CN102648000A - 新的流感病毒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新的流感病毒，其中的NS和PB1基因节段均被改造过，并且其中的PB1-F2开放读框通过引入至少一个终止密码子而被改造。具体来说，所述流感病毒缺少功能性NS1和PB1-F2蛋白。此外，提供了包含所述经过改造的流感病毒的疫苗制剂及其防止流感感染的用途。

Description

新的流感病毒

本发明提供了新的流感病毒，所述病毒中NS和PB1基因节段均经过改造，并且PB1-F2 ORF被导入了至少一个终止密码子。根据特定实施方案，所述流感病毒缺少功能性NS1和PB1-F2蛋白，在干扰素活性细胞(interferoncompetent cells)中是复制缺陷的。

此外，提供了包含所述改造的流感病毒的疫苗制剂及其预防流感感染的用途。

发明背景

A型流感病毒是威胁人和动物的最常见病原体之一，甚至可能引起灾难性的大流行。A型流感病毒每年在世界范围内造成300,000-500,000例死亡，在大流行的年份中，这个数字可能增加到1百万(1957-1958年)或者可能象1918-1919年发生的情况，高达5千万。近年，关于高致病性的禽流感病毒(H5N1)造成大流行的可能性已引起人们的极大关注。1997年香港发生了人体H5N1感染的一次小规模爆发，造成18人被感染和6例死亡，至今共计383例人感染事件，而死亡率达到61％。

已在欧洲获得批准的灭活流感疫苗仅有有限的保护效果，特别是对于老年群体和还未经历过天然流感的幼童来说。冷适应活流感疫苗能够更有效地用于儿童的疾病预防和控制疾病传播，但当前可以利用诸如反向遗传学的新技术来进一步改善活疫苗方法。

目前的减毒活疫苗的概念基于产生适应在25℃生长(冷适应)的温度敏感的、减毒的“主毒株(master strain)”。冷适应活病毒疫苗和灭活病毒疫苗以不同方式刺激免疫系统，但这两种情况中，缺乏足够的免疫原性是流感疫苗接种的最重要的缺点之一，尤其是对于老年人。

尽管ca活流感病毒疫苗被认为是足够安全的，减毒的确切遗传和分子机制并未被彻底理解。冷适应流感疫苗的安全属性据称是基于散布在内部基因区段上的大量点突变之上的。但只有少数通过作图定位到聚合酶基因内的突变可以造成那些不能在正常体温复制的冷适应病毒株的弱化(Herlocher，M.L.，A.C.Clavo，and H.F.Maassab.1996，Virus Res.42：11-25；Herlocher，M.L.，H.F.et al.，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90：6032-6036)。事实上，活疫苗株的遗传稳定性受到了诸多质疑，因为从接种了疫苗的宿主体内重新分离得到的病毒显示出额外的点突变，而这些点突变可能最终发挥出“抑制”突变的作用，造成回复病毒的复制性能加强并可能丧失温度敏感的表现型(Herlocher，M.L.，H.F.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90：6032-6036，Treanor，J.，M.et al.，1994 J Virol.68：7684-7688.)。

对流感遗传学的新认识给构建用于活疫苗的理想免疫株提供了指导，其中可能通过靶向遗传工程将全部的主要致病因子去除。A型流感病毒含有分节段的负链RNA基因组(Lamb & Krug，1996)。8个节段编码转录酶复合体(PB1、PB2、PA、核蛋白NP)、三个整合膜蛋白(凝血素HA、神经氨酸苷酶NA、蛋白通道M2)、基质蛋白(M1)、核输出蛋白(NS2/NEP)和非结构性多功能致病因子NS1的亚基。

已证实，显示缺失NS1蛋白，由于在干扰素感受态(interferon competent)细胞或生物体中不能复制(复制缺陷表现型)会导致流感病毒的毒力明显减弱。缺少NS1蛋白的病毒不能拮抗被感染的细胞产生的细胞因子，因此诱发自体佐剂化(self-adjuvanting)和免疫调节效应。用DelNS1病毒进行免疫后的免疫反应特征是引发与优势IgG2A同种型抗体反应相关的Th1型免疫反应(B.Ferko et al.2002)。

据报道存在由节段2的替代ORF编码的第11个蛋白(Chen et al.，2001)。这个促细胞凋亡蛋白能够与线粒体蛋白ANT3(腺嘌呤核苷酸转运蛋白3)和VDAC1(电压依赖性阴离子通道1)相互作用，被认为是重要的致病因子。在被感染的宿主免疫细胞中观察到了PB1-F2诱发的细胞类型依赖性细胞死亡，而表皮细胞中未见到这一现象。有可能病毒致病性的提高是由于被感染免疫细胞的凋亡造成了免疫反应的延迟。据估计在病毒复制的初期，PB1-F2的功能损害了诸如巨噬细胞和树突细胞的专职抗原递呈细胞递呈抗原的能力。

