JP6839088B2 - 手足口病ワクチン、ならびにその製造方法及び使用方法 - Google Patents

手足口病ワクチン、ならびにその製造方法及び使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体で本明細書により援用される２０１４年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／０７７，１３９号明細書の利益を主張するものである。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体で本明細書に参照により援用される：コンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイルの名称：６０６７７２０００９４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ。データの記録日は、２０１５年１０月２９日。サイズ：９２ＫＢ）。
発明の分野
本開示は、ヒトにおいて手足口病の原因となる少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を有する手足口病のワクチン及び免疫原性組成物、ならびにそれらの製造方法、製剤化方法、及び検証方法、及び使用方法に関するものである。
手足口病（ＨＦＭＤ：Ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）群のいくつかのメンバーにより引き起こされる。一般的に、ほとんどは子供が罹患する自己限定的な感染であり、手、足及び口腔の潰瘍と小疱に特徴づけられる。しかし、肺水腫をもたらす例えば髄膜炎、脳炎、ポリオ様麻痺、及び脳幹脳炎などの神経症状を伴う、より重症型の疾患が発生する場合がある（Huang, C., et al., (1999) N Engl J Med 341: 936-942, Chang, L., et al. (1998) Lancet 352: 367-368, Ooi, M., et al. (2009) BMC Infect Dis 9: 3）。ヒトエンテロウイルスＡは、非エンベロープ型のプラス鎖ＲＮＡウイルスであるピコルナウイルス科に属し、当該科はポリオウイルス及びライノウイルスも含んでいる。ＨＦＭＤを引き起こし得るＨＥＶ−Ａ群のメンバーとしては、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、ならびに血清型Ａ１、Ａ４、Ａ６、Ａ１０及びＡ１６を含むコクサッキーウイルスが挙げられる（Pallansch and Roos, (2007) Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, editors. Fields Virology. Philadelphia, PA Lippincott Williams & Wilkins. pp. 839-894; and Kobayashi M et al., Jpn J Infect Dis 2013; 66:260-1）。
エンテロウイルス７１及びコクサッキーウイルスは、４個のカプシドタンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４）と７個の非構造タンパク質を含有する。ウイルスＲＮＡの保護に加え、当該カプシドタンパク質は宿主細胞表面上の受容体を認識し、ウイルスの抗原プロファイルに寄与している（Jubelt 2014 Handbook of Clinical Neurology）。ＥＶ７１に対する公知のヒト細胞表面受容体は、スカベンジャー受容体Ｂ２（ＳＣＡＲＢ２）、及びＰセレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）（Yamayoshi S., et al. (2009) Nat Med 15:798-801, Nishimura Y., et al. (2009) Nat Med 15: 794-797）である一方、コクサッキーＡウイルスは、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、インテグリンαｖβ３、及びＭＨＣ−Ｉ関連グルコース制御タンパク質７８（ＧＲＰ７８）（Bergelson, J. et al. (2013) Adv Exp Med 790: 24-41）に結合する。
ＨＦＭＤの発症率は通常、年齢とともに低下する。しかしながら、５歳未満の子供は、ＥＶ７１がＣＮＳ感染するため、ＨＦＭＤの最重症型に対し特に感受性である。これにより、無菌性髄膜炎、脳幹及び／又は小脳の脳炎、ならびに急性弛緩性麻痺をはじめとする神経性疾患が生じ得る（Ooi, M., et al. (2010) Lancet Neurol . 9: 1097-1105, McMinn, P., et al. (2002) FEMS Microbiol. Rev . 26: 91-107）。また、これら重症例の一部は自律神経系にも感染を生じさせ得、それによって、神経原性肺水腫が生じ得、ついには心肺機能不全が生じる場合がある。ＣＮＳの関与はあるが、神経原性肺水腫を伴わない患者と比較し、ＣＮＳが関与し、心肺機能不全を伴うＥＶ７１感染は、長期にわたる神経学的後遺症、神経発達遅延、及び認知機能の低下と関連づけられている（Chang, L., et al., (2007) N. Engl. J. Med. 356:1226-1234, Ooi, M., et al. (2010) Lancet Neurol. 9: 1097-1105, Solomon, T., et al. (2010) Lancet Infect. Dis. 10: 778-790）。長期にわたる神経学的後遺症の原因は、ＥＶ７１のニューロンへの直接的な感染による神経損傷が原因であると考えられている。
アジアにおいて、ＨＦＭＤの流行が毎年発生しており、多くの重症例が報告されている。２００７年の中国からの散発的な報告では、８０，０００症例を超える重症ＨＦＭＤが示されている。２００８年には中国でほぼ５００，０００の重症例が報告された。２００９年の１月〜７月の間に、中国衛生部（ＭＯＨ：Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）は、ＣＮＳ関与と定義された１０，５００を超える重症例を伴う７８７，０００を超えるＨＦＭＤの症例があったことを報告している。中国からの最近の報告ではさらに、２０１０年には１５０万人を超える子供がＨＦＭＤと診断されたことを示唆している。
中国でのＨＦＭＤ流行にもかかわらず、現在のところ利用可能なＨＦＭＤに対するワクチンは無く、感染に対する有効な抗ウイルス療法も存在しない。ＨＦＭＤの治療は症状の緩和にのみ重点が置かれている。重篤な口腔内潰瘍は痛みを伴う口内炎をもたらし、食物と飲物の両方ともが経口摂取を妨げられ、それにより入院が必要となる得るほどの脱水が生じる。髄膜脳炎と心肺停止は緊急的及び全面的な支持療法ならびに管理を必要とする。
Huang, C., et al., (1999) N Engl J Med 341: 936-942 Chang, L., et al. (1998) Lancet 352: 367-368, Ooi, M., et al. (2009) BMC Infect Dis 9: 3 Pallansch and Roos, (2007) Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, editors. Fields Virology. Philadelphia, PA Lippincott Williams & Wilkins. pp. 839-894; and Kobayashi M et al., Jpn J Infect Dis 2013; 66:260-1 Jubelt 2014 Handbook of Clinical Neurology Yamayoshi S., et al. (2009) Nat Med 15:798-801 Nishimura Y., et al. (2009) Nat Med 15: 794-797 Bergelson, J. et al. (2013) Adv Exp Med 790: 24-4 Ooi, M., et al. (2010) Lancet Neurol . 9: 1097-1105 McMinn, P., et al. (2002) FEMS Microbiol. Rev . 26: 91-107 Chang, L., et al., (2007) N. Engl. J. Med. 356:1226-1234 Solomon, T., et al. (2010) Lancet Infect. Dis. 10: 778-790
したがって、特に子供における手足口病を治療及び／又は予防するためのワクチンならびに免疫原性組成物を開発する必要がある。このニーズを満たすために、本開示は、例えばＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６などのヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の抗原を含む、手足口病を治療及び／又は予防するためのワクチンならびに免疫原性組成物を提供する。有利なことには、抗原は、例えばＶｅｒｏ細胞などの培養非ヒト細胞株での産生を許容する少なくとも１つの適応突然変異を含んでもよい。さらには、本明細書において開示されるように、本発明のワクチン及び免疫原性組成物は、ヒトに手足口病を引き起こすウイルスに対する防御的免疫反応を誘導することが示されている。
したがって、本開示のある態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチンを提供するものであり、この場合において、当該１つ以上の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む。したがって、本開示のある態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物を提供するものであり、この場合において、当該１つ以上の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む。本開示の他の態様は、その必要のある対象における手足口病を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの治療有効量を当該対象に投与することにより、治療又は予防する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、その必要のある対象における免疫反応を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を当該対象に投与することにより、誘導する方法を提供するものである。
本開示の他の態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチンを提供するものであり、この場合において、当該少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ１６又はその両方であり、当該少なくとも１つのウイルスはベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ：ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ）で不活化されていた。本開示の他の態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物を提供するものであり、この場合において、当該少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ１６又はその両方であり、当該少なくとも１つのウイルスはベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で不活化されていた。本開示の他の態様は、その必要のある対象の手足口病を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの治療有効量を当該対象に投与することにより、治療又は予防する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、その必要のある対象において免疫反応を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を当該対象に投与することにより、誘導する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から手足口病ウイルス調製物を単離することであって、この場合において当該細胞はウイルス調製物の製造に用いられていること、（ｂ）ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）の有効量を用いて当該ウイルス調製物を処置すること、及び（ｃ）ホルマリンの有効量を用いて当該ウイルス調製物を処置することであって、この場合においてホルマリンを用いた処置工程は、工程（ｂ）と同時に、又は工程（ｂ）の後で発生し、及び当該ウイルスはＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、により手足口病ウイルスの調製物を不活化する方法を提供するものである。
本開示の他の態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチンを提供するものであり、この場合において当該少なくとも１つのウイルスはＣＡ６、ＣＡ１６又はその両方であり、当該少なくとも１つのウイルスはホルマリンで不活化されていた。本開示の他の態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物を提供するものであり、この場合において当該少なくとも１つのウイルスはＣＡ６、ＣＡ１６又はその両方であり、当該少なくとも１つのウイルスはホルマリンで不活化されていた。本開示の他の態様は、その必要のある対象の手足口病を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの治療有効量を当該対象に投与することにより、治療又は予防する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、その必要のある対象において免疫反応を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を当該対象に投与することにより、誘導する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から手足口病ウイルス調製物を単離することであって、この場合において当該細胞はウイルス調製物の製造に用いられていること、（ｂ）ホルマリンの有効量を用いて当該ウイルス調製物を処置すること、及び（ｃ）ホルマリンから当該ウイルス調製物を精製することであって、この場合において当該ウイルスはＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、 により手足口病ウイルスの調製物を不活化する方法を提供するものである。
本開示の他の態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原と、アルミニウム塩アジュバントを含有する手足口病のワクチンを提供するものであり、この場合において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の抗原が当該アルミニウムアジュバントに吸着している。本開示の他の態様は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原と、アルミニウム塩アジュバントを含有する手足口病の免疫原性組成物を提供するものであり、この場合において、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の抗原が当該アルミニウムアジュバントに吸着している。本開示の他の態様は、その必要のある対象における手足口病を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの治療有効量を当該対象に投与することにより、治療又は予防する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、その必要のある対象において免疫反応を、本明細書に開示されるワクチン又は免疫原性組成物のいずれかの免疫原性量を当該対象に投与することにより、誘導する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、（ａ）ワクチンとアルミニウム塩アジュバントを混合させることであって、この場合において当該ワクチンは、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を含んでおり、及び（ｂ）当該混合物を、約１６時間〜約２４時間の範囲の期間、適切な条件下でインキュベートすることであって、この場合において少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の抗原が当該アルミニウム塩アジュバントに吸着しており、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、によりアジュバント化された手足口病のワクチンを作製する方法を提供するものである。本開示の他の態様は、（ａ）免疫原性組成物とアルミニウム塩アジュバントを混合させることであって、この場合において当該免疫原性組成物は、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を含んでおり、及び（ｂ）当該混合物を、約１６時間〜約２４時間の範囲の期間、適切な条件下でインキュベートすることであって、この場合において少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の抗原が当該アルミニウム塩アジュバントに吸着しており、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、によりアジュバント化された手足口病の免疫原性組成物を作製する方法を提供するものである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物又はワクチンであって、前記１つ以上の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、前記免疫原性組成物又はワクチン。
（項目２）
ａ．前記少なくとも１つのウイルスがＥＶ７１であるか、又は、
ｂ．前記１つ以上の抗原がＥＶ７１由来である、 項目１に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目３）
前記１つ以上の抗原が、
ａ．ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドであって、前記ＶＰ１ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含有する、
ｂ．ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドであって、前記ＶＰ１ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含有しており、及び前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位で、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位に相当する位置で、発生する、
ｃ．ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドであって、前記ＶＰ１ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含有しており、及び前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位で、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位に相当する位置で、発生し、配列番号１の７位の前記突然変異又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときに配列番号１の７位に相当する位置の前記突然変異は、バリンからメチオニンへの置換である、
ｄ．ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドであって、前記ＶＰ１ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含有しており、及び前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位、１４位、１４５位及び２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つ全てで、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置の２つ以上、３つ以上、又は４つ全てで、発生する、
ｅ．ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドであって、前記ＶＰ１ポリペプチドが、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含有しており、及び前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位、１４位、１４５位及び２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つ全てで、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置の２つ以上、３つ以上、又は４つ全てで発生しており、及び配列番号１の１４位の前記突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４位に相当する位置の前記突然変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換であり、配列番号１の１４５位の前記突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４５位に相当する位置の前記突然変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換であり、又は配列番号１の２８２位の前記突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の２８２位に相当する位置の前記突然変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、又は
ｆ．上記（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせ、 を含有する、項目１又は２に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目４）
前記少なくとも１つのウイルスが、
ａ．ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、
ｂ．ホルマリン、
ｃ．ＢＰＬとホルマリンの組み合わせ、又は
ｄ．バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ） のうちの１つ以上で化学的に不活化された、項目１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目５）
ＢＰＬにより不活化された前記少なくとも１つのウイルスが１つ以上の改変を含有しており、この場合において、任意選択で、
ａ．前記１つ以上の改変が、改変核酸を含有し、任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であるか、又は
ｂ．前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、任意選択で前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、項目４に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目６）
ホルマリンにより不活化された前記少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含有しており、任意選択で前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記免疫原性組成物又はワクチンがホルマリンをさらに含有する、項目４に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目７）
ＢＥＩにより不活化された前記少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含有しており、任意選択で前記１つ以上の改変が、改変核酸を含有し、及び任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であり、及び任意選択で反応しなかったＢＥＩが、チオ硫酸ナトリウムを用いて加水分解された、項目４に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目８）
ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物又はワクチンであって、前記少なくとも１つのウイルスはＥＶ７１であり、前記少なくとも１つのウイルスがベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で不活化されている、前記免疫原性組成物又はワクチン。
（項目９）
前記少なくとも１つの不活化ウイルスが、１つ以上の改変を含有し、この場合において、任意選択で、
ａ．前記１つ以上の改変が、改変核酸を含有し、任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であるか、又は
ｂ．前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、任意選択で前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、 項目８に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１０）
ａ．有効濃度の洗剤であって、任意選択で前記洗剤が、ポリソルベート［８０］を含有し、及び／又は前記有効濃度が、約０．００１％〜約０．０１％の範囲である、前記洗剤、ｂ．アジュバントであって、任意選択で前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から 選択される、アジュバント、
ｃ．アジュバントであって、前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）である、前記アジュバント、
ｄ．アジュバントであって、前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択されるアルミニウム塩アジュバントである、前記アジュバント、及び／又は、
ｅ．アジュバントであって、前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択されるアルミニウム塩アジュバントであり、この場合において、前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アジュバントに吸着されている、前記アジュバント、 をさらに含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１１）
ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原とアルミニウム塩アジュバントを含有する手足口病の免疫原性組成物又はワクチンであって、前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着されている、前記免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１２）
前記アルミニウム塩アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される、項目１１に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１３）
前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１である、項目１１又は１２に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１４）
前記１つ以上の抗原が、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含有する、項目１１〜１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１５）
前記非ヒト細胞が、サルの細胞又はＶｅｒｏ細胞株由来であり、この場合において任意選択で前記Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）およびＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１６）
前記１つ以上の抗原が、前記非ヒト細胞を培養することにより作製され、及びこの場合において、任意選択で、前記細胞は無血清培地中で培養される、項目１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１７）
前記免疫原性組成物又はワクチンが、精製抗原免疫原性組成物もしくはワクチン、サブユニット免疫原性組成物もしくはワクチン、不活化全粒子ウイルス免疫原性組成物もしくはワクチン、又は弱毒化ウイルス免疫原性組成物もしくはワクチンである、項目１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
（項目１８）
その必要のある対象において免疫反応を誘導する方法、又はその必要のある対象の手足口病を治療もしくは予防する方法であって、項目１〜１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目１９）
前記投与が、前記対象に防御的免疫反応を誘導する項目１８の方法であって、この場合において任意選択で、
ａ．前記免疫反応が、ＥＶ７１に対する免疫反応を含み、及び／又は
ｂ．前記免疫反応が、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｃ２、及びＣ４から選択されるＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を含む、 前記方法。
（項目２０）
（ａ）ワクチンとアルミニウム塩アジュバントを混合させる工程であって、前記ワクチンが、ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を含む、工程、及び
（ｂ）前記混合物を、約１６時間〜２４時間の範囲にわたる期間、適切な条件下でインキュベートする工程
を含む、アジュバント化された手足口病の免疫原性組成物又はワクチンを作製する方法であって、ここで、
前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着しており、かつ
手足口病を引き起こす前記少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１である、
前記方法。
（項目２１）
前記混合物が、約２℃〜約８℃の範囲の温度でインキュベートされる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から手足口病ウイルス調製物を単離する工程であって、この場合において前記細胞は前記ウイルス調製物の製造に用いられる、工程、
（ｂ）ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）の有効量を用いて前記ウイルス調製物を処置する工程、及び
（ｃ）ホルマリンの有効量を用いて前記ウイルス調製物を処置する工程
を含む、手足口病ウイルス調製物を不活化する方法であって、ここで、
前記ホルマリンを用いた処置工程が、工程（ｂ）と同時に、又は工程（ｂ）の後で行われ、かつ
前記ウイルスがＥＶ７１である、前記方法。
（項目２３）
前記方法が、前記ＢＰＬを加水分解するのに十分な期間、３７℃の温度で前記ウイルス調製物を加熱する工程をさらに含み、この場合において任意選択で前記期間は、約１時間〜約６時間の範囲である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
不活化された前記ウイルス調製物が、１つ以上の改変を含有し、この場合において、任意選択で、
ａ．前記１つ以上の改変が、改変核酸を含有し、任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であるか、又は
ｂ．前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、この場合において、任意選択で前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、 項目２２又は２３に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から手足口病ウイルス調製物を単離する工程であって、この場合において前記細胞は前記ウイルス調製物の製造に用いられる、工程、
（ｂ）ホルマリンの有効量を用いて前記ウイルス調製物を処置する工程、及び
（ｃ）前記ホルマリンから前記ウイルス調製物を精製する工程
を含む、手足口病ウイルス調製物を不活化する方法であって、ここで、
前記ウイルスがＥＶ７１である、前記方法。
（項目２６）
不活化された前記ウイルス調製物が、１つ以上の改変を含有しており、任意選択で前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含有する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記免疫原性組成物又はワクチンが、ホルマリンをさらに含有する、項目２５又は２６に記載の方法。
特許又は出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面付きの本特許または特許出願公開のコピーは、要求を行い、及び必要な料金を支払うことにより当局から提供される。
ヒトエンテロウイルスの系統発生関係を表現するツリーを示す。
例示的なＥＶ７１株の遺伝子構造を示す。
異なる用量レベルでの適応エンテロウイルス７１ワクチンのマウスにおける免疫原性を、グラフ形式で示される、長期にわたる時点でのＴＣＩＤ５０中和アッセイからの幾何平均力価とともに示す。
選択されたＥＶ７１サブ−ジェノグループ（ｓｕｂ−ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｓ）に対するＥＶ７１抗血清の交差中和を示す。
適応エンテロウイルス７１ワクチンのＮＺＷウサギにおける免疫原性を、グラフ形式で示される、長期にわたる時点でのＴＣＩＤ５０中和アッセイからの幾何平均力価とともに示す。
ＣＶＡ６ゲノムの略図を示す。
いくつかのＣＶＡ６流行株のＶＰ１タンパク質を比較するアミノ酸配列アライメントを示す。 同上。
ＣＶＡ１６のゲノム全長の配列解析のために用いたプライマーの略図を示す。
ＣＶＡ１６のゲノムの略図を示す。
ＣＶＡ１６流行株のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。 同上。
ＶＰ１遺伝子に基づく、ＣＶＡ１６の系統発生学的分類を示す。
ウイルスＲＮＡをトランスフェクトさせたＶｅｒｏ細胞における、ＣＶＡ６及びＣＶＡ１６により出現した細胞変性効果を示す。
限界希釈によるＣＶＡ６のクローン単離のプロトコールの略図を示す。 ＣＶＡ６の限界希釈の第一ラウンドで選択されたクローンの略図を示す。 ＣＶＡ６の限界希釈の第二ラウンドで選択されたクローンの略図を示す。
Ｖｅｒｏ細胞およびＲＤ細胞における、ＲＮＡ−再誘導されたＣＶＡ６の力価の比較を示す。
ＣＶＡ１６の第一ラウンドのプラーク精製を示す。 ＣＶＡ１６の第二ラウンドのプラーク精製を示す。
クローン化ＣＶＡ１６およびＰ−３ウイルスの間のＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列アライメントを示す。
ＥＶ７１、ＣＶＡ１６及びＣＶＡ６に対する抗体の幾何平均力価を示す。
マウスにおける、ＥＶ７１及びＣＶＡ１６を用いた免疫化及びチャレンジに対する治療プロトコールを示す。
ＥＶ７１でチャレンジされたマウスの生存率を示す。
免疫化マウスにおけるＥＶ７１血清ウイルス価を示す。
ＣＶＡ１６でチャレンジされたマウスの生存率を示す。
免疫化マウスにおけるＣＶＡ１６血清ウイルス価を示す。
マウスにおける、ＣＶＡ６を用いた受動免疫化及びチャレンジに関する治療プロトコールを示す。
ＣＶＡ６でチャレンジされたマウスの生存率を示す。
免疫化マウスにおけるＣＶＡ６血清ウイルス価を示す。
一般的方法
本明細書に記述される、又は参照される技術及び手順は一般的に当分野の当業者により理解され、及び例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995);及び Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)などに記述される広く使用されている技法などの標準的な技法を用いて普遍的に利用されている。
手足口病の原因となるウイルス。
本開示のある態様は、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、又はサブユニットワクチンのための精製及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質をはじめとする、ワクチン及び／又は免疫原性組成物に有用であり得る、手足口病の原因となる少なくとも１つのウイルスに関する。
ヒトの手足口病（ＨＦＭＤ）は、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）群のいくつかのメンバーにより引き起こされる（図１） ヒトエンテロウイルスＡは、非エンベロープ型のプラス鎖ＲＮＡウイルスのピコルナウイルス科に属し、当該科はポリオウイルス及びライノウイルスも含んでいる。ＨＦＭＤを引き起こし得るＨＥＶ−Ａ群のメンバーとしては、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）及びコクサッキーウイルスが挙げられる。したがって、手足口病を引き起こす本開示の適切なウイルスの例としては、限定されないが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、血清型Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ９、Ａ１０もしくはＡ１６をはじめとするコクサッキーウイルスＡ株、血清型Ｂ３もしくはＢ５をはじめとするコクサッキーウイルスＢ株、又はそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書において用いられる場合、「ＣＡ６」という用語は、「ＣＶＡ６」及び「コクサッキーウイルスＡ６」と相互交換可能に用いられる。本明細書において用いられる場合、「ＣＡ１６」という用語は、「ＣＶＡ１６」及び「コクサッキーウイルスＡ１６」と相互交換可能に用いられる。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６から選択される１つ以上、２つ以上、又は３つのウイルスであってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１及びＣＡ６であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１及びＣＡ１６であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＣＡ６及びＣＡ１６であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１であってもよい。
したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示されるワクチン及び／又は免疫原性組成物のいずれかに手足口病を引き起こす本開示のウイルスが用いられてもよい。例えば、手足口病を引き起こす本開示のウイルスは、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用な１つ以上の抗原を提供するために用いられてもよく、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用な１つ以上の抗原を提供するために用いられてもよい。
ウイルス抗原
本開示の他の態様は、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、又はサブユニットワクチンのための精製及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質をはじめとする、ワクチン及び／又は免疫原性組成物に有用であり得る手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原に関する。
本開示の抗原は、免疫反応を惹起させることができる任意の物質であってもよい。適切な抗原の例としては、限定されないが、全粒子ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド模倣体及び非ペプチド模倣体、ならびに他の分子、小分子、脂質、糖脂質及び炭水化物が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示の抗原は、限定されないが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、血清型Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、もしくはＡ１６をはじめとするコクサッキーウイルスＡ株、又は血清型Ｂ３もしくはＢ５をはじめとするコクサッキーウイルスＢ株、またはそれらの任意の組み合わせをはじめとするＨＦＭＤを引き起こすことが知られている任意のウイルス由来であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、又は１０以上の抗原であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＥＶ７１及びＣＡ６由来であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＥＶ７１及びＣＡ１６由来であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＣＡ６及びＣＡ１６由来であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＥＶ７１由来であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＣＡ６由来であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ＣＡ１６由来であってもよい。
本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含んでもよい。適応突然変異は、特定の細胞株で増殖するようウイルスを適応させることにより生成されてもよい。たとえば、細胞にウイルスをトランスフェクトさせ、及び継代させて、当該ウイルスを複製させ、その核酸を突然変異させてもよい。核酸突然変異は、点突然変異、挿入突然変異、又は欠失突然変異であってもよい。核酸突然変異は、非ヒト細胞中のウイルスの増殖を促進させるウイルスタンパク質内のアミノ酸変化をもたらしてもよい。適応突然変異は、プラークサイズの変化、増殖動態の変化、温度感受性の変化、薬剤耐性の変化、病原性の変化、及び細胞培養におけるウイルス収量の変化をはじめとするウイルスの表現型の変化を促進してもよい。これら適応突然変異は、細胞株で培養されるウイルスのスピード及び収量を上昇させることにより、ワクチン製造に有用であり得る。さらに、適応突然変異は、免疫原性エピトープの構造を変化させることにより、ウイルス抗原の免疫原性を増強させ得る。
したがって、ある実施形態では、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の本開示の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞の適応突然変異を含む。ある実施形態では、適応突然変異は非ヒト細胞へのウイルス抗原の突然変異である。一部の実施形態では、非ヒト細胞は哺乳類の細胞であってもよい。非ヒト哺乳類細胞の例としては、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記述される、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。一部の実施形態では、非ヒト細胞はサルの細胞であってもよい。一部の実施形態では、サルの細胞は、Ｖｅｒｏ細胞株由来であってもよい。適切なＶｅｒｏ細胞株の例としては、限定されないが、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、又はＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）が挙げられる。
ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６は、直線状のプラス鎖、一本鎖ＲＮＡゲノムを有している(図２)。これら各ウイルスゲノムは構造ポリペプチド及び非構造ポリペプチドの両方をコードしている。これら各ウイルスによりコードされる構造ポリペプチドとしては、限定されないが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４が挙げられ、それらはともにウイルスカプシドを構成し得る。これら各ウイルスによりコードされる非構造ポリペプチドとしては、限定されないが、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄが挙げられ、それらは例えば、ウイルスの複製及び病原性に関与している。
したがって、ある実施形態では、本開示の抗原は、限定されないが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄをはじめとする１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のウイルス抗原内に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれ以上の非ヒト細胞適応突然変異を含有してもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、ウイルスの５’又は３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）内に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又はそれ以上の非ヒト細胞適応突然変異を含有し得る全粒子不活化ウイルスを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチド内にある。例示的なＥＶ７１株由来のＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GDRVADVIESSIGDSVSRALTQALPAPTGQNTQVSSHRLDTGEVPALQAAEIGASSNTSDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPESRESLAWQTATNPSVFVKLTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGSSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGTSRNAITTL（配列番号１）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異はＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７、１４、１４５及び２８２から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つのアミノ酸の位置で、又はＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドをペアワイズアライメントアルゴリズム（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置で、発生してもよい。 一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７位で、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位に相当する位置で、発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７位で、又は配列番号１の７位、１４位、１４５位、もしくは２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで、又はＥＶ７１のＶＰ１ポリぺプチドをペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位、もしくは２８２位に相当する位置で、発生する。 一部の実施形態では、７位の突然変異は、バリンからメチオニンへの置換である。一部の実施形態では、１４位の突然変異は、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である。一部の実施形態では、１４５位の突然変異は、グルタミン酸からグルタミンへの置換である。一部の実施形態では、２８２位の突然変異は、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチド内である。例示的なＣＡ６株由来のＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
NDPISNAIENAVSTLADTTISRVTAANTAASSHSLGTGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTSQDGYTVWPIDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNDSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDGRKSYQWQTATNPSIFAKLSDPPPQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPFRSQAYMVKNYPTYSQTISNTAADRASITTTDYEGGVPANPQRTF（配列番号２）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異はＣＡ６のＶＰ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号２の４６、９０、９６及び２６８から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つのアミノ酸の位置で、又はＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドをペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させたときには配列番号２の４６位、９０位、９６位及び２６８位に相当する位置で、発生してもよい。 一部の実施形態では、突然変異は、配列番号２の４６位、９０位、９６位及び２６８位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで、又はＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドをペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させたときには配列番号２の４６位、９０位、９６位及び２６８位に相当する位置で、発生する。 一部の実施形態では、４６位の突然変異は、アラニンからバリンへの置換である。一部の実施形態では、９０位の突然変異は、グルタミン酸からリシンへの置換である。一部の実施形態では、９６位の突然変異は、スレオニンからアラニンへの置換である。一部の実施形態では、２６８位の突然変異は、バリンからイソロイシンへの置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチド内である。例示的なＣＡ６株由来のＶＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
SPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPGYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVVVIPEFVVAASSPAMKPNGQGLYPDFAHTNPGKEGQVFRDPYVLDAGIPLSQALVFPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLAVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQ（配列番号３）
一部の実施形態では、突然変異は、配列番号３のアミノ酸１４４位で、又はＣＡ６のＶＰ２ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列されたときには配列番号３の１４４位に相当する位置で、発生してもよい。 一部の実施形態では、１４４位の突然変異は、グルタミンからリシンへの置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチド内である。例示的なＣＡ６株由来のＶＰ３ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GLPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCRIETILEVNNTTGTTGVNRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPTTREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPSEANIIALGAAQENFTLKLCKDTDEIRQTAEYQ（配列番号４）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号４のアミノ酸１０２位で、又はＣＡ６のＶＰ３ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列されたときには配列番号４の１０２位に相当する位置で、発生してもよい。 一部の実施形態では、１０２位の突然変異は、イソロイシンからバリンへの置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６の５’ＵＴＲ内である。例示的なＣＡ６株由来の５’ＵＴＲの核酸配列を以下に記載する。
TTAAAACAGCTAGTGGGTTGCACCCACTCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTTCCCGGAATCCTTGTGCGCCTGTTTTATATCCCCTCCCCCATGCGCAACTTAGAAGCAATCTACACCTTCGATCAATAGCAGGCGTGGCGCGCCAGCCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAAACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAATGTTCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGTAGCACCATGAAAATTGCAGAGCGTTtCGcTCAGCGcTtCCCCcGCGtAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCATTCCTCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATATGGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATACCCCCAAACCAGGGGGCGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGAATAACAGAGCCTTGATATACCTTTTTGTAGGGTTTATACCACTTACTCTTCGCGTTGTTGAGACTCTAAAGTACATTCTAATCTTGAACACTAGAAA（配列番号８）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６の５’ＵＴＲ内の１つ以上の核酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４及び４０から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つの核酸の位置で、又はＣＡ６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列されたときには配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４及び４０の位置に相当する位置で、発生してもよい。 一部の実施形態では、突然変異は、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、及び４０位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで、又はＣＡ６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列されたときには配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、及び４０位に相当する位置で、発生する。 一部の実施形態では、１位の突然変異は、チミンからグアニンへの置換である。一部の実施形態では、１３位の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換である。一部の実施形態では、１４位の突然変異は、チミンからグアニンへの置換である。一部の実施形態では、１５位の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である。一部の実施形態では、１６位の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換である。一部の実施形態では、２１位の突然変異は、シトシンからチミンへの置換である。一部の実施形態では、２３位の突然変異は、シトシンからチミンへの置換である。一部の実施形態では、３４位の突然変異は、グアニンからチミンへの置換である。一部の実施形態では、４０位の突然変異は、シトシンからグアニンへの置換である。
一部の実施形態は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の２Ａポリペプチド内である。例示的なＣＡ１６株の２Ａポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GKFGQQSGAIYVGNYRVVNRHLATHNDWANLVWEDSSRDLLVSSTTAQGCDTIARCDCQTGIYYCSSKRKHYPVSFTKPSLIFVEASEYYPARYQSHLMLAVGHSEPGDCGGILRCQHGVVGIVSTGGNGLVGFADVRDLLWLDEEAMEQ（配列番号５）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の２Ａポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号５のアミノ酸２位で、又はＣＡ１６の２Ａポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列されるときには配列番号５の２位に相当する位置で、発生する。 一部の実施形態では、２位の突然変異は、リシンからグルタミン酸への置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチド内である。例示的なＣＡ１６株のＶＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
SPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIVIAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFFTLDTKSWAKDSKGWYWKFPDVLTEVGVFGQNAQFHYLYRSGFCVHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVLGTIAGGTGNENSHPPYATTQPGQVGAVLMHPYVLDAGIPLSQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYMNTVPFDSALNHCNFGLLVIPVVPLDFNAGATSEIPITVTIAPMCAEFAGLRQAVKQ（配列番号６）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号６のアミノ酸１６１位で、又はＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列されるときには配列番号６の１６１位に相当する位置で、発生する。 一部の実施形態では、１６１位の突然変異はメチオニンからスレオニンへの置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド内である。例示的なＣＡ１６株のＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GDPIADMIDQTVNNQVNRSLTALQVLPTAANTEASSHRLGTGVVPALQAAETGASSNASDKNLIETRCVLNHHSTQETAIGNFFSRAGLVSIITMPTTDTQNTDGYVNWDIDLMGYAQLRRKCELFTYMRFDAEFTFVVAKPNGVLVPQLLQYMYVPPGAPKPTSRDSFAWQTATNPSVFVKMTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHLQANDLDYGQCPNNMMGTFSIRTVGTEKSPHSITLRVYMRIKHVRAWIPRPLRNQPYLFKTNPNYKGNDIKCTSTSRDKITTL（配列番号７）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号７のアミノ酸９９及び１４５から選択される１つ以上又は２つのアミノ酸の位置で、又はＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列されるときには配列番号７の９９位又は１４５位に相当する位置で、発生してもよい。 一部の実施形態では、９９位の突然変異は、アスパラギン酸からグリシンへの置換である。一部の実施形態では、１４５位の突然変異は、バリンからグルタミン酸への置換である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の５’ＵＴＲ内である。例示的なＣＡ１６株の５’ＵＴＲの核酸配列を以下に記載する。
AGCCTGTGGGTTGTTCCCACCCACAGGGCCCAGTGGGCGCTAGCACACTGATTCTGCGGGATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCTAAGCAGCAACTTAGAAGTTTCACACAATCACGACCAGTAGTGGGCGTGGCGCGCCAGTCACGTCTTGGTCAAGCACTTCTGTTCCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGtAGCACCGTGAAAGTTGCGGAGtGTttCGCTCAGCACTTCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGTAAACCCCACGGGCGACCGTGACAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACGCACCCTCAACCCAGGGGGCGGCGTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTTATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTCTAACAGAGCTATTGTTTACCTATTTATTGGATACGTCCCTCTTAATCTCAAGGCCATTCAAACTCTTGATTATATATTGCTCCTTAACTGTAAGAAA（配列番号９）
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の５’ＵＴＲ内の１つ以上の核酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号９の６及び３３から選択される１つ以上、または２つの核酸の位置で、又はＣＡ１６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号９に対して整列されたときには配列番号９の６及び３３の位置に相当する位置で、発生してもよい。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号９の６位及び３３位の両方で、またはＣＡ１６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号９に対して整列されたときには配列番号９の６及び３３の位置に相当する位置で、発生する。 一部の実施形態では、６位の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換である。一部の実施形態では、３３位の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である。
本開示の上述の実施形態において、例示的なペアワイズアライメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムである（たとえば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを用いて、Ｇａｐ開始（ｏｐｅｎｉｎｇ）ペナルティ＝１０．０、及びＧａｐ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティ＝０．５）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツール中に簡便に実装される。
一部の実施形態では、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の本開示の抗原は、本開示のワクチン及び免疫原性組成物のいずれかにおいて用いられてもよい。例えば、本開示の抗原は、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であってもよく、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。
ワクチン及び免疫原性組成物の作製
本開示の他の態様は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の本開示の１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチン及び免疫原性組成物に関するものである。かかるワクチン及び免疫原性組成物は、例えば、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であってもよく、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、ならびに／又はサブユニットワクチンのための精製及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質を含んでもよい。本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、精製された抗原のワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、又は弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物をさらに含んでもよい。
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の作製は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスの増殖と、当該増殖したウイルスから調製された抗原を含む。細胞培養での増殖が、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の作製方法である。ウイルス増殖のための細胞は、懸濁又は付着状態で培養されてもよい。
本開示の少なくとも１つのウイルスの増殖に適した細胞株は、哺乳類起源が好ましく、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）又はＭＤＣＫ ３３０１６、寄託番号はＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９であり、ＷＯ９７／３７００１に記述されている）、ネコ及び齧歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が挙げられ、例えば、成体、新生仔、胎仔、及び胚をはじめとする広範な発生段階から得てもよい。ある実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記述され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲＣ．６細胞など）。好ましい実施形態では哺乳類細胞が使用され、以下の非限定的な細胞型のうちの１つ以上から選択されてもよく、及び／又は誘導されてもよい：線維芽細胞（例えば、皮膚、肺）、内皮細胞（大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝臓細胞、角化細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頚、網膜周皮細胞）、メラニン細胞、神経系細胞（例えば、星状膠細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地中での増殖が可能で、ウイルスの産生及び複製に有用な動物細胞及び細胞株の製造を記載している。
上述の細胞型の培養条件は公知であり、様々な刊行物中に記載されており、あるいは培養培地、補充物質、及び状態が、市販されている場合があり、例えばＣａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ， Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び追加文献中に記載されている。
ある実施形態では、本明細書に記載される方法に用いられる細胞は、無血清及び／又は無タンパク質の培地中で培養される。ヒトまたは動物を源とする血清由来の添加物が無い場合、本開示の文脈において、培地とは無血清培地を指す。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質が除外されて細胞の増殖が発生するが、任意選択で例えばトリプシン又はウイルス増殖に必要な場合があり得る他のプロテアーゼなどのタンパク質を含み得る培養を意味すると理解される。かかる培養での細胞の増殖は、当然ながら、それ自身のタンパク質は含有する。
公知の無血清培地としては、イスコフ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）又はＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が挙げられる。通常の血清含有培地としては、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）又は最小必須培地（ＭＥＭ）（Eagle, Science, 130, 432 (1959)）又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）が挙げられ、それらは通常、最大で１０％のウシ胎仔血清又は類似の添加物と共に使用される。任意選択で、最小必須培地（ＭＥＭ）(Eagle, Science, 130, 432 (1959))又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）が、血清含有補充物質をいずれも含まずに用いられてもよい。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）などの無タンパク質培地、ＰｒｏＣＨＯ ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、又はＳＭＩＦ ７ （Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの既知組成培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ又はＨｙＰｅｐ．ＴＭ．（すべてＱｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、又はラクトアルブミン水解物（Ｇｉｂｃｏ社及び他のメーカー）などのマイトジェンペプチドもまた、先行技術において十分に公知である。植物水解物を基にした培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマ又は未知の感染体の混入を排除することができるという特別な利点を有している。
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本開示に従い用いられる細胞株の適合性に応じて非常に広い範囲で変更可能であり、特定のウイルス株の要件に対し適応させることができる。
培養細胞中でウイルスを増殖させる方法は、通常、培養細胞に培養される株を接種する工程、例えばウイルス力価又は抗原の発現により決定されるウイルス増殖にとって望ましい期間（例えば、接種後２４時間〜１６８時間）、感染細胞を培養する工程、及び増殖したウイルスを回収する工程を含む。１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０のウイルスと細胞の比率で（ＰＦＵ又はＴＣＩＤ５０により測定）、培養細胞に接種される。ウイルスは細胞懸濁液に添加され、または細胞の単層に加えられ、少なくとも６０分間、通常は３００分未満、好ましくは９０〜２４０分間、２５℃〜４０℃で、好ましくは２８℃〜３７℃で、細胞上にウイルスが吸収される。感染細胞培養物（例えば単層）を、凍結融解により、又は酵素作用のいずれかにより除去し、採取される培養上清のウイルス含有量を増加させてもよい。次いで採取された液体を不活化又は凍結保存する。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染されてもよい。さらにより好ましくは、細胞は約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染する。感染細胞は、感染後３０〜６０時間で、又は感染後４〜１０日で採取されてもよい。ある実施形態では、細胞は、感染後３４〜４８時間で採取される。ある好ましい実施形態では、細胞は感染後４〜７時間で採取される。より好ましくは、細胞は感染後４〜５日で採取される。一部の実施形態では、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）を細胞培養の間に添加し、ウイルスを放出させてもよく、及びプロテアーゼは培養の間の任意の適切な段階で添加されてもよい。あるいは、ある実施形態では、感染細胞培養の上清を採取して、当該上清からウイルスを単離し、又はさもなければ上清から精製してもよい。
ウイルス接種物、及びウイルス培養物は、好ましくは単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオ―マウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／又はパルボウイルスが無い状態である。（すなわち、これらウイルスによる汚染を検査し、陰性結果を得ている）［ＷＯ２００６／０２７６９８］
ウイルスが細胞株で増殖される場合、最終ワクチン中の残留細胞株ＤＮＡの量を最小化し、当該ＤＮＡの任意の発がん活性を最小化するのが標準的な実施である。混入ＤＮＡは、例えばクロマトグラフィーなどの標準的な精製手順を用いてワクチン調製の間に取り除くことができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えばＤＮａｓｅによるヌクレアーゼ処置により強化することができる。宿主細胞ＤＮＡ汚染を減少させるための簡便な方法は、参照文献中に開示されており[Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2001.]、それらは２工程の処置を含んでおり、最初にウイルス増殖の間に使用し得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ）を使用し、次いでビリオン破壊の間に使用し得る陽イオン洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する。β−プロピオラクトン処置による除去を用いてもよい。
抗原の製造
手足口病を治療もしくは予防するための、及び／又は手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応を誘導するための、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、ならびに／又はサブユニットワクチンのための精製ウイルスタンパク質及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質をはじめとする、ワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のための本開示の抗原は、当分野に公知の任意の適切な方法により製造されてもよく、及び／又は精製されてもよく、もしくはさもなければ単離されてもよい。本開示の抗原の例としては、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスから産生された、誘導された、精製された、及び／又はさもなければ単離された、全粒子ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド模倣体及び非ペプチド模倣体、ならびに他の分子、小分子、脂質、糖脂質及び炭水化物が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、適切な抗原としては、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６などのウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４などの構造ポリペプチド、ならびに２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄなどの非構造ポリペプチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本開示の抗原は、化学的又は酵素的に合成されてもよく、組み換え製造されてもよく、天然源から単離されてもよく、又は前述の組み合わせであってもよい。ある実施形態では、本開示の抗原は、例えばＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６などの手足口病を引き起こす本開示のウイルスの少なくとも１つから産生、精製、単離、及び／又は誘導される。本開示の抗原は、精製されていてもよく、部分的に精製されていてもよく、又は粗抽出物であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、上記の「ワクチン及び免疫原性組成物の製造」の項に記載されるように製造された例えば不活化ウイルスなどのウイルスである。
ある実施形態では、本開示の１つ以上の抗原は、非ヒト細胞を培養することにより製造されてもよい。本開示の１つ以上の抗原の製造に適した細胞株は、好ましくは哺乳類起源であり、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）又はＭＤＣＫ ３３０１６、寄託番号はＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９であり、ＷＯ９７／３７００１に記述されている）、ネコ及び齧歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が挙げられ、例えば、成体、新生仔、胎仔、及び胚をはじめとする広範な発生段階から得てもよい。ある実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記述され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲＣ．６細胞など）。好ましい実施形態では哺乳類細胞が使用され、以下の非限定的な細胞型のうちの１つ以上から選択されてもよく、及び／又は誘導されてもよい：線維芽細胞（例えば、皮膚、肺）、内皮細胞（大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝臓細胞、角化細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頚、網膜周皮細胞）、メラニン細胞、神経系細胞（例えば、星状膠細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地中での増殖が可能で、ウイルス抗原の製造に有用な動物細胞及び細胞株の製造を記載している。ある実施形態では、非ヒト細胞は無血清培地中で培養される。
ポリペプチド抗原は、当分野に公知の標準的なタンパク質精製法を用いて天然源から単離されてもよく、当該方法としては、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む）、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術が挙げられるがこれらに限定されない。多くの実施形態において、抗原は、例えば、約５０％〜約７５％純粋、約７５％〜約８５％純粋、約８５％〜約９０％純粋、約９０％〜約９５％純粋、約９５％〜約９８％純粋、約９８％〜約９９％純粋、又は９９％超純粋な精製抗原である。
固相ペプチド合成法を用いてもよく、かかる技術は当分野の当業者に公知である。Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994)を参照のこと。一般的に、かかる方法において、ペプチドは、固相結合伸長ペプチド鎖に活性化単量体単位を逐次的に添加することにより製造される。
ポリペプチドの製造に、十分に確立された組み換えＤＮＡ法を用いてもよく、この場合、例えばポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える発現構築物を適切な宿主細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養で単細胞体として増殖される真核宿主細胞であり、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）又は原核細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養で増殖する）に導入し、遺伝子改変された宿主細胞を生成し、適切な培養条件下で当該遺伝子改変された宿主細胞からタンパク質を産生させる。
死滅ウイルス及び弱毒化ウイルスの免疫原性組成物に加え、サブユニット免疫原性組成物、又は手足口病ウイルスの抗原性構成要素を動物に提示する他のタイプの免疫原性組成物を使用してもよい。抗原性構成要素は、ヒトに注入された際にヒトの免疫反応を刺激し、ヒトが手足口病に対する防御的免疫を発現するタンパク質、糖タンパク質、脂質結合したタンパク質もしくは糖タンパク質、改変脂質部分、又は他のウイルス構成要素であってもよい。サブユニット免疫原性組成物に関しては、ウイルスは上述の哺乳類細胞上で培養されてもよい。細胞培養物をホモジナイズし、この細胞培養物ホモジネートを適切なカラム上で免疫原性組成物を単離してもよく、又は適切な孔サイズのフィルターを通して免疫原性組成物を単離してもよく、又はこの細胞培養物ホモジネートを遠心することにより免疫原性組成物を単離してもよい。
抗原性構成要素がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードする核酸を単離し、当該単離された核酸を含有する免疫原性組成物を作製してもよい。抗原性構成要素をコードする核酸は、真核細胞プロモーターのシグナル配列の下流で、プラスミド上に配置されていてもよい。そのプラスミドは、１つ以上の選択可能なマーカーを含有してもよく、例えばサルモネラ属、シゲラ属、又は他の適切な細菌などの弱毒化原核生物へとトランスフェクトされてもよい。次いで、ヒトが抗原性構成要素に対する防御的免疫反応を起こすことができるよう、この細菌をヒトに投与してもよい。あるいは、抗原性構成要素をコードする核酸は、原核細胞プロモーターの下流に配置されてもよく、１つ以上の選択可能マーカーを有してもよく、及びサルモネラ属、シゲラ属又は他の適切な細菌などの弱毒化された原核生物へとトランスフェクトされてもよい。次いで、対象抗原に対する免疫反応が所望される真核生物対象へと細菌が投与されてもよい。例えば、Honeらへの米国特許 第６，５００，４１９号を参照のこと。
サブユニット免疫原性組成物に関し、手足口病ウイルスのタンパク性抗原性構成要素をコードする核酸を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３２０４７（Ｇａｌｅｎ）及び国際特許出願公開ＷＯ０２／０８３８９０（Ｇａｌｅｎ）に記載されるプラスミドなどのプラスミドへとクローニングしてもよい。次いで、プラスミドを細菌へとトランスフェクトし、その細菌が所望される抗原性タンパク質を産生してもよい。両特許出願に記載されている様々な方法により、所望される抗原性タンパク質を単離及び精製してもよい。
ウイルス不活化
本開示のある態様は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物に関する。本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、精製ウイルス、全粒子ウイルス、組み換えウイルス、弱毒化生全粒子ウイルス、又は好ましくは不活化全粒子ウイルス、又は不活化ウイルス由来のサブユニット、ポリペプチド、及び／もしくは抗原を含んでもよい。したがって、本開示のある実施形態は、手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルス由来の１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチン、及び／又は免疫原性組成物に関する。哺乳類細胞への感染能力を破壊するためのウイルスの不活化方法又は死滅方法は当分野に公知である。かかる方法としては、化学的手段及び物理的手段の両方が挙げられる。ウイルス不活化の適切な手段としては、洗剤、ホルマリン（本明細書において、「ホルムアルデヒド」とも呼称される）、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、加熱、電磁放射線、Ｘ線放射、γ線、紫外線放射（ＵＶ放射）、ＵＶ−Ａ放射、ＵＶ−Ｂ放射、ＵＶ−Ｃ放射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、及びそれらすべての任意の組み合わせから選択される１つ以上の手段の有効量を用いた処置が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のある実施形態では、少なくとも１つのウイルスは化学的に不活化されている。化学的不活化のための剤、及び化学的不活化のための方法は、当分野に周知であり、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、少なくとも１つのウイルスは、ＢＰＬ、ホルマリン、又はＢＥＩのうちの１つ以上を用いて化学的に不活化されている。少なくとも１つのウイルスがＢＰＬを用いて化学的に不活化されている実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、改変核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、改変核酸は、アルキル化核酸である。他の実施形態では、１つ以上の改変は、改変ポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、改変ポリペプチドは、改変されたシステイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上を含む改変アミノ酸を含有する。少なくとも１つのウイルスがホルマリンを用いて化学的に不活化されている実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、改変ポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、架橋ポリペプチドを含んでもよい。少なくとも１つのウイルスがホルマリンを用いて化学的に不活化されている一部の実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物はさらにホルマリンを含む。少なくとも１つのウイルスがＢＥＩを用いて化学的に不活化されている特定の実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、改変核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、改変核酸は、アルキル化核酸である。
少なくとも１つのウイルスがＢＥＩ又はＢＰＬを用いて化学的に不活化されている一部の実施形態では、反応しなかった残留ＢＥＩ又は残留ＢＰＬはいずれもチオ硫酸ナトリウムを用いて中和されていてもよい（すなわち加水分解されていてもよい）。一般的に、チオ硫酸ナトリウムは過剰に添加される。一部の実施形態では、チオ硫酸ナトリウムは、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で添加されてもよい。ある実施形態では、チオ硫酸ナトリウムは、ＢＥＩが２０に対し、濃チオ硫酸ナトリウムが１の比率で、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭの濃度で添加されてもよい。一部の実施形態では、溶液は、たとえばインライン静的ミキサーなどのミキサーを用いて混合され、次いでろ過（例えば、浄化）されてもよい。一般的に、２つの溶液はポンプでミキサーに通すことにより完全に混合し、チオ硫酸ナトリウムによりＢＥＩが中和される。
本開示のある実施形態は、手足口病のウイルス調製物を不活化する方法に関する。一部の実施形態では、当該方法は、（ａ）ウイルス調製物を作製するために用いられる１つ以上の非ヒト細胞から手足口病のウイルス調製物を単離すること、及び（ｂ）有効量のＢＥＩを用いて当該ウイルス調製物を処置すること、を含む。ある実施形態では、ＢＥＩの有効量を用いた処置は、約０．２５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量でＢＥＩを用いて処置することを含むが、これに限定されない。 ある実施形態では、単離され、処置されるウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。この方法のある実施形態では、ウイルス調製物は、約２５℃〜約４２℃の範囲の温度でＢＥＩを用いて処置される。この方法のある実施形態では、ウイルス調製物は、約１時間〜約１０時間の範囲の期間、ＢＥＩを用いて処置される。ある実施形態では、当該方法はさらに、チオ硫酸ナトリウムの有効量を用いて、反応しなかったＢＥＩを不活化する（すなわち、加水分解する）ことを含む。一部の実施形態では、チオ硫酸ナトリウムの有効量は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である。
一部の実施形態では、当該方法は、（ａ）ウイルス調製物を作製するために用いられる１つ以上の非ヒト細胞から、手足口病ウイルス調製物を単離すること、（ｂ）有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルス調製物を処置すること、及び任意選択で（ｃ）（ｂ）の工程と同時、または（ｂ）の工程の後に、有効量のホルマリンを用いてウイルス調製物を処置すること、を含む。あるいは、一部の実施形態では、当該方法は、（ａ）ウイルス調製物を作製するために用いられる１つ以上の非ヒト細胞から、手足口病ウイルス調製物を単離すること、（ｂ）有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルス調製物を第一の期間、処置すること、及び（ｃ）有効量のＢＰＬを用いてウイルス調製物を第二の期間、処置して、ウイルス調製物を完全に不活化すること、を含む。一部の実施形態において、第一の期間及び／又は第二の期間は、約１２時間〜約３６時間の範囲である。ある実施形態においては、第一の期間及び／又は第二の期間は、約２４時間である。ある実施形態においては、有効量のＢＰＬを用いた処置は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、又は約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲の量で、ＢＰＬを用いて処置することを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、有効量のＢＰＬを用いる処置は、０．０５％ｖ／ｖ、０．０６％ｖ／ｖ、０．０７％ｖ／ｖ、０．０８％ｖ／ｖ、０．０９％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ、０．２％ｖ／ｖ、０．３％ｖ／ｖ、０．４％ｖ／ｖ、０．５％ｖ／ｖ、０．６％ｖ／ｖ、０．７％ｖ／ｖ、０．８％ｖ／ｖ、０．９％ｖ／ｖ、又は１％ｖ／ｖのＢＰＬを用いて処置することを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、単離され、処置されるウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。この方法のある実施形態では、ウイルス調製物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でＢＥＩを用いて処置される。ある実施形態では、この方法は、ＢＰＬを加水分解するのに十分な期間、３７℃の温度でウイルス調製物を加熱することを含む。ある実施形態では、当該期間は、約１時間〜約６時間の範囲である。あるいは、一部の実施形態では、当該方法はさらに、チオ硫酸ナトリウムの有効量を用いて反応していないＢＰＬを不活化（すなわち加水分解）することを含む。一部の実施形態では、チオ硫酸ナトリウムの有効量は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である。
一部の実施形態では、当該方法は、（ａ）ウイルス調製物を作製するために用いられる１つ以上の非ヒト細胞から、手足口病ウイルス調製物を単離すること、（ｂ）有効量のホルマリンを用いてウイルス調製物を処置すること、及び（ｃ）ホルマリンからウイルス調製物を精製すること、を含む。ある実施形態では、ホルマリンの有効量を用いた処置は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、又は約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲の量でホルマリンを用いて処置することを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、単離され、ホルマリン処置されるウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。ある実施形態では、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の量でホルマリンから高度に精製される。
手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であってもよく、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。
ワクチン及び／又は免疫原性組成物の製剤化
本開示のさらなる態様は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の製剤化に関する。手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のかかるワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象の手足口病の治療又は予防に有用であってもよく、及び／又はその必要のある対象において手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。
典型的には、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかの注射物質として調製される。注射前の液体中の溶液又は懸濁液に適した固形形態が調製されてもよい。かかる調製物はまた、乳化されてもよく、又は乾燥粉末として製造されてもよい。活性な免疫原性成分はしばしば、薬学的に受容可能であり、当該活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノール又はその同等物、及びそれらの組み合わせである。さらに、もし所望の場合には、ワクチン又は免疫原性組成物は、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又は当該ワクチンもしくは免疫原性組成物の効果を増強させるアジュバントなどの補助的物質を含有してもよい。
ワクチン又は免疫原性組成物は、非経口的に注射によって、例えば皮下、経皮、皮内、真皮下、又は筋肉内に簡便に投与されてもよい。他の投与様式に適したさらなる製剤としては、座薬が挙げられ、及び一部の場合においては、口腔、経口、鼻内、頬側、舌下、腹腔、膣内及び頭蓋内の製剤が挙げられる。座薬に関しては、従来型の結合剤及び担体として、例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドなどが挙げられ、かかる座薬は、０．５％〜１０％、又はさらには１〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成される。ある実施形態では、例えば脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に溶け、本明細書に記載される手足口病のワクチン又は免疫原性組成物抗原が例えば攪拌などにより均一に分散される。溶解した均一な混合物は、次いで、利便なサイズの型に注がれ、冷却され、凝固する。
鼻内送達に適した製剤としては、液体（例えば、エアロゾル又は点鼻薬としての投与のための水溶液）及び乾燥粉末（例えば鼻腔内での急速な沈着のための）が挙げられる。製剤は、通常に用いられる賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、及びキトサンなどを含有する。例えばキトサンなどの粘膜付着剤は、鼻内投与された製剤の粘膜せん毛クリアランスを遅延させる液体又は粉末製剤のいずれかで使用されてもよい。例えばマンニトール及びスクロースなどの糖類は、液体製剤中の安定剤として使用することができ、乾燥粉末製剤中では安定剤、膨化剤、粉体流剤、及びサイズ剤として使用することができる。さらに、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）又はその誘導体、又はＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、免疫賦活アジュバントとして液体製剤及び乾燥粉末製剤の両方において使用することができる。
経口送達に適した製剤としては、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、トローチなどが挙げられる。経口送達に適した製剤としては、錠剤、トローチ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが挙げられる。製剤は、このように通常に使用される賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有する。他の手足口病のワクチン及び免疫原性組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、徐放製剤又は粉末の形態をとってもよく、及び１０〜９５％の活性成分、又は２５〜７０％の活性成分を含有してもよい。経口製剤に関し、コレラ毒素は興味深い製剤パートナーである（また、可能性のある結合パートナーである）。
膣投与用に製剤化された場合、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡沫、又はスプレーの形態であってもよい。前述の製剤のいずれも、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物抗原に加え、例えば適切であると当分野において知られている例えば担体などの剤を含有してもよい。
一部の実施形態では、本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、全身送達用又は局所送達用に製剤化されていてもよい。かかる製剤は、当分野に周知である。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、液体、及び栄養補助物質、電解質補助物質（例えば、リンゲルのデキストロースに基づいたもの）などが挙げられる。全身及び局所の投与経路としては、例えば皮内、局所塗布、静脈内、筋肉内などが挙げられる。
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、投与製剤に適合した様式で、治療有効であり、及び免疫原性のある量で、投与されてもよい。投与される量は、例えば、免疫反応を開始させる個々の免疫系の能力、及び所望される防御の程度などをはじめとする、治療される対象に依存している。適切な投与量範囲は、ワクチン接種１回当たり数百マイクログラムの活性成分のオーダーであり、例示的な範囲は約０．１μｇ〜１０μｇ（より高い量の１〜１０ｍｇの範囲も予期されるが）であり、例えば、約０．１μｇ〜５μｇの範囲、又は０．６μｇ〜３μｇの範囲、又は約１μｇ〜３μｇの範囲、又は０．１μｇ〜１μｇの範囲である。ある実施形態では、投与量は、用量当たり約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、又は約３μｇであってもよい。ある実施形態では、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、用量当たり、１μｇの量で投与されてもよい。例えば、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの２つ以上からの抗原を含有する二価もしくは三価のワクチン及び／又は免疫原性組成物などの多価である本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物において、各構成要素の投与量は、同等の投与量比で投与される（すなわち、二価のワクチン及び／又は免疫原性組成物であれば１：１、三価及び／又は免疫原性組成物であれば１：１：１）。
最初の投与及びブースター接種に対する適切なレジメンもまた可変であるが、最初の投与の後に引き続く接種又は他の投与が行われるのが典型である。
適用様式は広く変化し得る。ワクチン又は免疫原性組成物の任意の簡便な投与方法が適用可能である。これらには、生理学的に受容可能な固形の基剤、又は生理学的に受容可能な分散剤での経口適用、注射などによる非経口適用が挙げられる。ワクチン又は免疫原性組成物の投与量は、投与経路に依存し、ワクチン接種される人物の年齢、及び抗原の製剤に従い変化する。ワクチン又は免疫原性組成物は、本明細書に記載されるように、０．５ｍＬ超の単位投与量体積、０．５ｍＬの単位投与量体積、又は０．５ｍＬ未満の単位投与量体積を有してもよい。例えば、０．２５ｍＬの体積で投与されてもよい。
