛋白质印迹。(C) MDCK细胞用WSN-WT或WSN-M-A14U病毒以MOI 5感染。在标明的时间点制备细胞裂解物用于用特异性抗体蛋白质印迹。β-微管蛋白作为上样对照包含在内。所有的结果均代表三个独立实验。

图16显示M-A14U置换对M转录物的选择性剪接的作用。(A) M段转录物的示意图。vRNA M段的3’ NCR的序列以红色显示，mRNA3剪接供体(SD)位点用黄色突出显示。供体位点的剪接共有序列在非编码区序列上用绿色标明(M、A或C；R、A或G)。(B) 病毒-感染细胞中不同M mRNA水平的分析。MDCK细胞用标明的病毒以MOI 0.1感染。感染后16 h分离总RNA。通过定量RT-PCR测定M1、M2、mRNA3和M4的mRNA水平，如材料与方法中所描述的。(C) HEK293T细胞用pHW2000-WSN-M-WT或pHW2000-WSN-M-A14U质粒转染，用或不用pCX-WSN-NS1共转染用于共表达NS1。转染后48 h，分离总RNA。DNA酶处理后，通过定量RT-PCR测定mRNA水平。(D)MDCK细胞用PR8-WT、PR8-M-A14U或PR8-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染后16 h，分离总RNA并通过qPCR测量mRNA水平。示出了M2/M1 mRNA和mRNA3/M1 mRNA比率。标绘的所有结果均指示平均值± SD (n = 3)并且代表三个独立实验。

图17显示M-A14U置换对M2/M1 mRNA比率的作用。(A) MDCK细胞用WSN-WT、WSN-M-A14U、WSN-M-A14G或WSN-MG12C-CM13病毒以MOI 5感染。在标明的时间点提取总RNA并通过定量RT-PCR测定mRNA3的水平。(B) WSN-WT、WSN-M-A14U、WSN-M-A14G和WSN-M-G12C-CM13病毒的生长动力学分析。MDCK细胞用这些病毒以MOI 0.001感染。在标明的时间点收集上清液并通过噬菌斑测定滴定。(C - E) MDCK细胞用WSN-WT、WSN-M-A14U、WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染后16 h，分离总RNA，并通过定量RT-PCR测定M2/M1、mRNA3/M1和M4/M1 mRNA比率。(F) mRNA3对病毒复制的作用。HEK293T细胞在用WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染之前24 h用pCX-WSNmRNA3或对照载体转染。在标明的时间点收集上清液并通过噬菌斑测定滴定病毒。标绘的所有条和点指示来自三个独立实验的平均值± SD (n = 3)。**，学生t检验p = 0.0013。

图18显示病毒NS1和聚合酶蛋白对M mRNA剪接宿主机构的调节。(A) HEK293T细胞用递增量的pCX-WSN-NS1转染。转染后24 h，细胞用WSN-DelNS1-M-WT、WSN-DelNS1-M-A14U或WSN-WT病毒以MOI 0.5感染。转染后8 h分离总RNA并通过定量RT-PCR分析M1 mRNA、M2mRNA和mRNA3水平。(B) 用克隆入的pHW2000质粒的M段（表达M vRNA）的WT和多个突变体，与或不与pCX-WSN-NS1质粒一起转染HEK293T细胞。转染后48 h制备细胞裂解物用于用特异性抗体蛋白质印迹。β-微管蛋白作为上样对照包含在内。(C) A14U置换对M vRNA复制的作用。MDCK细胞用WSN-WT、WSN-M-A14U或WSN-M-A14G病毒以MOI 5感染。转染后4和10 h，分离总RNA用于qRT-PCR分析，并如上所述测定vRNA的相对量。(D) A14U置换增强MvRNA复制。MDCK细胞用WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒以MOI 0.1感染。感染后16 h分离总RNA。M和NP vRNA水平通过定量RT-PCR测定，如上所述。标绘的所有条显示平均值± SD (n= 3)。结果代表三个独立实验。**, p < 0.01; ***, p = 0.0002 (学生t检验)。

序列简述

SEQ ID NO: 1：NS-529F，用于反向PCR以缺失NS基因的内含子的正向引物。(5’-GACATACTGATGAGGATGTCAAAAATG-3’)

SEQ ID NO: 2：NS-56R，用于反向PCR以缺失NS基因的内含子的反向引物。(5’-CTGAAAGCTTGACACAGTGTTTGG-3’)

SEQ ID NO: 3：M-478F，用于WSN-M1和PR8-M1的实时PCR的正向引物。(5’-CGGTCTCATAGGCAAATGGT-3’)

SEQ ID NO: 4：M-616R，用于WSN-M1的实时PCR的反向引物。(5’-CAATATCCATGGCCTCTGCT-3’)

SEQ ID NO: 5：WSN-M2-F，用于WSN-M2和PR8-M2的实时PCR的正向引物。(5’-CCGAGGTCGAAACGCCTATC-3’)

SEQ ID NO: 6：WSNM2-R，用于WSN-M2、WSN-mRNA3和WSN-M4的实时PCR的反向引物。(5’- CTCTGGCACTCCTTCGGTAG-3’)

SEQ ID NO: 7：WSN-mRNA3-F，用于WSN-MRNA3和PR8-mRNA3的实时PCR的正向引物。(5’- AGCAAAAGCAGGCCTATC -3’)

SEQ ID NO: 8：WSN-M4，用于WSN-M4的实时PCR的正向引物。(5’-ACCGATCTTGAGGCCTATC-3’)

SEQ ID NO: 9：用于PR8-M1的实时PCR的反向引物。(5’-CAACCTCCATGGCCTCTGCT-3’)

SEQ ID NO: 10：用于PR8-M2和PR8-mRNA3的反向引物。(5’-CTTTGGCACTCCTTCCGTAG-3’)

SEQ ID NO: 11：NP-625F，用于WSN-NP的实时PCR的正向引物。(5’-GGTGAGAATGGACGGAGAAC-3’)

SEQ ID NO: 12：NP-738R，用于WSN-NP的实时PCR的正向引物。(5’-CCGGCTCTCTCTCACTTGAT-3’)

SEQ ID NO: 13：用于犬IFN-β的实时PCR的正向引物。(5’-CCAGTTCCAGAAGGAGGACA-3’)

SEQ ID NO: 14：用于犬IFN-β的实时PCR的反向引物。(5’-CCTGTTGTCCCAGGTGAAGT-3’)

SEQ ID NO: 15：用于犬β-肌动蛋白的实时PCR的正向引物。(5’-CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3’)

SEQ ID NO: 16：用于犬β-肌动蛋白的实时PCR的反向引物。(5’-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG -3’)

发明详述

参考仅用于说明性目的的实施例，下文描述了本发明的几个方面。应理解的是，许多具体细节、关系和方法为提供本发明的充分理解而列出。然而，相关领域普通技术人员将容易地认识到本发明可无一个或多个具体细节而实践或用其它方法、方案、试剂、细胞系和动物实践。本发明不受行为或事件的所说明的排序限制，因为一些行为可能以不同次序和/或与其它行为或事件同时发生。此外，实现本发明的方法学不需要所有的所说明的行为、步骤或事件。所描述的或本文引用的许多技术和程序为本领域技术人员所充分理解并使用常规方法学普通利用。