在几个流感病毒株中缺失PB1-F2 ORF导致病毒因为更快地被从小鼠呼吸道清除而使毒力部分弱化(Zamarin D.et al.，J.Virol.2006，7976-7983)。还不清楚PB1-F2蛋白是否参与先天性或获得性免疫反应的调节或者病毒生长特性的调节。

Romanova等描述了对复制缺陷性减毒delNS1 H5N1候选活流感疫苗的临床前评估。疫苗制剂在三个动物模型中进行了研究，被给予小鼠、白鼬和猕猴。疫苗在经鼻内给药后，免疫动物没有显示排出(PLOS ONE，Vol 4，Article E5984)。

Zell等描述了对流感A PB1-F2序列进行大量评估从而获得关于PB1-F2广泛存在的详尽信息(J.Gen.Virology，2007，88，pp.536-546)。

WO2008/043805描述了两性霉素B作为培养流感病毒的补充物。

US2009/0074804公开了适合用于生产哺乳动物使用的疫苗的分离流感病毒株，所述病毒株含有至少一个经过改造的流感病毒蛋白。

鉴于目前对安全有效疫苗的需求，本发明的目的是改善现有疫苗株的安全性和免疫原性，并开发适合给人类，特别是3岁以下幼童(即传统的不经肠的灭活疫苗可能对其无效的年龄组)预防季节性和流行性流感的新一代鼻内流感疫苗。

本申请提供的实施方案实现了所述目的。

发明概述

令人惊奇的发现是包含缺少功能性NS1蛋白或者含有部分NS1蛋白缺失的DelNS1重组合病毒在小鼠中的潜在免疫原性可以通过另外的PB1-F2修饰或缺失得以加强。PB1-F2缺失可以促进IgG1(Th2型)和IgG2a(Th1型)免疫反应。这些效果显示对于构建用于鼻内接种的更有效疫苗株来说，双重修饰或缺失可能是有利的。

替代地，还惊奇地发现包含经过改造的NS和PB1基因节段的流感病毒在感染后第一个24小时内，在细胞培养中表现出生长加快。因此双突变体，特别是那些缺少功能性NS1和PB1-F2蛋白的双突变体与仅仅缺失了NS1蛋白的流感病毒株相比，似乎能够更高效地复制。

因此，本发明提供了这样的流感病毒，所述流感病毒中NS和PB1基因节段均经过改造，并且PB1-ORF(开放读框)被在不改变PB1氨基酸序列的情况下通过引入至少一个终止密码子或者去除至少一个甲硫氨酸/起始密码子进行了改造。

优选地，所述流感病毒是复制缺陷型病毒。

根据特定的实施方案，复制缺陷型流感病毒包含的PB1节段被通过在PB1-F2 ORF内引入多个终止密码子和/或去除甲硫氨酸密码子进行了改造。更具体地说，改造发生在按照SEQ ID NO.1的编号，核苷酸位点T120、T153、T222、T234、T255、T270和G291中的任意位点上。

再更具体地说，PB1基因的改造导致PB1-F2开放读框(ORF)被敲除。

根据发明的实施方案，流感病毒包含SEQ ID.No 2的核苷酸序列或者它的至少一部分。

具体来说，PB1F2蛋白包含SEQ ID No.4的氨基酸序列或者它的一部分。

根据本发明，病毒的NS基因节段包含至少一个核苷酸修饰、取代和/或缺失，特别是编码截短的NS1蛋白，更特别是完全缺少NS1蛋白。

流感病毒可以特别缺少功能性NS1和/或功能性PB1-F2蛋白。

根据进一步的实施方案，提供了包含本发明的病毒和任选的可药用载体的疫苗制剂，所述疫苗被特别地配制用于鼻内递送。此外，发明提供了防止患者感染流感病毒的方法，包括将发明所述疫苗给予该个体。

发明还提供了本发明的病毒用于制备防止个体感染流感病毒的制品的用途。

附图：

图1：按照材料与方法部分中的详细描述，用delNS1(delNS)和delNS1-PB1-delF2(delNS1-PB1-delF2)病毒变体感染Vero细胞。无论使用什么MOI，delNS1-PB1-delF2病毒变体与delNS病毒相比，在感染后24小时复制达到显著更高的TCID50滴度。数据表明删除F2蛋白对病毒在生产基质(Vero细胞)内的生长有正面影响。

图2：小鼠用delNS1-PB1-delF2(delNSF2)和delNS1(delNS)病毒突变体免疫两次。第一次免疫(单次)后28天以及第二次免疫(二次)后20天采集的血清样品经分析是否存在病毒特异性IgG1和IgG2a抗体。显示的是各个小鼠的终点滴度。水平线区段代表用图中所示的各病毒变体免疫的整组小鼠的几何平均滴度。

