ES2557315T3 - Nuevo virus de la gripe - Google Patents

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Abstract

Virus de la gripe que carece de proteínas NS1 y PB1-F2 funcionales y que es deficiente en replicación en células competentes para el interferón, en el que el ORF PB1-F2 está modificado por la introducción de al menos un codón de terminación por modificación de cualquiera de las posiciones T120, T153, T222, T234, T255, T270 y G291 de acuerdo con la numeración de la SEC ID Nº 1 y en el que se ha eliminado la proteína NS1.

Description

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reales con cinco o seis o siete segmentos de ARN que codifican otras proteínas de la cepa maestra atenuada, por ejemplo una combinación 6/2 que comprende segmentos HA y NA de una cepa diferente, o recombinados 7/1 que comprenden segmentos HA o NA de una cepa diferente o recombinados 5/3 que contienen segmentos HA, NA y M de una cepa circulante respectivamente.
5 De acuerdo con la divulgación, el virus de la gripe carece de NS1 funcional y proteínas PB1-F2 funcionales.
La modificación o supresión del marco de lectura de NS1 y PB1-F2 tiene varios efectos positivos. La supresión de uno o dos genes del genoma de los virus vacunales aumenta la estabilidad genética de su fenotipo atenuado y lleva la seguridad a un nivel más alto. En el caso de los mutantes con NS1 parcialmente truncada, que son capaces de replicarse en el tracto respiratorio, la supresión de PB1-F2 aumenta el aclaramiento del virus desencadenado por el sistema inmunitario innato. Además, la supresión de PB1-F2 aumenta la inmunogenicidad de la vacuna debido a una mejor atracción y activación de células inmunocompetentes como los macrófagos o células dendríticas. Tales células que se infectan por el virus mutante con doble supresión dan lugar a niveles más altos de interferón-alfa
15 tempranamente tras la infección en comparación con un virus que contenga solamente la supresión de NS1. La mejor inducción de citoquinas modula y estimula la respuesta inmunitaria adaptativa. Específicamente, la supresión del marco de lectura PB1-F2 además de la NS1 da lugar a niveles aumentados de IgG, específicamente de la respuesta de anticuerpos IgG1 e IgG2A en ratones. La respuesta de anticuerpos más alta proporciona una mejor protección a los animales contra la exposición a virus de la gripe altamente patógeno.
Debido al aumento de inmunogenicidad, la dosis del mutante con supresión doble para inducir una respuesta inmunitaria podría ser menor en comparación con la de virus de la gripe que comprende solamente el fenotipo delNS1.
25 Sorprendentemente, la modificación genética del virus por supresión de dos factores de patogenicidad podría incluso aumentar el crecimiento vírico en células Vero tempranamente tras la infección, mejorando la eficacia de producción de cepas vacunales.
También está incluida una composición vacunal que comprende una cantidad de inducción inmunógenamente eficaz del virus de acuerdo con la divulgación mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable. También puede haber adyuvantes y estabilizantes contenidos en la composición.
De acuerdo con la divulgación el término “inmunógeno” significa que el virus es capaz de dar lugar a una respuesta inmunitaria humoral o celular, y preferentemente ambas. Una entidad inmunógena también es antigénica. Una
35 cantidad de inducción inmunógenamente eficaz del virus da lugar a una respuesta inmunitaria humoral o celular, o ambas, cuando se administran a un animal, preferentemente un ser humano.
La composición vacunal se puede utilizar para el tratamiento profiláctico de la enfermedad de gripe que comprende la administración a un paciente humano que necesita el tratamiento de una cantidad de inducción inmunológicamente eficaz de la composición.
Las composiciones se pueden utilizar en métodos o como medicamentos en la prevención, manejo, neutralización, tratamiento y/o mejora de la infección por el virus de la gripe. Por supuesto se incluye el uso de un virus de la gripe de acuerdo con la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por el virus
45 de la gripe.
Las composiciones inmunógenas pueden comprender un virus de la gripe o vivo o inactivado de la invención. El virus se puede inactivar por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos comunes utilizan formalina y calor para la inactivación.
Puede preferirse una formulación inmunógena viva debido al aumento de inmunogenicidad. La producción de tales formulaciones inmunógenas vivas recombinantes se puede conseguir utilizando métodos convencionales que implican la propagación del virus en un cultivo celular o en huevos embrionados (por ejemplo, huevos embrionados de gallina) seguido por purificación.
55 La expresión “farmacéuticamente aceptable” significa que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en los EE. UU.
