CN107406856B - 手、足及口疫苗及其制备及使用方法 - Google Patents

手、足及口疫苗及其制备及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明关于手、足及口病疫苗以及免疫原性组合物，其具有一或多种来自至少一种引起人类手、足及口病的病毒的抗原；以及其制造、调配及测试的方法及用途。因此，需要开发用于治疗和/或预防特别是在儿童中的手、足及口病的疫苗和免疫原性组合物。为了满足这一需要，本发明提供了用于治疗和/或预防手、足及口病的疫苗和免疫原性组合物，其包括来自至少一种引起人类手、足及口病的病毒的抗原，例如EV71，CA6和CA16。

Description

手、足及口疫苗及其制备及使用方法
相关申请案的交叉参考
本案主张2014年11月7日申请的美国临时申请案第62/077,139号的权益，该案以全文引用的方式并入本文中。
序列表以正文档案提交
以ASCII正文档案提交以下内容以全文引用的方式并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：606772000940SEQLIST.TXT，记录日期：2015年10月29日，大小：92KB)。
技术领域
本发明关于具有一或多种抗原的手、足及口病疫苗以及免疫原性组合物，该等抗原来自一或多种导致人类的手、足及口病的病毒；以及其制造、调配及测试的方法及用途。
背景技术
手、足及口病(HFMD)由人类肠病毒A(HEV-A)群组中的若干成员引起。其通常为影响大多数儿童的自限性感染且特征为手、足及口腔出现溃疡及小泡。然而，更严重形式的疾病可能出现神经学症状，诸如脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹，及引起肺水肿的脑干脑炎(Huang,C.等人,(1999)N Engl J Med 341:936-942；Chang,L.等人,(1998)Lancet 352:367-368；Ooi,M.等人,(2009)BMC Infect Dis 9:3)。人类肠病毒A属于非包膜正义RNA病毒的小核糖核酸病毒科，其亦包括脊髓灰质炎病毒及鼻病毒。可引起HFMD的HEV-A群组成员包括肠病毒71(EV71)及柯沙奇病毒(Coxsackieviruses)，包括血清型A1、A4、A6、A10及A16(Pallansch及Roos,(2007)Knipe DM,Howley PM,Griffin DE,编者.FieldsVirology.Philadelphia,PA Lippincott Williams&Wilkins.第839-894页；及KobayashiM等人,Jpn J Infect Dis 2013；66:260-1)。
肠病毒71及柯沙奇病毒含有四种衣壳蛋白(VP1-VP4)及七种非结构蛋白。除保护病毒RNA之外，衣壳蛋白亦识别宿主细胞表面上的受体且促成病毒的抗原性概况[8](Jubelt 2014 Handbook of Clinical Neurology)。EV71的已知人类细胞表面受体为清道夫受体B2(scavenger receptor B2，SCARB2)，及P-选择素醣蛋白配位体1(P-selectinglycoprotein ligand 1，PSGL-1)(Yamayoshi S.等人,(2009)Nat Med 15:798-801；Nishimura Y.等人,(2009)Nat Med 15:794-797)，而柯沙奇A病毒结合至细胞内粘附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM)、衰减加速因子(decay acceleratingfactor，DAF)、整合素αvβ3，及MHC-I相关的葡萄糖调节性蛋白78(glucose regulatedprotein 78，GRP78)(Bergelson,J.等人,(2013)Adv Exp Med 790:24-41))。
HFMD的发病率通常随着年龄增长而降低。然而，五岁以下儿童由于CNS经EV71感染而特别易患最严重形式的HFMD。此可导致神经疾病，包括无菌性脑膜炎、脑干及/或小脑脑炎以及急性弛缓性麻痹(Ooi,M.等人,(2010)Lancet Neurol.9:1097-1105；McMinn,P.等人,(2002)FEMS Microbiol.Rev.26:91-107)。一些此等严重情况亦导致自主神经系统感染，接着可引起神经性肺水肿，神经性肺水肿又可引起心肺衰竭。相较于具有CNS受累、但不具有神经性肺水肿的患者，EV71感染伴CNS受累及心肺衰竭已与长期神经后遗症、神经发育延迟及认知功能降低相关(Chang,L.等人,(2007)N.Engl.J.Med.356:1226-1234；Ooi,M.等人,(2010)Lancet Neurol.9:1097-1105；Solomon,T.等人,(2010)Lancet Infect.Dis.10:778-790)。长期神经后遗症的病因被认为是由于神经元被EV71直接感染而引起的神经元损伤。
在亚洲，每年均发生HFMD流行病，其中有许多严重病例报导。2007年散布于中国的报导显示逾80,000个严重HFMD病例。2008年，据报导中国有近500,000个严重疾病病例。中国卫生部(Chinese Ministry of Health，MOH)报导，2009年1月与7月之间，存在逾787,000个HFMD病例，其中严重病例逾10,500例，定义为CNS受累。来自中国的近期报导进一步指出，2010年存在逾1.5百万个经诊断患有HFMD的儿童。
尽管HFMD盛行于中国，但目前针对HFMD的疫苗无法获得，针对感染的有效抗病毒疗法亦无法获得。治疗HFMD仅聚焦于症状缓解。严重口腔溃疡可产生疼痛性口腔炎，其干扰食物与流体的口服摄入，导致脱水，此可能需要住院。脑膜脑炎及心肺骤停需要应急的及全面的支持性疗法及管理。
发明内容
因此，需要开发用于治疗及/或预防手、足及口病、尤其儿童的手、足及口病的疫苗及免疫原性组合物。为了满足此需要，本发明提供用于治疗及/或预防手、足及口病的疫苗及免疫原性组合物，其包括来自至少一种引起人类的手、足及口病的病毒(诸如EV71、CA6及CA16)的抗原。有利的是，抗原可包括至少一个允许在所培养非人类细胞株(诸如Vero细胞)中产生的适应突变。此外，如本文所揭示，本发明的疫苗及免疫原性组合物已证明可诱导针对引起人类的手、足及口病的病毒的保护性免疫反应。
因此，本发明的某些态样提供手、足及口疫苗，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种病毒的抗原，其中一或多种抗原包括至少一个非人类细胞适应突变。因此，本发明的某些态样提供手、足及口免疫原性组合物，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种病毒的抗原，其中一或多种抗原包含至少一个非人类细胞适应突变。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与治疗有效量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来治疗或预防该个体的手、足及口病的方法。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与免疫原性量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来诱导该个体发生免疫反应的方法。
本发明的其它态样提供手、足及口疫苗，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为EV71、CA16或两者，且其中该至少一种病毒用β-丙内酯(BPL)不活化。本发明的其它态样提供手、足及口免疫原性组合物，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为EV71、CA16或两者，且其中该至少一种病毒用β-丙内酯(BPL)不活化。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与治疗有效量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来治疗或预防该个体的手、足及口病的方法。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与免疫原性量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来诱导该个体发生免疫反应的方法。本发明的其它态样提供一种如下使手、足及口病毒制剂不活化的方法：(a)自一或多个非人类细胞中分离出手、足及口病毒制剂，其中该等细胞用于产生病毒制剂；(b)用有效量的β-丙内酯(BPL)处理病毒制剂；及(c)用有效量的福尔马林(formalin)处理病毒制剂，其中福尔马林处理步骤与步骤(b)同时发生或在步骤(b)之后发生，且其中病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。
本发明的其它态样提供手、足及口疫苗，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为CA6、CA16或两者，且其中该至少一种病毒用福尔马林加以不活化。本发明的其它态样提供手、足及口免疫原性组合物，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为CA6、CA16或两者，且其中该至少一种病毒用福尔马林加以不活化。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与治疗有效量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来治疗或预防该个体的手、足及口病的方法。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与免疫原性量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来诱导该个体发生免疫反应的方法。本发明的其它态样提供一种如下使手、足及口病毒制剂不活化的方法：(a)自一或多个非人类细胞分离出手、足及口病毒制剂，其中该等细胞用于产生病毒制剂；(b)用有效量的福尔马林处理病毒制剂；及(c)自福尔马林纯化病毒制剂，其中病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。