本发明提供制备敲除关键毒力基因，甲型流感病毒干扰素拮抗物，非结构蛋白(NS1)的减弱活甲型流感疫苗毒株(本文指定为NS1-del和DelNS1；术语可互换使用)的方法。NS1蛋白的敲除提供两个优点。第一，该病毒毒株对人类无毒力；第二，更重要的是NS1-del疫苗可从宿主诱发好得多的免疫应答，这是因为NS1对于先天和适应性免疫二者均为强拮抗物。通常，敲除NS1基因的甲型流感病毒不能在细胞或卵，例如含胚鸡蛋中良好生长；然而，本发明提供用于通过病毒基因组编码基质膜蛋白的段中的突变，例如A14U或G917A补偿病毒复制中的这一缺陷的机制。因此，本发明提供一种产生对人类无毒力并且可在短时间内生产以应用于季节性和大流行流感的预防的减弱疫苗的新方法。

在一个方面，本发明提供包含遗传上修饰的病毒基因组的减弱流感病毒。所述遗传上修饰的病毒基因组包含非-结构(NS1)编码段中的中断和基质膜蛋白编码段中的一个或多个碱基置换。所述遗传修饰导致无NS1蛋白的病毒；然而，该病毒保留其病毒复制能力(由于基质膜蛋白编码段中的碱基置换，其补偿NS1丢失)。

在另一个方面，本发明提供包含减弱流感病毒和药学上可接受的载体的疫苗配方，所述病毒包含病毒基因组NS1编码段的中断和病毒基因组的基质膜蛋白编码段的一个或多个碱基置换。

如本文所使用的，术语“疫苗”或“疫苗配方”是指刺激对特定一种抗原或多种抗原(即，流感病毒)的免疫应答的组合物。因此，疫苗指以建立对特定流感病毒的免疫应答和/或免疫记忆为目标给予受试者的组合物。也考虑疫苗组合物可包含设计用以增加疫苗产生免疫应答的能力的其它物质。还考虑本发明可在本文所公开组合物的混合物中提供一种以上的减弱病毒。例如，混合物可包含减弱H1N1病毒和减弱H5N1病毒。同样，所公开的方法可包括同时或分别给予多个疫苗。因此，本发明进一步包括给予第二种、第三种、第四种等减弱病毒；其中所述第二种、第三种、第四种等减弱病毒在单独的疫苗中给予，用于与第一种减弱病毒同时或在第一种减弱病毒之后1、2、3、4、5、6、10、14、18、21、30、60、90、120、180、360天(或中间的任何天数)给予。

如本文关于组合物和配方所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机关批准或在美国药典或其它用于动物和/或人类的普遍承认的药典中列出。

术语“载体”指与本文所述组合物一起给予的稀释剂、赋形剂和/或溶媒。这样的药学载体可为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。合适的药学赋形剂包括，但不限于，淀粉、葡萄糖、蔗糖、明胶、乳糖、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。本文所述组合物和配方可还包含润湿剂或乳化剂或悬浮/稀释剂，或pH缓冲剂，或用于修饰或维持组合物的释放速率的剂。配方可包括标准载体例如医药级的甘露醇、乳糖、糖精钠、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁等。这样的组合物和疫苗将包含有效量的减弱病毒以及合适量的载体以便基于使用的给予方式为患者提供适当形式。

如果用于静脉内给予，可将所述疫苗和组合物包装在无菌等渗水性缓冲的溶液中。若需要，所述组合物可还包含增溶剂。组合物的组分以单位剂量形式混合在一起或单独提供。若组合物通过输注给予，其可用包含无菌医药级水或盐水的输注瓶分配。若组合物通过注射给予，可提供无菌水或盐水的安瓿以便成分可在注射前混合。所述疫苗和组合物还可鼻内、气管内、口服、皮内、肌内、腹膜内或皮下给予受试者。

在另一个方面，本发明提供用于产生减弱流感病毒的方法，包括：将中断的流感病毒NS1基因编码序列引入细胞或卵中；将流感病毒的基质膜编码序列引入细胞或卵中，其中所述基质膜编码序列包含一个或多个碱基置换并且其中所述细胞或卵包含产生流感病毒颗粒所需的其余流感病毒基因段和病毒蛋白；和培养细胞或卵，在其中减弱流感病毒被复制。所述NS1中断，与基质膜编码序列中的一个或多个碱基置换组合，导致保留其在宿主细胞或卵中的复制能力的减弱流感病毒。

如本文所使用的，术语“受试者”指动物。通常，提及受试者时术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。正因如此，“受试者”包括进行免疫的动物，或本文所述组分的混合物，例如减弱病毒疫苗的接受者。术语“动物”包括，但不限于，小鼠、大鼠、狗、豚鼠、奶牛、马、鸡、猫、兔、猪、猴、黑猩猩和人类。

如本文所使用的，术语“有效量”指能够诱发必需的免疫应答或另外能够产生预期治疗作用的量。

在本发明病毒、疫苗配方和方法的一些实施方案中，所述NS1编码段中的中断为导致敲除所编码的NS1蛋白的缺失。在其它实施方案中，NS1编码段的中断导致截短的蛋白。截短的NS1蛋白丧失，至少，抑制受感染的细胞中干扰素β表达的能力。

在一些实施方案中，所述减弱的流感病毒可从甲型流感病毒毒株产生，例如，但不限于，H7N9、H1N1和H5N1。

在一些实施方案中，所述流感病毒基质膜编码序列中的碱基置换选自G917A置换、A14U置换和其组合。这样的碱基置换导致编码的基质膜蛋白产物，其包含一个或多个错义突变。这些突变导致补偿NS1功能丧失的突变体基质膜蛋白产物，这导致细胞和/或卵中病毒复制的至少部分拯救。在一些实施方案中，减弱病毒中病毒复制的拯救水平与野生型活病毒相当。

材料与方法

细胞和病毒

人胚肾(HEK) 293T (ATCC)和Vero细胞(ATCC)在添加10%胎牛血清、100单位/ml盘尼西林和100 μg/ml硫酸链霉素(Life Technologies)的Dulbecco’s最小必需培养基(DMEM)中于37℃培养，而MDCK (ATCC)细胞在添加相同量的血清和抗生素的Eagle’s最小必需培养基(MEM)中生长。甲型流感病毒通过反向遗传学拯救并在MDCK细胞中扩增，如先前所描述的。病毒使用Amicon Ultra-15离心过滤元件(100 KD) (Millipore)纯化以除去培养基中的细胞因子。仙台病毒(SeV)在含胚鸡蛋中繁殖。

质粒构建

进行反向PCR以缺失插入pHW2000载体的NS基因的内含子，将质粒磷酸化并自身连接。用于反向PCR的引物为5’-GACATACTGATGAGGATGTCAAAAATG-3’ (NS-529F, SEQ ID NO:1)和5’-CTGAAAGCTTGACACAGTGTTTGG-3’ (NS-56R, SEQ ID NO: 2)。对于点突变，使用QuikChange II定点突变试剂盒(Stratagene)。