粘膜付着を改善させる送達剤を用いて、特に鼻内、経口、肺をベースとした送達製剤に対する送達、及び免疫原性を改善してもよい。そのような化合物の１つであるキトサンは、キチンのＮ脱アセチル型であり、多くの医薬製剤に使用されている。キトサンは、粘膜せん毛クリアランスを遅延させるその能力から、鼻内ワクチン送達の魅力的な粘膜付着剤であり、粘膜の抗原取込と処理のための時間をより長期化させる。さらに、キトサンは、抗原のＮＡＬＴへの経上皮輸送を増強させ得るタイトジャンクションを一過性に開かせることができる。最近のヒト臨床試験において、キトサンを用いて、追加のアジュバントは何も用いていない鼻内投与された三価の不活化インフルエンザワクチンにより、抗体陽転が生じ、ＨＩ価は、筋肉内接種後に得られたＨＩ価よりもわずかに低かった。
キトサンはまた、例えば、遺伝子的に無毒化された大腸菌の易熱性エンテロトキシン変異体ＬＴＫ６３などの鼻内で良く機能するアジュバントと共に製剤化されてもよい。これにより、キトサンにより与えられた送達及び付着の利益に加えて免疫刺激効果が加わり、粘膜と全身の反応が増強される。
最後に、キトサン製剤はまた、乾燥粉末形式でも調製することができ、それによりワクチンの安定性が改善され、液体製剤よりも粘膜せん毛クリアランスがさらに遅延させ得ることが示されていることに注意されたい。このことは、キトサンを用いて製剤化された鼻内乾燥粉末ジフテリアトキソイドワクチンを含む最近のヒト臨床試験において確認され、鼻内経路は、従来的な筋肉内経路と同じくらい有効であり、分泌性ＩｇＡ反応というさらなる利益も伴っていた。また、このワクチンは非常に良好な耐容性であった。キトサン及びＭＬＡ、又はその誘導体を含有する炭疽に対する鼻内粉末乾燥ワクチンは、ウサギにおいて筋肉内接種よりも強い反応を誘導し、エアロゾルの芽胞チャレンジに対しても防御的である。
鼻内ワクチンは、下部気道により強く作用する非経口投与されたワクチンとは対照的に、上部気道及び下部気道に作用することができる例示的な製剤である。これは、アレルゲンをベースとしたワクチンに対する寛容の誘導、及び病原体をベースとしたワクチンに対する免疫の誘導に有益であり得る。
上部気道と下部気道の両方に防御をもたらすことに加え、鼻内ワクチンは針接種による合併症を回避し、粒子状及び／又は可溶性の抗原と鼻咽喉関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）との相互作用を介して、粘膜及び全身の液性反応と細胞性反応の両方を誘導する手段をもたらす。
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、薬学的に受容可能である。それらは抗原とアジュバントに追加して構成要素を含有してもよく、例えばそれらは一般的に１つ以上の医薬担体（複数含む）及び／又は賦形剤（複数含む）を含有する。かかる構成要素に関する詳細な検討は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472で入手可能である。
張度を制御するために、たとえばナトリウム塩などの生理学的な塩を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含有してもよい。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）、又はクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
ワクチン又は免疫原性組成物のｐＨは、多くの場合、５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば、６．５〜７．５、又は７．０〜７．８である。本開示の製造方法は、したがって、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含む。
ワクチン又は免疫原性組成物は、好ましくは滅菌されている。好ましくは非発熱性であり、例えば、用量当たり１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的尺度）未満、及び好ましくは用量当たり０．１ＥＵ未満を含有する。好ましくはグルテンフリーである。
ある実施形態では、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、有効な濃度で洗剤を含有してもよい。一部の実施形態では、洗剤の有効量は、約０．００００５％ ｖ／ｖ〜約５％ ｖ／ｖ、又は約０．０００１％ ｖ／ｖ〜約１％ ｖ／ｖを含み得るが、これに限定されない。ある実施形態では、洗剤の有効量は、約０．００１％ ｖ／ｖ、約０．００２％ ｖ／ｖ、約０．００３％ ｖ／ｖ、約０．００４％ ｖ／ｖ、約０．００５％ ｖ／ｖ、約０．００６％ ｖ／ｖ、約０．００７％ ｖ／ｖ、約０．００８％ ｖ／ｖ、約０．００９％ ｖ／ｖ、又は約０．０１％ ｖ／ｖである。理論に拘束されることを望まないが、洗剤は、溶液中での本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の維持を補助し、ワクチン及び／又は免疫原性組成物の凝集予防を補助する。
特にスプリットワクチン又は表面抗原ワクチンに対して適切な洗剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（Ｔｗｅｅｎとして知られている）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ１００）又はｔオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、及びデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。洗剤は、微量のみで存在してもよい。微量の他の残りの構成要素は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。一部の実施形態では、洗剤はポリソルベートを含有する。一部の実施形態では、洗剤の有効濃度は、約０．００００５％ ｖ／ｖ〜約５％ ｖ／ｖの範囲を含む。
ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは凍結させてはならない。それらは理想的には直射日光を避けなければならない。抗原及びエマルションは、典型的には混合されているが、はじめはその場で混合するための別々の構成要素のキットの形態であってもよい。ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、対象に投与されるとき、多くの場合は水性形態である。
アジュバント
本開示の他の態様は、１つ以上のアジュバントと組み合わされた、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物に関する。本開示のかかるアジュバント化ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であってもよく、又はその必要のある対象において手足口病に対する防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。
ワクチンに対しアジュバント効果を得るためのさまざまな方法が公知であり、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物と併せて使用されてもよい。一般的な原理と方法は、"The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6に、また"Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9に詳述されている。
一部の実施形態では、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、抗原とアジュバントを含有する。抗原は、少なくとも１つのアジュバントと、約１０：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの重量を基にした比率で混合されていてもよく、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、又は約１０９：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの比率で混合されていてもよい。当業者であれば、アジュバントに関する情報と、最適な比率を決定するための日常的な実験を介して適切な比率を容易に決定することができる。
例示的なアジュバントとしては、限定されないが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、アジュバントはＭＬＡ又はその誘導体である。
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。一部の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５のうち少なくとも１つを含有する。一部の実施形態では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のＨＦＭＤワクチン及び／又は免疫原性組成物の抗原の吸着を増強することが判明している。したがって、一部の実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の抗原がアルミニウム塩アジュバントに吸着している。
本開示のある実施形態は、手足口病のアジュバント化ワクチン及び／又は免疫原性組成物の作製方法を含み、当該方法は、（ａ）アルミニウム塩アジュバントと、ワクチン又は免疫原性組成物を混合することであって、ワクチン又は免疫原性組成物は手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有していること、及び（ｂ）約１６時間〜約２４時間の範囲の期間、適切な条件下で混合物をインキュベートすることであって、抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％がアルミニウム塩アジュバントに吸着していること、を含む。当該方法のある実施形態では、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。当該方法の一部の実施形態では、混合物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でインキュベートされる。当該方法の一部の実施形態では、混合物は、当分野に公知の任意の適切なミキサーを用いて持続的に混合されながらインキュベートされる。当該方法の一部の実施形態では、混合物は、約６．５〜約８、約６．８〜約７.８、約６．９〜約７．６、又は約７〜約７．５の値の範囲のｐＨでインキュベートされる。ある好ましい実施形態では、混合物は中性ｐＨでインキュベートされる。当該方法の一部の実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される。
モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）はサルモネラ由来のリピドＡの非毒性誘導体であり、ワクチンアジュバントとして開発された強力なＴＬＲ−４作動薬である（Evans et al. 2003）。前臨床マウス実験において、鼻内ＭＬＡは、分泌反応ならびに全身反応、液性反応を増強することが示されている （Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002）。また、１２０，０００人を超える患者の臨床試験においても、ワクチンアジュバントとしての安全性及び有効性が証明されている（Baldrick et al. , 2002; 2004）。ＭＬＡは、ＴＬＲ−４受容体を介して先天免疫の誘導を刺激し、それにより、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方、ウイルスならびに寄生虫をはじめとする広範な感染性病原体に対する非特異的免疫反応を惹起することができる（Baldrick et al. 2004; Persing et al. 2002）。鼻内製剤中のＭＬＡの含有は、先天性反応の急速な誘導をもたらし、ウイルスチャレンジから非特異的免疫反応を惹起させ、一方で、ワクチンの抗原性構成要素により生じる特異的反応を増強させるはずである。
したがって、１つの実施形態において、本開示は、獲得免疫及び先天免疫の増強剤としてのモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、又はそれらの誘導体を含有する組成物を提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＬＡは、４、５又は６個のアシル化鎖を有する３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、欧州特許０ ６８９ ４５４ Ｂ１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡ社）に開示されている。他の実施形態では、本開示は、例えばＢｉｏＭｉｒａ’ｓ ＰＥＴ Ｌｉｐｉｄ Ａなどの合成リピドＡ、リピドＡ模倣体もしくはアナログ、又はＴＬＲ−４作動薬のように機能するよう設計された合成誘導体を含有する組成物を提供する。
さらなる例示的なアジュバントとしては、ポリペプチド構成要素との共発現により、又はキメラポリペプチドを産生するポリペプチド構成要素との融合により、本明細書に開示される抗原に容易に付加され得るポリペプチドアジュバントが挙げられるが、これに限定されない。細菌フラジェリンは、鞭毛の主要なタンパク構成物質であり、トール様受容体ＴＬＲ５により先天免疫系に認識されることを理由に、アジュバントタンパク質として注目が高まっているアジュバントである（65）。ＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナル伝達は、ＤＣの成熟と移動を誘導し、ならびにマクロファージ、好中球及び腸上皮細胞を活性化し、その結果、炎症促進性メディエーターが産生されることによって、先天免疫機能と獲得免疫機能の両方に効果を有している（66-72）。
ＴＬＲ５は、このタンパク質に固有であり、鞭毛の機能に必要なフラジェリン単量体内の保存構造を認識しており、免疫的圧力への反応においてその突然変異を排除する（73）。受容体は、１００ｆＭの濃度に感受性であるが、インタクトなフィラメントは認識しない。結合及び刺激には鞭毛の単量体への分解が必要である。
非経口又は鼻内のいずれかで投与された異種抗原に対する防御的反応の誘導に関し、アジュバントとしてフラジェリンは強力な活性を有しており、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果も報告されている。フラジェリンが用いられた場合、例えばインフルエンザなどの呼吸器系のウイルスに適したＴｈ２偏向が観察されているが、マウス又はサルにおいてＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。さらに、サルにおいて、鼻内または全身への投与後の局所炎症反応も全身炎症反応も報告されていない。ＭｙＤ８８依存性の様式のＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナル、及びＴＬＲを介した他のすべてのＭｙＤ８８依存性のシグナルは、Ｔｈ１偏向を生じさせることが示されていることから、フラジェリン使用後に惹起されるＴｈ２を特徴とする反応はいささか驚きである。重要なことは、従前から存在したフラジェリンに対する抗体は、アジュバント効果に関しては適切な効果を有しておらず、このことから、多様な使用ができるアジュバントとして魅力的である。
近年の多くの鼻内ワクチン試験における普遍的なテーマは、ワクチン効果を改善するためのアジュバント及び／又は送達システムの使用である。そのような試験の一つにおいて、遺伝的に非毒化された大腸菌易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンは、Ｈ５チャレンジに対して異種部分的防御を生じさせたが、鼻内送達後のみであった。防御は、交差中和抗体の誘導に基づいたものであり、新たなワクチンの開発における鼻内経路の重要な関与を示していた。
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）、腫瘍壊死因子、インターロイキン２、７、１２、インターフェロン及び他の同様な成長因子をアジュバントとして用いてもよい。なぜなら、それらはポリペプチド構成要素と混合することにより、又は融合させることにより容易に手足口病のワクチン又は免疫原性組成物中に含ませることができるからである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び免疫原性組成物は、例えば５’−ＴＣＧ−３’配列を含有する核酸ＴＬＲ９リガンド、イミダゾキノリンＴＬＲ７リガンド、置換グアニンＴＬＲ７／８リガンド、例えばロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、及びレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンド、などのトール様受容体を介して作用する他のアジュバントを含有してもよい。
あるアジュバントは、例えば樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取り込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント、例えば毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント、油性製剤、ポリマー、ミセル形成アジュバント、サポニン、免疫刺激複合体マトリクス（ＩＳＣＯＭマトリクス：ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍａｔｒｉｘ）、粒子、ＤＤＡ、アルミニウムアジュバント、ＤＮＡアジュバント、ＭＬＡ、及びカプセル化アジュバントからなる群から選択される。
アジュバントのさらなる例としては、例えば水酸化物又はリン酸塩などのアルミニウム塩（ミョウバン）などの剤が挙げられ、それらは通常、緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１％溶液として使用され（例えば、Nicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493を参照のこと）、０．２５％溶液として使用される糖類の合成ポリマー（例えば、カーボポール（登録商標））と混合され、７０℃〜１０１℃の範囲の温度でそれぞれ３０秒〜２分の間の加熱処置によりワクチン中のタンパク質を凝集させ、また、架橋剤による凝集も可能である。ペプシン処置抗体（Ｆａｂ断片）を用いた再活性化によるアルブミンへの凝集、例えばクリプトスポリジウム・パルバムなどの細菌細胞、又はエンドトキシン、又はグラム陰性細菌のリポ多糖成分との混合、たとえばマンニド一モノオレイン酸塩（Ａｒａｃｅｌ Ａ）などの生理学的に受容可能な油性ビヒクル中のエマルション、又はブロック代替品（ｂｌｏｃｋ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）として用いられるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液とのエマルションを用いてもよい。例えば、スクアレン及びＩＦＡなどの油との混合を用いてもよい。
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は興味深いアジュバント候補であるが、フロイントの完全及び不完全アジュバント、ならびに例えばＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１などのキラヤ属サポニンも興味深い。さらなる可能性としては、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、及びスレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）などのリポ多糖のポリ［ジ］（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体が挙げられる。Ｔｈ１型反応を優先的に生じさせるために、例えば３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせをはじめとするリポ多糖をベースとしたアジュバントを使用してもよい。
リポソーム製剤もまた、アジュバント効果をもたらすことが知られており、そのため、リポソームアジュバントを手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物と併せて用いてもよい。
免疫刺激複合体マトリクス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリクス）アジュバントを、手足口病のワクチン抗原及び免疫原性組成物と共に用いてもよい。なぜなら、特に、このタイプのアジュバントはＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御させることができることが示されているからである。ＩＳＣＯＭマトリクスは、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の（任意選択で分画化された）サポニン（トリペルテノイド）、コレステロール、及びリン脂質からなる。例えば手足口病のワクチン又は免疫原性組成物抗原などの免疫原性タンパク質と混合した場合、得られた微粒子製剤は、サポニンが６０〜７０％ ｗ／ｗを構成し、コレステロール及びリン脂質が１０〜１５％ ｗ／ｗを構成し、及びタンパク質が１０〜１５％ ｗ／ｗを構成し得るＩＳＣＯＭ粒子として知られる製剤である。組成及び免疫刺激複合体の使用に関する詳細は、例えばアジュバントを扱っている上述のテキスト中に見いだされ、また、Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475、ならびにBarr I G and Mitchell G F, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25は、完全免疫刺激複合体の調製に関する有用な解説を提供している。
ｉｓｃｏｍの形態であるか否かを問わず、サポニンは本明細書に開示される手足口病ワクチン抗原及び免疫原性組成物とのアジュバントの組み合わせに用いられてもよく、米国特許 第５，０５７，５４０号及び"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55、及びＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１に記載されるＱｕｉｌＡと称されるシャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から誘導されるサポニン及びその画分を含み得る。例示的なＱｕｉｌＡ画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、及びＱＳ１７である。
β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）は、手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物のアジュバント組成物における使用のための他の溶血性サポニンである。エスシンは、セイヨウトチノキ（ｈｏｒｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｔｒｅｅ）、Ｌａｔ：Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍの種子中に生じるサポニンの混合物として、メルクインデックス（第１２版：エントリー３７３７）に記述されている。その単離は、クロマトグラフィー及び精製（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)）、及びイオン交換樹脂（Erbring et al., 米国特許第３，２３８，１９０号）により記載されている。エスシンの画分は精製され、生物的に活性があることが示されている（Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8):1454-1464)）。β−エスシンは、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）とも知られている。
手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のための他の溶血性サポニンはジギトニンである。ジギトニンはメルクインデックス（第１２版：エントリー３２０４）にサポニンとして記載されており、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａの種子から誘導され、Gisvold et al., J.Am.Pharm.Assoc., 1934, 23, 664、及びRuhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1955, 301, 621に記載される手順に従い精製される。 その使用は、コレステロール測定のための臨床試薬であるとして記載されている。
アジュバント効果が得られる他の興味深い可能性は、Gosselin et al., 1992に記載される技術を用いることである。簡潔に述べると、例えば本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物中の抗原などの関連抗原の提示は、単球／マクロファージのＦＣ受容体に対する抗体（または抗原に結合する抗体断片）にこの抗原を結合させることにより増強させることができる。特に、抗原と抗ＦＣＲＩの間の結合は、ワクチン接種を目的とした免疫原性を増強させることが示されている。抗体は、生成された後に、又は手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原のポリペプチド成分のいずれか１つへの融合物として発現させることを含む生成の一部として、手足口病のワクチン又は免疫原性組成物に結合されてもよい。他の可能性は、標的化及び免疫調節物質（すなわちサイトカイン）の使用を含む。さらに、例えばポリＩ：Ｃなどのサイトカインの合成誘導物質を用いてもよい。
適切なマイコバクテリア派生物は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｍｏｎｔ．）、ならびに例えばＴＤＭ及びＴＤＥなどのトレハロースのジエステルからなる群から選択されてもよい。
適切な免疫標的化アジュバントの例としては、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体、又は特にそれらの結合断片（上述を参照）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が挙げられる。
適切なポリマーアジュバントの例としては、例えばデキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、及びマンノースなどの炭水化物、プラスチックポリマー、及び例えばラテックスビーズなどのラテックスが挙げられる。
免疫反応を調節する他のさらなる興味深い方法は、免疫原を（任意選択でアジュバントならびに薬学的に受容可能な担体及びビヒクルとともに）、「バーチャルリンパ節（ＶＬＮ：ｖｉｒｔｕａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）」（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ， Ｉｎｃ．， ３６０ Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １００１７−６５０１により開発され、所有される医療デバイス）に含ませることである。ＶＬＮ（薄い管状のデバイス）はリンパ節の構造及び機能を模倣している。皮膚の下にＶＬＮを挿入することで無菌の炎症部位が創出され、サイトカイン及びケモカインが急増する。Ｔ細胞及びＢ細胞ならびにＡＰＣがこの危険なシグナルに急速に反応し、炎症部位に誘導され、ＶＬＮの多孔質マトリクスの内部に蓄積される。ＶＬＮを使用した場合、抗原に対する免疫反応を開始させるために必要とされる抗原の必要用量は低減されることが示されており、及びＶＬＮを用いたワクチン接種により与えられる免疫防御は、アジュバントとしてＲｉｂｉを使用した従来的なワクチン接種を凌いだことが示されている。この技術は、Gelber C et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"、"From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif."に簡潔に記載されている。
手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原と併せて、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いてもよく、及びオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ以上、又はさらには少なくとも６つ以上のヌクレオチドによって分離される２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有してもよい。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）は、Ｔｈ１反応を優先的に誘導する。かかるオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ならびに米国特許第６，００８，２００号及び第５，８５６，４６２号に記載されている。
かかるオリゴヌクレオチドアジュバントは、デオキシオリゴヌクレオチドであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド主鎖は、ホスホロジチオアート、またはホスホロチオアートの結合であるが、ホスホジエステル、及び例えば混合主鎖結合を有するオリゴヌクレオチドを含むＰＮＡなどの他のヌクレオチド主鎖を用いてもよい。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオアートの作製方法は、米国特許 第５，６６６，１５３号、米国特許 第５，２７８，３０２号、及びＷ０９５／２６２０４に記載されている。
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有するものである。この配列は、ホスホロチオアート改変ヌクレオチド主鎖を含有してもよい。
（配列番号１０）オリゴ１：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) 、
（配列番号１１）オリゴ２：TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) 、
（配列番号１２）オリゴ３：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG、
（配列番号１３）オリゴ４：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)、及び
（配列番号１４）オリゴ５：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
別のＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、配列に些末な欠失または付加を伴う上述の配列が挙げられる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当分野に公知の任意の方法により合成されてもよい（例えば、ＥＰ４６８５２０）。例えば、かかるオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を利用して合成されてもよい。かかるオリゴヌクレオチドアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであってもよい。他のアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に公開されている。
多くの単相又は多相のエマルション系が記載されている。当業者であれば、このエマルションが抗原構造を破壊しないように、かかるエマルション系を手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原との使用に容易に適合させることができる。水中油型エマルションアジュバントはそれ自体がアジュバント組成物として有用であることが提唱されており（ＥＰＯ ３９９ ８４３Ｂ）、水中油型エマルションと他の活性剤との組み合わせもワクチンのアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９８／５６４１４、ＷＯ９９／１２５６５、ＷＯ９９／１１２４１）。例えば油中水型エマルション（米国特許第５，４２２，１０９号、ＥＰ ０ ４８０ ９８２ Ｂ２）及び水中油中水型エマルション（米国特許第５，４２４，０６７号、ＥＰ ０ ４８０ ９８１ Ｂ）などの他の油性エマルションアジュバントが記載されている。
本明細書に記載される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物との使用のための油性エマルションアジュバントは、天然であっても又は合成であってもよく、及び鉱物又は有機であってもよい。鉱物油及び有機油の例は、当分野の当業者には容易に明白であろう。
任意の水中油型組成物をヒト投与に適合させるために、エマルション系の油相に代謝可能な油を含有させてもよい。代謝可能な油という用語の意味は、当分野に周知である。代謝可能とは、「代謝により転換されることができる」と定義することができる（Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)）。油は任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であってもよく、それらはレシピエントに対して非毒性であり、代謝により転換されることができるものである。堅果（例えば、ピーナッツ油）、種子、及び穀物が植物油の一般的な源である。合成油を用いてもよく、合成油は例えばＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油を含有してもよい。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）は、サメ肝臓油中に大量に存在するが、オリーブオイル、コムギ胚種油、米ぬか油、及び酵母中には少量で存在する不飽和油であり、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原と共に用いられてもよい。スクアレンはコレステロールの生合成中の中間体であるという事実により代謝可能な油である（メルクインデックス、第１０版、エントリー番号８６１９）。
例示的な油性エマルションは、水中油型エマルションであり、特に水中スクアレンエマルションである。
さらに、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原との使用のための油性エマルションアジュバントは、例えば油性α−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ ０ ３８２ ２７１ Ｂ１）などの抗酸化剤を含有してもよい。
ＷＯ９５／１７２１０及びＷＯ９９／１１２４１は、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）を基にし、任意選択で免疫刺激物質ＱＳ２１及び／又は３Ｄ−ＭＬＡを用いて製剤化したエマルションアジュバントを公開している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相にステロールを添加した、これらスクアレンエマルションに対する改善を記載している。さらに例えばトリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを油相に添加し、エマルションを安定化させてもよい（ＷＯ９８／５６４１４）。
この安定な水中油型エマルション内に存在する油滴のサイズは、１ミクロン未満であってもよく、光子相関法（ｐｈｏｔｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）による測定で、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲であってもよく、実質的に約３０〜５００ｎｍの直径であってもよく、又は実質的に１５０〜５００ｎｍの直径であってもよく、及び特に約１５０ｎｍの直径であってもよい。この点で、数により８０％の油滴は、これら範囲内にあってもよく、数により９０％超または９５％超の油滴は、既定のサイズ範囲内である。油性エマルション中に存在する成分の量は、例えばスクアレンなど、慣例的に２〜１０％の油の範囲内であり、存在する場合にはアルファトコフェロールは２％〜１０％の範囲であり、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤は、０．３〜３％の範囲である。油：アルファトコフェロールの比率は、等しいか、１未満であり、これにより安定なエマルションが提供される。ＳＰＡＮ８５（ＴＭ）もまた、約１％のレベルで存在してもよい。一部の例では、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は安定剤をさらに含有することが有益である場合がある。
水中油型エマルションの作製方法は当分野の当業者に周知である。一般的に、当該方法は、油相と、例えばＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤を混合する工程、次いで、ホモジナイザーを用いてホモジナイズする工程を含み、小体積の液体をホモジナイズするには、この混合物を注射針に２回通すことを含む方法が適していることは当業者には明らかである。同様に、当業者であれば、マイクロフルダイザーにおける乳化プロセス（Ｍ１１０Ｓ微小流体装置、最大５０パス、６バールの最大入力圧力で２分間（出力圧力は約８５０バール））を適合させ、より小体積、またはより大体積のエマルションを製造することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物を得るまで、得られたエマルションを測定することを含む、日常的な実験により行うことができる。
あるいは、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、キトサン（上述）から構成されるワクチンビヒクルと混合されてもよく、または他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチド、及びポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基にしたポリマーマトリクス、多糖又は化学的に改変された多糖から構成される粒子、リポソーム及び脂質を基にした粒子、グリセロールモノエステルから構成される粒子などと混合されてもよい。例えばリポソーム又はＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成させるために、コレステロールの存在下でサポニンもまた製剤化されてもよい。さらに、サポニンは、非粒子溶液もしくは懸濁液中、又は寡層薄膜（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒状構造中のいずれかにおいて、例えばポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと共に製剤化されてもよい。
本明細書に記載される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のためのさらなる実例となるアジュバントとしては、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ社、Ｃａｌｉｆ．米国）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ社、例えば、Granoff et al. (1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715）を参照のこと。ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えばＳＢ−ＡＳ２（ＭＬＡ及びＱＳ２１を含有する水中油型エマルション）、ＳＢＡＳ−４（ミョウバン及びＭＬＡを含有するアジュバント系）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギーから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、及びＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、及び例えば係属中の米国特許出願０８／８５３，８２６及び０９／０７４，７２０に記載されているものなどの他のアミノアルキルグルコサミド４−リン酸塩（ＡＧＰ）が挙げられる。
他のアジュバントの例としては、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント (ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ジョージア州)、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｇａｉｂｅｒｇ、ドイツ）、ニトロセルロース（Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557）、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルションを基にした、鉱物油、非鉱物油を含む製剤、油中水型エマルション又は水中油型エマルション、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など。Ｓｅｐｐｉｃ社、パリ、フランス）、及びＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＯＭ−１７４（リピドＡに関連したグルコサミン二糖）、リーシュマニア伸長因子、例えばＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、及びＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、O'Hagan et al. O'Hagan et al. 18(3):69-85; and "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols" D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Press.を参照のこと。
他の例示的なアジュバントとしては、以下の一般式のアジュバント分子が挙げられる：
ＨＯ（ＣＨ ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ， （Ｉ）
式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合又は−−Ｃ（Ｏ）−−、であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキル又はフェニルＣ１〜５０アルキルである。
１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含有するワクチン製剤からなり、式中、ｎは１〜５０であり、４〜２４、又は９であり、Ｒ構成要素は、Ｃ１−５０、Ｃ４−Ｃ２０アルキル、又はＣ１２アルキルであり、Ａは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、０．１〜１０％の範囲、または０．１〜１％の範囲でなければならない。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される： ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、 ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、 ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、 ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、 ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、及び ポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。例えばポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、メルクインデックス（第１２版、エントリー７７１７）に記載されている。 これらアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
上述の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、もし望ましい場合には、他のアジュバントと混合されてもよい。例えば、アジュバントの組み合わせは、上述のＣｐＧを含んでもよい。
本明細書に記載される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物との使用に適切な薬学的に受容可能な賦形剤のさらなる例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、等張緩衝溶液が挙げられる。
本開示の方法
本開示のさらなる態様は、その必要のある対象における手足口病を治療または予防するための、及び／又はその必要のある対象において手足口病に対する免疫反応を誘導するための、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の使用方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することによる、その必要のある対象における手足口病を治療または予防する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することによる、その必要のある対象において手足口病に対する免疫反応を誘導する方法に関する。
一部の実施形態では、投与工程は、対象において防御的免疫反応を誘導する。一部の実施形態では、防御的免疫反応は、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む。一部の実施形態では、防御的免疫反応は、例えばＢ４、Ｃ２、Ｃ４及びＣ５などのＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を誘導する。
本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、当該ワクチンの、鼻内、口腔、経口、頬側、舌下、筋肉内、腹腔、皮内、経真皮、真皮下、膣内、肛門、頭蓋内、静脈内、経皮又は皮下への投与によって、ウイルス感染に感受性の、もしくはウイルス感染に苦しむ、哺乳類又は鳥類を防御又は治療するために使用されてもよい。本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の全身投与方法は、伝統的なシリンジと針、又は固形ワクチンの衝撃送達用に設計されたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）または針の無い圧力液体ジェットデバイス（米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第５，９９３，４１２号）、または経真皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０、ＷＯ９８／２８０３７）を含んでもよい。本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、皮膚に塗布されてもよい（経真皮及び経皮送達。ＷＯ９８／２０７３４、ＷＯ９８／２８０３７）。本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、したがって、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物が前もって充てんされた全身投与用の送達デバイスを含んでもよい。したがって、任意選択的にアジュバント及び／又は担体を含む、本開示のワクチン又は免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む、例えば哺乳類又は鳥類などの対象において手足口病を治療又は予防する方法、及び免疫反応を誘導する方法が提供され、当該ワクチン又は免疫原性組成物は、非経口又は全身の経路を介して投与される。
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物を用いて、例えば経口／消化管又は鼻の経路などの粘膜経路を介して、当該ワクチン又は免疫原性組成物を投与することにより、ウイルス感染に感受性の、もしくはウイルス感染に苦しむ哺乳類又は鳥類を防御又は治療してもよい。別の粘膜経路は、膣内及び直腸内である。投与の粘膜経路は、鼻を介した経路であってもよく、鼻内ワクチン接種と称される。鼻内ワクチン接種の方法は当分野に周知であり、液滴形態、スプレー形態、又は粉末乾燥形態のワクチンを免疫化される個体の鼻咽頭内へ投与することを含む。霧状化ワクチン製剤またはエアロゾル化ワクチン製剤も、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物の可能性のある形態である。例えば胃抵抗性カプセルなどの腸溶性製剤、及び経口投与用の顆粒、直腸投与又は膣投与用の座薬もまた、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の製剤である。
本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、経口経路を介して投与されてもよい。そのような場合において、薬学的に受容可能な賦形剤はまた、アルカリ緩衝液、又は腸溶性カプセルもしくは微粒剤を含有してもよい。本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、膣経路により投与されてもよい。そのような場合において、薬学的に受容可能な賦形剤はまた、乳化剤、例えばカーボポール（登録商標）などのポリマー類、ならびに膣クリーム及び座薬の他の公知の安定剤を含有してもよい。手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物はまた、直腸経路により投与されてもよい。そのような場合において、賦形剤はまた、ワックス、及び直腸座薬の形成に関し当分野に公知のポリマーを含有してもよい。
一部の実施形態では、投与工程は、１回以上の投与を含む。投与は、単回投与スケジュールによるものであってもよく、又は複数回の投与スケジュール（プライム−ブースト）によるものであってもよい。複数回の投与スケジュールにおいて、様々な用量が同じ経路又は異なる経路により与えられてもよく、例えば、プライムが非経口でブーストが粘膜、プライムが粘膜でブーストが非経口などがある。典型的には、それらは同じ経路で投与される。複数回の用量は、典型的には、少なくとも１週（例えば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１２週、約１６週など）離れて投与される。２５〜３０日間（例えば、２８日間）離して２回投与することが特に有用である。