本发明的其它态样提供手、足及口疫苗，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种病毒的抗原及铝盐佐剂，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂。本发明的其它态样提供手、足及口免疫原性组合物，其含有一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种病毒的抗原及铝盐佐剂，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与治疗有效量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来治疗或预防该个体的手、足及口病的方法。本发明的其它态样提供一种藉由向有需要的个体投与免疫原性量的任一种本文所揭示疫苗或免疫原性组合物来诱导该个体发生免疫反应的方法。本发明的其它态样提供一种如下制备有佐剂的手、足及口疫苗的方法：(a)将疫苗与铝盐佐剂混合，其中疫苗包括一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种病毒的抗原；及(b)在适合条件下将混合物培育约16小时至约24小时范围内的时间段，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％抗原吸附至铝盐佐剂，且其中至少一种引起手、足及口病的病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。本发明的其它态样提供一种制备有佐剂的手、足及口免疫原性组合物的方法：(a)将免疫原性组合物与铝盐佐剂混合，其中免疫原性组合物包括一或多种来自引起人类的手、足及口病的至少一种病毒的抗原；及(b)在适合条件下将混合物培育约16小时至约24小时范围内的时间段，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％抗原吸附至铝盐佐剂，且其中至少一种引起手、足及口病的病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。
附图说明
该专利或申请案档案含有至少一个彩制图。在申请且支付必要费用后，专利局将提供附有彩图的此专利或专利申请公开案的复本。
图1显示描绘人类肠病毒的系谱关系的树。
图2显示例示性EV71株系的基因结构。
图3显示经适应肠病毒71疫苗在不同剂量水准下、在小鼠中的免疫原性，得自TCID50中和分析的几何平均效价值是以横跨纵向时间点的图形式呈现。
图4显示针对所选EV71子基因组(sub-genogroups)的EV71抗血清的交叉中和。
图5显示经适应肠病毒71疫苗在NZW兔中的免疫原性，得自TCID50中和分析的几何平均效价值是以横跨纵向时间点的图形式呈现。
图6显示CVA6基因组的图。
图7显示对若干流行中的CVA6株系的VP1蛋白进行比较的氨基酸序列比对。
图8显示对CVA16的全长基因组测序所用的引子的图。
图9显示CVA16基因组的图。
图10显示流行中的CVA16株系的VP1蛋白的氨基酸序列比对。
图11显示基于VP1基因的CVA16的系谱分类。
图12显示CVA6及CVA16对经病毒RNA转染的Vero细胞所显现的细胞病变效应。
图13A显示藉由限制稀释法对CVA6进行纯系分离的方案的图。图13B显示在第一轮CVA6限制稀释中所选纯系的图。图13C显示在第二轮CVA6限制稀释中所选纯系的图。
图14显示RNA再衍生CVA6在Vero细胞及RD细胞中效价的比较。
图15A显示CVA16的第一轮空斑纯化。图15B显示CVA16的第二轮空斑纯化。
图16显示VP1蛋白在所选殖CVA16与P-3病毒之间的氨基酸序列比对。
图17显示针对EV71、CVA16及CVA6的抗体的几何平均效价。
图18显示对小鼠进行免疫接种且用EV71及CVA16攻击(challenge)的处理方案。
图19显示经EV71攻击小鼠的存活率。
图20显示所免疫小鼠中血清EV71病毒效价。
图21显示经CVA16攻击小鼠的存活率。
图22显示所免疫小鼠中血清CVA16病毒效价。
图23显示对小鼠进行被动免疫接种且用CVA6攻击的处理方案。
图24显示经CVA6攻击小鼠的存活率。
图25显示所免疫小鼠中血清CVA6病毒效价。
具体实施方式
通用技术
本文所述或所提及的技术及程序通常很好理解且普遍使用习知方法、由熟习此项技术者采用，诸如以下文献中广泛使用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,(2003))；系列丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor编(1995))；Harlow及Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,及Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编,1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,及D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd及C.Dean.编,OxfordUniversity Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer:Principles andPractice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.Lippincott Company,1993)。
手、足及口病致病病毒
本发明的某些态样是关于至少一种引起手、足及口病、可适用于疫苗及/或免疫原性组合物中的病毒，包括(但不限于)纯化病毒、不活化病毒、减毒病毒、重组病毒，或用于次单位疫苗的经纯化及/或重组病毒蛋白。
人类的手、足及口病(HFMD)起因于人类肠病毒A(HEV-A)群组的若干成员(图1)。人类肠病毒A属于非包膜正义RNA病毒的小核糖核酸病毒科，其亦包括脊髓灰质炎病毒及鼻病毒。可引起HFMD的HEV-A群组成员包括肠病毒71(EV71)及柯沙奇病毒。因此，本发明的引起手、足及口病的适合病毒的实例包括(但不限于)肠病毒71(EV71)；柯萨奇病毒A株系，包括血清型A1、A2、A4、A5、A6、A8、A9、A10或A16，或柯萨奇病毒B株系，包括血清型B3或B5或其任何组合。如本文所使用，术语「CA6」可与「CVA6」及「柯萨奇病毒A6」互换使用。如本文所使用，术语「CA16」可与「CVA16」及「柯萨奇病毒A16」互换使用。在一些实施例中，至少一种病毒可为选自EV71、CA6及CA16中的一或多种，两种或两种以上，或三种病毒。在一些实施例中，至少一种病毒可为EV71及CA6。在一些实施例中，至少一种病毒可为EV71及CA16。在一些实施例中，至少一种病毒可为CA6及CA16。在一些实施例中，至少一种病毒可为EV71。
因此，在一些实施例中，引起手、足及口病的本发明病毒可用于本文所揭示的任一种疫苗及/或免疫原性组合物中。举例而言，引起手、足及口病的本发明病毒可用于提供适用于治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应(诸如保护性免疫反应)的一或多种抗原。
病毒抗原
本发明的其它态样是关于一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒、可适用于疫苗及/或免疫原性组合物中的抗原，包括(但不限于)纯化病毒、不活化病毒、减毒病毒、重组病毒，或用于次单位疫苗的经纯化及/或重组病毒蛋白。
本发明的抗原可为能够诱发免疫反应的任何物质。适合抗原的实例包括(但不限于)完整病毒、减毒病毒、不活化病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白及蛋白质内的个别多肽抗原决定基)、醣多肽、脂多肽、肽、多醣、多醣结合物、肽，以及多醣及其它分子、小分子、脂质、醣脂及碳水化合物的非肽模拟物。
在一些实施例中，本发明的抗原可来自已知可引起HFMD的任何病毒，包括(但不限于)肠病毒71(EV71)；柯萨奇病毒A株系，包括血清型A1、A2、A4、A5、A6、A8、A9、A10或A16，或柯萨奇病毒B株系，包括血清型B3或B5，或其任何组合。在一些实施例中，本发明的抗原可为选自EV71、CA6及CA16中的一或多种，两种或两种以上，三种或三种以上，四种或四种以上，五种或五种以上，六种或六种以上，七种或七种以上，八种或八种以上，九种或九种以上，或十种或十种以上抗原。在一些实施例中，本发明的抗原可来自EV71及CA6。在一些实施例中，本发明的抗原可来自EV71及CA16。在一些实施例中，本发明的抗原可来自CA6及CA16。在一些实施例中，本发明的抗原可来自EV71。在一些实施例中，本发明的抗原可来自CA6。在一些实施例中，本发明的抗原可来自CA16。
本发明的抗原可包括至少一种非人类细胞适应突变。适应突变可藉由采用病毒于特定细胞株中生长而产生。举例而言，细胞可经病毒转染且继代，从而使病毒复制且其核酸发生突变。核酸突变可为点突变、插入突变或缺失突变。核酸突变可引起病毒蛋白质内发生促使病毒于非人类细胞中生长的氨基酸变化。适应突变可促使病毒发生表型变化，包括改变的空斑大小、生长动力学、温度敏感性、抗药性、毒性，及细胞培养中的病毒产量。此等适应性突变可适用于藉由提高病毒于细胞株中所培养的速度及产量而制成的疫苗。另外，适应性突变可藉由改变免疫原性抗原决定基的结构来增强病毒抗原的免疫原性。
因此，在某些实施例中，来自至少一种引起手、足及口病的病毒的本发明抗原包括至少一个非人类细胞适应突变。在某些实施例中，适应突变为病毒抗原相对于非人类细胞发生的突变。在一些实施例中，非人类细胞可为哺乳动物细胞。非人类哺乳动物细胞的实例包括(但不限于)VERO细胞(来自猴肾脏)、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(寄存编号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞，或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施例中，非人类细胞可为猴细胞。在一些实施例中，猴细胞来自Vero细胞株。适合Vero细胞株的实例包括(但不限于)WHO Vero 10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC寄存编号CRL-1587)，或Vero C1008(ATCC寄存编号CRL-1586)。
EV71、CA6及CA16具有线性、正义、单股RNA基因组(图2)。此等病毒基因组中的每一者编码结构多肽与非结构多肽。由此等病毒中的每一者编码的结构多肽包括(但不限于)VP1、VP2、VP3及VP4，其可一起组成病毒衣壳。由此等病毒中的每一者编码的非结构多肽包括(但不限于)涉及例如病毒复制及毒性的2A、2B、2C、3A、3B、3C及3D。