图3：SEQID1：GHB01 PB1基因的核苷酸序列。

图4：SEQID2：GHB01 PB1delF2的核苷酸序列。

图5：SEQID 3：GHB01 PB1F2蛋白的氨基酸序列。

图6：SEQID 4：GHB01 PB1delF2的氨基酸序列，其中显示了导入的终止密码子和被去除的甲硫氨酸/起始密码子。与GHB01 PB1F2相比的氨基酸取代以粗体带下划线的字母显示。

图7：在人PBMCs中的IFN-α诱导，IFN-α水平(pg/ml)6h p.i。

A、B、C和D显示了各个供体的数据；F是总结性图形(数据表示为四个志愿者的平均值数据±SEM)。

发明详述

本发明提供了其中NS和PB1基因节段均被改造的流感病毒。

具体来说，本发明的流感病毒是复制缺陷型病毒。

根据发明的特定实施方案，PB1基因被通过向编码PB1-F2蛋白的ORF中导入至少一个终止密码子而改造。

名词“基因”或“基因节段”在申请中定义为由列出的SEQ.ID的完整序列构成，或者包含所述完整序列的至少一部分或其片段。

本发明的流感病毒可以是A、B或C型病毒。优选是A型流感病毒。举例来说，可以是H5N1、H3N2、H1N1或者由它们衍生的任何重组合病毒。

人们认为，致病的流感株通过清除病毒进入和复制部位的免疫细胞，能够下调先天性免疫反应和特异性免疫的发展。因此，PB1-F2蛋白被看作是新的大流行病毒株进入人类群体的辅助因子之一。所有20世纪的流感大流行株和致病最强的季节性H2N2，H3N2 A型流感病毒株均编码功能活性的PB1-F2蛋白，而多数致病性稍弱的现代H1N1株含有该蛋白的截短形式。目前对PB1-F2蛋白的缺失是如何调制免疫反应的还一无所知。

根据发明的特定实施方案，PB1节段通过在PB1-F2 ORF内的任意核酸位点引入多个终止密码子导致PB1-F2开放读框(ORF)被敲除而被改造。具体来说，所有编码甲硫氨酸的密码子都被改造。例如，改造可以发生在按照SEQ ID1的核苷酸编号的核苷酸位点T120、T153、T222、T234、T255、T270和G291中的任何一个。更具体来说，位点153、222和/或291的核苷酸被取代从而包含终止密码子。

根据本发明，名词“多个终止密码子”意味着至少两个，优选至少三个终止密码子被导入各个基因。

与PB1-F2 ORF相关的名词“改造”意味着至少一个核苷酸被不同的核苷酸代替，导致亲本核苷酸序列被改变。替代地，至少一个氨基酸被替代，导致亲本氨基酸序列被改变。

具体来说，流感病毒含有PB1基因的改造，导致了整个PB1-F2 ORF被敲除。这可以通过向PB1-F2 ORF中导入至少一个终止密码子，优选至少两个终止密码子，更优选至少三个终止密码子来实现。优选地，在PB1-F2 ORF中导入至少一个终止密码子是在不改变PB1的氨基酸序列的情况下进行的。

更具体地说，本发明的流感病毒含有的PB1-F2蛋白包含按照SEQ ID.No 4中的至少一个终止密码子，优选按照SEQ ID NO4中的至少两个，更优选至少三个终止密码子。更具体地说，PB1-F2蛋白具有SEQ ID No.4的氨基酸序列。

A型流感病毒的NS1蛋白是一种多功能蛋白，其由将近230个氨基酸组成，在感染早期被大量合成。该蛋白对抗细胞的抗病毒活性，是一种毒性因子。借助其羧基端区域的活性，NS1蛋白能够抑制宿主mRNA的加工机制。第二，它能够通过与细胞翻译起始因子的直接相互作用，促进优先翻译病毒的mRNA。第三，通过结合dsRNA和与推测的细胞激酶的相互作用，NS1蛋白能够阻止干扰素(IFN-)诱导的dsRNA激活的激酶(PKR)、2′5′-寡腺苷酸合成酶系统以及细胞因子转录因子的活化。

第四，NS1的N端部分结合RIG-I并抑制下游的IRF-3活化，从而阻止IFN-β的转录诱导。因此，NS1蛋白能够抑制IFN-α或IFN-β基因的表达，延迟被感染细胞的细胞凋亡的进展，并阻止相邻细胞内形成抗病毒状态。含有NS1蛋白的修饰的流感病毒是本领域已知的。例如WO 99/64571描述了NS基因节段的彻底敲除，WO 99/64068公开了被部分删除的多种NS基因节段。

与NS1相关的名词“改造”定义为至少一个核苷酸的插入、缺失或被不同核苷酸取代，导致亲本核苷酸序列改变。替代地，至少一个氨基酸被插入、缺失或代替，导致亲本氨基酸序列改变。

NS基因的改造可以包括至少一个核苷酸的任何修饰、取代和/或缺失，特别是NS基因可以编码截短的NS1蛋白，或者作为优选的替代情况，含有NS1 ORF内的缺失，造成缺少功能性NS1蛋白的流感病毒。