DelNS1病毒的传代

本研究中进行DelNS1病毒的连续盲传（blind serial passage）。首先通过将包含8段流感病毒基因组的8个pHW2000质粒共转染入HEK293T/MDCK混合细胞培养物拯救DelNS1病毒；随后在转染后72 h收集上清液并指定为0代(P0)病毒。使用从拯救程序获得的P0病毒在T25烧瓶中于37℃感染MDCK细胞。二或三天后，转移上清液以感染新鲜MDCK细胞。在每代测量病毒滴度。5次传代后，当亚培养物中的病毒滴度稳定时，获取并分析每一代DelNS1病毒的全基因组序列。

报道基因测定

将HEK293T细胞接种在48-孔板上并用50 ng包含来自M段的非编码区的每一检验质粒和萤火虫荧光素酶报道基因共转染，连同10 ng 海肾荧光素酶报道基因作为对照。培养24 h后，依照制造商的说明(Promega)测量荧光素酶活性。对于IFN-β启动子活性报道基因测定，细胞在转染后24 h用标明的病毒以复合感染(MOI) 1 (甲型流感病毒)或50 HA单位(SeV)感染。使用海肾荧光素酶值将萤火虫荧光素酶值归一化。

生长动力学

用标明的病毒以MOI 0.1感染接种在24-孔板中的80-100%汇合的MDCK或Vero细胞。吸收1 h后，去除上清液并用500 μl磷酸-缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次。用包含1 μg/ml甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)-处理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM覆盖感染的细胞并于37℃孵育。在标明的时间点收集上清液并通过噬菌斑测定在MDCK细胞中测定病毒滴度。

噬菌斑测定

在MEM中制备每一待检验病毒的十倍连续稀释。用病毒接种接种在6-孔板上的汇合MDCK细胞，37℃吸附1 h然后去除上清液。细胞用PBS洗涤两次然后用包含1 μg/ml TPCK-处理的胰蛋白酶的1% MEM琼脂糖覆盖。将板倒置在37℃培养箱中48 h。然后用25%福尔马林室温固定板至少2 h。用1%结晶紫/20%乙醇染色后，用自来水洗涤板以去除过量染料。将噬菌斑肉眼可视化并计数。噬菌斑测定检测浓度≥ 1 PFU/ml的流感病毒。

蛋白质印迹

用标明的病毒以MOI 5感染MDCK细胞并在不同的时间点用细胞裂解缓冲液(50 mMTris-HCl, 150 mM NaCl, 和1% Triton X-100, pH 7.4)裂解。以12,000 g的速度离心15min后丢弃细胞碎片。如下进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NPAGE)。不添加SDS制备7-8%的聚丙烯酰胺凝胶并省略浓缩胶。

用于N-PAGE的样品用荧光素酶测定中使用的被动裂解缓冲液裂解。与5X上样缓冲液(1MTris-HCl [pH 6.8], 50%甘油, 1% 溴酚蓝)混合后，将样品储存在–80℃或立即分析，上样前将凝胶在4℃以40 mA的恒定电流预运行30 min。然后以与对于SDS-PAGE相似的方式处理凝胶。小鼠单克隆抗-M1 (sc-57881)和兔多克隆抗-IRF3 (sc-9082)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。小鼠单克隆抗-M2 (ab5416)购自Abcam。小鼠单克隆抗-β-微管蛋白购自Sigma。NP、HA和NS1使用实验室自制的抗体分别以1:5,000、1:3,000和1:5,000的稀释度检测。

定量实时PCR (qRT-PCR)

在感染或转染之后标明的时间点，使用RNAiso (TaKaRa)分离总RNA。通过DNase(Ambion)处理去除DNA污染。使用高容量cDNA反转录试剂盒(Life Technologies)反转录大约200 ng总RNA。Uni12和oligo(dT)引物分别用于在反转录反应中制备mRNA和vRNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行实时PCR。用于WSN-M1的引物为5’-CGGTCTCATAGGCAAATGGT-3’ (M-478F, SEQ ID NO: 3)和5’-CAATATCCATGGCCTCTGCT-3’(M-616R, SEQ ID NO: 4)。用于WSN-M2的引物为5’-CCGAGGTCGAAACGCCTATC-3’ (WSN-M2-F, SEQ ID NO: 5)和5’-CTCTGGCACTCCTTCGGTAG-3’ (WSNM2-R, SEQ ID NO: 6)。用于WSN-mRNA3的正向引物为5’-AGCAAAAGCAGGCCTATC-3’ (WSN-mRNA3-F, SEQ ID NO: 7)，用于WSN-M4的正向引物为5’-ACCGATCTTGAGGCCTATC-3’ (SEQ ID NO: 8)。用于WSN-mRNA3和WSN-M4的反向引物为WSN-M2-R。用于PR8-M1的正向引物与WSN-M1的正向引物M-478F相同，并且反向引物为5’-CAACCTCCATGGCCTCTGCT-3’ (SEQ ID NO: 9)。用于PR8-M2和PR8-mRNA3的反向引物为5’-CTTTGGCACTCCTTCCGTAG-3’ (SEQ ID NO: 10)，并且正向引物分别为WSN-M2-F和WSN-mRNA3-F。用于WSN-NP的引物为5’-GGTGAGAATGGACGGAGAAC-3’ (NP-625F, SEQID NO: 11)和5’-CCGGCTCTCTCTCACTTGAT-3’ (NP-738R, SEQ ID NO: 12)。用于犬IFN-β的引物为5’-CCAGTTCCAGAAGGAGGACA-3’ (正向，SEQ ID NO: 13)和5’-CCTGTTGTCCCAGGTGAAGT-3’ (反向，SEQ ID NO: 14)。

用于犬β-肌动蛋白的引物为5’-CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3’ (正向，SEQ IDNO: 15)和5’-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3’ (反向，SEQ ID NO: 16)。

使用已建立的方案分析相对mRNA水平。qRT-PCR的扩增特异性通过每个程序结束时的熔解曲线分析确认。

小鼠感染

小鼠实验使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行。为了测定肺组织中的病毒复制，用稀释在25 μl PBS中的1x 10⁴ PFU的WSN-WT、WSN-DelNS1-M-WT或WSN-DelNS1-M-A14U病毒鼻内感染3只小鼠的组群。三天后，将小鼠安乐死并移除肺以在1 ml PBS中均质化。然后通过噬菌斑测定在MDCK细胞中测定病毒滴度。为了测定病毒的致病性，用25 μl PBS中5 x10⁴ PFU的野生型(WT)或DelNS1-M-A14U病毒或仅用PBS鼻内接种6只小鼠的组群，每天记录感染和对照组小鼠的体重持续14天。依照动物伦理学指南，将体重损失超过初始体重的25%的小鼠安乐死。

本文参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版通过引用以其整体结合，其包括所有图片和表格，至其不与本说明书的明确教导矛盾的程度。

下列为说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。所有百分比均为按重量计并且所有的溶剂混合物比例均为按体积计，除非另外指明。