本開示方法は、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量又は免疫原性量を投与することを含む。治療有効量または免疫原性量は、投与される非感染対象、感染対象、又は非曝露対象において、防御的免疫反応を誘導する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の量であってもよい。かかる反応は、多くの場合、対象において、ワクチンに対する分泌性、細胞性、及び／又は抗体介在性の免疫反応の発現をもたらす。通常、かかる反応は、以下の効果のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない：例えばイムノグロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭなどの任意の免疫学的分類の抗体の産生；Ｂリンパ球及びＴリンパ球の増殖；免疫細胞に対する活性化、増殖、及び分化のシグナルの提示；ヘルパーＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞の拡大増殖。
好ましくは、治療有効量又は免疫原性量は、疾患の症状の治療または予防をもたらすのに十分な量である。正確な必要量は、他の因子の中でも治療される対象、治療される対象の年齢及び一般状態、対象の免疫系が抗体を合成する能力、望ましい防御の程度、治療される状態の重篤度、選択された特定の手足口病の抗原ポリペプチド、及びその投与様式によって変化する。適切な治療有効量又は免疫原性量は、当分野の当業者により容易に決定することができる。治療有効量又は免疫原性量は、日常的な試験を介して決定することができる、比較的広い範囲におさまる。
実施形態の列挙
以下の列挙される実施形態は、本発明の一部の態様の代表である。
1. ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病のワクチンであって、前記１つ以上の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、前記ワクチン。
2. ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物であって、前記１つ以上の抗原は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、前記免疫原性組成物。
3. 前記少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６の１つ以上から選択される、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
4. 前記少なくとも１つのウイルスがＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６を含む、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
5. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１及びＣＡ６を含む、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
6. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１及びＣＡ１６を含む、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
7. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＣＡ６及びＣＡ１６を含む、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
8. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１である、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
9. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１、ＣＡ６、ＣＡ１６、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態１もしくは実施形態２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
10. 前記１つ以上の抗原は、ＥＶ７１由来である、実施形態９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
11. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ１ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜１0のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
12. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置で発生するか、又は、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位に相当する位置のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態１１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
13. 前記配列番号１の７位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置の突然変異が、バリンからメチオニンへの置換である、実施形態１２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
14. 前記配列番号１の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である、実施形態１２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
15. 前記配列番号１の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４５位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換である、実施形態１２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
16. 前記配列番号１の２８２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の２８２位に相当する位置の突然変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、実施形態１２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
17. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ１ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
18. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位に相当する位置のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態１７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
19. 前記配列番号２の４６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６位に相当する位置の突然変異が、アラニンからバリンへの置換である、実施形態１８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
20. 前記配列番号２の９０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９０位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からリシンへの置換である、実施形態１８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
21. 前記配列番号２の９６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９６位に相当する位置の突然変異が、スレオニンからアラニンへの置換である、実施形態１８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
22. 前記配列番号２の２６８位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の２６８位に相当する位置の突然変異が、バリンからイソロイシンへの置換である、実施形態１８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
23. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ２ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
24. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号３の１４４位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置で発生する、実施形態２３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
25. 前記配列番号３の１４４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置の突然変異が、グルタミンからリシンへの置換である、実施形態２４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
26. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ３ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
27. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号４の１０２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置で発生する、実施形態２６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
28. 前記配列番号４の１０２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置の突然変異が、イソロイシンからバリンへの置換である、実施形態２７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
29. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
30. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲが配列番号８に対して整列された場合には、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位に相当する位置で発生する、実施形態２９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
31. 前記配列番号８の１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１３位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１４位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１５位に相当する位置の突然変異が、グアニンからシトシンへの置換であり、前記配列番号８の１６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１６位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の２１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２１位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の２３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２３位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の３４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の３４位に相当する位置の突然変異が、グアニンからチミンへの置換であり、あるいは前記配列番号８の４０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の４０位に相当する位置の突然変異が、シトシンからグアニンへの置換である、実施形態３０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
32. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の２Ａポリペプチドを含有し、前記２Ａポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
33. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号５の２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置で発生する、実施形態３２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
34. 前記配列番号５の２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置の突然変異が、リシンからグルタミン酸への置換である、実施形態３３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
35. 前記１つ以上の抗原がＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチドを含み、前記ＶＰ２ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
36. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号６の１６１位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置で発生する、実施形態３５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
37. 前記配列番号６の１６１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置の突然変異が、メチオニンからスレオニンへの置換である、実施形態３６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
38. ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド中に少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異をさらに含む、実施形態３２〜３７のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
39. 前記少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号７の９９位もしくは１４５位のうちの１つ以上または両方で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位又は１４５位に相当する位置で発生する、実施形態３８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
40. 前記配列番号７の９９位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からグリシンへの置換である、実施形態３９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
41. 前記配列番号７の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の１４５位に相当する位置の突然変異が、バリンからグルタミン酸への置換である、実施形態３９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
42. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ１６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
43. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号９の６位もしくは３３位のうちの１つ又は２つで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲを配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位又は３３位に相当する位置で発生する、実施形態４２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
44. 前記配列番号９の６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位に相当する位置の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換であり、あるいは前記配列番号９の３３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の３３位に相当する位置の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である、実施形態４３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
45. 前記非ヒト細胞が、哺乳類細胞である、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
46. 前記非ヒト細胞が、サルの細胞である、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
47. 前記サルの細胞が、Ｖｅｒｏ細胞株由来である、実施形態４６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
48. 前記Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される、実施形態４７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
49. 前記１つ以上の抗原が、非ヒト細胞を培養することにより作製された、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
50. 前記細胞が、無血清培地中で培養された、実施形態４９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
51. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、又は弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
52. 前記少なくとも１つのウイルスが化学的に不活化されていた、実施形態１〜５１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
53. 前記少なくとも１つのウイルスが、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上を用いて化学的に不活化されていた、実施形態５２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
54. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬを用いて化学的に不活化されていた、実施形態５２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
55. 前記少なくとも１つのウイルスが、ホルマリンを用いて化学的に不活化されていた、実施形態５２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
56. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬ及びホルマリンの組み合わせを用いて化学的に不活化されていた、実施形態５２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
57. 前記ＢＰＬにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態５３、５４、又は５６のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
58. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態５７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
59. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態５８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
60. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態５７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
61. 前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、実施形態６０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
62. 前記ホルマリンにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態５３、５５、又は５６のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
63. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態６２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
64. 前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含む、実施形態６２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
65. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、ホルマリンをさらに含む、実施形態６２〜６４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
66. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＥＩで化学的に不活化されていた、実施形態５２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
67. 前記ＢＥＩにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態５３又は実施形態６６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
68. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態６７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
69. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態６８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
70. 未反応ＢＥＩが、チオ硫酸ナトリウムを用いて加水分解された、実施形態６６〜６９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
71. 有効濃度の洗剤をさらに含む、実施形態１〜７０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
72. 前記洗剤が、ポリソルベート［８０］を含む、実施形態７１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
73. 前記有効濃度が、約０．００１％〜約０．０１％の範囲である、実施形態７２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
74. アジュバントをさらに含む、実施形態１〜７３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
75. 前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、実施形態７４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
76. 前記アジュバントが、アルミニウム塩である、実施形態７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
77. 前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される、実施形態７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
78. 前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アジュバントに吸着されている、実施形態７６又は７７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
79. 前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）及びその誘導体である、実施形態７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
80. その必要のある対象の手足口病を治療又は予防する方法であって、実施形態１〜７９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
81. その必要のある対象において免疫反応を誘導する方法であって、実施形態１〜７９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の免疫原性量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
82. 前記投与が、前記対象に防御的免疫反応を誘導する、実施形態８０又は実施形態８１に記載の方法。
83. 前記免疫反応が、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態８２に記載の方法。
84. 前記免疫反応が、Ｂ４、Ｃ２、Ｃ４及びＣ５から選択されるＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態８２に記載の方法。
85. 前記投与が、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口送達、口腔送達、鼻内送達、頬側送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、及び頭蓋内送達からなる群から選択される実施形態８０〜８４のいずれか１つに記載の方法。
86. 前記投与が、１つ以上の投与を含む、実施形態８０〜８５のいずれか１つに記載の方法。
87. ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含む手足口病のワクチンであって、前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ１６、又はその両方であって、前記少なくとも１つのウイルスが、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で不活化されていた、前記ワクチン。
88. ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含む手足口病の免疫原性組成物であって、前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ１６、又はその両方であって、前記少なくとも１つのウイルスが、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）で不活化されていた、前記免疫原性組成物。
89. 前記少なくとも１つの不活化ウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態８７もしくは８８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
90. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態８９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
91. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態９０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
92. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態８９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
93. 前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、実施形態９２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
94. ＣＡ６由来の１つ以上の抗原をさらに含む、実施形態８７〜９３のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
95. 前記１つ以上の抗原が、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
96. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含み、前記ＶＰ１ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
97. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置で発生するか、又は、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位に相当する位置のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態９６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
98. 前記配列番号１の７位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置の突然変異が、バリンからメチオニンへの置換である、実施形態９７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
99. 前記配列番号１の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である、実施形態９７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
100. 前記配列番号１の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４５位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換である、実施形態９７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
101. 前記配列番号１の２８２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の２８２位に相当する位置の突然変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、実施形態９７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
102. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ１ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１０１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
103. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位に相当する位置のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態１０２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
104. 前記配列番号２の４６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６位に相当する位置の突然変異が、アラニンからバリンへの置換である、実施形態１０３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
105. 前記配列番号２の９０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９０位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からリシンへの置換である、実施形態１０３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
106. 前記配列番号２の９６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９６位に相当する位置の突然変異が、スレオニンからアラニンへの置換である、実施形態１０３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
107. 前記配列番号２の２６８位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の２６８位に相当する位置の突然変異が、バリンからイソロイシンへの置換である、実施形態１０３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
108. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ２ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１０７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
109. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号３の１４４位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置で発生する、実施形態１０８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
110. 前記配列番号３の１４４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置の突然変異が、グルタミンからリシンへの置換である、実施形態１０９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
111. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ３ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１１０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
112. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号４の１０２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置で発生する、実施形態１１１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
113. 前記配列番号４の１０２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置の突然変異が、イソロイシンからバリンへの置換である、実施形態１１２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
114. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１１３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
115. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲが配列番号８に対して整列された場合には、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位に相当する位置で発生する、実施形態１１４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
116. 前記配列番号８の１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１３位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１４位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１５位に相当する位置の突然変異が、グアニンからシトシンへの置換であり、前記配列番号８の１６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１６位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の２１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２１位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の２３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２３位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の３４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の３４位に相当する位置の突然変異が、グアニンからチミンへの置換であり、あるいは前記配列番号８の４０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の４０位に相当する位置の突然変異が、シトシンからグアニンへの置換である、実施形態１１５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
117. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の２Ａポリペプチドを含有し、前記２Ａポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１１６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
118. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号５の２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置で発生する、実施形態１１７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
119. 前記配列番号５の２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置の突然変異が、リシンからグルタミン酸への置換である、実施形態１１８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
120. 前記１つ以上の抗原がＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチドを含み、前記ＶＰ２ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１１９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
121. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号６の１６１位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置で発生する、実施形態１２０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
122. 前記配列番号６の１６１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置の突然変異が、メチオニンからスレオニンへの置換である、実施形態１２１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
123. ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド中に少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異をさらに含む、実施形態１１７〜１２２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
124. 前記少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号７の９９位もしくは１４５位のうちの１つ以上または両方で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位又は１４５位に相当する位置で発生する、実施形態１２３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
125. 前記配列番号７の９９位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からグリシンへの置換である、実施形態１２４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
126. 前記配列番号７の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の１４５位に相当する位置の突然変異が、バリンからグルタミン酸への置換である、実施形態１２４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
127. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ１６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態９５〜１２６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
128. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号９の６位もしくは３３位のうちの１つ又は２つで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲを配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位又は３３位に相当する位置で発生する、実施形態１２７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
129. 前記配列番号９の６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位に相当する位置の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換であり、あるいは前記配列番号９の３３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の３３位に相当する位置の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である、実施形態１２８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
130. 前記非ヒト細胞が、哺乳類細胞である、実施形態８７〜１２９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
131. 前記非ヒト細胞が、サルの細胞である、実施形態８７〜１２９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
132. 前記サルの細胞が、Ｖｅｒｏ細胞株由来である、実施形態１３１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
133. 前記Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される、実施形態１３２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
134. 前記１つ以上の抗原が、非ヒト細胞を培養することにより作製された、実施形態８７〜１３３のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
135. 前記細胞が、無血清培地中で培養された、実施形態１３４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
136. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、又は弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、実施形態８７〜１３５のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
137. 前記少なくとも１つのウイルスが、ホルマリンと組み合わせたＢＰＬを用いて不活化されていた、実施形態８７〜１３６のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
138. 前記ホルマリンにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態１３７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
139. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態１３８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
140. 前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含む、実施形態１３８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
141. 前記ワクチン又は免疫原性組成物がホルマリンをさらに含む、実施形態１３７〜１４０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
142. 有効濃度の洗剤をさらに含む、実施形態８７〜１４１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
143. 前記洗剤が、ポリソルベート［８０］を含む、実施形態１４２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
144. 前記有効濃度が、約０．００１％〜約０．０１％の範囲である、実施形態１４３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
145. アジュバントをさらに含む、実施形態８７〜１４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
146. 前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、実施形態１４５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
147. 前記アジュバントが、アルミニウム塩である、実施形態１４６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
148. 前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される、実施形態１４６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
149. 前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アジュバントに吸着されている、実施形態１４７又は実施形態１４８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
150. 前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）及びその誘導体である、実施形態１４６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
151. その必要のある対象の手足口病を治療又は予防する方法であって、実施形態８７〜１５０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
152. その必要のある対象において免疫反応を誘導する方法であって、実施形態８７〜１５０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の免疫原性量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
153. 前記投与が、前記対象に防御的免疫反応を誘導する、実施形態１５１又は実施形態１５２に記載の方法。
154. 前記免疫反応が、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態１５３に記載の方法。
155. 前記免疫反応が、Ｂ４、Ｃ２、Ｃ４及びＣ５から選択されるＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態１５３に記載の方法。
156. 前記投与が、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口送達、口腔送達、鼻内送達、頬側送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、及び頭蓋内送達からなる群から選択される実施形態１５１〜１５５のいずれか１つに記載の方法。
157. 前記投与が、１つ以上の投与を含む、実施形態１５１〜１５６のいずれか１つに記載の方法。
158. 手足口病のウイルス調製物を不活化する方法であって、
（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から手足口病ウイルス調製物を単離することであって、前記細胞は前記ウイルス調製物を作製するために使用されていること、