因此，在某些实施例中，本发明的抗原可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或20个以上非人类细胞适应突变于一或多种、两种或两种以上、三种或三种以上、四种或四种以上、五种或五种以上、六种或六种以上、七种或七种以上、八种或八种以上、九种或九种以上、或十种或十种以上病毒抗原内，包括(但不限于)VP1、VP2、VP3、2A、2B、2C、3A、3B、3C及3D。在一些实施例中，本发明的抗原包括完整不活化病毒，其可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或10个以上非人类细胞适应突变于病毒的5’或3’未转译区(UTR)内。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于EV71的VP1多肽内。来自例示性EV71株系的VP1多肽的氨基酸序列阐述为：
GDRVADVIESSIGDSVSRALTQALPAPTGQNTQVSSHRLDTGEVPALQAAEIGASSNTSDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPESRESLAWQTATNPSVFVKLTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGSSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGTSRNAITTL(SEQ ID NO：1)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于EV71的VP1多肽内的一或多个氨基酸位置。在一些实施例中，当使用成对(pairwise)比对算法对EV71的VP1多肽与SEQ ID NO：1比对时，突变可发生于选自SEQ ID NO：1的7、14、145及282的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或四个氨基酸位置，或发生于与SEQ ID NO：1的位置7、14、145或282对应的位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，突变发生于SEQ ID NO：1的位置7或与SEQ ID NO：1的位置7对应的位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对EV71的VP1多肽与SEQ ID NO：1比对时，突变发生于SEQ ID NO：1的位置7，或SEQID NO：1的位置7、14、145或282中的两个或两个以上，三个或三个以上或所有四个位置，或与SEQ ID NO：1的位置7、14、145或282对应的位置。在一些实施例中，位置7的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代。在一些实施例中，位置14的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代。在一些实施例中，位置145的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代。在一些实施例中，位置282的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA6的VP1多肽内。来自例示性CA6株系的VP1多肽的氨基酸序列阐述为：
NDPISNAIENAVSTLADTTISRVTAANTAASSHSLGTGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTSQDGYTVWPIDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNDSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDGRKSYQWQTATNPSIFAKLSDPPPQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPFRSQAYMVKNYPTYSQTISNTAADRASITTTDYEGGVPANPQRTF(SEQ ID NO：2)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA6的VP1多肽内的一或多个氨基酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA6的VP1多肽与SEQ ID NO：2比对时，突变可发生于选自SEQ ID NO：2的46、90、96及268中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或四个氨基酸位置，或发生于与SEQ ID NO：2的位置46、90、96及268对应的位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA6的VP1多肽与SEQ ID NO：2比对时，突变发生于SEQ ID NO：2的位置46、90、96及268中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置，或发生于与SEQ ID NO：2的位置46、90、96及268对应的位置。在一些实施例中，位置46的突变为丙氨酸经缬氨酸取代。在一些实施例中，位置90的突变为麸氨酸经离氨酸取代。在一些实施例中，位置96的突变为苏氨酸经丙氨酸取代。在一些实施例中，位置268的突变为缬氨酸经异白氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA6的VP2多肽内。来自例示性CA6株系的VP2多肽的氨基酸序列阐述为：
SPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPGYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVVVIPEFVVAASSPAMKPNGQGLYPDFAHTNPGKEGQVFRDPYVLDAGIPLSQALVFPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLAVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQ(SEQ ID NO：3)。
在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA6的VP2多肽与SEQ ID NO：3比对时，突变可发生于SEQ ID NO：3的氨基酸位置144，或发生于与SEQ ID NO：3的位置144对应的位置。在一些实施例中，位置144的突变为麸酰氨酸经离氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA6的VP3多肽内。来自例示性CA6株系的VP3多肽的氨基酸序列阐述为：
GLPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCRIETILEVNNTTGTTGVNRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPTTREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPSEANIIALGAAQENFTLKLCKDTDEIRQTAEYQ(SEQ ID NO：4)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA6的VP3多肽内的一或多个氨基酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA6的VP3多肽与SEQ ID NO：4比对时，突变可发生于SEQ ID NO：4的氨基酸位置102，或发生于与SEQ ID NO：4的位置102对应的位置。在一些实施例中，位置102的突变为异白氨酸经缬氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA6的5’UTR内。来自例示性CA6株系的5’UTR的核酸序列阐述为：
TTAAAACAGCTAGTGGGTTGCACCCACTCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTTCCCGGAATCCTTGTGCGCCTGTTTTATATCCCCTCCCCCATGCGCAACTTAGAAGCAATCTACACCTTCGATCAATAGCAGGCGTGGCGCGCCAGCCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAAACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAATGTTCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGTAGCACCATGAAAATTGCAGAGCGTTtCGcTCAGCGcTtCCCCcGCGtAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCATTCCTCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATATGGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATACCCCCAAACCAGGGGGCGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGAATAACAGAGCCTTGATATACCTTTTTGTAGGGTTTATACCACTTACTCTTCGCGTTGTTGAGACTCTAAAGTACATTCTAATCTTGAACACTAGAAA(SEQ IDNO：8)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA6的5’UTR内的一或多个核酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA6的5’UTR与SEQ ID NO：8比对时，突变可发生于选自SEQ ID NO：8的1、13、14、15、16、21、23、34及40中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上、五个或五个以上、六个或六个以上、七个或七个以上、八个或八个以上，或九个核酸位置，或发生于与SEQ ID NO：8的位置1、13、14、15、16、21、23、34及40对应的位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA6的5’UTR与SEQ ID NO：8比对时，突变发生于SEQ ID NO：8的位置1、13、14、15、16、21、23、34及40中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上、五个或五个以上、六个或六个以上、七个或七个以上、八个或八个以上，或所有九个位置，或发生于与SEQ ID NO：8的位置1、13、14、15、16、21、23、34及40对应的位置。