实施例1 – NS1-del病毒中用于病毒复制的M段中的置换

为了获得NS1-del病毒毒株，分别将衍生自H1N1、H7N9和H5N1的全长NS基因组段NS克隆入pHW2000载体。通过诱变方案敲除NS1的编码区，而完整的NS2 (或NEP)保留在基因组段中(图1)。NS1-del病毒通过将每一病毒的8段共转染入293T细胞中拯救。将所得的拯救病毒(滴度非常低或甚至通过常规测定检测不到)在A549或VERO细胞中盲传。收集上清液用于滴定和测序分析。一旦传代中的病毒滴度稳定，比较每一代的序列。将所有8段的序列与亲本基因组比较并鉴定置换。在重复实验中始终观察到M段中的两个置换，即H1N1中的A14U和H7N9中的G917A (图2和3)。

实施例2 – M段中具有置换的NS1-del病毒的生长的表征

在多个细胞系，包括MDCK、VERO和A549中分析了衍生自H1N1 (WSN毒株) (图4)和H7N9 (Zhejiang毒株) (图5)的NS1-del病毒与野生型副本的生长动力学。发现NS1-del病毒能够在MDCK或VERO细胞中生长至一定水平。在Vero细胞中WSN-delNS1-A14U病毒复制至远高于delNS1-M-WT和WSN-delNS1-M-CA2的滴度。NS1-del病毒使用含胚鸡蛋进一步评估，并且显示这些病毒能够在鸡蛋中繁殖。

实施例3 – NS1-del病毒的干扰素拮抗的表征

NS1蛋白的主要功能为抑制受感染细胞中的干扰素表达。进行实验以证明NS1-del病毒不能抑制宿主干扰素表达(图6)。确定NS1-del病毒已丧失此功能尤其重要，因为其与流感病毒的毒力有关。

实施例4 – NS1-del病毒的M段中的突变增强M2但下调M3从M段转录

由于M2、M3和M4 mRNA的差异剪接在病毒复制的调节中发挥作用，进行了实验，其显示M段中的置换增强M2但是下调M3 mRNA转录(图7)。这一发现提供了对在缺乏NS1蛋白时M的置换对病毒复制的机制解释。

实施例5 – NS1-del病毒在小鼠中的表征

为了进一步评估NS1-del病毒的致病性质，进行实验以检查小鼠中的NS1-del病毒。用野生型H7N9或NS1-del病毒感染6只小鼠的组群并每天记录死亡率和体重持续两周。发现用NS-del病毒感染的小鼠不显示疾病症状并且保持稳定的体重，而用野生型H7N9病毒感染的小鼠从感染后第2天丧失体重；所有感染小鼠在第6天死亡。该结果证明NS-del病毒对小鼠无毒力，甚至在高剂量时(图8)。

实施例6 –通过NS1-del病毒免疫保护小鼠免于致死攻击

为了检验NS1-del疫苗在小鼠中的功效，如图9中所说明来进行实验。首先用5 x10⁴噬菌斑形成单位(pfu)的多个版本的NS-del病毒、裂解疫苗或PBS对照接种6只小鼠的组群。两周后，用10⁵ pfu的野生型H7N9病毒攻击小鼠。监测小鼠的死亡率，并记录体重持续14天。图9中的结果显示：(1) 用PBS对照接种的小鼠从感染后第3天丧失体重并且所有小鼠在攻击后第10天死亡；(2) 用H7N9 NS1-del病毒接种的小鼠在整个实验期间未显示明显体重丧失；(3) 用H1N1 NS1-del病毒接种的小鼠在感染的最初4天期间显示轻微体重丧失但其后恢复并在剩余实验中保持正常；(4) 用一剂裂解H7N9疫苗接种的小鼠在第一周显示明显的体重丧失，但小鼠能够从感染恢复并恢复体重。该实验显示了使小鼠免于致死剂量的高致病性H7N9病毒攻击的保护。NS1-del疫苗提供比裂解疫苗更好的保护。NS1-del H1N1病毒保护小鼠免于H7N9攻击进一步提示NS1-del疫苗可提供对异-亚型病毒感染的交叉保护。

实施例7 – NS1-del疫苗对禽H5N1病毒致死攻击的交叉保护

进行了实验以验证DelNS1疫苗对高致病性禽H5N1病毒致死攻击的交叉保护。除了衍生自WSN和H7N9毒株的DelNS1病毒以外，还相似地构建了来自2009大流行H1N1病毒的DelNS1病毒，其被指定为2009H1N1-DelNS1并评估对A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒致死攻击的交叉保护。为了检验接种DelNS1病毒是否会提供对小鼠中H5N1病毒感染的更好保护，使用2009 H1N1冷适应病毒，其被指定为2009 H1N1-冷适应，作为对照。2009 H1N1-冷适应病毒在病毒基因组中包含野生型NS1基因。

如图10中所示，尽管在感染开始时存在一些体重丧失(A)，80%的用WSN-DelNS1、2009H1N1-DelNS1和2009 H1N1-冷适应病毒接种的小鼠从较低致死剂量(100 MLD₅₀) 1194H5N1病毒的攻击中存活。该结果表明用冷适应或DelNS1病毒接种会提供对异亚型病毒感染的交叉保护。然而，基于病毒攻击后的体重变化与包含野生型NS1基因的同种减弱活病毒相比，2009H1N1-DelNS1病毒似乎提供更好的保护(A)。为了进一步区分包含NS1和DelNS1的疫苗毒株之间的保护水平，评估了用较高致死剂量(1000 MLD₅₀)的A/Vietnam/1194/04 H5N1病毒攻击的小鼠中的保护。如图11中所示，用PBS或2009 H1N1-冷适应病毒接种的小鼠在H5N1病毒攻击后6和9天之后死亡(A & B)。然而，80%的用2009 H1N1-DelNS1或H7N9DelNS1-MG917A病毒接种的小鼠从致死攻击中存活(B)。在感染开始时仅观察到小于15%的体重丧失并且小鼠能够在H5N1病毒攻击10天后恢复。综合起来，这些结果显示DelNS1流感病毒提供比包含野生型NS1的疫苗毒株强得多的交叉保护。

实施例8 –病毒RNA的M段的3’非编码区(NCR)中的A14U置换支持流感病毒的复制

本发明的这一实施方案提供病毒RNA的M段的3’ NCR中的A14U置换通过调节M段mRNA的选择性剪接支持具有NS1缺失的流感病毒的复制。流感病毒的NS1蛋白具有多种功能并且为毒力的决定因子。DelNS1流感病毒为用于研究病毒复制的有用工具并且可用作有效的减弱活疫苗；然而，NS1的缺失严重减少病毒复制，妨碍功能研究和疫苗生产。本发明提供在细胞中持续传代的WSN-DelNS1病毒经适应而获得在病毒RNA (vRNA)的M段的3’ NCR中A14U置换，该置换恢复复制能力。DelNS1-M-A14U病毒不能抑制病毒-感染细胞中的干扰素表达，为研究NS1不存在时的病毒复制提供了基本模型。DelNS1-M-A14U病毒的表征显示NS1缺乏对其它病毒蛋白的表达无明显作用，除了M mRNA。M转录物，M1、M2、mRNA3和mRNA4的表达受选择性剪接调节。A14U置换改变mRNA3的剪接供体位点共有序列，更改M转录物的表达，在DelNS1-M-A14U，而非DelNS1-M-WT病毒-感染的细胞中M2表达明显增加并且mRNA3受到显著抑制。进一步的分析揭示A14U置换还影响病毒基因组复制期间的启动子功能。M-A14U突变增加DelNS1病毒感染中的MvRNA合成并且在其它病毒蛋白质缺乏时增强M2 mRNA的选择性剪接。该发现证明NS1通过调节M转录物的选择性剪接直接参与流感病毒复制并提供对于构建NS1缺失疫苗毒株重要的战略信息。