El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica (por ejemplo, la formulación inmunógena o vacuna). Se pueden emplear también soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos 65 adecuados en "Remington’s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. La formulación se debería seleccionar de acuerdo con el modo de administración. La formulación particular también puede depender de si el virus está vivo o
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T120C: M hasta T T153G: L hasta terminación T222A: L hasta terminación T234C: M hasta T T255C: M hasta T T270C: M hasta T G291A: W hasta terminación
Todas las sustituciones de aminoácidos en el ORF F2 son mutaciones silenciosas con respecto al ORF PB1.
Rescate vírico
5 El rescate vírico de los virus PB1-F2 tipo silvestre y PB1-F2 mutante se hace a partir de plásmidos que utilizan un sistema de 8 plásmidos bidireccional desarrollado por Erich Hoffmann (Hoffmann et al. 2000, PNAS 97(11):6108-13).
En resumen, las células Vero (recomendadas por la OMS para la producción de vacunas) se co-transfectaron con
10 ocho plásmidos que contenían cada uno los respectivos segmentos de gripe A de acuerdo con un protocolo optimizado previamente. Tras la transfección, las células se incubaron en medio libre de suero que contenía tripsina para permitir la replicación vírica. Habitualmente tres a cuatro días después se observó un fuerte efecto citopático producido por la replicación vírica. En este momento los virus se recolectan y o se congelan hasta un uso posterior o directamente se utilizan para la preparación de reservas de virus.
15
Cultivo de los virus
El cultivo y la evaluación de las características de crecimiento se hacen en cultivo de células Vero libres de suero. Se llevó a cabo la titulación de virus de reserva por el método de TCID50 en placas de 96 pocillos de acuerdo con
20 SOP establecidos.
Materiales y métodos
Ratones e inmunizaciones
25 Los ratones C57BI hembras adultas jóvenes de aproximadamente ocho semanas de edad, se inmunizaron por vía
i.n. dos veces bajo anestesia de éter con dos virus A/Kurgan/5/05delNS1 recombinados (recombinados 6:2 basados en virus de la gripe IVR-116) con o sin ORF PB1-F2. Se ajustó la dosis por ratón a 5,5 Ig TCID50 en caso de A/Kurgan/5/05 6:2 delNS1 y 5,4 IgTCID50 en el caso de A/Kurgan/5/05 6:2 delNSdelPB1-F2. El intervalo entre las
30 inmunizaciones fue de 28 días.
Generación de muestras de suero
Se recolectó la sangre del plexo venoso retro orbital murino 28 días después de la primera inmunización y el día 20
35 tras la segunda inmunización. Las muestras de sangre coagularon a temperatura ambiente durante 2 horas y el suero se generó después de la centrifugación (4000 rpm, 10 min), y finalmente se almacenó a -20 ºC.
Potencial de crecimiento de las variantes víricas
40 Para evaluar el potencial de las cepas de virus recombinados para crecer en células Vero, se llevaron a cabo ensayos TCID50 a partir de los sobrenadantes recolectados de los pocillos infectados en diferentes momentos. En resumen, se inoculó la monocapa de células Vero nueva (placas de 6 pocillos) con ambos virus recombinados: A/Kurgan/5/05 6:2 delNS y A/Kurgan/5/05 6:2 delNSdelPB1-F2 a una MOI = 0,01; 0,001 y 0,0001 (dos pocillos para cada MOI). Tras 40 min de incubación a temperatura ambiente, las inoculaciones se retiraron y se añadió medio de
45 ensayo (medio Opti-Pro®; Invitrogen), complementado con L-Glutamina 4 mM (GIBCO) y tripsina 5 µg/ml (Sigma). Las células se incubaron a 37 ºC y un 5 % de CO2. Tras 24, 48 y 72 horas se combinaron alícuotas (300 µl) de dos pocillos y se congelaron a -80 ºC. Luego, se descongelaron todas las muestras y se titularon en células Vero por el ensayo TCID50. Se prepararon diluciones en serie de 10 veces de los sobrenadantes congelados en medio de ensayo. Se añadieron a los pocillos 100 µl de las muestras diluidas a los pocillos de una placa de 96 pocillos que
50 contenía monocapas de células Vero recién preparadas. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 50 min. Se retiró el inóculo y se añadió medio de ensayo nuevo. Se incubaron las células a 37 ºC y un 5 % de CO2 durante 3 días. Los pocillos infectados y no infectados se valoraron microscópicamente y los sobrenadantes se evaluaron también por el ensayo de HA, utilizando un 0,5 % de RBC de pollo. Se calculó el título TCID50 utilizando el método de Reed y Muench.