在一些实施例中，位置1的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代。在一些实施例中，位置13的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代。在一些实施例中，位置14的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代。在一些实施例中，位置15的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代。在一些实施例中，位置16的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代。在一些实施例中，位置21的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代。在一些实施例中，位置23的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代。在一些实施例中，位置34的突变为鸟嘌呤经胸腺嘧啶取代。在一些实施例中，位置40的突变为胞嘧啶经鸟嘌呤取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA16的2A多肽内。来自例示性CA16株系的2A多肽的氨基酸序列阐述为：
GKFGQQSGAIYVGNYRVVNRHLATHNDWANLVWEDSSRDLLVSSTTAQGCDTIARCDCQTGIYYCSSKRKHYPVSFTKPSLIFVEASEYYPARYQSHLMLAVGHSEPGDCGGILRCQHGVVGIVSTGGNGLVGFADVRDLLWLDEEAMEQ(SEQ ID NO：5)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA16的2A多肽内的一或多个氨基酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA16的2A多肽与SEQ ID NO：5比对时，突变可发生于SEQ ID NO：5的氨基酸位置2，或发生于与SEQ ID NO：5的位置2对应的位置。在一些实施例中，位置2的突变为离氨酸经麸氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA16的VP2多肽内。来自例示性CA16株系的VP2多肽的氨基酸序列阐述为：
SPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIVIAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFFTLDTKSWAKDSKGWYWKFPDVLTEVGVFGQNAQFHYLYRSGFCVHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVLGTIAGGTGNENSHPPYATTQPGQVGAVLMHPYVLDAGIPLSQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYMNTVPFDSALNHCNFGLLVIPVVPLDFNAGATSEIPITVTIAPMCAEFAGLRQAVKQ(SEQ ID NO：6)
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA16的VP2多肽内的一或多个氨基酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA16的VP2多肽与SEQ ID NO：6比对时，突变可发生于SEQ ID NO：6的氨基酸位置161，或发生于与SEQ ID NO：6的位置161对应的位置。在一些实施例中，位置161的突变为甲硫氨酸经苏氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA16的VP1多肽内。来自例示性CA16株系的VP1多肽的氨基酸序列阐述为：
GDPIADMIDQTVNNQVNRSLTALQVLPTAANTEASSHRLGTGVVPALQAAETGASSNASDKNLIETRCVLNHHSTQETAIGNFFSRAGLVSIITMPTTDTQNTDGYVNWDIDLMGYAQLRRKCELFTYMRFDAEFTFVVAKPNGVLVPQLLQYMYVPPGAPKPTSRDSFAWQTATNPSVFVKMTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHLQANDLDYGQCPNNMMGTFSIRTVGTEKSPHSITLRVYMRIKHVRAWIPRPLRNQPYLFKTNPNYKGNDIKCTSTSRDKITTL(SEQ ID NO：7)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA16的VP1多肽内的一或多个氨基酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA16的VP1多肽与SEQ ID NO：7比对时，突变可发生于选自SEQ ID NO：7的99及145中的一或多个或两个氨基酸位置，或发生于与SEQ ID NO：7的位置99或145对应的位置。在一些实施例中，位置99的突变为天冬氨酸经甘氨酸取代。在一些实施例中，位置145的突变为缬氨酸经麸氨酸取代。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变位于CA16的5’UTR内。来自例示性CA16株系的5’UTR的核酸序列阐述为：
AGCCTGTGGGTTGTTCCCACCCACAGGGCCCAGTGGGCGCTAGCACACTGATTCTGCGGGATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCTAAGCAGCAACTTAGAAGTTTCACACAATCACGACCAGTAGTGGGCGTGGCGCGCCAGTCACGTCTTGGTCAAGCACTTCTGTTCCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGtAGCACCGTGAAAGTTGCGGAGtGTttCGCTCAGCACTTCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGTAAACCCCACGGGCGACCGTGACAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACGCACCCTCAACCCAGGGGGCGGCGTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTTATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTCTAACAGAGCTATTGTTTACCTATTTATTGGATACGTCCCTCTTAATCTCAAGGCCATTCAAACTCTTGATTATATATTGCTCCTTAACTGTAAGAAA(SEQ ID NO：9)。
在一些实施例中，至少一个非人类细胞适应突变发生于CA16的5’UTR内的一或多个核酸位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA16的5’UTR与SEQ ID NO：9比对时，突变可发生于选自SEQ ID NO：9的6及33中的一或多个或两个核酸位置，或发生于与SEQ IDNO：9的位置6或33对应的位置。在一些实施例中，当使用成对比对算法对CA16的5’UTR与SEQID NO：9比对时，突变发生于SEQ ID NO：9的位置6与33，或发生于与SEQ ID NO：9的位置6与33对应的位置。在一些实施例中，位置6的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代。在一些实施例中，位置33的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代。
在本发明的上述实施例中，例示性成对比对算法为尼德曼-翁施全局比对算法(Needleman-Wunsch global alignment algorithm)，其使用预设参数(例如空隙敞口罚分＝10.0，空隙延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62计分矩阵)。此算法宜用EMBOSS套装中的针工具实施。
在一些实施例中，来自至少一种引起手、足及口病的病毒的本发明抗原可用于本发明的任一种疫苗及免疫原性组合物中。举例而言，本发明的抗原可适用于治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应。
疫苗及免疫原性组合物的产生
本发明的其它态样是关于含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的本发明抗原的手、足及口疫苗及免疫原性组合物。此类疫苗及免疫原性组合物可适用于例如治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应。本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可包括(但不限于)纯化病毒、不活化病毒、减毒病毒、重组病毒、用于次单位疫苗的经纯化及/或重组病毒蛋白。本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可进一步包括纯化抗原疫苗或免疫原性组合物、次单位疫苗或免疫原性组合物、不活化完整病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。
本发明的疫苗及/或免疫原性组合物的产生包括使至少一种引起手、足及口病的病毒生长，其中抗原是由所生长的病毒制备。在细胞培养物中生长为制备本发明的疫苗及/或免疫原性组合物的方法。供病毒生长用的细胞可在悬浮液中或在粘附条件下培养。