流感病毒的NS1具有多种功能。除了其在对抗宿主抗病毒活性中的作用外，还认为NS1牵涉调节病毒复制。NS1蛋白为抑制先天和适应性免疫二者的毒力决定因子并且NS1缺失的减弱活病毒有希望作为有效的疫苗。然而，NS1的缺失导致感染期间病毒复制的严重减弱，这妨碍功能研究和疫苗开发。提供了在vRNA M段的3’NCR中携带A14U置换的能够复制的DelNS1病毒。M-A14U突变通过调节从M段转录的mRNA的选择性剪接支持病毒复制。正因如此，本发明提供可用作减弱活疫苗的NS1缺失的可复制毒株。

甲型流感病毒是导致年度流行病以及偶见的大流行的重要的人呼吸道病原体。甲型流感病毒基因组包含8个负义单链RNA段。分段的基因组允许不同流感病毒之间频繁发生重新分配事件，这导致重配病毒的致病性和传播性质改变。感染周期期间甲型流感病毒的复制过程受宿主和病毒因子调节。流感病毒进入细胞通过病毒血凝素(HA)附着至细胞唾液酸受体引发，所述细胞唾液酸受体介导内吞过程以将病毒基因组释放入细胞质中。病毒基因组随后经由输入蛋白-α1/输入蛋白-β1-依赖性核输入途径输入核中，在此处流感病毒利用基因组-结合病毒RNP聚合酶复合体和宿主转录机构复制病毒基因组和表达病毒mRNA用于蛋白合成。已经从病毒-感染细胞鉴定了至少14种病毒蛋白。在这些病毒蛋白中，PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M1、M2、NS1和NS2 (NEP)在受感染细胞中有规律地表达。PB1-F2、PB1-N40和PA-X的表达不那么一致地被观察到并且可能与病毒毒株和感染条件有关。用在M段转录物中mRNA4剪接供体位点处突变的病毒感染期间还报道了一种M2-相关蛋白，M42的表达。然而，许多甲型流感病毒体可能未能表达至少一种必需病毒蛋白并变为不能复制的感染颗粒。病毒蛋白的表达受病毒和宿主二者控制并且病毒蛋白表达的差异调节可导致病毒复制效率差异，引起可变的致病性感染结果。

在甲型流感病毒的8个基因组段之中，NS和M段二者均表达差异剪接的转录物。从NS和M段分别表达两种成熟mRNA，NS1和NS2 (NEP)，和四种mRNA，M1、M2、M3和M4。尽管存在四种来自M段的差异剪接的转录物，在甲型流感感染中仅基质(M1)和离子通道(M2)蛋白具有已知作用。M1和M2在病毒复制期间在病毒核输出、病毒体包装和出芽中具有重要功能。对于从M段衍生的其它两种mRNA，mRNA3和mRNA4，尚未发现已知的功能。一个病毒mRNA动力学研究发现细胞的病毒感染期间M1和M2 mRNA的积累受到调节。在NS1和NS2 (NEP)剪接调节中也观察到相似的现象，其与病毒感染的进展协调。病毒聚合酶复合体调节流感病毒M1 mRNA中选择性5’剪接位点的利用，与细胞剪接因子SF2/ASF协调，以控制病毒复制期间M2 mRNA的表达。然而，另一个研究显示NS1蛋白调节M段mRNA的剪接并且该活性需要NS1具有RNA结合功能。据报道通过传代包含来自A/turkey/Turkey/1/05的H5和N1以及来自A/PR/8/34毒株的其余段但缺失NS1的重配病毒在M段中获得适应性置换。虽然这些M段置换的具体功能尚未表征，该研究似乎提示在病毒复制中NS1与M功能之间存在相互作用。尽管NS1蛋白对病毒复制不是必需的，但它具有多种功能，并且NS1基因的缺失引起流感病毒复制的严重减弱。DelNS1病毒的减弱可能是由于抑制宿主干扰素(IFN)表达能力的丧失，因为无NS1的病毒在干扰素-缺陷细胞中能够正常复制。然而，若干研究显示NS1可能还通过其它机制参与流感病毒转录和复制的调节。

本发明的一个实施方案提供从A/WSN/33和A/PR/8/34毒株衍生的DelNS1流感病毒。尽管NS1基因缺失在有干扰素能力的系统中通常引起严重的病毒减弱，但vRNA的M段的3’ NCR中的适应性置换，A14U，显著增强DelNS1病毒的复制。同样，DelNS1病毒不能表达充足量的M2 mRNA，可能是因为NS1功能的缺乏，而M-A14U置换恢复M2表达。

M段中的A14U突变足以恢复DelNS1 WSN病毒的生长

尽管流感病毒的NS1蛋白对病毒复制不是必需，但不表达功能NS1的病毒严重减弱并且仅能在IFN-缺陷系统中复制。已使用在细胞中表达NS1的辅助病毒来支持用于疫苗研究的DelNS1病毒的生产。在一个使用包含来自H5N1病毒的HA和NA以及来自A/PR/8/34的内段的重配病毒的研究中显示M和NS段中的置换恢复DelNS1病毒复制的生长。然而，恢复生长的机制尚未确定。为了更好地理解NS1在病毒复制中的作用以及为了开发用于制造DelNS1病毒的方法，生产了A/WSN/33毒株的DelNS1版本(图12A)。NS1的缺失通过病毒基因组检查确认。

噬菌斑分析显示DelNS1病毒形成明显比野生型病毒小的噬菌斑(图12B和C)。在MDCK细胞中WSN-DelNS1病毒的复制能力在三代内增加，与原始DelNS1病毒(P1)相比病毒滴度上升几乎2 logs (图12D)。序列分析证实产生了变体病毒但仅在vRNA M段的3’ NCR中发现一个置换，A14U (M-A14U)；在基因组中未发现其它突变(图12E)。为了证实M段中M-A14U的引入不是随机事件，重复该实验并且获得相同的A14U变体。为了进一步检验M-A14U突变是否足以增加DelNS1病毒的生长，比较WSN-DelNS1病毒与M-WT或使用反向遗传学拯救的M-A14U、M-A14UCM15、M-A14G或M-A14C突变的效率，然后在MDCK细胞中噬菌斑滴定拯救的病毒。