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específica del virus comparables a los de los ratones sensibilizados con la variante delNS1-PB1-F2. Con respecto a anticuerpos IgG2a específicos del virus los títulos de la media geométrica (respuesta inmunitaria tipo Th1) eran comparables en ambos grupos de ratones inmunizados tras la primera inmunización, sin embargo, tras la segunda inmunización también se reveló la ventaja de la variante delNS1-PB1-F2.
5 Estos datos indican que la supresión del marco de lectura F2 en la variante delNS1-PB1-F2 estimula significativamente la respuesta inmunitaria tipo Th2 y por lo tanto puede contribuir a un espectro más amplio de anticuerpos específicos del virus y aumento de la protección de los hospedadores inmunizados.
10 En la figura 2 se muestran los resultados cuando se inmunizaron los ratones dos veces con los virus mutantes delNS1-PB1-F2 y delNS. Se analizaron las muestras de suero recolectadas el día 28 tras la primera inmunización (única) y el día 20 tras la segunda inmunización (segunda) en cuanto a la presencia de anticuerpos IgG1 e IgG2a específicos del virus. Se muestran los títulos de puntos finales de ratones individuales. Los segmentos lineales horizontales representan el título de la media geométrica del grupo entero de ratones inmunizados con la variante
15 vírica respectiva como se indica en la figura.
Determinación de la respuesta inmunitaria de linfocitos T en ratones
Los ratones inmunizados con la variante vírica delNS-PB1-F2 eran capaces de desarrollar las mismas magnitudes
20 de linfocitos T CD6+ específicos de virus en comparación con los ratones inmunizados con el virus delNS. La estimulación de linfocitos T CD4+ específicos de los ratones con epítopos peptídicos auxiliares dieron como resultado en ambos grupos de ratones inmunizados con el virus, linfocitos T CD4+ que formaban puntos de IFN-γ con baja frecuencia cerca del intervalo de los ratones de control.
25 Tabla 4. Determinación de respuestas inmunitarias de linfocitos T en ratones inmunizados.
Grupo de inmunización (Virus)
Células formadoras de puntos de IFN-γ/106 células (± E.T.M.)
linfocitos T CD8+
linfocitos T CD4+
delNS
51 (11,3) 31 (3,3)
delNSdelPBF2
50 (3,3) 25
control
<10 22
Los bazos de los ratones inmunizados y de control se obtuvieron los días 10 (ELISPOT de linfocitos T CD8+) y 28 (ELISPOT de linfocitos T CD4+) tras la inmunización de tres ratones por grupo y se agruparon, se disociaron en poblaciones celulares únicas y se llevó a cabo el ensayo ELISPOT como se describe en la sección de Materiales y
30 métodos. Se muestra la media de células secretoras de IFN-γ por millón de células más el error típico de la media (E.T.M.).
Aclaramiento de los virus mutantes con NS1 parcialmente truncada a partir del tracto respiratorio del ratón
35 Al contrario que con los virus con supresión completa de NS1 que son deficientes en replicación in vivo, los virus con proteínas NS1 truncadas solo parcialmente, a saber, que comprenden los aminoácidos 1-125 o restos de aminoácidos 1-80 son capaces de replicarse hasta cierto punto en el tracto respiratorio de los ratones. Estos mutantes víricos que contenían o no contenían marco de lectura abierto PB1-F2 activo se comparan en cuanto al alcance y la duración de la replicación vírica en las diferentes partes del tracto respiratorio. El experimento permite
40 demostrar un aumento de la atenuación de los virus que contienen la supresión de la proteína PB1-F2. El ejemplo muestra que la supresión adicional del factor de patogenicidad PB1-F2 asegura el perfil de seguridad de las cepas vivas vacunales intranasales atenuadas (competentes para la replicación).
La supresión de la PB1-F2 aumenta la eficacia de la vacuna deficiente en replicación intranasal
45 La inmunización intranasal única de ratones con 5 log de dos virus vacunales modelo que contienen una supresión única de NS1 o doble de NS1/ PB1-F2, que se basa en un virus A/Chicken/Kurgan/5/05 (H5N1), eran capaces de inducir protección contra la mortalidad inducida por la exposición a la cepa homóloga altamente patógena en un grado diferente. La vacuna basada en un virus con doble supresión protegía el 100 % de los animales, mientras que
50 solamente el 37 por ciento de los animales estaban protegidos tras la inmunización con el virus mutante con supresión de NS1. En el grupo de control de simulación inmunizado con PBS el nivel de mortalidad había alcanzado el 95 % durante el periodo de observación de 15 días. Por lo tanto el virus vacunal mutante con doble supresión NS1/PB1-F2 es superior en eficacia de protección en comparación con un virus vacunal que contiene solamente una supresión única de NS1.
55
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