适于供本发明的至少一种病毒生长用的细胞株较佳具有哺乳动物来源，且包括(但不限于)：VERO细胞(来自猴肾脏)、马、牛(例如MDBK细胞)、绵羊、犬(例如来自犬肾脏的MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016，寄存编号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)、猫及啮齿动物(例如仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，且可自广泛多个发育阶段获得，包括例如成人、新生儿、胎儿及胚。在某些实施例中，使细胞永生化(例如PERC.6细胞，如WO01/38362及WO02/40665中所述，且以ECACC寄存编号96022940寄存)。在较佳实施例中，使用哺乳动物细胞且可选自及/或来源于以下非限制性细胞类型中的一或多者：纤维母细胞(例如皮肤、肺)、内皮细胞(例如主动脉、冠状动脉、肺、血管、真皮微血管、脐)、肝细胞、角质细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突状细胞)、乳腺细胞(例如上皮)、平滑肌细胞(例如血管、主动脉、冠状动脉、动脉、子宫、支气管、子宫颈、视网膜周细胞)、黑色素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮、平滑肌)、肾细胞(例如上皮、肾小球膜、近端小管)、骨胳细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌肉细胞(例如肌母细胞、骨胳、平滑肌、支气管)、肝细胞、视网膜母细胞及基质细胞。WO97/37000及WO97/37001描述产生能够在悬浮液中及在无血清培养基中生长且适用于产生及复制病毒的动物细胞及细胞株。
上述细胞类型的培养条件已知且描述于多个公开案中，或者培养基、补充剂及条件可市购，诸如如Cambrex Bioproducts(East Rutherford,N.J.)的目录及其它文献中所述。
在某些实施例中，本文所述方法中所用的细胞在无血清及/或无蛋白质培养基中培养。在本发明的上下文中，培养基称为无血清培养基，其中不存在来自人类或动物来源的血清的添加剂。无蛋白质理解为意谓其中细胞增殖是在蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂及非血清蛋白质排除的情况下发生、但视情况可包括病毒生长可能需要的蛋白质(诸如胰蛋白酶或其它蛋白酶)的培养物。在此类培养物中生长的细胞天然含有蛋白质本身。
已知的无血清培养基包括伊斯科夫氏培养基(Iscove's medium)、超CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH Bioscience)。普通的含血清培养基包括伊格尔氏基本培养基(Eagle's Basal Medium，BME)或最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或杜尔贝科氏修饰的伊格尔氏培养基(DMEM或EDM)，其通常结合多达10％胎牛血清或类似添加剂使用。视情况，最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或杜尔贝科氏修饰的伊格尔氏培养基(DMEM或EDM)可不结合任何含血清补充剂使用。无蛋白质培养基，如PF-CHO(JHR Bioscience)；化学上已定义的培养基，如ProCHO 4CDM(BioWhittaker)或SMIF 7(Gibco/BRL Life Technologies)及促有丝分裂肽，如Primactone、Pepticase或HyPep.TM.(皆得自Quest International)或乳白蛋白水解物(Gibco及其它制造商)，亦充分已知于先前技术中。基于植物水解物的培养基添加剂具有可排除病毒、霉浆菌或未知传染媒介物污染的特别优势。
细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)由于根据本发明所使用的细胞株的适合性而可在非常广泛的范围内变化且可依照特定病毒株的需要来调适。
使病毒在所培养细胞中传播的方法通常包括如下步骤：用欲培养的株系接种所培养细胞，将所感染细胞培育所要时间段供病毒传播，诸如如藉由病毒效价或抗原表现所测定(例如接种之后24小时与168小时之间)，且收集所传播病毒。所培养细胞利用1:500至1:1、较佳1:100至1:5、更佳1:50至1:10的病毒(藉由PFU或TCID50量测)与细胞比率来接种。将病毒添加至细胞悬浮液中或涂覆于细胞单层上，且在25℃至40℃、较佳在28℃至37℃下，使病毒在细胞上吸收至少60分钟，但通常小于300分钟，较佳在90分钟与240分钟之间。所感染细胞培养物(例如单层)可藉由冷冻-解冻或藉由酶促作用来移除，以增加所收集的培养物上清液中的病毒含量。所收集的流体接着不活化或冷冻储存。所培养细胞可在约0.0001至10、较佳为0.002至5、更佳为0.001至2的感染倍率(「m.o.i.」)下感染。再更佳地，细胞在约0.01的m.o.i下感染。感染后30至60小时，或感染后4至10天，可收集所感染细胞。在某些实施例中，感染后34至48小时收集细胞。在某些较佳实施例中，感染后4至7小时收集细胞。更佳地，感染后4至5天收集细胞。在一些实施例中，可在允许病毒释放的细胞培养期间添加蛋白酶(例如胰蛋白酶)，且可在培养期间的任何适合阶段添加蛋白酶。或者，在某些实施例中，可收集所感染细胞培养物的上清液且可自上清液中分离出病毒或以其它方式纯化病毒。
病毒接种物及病毒培养物较佳不含(亦即已针对以下病毒的污染加以测试且得到阴性结果)单纯性疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、囊病毒、环病毒及/或小病毒[WO2006/027698]。
若病毒已在细胞株上生长，则标准实务为使最终疫苗中的残余细胞株DNA的量最小化，以便最小化DNA的任何致癌活性。可在疫苗制备期间，使用标准纯化程序(例如层析等)移除污染性DNA。移除残余宿主细胞DNA可藉由核酸酶处理(例如藉由使用DNA酶)来增强。减少宿主细胞DNA污染的方便方法揭示于参考文献中[Lundblad(2001)Biotechnologyand Applied Biochemistry 34:195-197,Guidance for Industry:BioanalyticalMethod Validation.美国健康及人类服务部食品与药物管理局药物评价及研究中心(CDER)兽医学医药中心(CVM)(U.S.Department of Health and Human Services Foodand Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Centerfor Veterinary Medicine(CVM)),2001年5月]，该方法包括两步处理：首先使用可在病毒生长期间使用的DNA酶(例如核酸酶)，接着使用可在病毒粒子破裂期间使用的阳离子清洁剂(例如CTAB)。亦可使用藉由β-丙内酯处理来进行的移除。
抗原的产生
用于疫苗及/或免疫原性组合物中的本发明抗原(包括(但不限于)纯化病毒、不活化病毒、减毒病毒、重组病毒，或用于次单位疫苗的经纯化及/或重组病毒蛋白质，以治疗或预防手、足及口病及/或诱导针对手、足及口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应)可藉由此项技术中已知的任何适合方法产生及/或纯化或以其它方式分离。本发明的抗原可包括(但不限于)自至少一种引起手、足及口病的病毒产生、衍生、纯化及/或以其它方式分离出的完整病毒、减毒病毒、不活化病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白质及蛋白质内的个别多肽抗原决定基)、醣多肽、脂多肽、肽、多醣、多醣结合物、肽以及多醣及其它分子、小分子、脂质、醣脂及碳水化合物的非肽模拟物。举例而言，适合抗原可包括(但不限于)来自病毒(诸如EV71、CA6及CA16)的结构多肽，诸如VP1、VP2、VP3及VP4，及非结构多肽，诸如2A、2B、2C、3A、3B、3C及3D。
本发明的抗原可以化学方式或以酶促方式合成，以重组方式产生，自天然来源分离，或前述者的组合。在某些实施例中，本发明的抗原是由引起手、足及口病的至少一种本发明病毒(诸如EV71、CA6及CA16)产生、纯化、分离及/或衍生。本发明的抗原可经纯化，部分纯化或可为粗萃取物。在一些实施例中，本发明的抗原为如标题「疫苗及免疫原性组合物的产生」的上述章节中所述产生的病毒，诸如不活化病毒。
在某些实施例中，一或多种本发明抗原可藉由培养非人类细胞来产生。适用于产生一或多种本发明抗原的细胞株较佳具有哺乳动物来源，且包括(但不限于)：VERO细胞(来自猴肾脏)、马、牛(例如MDBK细胞)、绵羊、犬(例如来自犬肾脏的MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)或MDCK 33016，寄存编号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)、猫及啮齿动物(例如仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，且可自广泛多个发育阶段获得，包括例如成人、新生儿、胎儿及胚。在某些实施例中，使细胞永生化(例如PERC.6细胞，如WO01/38362及WO02/40665中所述，且以ECACC寄存编号96022940寄存)。在较佳实施例中，使用哺乳动物细胞且可选自及/或来源于以下非限制性细胞类型中的一或多者：纤维母细胞(例如皮肤、肺)、内皮细胞(例如主动脉、冠状动脉、肺、血管、真皮微血管、脐)、肝细胞、角质细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突状细胞)、乳腺细胞(例如上皮)、平滑肌细胞(例如血管、主动脉、冠状动脉、动脉、子宫、支气管、子宫颈、视网膜周细胞)、黑色素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮、平滑肌)、肾细胞(例如上皮、肾小球膜、近端小管)、骨胳细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌肉细胞(例如肌母细胞、骨胳、平滑肌、支气管)、肝细胞、视网膜母细胞及基质细胞。WO97/37000及WO97/37001描述产生能够在悬浮液中及在无血清培养基中生长且适用于产生病毒抗原的动物细胞及细胞株。在某些实施例中，非人类细胞在无血清培养基中培养。
多肽抗原可使用此项技术中已知的标准蛋白质纯化方法自天然来源分离，包括(但不限于)液相层析(例如高效液相层析、快速蛋白质液相层析等)、尺寸排阻层析、凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)、亲和层析，或其它纯化技术。在多个实施例中，抗原为纯化抗原，例如约50％至约75％纯度、约75％至约85％纯度、约85％至约90％纯度、约90％至约95％纯度、约95％至约98％纯度、约98％至约99％纯度，或大于99％纯度。