（ｂ）ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）の有効量を用いて前記ウイルス調製物を処置すること、及び
（ｃ）ホルマリンの有効量で前記ウイルス調製物を処置することであって、前記ホルマリンを用いた処置工程は、工程（ｂ）と共に、又は工程（ｂ）の後で行われ、ならびに、
前記ウイルスはＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、を含む前記方法。
159. 前記方法が、ＢＰＬを加水分解するのに十分な期間、３７℃の温度で前記ウイルス調製物を加熱することをさらに含む、実施形態１５８に記載の方法。
160. 前記期間が、約１時間〜約６時間の範囲である、実施形態１５９に記載の方法。
161. 前記不活化されたウイルス調製物が、１つ以上の改変を含む、実施形態１５８〜１６０のいずれか１つに記載の方法。
162. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態１６１に記載の方法。
163. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態１６２に記載の方法。
164. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態１６１に記載の方法。
165. 前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、実施形態１６４に記載の方法。
166. ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含む手足口病のワクチンであって、前記少なくとも１つのウイルスが、ＣＡ６、ＣＡ１６又はその両方であり、前記少なくとも１つのウイルスがホルマリンで不活化されていた、前記ワクチン。
167. ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含む手足口病の免疫原性組成物であって、前記少なくとも１つのウイルスが、ＣＡ６、ＣＡ１６又はその両方であり、前記少なくとも１つのウイルスがホルマリンで不活化されていた、前記免疫原性組成物。
168. 前記少なくとも１つのホルマリンにより不活化されたウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態１６６もしくは１６７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
169. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態１６８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
170. 前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含む、実施形態１６８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
171. 前記ワクチン又は免疫原性組成物がホルマリンをさらに含む、実施形態１６６〜１７０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
172. ＥＶ７１からの１つ以上の抗原をさらに含む、実施形態１６６〜１７１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
173. 前記１つ以上の抗原が、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
174. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含み、前記ＶＰ１ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
175. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置で発生するか、又は、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位に相当する位置のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態１７４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
176. 前記配列番号１の７位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置の突然変異が、バリンからメチオニンへの置換である、実施形態１７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
177. 前記配列番号１の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である、実施形態１７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
178. 前記配列番号１の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４５位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換である、実施形態１７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
179. 前記配列番号１の２８２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の２８２位に相当する位置の突然変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、実施形態１７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
180. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ１ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜１７９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
181. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位に相当する位置のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態１８０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
182. 前記配列番号２の４６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６位に相当する位置の突然変異が、アラニンからバリンへの置換である、実施形態１８１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
183. 前記配列番号２の９０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９０位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からリシンへの置換である、実施形態１８１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
184. 前記配列番号２の９６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９６位に相当する位置の突然変異が、スレオニンからアラニンへの置換である、実施形態１８１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
185. 前記配列番号２の２６８位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の２６８位に相当する位置の突然変異が、バリンからイソロイシンへの置換である、実施形態１８１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
186. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ２ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜１８５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
187. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号３の１４４位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置で発生する、実施形態１８６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
188. 前記配列番号３の１４４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置の突然変異が、グルタミンからリシンへの置換である、実施形態１８７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
189. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ３ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜１８８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
190. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号４の１０２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置で発生する、実施形態１８９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
191. 前記配列番号４の１０２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置の突然変異が、イソロイシンからバリンへの置換である、実施形態１９０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
192. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜１９１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
193. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲが配列番号８に対して整列された場合には、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位に相当する位置で発生する、実施形態１９２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
194. 前記配列番号８の１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１３位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１４位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１５位に相当する位置の突然変異が、グアニンからシトシンへの置換であり、前記配列番号８の１６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１６位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の２１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２１位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の２３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２３位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の３４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の３４位に相当する位置の突然変異が、グアニンからチミンへの置換であり、あるいは前記配列番号８の４０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の４０位に相当する位置の突然変異が、シトシンからグアニンへの置換である、実施形態１９３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
195. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の２Ａポリペプチドを含有し、前記２Ａポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜１９４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
196. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号５の２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置で発生する、実施形態１９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
197. 前記配列番号５の２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置の突然変異が、リシンからグルタミン酸への置換である、実施形態１９６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
198. 前記１つ以上の抗原がＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチドを含み、前記ＶＰ２ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜１９７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
199. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号６の１６１位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置で発生する、実施形態１９８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
200. 前記配列番号６の１６１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置の突然変異が、メチオニンからスレオニンへの置換である、実施形態１９９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
201. ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド中に少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異をさらに含む、実施形態１９５〜２００のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
202. 前記少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号７の９９位もしくは１４５位のうちの１つ以上または両方で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位又は１４５位に相当する位置で発生する、実施形態２０１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
203. 前記配列番号７の９９位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からグリシンへの置換である、実施形態２０２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
204. 前記配列番号７の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の１４５位に相当する位置の突然変異が、バリンからグルタミン酸への置換である、実施形態２０２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
205. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ１６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態１７３〜２０４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
206. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号９の６位もしくは３３位のうちの１つ又は２つで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲを配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位又は３３位に相当する位置で発生する、実施形態２０５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
207. 前記配列番号９の６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位に相当する位置の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換であり、あるいは前記配列番号９の３３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の３３位に相当する位置の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である、実施形態２０６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
208. 前記非ヒト細胞が、哺乳類細胞である、実施形態１６６〜２０７のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
209. 前記非ヒト細胞が、サルの細胞である、実施形態１６６〜２０７のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
210. 前記サルの細胞が、Ｖｅｒｏ細胞株由来である、実施形態２０９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
211. 前記Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される、実施形態２１０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
212. 前記１つ以上の抗原が、非ヒト細胞を培養することにより作製された、実施形態１６６〜２１１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
213. 前記細胞が、無血清培地中で培養された、実施形態２１２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
214. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、不活化全粒子ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物、又は弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、実施形態１６６〜２１３のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
215. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬと組み合わせたホルマリンを用いて不活化されていた、実施形態１６６〜２１４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
216. 前記ＢＰＬにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態２１５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
217. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態２１６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
218. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態２１７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
219. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態２１６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
220. 前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、実施形態２１９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
221. 有効濃度の洗剤をさらに含む、実施形態１６６〜２１５のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
222. 前記洗剤が、ポリソルベート［８０］を含む、実施形態２２１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
223. 前記有効濃度が、約０．００１％〜約０．０１％の範囲である、実施形態２２２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
224. アジュバントをさらに含む、実施形態１６６〜２２３のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
225. 前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、実施形態２２４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
226. 前記アジュバントが、アルミニウム塩である、実施形態２２５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
227. 前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される、実施形態２２５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
228. 前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アジュバントに吸着されている、実施形態２２６又は実施形態２２７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
229. 前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）及びその誘導体である、実施形態２２５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
230. その必要のある対象の手足口病を治療又は予防する方法であって、実施形態１６６〜２２９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
231. その必要のある対象において免疫反応を誘導する方法であって、実施形態１６６〜２２９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の免疫原性量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
232. 前記投与が、前記対象に防御的免疫反応を誘導する、実施形態２３０又は実施形態２３１に記載の方法。
233. 前記免疫反応が、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態２３２に記載の方法。
234. 前記免疫反応が、Ｂ４、Ｃ２、Ｃ４及びＣ５から選択されるＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態２３２に記載の方法。
235. 前記投与が、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口送達、口腔送達、鼻内送達、頬側送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、及び頭蓋内送達からなる群から選択される実施形態２３０〜２３４のいずれか１つに記載の方法。
236. 前記投与が、１つ以上の投与を含む、実施形態２３０〜２３５のいずれか１つに記載の方法。
237. 手足口病のウイルス調製物を不活化する方法であって、
（ａ）１つ以上の非ヒト細胞から手足口病ウイルス調製物を単離することであって、前記細胞は前記ウイルス調製物を作製するために使用されていること、
（ｂ）ホルマリンの有効量を用いて前記ウイルス調製物を処置すること、及び
（ｃ）前記ホルマリンから前記ウイルス調製物を精製することであって、前記ウイルスはＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、 を含む前記方法。

238. 前記不活化されたウイルス調製物が、１つ以上の改変を含む、実施形態２３７に記載の方法。
239. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態２３８に記載の方法。
240. 前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含む、実施形態２３８に記載の方法。
241. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、ホルマリンをさらに含む、実施形態２３７〜２４０のいずれか１つに記載の方法。
242. ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原とアルミニウム塩アジュバントを含む手足口病のワクチンであって、前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着されている、前記ワクチン。
243. ヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原とアルミニウム塩アジュバントを含む手足口病の免疫原性組成物であって、前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着されている、前記免疫原性組成物。
244. 前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される、実施形態２４２又は実施形態２４３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
245. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
246. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６を含む、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
247. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、及びＣＡ６を含む、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
248. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、及びＣＡ１６を含む、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
249. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＣＡ６、及びＣＡ１６を含む、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
250. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１である、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
251. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１、ＣＡ６、ＣＡ１６、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、実施形態２４２〜２４４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
252. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１由来である、実施形態２５１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
253. 前記１つ以上の抗原が、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２４２〜２５２のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
254. 前記１つ以上の抗原が、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含み、前記ＶＰ１ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
255. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号１の７位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置で発生するか、又は、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７、１４、１４５もしくは２８２位に相当する位置のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態２５４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
256. 前記配列番号１の７位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の７位に相当する位置の突然変異が、バリンからメチオニンへの置換である、実施形態２５５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
257. 前記配列番号１の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である、実施形態２５５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
258. 前記配列番号１の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の１４５位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換である、実施形態２５５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
259. 前記配列番号１の２８２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させた場合には、配列番号１の２８２位に相当する位置の突然変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、実施形態２５５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
260. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ１ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２５９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
261. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６、９０、９６、又は２６８位に相当する位置のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで発生する、実施形態２６０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
262. 前記配列番号２の４６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の４６位に相当する位置の突然変異が、アラニンからバリンへの置換である、実施形態２６１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
263. 前記配列番号２の９０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９０位に相当する位置の突然変異が、グルタミン酸からリシンへの置換である、実施形態２６１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
264. 前記配列番号２の９６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の９６位に相当する位置の突然変異が、スレオニンからアラニンへの置換である、実施形態２６１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
265. 前記配列番号２の２６８位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２に対して整列させた場合には、配列番号２の２６８位に相当する位置の突然変異が、バリンからイソロイシンへの置換である、実施形態２６１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
266. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ２ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２６５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
267. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号３の１４４位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置で発生する、実施形態２６６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
268. 前記配列番号３の１４４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３に対して整列させた場合には、配列番号３の１４４位に相当する位置の突然変異が、グルタミンからリシンへの置換である、実施形態２６７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
269. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチドを含有し、前記ＶＰ３ポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２６８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
270. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号４の１０２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置で発生する、実施形態２６９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
271. 前記配列番号４の１０２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４に対して整列させた場合には、配列番号４の１０２位に相当する位置の突然変異が、イソロイシンからバリンへの置換である、実施形態２７０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
272. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２７１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
273. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲが配列番号８に対して整列された場合には、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、又は４０位に相当する位置で発生する、実施形態２７２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
274. 前記配列番号８の１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１３位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の１４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１４位に相当する位置の突然変異が、チミンからグアニンへの置換であり、前記配列番号８の１５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１５位に相当する位置の突然変異が、グアニンからシトシンへの置換であり、前記配列番号８の１６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の１６位に相当する位置の突然変異が、グアニンからアデニンへの置換であり、前記配列番号８の２１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２１位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の２３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の２３位に相当する位置の突然変異が、シトシンからチミンへの置換であり、前記配列番号８の３４位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の３４位に相当する位置の突然変異が、グアニンからチミンへの置換であり、あるいは前記配列番号８の４０位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号８の４０位に相当する位置の突然変異が、シトシンからグアニンへの置換である、実施形態２７３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
275. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の２Ａポリペプチドを含有し、前記２Ａポリペプチドが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２７４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
276. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号５の２位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置で発生する、実施形態２７５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
277. 前記配列番号５の２位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５に対して整列させた場合には、配列番号５の２位に相当する位置の突然変異が、リシンからグルタミン酸への置換である、実施形態２７６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
278. 前記１つ以上の抗原がＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチドを含み、前記ＶＰ２ポリペプチドが少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２７７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
279. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号６の１６１位で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置で発生する、実施形態２７８に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
280. 前記配列番号６の１６１位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６に対して整列させた場合には、配列番号６の１６１位に相当する位置の突然変異が、メチオニンからスレオニンへの置換である、実施形態２７９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
281. ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド中に少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異をさらに含む、実施形態２７５〜２８０のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
282. 前記少なくとも１つの追加の非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号７の９９位もしくは１４５位のうちの１つ以上または両方で発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位又は１４５位に相当する位置で発生する、実施形態２８１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
283. 前記配列番号７の９９位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の９９位に相当する位置の突然変異が、アスパラギン酸からグリシンへの置換である、実施形態２８２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
284. 前記配列番号７の１４５位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７に対して整列させた場合には、配列番号７の１４５位に相当する位置の突然変異が、バリンからグルタミン酸への置換である、実施形態２８２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
285. 前記１つ以上の抗原が、ＣＡ１６の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、前記ＣＡ１６の５’ＵＴＲが、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含む、実施形態２５３〜２８４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
286. 前記少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異が、配列番号９の６位もしくは３３位のうちの１つ又は２つで発生するか、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いてＣＡ６の５’ＵＴＲを配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位又は３３位に相当する位置で発生する、実施形態２８５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
287. 前記配列番号９の６位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の６位に相当する位置の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換であり、あるいは前記配列番号９の３３位の突然変異、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８に対して整列させた場合には、配列番号９の３３位に相当する位置の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である、実施形態２８６に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
288. 前記非ヒト細胞が、哺乳類細胞である、実施形態２４２〜２８７のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
289. 前記非ヒト細胞が、サルの細胞である、実施形態２４２〜２８７のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
290. 前記サルの細胞が、Ｖｅｒｏ細胞株由来である、実施形態２８９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
291. 前記Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される、実施形態２９０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
292. 前記１つ以上の抗原が、非ヒト細胞を培養することにより作製された、実施形態２４２〜２９１のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
293. 前記細胞が、無血清培地中で培養された、実施形態２９２に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
294. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、精製抗原ワクチンもしくは免疫原性組成物、サブユニットワクチンもしくは免疫原性組成物、又は弱毒化ウイルスワクチンもしくは免疫原性組成物である、実施形態２４２〜２９３のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
295. 前記少なくとも１つのウイルスが化学的に不活化されていた、実施形態２４２〜２９４のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
296. 前記少なくとも１つのウイルスが、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上を用いて化学的に不活化されていた、実施形態２９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
297. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬを用いて化学的に不活化されていた、実施形態２９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
298. 前記少なくとも１つのウイルスが、ホルマリンを用いて化学的に不活化されていた、実施形態２９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
299. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＰＬ及びホルマリンの組み合わせを用いて化学的に不活化されていた、実施形態２９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
300. 前記ＢＰＬにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態２９６、２９７、又は２９９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
301. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態３００に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
302. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態３０１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
303. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態３００に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
304. 前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、実施形態３０３に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
305. 前記ホルマリンにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態２９６、２９８、又は２９９のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
306. 前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含む、実施形態３０５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
307. 前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含む、実施形態３０５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
308. 前記ワクチン又は免疫原性組成物が、ホルマリンをさらに含む、実施形態３０５〜３０７のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
309. 前記少なくとも１つのウイルスが、ＢＥＩで化学的に不活化されていた、実施形態２９５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
310. 前記ＢＥＩにより不活化された少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含む、実施形態２９６又は実施形態３０９に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
311. 前記１つ以上の改変が、改変核酸を含む、実施形態３１０に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
312. 前記改変核酸が、アルキル化核酸である、実施形態３１１に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