A14G与A14U在生物化学上相似，因此也拯救了相应的病毒，而不是具有A14C突变的那些。为了检验A14U碱基配对的潜在中断，如已经观察到12和13位的突变可影响病毒生长，将在M cRNA 3’末端的15位处包含额外的互补突变的M-A14U-CM15突变体包含在内。A14U置换似乎是独特的并且不需要互补突变。所拯救的DelNS1-M-A14U突变体病毒的滴度高达1.75 x 10⁵ PFU/m，比M-WT DelNS1病毒高约750倍(图12F)。为了检验A14U置换是否也可在其它细胞中出现，在Vero细胞中传代WSN-DelNS1病毒。然而，在超过8次传代后未观察到突变。

为了进一步证实M-A14U还支持其它流感病毒毒株的复制，将该置换引入A/PR/8/34毒株的DelNS1版本的M段并且，与用WSN的观察一致，M-A14U显著提高所拯救的病毒的滴度(图12G)，而无M-A14U置换的PR8-DelNS1病毒不能被拯救。这些结果表明M-14U置换可在缺乏NS1蛋白表达下恢复病毒复制。

M-A14U置换支持病毒复制但不抑制IFN表达

DelNS1流感病毒不能在MDCK细胞中复制并且仅可在Vero细胞中生长。生长动力学分析显示M-A14U DelNS1病毒在MDCK和Vero细胞二者中能够复制达到与野生型病毒相当的滴度(相比低不到1 log) (图13A和B)。相似地，M-A14U置换支持PR8 DelNS1病毒在Vero和MDCK细胞中复制，而无该置换的PR8 DelNS1病毒不能繁殖(图13C)。NS1蛋白作为宿主抗病毒活性的病毒拮抗物的功能已明确定义。NS1的缺失减弱病毒抑制干扰素表达的能力，如在报告基因测定中和通过IFN-β活化的qRT-PCR所测量的(图14A和B)。DelNS1-M-A14U病毒不能抑制受感染细胞中IRF3的活化(图14C)。尽管M-A14U使DelNS1病毒能够比WSN-DelNS1-M-WT病毒更有效地生长，该置换对干扰素的抑制无作用(图14D)。为了进一步确定M段中的A14U置换是否可改变病毒在体内的致病性性质，在小鼠中比较了WSN-WT和WSN-DelNS1-M-A14U突变体病毒在肺组织中的毒力和复制。尽管野生型WSN毒株导致受感染小鼠中迅速的体重丧失和死亡，但用WSN-DelNS1-M-A14U突变体病毒未观察到明显的致病性。受感染小鼠的肺组织中的病毒滴度的评估显示WSN-DelNS1-M-A14U和WSN-DelNS1-M-WT突变体二者在肺组织中均复制不佳，达到的水平与对于WSN-WT病毒所观察到的相比低大约3 logs (图14E和F)。因此，M-A14U置换的引入保留DelNS1病毒所具有的无毒力性质，这使其适合用于疫苗开发。

M-A14U置换影响病毒复制中M转录物的剪接。NS1蛋白不是病毒聚合酶复合体的组分。DelNS1病毒中M段中单独的A14U置换恢复复制这一观察提示NS1可牵涉调节复制或从vRNA M段转录。为了理解M-A14U置换在支持NS1缺失病毒的复制中的作用的分子基础，检查了用DelNS1-M-A14U病毒感染MDCK细胞期间病毒蛋白的表达。尽管病毒HA和NP蛋白的表达模式在WSN-WT和DelNS1-MA14U病毒感染中很大程度上相似(图15A)，与WSN-WT病毒感染相比M-A14U DelNS1中M2表达无变化并且M1水平显著降低。DelNS1-M-A14U与DelNS1-M-WT病毒之间病毒蛋白表达的比较也显示A14U置换对M1和M2蛋白有作用但对HA和NP无作用(图15B)。然而，M-A14U置换对M2蛋白表达的增强作用在具有完整NS1功能的WSN病毒中不明显(图15C)，提示M-A14U可能对于补偿调节M mRNA的表达和剪接中的NS1功能的丧失必不可少。

M-A14U突变通过在病毒复制期间下调mRNA3提高M2 mRNA的表达。流感病毒感染期间，在M段转录时，发生差异剪接以产生四种转录物，其中M1和M2 mRNA分别表达M1和M2蛋白(图15A)。mRNA3和mRNA4的功能未知。值得注意的是，A14U突变位于mRNA3剪接共有序列中，该序列覆盖M mRNA的非编码区的5’末端的核苷酸(nt) 9-17。A14U置换可将mRNA3的剪接供体(SD)位点共有序列从CAG/GUA改变为CAG/GUU并影响mRNA3的产生。同样，vRNA M段中的A14U置换可通过下调mRNA3表达以增加M2与M1 mRNA表达的比率来支持DelNS1病毒生长。

为了验证该假设，使用qRT-PCR分析检查病毒-感染细胞中的mRNA3水平。正如预期的，在四种M mRNA转录物之中，WSN-DelNS1-MA14U病毒-感染的MDCK细胞中M1、M2和M4显著增加但mRNA3几乎完全消除(图16B)。相比之下，DelNS1病毒中NP mRNA的表达不受M-A14U置换影响(图16B)，提示NS1的缺失与从M段表达的调节特异性相关。

进一步地，用表达全长M mRNA的M-A14U或M-WT段质粒转染HEK293T细胞。尽管对于M-WT和M-A14U质粒M1 mRNA的水平相似，但来自M-A14U质粒的mRNA3的表达显著下调并且M2mRNA的表达显著上调(图16C)。NS1的共表达进一步证明了NS1对M mRNA转录的正面作用；A14U置换可在DelNS1病毒中出现以补偿NS1-相关的M mRNA表达的增强。M-A14U置换在支持从A/PR/8/34毒株衍生的DelNS1病毒的复制中具有相似的作用(图12G和13C)。检查来自PR8-DelNS1-M-A14U病毒-感染细胞的差异剪接的M转录物发现与用WSN-DelNS1-MA14U所观察到的那些相似的模式(图16D)，这支持该核苷酸在WSN和PR8两种毒株中的功能保守性。因此，vRNA M段中的M-A14U置换改变病毒感染期间，甚至在缺乏其它病毒蛋白时，M1 mRNA的剪接模式。

M-A14U突变导致增加的M2 mRNA与M1 mRNA的比率

为了进一步探究NS1表达缺乏时M-A14U对病毒复制的作用的潜在分子机制，制造下调mRNA3表达的突变体。M-G12C-CM13突变体病毒显著下调mRNA3的表达。同样，mRNA3的表达在WSN-MA14U、WSN-M-A14G和WSN-MG12C-CM13病毒感染中减少(图17A)。然而，生长动力学分析显示该病毒的复制减弱，WSN-DelNS1-M-G12CCM13病毒不能被有效拯救(图17B)，提示mRNA3的下调可能不与病毒生长直接相关。M1基质蛋白牵涉vRNA核输出，而M2具有离子通道功能并且牵涉流感病毒复制期间的病毒脱壳和出芽过程。通过调节M1 mRNA的选择性剪接病毒复制进程期间可能存在M1与M2的表达的协调，并且NS1可能也在其中发挥作用。DelNS1病毒感染中M1与M2的比率可能改变，如上文所见(图15和16)。据报道M2在病毒感染的早些时候选择性表达，提示M2在病毒复制早期中的关键作用。除了在病毒脱壳和出牙过程中的作用外，据报道M2还与自噬体和炎症小体相互作用，提示其在病毒复制期间发挥其它作用。在缺乏具有多种功能以对抗宿主抗病毒活性的NS1时，DelNS1病毒可经适应优先表达M2以试图维持病毒复制的最佳平衡。