根据本发明，NS1蛋白内进行的改造可以提供复制缺陷型流感病毒或者表现出在干扰素活性细胞内复制能力下降的流感病毒。

在一个方法中，保留了NS1基因产物的氨基端部分，而删除了NS1基因产物C端部分。

具体来说，通过在合适的密码子进行核酸插入、缺失或突变可以制备所需的突变。尤其是截短的NS1蛋白仍然包含野生型NS1基因产物的氨基酸1-60、氨基酸1-70、氨基酸1-80、氨基酸1-90(N末端氨基酸为1)，尤其是前90个氨基酸；包含氨基酸1-100，尤其是包含氨基酸1-99；氨基酸1-110、氨基酸1-120，或者氨基酸1-130，尤其是前124个氨基酸。在替代实施方案中，改造过的NS1蛋白包含缺失至少50％的NS1氨基酸，优选至少70％，更优选至少90％。替代地，NS1蛋白的功能被完全废除。

发明所述流感病毒载体的NS1蛋白缺少功能性RNA结合结构域。位于NS1蛋白氨基端的这个结构域(氨基酸1-73)的主要功能是结合dsRNA并抑制2′5′寡聚(A)合成酶/RNase L途径(Min J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，2006，103，7100-7105，Chien et al.，Biochemistry.2004 Feb 24；43(7)：1950-62)以及激活胞质RNA解旋酶、RIG-1、視黄酸诱导性蛋白I(Yoneyama M.et al.，Nat.Immunol.，2004，5，730-737)。

根据本发明，缺少功能性RNA结合结构域定义为完全缺乏dsRNA结合能力，导致流感病毒在干扰素活性细胞内不能复制。

根据本发明的实施方案，流感病毒载体的NS1蛋白的效应结构域不是功能性的。效应结构域与细胞蛋白相互作用从而抑制mRNA的出核转运。所述效应结构域位于NS1蛋白的C端部分。根据Schultz等，效应结构域具体位于氨基酸残基117和161之间，其他文献将效应结构域定位在134和161之间。NS1效应结构域可以被完全或部分地删除，氨基酸可以被取代或插入，余下的效应结构域可以按照现有技术的描述检测其功能性(Schultz-Cherry S.et al.，J.Virol.，2001，7875-7881)。

根据本发明的其他实施方案，与效应结合活性相关的C末端氨基酸被改造从而抑制效应功能。具体来说，位点74-230中任何一个位点上的至少一个氨基酸，更具体来说，位点116-161中任何一个位点上的至少一个氨基酸，更具体来说，位点134-161中任何一个位点上的至少一个氨基酸被改造。根据优选实施方案，改造是缺失位点74-230，尤其是位点116-161，更尤其是位点134-161上的氨基酸。

可以使用建立在Vero细胞上的反向遗传学系统，所述系统用于开发重组合流感病毒和/或经过改造的重组流感病毒的表达。该项技术是本领域已经公知的(Pleschka S.et al.，1996，J.Virol.，70(6)，4188-4192，Neumann andKawaoka，1999，Adv.Virus Res.，53，265-300，Hoffmann et al.2000，Proc NatlAcad Sci U S A.97：6108-13)。替代地，可以利用Enami和Enami(J.Virol，2000，74，12，pp.5556-5561)描述的基于RNPs的技术来发展重组合病毒。替代地，可以使用存在辅助病毒的反向遗传学系统。

更具体地说，选中用于本发明的病毒包含经过改造的NS基因，导致产生减毒的流感病毒，即病毒具有感染性，可以在干扰素缺陷型细胞或细胞系统中体外复制，但在干扰素活性细胞中不能复制或者表现出极大下降的复制能力。根据发明，名词“复制缺陷型”定义为在干扰素活性宿主细胞内的复制率通过本领域已知的血凝分析法、TCID50法或噬斑法确定是野生型流感病毒的至少5％以下，优选1％以下，优选0.1％以下。

根据发明的特定实施方案，流感基因节段可以来源于大流行或者不是大流行的不同流感病毒株。这可以造成产生重组合的流感病毒，所述重组合流感病毒将编码实际大流行间期病毒的表面糖蛋白血凝素(HA)和/或神经氨酸苷酶(NA)的基因与来自减毒mater strain的5或6或7个编码其他蛋白的RNA节段组合在一起，例如6/2组合包含来自不同病毒株的HA和NA节段，或者7/1重组合病毒包含来自不同病毒株的HA或NA节段，或者5/3重组合病毒含有流行毒株的各自HA、NA和M节段。