313. 未反応ＢＥＩが、チオ硫酸ナトリウムを用いて加水分解された、実施形態３０９〜３１２のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
314. 有効濃度の洗剤をさらに含む、実施形態２４２〜３１３のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
315. 前記洗剤が、ポリソルベート［８０］を含む、実施形態３１４に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
316. 前記有効濃度が、約０．００１％〜約０．０１％の範囲である、実施形態３１５に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
317. 少なくとも１つの追加アジュバントをさらに含む、実施形態２４２〜３１６のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物。
318. 前記少なくとも１つの追加アジュバントが、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、実施形態３１７に記載のワクチン又は免疫原性組成物。
319. その必要のある対象の手足口病を治療又は予防する方法であって、実施形態２４２〜３１８のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
320. その必要のある対象において免疫反応を誘導する方法であって、実施形態２４２〜３１８のいずれか１つに記載のワクチン又は免疫原性組成物の免疫原性量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
321. 前記投与が、前記対象に防御的免疫反応を誘導する、実施形態３１９又は実施形態３２０に記載の方法。
322. 前記免疫反応が、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態３２１に記載の方法。
323. 前記免疫反応が、Ｂ４、Ｃ２、Ｃ４及びＣ５から選択されるＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を含む、実施形態３２１に記載の方法。
324. 前記投与が、皮下送達、経皮送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口送達、口腔送達、鼻内送達、頬側送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、及び頭蓋内送達からなる群から選択される実施形態３１９〜３２３のいずれか１つに記載の方法。
325. 前記投与が、１つ以上の投与を含む、実施形態３１９〜３２４のいずれか１つに記載の方法。
326. 手足口病のアジュバント化ワクチンを作製する方法であって、
（ａ）アルミニウム塩アジュバントと、ワクチンを混合することであって、前記ワクチンはヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含み、及び
（ｂ）約１６時間〜約２４時間の範囲の期間、適切な条件下で前記混合物をインキュベートすることであって、
前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着しており、及び
前記手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択されること、を含む前記方法。
327. 手足口病のアジュバント化免疫原性組成物を作製する方法であって、
（ａ）アルミニウム塩アジュバントと、免疫原性組成物を混合することであって、前記免疫原性組成物はヒトに手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含み、及び
（ｂ）約１６時間〜約２４時間の範囲の期間、適切な条件下で前記混合物をインキュベートすることであって、
前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着しており、及び
前記手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される、前記方法。
328. 前記混合物が、約２℃〜約８℃の範囲の温度でインキュベートされる、実施形態３２６又は実施形態３２７に記載の方法。
329. 前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される、実施形態３２６〜３２８のいずれか１つに記載の方法。
本開示は、以下の実施例を参照することにより、さらに充分に理解される。しかしながら、これら実施例は本開示の任意の態様又は範囲を限定するとは決して見なされるべきではない。
実施例
実施例１ Ｖｅｒｏ細胞におけるＥＶ７１の適応
エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）を、２ラウンドのＶｅｒｏ細胞における全粒子ウイルスゲノムＲＮＡの抽出及びトランスフェクションに供し、次いで２ラウンドのプラーク精製を行い、以下に記載されるサブジェノグループＢ２ ＥＶ７１の新規な適応株を得た。ウイルスゲノムの配列解析により、ＶＰ１ポリペプチドにおいて４つの適応突然変異を特定した。適応ウイルスを用いてプレマスターウイルス種（ｐｒｅ−ＭＶＳ：ｐｒｅ−Ｍａｓｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｅｄ）を作製し、ＥＶ７１ワクチン製造に引き続き使用した。
ウイルス株の源
適応ウイルスの作製に用いたＥＶ７１／７４２３／ＭＳ／８７株ウイルス種は、Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、シンガポールから得た。［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 Ｕ２２５２２］
Ｖｅｒｏ細胞株
ＥＶ７１／７４２３／ＭＳ／８７株の適応及びウイルス産生に用いたＶｅｒｏ細胞株は、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１Ｖｅｒｏ細胞株から誘導された、Ｖｅｒｏ細胞株ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７から誘導された。
トランスフェクション及びプラーク精製
Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、シンガポールから得たＥＶ７１ウイルス種を用いて、Ｔ２５フラスコ中、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）において増殖させたＶｅｒｏ細胞の８０％コンフルエント単層に感染させた。ＥＶ７１の増殖に関与するすべての手順で用いられたＦＢＳは、原材料由来の伝達性海綿状脳症リスクを最小化するために、オーストラリア原産のものから得た。１．５時間の吸着後、ウイルス上清を吸引し、２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地を加えた。感染後３日目及び６日目、細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたときにウイルス上清を採取した。６日目のウイルス採取物は、同様の手順を用いてＶｅｒｏ細胞中でさらに増幅された（４回の追加の継代）。
ＥＶ７１ウイルスの回収及びＲＮＡトランスフェクションのために、Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキットを用いてウイルスＲＮＡが抽出された。ＳＶＣＲ００５９由来のＶｅｒｏ細胞を１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中で増殖させ、５ｘ１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、３６±１℃で１日インキュベートした。このインキュベーションの後、各ウェルの細胞を、＞９０％コンフルエンシーまで増殖させた。ＥＶ７１全ゲノムＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトした。およそ３時間後にＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、２．５ｍＬのＭＥＭ（無血清）を各ウェルに添加した。トランスフェクション後４日目に、ＣＰＥを観察し、細胞及びウイルス上清を採取し、１時間、≦−６０℃で凍結させ、次いで解凍した。サンプルを遠心し、継代１（ＰＮ１）ウイルス上清のストックを分注し、次に使用するまで≦−６０℃で保存した。ＰＮ１ストックを使用してＲＮＡの抽出とトランスフェクションの手順を繰り返し、ＰＮ２のウイルスストックを作製した。
Ｖｅｒｏ細胞単層上に重ねたニュートラルレッド染色Ｓｅａプラークアガロースを用いて、６ウェルプレート中でプラーク精製を行った。ＰＮ２ウイルスのストックを用いて、４つのウェル単離プラーク（ＰＮ３）を作製し、それらを個々にＶｅｒｏ細胞中で増幅させた。細胞とウイルスを含有する、増幅させた個々の採取物を各々凍結融解処置及びベンゾナーゼ処置に供し、その後に遠心して、ウイルス含有上清を分離させ（ＰＮ４）、≦−６０℃で保存した。ＰＮ４ウイルスストックの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）力価をＶｅｒｏ細胞で決定した。
最も高い力価を有する２つのウイルスストックを、同じ手順を用いて再度プラーク精製し、ＰＮ６ウイルスストックとして保存した。このプラーク精製の第二ラウンドを行った後、最も高いＴＣＩＤ５０力価を産出したウイルスのクローン集団を、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１での、Ｖｅｒｏ細胞中でのさらなる増幅に選択した。感染後４日目、細胞は９０％のＣＰＥを示し、採取され、１回の凍結融解サイクルに供された。遠心した後、ウイルスストック（ＰＮ７）を含有する上清を回収し、≦−６０℃で保存した。プレ−ＭＶＳの産生のために、ＰＮ７のウイルスストックを用いて、２列の細胞ファクトリー（ｔｗｏ−ｔｉｅｒ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）（１，２６４ｃｍ２の表面積）中、０．１のＭＯＩで、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた。感染後３日目、培養物にＣＰＥを観察した。感染培養物を、同じ凍結融解サイクル、及び上述の遠心に供し、その後、ウイルス上清を４０ｘ５ｍＬと１２６ｘ１．５ｍＬの分注物に分配し、≦−６０℃で保存した。このＰＮ８ウイルスストックを適応ＥＶ７１と指定し、引き続きプレ−ＭＶＳとして用いた。
適応ＥＶ７１の配列解析
ＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社 カタログ番号５２９０４）を、メーカーの説明書に従い用いて、適応ＥＶ７１（ＰＮ８）からウイルスＲＮＡを単離した。２つの逆転写反応と、逆転写酵素を欠いた対照反応を、ＲＮＡランダムプライマーを用いて行った。次いで得られたｃＤＮＡ産物を、参照配列ＥＶ７１／７４２３／ＭＳ／８７株［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２２５２２］を基にして設計されたプライマー対を用いたＰＣＲ増幅において鋳型として使用した。アガロースゲル電気泳動により増幅産物を可視化し、メーカーの説明書に従い、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ ＰＣＲ産物クリーンアップキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号ＵＳ７８２００）を用いて精製した。次いで、ＰＣＲ増幅産物を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号４３３７４５１）を用いて配列解析し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて配列を検出した。作製された配列データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．９を用いて連続配列へとアセンブリされた。最小の４倍カバレッジ（ｆｏｕｒ−ｆｏｌｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）は、数個の短い内部配列の一方向性の４倍カバレッジと、配列の５’末端と３’末端を除き、ウイルス配列に対する各ＤＮＡ鎖の２倍カバーで得られた。適応ＥＶ７１の完全ヌクレオチド配列は、ＢｉｏＯｕｔｓｏｕｒｃｅへの再委託として、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社により決定された。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社により決定されたＥＶ７１ ＭＶＳのコンセンサスヌクレオチド配列を提示する。
ＶＰ１遺伝子の配列解析に基づいたジェノグループ化により、適応ＥＶ７１株がＢ２サブジェノグループと分類されることが明らかとなった。ＶＰ１の遺伝子配列のＭＳ／７４２３／８７株との比較から、１２ヌクレオチドの差異が明らかとなった。これらのうち、８つの差異はサイレントであり、４つの改変は、ＶＰ１に４つのアミノ酸の差異を生じさせた。この４つのアミノ酸の置換、及び配列番号１の中でのそれらの各々の位置を以下の表１に示す。
表１ ＥＶ７１の全長ゲノムの配列解析 P-0 vs P-8
実施例２ ワクチンの製造及び製剤化
実施例１で作製された適応ＥＶ７１ウイルスを、手足口病不活化ワクチンの製造に使用した。ワクチンを製造するために、ウイルスをＶｅｒｏ細胞中で増殖させ、採取し、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を用いて不活化させた。次いで、非感染性不活化ウイルス粒子を精製し、水酸化アルミニウムとともに製剤化した。
マスター細胞バンク及びマスターウイルス種の調製
Ｖｅｒｏマスター細胞バンク（ＭＣＢ：Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）の調製
ＡＴＣＣから得たＶｅｒｏ（ＷＨＯ）１０−８７細胞種のストックの１本のバイアルを３７±１℃で急速に解凍し、遠心し、Ｔ１５０フラスコ中に播種する前に、Ｌ−グルタミン添加（ＤＧＥＭ）１０％ＦＢＳ添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁した（ＰＮ１３５と指定）。このフラスコを、５±０．５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーターにおいて、３６±１℃でインキュベートした。４日目、細胞がコンフルエンシーに達したときに、Ｖｅｒｏ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を用いてフラスコから遊離させ、５つのＴ２２５フラスコ（ＰＮ １３６）へと分割した。コンフルエントな単層が形成された後、フラスコをインキュベーターから取り出し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を用いて細胞を遊離させ、６，３２０ｃｍ２の表面積の１つの１０列細胞ファクトリー（１０−ｔｉｅｒ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）（ＣＦ１０）へと分割させた（ＰＮ１３７）。４つのＣＦ１０へと播種された細胞を用いて、同様の方法でもう１回継代が行われた（ＰＮ１３８）。
４つのＣＦ１０からのＶｅｒｏ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を用いて遊離させ、採取した。細胞数が計測され、凍結培地（ＤＭＥＭ＋２０％ ＦＢＳ＋２０％ ＤＭＳＯ）を添加して細胞濃度を１．０ｘ１０７細胞／ｍｌに調節した。細胞を、１バイアル当たり１ｍＬの体積で２２４本のバイアルに分注し、これをＭＣＢと指定した。
適応ＥＶ７１マスターウイルス種の調製
ＰＮ１３８のＭＣＢの１本のバイアルからのＶｅｒｏ細胞を解凍し、遠心して、ＤＧＥＭを含有する２つのＴ２５フラスコへ播種するために用いた（ＰＮ１３９）。５±１％ＣＯ２雰囲気下、３７±１℃で５日間インキュベーションを行った後、細胞単層を１つのＴ２２５フラスコへと継代した（ＰＮ１４０）。この継代と、すべての次の細胞継代のために、細胞単層をＣａとＭｇを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液で処置し、次いで、新鮮なＤＧＥＭを添加し、５±１％ＣＯ２雰囲気下、３７±１℃でインキュベートした。３日間のインキュベーションの後、１つのＴ１５０フラスコと８つのＴ２２５フラスコへと細胞に２度目の継代を行った（ＰＮ１４１）。３日間のインキュベーションの後、１つの２列細胞ファクトリー（ＣＦ２、１，２６４ｃｍ２の表面積）へと３度目の継代を行った（ＰＮ１４２）。４日間のインキュベーションの後、１つのＴ２２５フラスコと２つの１０列細胞ファクトリー（ＣＦ１０、６，３２０ｃｍ２の表面積）へと細胞に４度目の継代を行った（ＰＮ１４３）。
Ｔ２２５フラスコと２つのＣＦ１０を３日間インキュベートし、単層がおおよそ９０〜１００％コンフルエントとなった。１つのＴ２２５フラスコからの細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を用いて処置することにより遊離させ、計数し、ＣＦ１０でのｃｍ２表面積当たりのおよその細胞密度を決定した。各細胞ファクトリーの単層をＣａとＭｇを含まないＤＰＢＳで洗浄し、残留増殖培地をすべて除去した。ＣＦ１０の感染のために、Ｌ−グルタミンが添加された１Ｌの新鮮な無血清ＤＭＥＭを各々が含有する瓶２本分の感染培地が調製された。実施例１からの適応ＥＶ７１プレＭＶＳのバイアル２本を解凍し、０．９５ｍＬを、感染培地の２本の瓶の各々に加え、およそ０．０５のＭＯＩとした。メーカーの説明書に従い、２つのＣＦ１０に感染培地を加えた。感染ＣＦ１０を、５±１％ＣＯ２雰囲気下、３７±１℃でインキュベートした。３日間のインキュベーションの後、ＣＦ１０をインキュベーターから取り出し、感染培養上清を採取、プールし、４つの遠心管に分配した。粗採取物質を１，４２４ｘｇで１０分間遠心し、上清を集め、５±３℃で一時的に保存した。各細胞ペレットを１００ｍＬのＤＭＥＭに再懸濁し、３回の凍結融解サイクルへと供し、次いで１，４２４ｘｇで１０分間、遠心した。これら上清を集め、最初の遠心工程からの上清と一緒にプールした。次いで、公称０．２２μｍの孔サイズのｍｉｌｌｉｐａｋ１００フィルターアセンブリを通して溶液をろ過し、ろ液を集めた。このバルクＭＶＳ溶液を、１バイアル当たり４ｍＬの体積で、５０６クライオバイアル（５ｍＬ）へと分注した。すべてのバイアルは、Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国のＳＡＦＣにて、≦−６０℃に制御された保管場所へと移した。
ワクチンの製造
工程１：Ｖｅｒｏ細胞の開始
ＰＮ１３８の、ＶＥＲＯ ＭＣＢ（ＬＮ１７３−０９００１）のバイアル１本を、少量の氷が残るまで、一定に回転させながら３７±３℃で急速に解凍した。次いでバイアルを水槽から取り出し、完全に解凍するまでそのままにして、内容物を、９ｍＬのＤＧＥＭを含有する滅菌済ディスポーザブルの１５ｍＬ遠心管へと直接加えた。２００ｘｇで５分間、１８±３℃で細胞を遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを２．０ｍＬのＤＧＥＭに再懸濁した。再懸濁細胞の全量を、１５ｍＬのＤＧＥＭを含有するＴ７５フラスコへと加え、このフラスコを５±２％ＣＯ２インキュベーター中、３７±２℃でインキュベートした。
工程２：培地交換
３〜４日間のインキュベーションの後、培地交換を行った。細胞培養培地を吸引して取り除き、１５ｍＬの新鮮なＤＧＥＭをＴ７５フラスコに加えた。
工程３：１回目の細胞継代
Ｔ７５フラスコを、単層形成に関して観察した。単層がおよそ８０〜１００％コンフルエントになった時点で（典型的には６日目）、使用済みの培地を吸引し、細胞をＣａとＭｇを含まない１０ｍＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、細胞残渣を除去した。ＤＰＢＳを除去した後、３ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を加えることにより細胞を遊離させ、フラスコを前後に振とうさせて、溶液を分散させた。フラスコを３７±１℃で４±２分間、インキュベートし、その後、フラスコを穏やかにタッピングして細胞を懸濁させた。９ｍＬの新鮮なＤＧＥＭをフラスコに加え、細胞塊がすべて壊れるよう、細胞を粉砕した。全体積（およそ１２ｍＬ）を１５ｍＬのコニカル遠心管へと加え、２００ｘｇで５分間、１６±２℃で遠心した。上清を吸引し、細胞ペレットを注意深く２ｍＬのＤＧＥＭ中に再懸濁した。細胞数カウントと、生存度決定のために、細胞懸濁液のサンプルを採取した。細胞数に基づき、最大量の細胞懸濁液を用いて、１５、３５、又は４５ｍＬのＤＧＥＭを各々含有する適切な数のＴ７５フラスコ、Ｔ１７５フラスコ及びＴ２２５フラスコへとおよそ１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。このフラスコを、５±２％ＣＯ２インキュベーター中、３７±２℃でコンフルエントまでインキュベートした（典型的には３日）。
工程４：２回目の細胞継代
工程３からの組織培養フラスコを、単層形成に関して観察した。単層がおよそ８０〜１００％コンフルエントになった時点で（典型的には９日目）、使用済みの培地を吸引し、細胞を適量のＤＰＢＳ（Ｔ７５フラスコには１０ｍＬ、Ｔ１７５フラスコとＴ２２５フラスコには各々２０ｍＬ）で洗浄した。ＤＰＢＳを除去した後、適量のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液（Ｔ７５フラスコには５ｍＬ、Ｔ１７５フラスコとＴ２２５フラスコには各々７ｍＬ）を加えることにより細胞を遊離させ、フラスコを前後に振とうさせて、溶液を分散させた。フラスコを３７±１℃で４±２分間、インキュベートし、その後、フラスコを穏やかにタッピングして細胞を懸濁させた。大きさに関係なく１２ｍＬのＤＧＥＭを各フラスコに加え、細胞塊がすべて壊れるよう、細胞を粉砕した。細胞懸濁液を滅菌済ディスポーザブルの５０ｍＬ遠心管にプールし、２００ｘｇで５分間、１６±２℃で遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを３．０ｍＬのＤＧＥＭに再懸濁した。細胞数カウントと、生存度決定のために、細胞懸濁液のサンプルを採取した。細胞数に基づいて、適量の細胞懸濁液を用いて、４５ｍＬの新鮮なＤＧＥＭを各々含有する８〜１０個のＴ２２５フラスコへと、およそ１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。このフラスコを、５±２％ＣＯ２インキュベーター中、３７±２℃でコンフルエントまでインキュベートした（典型的には３日）。
工程５：３回目の細胞継代
８〜１０個のＴ２２５フラスコを、単層形成に関して観察した。単層がおよそ８０〜１００％コンフルエントになった時点で（典型的には１２日目）、使用済みの培地を吸引し、各フラスコの細胞を２０ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した。ＤＰＢＳを除去した後、７．０ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を各フラスコに加えることにより細胞を遊離させ、３７±２℃で４±２分間、インキュベートし、その後、フラスコを穏やかにタッピングして細胞を懸濁させた。２８ｍＬのＤＧＥＭを各フラスコに加え、細胞塊がすべて壊れるよう、細胞を粉砕した。細胞懸濁液を５００ｍＬ滅菌済遠心瓶にプールし、２００ｘｇで５分間、１６±２℃で遠心した。上清を吸引し、細胞ペレットを１０ｍＬのＤＧＥＭに再懸濁し、懸濁液を滅菌済ディスポーザブルの５０ｍＬ試験管へと移した。５００ｍＬの遠心瓶を、２０ｍＬのＤＧＥＭを用いてすすぎ、洗液を上述の５０ｍＬ試験管に加えた。細胞数カウントと、生存度決定のために、細胞懸濁液を穏やかに混合させ、サンプルを採取した。細胞数に基づいて、適量の細胞懸濁液を用いて、２つの１０列細胞ファクトリー（ＣＦ１０、６，３２０ｃｍ２表面積）へ、およそ１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。各ＣＦ１０に対し、２，０００ｍＬの新鮮なＤＧＥＭを含有する５ＬのＳｔｅｄｉｍバッグの注入ポートを通して、適量の細胞懸濁液を無菌状態下で添加した。このバッグを穏やかに混合させ、メーカーの説明書に従い、内容物をＣＦ１０へ無菌状態下で移した。このＣＦ１０を、５±１％ＣＯ２インキュベーター中、３７±２℃でコンフルエントまでインキュベートした（典型的には４日）。
工程６：４回目の細胞継代
２つのＣＦ１０を、単層形成に関して観察した。単層がおよそ８０〜１００％コンフルエントになった時点で（典型的には１６日目）、以下の様に各ＣＦ１０から細胞を逐次的に取り出した：使用済みの培地を第一のＣＦ１０から除去し、細胞を４００ｍＬのＤＰＢＳを用いてメーカーの説明書に従い、洗浄した。ＤＰＢＳを除去した後、１５０ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を第一のＣＦ１０に加えることにより細胞を遊離させた。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）溶液を各トレイの表面全体にむらなく広げ、０．５〜１分後、余分な溶液を取り出した。ＣＦ１０を３７±２℃で４±１分間インキュベートし、細胞剥離を促進させた。このインキュベーション時間後、細胞剥離をモニターするために位相差顕微鏡で細胞を観察した。メーカーの説明書に従い３００ｍＬのＤＧＥＭを第一のＣＦ１０に加え、各トレイの表面全体にむらなく広げた。この時点で第一のＣＦ１０を置いておき、第二のＣＦ１０を同じように処理した。両方のＣＦ１０からの細胞懸濁液を滅菌済ディスポーザブルの２Ｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコへとプールし、穏やかに混合させた。プールされた細胞懸濁液を無菌状態下で２つの５００ｍＬ遠心瓶へと移し、２００ｘｇで５分間、１６±２℃で遠心した。上清を吸引し、各細胞ペレットを４０．０ｍＬのＤＧＥＭ中に再懸濁し、プールした。プールされた細胞懸濁液を穏やかに混合させ、細胞数カウントと生存度決定のためにサンプルを採取した。細胞数に基づいて、適量の細胞懸濁液を用いて、１０個のＣＦ１０へ、およそ１ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。各ＣＦ１０に対し、２，０００ｍＬの新鮮なＤＧＥＭを含有する５ＬのＳｔｅｄｉｍバッグの注入ポートを通して適量の細胞懸濁液を無菌状態下で添加した。このバッグを穏やかに混合させ、メーカーの説明書に従い、内容物をＣＦ１０へ無菌状態下で移した。このＣＦ１０を、５±１％ＣＯ２インキュベーター中、３７±２℃でコンフルエントまでインキュベートした（典型的には４日）。
工程７：細胞の感染
予定された感染を行う前日（典型的には、１９日目）、感染用培地を前もって温めておくため、各々２，０００ｍＬの無血清ＤＭＥＭを含有する１０個の５Ｌ Ｓｔｅｄｉｍバッグを、３７±２℃でインキュベートした。単層がおよそ９０〜１００％コンフルエントになった感染の当日（典型的には、２０日目）、ＥＶ７１ ＭＶＳ（ＬＮ１７３−１０００１）の２本のバイアルを３７±２℃の水槽中で急速に解凍し、各Ｓｔｅｄｉｍバッグの注入ポートを通して０．６ｍＬのＭＶＳを加え、およそ０．０３のＭＯＩとした。このＭＯＩは、平均細胞密度が２ｘ１０５細胞／ｃｍ２であり、ＥＶ７１ ＭＶＳのウイルス力価が３．４ｘ１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍＬであるという仮定に基づき算出された。各ＣＦ１０に対し、使用済培地を除去し、上述の工程６に記載されているように４００ｍＬのＤＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。ＣＦ１０のメーカーの説明書に従い、上述のウイルス含有無血清ＤＭＥＭ調製物２，０００ｍＬのうちの１つを添加することにより、各ＣＦ１０を感染させた。感染ＣＦ１０は、１００％ＣＰＥが観察されるまで、５±１％ＣＯ２インキュベーター中、３７±２℃でインキュベートされた（典型的には４日）。
工程８：ウイルス採取物
ウイルス感染期間の最後（典型的には２４日目）に、各細胞ファクトリーを位相差顕微鏡で観察して１００％ＣＰＥを確認した。ＣＦ１０のメーカーの説明書に従い、１０個のＣＦ１０からの上清を無菌状態下で集め、Ｓｔｅｄｉｍ ２０Ｌ Ｆｌｅｘｂｏｙバッグ中にプールした。これが粗ウイルス採取物となる。
工程９：ベンゾナーゼ処置
適切な量の２５０，０００Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ溶液と、１Ｍ ＭｇＣｌ２溶液を、粗ウイルス採取物を含有する２０Ｌ Ｓｔｅｄｉｍバッグの注入ポートを通して無菌状態下で添加し、それぞれ最終濃度２０Ｕ／ｍｌ及び２ｍＭを得た。バッグの内容物を混合し、次いで１８〜２４時間、３７±１℃でインキュベートした。
工程１０：ウイルス不活化
ＢＥＩ不活化溶液は、３００ｍＬの１７５ｍＭ ＮａＯＨに６．２ｇの２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）を加え、水槽にて３７±１℃でインキュベートすることにより、使用直前に調製された。ＢＥＡが溶解したら、ｐＨが、ｐＨ８〜９の範囲内に収まるまで、ＢＥＩ溶液のｐＨ値を慣例通りに確認した。ｐＨ値がこの範囲にあるＢＥＩ溶液を用いて、ベンゾナーゼ処置粗ウイルス採取物を含有する２０Ｌバッグへとこの溶液を、蠕動ポンプを使用し、０．２μｍのフィルターカプセルを通して直接ポンプ注入することにより、６０分以内の不活化を行った ＢＥＩ粗ウイルス採取物は少なくとも５分間、手で混合し、次いで、さらに混合させるため、このＢＥＩ粗採取物溶液を新たな２０Ｌ Ｓｔｅｄｉｍ Ｆｌｅｘｂｏｙバッグへとポンプ注入した。このＢＥＩ粗ウイルス採取物を少なくとも５分間、再度手で混合し、次いで６〜７時間、３７±１℃でインキュベートした。
工程１１：ＢＥＩの中和
残留ＢＥＩを、３２ｍＭのチオ硫酸ナトリウム１Ｌを添加することにより加水分解した。ＢＥＩ処置粗採取物を含有するＦｌｅｘｂｏｙバッグを、Ｙコネクターを用いて３２ｍｍ チオ硫酸ナトリウムを１Ｌ含有するバッグと並行に接続した。Ｙコネクター下流の管類中に、インライン静的ミキサーが備えられた。ＢＥＩ処置粗採取物と３２ｍＭのチオ硫酸ナトリウム溶液を静的ミキサーを介してそれぞれ１Ｌ／分及び５０ｍＬ／分でＹコネクターへと同時にポンプ注入し、新たなＦｌｅｘｂｏｙバッグへと集めた。次いで、不活化され、中和された粗採取物を以下に記載されるようにただちに浄化した。
工程１２：浄化
ベンゾナーゼ処置が行われ、不活化され、中和されたウイルスプールは、４ステージのろ過アセンブリを用いて浄化された。このアセンブリは、Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２フィルターカプセルと直列であり、及び上流にあるＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｌｅａｎ ＧＦフィルターカプセルからなる。最初の２つのろ過ステージは、公称３．０μｍ及び公称０．８μｍの酢酸セルロースフィルターを備えたＳａｒｔｏｃｌｅａｎ ＧＦカプセル中に配置された。３番目と４番目のステージは、公称０．４５μｍ及び公称０．２μｍのポリエーテルスルホン膜フィルターを備えたＳａｒｔｏｐｏｒｅ２フィルターカプセル内に配置された。ウイルスプールはこのろ過アセンブリを通してポンプ注入され、５つの５Ｌ Ｆｌｅｘｂｏｙバッグ中に集められた（各々、約４Ｌ）。最終で５Ｌ Ｆｌｅｘｂｏｙバッグが、ろ過アセンブリの出口に接続され、３ＬのＰＢＳＴをアセンブリを通してポンプ注入し、フィルターを洗浄して、残留不活化ウイルスをすべて集めた。
工程１３：濃縮及び透析ろ過
３つのＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｌｉｃｅディスポーザブル交差流ろ過カセットは各々０．１ｍ２、１００ｋＤａ分子量カットオフのＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜を備えており、並行に接続され、浄化された不活化ウイルスプールを接線流ろ過（ＴＦＦ）を介して体積で１０倍に濃縮した。ＴＦＦの次に、１０体積のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ８０（１０ｍＭ Ｎａ−ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ８０）、ｐＨ７．５を用いて定容透析ろ過が行われた。３００Ｌ／ｍ２／時（ＬＭＨ）の一定流量、及び０．４０〜０．４５バールの膜透過圧（ＴＭＰ）が、実験の間、維持された。等体積の緩衝液を用いてＴＦＦカセットアセンブリを洗浄し、ウイルス採取率を改善した。最終残余濃度は、滅菌された０．４５μｍフィルター及び０．２μｍフィルターを通してろ過を行う前のおよそ５倍であった。ろ過された残余物は、クロマトグラフィー精製を行うまで、最長で７日間、５±３℃で、又は最長で４週間、≦−６０℃で保存された。
工程１４：陰イオン交換クロマトグラフィー
最初の精製工程は、ＥＶ７１を捕捉するためのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ（Ｍｅｒｃｋ社）媒体を備えた陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われ、これは、混入宿主細胞タンパク質およびあらゆる残留宿主核酸を部分的に除去する。この製品開発段階では、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）媒体は、使い捨てを検討され、各生産工程に対する製品専用カラムは再度パッキングされた。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社の７０ｘ５００ｍｍ（ＩＤｘ高さ）ＩＮｄＥＸカラムは、およそ３９０ｍＬのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥクロマトグラフィー媒体でパックされ、およそ１００ｍｍのベッド高を生じさせた。パックされた時点で、カラムに４ｍＬのＡＥＸ試験溶液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）をロードし、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ：ｈｅｉｇｈｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｐｌａｔｅ）及び非対称（Ａｓ：ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）を測定した。もしＨＥＴＰ及びＡｓが、それぞれ＞３，０００段／ｍ及び０．８〜１．８であった場合に、使用を承認した。カラムは、室温、１５０ｃｍ／時の線流速（およそ９６ｍＬ／分）で操作され、カラム溶出物の吸光度は、２１５ｎｍで、２，０００ｍＡＵ範囲に設定されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 ＵＶｉｓ ９２０検出器を用いてモニターされた。カラムは、２カラム体積（ＣＶ）の０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて洗浄され、３〜５ＣＶの結合緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて平衡化され、そして工程１３からのろ過残余物をロードした。このカラムの結合能力は、およそ１．９６ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂であり、サンプルはカラム破過の４０〜８０％でロードされた。工程１３からのろ過残余物は、（もし必要であれば）空気の流入を避けるために流速を低下させてＡＥＸカラム上にロードされた。ろ過残余物がロードされたら、ベースライン吸光度が得られるまで（およそ２〜５ＣＶ）、結合緩衝液でカラムが洗浄された。ＥＶ７１抗原含有材料は、溶出緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いた段階勾配様式（ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ）で溶出された。画分採取は、検出器が１００ｍＡＵを指したときに開始され、吸光度が１００ｍＡＵ未満に低下するまで継続された（およそ２〜４ＣＶ）。工程１３からのろ過残余物の体積サイズ及びタンパク質濃度は、ＡＥＸカラムの寸法と結合能力を併せると、典型的には、すべての材料の処理を完了させるために２サイクルのＡＥＸクロマトグラフィーを必要とした。最初の泳動の最後に、５ＣＶの再生緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いてＡＥＸカラムをストリップし、次いで３〜５ＣＶの結合緩衝液を用いて（ベースライン吸光度が得られるまで）平衡化させ、ろ過残余物の残りをロードした。すべてのＡＥＸ泳動が完了したら、ＥＶ７１含有溶出画分をプールし、５ＣＶの再生緩衝液を用いてカラムをストリップし、２ＣＶの０．５ｍ ＮａＯＨ及び５ＣＶの０．０１Ｍ ＮａＯＨを用いて洗浄して、その後保存した。プールされたＡＥＸ溶出画分は５±３℃で最長で３日保存し、その後に以下に記載されるように陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
工程１５：陽イオン交換クロマトグラフィー
第二の精製工程は、フロースルー画分（複数含む）中の不純物をさらに除去するため、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＳＯ３（Ｍｅｒｃｋ社）を備えた陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われた。この製品開発段階では、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体は使い捨てを検討され、各生産工程に対する製品専用カラムは再度パッキングされた。Ｏｍｎｉｆｉｔ ３５ｘ２５０ｍｍ（ＩＤｘ高さ）ＢｅｎｃｈＭａｒｋカラムは、およそ１００ｍＬのＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＳＯ３クロマトグラフィー媒体でパックされ、およそ１００ｍｍのベッド高を生じさせた。結合緩衝液、溶出緩衝液、再生緩衝液、線流速（１５０ｃｍ／時、およそ２４ｍＬ／分）及びモニタリング条件は、上記の工程１４の陰イオン交換精製に使用されたものと同じであった。パッキングされたら、カラムに０．５ｍＬの再生緩衝液をロードし、ＨＥＴＰ及びＡｓを測定した。もしＨＥＴＰ及びＡｓが、それぞれ＞４，０００段／ｍ及び０．８〜１．８であった場合に、使用を承認した。カラムは、２カラム体積（ＣＶ）の０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて洗浄され、３〜５カラム体積（ＣＶ）の結合緩衝液を用いて平衡化され、そしてサンプルがロードされた。上述の陰イオン交換工程からのＥＶ７１含有溶出画分（２５０ｍＭ ＮａＣｌ）は、塩濃度を低下させるため、ロードされる前に２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５を用いて（およそ３倍に）希釈された。このカラムの結合能力は、２．７ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂であり、希釈ＥＶ７１溶出物は、カラム破過の４０〜８０％でＣＥＸカラム上に（もし必要であれば）空気の流入を避けるために流速を低下させてロードされた。希釈ＡＥＸサンプルがロードされたら、ベースライン吸光度が得られるまで（およそ２〜５ＣＶ）、結合緩衝液でカラムが洗浄された。ＥＶ７１抗原含有材料は、溶出緩衝液を用いて陽イオン交換カラムから溶出された。画分回収は、検出器が５０ｍＡＵを指したときに開始され、吸光度が５０ｍＡＵ未満に低下するまで継続された（およそ３〜５ＣＶ）。工程１４からのプールされたＡＥＸ溶出画分の体積サイズ及びタンパク質濃度は、ＣＥＸカラムの寸法と結合能力を併せると、典型的には、すべての材料の処理を完了させるために２サイクルのＣＥＸクロマトグラフィーを必要とした。最初の泳動の最後に、５ＣＶの再生緩衝液を用いてＣＥＸカラムをストリップし、次いで３〜５ＣＶの結合緩衝液を用いて（ベースライン吸光度が得られるまで）平衡化させ、プールされたＡＥＸ溶出画分の残りをロードした。すべてのＣＥＸ泳動が完了したら、ＥＶ７１含有溶出画分をプールし、５ＣＶの再生緩衝液を用いてカラムをストリップし、２ＣＶの０．５ｍ ＮａＯＨ及び５ＣＶの０．０１Ｍ ＮａＯＨを用いて洗浄して、その後保存した。プールされたＣＥＸ溶出画分は５±３℃で最長で３日保存し、その後以下に記載されるようにサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
工程１６：サイズ排除クロマトグラフィー
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ ＨＲ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）媒体を備えたサイズ排除クロマトグラフィーを、ＥＶ７１抗原精製プロセスの最終仕上工程として使用した。この製品開発段階では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）媒体は使い捨てを検討され、各生産工程に対する製品専用カラムは再度パッキングされた。２つのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 １００ｘ５００ｍｍ（ＩＤｘ高さ）ＢＰＧカラムを、それぞれおよそ２．３５ＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ ＨＲクロマトグラフィー媒体でパッキングし、カラム当たり２５０〜３００ｍｍのベッド高を得た。パッキングしたら、個々のカラムにそれぞれ２５ｍＬのＳＥＣ試験溶液（１０ｍＭ Ｎａ−ＰＯ４、２Ｍ ＮａＣｌ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．５）をロードし、ＨＥＴＰ及びＡｓを測定した。もしＨＥＴＰ及びＡｓが、それぞれ＞４，０００段／ｍ及び０．８〜１．８であった場合に、使用を承認した。２つのカラムは、１ＣＶの０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて個々に洗浄され、３〜５ＣＶの泳動緩衝液（ＰＢＳＴ：１０ｍＭ Ｎａ−ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．５）を用いて平衡化され、次いで、使用のために直列にアセンブリされた。上述の工程１６からのプールされたＣＥＸ溶出画分は、総カラム体積の２．５〜５．０％でＳＥＣカラムアセンブリにロードされ、このカラムを、線流速２４ｃｍ／時（３１．４ｍＬ／分）、室温、均一濃度で操作された。カラム溶出物の吸光度は、２１５ｎｍで、１００ｍＡＵ範囲に設定されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 ＵＶｉｓ ９２０検出器を用いてモニターされた。観察された溶出ピークから各々５０〜１００ｍＬの画分を採取した。画分サイズはクロマトグラムの状況に合わせて調節された。従前の経験から、≧９０％の純度のＥＶ７１画分は、およそ０．４５ ０．６０ＣＶで溶出された。プールされたＣＥＸ溶出画分の体積サイズ、及びカラムの寸法から、典型的には、すべての材料の処理を完了させるためには４サイクルのＳＥＣクロマトグラフィーを必要とした。各サイクルの最後に、３〜５ＣＶの泳動緩衝液を用いて、ベースライン吸光度が得られるまでカラムを再平衡化した。すべてのＳＥＣ泳動が完了した時点で、カラムを１ＣＶの０．５ｍ ＮａＯＨで洗浄し、次いで２ＣＶの０．０１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、その後保存した。個々の画分をＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより分析することにより、≧９０％の純度のＥＶ７１抗原を含有する画分の選択とプールを行った。選択された≧９０％の純度の適応ＥＶ７１ワクチン溶出画分はプールされ、最長で３日、５±３℃で保存され、その後濃縮された。
工程１７：濃縮
濃縮は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｓｌｉｃｅ ２００ホルダーにアセンブリされた、２つの３０ｋＤａ分子量カットオフのＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜カセットを備えたＴＦＦを用いて行われた。処理の間、３００ＬＭＨの一定流が維持され、ＴＭＰは０．４０〜０．４５バールの間を変動した。工程１６から得た選択されたプールＳＥＣ画分中の総タンパク質濃度、及び製剤化の必要条件に依って、濃縮倍数は１０〜４０倍の範囲であった。濃縮された溶液は０．２μｍのフィルターを通してろ過され、最大６か月間、＜−６０℃で、又は最大２週間、５±２℃で保存された。
ワクチン製剤化
工程１：水酸化アルミニウムへの吸着
適切な量の適応ＥＶ７１ワクチン製品を保管庫から取り出し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳプラス０．００２％ Ｔｗｅｅｎ８０）と混合し、水酸化アルミニウムを用いた製剤化のための用量レベル特異的な希釈ワクチン製品を得た。Ｔｗｅｅｎ８０は、ワクチンの凝集を減少させるために添加された。希釈ワクチン製品は、０．２μｍの孔サイズのフィルター（Ｐａｌｌ Ａｃｒｏｐａｋ社）を通して直接、混合容器へとろ過された。１０分の１体積の水酸化アルミニウム滅菌懸濁液（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５）をこの混合容器に加え、内容物を５±３℃、１６〜２４時間、攪拌プレート上で混合した。適応ＥＶ７１ワクチンの調製に使用された水酸化アルミニウムアジュバントは、デンマーク、ＦｒｅｄｅｒｉｋｓｕｎｄのＢｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ社により製造されたもので、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５の商品名で、２％（ｗ／ｖ）溶液が販売されている。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５への吸着はおよそ１００％であった。
工程２：充填
適応ＥＶ７１ワクチンは、検証済みの、手による充填操作を用いて、無菌的に３ｍＬの滅菌ガラス（ＵＳＰ Ｉ型）バイアル（Ｓｃｈｏｔｔ社）へと充填された。充填操作は、クラス１０，０００（ＩＳＯ ７）の室内に設置されたクラス１００（ＩＳＯ ５）バイオセーフティキャビネット中で行われた。充填済みバイアルは滅菌クロロブチルゴム栓（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ社）で栓をされ、半自動化バイアルクリンピングステーション（Ｋｅｂｂｙ Ｐｒｏ−Ｓｅａｌ）を使用し、滅菌フリップオフアルミニウムシール（Ｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａ社）で密封された。密封したら、このバイアルに、１．５０”ｘ０．７５”の不透明な白色のレーザープリントされた低温タグラベル（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＬＣＲＹ−１２００）を手で張り付けた。
工程３：目視検査と保存
すべてのバイアルは目視検査され、もし過少に充填されていたり、蓋が緩んでいたり、ガラス部品や他の部分が外れていた場合には却下とした。目視検査の後、ワクチン製品を５±３℃で保存した。
適応ワクチンの質量分析
質量分析（ＭＳ）は、適応ワクチン製剤原料に対し、Ｍ−Ｓｃａｎ（英国）により行われた。サンプルはジチオスレイトール中で還元され、ヨード酢酸でカルボキシメチル化され、スピンカラム（３ｋＤａカットオフ膜）を用いて重炭酸アンモニウム緩衝液中で濃縮され、膜上でトリプシンで消化され、得られたペプチドを、ＬＣ−ＥＳ−ＭＳ／ＭＳ（高速液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー四重極型飛行時間型質量分析）により溶出及び分析した。ペプチド配列は、高エネルギーＭＳで得られたスペクトルから生成され、得られた配列を使用し、ＭＡＳＣＯＴソフトウェアを用いたＮＣＢＩデータベース検索を行った。上述に従い、ＭＳ分析から、カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４が試験サンプル中の主要成分であったことが示された。
実施例３ 免疫力実験
免疫力試験を用いて、適応ＥＶ７１ワクチンの有効性を示した。アッセイは、適応ＥＶ７１ワクチンを接種されたマウスの特異的ＥＶ７１免疫反応を継時的に一定の間隔で評価することにより、適応ＥＶ７１ワクチンの有効性と安定性を示すよう設計された。したがって、このアッセイにはＴＣＩＤ５０ウイルス中和法もまた組み込まれる。
簡潔に述べると、マウス（１群当たり６匹）それぞれに、０日目及び１４日目、低用量または高用量の適応ＥＶ７１ワクチンを、同じリンパ節を標的とするために同じ脚へ、２回の５０μＬ ＩＭ注射を介して接種した。マウスでの注射体積には限界があるため（総量で１００μＬ）、製剤化ワクチン１回用量の１／５をマウスに投与し、低用量免疫化マウスには、１用量当たり、０．１２μｇのタンパク質及び０．１ｍｇのａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを投与し、高用量免疫化マウスには１用量当たり、０．６μｇのタンパク質と０．１ｍｇのａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを投与した。マウス６匹の対照群は、１用量当たり、０．１ｍｇのａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有するａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみの製剤を投与する。免疫力を評価するために、免疫前採血として０日目、及び１４日目、最終採血として２８日目の３つの時点で各マウスから血清を採取した。各群の血清サンプルは熱不活化し、プールされた。各群のプール血清は、Ｖｅｒｏ細胞アッセイ培地（２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ）で連続希釈され、既知量の適応ＥＶ７１生ウイルス（５０μＬ当たり１００ＴＣＩＤ５０）がこれらサンプルに添加され、混合物を１．５時間、インキュベートした。次いで、これらサンプルと対照サンプル（陽性対照として５０μＬ当たりＥＶ７１ １００ＴＣＩＤ５０、陰性対照としてアッセイ培地）を、ＴＣＩＤ５０に関して記載されるように９６ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞に添加した。ＣＰＥは３〜５日目に観察され、結果は、３回の反復試験のうちの少なくとも２つがＣＰＥ陰性である最大血清希釈として定義された血清中和力価として表された。これらの実験結果を以下の表２〜４に示す。
表２ 対照群からの血清中和力価
ミョウバンのみの対照群に対する５日目の結果。ＮＴ＝試験せず。ＮＲ＝１２８において抗体反応＜１。
表２に示されるように、陰性対照は、０日目及び２８日目の両方で６匹個々の動物のそれぞれにおいて陰性反応を示し、このことから、ミョウバン単独では抗ＥＶ７１抗体の上昇が生じなかったことが示される。
表３ 低用量群からの血清中和力価
低用量群に対する５日目の結果。ＮＡ＝解析には不十分なサンプル体積。ＮＲ＝１２８において抗体反応＜１。
表３に示されるように、０日目に採取されたプレ採血において、低用量群から中和抗体反応は検出されず、このことから、この動物は従前にＥＶ７１様のウイルスに曝露されていなかったことが示された。１４日目にも陰性の結果が得られたことから、１４日間隔後の単回用量では、検出可能な免疫反応を生じさせるには不十分であったことが示される。しかしながら、６匹の動物のうち５匹で、２８日目までに測定可能な抗血清中和力価が示された。低用量群の６匹の動物の各々からプールが調製された場合、測定可能な中和抗血清反応が検出された。
表４ 高用量群からの血清中和力価