可使用固相肽合成技术，其中此类技术已为熟习此项技术者所知。参见Jones,TheChemical Synthesis of Peptides(Clarendon Press,Oxford)(1994)。一般而言，在此类方法中，肽是经由依序添加活化单体单元至固相结合的生长肽链来产生。
可利用充分确立的重组DNA技术来产生多肽，其中例如将包含编码多肽的核苷酸序列的表现构筑体引入适当宿主细胞(例如以单细胞实体形式在活体外细胞培养物中生长的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)或原核细胞(例如在活体外细胞培养物中生长)中，从而产生经基因修饰的宿主细胞；经基因修饰的宿主细胞在适当培养条件下产生蛋白质。
除杀死的病毒及减毒病毒免疫原性组合物之外，可使用将手、足及口病病毒的抗原性组分呈递至动物的次单位免疫原性组合物或其它类型的免疫原性组合物。抗原性组分可为当注入人类中时刺激人类的免疫反应以使得人类产生针对手、足及口病的保护性免疫的蛋白质、醣蛋白、脂质结合的蛋白质或醣蛋白、经修饰的脂质部分，或其它病毒组分。对于次单位免疫原性组合物而言，病毒可如上文所述在哺乳动物细胞上培养。细胞培养物可均质化且免疫原性组合物可藉由使细胞培养均质物通过适当管柱或通过适当孔径的过滤器或经由将细胞培养均质物离心而分离。
若抗原性组分为蛋白质，则可分离出编码该蛋白质的核酸且产生含有该经分离核酸的免疫原性组合物。编码抗原性组分的核酸可置放于真核激活子信号序列下游的质体上。该质体可含有一或多个可选标记物且转染至减毒原核生物体中，诸如沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺杆菌属(Shigella spp.)或其它适合细菌。接着可将细菌投与人类，以使得人类可产生针对抗原性组分的保护性免疫反应。或者，可将编码抗原性组分的核酸置放于原核激活子下游，其具有一或多个可选标记物，且转染至减毒原核生物体中，诸如沙门氏菌属、志贺杆菌属或其它适合细菌。接着可将细菌投与需要针对所关注抗原的免疫反应的真核个体。参见例如针对Hone等人的美国专利第6,500,419号。
对于次单位免疫原性组合物而言，可将编码手、足及口病病毒的蛋白质抗原性组分的核酸选殖至质体中，诸如国际专利申请公开案第WO 00/32047号(Galen)及国际专利申请公开案第WO 02/083890号(Galen)中所述的质体。接着可将质体转染至细菌中且细菌可产生所要抗原性蛋白质。可藉由两个专利申请案中所述的多种方法分离且纯化所要抗原性蛋白质。
病毒不活化
本发明的某些态样是关于手、足及口疫苗及免疫原性组合物，其含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原。本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可包括纯化病毒、完整病毒、重组病毒、活减毒完整病毒或较佳为不活化完整病毒，或来自不活化病毒的亚单元、多肽及/或抗原。因而，本发明的某些实施例关于含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种不活化病毒的抗原的手、足及口疫苗及/或免疫原性组合物。不活化或杀死病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力的方法在此项技术中已知。此类方法包括化学与物理方式。适用于不活化病毒的方式包括(但不限于)用有效量的一或多种药剂处理，该等药剂选自清洁剂、福尔马林(在本文中亦称为「甲醛」)、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基伸乙基亚胺、热、电磁辐射、x射线辐射、γ辐射、紫外辐射(UV辐射)、UV-A辐射、UV-B辐射、UV-C辐射、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(carboxyfullerene)(C60)及其任一者的任何组合。
在本发明的某些实施例中，至少一种病毒以化学方式不活化。化学不活化药剂及化学不活化方法在此项技术中已熟知且描述于本文中。在一些实施例中，至少一种病毒在化学上用BPL、福尔马林或BEI中的一或多者不活化。在其中至少一种病毒使用BPL进行化学不活化的某些实施例中，病毒可含有一或多种修饰。在一些实施例中，一或多种修饰可包括经修饰的核酸。在一些实施例中，经修饰的核酸为烷基化核酸。在其它实施例中，一或多种修饰可包括经修饰的多肽。在一些实施例中，经修饰的多肽含有经修饰的氨基酸残基，包括以下中的一或多者：经修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、酪氨酸、离氨酸、丝氨酸及苏氨酸。在其中至少一种病毒使用福尔马林进行化学不活化的某些实施例中，病毒可含有一或多种修饰。在一些实施例中，一或多种修饰可包括经修饰的多肽。在一些实施例中，一或多种修饰可包括交联多肽。在其中至少一种病毒使用福尔马林进行化学不活化的一些实施例中，疫苗或免疫原性组合物进一步包括福尔马林。在其中至少一种病毒使用BEI进行化学不活化的某些实施例中，病毒可含有一或多种修饰。在一些实施例中，一或多种修饰可包括经修饰的核酸。在一些实施例中，经修饰的核酸为烷基化核酸。
在其中至少一种病毒使用BEI或BPL进行化学不活化的一些实施例中，未反应的任何残余BEI或BPL可使用硫代硫酸钠中和(亦即水解)。一般而言，过量添加硫代硫酸钠。在一些实施例中，硫代硫酸钠可以约25mM至约100mM、约25mM至约75mM或约25mM至约50mM范围内的浓度添加。在某些实施例中，硫代硫酸钠可在约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM或约40mM的浓度下，以1份浓缩硫代硫酸钠相对于20份BEI的比率添加。在一些实施例中，溶液可使用混合器(诸如管线内静态混合器)混合，且随后过滤(例如澄清)。一般而言，抽吸两种溶液通过混合器，导致完全混合且藉由硫代硫酸钠中和BEI。
本发明的某些实施例是关于一种使手、足及口病毒制剂不活化的方法。在一些实施例中，方法包括(a)自一或多个用于产生病毒制剂的非人类细胞分离出手、足及口病毒制剂及(b)用有效量的BEI处理病毒制剂。在某些实施例中，用有效量的BEI处理包括(但不限于)用约0.25％v/v至约3.0％v/v范围内的量的BEI处理。在某些实施例中，经分离且经处理的病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。在方法的某些实施例中，病毒制剂在约25℃至约42℃范围内的温度下经BEI处理。在方法的某些实施例中，病毒制剂经BEI处理约1小时至约10小时范围内的时间段。在某些实施例中，方法进一步包括用有效量的硫代硫酸钠使未反应的BEI不活化(亦即水解)。在一些实施例中，硫代硫酸钠的有效量在约25mM至约100mM、约25mM至约75mM或约25mM至约50mM范围内。
在一些实施例中，方法包括(a)自一或多个用于产生病毒制剂的非人类细胞中分离出手、足及口病毒制剂；(b)用有效量的β-丙内酯(BPL)处理该病毒制剂；及视情况，(c)在步骤(b)的同时或之后，用有效量的福尔马林处理该病毒制剂。或者，在一些实施例中，方法包括(a)自一或多个用于产生病毒制剂的非人类细胞中分离出手、足及口病毒制剂；(b)病毒制剂用有效量的β-丙内酯(BPL)处理第一时间段；及(c)病毒制剂用有效量的BPL处理第二时间段以使病毒制剂完全不活化。在一些实施例中，第一及/或第二时间段在约12小时至约36小时范围内。在某些实施例中，第一及/或第二时间段为约24小时。在某些实施例中，用有效量的BPL处理包括(但不限于)用约0.05％v/v至约3.0％v/v(0.1％v/v至约2％v/v，或约0.1％v/v至约1％v/v)范围内的量的BPL处理。在某些实施例中，用有效量的BPL处理包括(但不限于)用0.05％v/v、0.06％v/v、0.07％v/v、0.08％v/v、0.09％v/v、0.1％v/v、0.2％v/v、0.3％v/v、0.4％v/v、0.5％v/v、0.6％v/v、0.7％v/v、0.8％v/v、0.9％v/v或1％v/vBPL处理。在某些实施例中，经分离且经处理的病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。在方法的某些实施例中，病毒制剂在约2℃至约8℃范围内的温度下经BEI处理。在某些实施例中，方法包括将病毒制剂在37℃的温度下加热足以使BPL水解的时间段。在某些实施例中，时间段在约1小时至约6小时范围内。或者，在一些实施例中，方法进一步包括用有效量的硫代硫酸钠使未反应的BPL不活化(亦即水解)。在一些实施例中，硫代硫酸钠的有效量在约25mM至约100mM、约25mM至约75mM或约25mM至约50mM范围内。
在一些实施例中，方法包括(a)自一或多个用于产生病毒制剂的非人类细胞分离出手、足及口病毒制剂；(b)用有效量的福尔马林处理该病毒制剂；及(c)自福尔马林纯化该病毒制剂。在某些实施例中，用有效量的福尔马林处理包括(但不限于)用约0.05％v/v至约3.0％v/v、0.1％v/v至约2％v/v或约0.1％v/v至约1％v/v范围内的量的福尔马林处理。在某些实施例中，经分离且经福尔马林处理的病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。在某些实施例中，病毒制剂自福尔马林中纯化的程度较高，此程度的量为约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或99％以上。
含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种不活化病毒的抗原的本发明疫苗及/或免疫原性组合物可适用于治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应。
疫苗及/或免疫原性组合物的调配物
本发明的其它态样是关于含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原的本发明疫苗及免疫原性组合物的调配物。含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原的本发明的此类疫苗及/或免疫原性组合物可适用于治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应。
典型地，本发明的疫苗及/或免疫原性组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射剂；亦可制备适于在注射之前溶于或悬浮于液体中的固体形式。此类制剂亦可乳化或以干粉形式产生。活性免疫原性成分通常与医药学上可接受的且与活性成分兼容的赋形剂混合。适合的赋形剂为例如水、生理盐水、右旋糖、蔗糖、甘油、乙醇或其类似物及其组合。另外，必要时，疫苗或免疫原性组合物可含有助剂，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，或增强疫苗或免疫原性组合物的有效性的佐剂。