根据特定实施方案，流感病毒缺少功能性NS1和功能性PB1-F2蛋白。

NS1和PB1-F2开放读框的改造或删除具有几个正面效果。从疫苗病毒基因组中删除两个基因使它们的减毒表现型更稳定，安全性更高。对于部分截短的NS1突变体(能够在呼吸道中复制)的情况，PB1-F2缺失能够提高先天性免疫系统引发的病毒清除。此外，缺失PB1-F2会增加疫苗的免疫原性，因为能更好地吸引和激活免疫活性细胞，比如巨噬细胞或树突细胞。与只含有NS1缺失的病毒相比，被双重缺失突变体病毒感染的这类细胞在感染后早期能够引发更高的α干扰素水平。更强的细胞因子诱导能够调整和刺激适应性免疫反应。具体来说，除了NS1还缺失了PB1-F2开放读框导致小鼠中IgG水平，特别是IgG1和IgG2A抗体反应提高。更高的抗体反应能够给动物提供更好的抗高致病性流感攻击病毒的保护作用。

由于免疫原性的提高，双重缺失突变体诱发免疫反应所需的剂量与只包含delNS1表现型的流感病毒相比，可以低一些。

令人惊讶的是，通过删除两个致病因子对病毒进行的遗传修饰甚至可以加快感染后早期病毒在Vero细胞中的生长，从而提高疫苗株的生产效率。

还涉及了疫苗组合物，所述疫苗组合物包含发明所述的免疫诱发有效量的病毒和可药用载体。组合物中还可以含有佐剂和稳定剂。

根据发明，名词“免疫原性”意味着病毒能够引发体液或细胞免疫反应，优选是引发两者。免疫原性实体也是抗原性的。免疫原性诱发有效量的病毒在给予动物，优选给予人时，引发体液或细胞免疫反应，或者引发了这两种免疫反应。

所述疫苗组合物可以用于流感疾病的预防性治疗，包括将免疫原性诱发有效量的组合物给予需要这种治疗的人类患者。

组合物可以用于流感病毒感染的预防、控制、中和、治疗和/或缓解的方法中或者作为药物。当然还包括发明所述流感病毒在制备治疗流感病毒感染的药物中的用途。

免疫原性组合物可以包含活性或失活的本发明的流感病毒。病毒可以通过本领域技术人员已知的方法灭活。常用方法使用福尔马林和加热来灭活。

由于具有更高的免疫原性，可能优选免疫原性活制剂。生产这类重组免疫原性活制剂可以利用常规方法实现，包括将病毒在细胞培养物或含胚卵(例如鸡胚蛋)中增殖，然后进行纯化。

名词“可药用”意味着获得了联邦或州政府或者美国设立的管理机构的批准。

名词“载体”是指与药物组合物(例如免疫原性或疫苗制剂)一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液态载体，特别是注射性溶液的载体。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干的脱脂奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的例子在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中有描述。配方应当根据给药模式来选择。具体的配方可能还取决于病毒是活的还是灭活的。

名词“佐剂”是指能够增强对某抗原的免疫反应的化合物或混合物。名词“稳定剂”是指能够提高发明所述病毒的稳定性的任何试剂，例如可以是牛血清白蛋白、糖、壳聚糖、右旋糖酐、PEG等。

导入方法包括，但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、鼻内、硬膜外或经口途径。优选经过鼻内途径的导入。

在优选实施方案中，可能希望将药物通过任何合适的途径导入肺内。还可以利用例如吸入器或喷雾器或者将药物与雾化剂一起成剂来进行肺部给药。

药物制品还可以通过控释系统，例如泵来进行递送。

替代地，提供了即用型输液。替代地，制品可以配制成粉末，在即将使用前溶解在合适的水溶液中。

本发明的药物组合物的能够有效治疗具体疾病或状况的量取决于疾病或状况的性质，并且可以通过常规临床技术进行确定。此外，任选采用体外方法来协助鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的确切剂量还取决于给药途径和疾病或紊乱的严重程度，应当根据医务人员的判断和每个患者的具体情形来决定。但是，合适的给药剂量范围通常在大约10⁴-5×10⁷pfu，可以根据需要给予一次或间隔给予多次。本发明的药物组合物包含10⁴-5×10⁷pfu的复制缺陷型病毒突变体，可以经鼻内、气管内、肌内或皮下给药。有效剂量可以由来自体外或者动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推得到。

当然发明还提供了防止流感病毒感染患者的方法，所述方法包括将发明的疫苗给予个体。

发明还提供了发明的疫苗在制备用于防止流感病毒感染个体的制品中的用途。

参考下面的实施例可以更充分地理解以上描述。但是这些实施例仅仅是实施本发明的一或多个实施方案的代表性方法，不应当理解为对发明范围的限制。

实施例：

PB1-F2突变

PB1-F2的突变是利用标准分子生物学方法(例如PCR、定点突变)或者在Geneart AG(Germany)通过特别定制的基因合成进行的。所有构建体经过测序来验证没有不需要的突变。