为了理解M-A14U对M转录物差异剪接的调节的作用，测定了病毒-感染细胞中M2mRNA与M1 mRNA的比率。比较用WSN-M-A14U、WSN-DelNS1-M-WT、WSNDelNS1-M-A14U和WT WSN病毒感染的细胞中的M2/M1比率。WSN-DelNS1-M-A14U-感染细胞中的M2/M1剪接效率比WSN-DelNS1-M-WT-感染细胞中高约6倍(图17C)。然而，WSN-WT与WSN-M-A14U M2/M1比率之间的比较揭示尽管A14U置换上调M2，但该作用不如在WSN-DelNS1病毒之间所见到的显著(差异小于2倍)(图17C)。在WSN-WT-M-A14U和WSNDelNS1-M-A14U病毒感染二者中mRNA3的表达减少并且M4 mRNA下调(图17D和E)。

为了进一步检验mRNA3对病毒生长的作用，从质粒表达mRNA3，但未观察到对病毒滴度的负面作用(图17F)，这提示对于mRNA3表达的选择性剪接可能是专为调节M1和M2mRNA的水平。这些结果支持M-A14U突变导致增加的用于产生M2，并且可能也产生M1，mRNA的选择性剪接以增强NS1表达缺乏时的病毒复制这一假设。

M-A14U突变增强M2 mRNA的选择性剪接和M vRNA的合成

先前的研究已经提示M段mRNA的剪接可受病毒RNP复合体连同宿主因子SF2或NS1调节。这些机制可能与M-A14U置换有关。M-A14U置换影响M1 mRNA的剪接效率并且该性质为补偿NS1表达的缺乏所需。在其中NS1牵涉病毒复制期间M转录物剪接为M2 mRNA的调节的机制中，看起来很有可能DelNS1病毒可被迫在通常与NS1相关的vRNA M段的启动子区域处的调节元件中获得适应性置换以补偿NS1功能的缺乏。

为了检验该假设，在DelNS1-M-WT病毒-感染细胞中检查了恢复NS1表达对M2/M1比率的作用。用病毒感染之前24 h将递增量的NS1表达载体转染入HEK293T细胞，通过定量RT-PCT评估M1和M2病毒mRNA的表达。DelNS1-M-WT病毒-感染细胞中M2剪接形式的量随NS1表达水平增加而增加(图18A)。使用表达M段的mRNA和vRNA 二者的质粒，观察到甚至在缺乏其它病毒蛋白时，所有在14位处具有置换的质粒表达比M-WT更高水平的M2蛋白，而非M1，这表明M-A14U与M2剪接形式的上调相关(图18B)。NS1质粒M的共转染显著增强M1从所有这些质粒的表达，并且对于在第14位处或在第12位处具有置换以下调mRNA3的质粒(G12C-CM13) M2水平更显著上调(图17A和18B)。该结果强烈提示NS1可通过下调用于mRNA3的选择性剪接位点发挥功能以允许优先表达M1和M2，而该剪接位点的置换允许将M1有效加工为M2剪接形式。

A14U置换发生在M vRNA段(cRNA的5’或5’mRNA)的3’非编码区，该区域也是用于病毒基因组复制的启动子区。该突变可能影响病毒聚合酶复合体的结合以增强vRNA从M段合成，在病毒复制期间产生更多的M1 mRNA用于剪接为M2 mRNA。检验了用在14位包含变异和具有完整NS1基因的突变体病毒感染的细胞中的M vRNA合成水平。从WSN-M-A14U突变体产生的M vRNA的水平比WSN-WT病毒高大约15倍(图18C)。相比之下，对于WSN-M-A14G突变体观察到与WSN-WT病毒-感染细胞相比相对更低的M vRNA水平(图18C)。

检验了提高的M vRNA产生是否与DelNS1-MA14U病毒感染相关。M vRNA的水平在WSN-DelNS1-M-A14U中与在WSNDelNS1-M-WT病毒感染中相比显著更高，而对于NP vRNA未观察到相似的倾向(图18D)。因此，M-A14U正面影响M vRNA合成并且该作用可能对于NS1-缺陷病毒的复制是必需的。

流感病毒利用病毒聚合酶复合体和宿主机构在核中转录和复制病毒基因组。用于从转录转换为复制和vRNA从核输出至细胞质的病毒产物的表达的协调对最佳复制效率至关重要。病毒蛋白M1和NEP (NS2)牵涉vRNP的核输出。M2为一种结构蛋白并且牵涉输入早期期间的病毒脱壳过程和病毒感染晚期中的病毒体出芽。M1/M2和NS1/NS2 (NEP)病毒蛋白分别通过来自M和NS段的选择性剪接的mRNA表达。尽管来自M或NS段的蛋白不直接牵涉入病毒聚合酶复合体中，但有提示病毒复制可通过调节M1/M2和NS1/NEP (NS2) mRNA的选择性剪接调节。尽管流感病毒利用病毒聚合酶复制并利用帽抢夺（cap-snatching）机制转录病毒基因组，但认为对于mRNA剪接病毒依赖于宿主机构。剪接的NS和M mRNA的表达受到高度调节。发现NS1通过与CPSF相互作用抑制宿主前体mRNA剪接并且还可对病毒mRNA具有相同作用。

先前的研究显示病毒和宿主机制二者均牵涉M mRNA的差异剪接的调节。由于M1和M2蛋白具有病毒感染的不同阶段，例如RNP核输出、病毒组装和出芽过程所需的基本功能，控制M1和M2表达的时间以优化病毒基因组复制的效率对病毒感染至关重要。vRNA M段的3’NCR含有25个核苷酸，其包含用于转录起始的启动子和用于mRNA的转录后加工的选择性剪接位点(图16A)。病毒聚合酶复合体可结合到NCR启动子区以封闭用于mRNA3表达的剪接位点，导致替代地利用另一个用于M2 mRNA的剪接位点。另一个研究发现在病毒复制中NS1蛋白调节M2的积累。然而，在用DelNS1病毒感染的Vero细胞中未观察到NS1对M2积累的调节作用。