高用量群に対する５日目の結果。ＮＲ＝１２８において抗体反応＜１。
表４に示されるように、０日目に採取されたプレ採血において、高用量群から中和抗体反応は検出されず、このことから、この動物は従前にＥＶ７１様のウイルスに曝露されていなかったことが示された。１４日目にも陰性の結果が得られたことから、１４日間隔後の単回用量では、検出可能な免疫反応を生じさせるには不十分であったことが示される。しかしながら、すべての動物で、２８日目までに測定可能な抗血清中和力価が示された。高用量群の６匹の動物の各々からプールが調製された場合、５１２中１の中和抗体力価が生じた。プールが１４日目に高用量を受容した４匹の動物の各々から調製された場合、１，０２４中１の中和抗体力価が生じた。
これらの結果から、適応ＥＶ７１ワクチンの免疫力が示される。低用量処置及び高用量処置の両方ともが、測定可能な中和抗体反応を誘導した。
実施例４：ミョウバンアジュバント有り又は無しで、３つの用量レベルで製剤化されたＥＶ７１抗原。
この実施例は、オスのＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ミョウバンアジュバント有り又は無しで製剤化された、様々な用量レベルの適応ＥＶ７１ワクチン抗原の免疫反応を評価した。３つの用量レベル（０．１２μｇ、０．６μｇ、及び３μｇのＥＶ７１抗原／用量）を、動物において評価した。各動物群は、１群当たり８匹のマウスから構成された。ミョウバン無し（１群）、及びミョウバン有り（５群）の製剤に対する陰性対照はそれぞれ、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水＋０．００２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０）及び水酸化アルミニウムであった。ミョウバン（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５）の量は、このアジュバントを含有するすべての製剤中で、０．５ｍｇ／用量で一定とした。マウスは０日目及び２８日目にＩＭ注射により免疫化された。血清は０日目（免疫前）、２８日目（ブースト免疫化前）、及び５６日目（最終採血）で採取され、各処置群に対する各用量レベルの中和抗体力価及び抗体陽転率を評価した。血清中和抗体力価は、ＴＣＩＤ５０を基にした中和アッセイを用いて決定された 中和抗体力価を単位とした免疫反応を、アジュバント無しで製剤化されたＥＶ７１抗原の対照と比較した。幾何平均力価（ＧＭＴ）は、個々の逆数中和力価から、各群に対し算出された。抗体陽転率は、所与の群における逆数中和力価が≧１２８の動物の割合として定義された。
本実験の結果を、以下の表５に示す。
表５：ミョウバンアジュバント有り、及び無しのＥＶ７１抗原の免疫原性
ａ ＰＢＳＴ＝リン酸緩衝生理食塩水＋０．００２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０。精製され、不活化されたＥＶ７１に対する緩衝剤ベース。
ｂ 抗体陽転率（ＳＣＲ：Ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ）とは、逆数中和力価≧１２８の動物の割合として定義される。
全ての動物は、免疫化前の０日目では、測定可能な中和抗体力価は有していなかった。水酸化アルミニウムで製剤化されたＥＶ７１抗原は、アジュバント無しで同用量のＥＶ７１抗原を投与されたマウスと比較して、すべての用量レベルでマウスに高い中和抗体力価を生じさせた。０．６μｇ及び３μｇの用量レベルの単回用量投与（２８日目のサンプル）後に記載されているように、ミョウバンアジュバントの添加は抗体陽転率にも効果を有している。
結果から、ＥＶ７１抗原製剤にミョウバンアジュバントを含有させることにより、適応ＥＶ７１ワクチンの全体的な免疫原性が改善することが示される。このことは、ミョウバンアジュバントを用いた群における、２８日目（１用量後）で１１〜２３倍高いＧＭＴ、４２日目（２用量後）で４〜６倍高いＧＭＴ、及び５６日目（２用量後）で２．４〜９倍高いＧＭＴという、高いＧＭＴ中和力価により示された。このことは、異種の流行ＥＶ７１サブジェノグループに対する防御をもたらすワクチンの免疫反応及び能力の長期化という点に関して特に重要であった。
実施例５：マウスにおける用量範囲実験
本実施例は、ミョウバンアジュバントと共に製剤化された異なる用量の適応ＥＶ７１ワクチンの、マウスにおける中和抗体を誘導する能力を示すものである。オスのＢａｌｂ／ｃマウスに、ＩＭ注射を介して、用量当たり０．１２、０．６、３、９、及び１５μｇの適応ＥＶ７１ワクチンを用いて２回（０日目及び２８日目）免疫化を行った。ミョウバンの量はすべての製剤で、０．５ｍｇ／用量で一定とした。ＴＣＩＤ５０ ＥＶ７１ウイルス中和アッセイを用いて逆数中和抗体力価を０日目、２８日目、及び５６日目に決定した。本実験から得られたデータを用いて、ヒト試験で使用される用量レベルを決定した。全てのマウスは、免疫化の前の０日目には、測定可能な中和抗体は有していなかった（表６）。
表６：マウスにおけるＩＮＶ２１の用量範囲実験
ａ 抗体陽転率（ＳＣＲ）は、逆数中和力価が≧１２８の動物の割合として定義される。
対照のミョウバンのみの群（適応ＥＶ７１ワクチンの抗原は０μｇの用量）は、分析されたすべての時点で、いずれの中和抗体も産生しなかった。１用量の適応ＥＶ７１ワクチンの後、３μｇ及び１５μｇの用量レベルのみ、２８日目のＧＭＴが≧１２８と示されるように高レベルの中和抗体が産生された。２用量のワクチンの後、０．６μｇ以上の用量を投与された動物において、高レベルの中和抗体（５６日目でＧＭＴ≧１２８）が観察された。最も高いＧＭＴ（２７０２）は、最も高い用量の１５μｇを投与された動物群において認められた。二番目のワクチン投与のブースト効果は、５６日目、すべての用量群において明白であった。
抗体陽転率を算出する目的で、逆数中和力価≧１２８を用いて、抗体陽転された個々の動物を分類した。１用量のワクチンの後（２８日目）には、すべての用量レベルで、１０％（０．１２μｇの用量レベル）〜８０％（１５μｇの用量レベル）の範囲の不完全な抗体陽転が認められた。２用量の適応ＥＶ７１ワクチンの後は、２８日目と比較し、各用量レベルで高いＳＣＲ（５６日目）が得られ、０．１２μｇの用量で５０％の動物が、０．６μｇの用量で９０％の動物、３、９及び１５μｇの用量レベルで１００％の動物が抗体陽転した。１２８逆数中和力価（点線）と比較した、すべての用量群のＧＭＴを図３に示す。
結果は、上述の実施例４の結果と同等であり、２用量の適応ＥＶ７１ワクチンが、高レベルの中和抗体力価の生成に最適であることが示されている。ＥＶ７１に対する中和抗体レベルに関する、ヒトにおける防御的力価は確立されていないが、逆数中和力価≧１２８が、Yu et. al. (2000)に記載されており、マウスのＥＶ７１感染のチャレンジモデルにおいて、これが最小防御的力価であるとされている。同様の防御的力価が、ＥＶ７１受動的ワクチン接種及びチャレンジの関連マウスモデルに関するWu et. al. (2002)にも記載されている。この力価レベルは、図３において、水平な点線として表されている。本実験の結果から、０．６μｇ以上の適応ＥＶ７１ワクチン用量で２回の免疫化を行った後、この閾値を超えるＧＭＴを生じさせ得ることが示されている。本実験のデータと実施例４のデータを合わせると、それぞれ用量あたり０．６μｇと３．０μｇの低用量と高用量の適応ＥＶ７１ワクチン製剤が、ヒト試験に適していると結論付けることができる。
実施例６：選択されたＥＶ７１サブジェノグループに対する、適応ＥＶ７１ワクチン免疫反応の交差中和
適応ＥＶ７１ワクチンで免疫化した低力価のラット血清及び高力価のウサギ血清を、他のサブジェノグループ（Ｂ４、Ｂ５及びＣ４）由来の３つのＥＶ７１株を中和する能力に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで分析した。Ｂ２サブジェノグループはワクチン株と同じであり、陽性対照として含めた。本実験に用いたアッセイは、Ｂ４、Ｂ５、及びＣ４単離株はＶｅｒｏ細胞に細胞変性効果を生じさせるために長い時間を必要とするため、感染後、長期間の観察（５日ではなく、最大で１０日）が可能となるような改変を行ったＴＣＩＤ５０中和アッセイであった。試験サンプルの中和力価は、反復実験の≧５０％でＶｅｒｏ細胞の感染が阻害される最も高い希釈として定義された。
ウサギ抗ＥＶ７１血清は、同種Ｂ２サブジェノグループに対して得られた力価と比較して、Ｂ４及びＢ５サブジェノグループに対しても同様の逆数中和力価を有していた（図４）。Ｃ４サブジェノグループに対するウサギ血清の逆数中和力価は、Ｂ２力価よりもおよそ１．４倍高かった。Ｂ４、Ｂ５及びＣ４ウイルスに対するラット抗血清の逆数中和力価は、同種Ｂ２サブジェノグループに対して得られた力価と比較し、それぞれ０．２５倍、０．１８倍、及び２．８倍であった（表７）。
表７：同種及び異種のＥＶ７１サブジェノグループに対するＩＮＶ２１の逆数中和力価
結論として、この結果から、適応ＥＶ７１ワクチンに対して上昇した血清は、少なくとも２つの動物種においてＥＶ７１の異種の株に対する交差中和抗体を誘導し得ることが示される。
実施例７：毒性試験
ウサギにおける毒性試験
ヒトでの投与をサポートするための毒性評価を行う適切な種として、ＮＺＷウサギを使用した毒性実験を初期評価として行った。本試験において、３用量の適応ＥＶ７１ワクチンの後の免疫反応を、ＮＺＷウサギにおいて評価した。２群の動物（１群当たり２匹のオスのウサギ）に対し、０．５ｍｇ／用量のミョウバンと共に製剤化された適応ＥＶ７１ワクチン１５μｇ、又はミョウバンのみの対照製剤（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／用量）のいずれかで、ＩＭ注射により免疫化した。０日目、２８日目、及び５６日目に動物を免疫化し、８４日目までの試験期間中の様々な時点で中和抗体レベルを決定した。３回目の免疫化は、アッセイ開発試薬及び参照標準としての使用のための高抗体力価を有する血清を生成するために含められた。中和抗体力価は、ＴＣＩＤ５０中和アッセイを用いて測定された。
適応ＥＶ７１ワクチンを投与された動物はすべて、良好な免疫反応を惹起し、１４日目（１回の免疫化後）から、最終採血の８４日目（３回の免疫化後）まで高い逆数中和抗体力価を示した（表８）。
表８：ＮＺＷウサギにおけるＩＮＶ２１の免疫原性
逆数中和抗体力価は、適応ＥＶ７１ワクチンの２回目の用量を投与して１４日後、４２日目で最も高かった。適応ＥＶ７１の３回目の用量は、８４日目で測定された逆数中和力価の上昇をもたらさなかった（図５）。ミョウバン対照群の動物は、分析されたすべての時点で中和抗体が検出されなかった。
この結果から、適応ＥＶ７１ワクチンを用いた免疫化後に高レベルの中和抗体が示されたことから、ＧＬＰ毒性試験を行う種としてのＮＺＷウサギの妥当性が示される。
ＧＬＰ毒性試験及び局所耐性
適応ＥＶ７１ワクチンの毒性は、ＮＺＷウサギにおいてさらに評価された。さらに、このワクチンの局所耐性も評価された。本試験の目的は、反復ＩＭ免疫化後の適応ＥＶ７１ワクチンの毒性及び局所耐性を評価することであり、及び２〜４週の無処置期間にわたる、いずれか効果の可逆性を評価することである。本試験に用いた被験物質は、低用量及び高用量の適応ＥＶ７１ワクチン製剤であり、それぞれ０．６μｇのＥＶ７１／用量、及び３．０μｇのＥＶ７１／用量であり、０．５ｍｇ／用量のミョウバンアジュバントと共に製剤化された（表９）。
表９：ＩＮＶ２１の反復用量及び局所耐性試験の処置群（ＮＣ−ＮＳＰ−００７）
Ｍ−オス、Ｆ−メス
a 各群の半数の動物は、最後の免疫化の２日後、３０日目又４４日目（Ｇ４）のいずれかに殺処分され、群の残りは５６日目に殺処分された（最終殺処分）。
b ワクチンプラセボ群には、ミョウバンのみのアジュバント製剤を投与した。
含有された対照は、通常の生理食塩水プラセボ（ＰＢＳ）、及びミョウバンのみのアジュバント製剤（０．５ｍｇ／用量）であり、後者は本試験においてワクチンプラセボと呼称された。被験物質及び対照は、０日目及び２８日目に全群の動物に対してＩＭ注射として投与された。４群（高用量ワクチン）の動物は４２日目にも追加の免疫化を受け、これは第Ｉ相試験で予定される２回用量レジメンを１回用量だけ超過している。全ての動物は、肉眼的臨床変化、注射部位の局所反応、死亡及び罹患、臨床病理、血液検査、臨床化学検査、肉眼的病理及び組織病理に関して観察された。
全般的な適応ＥＶ７１ワクチンの毒性に関し、ＩＭ注射によりＮＺＷウサギにそれぞれ２回及び３回で投与された低用量（０．６μｇ／用量）及び高用量（３．０μｇ／用量）の製剤の両方ともが、死亡又は罹患を生じさせず、血液検査または臨床化学検査において、処置に関連した有意な変化は無かった。加えて、平均体重、食物摂取量、呼吸数又は直腸温度、ならびに肉眼的病理検査、絶対的器官重量及び相対的器官重量において処置に関連した変化は無かった。さらに、本試験において処置に関連した神経毒性、腎臓又は血液の有害作用は観察されなかった。局所耐性に関しては、紅斑又は浮腫はいずれの動物でも観察されなかった。顕微鏡検査では、わずかな筋肉病変が注射部位に観察されたが、これらの影響は最後の免疫化後の１４日又は２８日の無処置期間において可逆的であった。単核細胞（ＭＮＣ：ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）／好酸球の浸潤を伴う、又は伴わない筋変性が、ミョウバンアジュバントを含有する製剤を投与されたすべての群の動物の亜群において観察された。ＭＮＣ／好酸球浸潤を伴う、又は伴わない筋変性は、通常の生理食塩水プラセボ（ＰＢＳ）を投与されたＧ１群においては観察されなかった。筋変性が観察された動物の数を表１０に示す。
表１０：注射部位に筋変性を伴うウサギの数
a 値は、処置群当たりの、少なくとも１か所で観察された動物数／動物の総数として表されている。
b 総数の下の値は、ＭＮＣ／好酸球浸潤を伴う、及び伴わない、筋変性が観察された総数である。
c ワクチンプラセボ群はミョウバンのみのアジュバントの製剤を投与された
注射部位の筋肉病変は、Ｇ１（通常の生理食塩水ＰＢＳ対照）を除き、全群で、ＭＮＣ／好酸球浸潤を伴う、又は伴わない、様々な程度の変性を含んでいた。これの病変は、ワクチン調製物中のアルミニウム塩アジュバントに関連した、既知の変化と一致していた（Gherardi 1998; Gherardi 2001; Verdier 2005）。さらに、５６日目に殺処分されたすべての動物において、病変の軽減が記録された。したがって、注射部位の筋肉病変は、適応ＥＶ７１ワクチンを製剤化するために使用されたミョウバンアジュバントの作用であると考えられること、及びＥＶ７１抗原の存在の結果ではないこと、及びこの作用は可逆性であったことが結論づけられる。
低用量ワクチン群と高用量ワクチン群において、動物の内臓器官に異なる組織病理的変化が観察されたが、それらはワクチンプラセボ群と通常生理食塩水群と同等であった。さらに、病変は非特異的であり、重大ではないとみなされ、いずれのパターンにも従わず、従って、これら変化は、自然発生的又は偶発的な性質であると見なされた。
これら結果から、高用量及び低用量の適応ＥＶ７１ワクチン製剤、ならびにミョウバンのみの対照製剤に、ミョウバン製剤化ワクチン調製物の特徴である局所反応が注射部位に観察されたこと、及びその反応が可逆性であったことが判明したことが示される。さらに、低用量及び高用量の適応ＥＶ７１ワクチン製剤の両方とも、処置関連の生理学的変化及び病理学的変化をいずれも誘導しなかった。全体として、本試験の結果は、適応ＥＶ７１ワクチンが安全であり、良好な耐容性であることを示している。
実施例８：適応ＥＶ７１ワクチンは成人のボランティアにおいて、安全であり、免疫原性があり、及び交差中和抗体反応を誘導する。
実施例１〜７に記載される適応ＥＶ７１ワクチンを、健常な成人における第Ｉ相臨床試験において評価した。２１歳〜４５歳の３６名の健常な男性と女性を、治験医療ユニット、国立大学病院、シンガポール（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）での無作為化二重盲検プラセボ対照試験に登録した。本試験は、適応ＥＶ７１ワクチンに対する最初のヒト試験であった。動物実験のデータから、適応ＥＶ７１ワクチンは高レベルのウイルス中和抗体を複数種の動物で惹起させることが示されており、及びこれを免疫原性エンドポイント選択の基とする。
対象者
インフォームドコンセントへの署名後、対象者は以下に記載されるように本試験における適格性に関しスクリーニングされた。スクリーニング来院での手順には、健康診断、バイタルサイン、ＥＣＧ、及び臨床検査が含まれた。スクリーニングはワクチン接種の４２日前までに行われ得た。
本試験の適格者となるためには、対象者は以下の基準に合致する必要があった：スクリーニングの時点も含め、２１〜４５歳の男性又は女性であること。既往歴及び健康診断から、良好な健康状態であること。臨床安全性臨床検査［Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、グルコース、ＢＵＮ、クレアチニン、リン酸塩、カルシウム、タンパク質、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、白血球（ＷＢＣ）、ヘモグロビン、血小板及び尿検査］が正常であること。安全性臨床試験の正常範囲は、安全性臨床試験を行う検査室で使用されている範囲に従った。これら試験結果のいずれかが正常範囲の外にあった場合、その試験は繰り返された。もし繰り返された結果も正常範囲外であった場合、その対象者は、治験責任医師及び医療監視者］の両方の承認がある場合のみ登録された。１９〜２８ｋｇ／ｍ２の範囲の肥満度指数（ＢＭＩ）を有すること。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎抗体、及びＢ型肝炎表面抗原の血清検査が陰性と記録されること。子供を妊娠する可能性のある女性は、スクリーニングの間、尿妊娠検査が陰性でなければならず、ワクチン接種の直前にも尿妊娠検査が陰性でなければならず、スクリーニングから最終採血後（１９６日目）までの間、経口、埋め込み型、経皮もしくは注射型の避妊薬、又は治験責任医師に承認された他の信頼性のある避妊手段（子宮内避妊具、女性用コンドーム、殺精子ペッサリー、子宮頚管キャップ、性的パートナーによるコンドームの使用、又は不妊の性的パートナー、又は禁欲）を使用する意思がなければならない。参加する意思があり、参加のための書面でのインフォームドコンセントを提出することができること。治験責任医師と交流する意思があり、交流することができること、及び本試験の要件を理解できること。及び以下に記載されるようにＥＶ７１中和抗体が低レベルを示していること。
免疫原性の初期兆候を得るためには、ＥＶ７１ナイーブの対象者のみが本試験に採用されることが理想的であった。一部の対象者はＥＶ７１の事前免疫を有していたが、サイトでスクリーニングされた健常なボランティア集団のうち、逆数中和力価が≦８、又は最も低い逆数中和力価のいずれか早いほうの対象者だけは本試験に含め、先在する免疫が無い場合の免疫原性に関する何らかの評価を可能とした。
以下の基準のいずれかに合致する対象者は、本試験参加を不適格とした。いずれかの医学的、精神医学的、もしくは社会的状態、職業的な理由、又はプロトコール参加に対する禁忌もしくはインフォームドコンセントを提出するボランティアの能力を損なうと治験責任医師が判断した、他の責任能力。治験責任医師の判断による、臨床的に意義のある血液疾患（出血性疾患を含む）、腎臓疾患、肝臓疾患、肺疾患（喘息を含む）、中枢神経系疾患（てんかん、発作、けいれん、又は慢性片頭痛を含む）、心血管系疾患、又は消化管疾患。進行性の発疹又は他の皮膚疾患。治験責任医師により評価される異常なＥＣＧ。発熱性疾患（体温≧３８℃）、又はワクチン接種前の３日以内の中等度もしくは重度の急性疾患又は感染症。糖尿病の既往歴。いずれかワクチンに対する過敏症。ＣＮＳ関与を伴う重度のＨＦＭＤの既往歴。最初のワクチン接種試験前の４週間内のいずれかワクチンの受容。本試験の各ワクチン接種後、４週間内のいずれかワクチン受容の予定。最初のワクチン接種前の先立つ６か月間における、先天的免疫不全もしくは後天的免疫不全の既往又は疑い、例えば抗癌化学療法もしくは放射線療法などの免疫抑制療法もしくは細胞障害性療法、又は最初のワクチン接種前、長期間（少なくとも従前の３か月間内の少なくとも２週間）の全身性の副腎皮質ホルモン療法（少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量）。胸腺病理、胸腺摘出、筋無力症、又はいずれか免疫不全の既往。再発性片頭痛の既往、又は再発性頭痛もしくは片頭痛の治療のための処方薬。各ワクチン接種の直前３日間のいずれか非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、アセトアミノフェン、又は抗ヒスタミン剤の使用。最初のワクチン接種（０日目）前の７日間の処方薬又は市販薬の使用。ただし避妊薬の使用は除外する。コカイン、アンフェタミン、アヘン、又はカンナビノイドに対する尿検査陽性。最初のワクチン接種の１か月前から最後のワクチン接種の１か月後の間の他の治験製品の受容を含む、いずれか臨床試験への参加又は参加予定。最初のワクチン接種（０日目）前の８週間の血液製品又はイムノグロブリンの受容、又は試験期間の間の使用予定。最初のワクチン接種（０日目）前の６週間、又は試験の間のいずれか時点での献血。又は妊娠中もしくは授乳中の女性。
試験プロトコールは、独立した倫理委員会により承認された。試験は、その後の改定を含む、「ヘルシンキ宣言」（１９６４）の主旨、ならびに現地の法律及び規制に完全に従い行われた。本試験は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ（１９９６）の「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」に概要される主旨、ならびに現地の法律及び規制に対し完全に順守された。すべての候補対象者は、読み取り用のインフォメーションシート及びコンセントフォームの承認済バージョンのコピーを提供された。本治験責任医師は、本試験に参加するすべての参加者が、自身が何を引き受けたのかを理解し、及びインフォメーションシートを確実に読むことに関し、責任を負った。対象者は、参加を拒絶する自由があること、又はどの時点でも本試験から離脱する自由があること、及び彼らが受ける医療的ケアは本試験への参加の同意又は拒絶により影響を受けないことに関してアドバイスを受けた。
製品の投与
登録された時点で、対象者は、１群（低用量）又は２群（高用量）のいずれかに割り当てられ、及び無作為化され、適応ＥＶ７１ワクチン又はプラセボを投与された。ただし、適応ＥＶ７１ワクチンのワクチン接種を最初に受けた監視対象者は除く。監視対象者の後に、各コホートの残りの対象者は２回（０日目及び２８日目）投与された。低用量群には、適応ＥＶ７１ワクチン（０．６μｇのＥＶ７１／用量）に１２名の対象者が、プラセボに６名の対象者が含まれた。高用量群には、適応ＥＶ７１ワクチン（３μｇのＥＶ７１／用量）に１２名の対象者が、プラセボには６名の対象者が含まれた。プラセボ治療は、治験品のように投与されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であった。対象者は、各用量レベル（高用量又は低用量）で、１８名の対象者の２つのコホートに登録された。各コホートにおいて、１名の監視対象者が、プライム用量を受け、その後にコホートの残りの対象者が投与された。したがって、無作為化スケジュールは、各コホート内の残りの対象者（Ｎ＝１７）に対する治療を決定した。対象者は無作為化され、ワクチン又はプラセボを投与された。本試験の分析に関与しなかった無作為化の統計専門家が、無作為に対象者番号を群及び治療に割り当てるための無作為化リストを作成した。適切なブロック化スキームを用いて、治療割り当て間のバランスを確実に維持した。全ての治療に関する組成物及び用量体積を、以下の表１１に示す。
表１１：
適応ＥＶ７１ワクチンの用量は、製剤中のＥＶ７１抗原の量に基づいた。本試験は、適応ＥＶ７１ワクチンの２つの用量レベルである、低用量製剤と高用量製剤の安全性と免疫原性を評価したものであり、ＥＶ７１タンパク質の絶対量は、用量レベル間で５倍異なっていた。ミョウバンアジュバントの量は、両方の用量レベルで一定であった（０．５ｍｇ／用量）。
低用量製剤の組成物は、ヒトボランティアにおける適応ＥＶ７１ワクチンの初回安全性評価を提供することを意図していた。低用量及び高用量の製剤の両方ともが、ウサギで行われた重要な安全性試験において試験された。さらに、３用量がウサギの試験で投与され、それらは本試験で使用された、目的とする２用量レジメンを１用量超過していた。
本試験で試験される提案された用量レベルは、マウスにおける用量範囲試験に基づいたものであり、それによると、２用量の適応ＥＶ７１ワクチン後の、文献で報告された１：１２８の防御的力価に基づいた適切な中和抗体力価を惹起する最も低い用量は、０．６μｇ／用量であった。逆数中和力価及び抗体陽転率（ＳＣＲ）が、３μｇ／用量よりも低かった９μｇ／用量レベルを除き、３μｇ／用量及び１５μｇ／用量レベルは、中和抗体力価とＳＣＲにおいて大きな差を生じさせなかった。それにより、３μｇを本試験で評価される高用量レベルとして選択した。
対象者は、三角筋部に、２回の筋肉内注射（０日目のプライム用量、２８日目のブースター用量）を受けた。血液サンプルは、安全性評価（血液検査及び血清化学検査）及び免疫原性評価（ＥＶ７１に対する中和抗体）のために一定間隔で採取された。対象者は各ワクチン接種後１４日間で終了する日誌を渡され、口腔温度、及びワクチン接種後に経験したあらゆる症状（局所及び全身）を記録した。試験の間に発生する有害事象もすべて記録された。
以下の薬剤は本試験において許可されなかった。各ワクチン接種前の３日間、ＮＳＡＩＤ、アセトアミノフェン、又は抗ヒスタミン剤。以下の薬剤及び治療は本試験において許可された。各ワクチン接種後、最初の７日間、対象者に≧３７．８℃の発熱があった場合、又は対象者に著しい腕の痛み、筋肉痛もしくは頭痛があった場合、ＮＳＡＩＤ、アセトアミノフェン、又は抗ヒスタミン剤を使用してもよい。ＮＳＡＩＤ又はアセトアミノフェンは、対象者の日誌に症状又は発熱が記載された後にのみ摂取されるものとし、予防的には摂取されないものとした。１日当たり１回、１００ｍｇを超えない低用量アスピリン、ならびにオキシコドン及びアセトアミノフェンを含有する例えばパーコセット（Ｐｅｒｃｏｃｅｔ）などの低用量麻酔薬は、対象者の日誌に症状が記載された後にのみ摂取されるものとし、予防的には摂取されないものとした。
シリンジのマスキング、ならびに固有シリンジ番号と対象者識別番号でシリンジをラベリングすることを含む、被験製品を調製するために、非盲検試験コーディネーター又は被指名人を雇用することにより、対象者及び治験責任医師は治療（ワクチン又はプラセボ）に対し盲検化される。被験製品を含有するシリンジは、ラベルでマスクされ、内容物の色が見えないようにされた。血液検査、血清化学検査、尿検査、中和抗体アッセイを行う検査室も治療に対し盲検化され、サンプルは対象者固有識別番号、日付、及びプロトコール番号でのみラベリングされた。被験製品を投与する人物（治験責任医師又は資格要件を満たした被指名人）、及び安全性評価に関与する職員は、本試験の全期間、盲検化を維持された。
無作為化スケジュールは、試験の間、治験責任医師、盲検化されたモニター、又は試験チームには使用不可であった。重篤な有害事象の場合、又は医学的な緊急事態の場合に治験責任医師により明確に要求された場合にのみ、盲検化解除が行われた。治療コードが破壊されるイベントにおいて、本試験の継続に関する意思決定ができるよう、治験責任医師又は副治験責任医師から、非盲検化試験コーディネーター又は無作為化統計専門家への書面による要求で、問題となっている対象者（複数含む）に対してのみ、破壊される。
対象者は、最終用量後２か月（８４日目）及び６か月（１９６日目）で、追跡期間の安全性及び免疫原性の評価を行うためにサイトに戻るよう要求された。総じて、各対象者の参画は、スクリーニングの４２日間と、最終用量後の６か月の追跡期間（１９６日目の来院）を含み、およそ８．５か月であった。
全ての安全性及び有効性の測定を含む、試験のイベントスケジュールを以下の表１２及び１３に要約する。
表１２ 試験−４２日目〜試験１４日目（プライム用量)の間のイベントスケジュール
1低用量コホートに無作為化されなかった適格対象者は、４２日間のスクリーニング内であれば高用量コホートへと無作為化されることができた。もし４２日間のスクリーニング期間外であった場合、再スクリーニングされ、インフォームドコンセントのプロセスとデモグラフィックデータの回収を除くすべての検査と手順が繰り返された。
2各コホートの監視対象者は最初に投与され、その後、そのコホートの残りの対象者に投与された。監視対象者は２日間観察され、安全性評価のために１日目及び２日目にユニットへと戻るよう要求された。
3組み入れ基準／除外基準（Ｉ／Ｅ）及び健康診断は、ワクチン接種の前にレビューされ、又は行われた。薬物乱用検査、血清化学検査、血液検査、尿検査、及び血清中和抗体検査のサンプルはワクチン投与の前に採取された。
4尿妊娠検査の結果は、ワクチン投与の前に取得され、陰性の対象者が本試験を継続した。
5ワクチンが投与された腕の記録
6ワクチン投与前、ならびにワクチン投与後５分、３０分、及び６０分。
7ワクチン投与後５分、３０分、及び６０分。
8尿検査に関し、女性の対象者がサンプル採取時点で月経であった場合を記録。
9対象者の日誌は、１４日目の来院時に対象者から回収した。
10健康診断、ワクチン接種、及び注射部位の評価は、治験責任医師又は彼の被指名者により行われるものとした。
表１３：試験２８日目から１９６日目（ブースター用量）の間のイベントスケジュール
1ブースター用量のための２８日目の来院は、２８日目±３日で行われてもよい。
2５６日目の来院は、５６日目±３日で行われてもよい。
3８４日目の来院は、８４日目±５日で行われてもよい。
4１９６日目の来院は、１９６日目±７日で行われてもよい。
5来院７は、ブースト後、３日で常に行われる（すなわち、ブーストが２８日目に投与された場合には３１日目。もしブーストが３０日目に投与された場合には３３日目。もしブーストが２６日目に投与された場合には２９日目）。
6来院８は、ブースト後、７日で常に行われる（すなわち、ブーストが２８日目に投与された場合には３５日目。もしブーストが３０日目に投与された場合には３７日目。もしブーストが２６日目に投与された場合には３３日目）。
7来院９は、ブースト後、１４日で常に行われる（すなわち、ブーストが２８日目に投与された場合には４２日目。もしブーストが３０日目に投与された場合には４４日目。もしブーストが２６日目に投与された場合には４０日目）。
8追跡期間の来院は、もし対象者が１９６日目までに試験が完了していない場合、又は早期から試験中止された対象者（早期終了）の場合のみ、適用可能である。
9ワクチン接種の前に健康診断を行わなければならない。薬物乱用検査、血清化学検査、血液検査、尿検査、及び血清中和抗体検査のサンプルは、ワクチン投与の前に採取しなければならない。
10尿妊娠検査の結果は、ワクチン投与の前に取得しなければならず、及び本試験を継続する対象者は陰性でなければならない。
11ワクチンが投与された腕の記録。
12ワクチン投与前、ならびにワクチン投与後５分、３０分、及び６０分。
13ワクチン投与後５分、３０分、及び６０分。
14１回目のワクチン接種又は２回目のワクチン接種のいずれかの１４日以内に早期終了が発生した場合に、注射部位が評価される。
15尿検査に関して、もしサンプル採取時点で女性の対象者が月経であった場合には記録する。
16ワクチンの１回目の用量又は２回目の用量のいずれかの１４日以内に早期終了が発生した場合に、血清中和抗体検査のために血液が採取される。
17対象者の日誌は、４２日目の来院時に対象者から集められる。
18１回目のワクチン接種（０日目）から最終用量後２８日（５６日目）の間の全ての有害事象が記録される。
19 最終用量後、６か月以内に経験し得るすべてのＳＡＥに関し、８４日目及び１９６日目の来院時、対象者は質問される。
20健康診断、ワクチン接種、及び注射部位の評価は、治験責任医師又は彼の被指名者により行われるものとする。
評価される安全性測定値
すべての主要体組織のレビューを含む、完全な病歴が評価された。重大な過去及び現在の病歴は、スクリーニング来院の間にインタビューにより取得された。現在使用されていた、又はスクリーニング前の３か月で使用されていた処方薬及び市販薬の詳細（ビタミン類及びサプリメントを含む）は、スクリーニング来院の間に記録された。併用薬の記録は、各来院時にレビューされ、新たな医薬品はすべて記録された。
デモグラフィックには、対象者により記載された年齢、身長、体重、ＢＭＩ及び人種を含んだ。対象者は、軽い外出着を着用し、靴を脱いで体重及び身長が測定された。ＢＭＩは、以下の式を用いたメートル法にて算出された。ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長（ｍ）2。デモグラフィックはスクリーニングの間に取得された。
徹底的な健康診断は、スクリーニング時、０日目及び２８日目のワクチン投与前、ならびに５６日目に、各対象者に対し、治験責任医師又は彼の被指名者により行われた。検査は、以下の器官／全身の評価から構成された。頭部、眼、耳、鼻、喉、首、心血管、胸部、呼吸器官、腹部、尿生殖器、四肢、筋骨格、神経系、皮膚、及び他の注目すべき状態。健康診断の間に記録された、以前の検査からの変化はすべて記録された。
バイタルサインには、口腔体温、血圧、脈拍数、及び呼吸数が含まれた。バイタルサインは、スクリーニング時、０日目（ワクチン投与前、ならびにワクチン投与の５分後、３０分後、及び６０分後）、１日目（監視対象者のみ）、２日目（監視対象者のみ）、３日目、７日目、１４日目、２８日目（ワクチン投与前、ならびにワクチン投与の５分後、３０分後、及び６０分後）、ならびに３１日目、３５日目、４２日目、５６日目、８４日目、及び１９６日目に取得された。血圧は、対象者を着席させ、５分の休憩後に、腕を心臓の高さで支えながら、対象者の腕から測定された。血圧は、最も近いｍｍＨｇに対して記録された。バイタルサインが血液採取と同時に予定されていた場合、ワクチン接種の前後にバイタルサインが取得される０日目及び２８日目を除き、バイタルサインを最初に取得した。
全ての対象者は、本試験への登録前に正常なＥＣＧを有していることが必要とされた。標準的な１２誘導ＥＣＧがスクリーニング時に行われた。各ＥＣＧの解釈はレビューされ、治験責任医師により承認された。機械解釈は、治験責任医師による承認がある限りは受容可能であった。
注射を行う前、被験製品の投与に対して責任を負っている試験スタッフは、実際の注射部位周囲に消えないマーカーを用いて円（約１インチ（の直径）を描いた。手順は、試験の手順マニュアルに詳述された。注射物質が投与される腕が記録された。
注射部位は、０日目（ワクチン投与の５分後、３０分後、及び６０分後）、１日目（監視対象者のみ）、２日目（監視対象者のみ）、３日目、７日目、１４日目、２８日目（ワクチン投与の５分後、３０分後、及び６０分後）、３１日目、３５日目、及び４２日目に評価スケールを用いて局所反応原性を評価した。注射部位反応が観察された事象において、治験責任医師は適切な治療を提供した。注射部位の反応は、写真で明白に見える定規と共に写真撮影された。写真は、対象者の身元を確実に保護するため、対象者特定コード、来院番号、及び日付によってのみ特定された。
対象者は、各ワクチン接種の日から始まり、その後１４日間の日誌（症状の日誌）を完了させるよう依頼された（０日目から１４日目、及び２８日目から４２日目）。この期間の間、対象者は自身の口腔体温を（毎日同じ時刻に）計測し日誌に記録することを要求された。さらに、対象者は、以下を含む、この期間の間に経験した症状をすべて記録することを依頼された。例えば疼痛、発赤（紅斑）、腫れ（浮腫／硬結）、及び掻痒（かゆみ）などの注射部位の反応。例えば頭痛、筋肉の痛み（筋肉痛）、疲労（倦怠感）、身体の発疹、悪心及びおう吐（回数）などの全身症状。及び他の症状。対象者は、各来院に際し日誌を持参することを要求され、日誌は来院の間に治験責任医師又は彼の被指名者によりレビューされた。
臨床検査評価
臨床検査評価は血液検査、血清化学検査、及び尿検査から構成された。血液、血清化学、及び尿の検査は、スクリーニング時、０日目（用量前）、７日目、１４日目、２８日目（用量前）、３５日目、４２日目、及び５６日目に行われた。検査されたパラメーターを表１４に列挙する。
表１４：臨床検査、尿検査、及び他の検査のリスト。
全ての女性の対象者は、スクリーニング時、ならびに０日目及び２８日目の被験製品の投与前に尿妊娠検査の結果が陰性であることが要求された。尿妊娠検査は５６日目に繰り返された。陽性の検査結果はすべて適切に追跡された。
全ての対象者は、試験に参加するためのスクリーニング時、薬物乱用に対する検査の結果が陰性であることが要求された（コカイン、アヘン、カンナビノイド、及びアンフェタミン）。さらに、この検査は０日目及び２８日目の投与の前にも行われた。陽性の検査結果はすべて、適格な当局に報告された。
０日目（用量前）、１４日目、２８日目（用量前）、４２日目及び５６日目に、ＥＶ７１に対する中和抗体レベルの測定のために血液サンプルが取得された。８４日目及び１９６日目に取得されたサンプル中の中和抗体レベルを測定することにより、長期的な免疫原性が評価された。有効性のエンドポイントは以下を含んだ。プライムワクチン接種後の１４日目、２８日目、４２日目、及び５６日目での中和抗体力価に基づく幾何平均中和抗体力価（ＧＭＴ）。ＥＶ７１に対する中和力価のベースラインを超える倍数増加の測定。及びブーストワクチン接種後、２か月（８４日目）及び６か月（１９６日目）でのＥＶ７１に対する中和抗体及びＧＭＴにより評価される、免疫反応の持続性。
データの質と保証
正確で信頼性のあるデータの収集は、原資料に対する症例報告書（ＣＲＦ：Ｃａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔ Ｆｏｒｍ）の検証及び照合により保証された（原資料検証）。収集されたデータは電子データベースに入力され、データベースのロックの前に、品質保証検査に供された。
試験サイトへのモニタリング来院は、プロトコールのすべての態様が順守されたことを確認するため、本試験の間、定期的に行われた。出資者、又はその被指名人（試験モニター）は、現地の要件に従い対象者の機密性が維持されることを条件に、治験責任医師に接触及び訪問し、要求に応じて、様々な試験関連の記録及び原資料を調査することを許可された。原資料は原本と定義され、データ及び記録には、治験責任医師のファイル、試験薬剤、対象者の記録、インフォームドコンセント書類、ならびにＣＲＦ及び関連資料のレビューが含まれるがこれらに限定されない。
プロトコール順守、ならびにプロトコールに入力されたデータの完全性、一貫性及び正確性を検証するために、試験期間を通じて一定間隔でＣＲＦを調査することはモニターの責任であった。モニターは、臨床検査報告書、及びＣＲＦへの入力事項を検証するために必要とされる他の記録にアクセスした。モニタリング来院の間、治験責任医師、及び他の試験に関係する職員に会うことができること、及びこれらモニタリング来院の過程で検出されたあらゆる課題を確実に解決するためのプロセスに充分な時間が充てられていることが重要であった。
試験サイトはまた、出資者又は独立した監査役により、本試験がプロトコール、ＧＣＰ、ＩＣＨ要件、及び適切な規制に従い実施されたことを検証するための品質保証監査に供されることができた。そのような環境下で、スポンサーが指定した監査役は、監査来院を準備するため、前もってサイトに接触した。監査役は、検査サンプルが収集された施設、薬剤が保存及び調製された施設、ならびに本試験の間に使用された任意の他の施設を訪問することを要求することができた。さらに、本試験は、国の、又は国際的な規制当局により監査され得る可能性があった。もし本試験サイトが査察のために任意の規制機関と接触した場合、出資者はただちに通知されるものとした。治験責任医師は、査察及び監査の間、試験書類への直接アクセスを許可することとしていた。
本試験の統計解析計画書（ＳＡＰ）は、データベースのロックの前に、Ｃｏｐｐｅｒ Ｒｏｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．により準備された。以下の規格が含まれた。
安全性集団（ｓａｆｅｔｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）は、少なくとも１つの用量の試験ワクチンが投与され、投与後安全性データが取得されたすべての無作為化対象者から構成された。対象者は実際に受けた治療に従い、解析された。
フル・アナリシス・セット（ｆｕｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｅｔ）は、少なくとも１つの用量の試験ワクチンが投与され、免疫原性のための投与前及び投与後の有効な血液サンプルが受領されたすべての無作為化対象者から構成された。対象者は、実際に受けた治療に関わらず、無作為に割り当てられた治療に従い解析された。
パー・プロトコール集団は、データベースのロックの前に定義される、重大なプロトコール違反が無く試験を終了したすべての無作為化対象者から構成された。対象者は、実際に受けた治療に従い解析された。すべての無作為化対象者に関し、登録、配置、及び重要なプロトコールの逸脱の集計が提示される。デモグラフィック、ベースライン特性、及び安全性データの集計は、安全性集団に基づいた。免疫原性データの集計は、フル・アナリシス・セットならびにパー・プロトコール集団に基づいた。データ一覧は、すべての無作為化対象者に関するすべての利用可能なデータを提示した。
対象者の配置の集計は、無作為化され、試験ワクチンを投与され、試験を完了又は中止した対象者の数を提示した。また、試験終了／中止に関する理由に従い、試験を完了しなかった対象者の数を示すこの集計には、中止の対象者が含まれた。各解析セットに含まれた対象者の数及び割合の集計は、すべての無作為化対象者に関し、治療群により集計された。対象者、及び任意の解析セットからの除外理由の一覧もまた提示された。対象者の配置、理由を伴う無作為化からの排除、治療アームへの割り当て、除外理由を伴う解析セットへの含有、及び早期終了理由を伴う試験完了が、データ一覧に提示された。
試験期間中に報告された重大なプロトコールの逸脱が記録された。重大なプロトコールの逸脱（ＩＰＤ）は、試験結果に影響を与える可能性がある逸脱と定義された。試験データベースのロックの前に、プロトコールの逸脱はレビューされ、ＩＰＤが特定された。これらＩＰＤはデータ一覧中に集計された。データ一覧中に既往歴が提示された。
デモグラフィックデータ（年齢、性別、及び人種）及びベースライン特性（身長、体重、肥満度指数（ＢＭＩ））は、記述統計学及び度数分布表を用いて集計された。
ＥＶ７１に対する中和抗体は、ｌｏｇ変換を用いて各試験日のＧＭＴを算出することにより集計され、報告を目的として、累乗法により元の単位へと戻した。記述統計学には、対象者の数（ｎ）、幾何平均、及び幾何平均に対する９５％信頼区間が含まれた。
ＥＶ７１に対する中和抗体力価のベースラインを上回る倍数増加は、未変換力価を用いて、各ベースライン後の試験日における力価値をベースライン値で割ることにより、各試験日で算出された。ベースラインを超える倍数増加は、試験日及び治療群による記述統計を用いて集計された。さらに、ベースラインの４倍の増加と定義された、抗体陽転に達した対象者の数及び割合が各試験日で集計された。１回目のワクチン接種後の任意の時点で抗体陽転に達した対象者の数及び割合の全体的な集計が提示された。免疫反応の持続性は、ブーストワクチン接種後２か月（８４日目）及び６か月（１９６日目）での幾何平均中和抗体力価（ＧＭＴ）、ベースラインを超える倍数増加、及び抗体陽転の割合に対して、上記の解析を繰り返すことにより評価した。
ＭｅｄＤＲＡ（第１２．０版）器官別大分類（ＳＯＣ：ｓｙｓｔｅｍ ｏｒｇａｎ ｃｌａｓｓ）及び基本語（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｅｒｍ）によりカテゴライズされる自発性の治療−出現性の有害事象が度数分布表に列挙及び集計された。度数分布表には、事象数、各事象を１回以上経験した固有対象者数、及び各事象を１回以上経験した対象者の治療群に対する割合を含んだ。試験薬剤に関連した有害事象（ＡＥ）の度数分布表もまた提示された。
有害事象はまた、事象を経験した対象者の数及び割合に関し、最大重篤度により一覧にされた。最大重篤度による一覧化において、同じ基本語に対してコード化された２以上の事象があった対象者は、最も重篤な事象に従い分類された。各有害事象の持続期間は、ＡＥが停止した日付−ＡＥが開始した日付＋１として算出された。持続期間は記述統計学を用いてＳＯＣ、基本語、及び治療により集計された。重篤なＡＥ、死亡、及び本試験の早期中止へと至るＡＥは、データ一覧に記載された。
非自発性有害事象は、ワクチン接種用量（１回目又は２回目）、及び治療群により集計された。これら度数分布表は、各ワクチン接種用量及び治療群に対する、事象数、各事象を１回以上経験した固有対象者数、及び各事象を１回以上経験した対象者の割合を含んだ。割合に対する分母は、関連集計表に関する、ワクチン接種用量を受けた対象者の数である。また、非自発性ＡＥは最も高い強度により集計された。この作表において、ＡＥを複数回経験した対象者は、最も強いＡＥにより分類された。
各症状の累積日数は、各１４日の追跡期間中に日誌で報告され、記述統計学を用いて症状、治療群、及びワクチン接種用量により集計された。各追跡期間の１４日目に報告された症状はすべて、別々のデータ一覧に記載された。対象者の日誌からの追加の項目には、口腔体温、発赤及び腫れのサイズ、おう吐回数、ならびに全体的なワクチン耐容性の評価が含まれ、ワクチン接種用量及び治療群により集計された。対象者の症状に関する日誌には、非自発性ＡＥ及びすべての追加症状、ならびに対象者により報告されたコメントが含まれ、データ一覧に示された。
疼痛、圧痛、紅斑／発赤、硬結／腫れ、及び掻痒／かゆみといった注射部位反応は、各試験日及び時点での重篤度により、各反応を経験した対象者の数及び割合を示す度数分布表を用いて集計された。２名の監視対象者に関し、試験１日目及び２日目に記録された注射部位の反応は集計されなかったが、データ一覧には記載された。２名の監視対象者に関し、他の全試験日に記録された注射部位の反応は集計表に含まれ、ワクチン接種用量及び治療群により集計された。
健康診断の結果（正常、異常）は、体組織及び試験日により度数分布表中に集計された。
記述統計学の２つの集計表（例えば、Ｎ、平均、ＳＤ、最小、メジアン、最大）は、観察されたバイタルサインのデータに関し記載された。１つ目の表には、口腔体温（℃）、脈拍数（１分当たりの脈拍）、呼吸数（１分当たりの呼吸）、及び血圧（収縮期血圧及び拡張期血圧、ｍｍＨｇ）に関する１９６日目までの 各試験日に対する観察された値の記述統計学の集計を含んだ。
２つめの集計表は、前述のバイタルサインのパラメータに関する、１９６日目までの各投与日での各用量後の時点に対する、観察されたベースライン値からの変化に関する記述統計学の集計を含んだ。２名の監視対象者について試験１日目及び２日目に記録されたバイタルサインは、前述のようには集計されなかったが、データ一覧には提示された。他の全試験日の監視対象者に関するデータは、集計表に含まれた。スクリーニング時に行われた１２誘導ＥＣＧの結果は、データ一覧にのみ記載された。
血液検査及び臨床化学検査の観察されたデータは、試験日及び治療群により、記述統計学（平均、ＳＤ、メジアン、最小及び最大）を用いて、観察された値及びベースラインからの変化に関して集計された。また、血液検査のデータ、臨床化学検査のデータ、及び尿検査のデータは、毒性グレードのベースラインからのシフトを比較したシフト表に集計された。
他のすべての臨床検査データは、データ一覧でのみ記載された。臨床検査データのすべての一覧において、所与のパラメータに対する正常範囲が利用可能であった場合、一覧に含めた。さらに、範囲外の値は、「Ｌ」又は「Ｈ」（それぞれ、正常下限値よりも低い、又は正常上限値よりも高い）を用いて印をつけられた。また、一覧は、毒性グレード、ベースラインからの最大グレードのシフト、及びベースラインからの結果の変化を提示する。血液検査及び臨床化学検査が繰り返された場合、最初に予定された収集物からの値を統計学的集計に使用した。データ一覧にはすべての値が含まれた。
試験ワクチンの最初の用量の前に中止された治療薬は、前治療薬と見なされた。試験ワクチンの最初の用量の後に開始され、かつ試験中にも継続された治療薬、又は試験ワクチンの最初の用量時、もしくは用量後に開始された治療薬は、併用薬として報告された。前治療薬及び併用薬は、別々のデータ一覧において対象者により記載された。
以下の追加データは、データ一覧のみとして、対象者により提示された。組み入れ基準及び除外基準、無作為化及びインフォームドコンセント、試験薬投与、コメントログ、及び ログ終了検証。
本試験は、健常な成人における、２つの用量レベルの不活化ＥＶ７１ワクチンを用いたワクチン接種の短期の安全性及び耐容性及び免疫原性を評価するための探索的試験である。したがって、本試験は、潜在的な安全性及び免疫原性のデータにおける何らかの治療群間の差異を検出するための統計的検出力は無い。３６というサンプルサイズは、安全性及び耐容性に関する早期データを提供する最小数の対象者からのデータを提供するために選択された。
総数で３６名の対象者が本試験に登録された。３６名の対象者のうち３５名が予定されたとおりに本試験を完了し（すなわち、５６日目まで、試験を完了した）、予定された被験製品の両方の用量を受けた。高用量群の１名の対象者が、最初の用量後、管理上の理由により同意を取り下げた。
プロトコール逸脱の一覧は、サイトの試験モニターにより作製された観察結果、及び試験データベースのレビューから取得された。プロトコールの逸脱は、３６名の対象者のうち２８名に報告された。主要なプロトコールの逸脱は、適格性の逸脱、及び対象者の来院の遅延に関連したものであった。
有効性の評価
全ての対象者が、安全性集団、フル・アナリシス・セット、及びパー・プロトコール集団に含まれ、したがって、すべての対象者が、解析されたすべてのデータセットに使用された。本試験で取得された有効性データに対し、正式な統計解析は行われなかった。早期に本試験から離脱したすべての対象者に対し、早期の終了来院時に収集された免疫原性データ及び安全性データのすべてが、集計表から除外されたが、データ一覧には記載された。
全用量群の性別、年齢、身長、体重、及びＢＭＩに関する平均デモグラフィックの集計を、表１５に記載する。
表１５ 平均（ＳＤ）デモグラフィックの集計
本試験に登録されたすべての対象者がアジア人であった。対象者は、年齢、身長、体重及びＢＭＩに関し、全治療群にわたりよく一致していた。平均年齢は、適応ＥＶ７１ワクチン群は３１〜３４歳、プラセボ群は３０〜３１歳であった。ＢＭＩの範囲は、全治療群で２２．５〜２３．８であった。性別に関し、適応ＥＶ７１ワクチン用量群において対象者は比較的よく一致していた。プラセボ群においては、男性対象者の割合が高かった。既往歴はスクリーニング時に記録された。本試験の標的集団は、健常な成人であった。スクリーニング時、臨床的に意義のある何らかの進行中の既往歴を有していた対象者は本試験に登録されなかった。標準的な１２誘導ＥＣＧがスクリーニング時に行われた。全ての対象者が、本試験への登録前、正常なＥＣＧを有していた。ＥＶ７１逆数中和抗体力価のレベルは、スクリーニング時に測定され、表１６に提示されている。
表１６ スクリーニング時のＥＶ７１逆数中和抗体力価
表１６に示されるように、低用量群において、対象者のほとんど（７２．２％）がスクリーニング時、低レベルのＥＶ７１中和抗体を有し、６名の対象者（３３．３％）は逆数ＥＶ７１力価が８であり、５名の対象者（２７．８％）が１６であり、２名の対象者（１１．１％）が３２であった。同様に、高用量群において、対象者のほとんどがスクリーニング時、低レベルのＥＶ７１中和抗体を有し、２名の対象者（１１．１％）は逆数ＥＶ７１力価が＜８であり、５名の対象者（２７．８％）が８であり、２名の対象者（１１．１％）が１６であり、３名の対象者（１６．７％）が３２であった。
ＥＶ７１中和抗体レベルの解析のために、血清が、０日目（用量前）、１４日目、２８日目（用量前）、４２日目、５６日目、８４日目、及び１９６日目に取得された血液サンプルから調製された。免疫原性のデータは、ＧＭＴ、ならびにＧＭＴの倍数増加及び抗体陽転として以下の表１７に記載されている。
表１７ ＥＶ７１中和抗体力価の幾何平均の集計
a GMT (95% CI) = 幾何平均力価 (95% 信頼区間)
ＥＶ７１中和抗体のレベルはＧＭＴとして表され、低用量群及び高用量群の両方において、４２日目（２回目の用量後１４日）で最も高かった。低用量群において、適応ＥＶ７１ワクチンの１回の用量後、ＧＭＴは投与後１４日で２０．２から１２８．０へと増加した。２回目の用量後、ＧＭＴは８０．６（２８日目、用量前）からワクチン接種後１４日（４２日目）で３２２．５へと増加した。ＧＭＴは５６日目から１９６日目で若干低下したが（それぞれ、２０３．２及び８０．６）、それでも高いレベルを維持しており、２回目の用量後、６か月に至るまでベースライン値のおよそ４倍であった。プラセボ群のＧＭＴは、試験期間中に解析されたすべての時点で、ベースライン値と同様であった。