表1：

T120C：M-＞T

T153G：L-＞终止

T222A：L-＞终止

T234C：M-＞T

T255C：M-＞T

T270C：M-＞T

G291A：W-＞终止

F2 ORF中的所有氨基酸取代相对PB1 ORF来说都是沉默突变。

病毒拯救

PB1-F2野生型和PB1-F2突变体病毒的病毒拯救是利用Erich Hoffmann(Hoffmann et al.2000，PNAS 97(11)：6108-13)建立的双向8-质粒系统从质粒进行的。

简单来说，Vero细胞(WHO推荐用于疫苗生产)用8个各含有一个A型流感病毒相应节段的质粒，按照以前优化的试验方案共转染。转染后，细胞在含有胰蛋白酶的无血清培养基中温育以便病毒进行复制。通常3到4天后，可以观察到病毒复制所导致的强烈致细胞病变效应。此时收获病毒，冷冻待用或者直接用于制备病毒储液。

病毒培养

培养和对生长特性的评价在无血清Vero细胞培养中进行。病毒储液的滴度测定在96孔板上按照成熟的SOP经TCID₅₀方法进行。

材料与方法

小鼠和免疫

大约8周龄的年轻成年雌性C57Bl小鼠在乙醚麻醉的情况下，用含有或不含有PB1-F2 ORF的两种重组合病毒A/Kurgan/5/05delNS1(在流感病毒IVR-116的基础上6:2重组合)经i.n.免疫两次。每只小鼠使用的剂量对A/Kurgan/5/05 6:2 delNS1，调整到5,5lg TCID50；对A/Kurgan/5/05 6:2delNSdelPB1-F2，调整到5,4lgTCID50。两次免疫间隔28天。

血清样品的制备

第一次免疫后28天和第二次免疫后20天从鼠眼眶后静脉丛采血。血样在室温下凝集2小时，离心(4000rpm，10分钟)后获得血清，最后保存在-20℃。

病毒变体的生长潜力

为了评估重组合病毒株在Vero细胞内的生长潜能，对不同时间点从感染孔采集的上清液进行了TCID₅₀分析法。简单来说，将新鲜Vero单层细胞(6孔板)以MOI＝0.01；0.001和0.0001(每个MOI两个孔)接种两种重组合病毒：A/Kurgan/5/05 6:2 delNS和A/Kurgan/5/05 6:2 delNSdelPB1-F2。室温温育40分钟后，除去接种物，加入补充了4mM L-谷氨酰胺(GIBCO)和5μg/ml胰蛋白酶(Sigma)的分析培养基(

培养基；Invitrogen)。细胞在37℃和5％CO₂温育。24、48和72小时后，将两个孔的液份(300μl)合并，冷冻在-80℃。然后，将所有样品解冻，在Vero细胞中通过TCID50分析法测定滴度。在分析培养基中制备冷冻上清的系列10倍稀释液。向含有新鲜Vero细胞单层的96孔板的孔中加入100μl稀释样品。细胞室温下温育50分钟。除去接种物，并加入新鲜的分析培养基。细胞在37℃和5％CO₂温育3天。显微镜下给感染和未感染孔打分，上清也通过HA方法利用0.5％鸡RBC评定。采用Reed和Muench的方法计算TCID₅₀滴度。

ELISA

进行了改进的酶联免疫分析法(ELISA)。简单来说，96孔clear NuncMaxisorp板用纯化的H5N1重组合病毒A/Kurgan/5/05(40HAU/孔)于4℃包埋过夜。然后将培养板清洗，用含有0.5％I-block(Tropix)和0.01％Tween(分析缓冲液)的PBS封闭30分钟，向包埋好的孔中加入血清系列稀释(100μl/孔)，室温下温育2小时。充分清洗后，结合抗体的检测利用了亲和纯化的偶联辣根过氧化物酶的山羊抗人IgG1(0.5μg/ml，Invitrogen)或者IgG2a(1μg/ml，Invitrogen)(100μl/孔)，然后经过额外的清洗步骤并随后加入底物TMB(100μl/孔，KPL)。用2M H₂SO₄终止反应，测量光密度(OD)(测量波长450nm；参照波长630nm)。截止值定义为超过阴性对照血清平均吸光值0.15加上两个标准差的OD值。

脾细胞的分离

致敏后第10天(CD8+T细胞ELISPOT)和第28天(CD4+T cell ELISPOT)采集免疫小鼠(每组三只小鼠)的脾。借助细胞筛(Falcon)将脾机械解离为单细胞悬液。细胞悬液中存在的红细胞用Tris缓冲的氯化铵裂解，洗涤几次，最后重悬在含有10％FCS、青霉素、链霉素、IL-2(30U/ml)和50μM 2-巯基乙醇的Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)中。