疫苗或免疫原性组合物可习知地以非经肠方式、藉由注射投与，例如皮下、经皮、皮内、皮下或肌肉内。适于其它投药方式的其它调配物包括栓剂及(在一些情况下)口服、经口、鼻内、颊内、舌下、腹膜内、阴道内、肛门及颅内调配物。对于栓剂而言，传统粘合剂及载剂可包括例如聚烷二醇或甘油三酯；此类栓剂可由含有0.5％到10％或甚至1-2％范围内的活性成分的混合物形成。在某些实施例中，首先使低熔点蜡(诸如脂肪酸甘油酯混合物或可可脂)熔融且使本文所述的手、足及口病疫苗或免疫原性组合物均匀分散，例如藉由搅拌来达成。接着将熔融的均匀混合物倒入适宜大小的模具中，使其冷却且固化。
适于鼻内递送的调配物包括液体(例如以气溶胶或滴鼻剂形式投与的水溶液)及干燥散剂(例如用于在鼻孔内快速沉积)。调配物包括诸如医药级甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇及聚葡萄胺糖的常用赋形剂。粘膜粘着剂(诸如聚葡萄胺糖)可用于液体或粉末调配物中以延迟鼻内所投调配物的粘液纤毛清除。糖类(诸如甘露醇及蔗糖)可用作液体调配物中的稳定剂及干粉调配物中的稳定剂、增积剂或粉末流动剂及上浆剂。另外，液体与干粉调配物中均可使用佐剂(诸如单磷酰基脂质A(MLA)或其衍生物，或CpG寡核苷酸)作为免疫刺激性佐剂。
适于口服递送的调配物包括液体、固体、半固体、凝胶、锭剂、胶囊、口含锭及其类似物。适于口服递送的调配物包括锭剂、口含锭、胶囊、凝胶、液体、食物产品、饮料、营养药剂及其类似物。调配物包括诸如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及其类似物的常用赋形剂。其它手、足及口病疫苗及免疫原性组合物可呈溶液、悬浮液、丸剂、持续释放型调配物或散剂的形式且含有10-95％活性成分，或25-70％。对于口服调配物而言，霍乱毒素为受关注的调配搭配物(以及可能的结合搭配物)。
手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物当针对阴道投药而调配时可呈子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊状物、发泡体或喷雾剂的形式。任一种前述调配物可含有除手、足及口病疫苗及免疫原性组合物抗原之外、此项技术中已知为适当的药剂，诸如载剂。
在一些实施例中，本发明的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物可经调配供全身性或局部递送。此类调配物在此项技术中已熟知。非经肠媒剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒剂包括流体及营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的彼等物)及其类似物。全身性及局部投药途径包括例如皮内、局部施用、静脉内、肌肉内等。
本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可以与剂型兼容的方式及以治疗上有效且产生免疫原性的量投与。投药量视待治疗的个体而定，包括例如待建立免疫反应的个体免疫系统的能力，及所要保护程度。适合的剂量范围为每次疫苗接种数百微克活性成分的量级，例示性范围为约0.1μg至10μg(即使涵盖1-10mg范围内的较高量)，诸如约0.1μg至5μg范围，或甚至0.6μg至3μg范围或约1μg至3μg范围，或甚至0.1μg至1μg范围。在某些实施例中，剂量可为每剂约0.1μg、约0.2μg、约0.3μg、约0.4μg、约0.5μg、约0.6μg、约0.7μg、约0.8μg、约0.9μg、约1μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg或约3μg。在某些实施例中，本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可以每剂1μg的量投与。在包含选自EV71、CA6及CA16中的两者或两者以上的本发明多价疫苗及/或免疫原性组合物(例如二价或三价疫苗及/或免疫原性组合物)中，各组分的剂量是以相等剂量比投与(亦即二价三价疫苗及/或免疫原性组合物为1:1且三价疫苗及/或免疫原性组合物为1:1:1)。
适用于初次投药及加打的疗法亦为可变的，但典型的是，初次投药后，随后为接种或其它投药。
施用方式可广泛变化。用于投与疫苗或免疫原性组合物的任一种习知方法均为适用的。此等方法包括在生理学上可接受的固体碱上经口施用或在生理学上可接受的分散液中藉由注射或其类似方式而非经肠施用。疫苗或免疫原性组合物的剂量将视投药途径而定且根据所接种人员的年龄及抗原调配物而变化。疫苗或免疫原性组合物可具有大于0.5mL、0.5mL或小于0.5mL的单位剂量体积，如本文所述。举例而言，可以0.25mL的体积投与。
亦可使用改善粘膜粘附的递送剂来改善递送及免疫原性，特别是鼻内、口服或基于肺递送的调配物。一种此类化合物聚葡萄胺糖(甲壳素的N去乙酰化形式)用于许多医药调配物中。由于其能够延迟粘液纤毛清除且允许更多的时间用于粘膜抗原吸收及处理，因此其为用于鼻内疫苗递送的引人注目的粘膜粘着剂。另外，其可短暂开放紧密接合点，从而可增强抗原经上皮传输至NALT。在近期的人类试验中，与聚葡萄胺糖一起、但不与任何其它佐剂一起鼻内投与的三价不活化流感疫苗产生的血清转化及HI效价仅稍微低于肌肉内接种之后所获得的血清转化及HI效价。
聚葡萄胺糖亦可用在鼻内发挥良好作用的佐剂调配，诸如以遗传方式解毒的大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LTK63。在递送处于顶峰时，此添加了免疫刺激性作用，及聚葡萄胺糖所赋予的粘着益处，从而增强粘膜及全身性反应。
最后，应注意聚葡萄胺糖调配物亦可以干粉形式制备，其已显示可改善疫苗稳定性且进一步延迟液体调配物的粘液纤毛清除。此发现于近期的人类临床试验中，其涉及用聚葡萄胺糖所调配的鼻内干粉白喉类毒素疫苗，其中鼻内途径与传统的肌肉内途径同样有效，其中分泌性IgA反应的益处增加。疫苗亦具有非常良好的耐受性。含有聚葡萄胺糖及MLA或其衍生物的鼻内干粉状炭疽病疫苗在兔中诱导的反应比肌肉内接种更强且针对气溶胶孢子攻击亦具有保护性。
鼻内疫苗代表一种例示性调配物，原因在于其可影响上呼吸道及下呼吸道，相比之下，非经肠投与的疫苗更好地影响下呼吸道。此可有益于诱导对基于过敏原的疫苗的耐受性及诱导基于病原体的疫苗的免疫力。
除在上呼吸道及下呼吸道中提供保护之外，鼻内疫苗避免针接种的并发症且提供一种经由微粒及/或可溶性抗原与鼻咽相关淋巴组织(NALT)的相互作用来诱导粘膜及全身体液性及细胞反应的方式。
本发明的疫苗及/或免疫原性组合物为医药学上可接受的。其可包括除抗原及佐剂之外的组分，例如其典型地包括一或多种医药载剂及/或赋形剂。此类组分的充分论述可获得于Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy.第20版,ISBN:0683306472。
为了控制张力，较佳包括生理学上的盐，诸如钠盐。较佳为氯化钠(NaCl)，其可以1mg/ml至20mg/ml存在。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠脱水物、氯化镁、氯化钙等。
本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可包括一或多种缓冲液。典型缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；丁二酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(尤其联合氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。典型地包括5-20mM范围内的缓冲液。
疫苗或免疫原性组合物的pH通常介于5.0与8.1之间，且更典型地介于6.0与8.0之间，例如6.5与7.5之间，或7.0与7.8之间。本发明的制造方法因此可包括封装之前调节本体疫苗的pH的步骤。
疫苗或免疫原性组合物较佳为无菌的。其较佳为无热原质的，例如每剂含有<1EU(内毒素单位，标准量度)且较佳为每剂<0.1EU。其较佳为无麸质的。
在某些实施例中，本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可包括有效浓度的清洁剂。在一些实施例中，有效量的清洁剂可包括(但不限于)约0.00005％v/v至约5％v/v或约0.0001％v/v至约1％v/v。在某些实施例中，清洁剂的有效量为约0.001％v/v、约0.002％v/v、约0.003％v/v、约0.004％v/v、约0.005％v/v、约0.006％v/v、约0.007％v/v、约0.008％v/v、约0.009％v/v或约0.01％v/v。不希望被理论束缚，清洁剂有助于维持本发明的疫苗及/或免疫原性组合物处于溶液中且有助于防止疫苗及/或免疫原性组合物聚集。
适合清洁剂包括例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯界面活性剂(已知为「Tweens」)、辛苯聚醇(诸如辛苯聚醇-9(Triton X 100)或第三辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(「CTAB」)及去氧胆酸钠，尤其适用于分离的或表面抗原疫苗。清洁剂可仅痕量存在。痕量的其它残余组分可为抗生素(例如新霉素、康霉素、多粘菌素B)。在一些实施例中，清洁剂含有聚山梨醇酯。在一些实施例中，清洁剂的有效浓度包括约0.00005％v/v至约5％v/v的范围。
疫苗及/或免疫原性组合物较佳在2℃与8℃之间储存。其不应冷冻。理想上，其应避光保存。抗原及乳液典型地处于混合物中，然而其最初可以临时混合的各别组分的套组形式呈递。疫苗及/或免疫原性组合物投与个体时通常呈水性形式。
佐剂
本发明的其它态样是关于手、足及口疫苗及/或免疫原性组合物，其含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原与一或多种佐剂的组合。本发明的此类有佐剂的疫苗及/或免疫原性组合物可适用于治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应，诸如保护性免疫反应。
对疫苗达成佐剂作用的各种方法已知且可结合本文所揭示的手、足及口疫苗及/或免疫原性组合物使用。一般原理及方法详述于"The Theory and PracticalApplication of Adjuvants",1995,Duncan E.S.Stewart-Tull(编),John Wiley&SonsLtd,ISBN 0-471-95170-6,以及"Vaccines:New Generation Immunological Adjuvants",1995,Gregoriadis G等人(编),Plenum Press,New York,ISBN 0-306-45283-9。