同様に、高用量群において、適応ＥＶ７１ワクチンの１回の用量後、ＧＭＴは０日目（用量前）の２８．５から、ワクチン接種後１４日で１４３．７へと増加した。２回目の用量後、ＧＭＴは９９．５（２８日目、用量前）からワクチン接種後１４日（４２日目）で４５１．４へと増加した。ＧＭＴは５６日目から１９６日目で若干低下したが（それぞれ、２０３．２及び１４５．２）、それでも高いレベルを維持しており、２回目の用量後、６か月に至るまでベースライン値の少なくとも５倍であった。プラセボ群のＧＭＴは、試験期間中に解析されたすべての時点で、ベースライン値と同様であった。
ＧＭＴにおける継時的な増加の程度は、ＥＶ７１に対する中和抗体力価のベースライン値（０日目）を超える倍数増加として表されており、各試験日で算出され、記述統計学を用いて集計された。表１８において、継時的な、及び治療群間のＧＭＴにおける倍数増加の集計を示す。
表１８ 平均（ＳＤ）中和抗体力価の集計：ベースラインを超える倍数増加
表１８に示されるように、２８日目〜１９６日目で、ベースラインを超える倍数増加として表されているＧＭＴが、低用量群と比較し、高用量群でより高く増加した。ＧＭＴの最も高い増加は、低用量群及び高用量群の両方とも４２日目で観察され、それぞれ０日目と比較し、２３倍及び３２倍、力価が増加していた。４２日目での高い抗体レベルは、２８日目に与えられた適応ＥＶ７１ワクチンのブースター用量によるものであると説明することができる。プラセボ群においては、ＧＭＴの増加は最小限であった。
抗体陽転とは、ベースライン後の少なくとも４倍の抗体力価の増加と定義された。抗体陽転率（ＳＣＲ）の集計を表１９に示す。全試験ＳＣＲ（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｔｕｄｙ ＳＣＲ）は、試験中の任意の時点で抗体陽転に達した対象者の割合と定義された。
表１９ 抗体陽転率の集計
これらの結果から、抗体陽転に達した対象者の割合は、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、及び８４日目で高用量及び低用量の適応ＥＶ７１ワクチン群の間で類似していたことが示された。１９６日目では、低用量群と比較し、高用量群において高い割合の対象者が抗体陽転に達していた（それぞれ、５８．３％に対して、８１．８％）。低用量プラセボ群の対象者は、試験期間中のいずれの時点でも抗体陽転しなかった。高用量プラセボ群の１名の対象者は８４日目に抗体陽転したが、プラセボ群のＧＭＴは１９６日目までの試験期間を通じて低いままであった。
早期に試験から降りた対象者に関しては、免疫原性及び安全性のすべてのデータは、早期終了来院時に収集され、集計表からは除外されたが、データ一覧には記載された。欠損している値は、空白、不明、行われなかった、又はＣＲＦ上で適用不能であった値として定義された。欠損しているベースライン評価は、同じ評価に関してスクリーニング時の測定値が存在し、かつスクリーニング来院が試験ワクチンの最初の用量日前の４２日以内に行われている場合を除き、補完されなかった。予定された来院時に欠損している免疫原性のエンドポイントは、補完されなかった。ＥＶ７１に対する中和抗体力価が検出限界を下回った場合、＜８と報告された。これら力価は、解析の目的に対し、８に等しいと設定された。該当する場合、データ一覧では、このデータを「＜８」と示した。自発性ＡＥ及び併用薬について欠損している日付は、事象の時間を試験治療と関連させて確立させることを目的として補完された。全てのデータ一覧には、ＣＲＦ上に報告された際のデータよりもむしろ補完データが提示された。免疫原性データに関する３つの非盲検中間解析が行われた。
免疫原性の結論
本試験のさらなる目的は、本試験の間のさまざまな時点で採取された血清中のＥＶ７１中和抗体のレベルを測定することによる、適応ＥＶ７１ワクチンの免疫原性を評価することであった。
低用量群と比較して、高用量群において、より高いＧＭＴが観察された。低用量群及び高用量群の両方において、中和力価という観点で観察された免疫反応は、類似したパターンをたどり、ＧＭＴの増加は最初の用量の１４日後（１４日目）及び２番目の用量の１４日後（４２日目）で観察された。両用量群において、最も高いＧＭＴは４２日目に観察された。両用量群において、５６日目から１９６日目にかけて継時的にＧＭＴが若干低下したが、この期間もＧＭＴはベースライン値を優に上回って維持された。両プラセボ群のＧＭＴ（低用量群及び高用量群）は、本試験の期間中ずっとベースラインレベルに維持されていた。
抗体陽転（ＥＶ７１中和抗体レベルがベースラインよりも≧４倍増加したときと定義された）は、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、及び８４日目で、高用量群及び低用量群は類似していた。１９６日目では、低用量群と比較し、高用量群の対象者はより高い割合で抗体陽転に達していた（それぞれ５８．３％に対して８１．８％）。低用量群及び高用量群のすべての対象者が、４２日目（２回目の用量の１４日後）で抗体陽転した。プラセボ群の１名の対象者が８４日目で抗体陽転したが、プラセボ群のＧＭＴは、１９６日目までの本試験の期間中、低いままであった。
要約すると、低用量群と比較し、高用量群において高いＧＭＴが観察された。低用量群及び高用量群の両方において、中和力価という観点で観察された免疫反応は、類似したパターンをたどった。両用量群において、最も高いＧＭＴは４２日目に観察された。低用量群及び高用量群のすべての対象者は４２日目（２回目の用量の１４日後）に抗体陽転し、高用量群及び低用量群の抗体陽転率は類似していた。両用量群において、５６日目から１９６日目にかけて継時的にＧＭＴが若干低下したが、この期間もＧＭＴはベースライン値を優に上回って維持された。
安全性評価
総数で３６名の対象者がこの安全性解析に含まれた。３６名の対象者のうち３５名が適応ＥＶ７１ワクチンの両方の用量を受けた（０日目及び２８日目）。高用量群の対象者１４７は、適応ＥＶ７１ワクチンに割り当てられたが、同意の取り下げにより２回目の用量を受けなかった。
５６日目までに、２つの用量群全体で、３６名の対象者のうち２２名から総数で４２件のＡＥが報告された。低用量群では、１８名の対象者のうち１１名が、総数で２２件のＡＥを報告した。高用量群では、１８名の対象者のうち１１名が、総数で２０件のＡＥを報告した。
すべてのＡＥは、中等度の重篤度である１件の事象（痔）を除き、重篤度は軽度であるとみなされた。２件の事象のみ、治験品と関連しているとみなされた。両事象とも、プラセボに無作為化された対象者の低用量群において発生した。これら対象者のうちの１名は、筋骨格の凝りがあり、もう１名は頭痛があった。
最も高い頻度で報告された有害事象は、「呼吸器、胸部、及び縦隔の疾患」の器官別大分類の有害事象であり、咳、鼻漏、及び口腔咽頭の痛みが含まれた。本試験において重篤な有害事象（ＳＡＥ）は報告されなかった。ＡＥを理由として本試験から離脱した対象者はいなかった。全ての治療群全体で発生した、最も高い頻度で報告されたＡＥを、表２０に提示する。
表２０ 有害事象の集計
「呼吸器、胸部、及び縦隔の疾患」の器官別大分類の有害事象は、高用量及び低用量の両群全体で最も高い頻度で報告された事象であった。この器官別大分類で最も高い頻度で報告されたＡＥは、咳及び口腔咽頭の痛みであり、低用量群で発生率が最も高く、両事象は３名（２５％）の対象者で観察された。低用量プラセボ群の１名の対象者（１７％）も咳を報告した。高用量群では、口腔咽頭の痛みを報告した対象者はおらず、１名（８％）の対象者のみ咳を報告した。鼻漏は高用量群でのみ観察された。この事象は、適応ＥＶ７１ワクチン群の２名の対象者（１７％）、及びプラセボ群の２名の対象者（３３％）が経験した。
その他の高い頻度で報告されたＡＥは、「消化管の疾患」の器官別大分類に分類された。これらは、低用量群の１名の対象者（８％）と比較して、高用量群の４名（３３％）で最も頻繁に報告され、プラセボ群では報告されなかった。高用量群の消化管疾患には、腹部膨満、胃食道逆流症、痔、口の潰瘍形成、及びおう吐が含まれた。低用量群において、１名の対象者が上部腹痛及び下痢を経験した。
全身性の疾患及び投与部位の状態は、高用量群でより頻繁に報告され、低用量群の１名の対象者（８％）と比較し、３名の対象者（２５％）であった。低用量群において、適応ＥＶ７１ワクチン群の１名の対象者（８％）、及びプラセボ群の１名の対象者（１７％）が発熱を経験した。高用量群においては、２名の対象者（１７％）で発熱が報告された。
すべてのＡＥは、重篤度が中程度であった１件の経験事象を除き、重篤度は軽度であった。その事象は痔であり、最初のワクチン接種の８日後に発生し、２日間継続した。
もし治験品の投与が疑いなく関与した、又は関与の可能性があるとみなされた場合に、有害事象は関連したとみなされた。治験品の投与が関連したとみなされたのは、２件の有害事象のみであり、両対象者とも低用量群であり、プラセボに割り当てられていた。その事象は首の凝り及び頭痛であった。両事象は、重篤度は軽度であった。
注射部位は、疼痛、圧痛、紅斑、硬結及び掻痒に関して０日目（ワクチン接種後５分、３０分、及び６０分）、３日目、７日目、１４日目、２８日目（ワクチン接種後５分、３０分、及び６０分）、３１日目、３５日目 、及び４２日目に評価された。
表２１及び表２２は、注射部位に反応があった対象者の数の集計を提示する。評価は、治験責任医師により行われ、各症状に対して以下のグレードが使用された。グレード１（軽度）、グレード２（中等度）、グレード３（重度）、又はグレード４（致死的）。疼痛、圧痛、及び掻痒は、症状の重篤度に従いグレード化された一方で、紅斑及び硬結は、罹患面積の大きさに従いグレード化された（グレード１＝２．５〜５ｃｍ、グレード２＝５．１〜１０ｃｍ、グレード３＝＞１０ｃｍ、グレード４＝壊死）。
表２１ 最初の用量後の注射部位の反応
a注射部位は、０日目の用量後５分、３０分、及び６０分で評価された。b１名の対象者が、１４日目の評価を完了しなかった。
表２２ ２回目の用量後の注射部位の反応
a 注射部位は、０日目の用量後５分、３０分、及び６０分で評価された。b １名の対象者が、２８日目の前に辞退した。
c １名の対象者が３１日目の評価を完了しなかった。d １名の対象者が、３５日目の評価を完了しなかった。
全体として、注射部位の反応は、数件報告された。いずれの治療群（適応ＥＶ７１ワクチン又はプラセボ）においても最大で１名の対象者のみが、所与の評価時点での何らかの症状を報告した。適応ＥＶ７１ワクチン群とプラセボ群の間、又は低用量群と高用量群の間、又は１回目の用量と２回目の用量の間に反応の頻度における差異はなかった。
非自発性の有害事象は、対象者の日誌を用いて収集された。対象者は、各ワクチン接種の当日から始まり、その後１４日間（０日目〜１４日目、及び２８日目〜４２日目）は日誌をつけることを依頼された。これら事象は、自発性事象に加えられたことに注記されたい。表２３において、対象者の日誌で捕捉され、記録された症状の集計を提示される。
表２３ 日誌の症状の集計
対象者の日誌において最も高い頻度で捕捉された事象は注射部位の疼痛であった。治療群間の発生率は類似しており、低用量適応ＥＶ７１ワクチン群では１０名の対象者（８３％）、高用量適応ＥＶ７１ワクチン群では９名（７５％）の対象者が報告された。低用量プラセボ群と高用量プラセボ群の両方では、少数の対象者が注射部位の疼痛を経験しており、低用量プラセボ群では２名（３３％）の対象者、高用量プラセボ群では１名（１７％）の対象者であった。
低用量及び高用量の適応ＥＶ７１ワクチン群間で筋肉痛及び疲労の発生率も類似していた。両方のプラセボ群において、適応ＥＶ７１ワクチン治療群と比較して少数の対象者が筋肉痛及び疲労を経験していた。頭痛は、低用量適応ＥＶ７１ワクチン群の１名の対象者（８％）と比較し、高用量適応ＥＶ７１ワクチン群においては４名の対象者（３３％）が報告された。各プラセボ群では１名の対象者（１７％）が頭痛を経験した。注射部位の浮腫は、高用量適応ＥＶ７１ワクチン群のみで対象者から報告された（４名の対象者（３３％）） 同様に、悪心は、高用量適応ＥＶ７１ワクチン群のみで対象者から報告された（２名の対象者（１７％））。
注射部位のかゆみ及び紅斑の発生率は低用量群と高用量群で同じであり、各群の１名の対象者（８％）から報告されたが、プラセボ群では対象者から報告されなかった。要約すると、日誌に記録された症状の数は、プラセボと比較し、高用量及び低用量の治療群において多かった。
本試験群の少数に対して、有害事象の頻度又は重篤度の正式な統計解析は行われなかった。本試験の間、死亡又はＳＡＥは報告されなかった。
臨床検査パラメーターの評価
各臨床検査パラメーターについての毒性グレードは、有害事象共有用語基準（ＣＴＣＡＥ：Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）、第４版、２００９年、又はアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ：Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の業界向けガイダンス：予防ワクチン臨床試験に登録された健常な成人及び青年ボランティアに対する毒性グレードスケール（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｃａｌｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈｙ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ）、２００７年９月、のいずれかを用いて決定された。０日目以降のすべての毒性グレードは、ベースライングレードと比較され、毒性グレードにおけるあらゆる変化又はシフトが解析された。
血清化学検査に関しては、高用量適応ＥＶ７１ワクチン群と比較し、低用量適応ＥＶ７１ワクチン群において、対象者はベースラインからの頻度変化を経験した。低用量群において、グルコースの上昇が最も高い頻度で報告された事象であり、次いで、カリウムの低下、ナトリウムの上昇、及びグルコースの低下が続いた。高用量群においては、グルコースの上昇及び低下が最も高い頻度で報告された値のシフトであった。変化の大部分は、１グレード又は２グレードであった。
本試験において、１つの４グレードの変化が報告された:グルコースの上昇。この対象者は、低用量適応ＥＶ７１ワクチン群に無作為化されていた。この対象者は、０日目のグルコースレベルは低く、３．５ｍｍｏｌ／Ｌ（正常範囲は４〜７．８ｍｍｏｌ／Ｌ）であったが、７日目〜３５日目に正常限界の範囲内に戻り、そして再び正常限界以下の３．４ｍｍｏｌ／Ｌへと落ちた。５６日目にはグルコースレベルは８．８ｍｍｏｌ／Ｌへと大幅に増加した。０日目と比較した５６日目の全体的な変化は、この期間にわたる４グレードのシフトを生じさせた。この事象は有害事象としては報告されず、治験責任医師により臨床的に意義があるとはみなされなかった。
血液検査における最も重要な変化は、ヘモグロビンの低下であった。同様の頻度のヘモグロビンにおける値のシフト（主には１グレード）は、高用量群及び低用量群の両方で観察された。尿検査に関する値で最も多く報告された変化は、尿中赤血球の存在に関する変化であった。これら１グレードの変化は、適応ＥＶ７１ワクチン高用量群及びプラセボ用量群、ならびに適応ＥＶ７１ワクチン低用量群の両方において記録された。血清化学検査、血液検査、及び尿検査に関し、最も高い頻度で報告された、ベースラインからの値のシフトの集計を表２４に示す（これらのシフトは、ワクチン群（Ｖ）及びプラセボ群（Ｐ）の両方に関して報告されている）。
表２４ 高い頻度で報告された、ベースラインからの値のシフトの集計
＊ いずれか用量群において、２０％を超える対象者に対して値が記録された場合の検査結果
１９６日目までの試験の全期間にわたる体温、脈拍数、呼吸数、及び血圧（収縮期及び拡張期）を含むバイタルサインが評価された。記録されたバイタルサインのいずれに対しても、臨床的に意義のある所見はなかった。脈拍数、呼吸数、及び血圧は、期間中、比較的一定であり、治療群間に差異は観察されなかった。継時的なベースラインからの体温変化に関するレビューは、若干大きな増加（すなわち、０．５℃を超える増加）が、０日目に観察されたことを示した：適応ＥＶ７１ワクチンの高用量群に関し、用量後５分及び３０分（それぞれ０．５３℃及び０．５５℃の平均変化）と比較して、同時点で低用量群は０．２９℃及び０．２４℃、プラセボ低用量群は０．２５℃及び０．３７℃であり、プラセボ高用量群は０．２５℃及び０．４８℃の平均増加であった。
スクリーニング時、０日目及び２８日目のワクチン投与前、及び５６日目に、各対象者に対し、治験責任医師又は彼の被指名者により徹底的な健康診断が行われた。適応ＥＶ７１ワクチン低用量群において、５６日目の対象者に対し、１件のみの異常な身体所見（耳、鼻、食道、及び首）があり、その後に有害事象の扁桃炎として報告された。いずれの時点でも重要な他の身体所見は対象者のいずれに対しても報告されなかった。
安全性の結論
５６日目までに総数で４２件のＡＥが２つの用量群にわたる３６名の対象者のうち２３名から報告された。低用量群においては、１８名のうち１２名の対象者が総数で２２件のＡＥを報告した。高用量群においては、１８名のうち１１名の対象者が総数で２０件のＡＥを報告した。
すべてのＡＥは、中等度の重篤度であった１件の事象を除き、重篤度は軽度であるとみなされた。２件の事象のみ、治験品と関連しているとみなされ、両事象とも、低用量群において発生していた。１名の対象者は筋骨格の凝りがあり、もう１名は頭痛があった。両対象者とも、プラセボ群に無作為化されていた。最も高い頻度で報告されたＡＥは、咳、鼻漏、発熱及び口腔咽頭の痛みが含まれた。
注射部位反応の発生率は低く、最大で１７％の対象者がいずれかの１時点で反応を経験していた。注射部位の反応はほとんどが、プライム用量及びブースター用量（０日目と２８日目）の両方のワクチン接種後、６０分以内に認められた。適応ＥＶ７１ワクチン群及びプラセボ群の間、又は低用量群と高用量群の間、又はプライム用量とブースター用量の間に反応頻度の差異は無かった。
ベースラインからの値のシフトは、高用量群と比較し、低用量群の対象者により多く経験されていた。グルコースの上昇は、血清化学検査に関し、最も高い頻度で報告された変化であった。血液検査及び尿検査のパラメーターに対しても値の変化が観察された。低用量群と高用量群の間で発生率は類似していた。有害事象としての値の変化は報告されておらず、又は臨床的に意義があるとみなされた値の変化もなかった。
５６日目に１件のみ、異常な身体所見（耳、鼻、食道、及び首）があり、その後に有害事象の扁桃炎として報告された（適応ＥＶ７１ワクチン低用量群）。いずれの時点でも重要な他の身体所見は対象者のいずれに対しても報告されなかった。要約すると、低用量レベル及び高用量レベルの両方で、適応ＥＶ７１ワクチンは安全であり、良好な耐容性があるとみなされた。
全体的な結論
本件は、適応ＥＶ７１ワクチンに関する、ヒトにおける最初の臨床試験である。本試験の１つの目的は、健常な成人における適応ＥＶ７１ワクチンの安全性及び耐容性を評価することであった。低用量の組成物は、適応ＥＶ７１ワクチンの安全性に関する初期評価を提供することを意図していた。
ＡＥのレビューから、ＡＥの発生率は治療群間、用量群間、及び１回目の用量と２回目の用量の間で類似していた。すべてのＡＥは、中等度の重篤度であった１件の事象を除き、重篤度は軽度であるとみなされた。２件の事象のみ、治験品と関連しているとみなされた。その事象は、筋骨格の凝りと頭痛であり、両方とも重篤度は軽度で、低用量群で発生し、２名の対象者で報告されており、両者ともプラセボを投与されていた。
注射部位反応の発生率はすべての用量群及び治療群の間で類似しており、及び最小限であり、１７％の対象者のみがいずれかの１時点で反応を経験していた。注射部位反応の大部分がプライム用量及びブースター用量（０日目及び２８日目）の両方に関し、ワクチン接種後６０分以内に発生していた。臨床検査パラメーターに関し、観察された値の変化で、有害事象として報告されたものはなく、又は治験責任医師により臨床的に意義があるとみなされたものもなかった。
本試験の他の目的は、本試験が行われている間の様々な時点で採取された血清中のＥＶ７１中和抗体のレベルを測定することにより、適応ＥＶ７１ワクチンの免疫原性を評価することであった。低用量群と比較し、高用量群で、より高いＧＭＴが観察された。低用量群及び高用量群の両方において、中和力価という観点で観察された免疫反応は、類似したパターンをたどった。両用量群において、最も高いＧＭＴは４２日目に観察された。低用量群及び高用量群のすべての対象者は４２日目（２回目の用量の１４日後）に抗体陽転し、高用量群及び低用量群の抗体陽転率は類似していた。両用量群において、５６日目から１９６日目にかけて継時的にＧＭＴが若干低下したが、この期間もＧＭＴはベースライン値を優に上回って維持された。
要約すると、低用量レベル及び高用量レベルの両方とも、適応ＥＶ７１ワクチンは安全であり、良好な耐容性であるとみなされた。低用量レベル及び高用量レベルの両方の適応ＥＶ７１ワクチンの１回及び２回の用量投与後に、ＥＶ７１中和力価及び抗体陽転という観点で良好な免疫反応が観察され、それは１９６日目まで持続した。
実施例９：Ｖｅｒｏ細胞におけるＣＶＡ６の適応
ＣＶＡ６の適応は、Ｖｅｒｏ細胞中での１１回の継代にウイルス源を供することにより行われた。実施例１に記載される適応プロトコールと同様に、２ラウンドのトランスフェクションがＣＶＡ６に対して使用された。しかし、ＣＶＡ６はＶｅｒｏ細胞中でプラークを形成しないため、２ラウンドのトランスフェクション後、限界希釈による２ラウンドのクローニングが行われた。
継代数が異なる適応ウイルスに対するＴＣＩＤ５０中和アッセイの結果を表２５に示す。
表２５ ＣＶＡ６の適応
ＣＶＡ６ Ｐ−１１ウイルスは、単層中に及ぶ広範な細胞円形化を引き起こすが、Ｖｅｒｏ細胞中のような明白なＣＰＥは示さない。ＣＶＡ６ Ｐ−１１は、将来的な再誘導及びクローン選択に使用されている。
適応ＣＶＡ６の全長ゲノムの配列解析
ＲＮＡは１回の凍結融解サイクルを行った後の浄化採取物から精製された。全長ゲノムにおよぶ４つのＤＮＡ断片（図６）を、ＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＮＡから増幅させた。
配列解析は、サンガーサイクルシークエンス法により、ＵＷ−Ｂｉｏｔｅｃｈセンターで行われた。配列はＤＮＡｓｔａｒ（Ｌａｓｅｒ ｇｅｎｅ）ソフトウェアを用いてアセンブリされ、ＰｕｂＭｅｄのＢＬＡＳＴプログラムを用いて比較された。総数で２１か所のヌクレオチド変化が、ＣＶＡ６ Ｐ−０とＣＶＡ６ Ｐ−１１の間で認められた（図７）。
表２６ ＣＶＡ６の全長ゲノムの配列解析：Ｐ−０とＰ−１１
５’ＵＴＲ領域において、より多くの数の変化（９ヌクレオチド）がクラスター化していた（表２６）。適応ＣＶＡ６株で特定された９つの核酸置換は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の１位、１３位、１４位、１５位、１６位、２１位、２３位、３４位、及び４０位に位置していた。ＶＰ１タンパク質において、最も多くの数のアミノ酸突然変異（４）が観察された。４つのアミノ酸置換、及び配列番号２内のそれらの各位置を上記の表２６に示す。 配列解析の結果に基づくと、ＣＶＡ６ Ｐ−１１のＶＰ１タンパク質中のすべてのアミノ酸突然変異（４６Ａ−Ｖ、９０Ｅ−Ｋ、９６Ｔ−Ａ、２６８Ｖ−Ｉ）は固有のものであり、いずれの流行株にも見られなかった（図７）。１つの突然変異は、ＶＰ２タンパク質及びＶＰ３タンパク質の各々に観察された。検証されたすべての野生分離株、及びＣＶＡ６株は、これらアミノ酸を完全に保存していた。したがって、Ｖｅｒｏ細胞での適応により、これらの突然変異がもたらされた。５、１０、１４、３３、９８、１６０、１７４、１９４、２６１、２７９、２８３、３０５の位置で、ＣＶＡ６ Ｐ−０及びＰ−１１は、同じ配列を有していたが、野生分離株からは異なっていた。野生分離株のｎ２８２９７及びｎ４０４２８は、９８位、１６０位、１７４位、及び１９４位でＣＶＡ６ Ｐ−０及びＰ−１１と類似した配列を有している。
実施例１０ Ｖｅｒｏ細胞でのＣＶＡ１６の適応
ＣＶＡ１６の適応は、Ｖｅｒｏ細胞中での３回の継代にウイルス源を供することにより行われた。実施例１に記載される適応プロトコールと同様に、Ｖｅｒｏ細胞での適応後、ＲＮＡが抽出され、そのＲＮＡをＶｅｒｏ細胞に二連続でトランスフェクトすることによりウイルスを再誘導した。次いで、２ラウンドのプラーク精製を通じて単一ウイルスクローンを単離した。継代数が異なる適応ウイルスに対するＴＣＩＤ５０中和アッセイの結果を表２７に示す。適応ＣＶＡ１６ Ｐ−３ウイルスは、適応ＥＶ７１ウイルスと同様に、Ｖｅｒｏ細胞中で広範なＣＰＥを示す。ＣＶＡ１６ Ｐ−３は、将来的な再誘導及びクローン選択に使用されている。
表２７ Ｖｅｒｏ細胞におけるＣＶＡ１６株の適応
適応ＣＶＡ１６の全長ゲノム配列解析
適応ＣＶＡ１６ゲノムの配列解析に使用したプライマーを図８に示す。全長ゲノムに及ぶＤＮＡ断片（図９）はＲＴ−ＰＣＲにより増幅された。ＣＶＡ１６ Ｐ−０及びＣＶＡ１６ Ｐ−３の間で、総数で６か所のヌクレオチド変化が観察された。４つのアミノ酸置換、及びそれらの配列番号５〜７内での各位置（２Ａは配列番号５に相当する。ＶＰ２は配列番号６に相当する。及びＶＰ１は配列番号７に相当する）を以下の表２８に示す。
表２８ ＣＶＡ１６の全長ゲノム配列解析：Ｐ−０とＰ−３
２か所の核酸置換が、適応ＣＶＡ１６ウイルスの５’ＵＴＲ領域中、６位及び３３位で特定された（表２８）。さらに、２か所のアミノ酸置換が、ＶＰ１タンパク質中、９９位及び１４５位で特定され、１か所のアミノ酸置換が、ＶＰ２タンパク質中、１６１位で特定され、及び１か所のアミノ酸置換が２Ａタンパク質中、２位で特定された（表２８）。得られたＰ３ウイルスのＶＰ１タンパク質中の２か所の突然変異は、流行株中にも存在している一方で、ＶＰ２及び２Ａのポリペプチド中の突然変異は固有であり、流行株中には存在していない（図１０）。ＣＶＡ１６株は、ＶＰ１遺伝子の系統発生学的分類に基づき、ジェノグループＣと分類された（図１１）。
実施例１１ 他のＣＶＡ１６単離株に対する、抗ＣＶＡ１６抗体の交差反応性
不活化ＣＶＡ１６を用いたワクチン接種後、４２日目に採取された血清サンプルをプールし、マイクロ中和アッセイにより検証した。ＣＶＡ１６に対して惹起された抗体は、他のＣＶＡ１６単離株を効率的に中和した（表２９）。
表２９ 他のＣＶＡ１６単離株に対する、抗ＣＶＡ１６／Ｐ−０抗体の交差反応性
実施例１２：Ｖｅｒｏ適応ウイルスの抗原安定性
ミョウバンとともに不活化ＣＶＡ１６（Ｐ−０）又はＣＶＡ６（Ｐ−０）を用いてマウスをワクチン接種した。２回の免疫化後に採取された血清サンプル（０日目、２８日目）をプールし、従来的なＴＣＩＤ５０ベースのアッセイ法を用いて中和抗体力価を検証した（表３０）。適応ウイルスと非適応ウイルスの間に中和力価の有意な差は観察されなかったことから、抗原性に対する影響は無かったことが示唆される。
表３０ ｖｅｒｏ適応ウイルスの抗原安定性
実施例１３：適応ＣＶＡ６株及び適応ＣＶＡ１６株の再誘導及びクローニング
適応ＣＶＡ６株及び適応ＣＶＡ１６株を、２ラウンドのトランスフェクションを介して精製ウイルスＲＮＡから再誘導した。適応ＣＶＡ６（Ｐ１１）および適応ＣＶＡ１６（Ｐ３）を用いてトランスフェクトされた細胞を、採取日に−８０℃で凍結、解凍し、浄化し、分注した。 １本の分注物を解凍し、ウイルス力価に対し力価測定した。ウイルス力価の結果を表３１に示す。ウイルスＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞中のＣＶＡ６及びＣＶＡ１６により現れた細胞変性効果を図１２に示す。
表３１ 精製ＲＮＡからのＣＶＡ６及びＣＶＡ１６の再誘導
限界希釈によるＣＶＡ６のクローニング
適応ＣＶＡ６プレマスターウイルス種の調製のために、限界希釈法を用いた。ウイルスの連続希釈を行い、ウイルス増殖を支える最後のウェルを特定した。Ｖｅｒｏ細胞中で１４日間インキュベーションした後、細胞及び上清を凍結した。細胞溶解物をＲＤ細胞へと移し、４〜５日間、インキュベートし、続いて、Ｖｅｒｏ細胞のウイルスＣＰＥが陽性であるウェルからウイルスを増幅させることにより陽性ウェルを特定した。ウイルス力価の定量後、１Ｂ７クローン、１Ｃ３クローン、１Ｇ３クローン、及び２Ｄ６クローンを２ラウンド目の限界希釈に選択した。１Ｂ７Ｆ３クローン及び２Ｄ６Ｇ４クローンを３ラウンド目の限界希釈に選択した。これらクローンからのウイルスを増幅させ、定量し、さらに３ラウンド目の限界希釈によりクローニングした。限界希釈法の図表を図１３Ａ〜１３Ｃに示す。Ｖｅｒｏ細胞及びＲＤ細胞において、ＲＮＡ再誘導されたＣＶＡ６の力価の比較を図１４に示す。ＲＤ細胞及びＶｅｒｏ細胞において算出されたウイルス力価は異なっていた。Ｖｅｒｏ細胞におけるウイルス力価測定により算出された既知のＴＣＩＤ５０値を用いて限界希釈が繰り返された。２ラウンドの限界希釈が完了した。増幅後、クローンは、ウイルス力価に基づき選択され、特徴解析のためのストックを調製するために増殖される。
プラーク精製によるＣＶＡ１６のクローニング
Ｖｅｒｏ細胞に１０倍希釈された適応ＣＶＡ１６ウイルスを感染させ、無血清培地中、０．５％のｓｅａプラークアガロースで覆った。感染後、４〜５日目にプラークをピックアップし、２４時間、３７℃でインキュベートした。２５０／７５０μｌの量でＶｅｒｏ細胞に播種することによりウイルスを増幅させ、ＣＰＥが９０〜１００％となったときに採取した。４℃、一晩のベンゾナーゼ処置の後、ウイルスを分注し、−８５℃で保存した。図１５Ａ〜１５Ｂに示されるように２ラウンドのプラーク精製を行った。図１６に示されるように、上述のＰ−３ウイルスと比較したとき、クローン化ＣＶＡ１６（クローン１〜２５０）はＶＰ１タンパク質中にいずれのアミノ酸変化も示さなかった。適応ＣＶＡ１６ウイルスをさらに特徴解析し、実施例１において適応ＥＶ７１ウイルスに関し記載されたように、プレ−ＭＶＳを調製するために使用した。
実施例１４：三価ＨＦＭＤワクチンの免疫原性
以下の実施例は、成体マウスにおける不活化ＥＶ７１、ＣＶＡ６、及びＣＶＡ１６の三価ＨＦＭＤワクチンの有効性を示すものである。成体マウスを用いて、能動免疫化及び受動伝達実験の両方を行った。
不活化された一価ＥＶ７１ワクチン、ＣＡ６ワクチン、及びＣＡ１６ワクチンを、実施例１〜１４に記載されるように製剤化した。３つの一価ワクチンを１：１：１の比率で混合し、不活化三価ワクチンを製造した。各不活化一価ワクチンは、対照として使用した。成体のＡ１２９マウス（α／βインターフェロン（ＩＦＮ）受容体欠失）及びＡＧ１２９マウス（α／β、γＩＦＮ受容体欠失）を、本実施例に記載される実験に使用した。
一価ワクチンを用いた免疫化後血清の交差中和の可能性
ＡＧ１２９マウスの群に、１．５μｇのＥＶ７１、ＣＶＡ１６、又はＣＶＡ６の一価ワクチンを０日目及び２８日目に用いてワクチン接種した。ワクチン接種後、４２日目に採取した血清を群ごとにプールし、各ウイルスに対するマイクロ中和アッセイにより検証した。結果を表３２に示す。
表３２
表３２の結果から、検証したウイルス間に交差中和は観察されなかったことが示される。
ＨＦＭＤワクチンの免疫原性
ＡＧ１２９マウスに、１．５μｇの一価ワクチンのうちの１つ、又は１．５μｇのＥＶ７１、ＣＶＡ６及びＣＶＡ１６の各々の三価混合物のいずれかを用いて、０日目及び２８日目にワクチン接種した。血清サンプルは４２日目にマウスから採取した。三価免疫血清は、ＥＶ７１、ＣＶＡ１６、及びＣＶＡ６に対して検証した。各一価免疫血清は、その同種ウイルスに対して検証した。各ワクチンの幾何平均力価を図１７に示す。
マウスモデルにおける、ＥＶ７１及びＣＶＡ１６に対するワクチンの有効性
次いで、三価ワクチンの有効性をＥＶ７１及びＣＶＡ１６感染のマウスモデル中で検証した。４週齢のＡＧ１２９マウスの群（ｎ＝５〜６匹）に筋肉内（ＩＭ）ワクチン接種を行った。上述の一価ワクチン及び三価ワクチンは、実施例２に記載されるように、等体積のミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５）とともに４時間、４℃で回転器上で混合することによりアジュバント化した。 １．５μｇ／動物の投与量で一価ワクチンを用いて、４．５μｇ／動物の総投与量で三価ワクチン混合物を用いて（各一価ワクチンは１．５μｇ／動物）、又は対照としてミョウバンアジュバントを用いて、マウスをワクチン接種した。マウスは腹腔内（ＩＰ）注射を介して、９．８ｘ１０５ ＴＣＩＤ５０４００μｌウイルスのチャレンジ投与量で、ウイルスでチャレンジされた。各マウス群に対する処置及びチャレンジ、ならびに処置及びチャレンジのスケジュールを図１８に示す。
図１９に示されるように、ＥＶ７１一価ワクチン、または三価ワクチンのいずれかでワクチン接種された６匹のマウス中、６匹が、マウス適応ＥＶ７１でチャレンジされた後、少なくとも２５日間生存した。しかしながら、ＣＶＡ１６ワクチンでワクチン接種された６匹のマウス中、たった２匹のみがＥＶ７１でチャレンジされた後２０日間生存し、及びＣＶＡ６ワクチンでワクチン接種されたマウスは、ＥＶ７１でチャレンジされた後２０日間生存しなかったことから、交差防御は観察されなかったことが示される。
また、ＥＶ７１ウイルス血症を阻害する能力に関し、ワクチンを検証した。ウイルス力価は、ＥＶ７１でのチャレンジ後、１日目、３日目、及び５日目に測定された（図２０）。ワクチン接種マウスからの血清サンプルは、ＥＶ７１でのチャレンジ後、１日目、３日目、及び５日目に採取され、ウイルス力価はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定された。標準曲線は、連続希釈されたマウス適応ウイルスストックから作成された。陰性対照として正常なマウス血清を使用し、カットオフ値を決定した。結果は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ当量により測定したところ、ＥＶ７１一価ワクチン及び三価ワクチンの両方が、およそゼロにまで血清中ウイルス力価を低下させ得ることを示している（図２０）。
図２１に示されるように、ＣＶＡ１６一価ワクチン、または三価ワクチンのいずれかでワクチン接種された５匹のマウス中、５匹が、マウス適応ＣＶＡ１６でチャレンジ後、少なくとも２０日間生存した。しかしながら、ＣＶＡ６ワクチンでワクチン接種されたマウスはＥＶ７１でチャレンジ後、１５日間生存できなかったことから、交差防御は観察されなかったことが示される。
また、ＣＶＡ１６ウイルス血症を阻害する能力に関し、ワクチンを検証した。ウイルス力価は、ＣＶＡ１６でのチャレンジ後、１日目、３日目、及び５日目に測定された（図２２）。ワクチン接種マウスからの血清サンプルは、ＣＶＡ１６でのチャレンジ後、１日目、３日目、及び５日目に採取され、ウイルス力価はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定された。標準曲線は、連続希釈されたマウス適応ウイルスストックから作成された。陰性対照として正常なマウス血清を使用し、カットオフ値を決定した。結果は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ当量により測定したところ、ＣＶＡ１６一価ワクチン及び三価ワクチンの両方が、およそゼロにまで血清中ウイルス力価を低下させ得ることを示している（図２２）。
受動伝達を利用したＣＶＡ６に対するワクチンの有効性
次いで、ＣＶＡ６感染のマウスモデルにおいて、三価ワクチンの有効性を検証した。三週齢のＡ１２９マウスの群（ｎ＝５〜６）に、中和抗体血清を用いた腹腔内（ＩＰ）注射を介して受動免疫化を行った。１．５μｇ／動物の投与量でＣＶＡ６一価ワクチンを用いてマウスをワクチン接種することにより、又は４．５μｇ／動物の総投与量で三価ワクチン混合物を用いてマウスをワクチン接種することにより（各一価ワクチンは１．５μｇ／動物）、中和抗体血清をマウス中に惹起させた。次いで、中和抗体を含有する血清サンプルをワクチン接種後４２日目に各群から採取し、群ごとにプールし、マイクロ中和試験により検証した。三価血清に関し、ＥＶ７１に対する幾何平均抗体力価は６４０であり、ＣＶＡ１６に対する幾何平均抗体力価は１２８０であり、ＣＶＡ６に対する幾何平均抗体力価は１２８０であった。ＣＶＡ６一価血清に関し、ＣＶＡ６に対する幾何平均抗体力価は５１２０であった。２．３１ｘ１０４ＴＣＩＤ５０／２００μｌのＣＶＡ６のチャレンジ投与量で、腹腔内（ＩＰ）注射を介して、マウス適応ＣＶＡ６ウイルスでマウスをチャレンジした。各マウス群に対する受動伝達及びチャレンジ、ならびに処置及びチャレンジのスケジュールを図２３に示す。
図２４は、三価血清又はＣＶＡ６一価血清を用いた受動免疫化の結果を示す。三価血清、又はＣＶＡ６一価血清のいずれかで免疫化された６匹のマウスのうち、６匹がＣＶＡ６のチャレンジ後、２０日間生存した一方で、正常マウスからの対照血清で免疫化した６匹のマウスは、たった１匹のみが、ＣＶＡ６でのチャレンジ後、２０日間生存した（図２４）。この結果から、三価ワクチンでワクチン接種したマウス由来の血清の受動伝達は、ＣＶＡ６を用いた同種ウイルスチャレンジから防御したことを示している。
また、ＣＶＡ６ウイルス血症を阻害する能力に関し、防御血清を検証した。ウイルス力価は、ＣＶＡ６でのチャレンジ後、１日目、３日目、及び５日目に測定した（図２５）。ワクチン接種マウスからの血清サンプルは、ＣＶＡ６でのチャレンジ後、１日目、３日目、及び５日目に採取され、ウイルス力価はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定された。標準曲線は、連続希釈されたマウス適応ウイルスストックから作成された。陰性対照として正常なマウス血清を使用し、カットオフ値を決定した。結果は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ当量により測定したところ、ＣＶＡ６一価ワクチン及び三価ワクチンのいずれかでワクチン接種されたマウスの血清は、およそゼロにまで血清中ウイルス力価を低下させ得ることを示している（図２５）。
結論
この結果から、ＨＦＭＤウイルスのＥＶ７１、ＣＶＡ１６、又はＣＶＡ６に対する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで交差中和せず、また致死的チャレンジからマウスを交差防御しないこと、ならびにＥＶ７１、ＣＶＡ１６、及びＣＶＡ６の不活化調製物は、一価ワクチン製剤又は多価ワクチン製剤として投与された場合、マウスにおいて免疫原性であることが示される。この結果はまた、ＥＶ７１、ＣＶＡ１６、及びＣＶＡ６の不活化調製物は、ＥＶ７１及びＣＶＡ１６のＡＧ１２９マウスモデル、及びＣＶＡ６のＡ１２９マウスモデルにおいて、同種チャレンジに対し１００％効果的であることを示している。

Claims (20)

  1. ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物又はワクチンであって、前記少なくとも１つのウイルスは、不活化されたエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）を含み、前記１つ以上の抗原は、配列番号１の７位、１４位、１４５位及び２８２位の４つ全てで、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置の４つ全てで発生した変異を含むＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含み、ここで、
    配列番号１の７位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位に相当する位置の変異が、バリンからメチオニンへの置換であり、
    配列番号１の１４位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の１４位に相当する位置の変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換であり、
    配列番号１の１４５位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の１４５位に相当する位置の変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換であり、
    配列番号１の２８２位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の２８２位に相当する位置の変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、
    前記免疫原性組成物又はワクチン。
  2. 前記少なくとも１つのウイルスが１つ以上の不活化改変を含有しており、この場合において、
    ａ．前記１つ以上の不活化改変が、改変核酸を含有し、任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であるか、又は
    ｂ．前記１つ以上の不活化改変が、改変ポリペプチドを含有し、任意選択で前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  3. 前記少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の不活化改変を含有しており、前記１つ以上の不活化改変が、改変ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記１つ以上の不活化改変が、架橋ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記免疫原性組成物又はワクチンがホルマリンをさらに含有する、請求項１に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  4. 前記少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の不活化改変を含有しており、前記１つ以上の不活化改変が、改変核酸を含有し、及び任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であり、及び任意選択で前記免疫原性組成物又はワクチンがＢＥＩをさらに含有する、請求項１に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  5. ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つの不活化ウイルスからの１つ以上の抗原を含有する手足口病の免疫原性組成物又はワクチンであって、前記少なくとも１つのウイルスは不活化されたＥＶ７１を含み、前記１つ以上の抗原は、配列番号１の７位、１４位、１４５位及び２８２位の４つ全てで、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置の４つ全てで発生した変異を含むＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含み、ここで、
    配列番号１の７位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位に相当する位置の変異が、バリンからメチオニンへの置換であり、
    配列番号１の１４位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の１４位に相当する位置の変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換であり、
    配列番号１の１４５位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の１４５位に相当する位置の変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換であり、
    配列番号１の２８２位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の２８２位に相当する位置の変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換であり、ここで、
    前記不活化されたＥＶ７１ウイルスは、１つ以上の不活化改変を含有しており、
    ａ．前記１つ以上の不活化改変が、改変核酸を含有し、任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であるか、又は
    ｂ．前記１つ以上の不活化改変が、改変ポリペプチドを含有し、任意選択で前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、
    前記免疫原性組成物又はワクチン。
  6. ａ．有効濃度の洗剤であって、任意選択で前記洗剤が、ポリソルベート［８０］を含有し、及び／又は前記有効濃度が、０．００１％〜０．０１％の範囲である、前記洗剤、
    ｂ．アジュバントであって、任意選択で前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される、アジュバント、
    ｃ．アジュバントであって、前記アジュバントが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）である、前記アジュバント、
    ｄ．アジュバントであって、前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び硫酸カリウムアルミニウムから選択されるアルミニウム塩アジュバントである、前記アジュバント、及び／又は、
    ｅ．アジュバントであって、前記アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び硫酸カリウムアルミニウムから選択されるアルミニウム塩アジュバントであり、この場合において、前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アジュバントに吸着されている、前記アジュバント、
    をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  7. ヒトにおいて手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原とアルミニウム塩アジュバントを含有する手足口病の免疫原性組成物又はワクチンであって、前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着されており、ここで、前記少なくとも１つのウイルスはＥＶ７１を含み、前記１つ以上の抗原は、配列番号１の７位、１４位、１４５位及び２８２位の４つ全てで、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置の４つ全てで発生した変異を含むＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドを含み、ここで、
    配列番号１の７位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の７位に相当する位置の変異が、バリンからメチオニンへの置換であり、
    配列番号１の１４位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の１４位に相当する位置の変異が、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換であり、
    配列番号１の１４５位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の１４５位に相当する位置の変異が、グルタミン酸からグルタミンへの置換であり、
    配列番号１の２８２位の、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１に対して整列させたときには配列番号１の２８２位に相当する位置の変異が、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である、
    前記免疫原性組成物又はワクチン。
  8. 前記アルミニウム塩アジュバントが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、及び硫酸カリウムアルミニウムから選択される、請求項７に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  9. 無血清である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  10. 前記免疫原性組成物又はワクチンが、精製抗原免疫原性組成物もしくはワクチン、サブユニット免疫原性組成物もしくはワクチン、又は不活化全粒子ウイルス免疫原性組成物もしくはワクチンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチン。
  11. 免疫反応の誘導の必要のある対象において免疫反応を誘導するための組成物、又は手足口病の治療もしくは予防の必要のある対象の手足口病を治療もしくは予防するための組成物であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物又はワクチンの治療有効量を含む、前記組成物。
  12. 前記組成物が、前記対象に防御的免疫反応を誘導する請求項１１の組成物であって、この場合において任意選択で、
    ａ．前記免疫反応が、ＥＶ７１に対する免疫反応を含み、及び／又は
    ｂ．前記免疫反応が、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｃ２、及びＣ４から選択されるＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を含む、前記組成物。
  13. （ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の手足口病の免疫原性組成物又はワクチンとアルミニウム塩アジュバントを混合させる工程、及び
    （ｂ）前記混合物を、１６時間〜２４時間の範囲にわたる期間、適切な条件下でインキュベートする工程
    を含む、アジュバント化された手足口病の免疫原性組成物又はワクチンを作製する方法であって、ここで、
    前記抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％が前記アルミニウム塩アジュバントに吸着している、
    前記方法。
  14. 前記混合物が、２℃〜８℃の範囲の温度でインキュベートされる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つのウイルスが、
    ａ．ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、
    ｂ．ホルマリン、
    ｃ．ＢＰＬとホルマリンの組み合わせ、又は
    ｄ．バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ） のうちの１つ以上で化学的に不活化された、請求項１３に記載の方法。
  16. ＢＰＬにより不活化された前記少なくとも１つのウイルスが１つ以上の改変を含有しており、この場合において、任意選択で、
    ａ．前記１つ以上の改変が、改変核酸を含有し、任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であるか、又は
    ｂ．前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、任意選択で前記改変ポリペプチドが、システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上から選択される改変アミノ酸残基を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. ホルマリンにより不活化された前記少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含有しており、任意選択で前記１つ以上の改変が、改変ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記１つ以上の改変が、架橋ポリペプチドを含有し、及び任意選択で前記免疫原性組成物又はワクチンがホルマリンをさらに含有する、請求項１５に記載の方法。
  18. ＢＥＩにより不活化された前記少なくとも１つのウイルスが、１つ以上の改変を含有しており、任意選択で前記１つ以上の改変が、改変核酸を含有し、及び任意選択で前記改変核酸が、アルキル化核酸であり、及び任意選択で反応しなかったＢＥＩが、チオ硫酸ナトリウムを用いて加水分解された、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記１つ以上の抗原が、非ヒト細胞を培養することにより作製され、及びこの場合において、任意選択で、前記細胞は無血清培地中で培養される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記非ヒト細胞が、サルの細胞又はＶｅｒｏ細胞株由来であり、この場合において任意選択で前記Ｖｅｒｏ細胞株が、ＷＨＯ Ｖｅｒｏ １０−８７、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）およびＶｅｒｏ Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される、請求項１９に記載の方法。
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