ELISPOT检测

利用以下合成肽进行立即离体CD8+和CD4+IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)检测：ASNENMETM，保守的A型流感病毒核蛋白的H-2D^b-限制性免疫优势CTL表位(NP147-155；CD8+ELISPOT)；以及来自保守的A型流感病毒核蛋白的IRPNENPAHKSQLVW和INDRNFWRGENGRKT H-2D^b限制性CD4+肽(分别是NP 316-330和201-215，CD4+ELISPOT)的集合。简单来说，将来源于鼠脾的细胞群体的两倍系列稀释液转移到包埋了抗小鼠IFN-γ单克隆抗体(MAb R4-6A2，BioLegend)的孔中。细胞于37℃和5％CO₂，在有以上肽的情况下，在含有10％胎牛血清、IL-2(30U/ml)、青霉素、链霉素和50μM 2-巯基乙醇的DMEM中温育24小时(CD8+ELISPOT)或48小时(CD4+ELISPOT)。生物素化的抗IFN-γMAb(XMG1.2，BioLegend)被用作偶联抗体，然后将培养板与链霉亲和素过氧化物酶(0.25U/ml；Boehringer Mannheim Biochemica)温育。未经刺激的细胞和用TYQRTRALV(H-2K^d限制性免疫优势CTL肽)刺激的细胞作为阴性对照。在有溶于0.1M醋酸钠(pH 5.0)的过氧化氢的情况下，用底物3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)将代表分泌IFN-γ的CD8+细胞的斑点显现。借助解剖显微镜给斑点计数，结果表达为三个重复培养的IFN-γ分泌细胞的平均数量/10⁶细胞±平均数的标准误差(SEM)。在没有合成肽情况下温育的细胞显现＜15斑点/10⁶细胞。

人PBMCs中的IFN-α诱导

细胞：

用淋巴细胞分离培养基(PAA)通过梯度离心从四个志愿者的静脉血获得外周血单核细胞(PBMCs)。细胞用RPMI 1640培养基(Gibco)洗几次，并冷冻待用。

表2：

将病毒培养在Vero细胞中(3个传代)；这些细胞还用于病毒-TCID₅₀滴度确定。

细胞感染程序：

感染前一天，将细胞解冻，用含有10％FBS(Gibco)的RPMI 1640清洗，分成小份(1*10⁶细胞/管)在37℃和5％CO₂放置24小时。温育后，清洗细胞，用各种Kurgan病毒改造以2的感染复数(moi)进行感染或者假感染(RPMI1640)。接种30分钟后，将细胞离心沉淀，重悬在含有10％FCS的1ml RPMI1640培养基中，于37℃和5％CO₂温育。第6和24小时(p.i.)收获上清液，利用定量细胞因子特异性ELISA试剂盒确定IFN-α的水平。

小鼠中的病毒清除测试

小鼠用10⁶病毒颗粒/动物经鼻内感染，所述病毒颗粒是包含125或80个氨基酸残基的NS1突变病毒组合了(或者没有)PB1-F2读框的缺失。感染后第2、4、6、7和8天，取出肺，在Vero细胞中通过测定肺匀浆的滴度来评估病毒负荷(TCID50)。明确肺中病毒完全清除(没有可检测到的病毒)的第一天。

在小鼠中抗高致病性H5N1株攻击的保护作用

小鼠组(n＝20)用等剂量的两种重组合病毒经鼻内免疫，所述病毒含有来自A/Chicken/Kurgan/5/05(H5N1)株的表面糖蛋白HA和NA，保留单一NS1缺失或者NS1/PB1-F2双重缺失作为减毒因素。四周后，小鼠用野生型高致病性的同源A/Chicken/Kurgan/5/05(H5N1)株经鼻内攻击，摄入剂量为50LD₅₀。对攻击后的死亡率跟踪15天，确认死亡动物的百分比。

结果

DelNS1-PB1-F2变体在Vero细胞中显示增强的生长潜力

Vero细胞如材料与方法部分的详细描述用delNS1和delNS1-PB1-F2F2病毒变体感染。无论使用的MOI是多少，delNS1-PB1-F2病毒变体与delNS1病毒相比，在感染后24小时复制达到明显更高的TCID50滴度。如图1所示的数据表明PB1-F2蛋白的缺失对病毒在生产基质(Vero细胞)中的生长有正面影响。

DelNS1-PB1-F2变体提高了干扰素α的诱导

来自不同供体的人PBMCs，按照材料与方法部分的描述用等剂量delNS1和delNS1-PB1-delF2病毒变体感染。感染后6小时利用ELISA试剂盒测量培养物上清中的干扰素2α的水平。双重缺失突变体与NS1缺失病毒相比，显示在所有4个PBMCs培养物中引发了更高的干扰素产量(表3，图7)。因此，PB1-F2蛋白的缺失解除了病毒在感染免疫活性细胞后对先天性免疫反应的抑制作用。

表：IFN-α水平(pg/ml)6h p.i.