通过构建从A/WSN/33流感病毒毒株衍生的NS1缺失病毒研究了NS1蛋白在病毒复制中的作用。几次传代后DelNS1病毒中出现M段的非编码区中的A14U置换。在细胞中DelNS1-M-A14U病毒能够复制至与野生型病毒大致相似的水平，表明了NS1蛋白与M vRNA转录或复制之间的功能连接。从M vRNA表达四种mNRA，M1、M2、mRNA3和M4。DelNS1-M-A14U病毒表达升高水平的从M1 mRNA剪接的M2，同时抑制mRNA3的表达，这将NS1的作用与M转录物的选择性剪接的调节相联系。A14U对M mRNA的选择性剪接的作用的证据来自在缺乏其它病毒蛋白时进行的包含A14U和其它置换的M段的表达分析。M-A14U段表达更高水平的M2蛋白，而M1的水平未改变(图18B)，提示A14U置换有利于通过宿主剪接机构产生M2。

A14U恰好位于用于mRNA3表达的剪接供体位点内(图16A)，并且似乎有可能该置换消除或影响剪接因子与该基序的结合，导致选择邻近的替代地产生M2 mRNA的剪接供体位点。该假设受到该位点的其它置换在缺乏其它病毒蛋白时也增强M2表达这一证据的支持(图18B)。病毒感染之前用NS1-表达质粒转染细胞对NS1表达的恢复显著增加DelNS1-M-WT病毒-感染细胞中的M2/M1 mRNA比率，证实NS1直接牵涉M2 mRNA剪接的调节。

A14U置换可具有双重作用，调节vRNA合成和mRNA剪接，这是因为与DelNS1-M-WT感染相比M vRNA的水平在DelNS1-M-A14U病毒感染中显著增强，而对于NP vRNA未观察到相似作用。因此，M vRNA 3’启动子区中A14U置换的复合作用将导致更高的病毒聚合酶复合体效率，产生更多的vRNA用于转录为mRNA，与mRNA3剪接位点的封闭组合以允许M2 mRNA表达。尽管NS1蛋白不被认为是病毒复制的基本元件，但其作为宿主抗病毒活性的拮抗物具有多重功能。

因此，对于缺乏NS1的病毒在细胞中复制，将需要对抗宿主抗病毒活性的替代的病毒元件。已经发现在流感病毒感染期间M2蛋白与炎症小体和自噬体相互作用。因此，对于处于其中缺乏NS1的条件下的病毒维持最佳复制可能需要M2，因此为了该目的选择A14U适应性突变体以驱动较高水平的M2表达。

由于病毒感染期间NS1干扰先天和适应性免疫应答二者并且为流感毒力决定因子，DelNS1病毒被认为是有希望的减弱活疫苗候选。动物实验显示缺乏NS1的减弱活疫苗可诱发更好的免疫应答。然而，NS1的缺失严重影响病毒复制，并且难以产生高滴度的减弱病毒用于疫苗应用。在本领域先前的将NS1-缺陷病毒繁殖至高滴度的尝试中，发现DelNS1病毒受限于在有限的系统中扩增，例如，在IFN-缺陷系统或在NS1-表达系统中。本发明证明M段的NCR中的A14U置换足以支持DelNS1病毒在MDCK和Vero细胞二者中复制至接近野生型病毒的水平。A14U置换在A/WSN/33和A/PR/8/34毒株中对DelNS1病毒复制的作用可外推至其它流感病毒毒株和亚型。

实施例9 –DelNS1疫苗保护小鼠免于野生型病毒的致死剂量攻击

接种H7N9 DelNS1疫苗对小鼠无有害作用并且提供对野生型H7N9病毒的致死剂量攻击的全面保护。接种H1N1 DelNS1疫苗对小鼠无有害作用并且在轻微延迟反应之后提供对野生型H7N9病毒的致死剂量攻击的保护，表明DelNS1疫苗提供对异-亚型病毒感染的交叉保护。尽管裂解H7N9疫苗能够保护小鼠免于致死攻击，但该保护作用小于用H7N9或H1N1DelNS1疫苗。

本发明提供一种简单和可靠的经由在病毒内部基因之一中引入置换生产任何亚型的甲型流感病毒的无毒毒株的方法。仅以内部基因段之一中的简单修饰，NS1-缺失病毒即可容易地拯救并繁殖至高滴度，与野生型病毒相当。在本发明所提供的方法中，DelNS1病毒可不使用辅助病毒而容易地从普通细胞系拯救并且病毒可在细胞或卵中繁殖至相对高的滴度。编码病毒基质膜蛋白的基因组M段中的单一核苷酸置换对相应NS1缺失病毒经由反向遗传学的高拯救效率已经足够。由于其在Vero细胞或卵中容易繁殖和已很好地表征的安全性质，该NS1-del流感病毒疫苗系统具有其它潜在的应用。除了用作甲型流感病毒的多种亚型，包括未来的大流行毒株的减弱活疫苗之外，DelNS1流感病毒疫苗可用于制造预防当前仍无疫苗的其它呼吸道病毒剂的疫苗。从NS1缺失所产生的空间可插入来自其它病毒例如MERS冠状病毒或EBOLA的另一个基因段以诱发细胞-介导的免疫来对抗这些病原体感染。

应理解的是本文所述的实施例和实施方案仅为了说明目的并且根据此将为本领域技术人员提示多种修饰或变化，这些修饰和变化包含在本申请的精神和范围内。另外，本文所公开的任何发明或其实施方案的任何元素或限制可以与任何和/或所有其它元素或限制(单独或任意组合)或本文所公开的任何其它发明或其实施方案组合，并且所有这些组合考虑在本发明的范围内而不对其进行限制。

Claims

1.一种减毒甲型流感病毒，其包含：

含有以下的遗传上修饰的病毒基因组：

非结构蛋白NS1编码段中的中断，其中所述NS1编码段中的中断是导致敲除所编码的NS1蛋白的缺失；和

(a)基质膜蛋白编码段的3'非编码区中的碱基置换A14U，其中所述减毒流感病毒为减毒甲型流感病毒毒株H1N1，并且包含所述碱基置换的编码段包含序列AGCAAAAGCAGGUUGAUAUUGAAAGAUGAGUCUUCUAACCGAGGUCGAAACGUAC；或者

(b)基质膜蛋白编码段的碱基置换G917A，其中所述减毒流感病毒为减毒甲型流感病毒毒株H7N9，并且包含所述碱基置换的编码段包含序列GGGCCUUCUACGGAAGGAAUACCUGAGUCUAUGAGGGAAGAAUAUCGGC。

2.一种疫苗制剂，其包含：

权利要求1的减毒甲型流感病毒，和

生理学上可接受的载体。

3.用于产生权利要求1的减毒甲型流感病毒的方法，所述方法包括：

将流感病毒NS1基因的中断的编码序列引入细胞或卵中，其中所述流感病毒NS1基因的中断的编码序列是导致敲除所编码的NS1蛋白的缺失；

将流感病毒的基质膜编码序列引入细胞或卵中，其中所述基质膜编码序列包含

(b)基质膜蛋白编码段的碱基置换G917A，其中所述减毒流感病毒为减毒甲型流感病毒毒株H7N9，并且包含所述碱基置换的编码段包含序列GGGCCUUCUACGGAAGGAAUACCUGAGUCUAUGAGGGAAGAAUAUCGGC，并且

其中所述细胞或卵包含产生流感病毒颗粒所需的其余流感病毒基因段和病毒蛋白；和

培养细胞或卵，在其中减毒流感病毒被复制。