检测小鼠血清中H5特异性IgG1和IgG2a

采集于第一次免疫后28天和第二次免疫后20天的血清样品用于分析病毒特异性IgG1和IgG2a抗体的存在情况(图2)。有趣的是，用delNS1-PB-1F2突变病毒免疫的小鼠在第一次免疫后发展出明显增强的滴度，而用delNS1亲本病毒免疫的小鼠需要一次加强免疫才能达到与那些用delNS1-PB1-F2变体致敏的小鼠相当的病毒特异性IgG1水平。对于病毒特异性IgG2a抗体的几何平均滴度(Th1型免疫反应)，第一次免疫后两组免疫小鼠水平相当，但第二次免疫后，delNS1-PB1-F2变体的优势即显现出来。

这些数据表明，delNS1-PB1-F2变体中的F2读框缺失显著刺激了Th2型免疫反应，因此可能导致产生更广泛的病毒特异性抗体谱，增强了对经过免疫的宿主的保护作用。

图2显示了小鼠用delNS1-PB1F2和delNS病毒突变体免疫两次时的结果。采集于第一次免疫(单次)后28天和第二次免疫(二次)后20天的血清样品被用于分析病毒特异性IgG1 and IgG2a抗体的存在情况。显示的是各个小鼠的终点滴度。水平线区段代表用图中所示各病毒变体免疫的整组小鼠的几何平均滴度。

确定小鼠中T细胞免疫反应

与用delNS病毒免疫的小鼠相比，用delNS-PB1F2病毒变体免疫的小鼠能够发展出相同数量级的病毒特异性CD6+T细胞。用辅助表位肽对小鼠的特异性CD4+T细胞刺激导致两组病毒免疫小鼠与对照小鼠范围相近的低频率IFN-γ斑点形成CD4+T细胞。

表4.确定免疫小鼠中的T细胞免疫反应

免疫后10天(CD8+T细胞ELISPOT)和28天(CD4+T细胞ELISPOT)从每组三只小鼠获得经过免疫的小鼠和对照小鼠的脾并合在一起，分解成单细胞群，按照材料与方法部分的描述进行ELISPOT分析。显示的是每百万细胞中的IFN-γ分泌细胞的平均数加上平均数的标准误差(S.E.M.)。

部分截短的NS1突变病毒从小鼠呼吸道的清除

与体内复制缺陷的完全NS1缺失病毒不同，含有仅部分截短的NS1蛋白的病毒，即包含氨基酸1-125或者1-80个氨基酸残基的病毒，能够在小鼠呼吸道中一定程度地复制。比较了这些含有或不含有活性PB1-F2开放读框的病毒突变体在呼吸道不同部位中病毒复制的程度和持续性。试验表明含有PB1-f2蛋白缺失的病毒毒性衰减更强。这个例子显示额外缺失PB1-F2致病因子保证了减毒(具复制活性)鼻内活疫苗株的安全性。

缺失PB1-F2提高了鼻内复制缺陷型疫苗的效力

用5log的含有单一NS1或NS1/PB1-f2双重缺失的两种疫苗模型病毒(基于A/Chicken/Kurgan/5/05(H5N1)病毒)给小鼠鼻内免疫一次，能够不同程度地诱发保护作用，对抗高致病性同源株会引起的死亡。基于双重缺失病毒的疫苗保护了100％的动物，而用NS1缺失突变病毒免疫后，只有37％的动物获得保护。在用PBS进行免疫的假对照组，15天的观察期间，其死亡率达到95％。因此NS1/PB1-F2双重缺失突变疫苗病毒与仅含有NS1缺失的疫苗病毒相比，保护效率更胜一筹。

Claims (13)

1.流感病毒，其中NS节段包含至少一个核苷酸的插入、取代或缺失，并且其中PB1-F2开放读框(ORF)通过引入至少一个终止密码子而被改造。

2.权利要求1所述的流感病毒，其中所述病毒是复制缺陷型的。

3.权利要求1或2所述的流感病毒，其中PB1节段通过引入多个终止密码子而被改造。

4.权利要求1-3中任一项所述的流感病毒，其中所述改造发生在按照SEQ ID NO.1编号的核苷酸位点T120、T153、T222、T234、T255、T270和G291中的任何一个。

5.权利要求1-4中任一项所述的流感病毒，其中PB1基因的改造导致PB1-F2 ORF被敲除。

6.权利要求1-5中任一项所述的流感病毒，其包含SEQ ID.No 2的核苷酸序列或者它的至少一部分。

7.权利要求1-5中任一项所述的流感病毒，其中PB1F2蛋白包含SEQ IDNo.4的氨基酸序列或者它的一部分。

8.权利要求1-7中任一项所述的流感病毒，其中NS节段(或节段8)编码截短的NS1蛋白。

9.权利要求1-8中任一项所述的流感病毒，其中NS节段不编码NS1蛋白。

10.权利要求1-9中任一项所述的流感病毒，其缺少功能性NS1和功能性PB1-F2蛋白。

11.疫苗制剂，其包含权利要求1-10中任一项所述的病毒，并任选包含可药用载体。

12.权利要求11所述的疫苗，其被配制用于鼻内递送。

13.权利要求1-11中任一项所述的病毒在制备防止个体的流感病毒感染的制品中的用途。

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