在一些实施例中，手、足及口疫苗或免疫原性组合物包括抗原及佐剂。抗原可与至少一种佐剂混合，其基于重量的比率为约10:1至约1010:1抗原:佐剂，例如约10:1至约100:1、约100:1至约103:1、约103:1至约104:1、约104:1至约105:1、约105:1至约106:1、约106:1至约107:1、约107:1至约108:1、约108:1至约109:1，或约109:1至约1010:1抗原:佐剂。熟习此项技术者经由关于佐剂的信息及可确定最佳比率的常规实验可容易确定适当比率。
例示性佐剂可包括(但不限于)铝盐、铎样受体(toll-like receptor，TLR)促效剂、单磷酰基脂质A(MLA)、MLA衍生物、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、细胞激素、皂素、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌(gram-negative bacteria)的脂多醣(LPS)、聚膦氮烯、乳液、病毒颗粒(virosomes)、脂质卷(cochleates)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒(poloxamer particles)、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)，及不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund'sAdjuvant，IFA)。在一些实施例中，佐剂为MLA或其衍生物。
在一些实施例中，佐剂为铝盐。在一些实施例中，佐剂包括明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85中的至少一者。在一些实施例中，本发明的铝盐佐剂已发现可增强本发明的HFMD疫苗及/或免疫原性组合物中的抗原的吸附。因此，在一些实施例中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂。
本发明的某些实施例包括制备有佐剂的手、足及口疫苗或免疫原性组合物的方法，其包括(a)将疫苗或免疫原性组合物与铝盐佐剂混合，其中该疫苗或免疫原性组合物包括一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原；及(b)在适合条件下将混合物培育约16小时至约24小时范围内的时间段，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂。在该方法的某些实施例中，至少一种引起手、足及口病的病毒选自EV71、CA6及CA16中的一或多者。在该方法的一些实施例中，混合物在约2℃至约8℃范围内的温度下培育。在该方法的一些实施例中，使用此项技术中已知的任何适合混合器，在不断的混合下培育混合物。在该方法的一些实施例中，混合物在约6.5至约8、约6.8至约7.8、约6.9至约7.6或约7至约7.5范围内的pH值下培育。在某些较佳实施例中，混合物在中性pH下培育。在该方法的一些实施例中，铝盐佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85。
单磷酰基脂质A(MLA)(来自沙门氏菌的脂质A的无毒性衍生物)为已开发为疫苗佐剂的强TLR-4促效剂(Evans等人,2003)。在临床前鼠类研究中，鼻内MLA已显示可增强分泌性以及全身体液性反应(Baldridge等人,2000；Yang等人,2002)。其作为疫苗佐剂，亦已在超过120,000个患者的临床研究中证实为安全且有效的(Baldrick等人,2002；2004)。MLA刺激经由TLR-4受体诱导先天性免疫且因此能够诱发针对广泛范围的感染性病原体(包括革兰氏阴性与革兰氏阳性细菌、病毒及寄生虫)的非特异性免疫反应(Baldrick等人,2004；Persing等人,2002)。MLA包含于鼻内调配物中应提供内生反应的快速诱导，诱发来自病毒攻击的非特异性免疫反应，同时增强由疫苗中的抗原性组分所产生的特异性反应。
因此，在一个实施例中，本发明提供一种组合物，其包含单磷酰基脂质A(MLA)、3De-O-酰基化单磷酰基脂质A(3D-MLA)或其衍生物作为适应性及内生免疫力的增强剂。在化学上，3D-MLA为3De-O-酰基化单磷酰基脂质A与4、5或6条酰基化链的混合物。3De-O-酰基化单磷酰基脂质A的较佳形式揭示于欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline BeechamBiologicals SA)中。在另一个实施例中，本发明提供一种组合物，其包含合成脂质A、脂质A模拟物或类似物(诸如BioMira的PET脂质A)，或经设计可发挥如TLR-4促效剂作用的合成衍生物。
其它例示性佐剂包括(但不限于)多肽佐剂，其可藉由与多肽组分共表现或与多肽组分融合产生嵌合多肽而容易添加至本文所述的抗原中。细菌鞭毛蛋白(鞭毛的主要蛋白质成分)为一种佐剂，由于其被内生免疫系统、被铎样受体TLR5识别，因此其作为佐剂蛋白质已受到愈来愈多的关注(65)。经由TLR5发生的鞭毛蛋白信号传导藉由诱导DC成熟及迁移以及活化巨噬细胞、嗜中性球及肠上皮细胞、从而产生促炎性介体来影响内生与适应性免疫功能(66-72)。
TLR5识别鞭毛蛋白单体内的保守性结构，此结构为此蛋白质特有的且为鞭毛功能所必需的，从而排除其响应于免疫压力而发生的突变(73)。受体对100fM浓度敏感，但不识别完整纤丝。结合及刺激需要鞭毛分解成单体。
作为佐剂，鞭毛蛋白对于非经肠或鼻内投与的异质抗原具有诱导保护性反应的强活性且对于DNA疫苗的佐剂效应亦已报导。当使用适于呼吸性病毒(诸如流感)的鞭毛蛋白时，观测到Th2偏移，但在小鼠或猴中尚未观测到IgE诱导的证据。另外，鼻内或全身性投与猴之后，尚无局部或全身性发炎反应的报导。使用鞭毛蛋白后所诱发的Th2反应特征稍微出人意料，原因在于以MyD88依赖性方式经由TLR5发生的鞭毛蛋白信号及经由TLR发生的所有其它MyD88依赖性信号已显示可导致Th1偏移。重要的是，针对鞭毛蛋白的预存在抗体对于佐剂功效无明显影响，从而使其成为引人注目的多用途佐剂。
近期鼻内疫苗多次试验中的共同主题为使用佐剂及/或递送系统来改善疫苗功效。在一项此类研究中，含有以遗传方式解毒的大肠杆菌不耐热肠毒素佐剂(LT R192G)的流感H3疫苗对H5攻击产生异源亚型保护，但仅在鼻内递送之后如此。保护基于交叉中和性抗体的诱导且证明在开发新疫苗时对于鼻内途径具有重要影响。
细胞激素、群落刺激因子(例如GM-CSF、CSF及其类似物)；肿瘤坏死因子；介白素-2、介白素-7、介白素-12；干扰素及其它，如生长因子，亦可用作佐剂，因为其可藉由与多肽组分混合或融合而容易包括于手、足及口疫苗或免疫原性组合物中。
在一些实施例中，本文所揭示的手、足及口疫苗及免疫原性组合物可包括经由铎样受体起作用的其它佐剂，诸如包含5'-TCG-3'序列的核酸TLR9配位体；咪唑并喹啉TLR7配位体；经取代的鸟嘌呤TLR7/8配位体；其它TLR7配位体，诸如洛索立宾(Loxoribine)、7-去氮杂去氧鸟苷、7-硫杂-8-侧氧基去氧鸟苷、咪喹莫特(Imiquimod)(R-837)及雷西莫特(Resiquimod)(R-848)。
某些佐剂促使疫苗分子被APC(诸如树突状细胞)吸收，且活化此等物。非限制性实例是选自由以下组成的群：免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，诸如毒素、细胞激素及分支杆菌衍生物；油调配物；聚合物；微胞形成佐剂；皂素；免疫刺激性复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；MLA；及囊封佐剂。
佐剂的其它实例包括诸如以下的药剂：铝盐，诸如氢氧化物或磷酸盐(明矾)，其通常以缓冲生理盐水中的0.05至0.1％溶液使用(参见例如Nicklas(1992)Res.Immunol.143:489-493)；与糖类的合成聚合物(例如
Figure BDA0001342303280000271
)的混合物，其以0.25％溶液使用；分别地，用70℃至101℃范围内的温度热处理30秒至2分钟时段可能会使疫苗中的蛋白质发生聚集，且藉助于交联剂亦可能发生聚集。亦可使用藉由经胃蛋白酶处理的抗体(Fab片段)再活化来发生聚集，与细菌细胞(诸如微小隐孢子虫或内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多醣组分)混合，在生理学上可接受的油媒剂(诸如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A))中乳化或使用用作阻断替代物的全氟化碳(Fluosol-DA)的20％溶液乳化。亦可使用与油(诸如角鲨烯及IFA)的混合物。
DDA(二甲基二(十八烷基)溴化铵)为受关注的候选佐剂，而且弗氏完全及不完全佐剂(Freund's complete and incomplete adjuvants)以及皂树皂素(诸如QuilA及QS21)亦受关注。其它可能性包括脂多醣的聚[二(羧酸根苯氧基)膦氮烯(PCPP)衍生物，诸如单磷酰基脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)及苏胺酰胞壁酰二肽(tMDP)。基于脂多醣的佐剂亦可用于产生主要的Th1型反应，包括例如单磷酰基脂质A(诸如3-de-O-酰基化单磷酰基脂质A)与铝盐一起的组合。
脂质体调配物亦已知可赋予佐剂效应，且因此，脂质体佐剂可结合手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物使用。
免疫刺激性复合物基质型(
Figure BDA0001342303280000281
基质)佐剂亦可结合手、足及口病疫苗抗原及免疫原性组合物使用，特别是由于已显示此类型佐剂能够藉由APC来上调MHC II级表现。ISCOM基质由皂皮树(Quillaja saponaria)的(视情况分离)皂素(三萜化合物)、胆固醇及磷脂组成。与免疫原性蛋白质(诸如手、足及口病疫苗或免疫原性组合物抗原)混合时，所得微粒调配物为已知为ISCOM颗粒的物质，其中皂素可占60-70％w/w，胆固醇及磷脂占10-15％w/w且蛋白质占10-15％w/w。与免疫刺激性复合物的组成及用途相关的细节可发现于例如牵涉佐剂的上述教科书中，而且Morein B等人,1995,Clin.Immunother.3:461-475以及Barr I G及Mitchell G F,1996,Immunol.and Cell Biol.74:8-25提供适用于制备完全免疫刺激性复合物的说明。
可与本文所揭示的手、足及口病疫苗抗原及免疫原性组合物以佐剂组合使用的皂素(无论是否呈免疫刺激复合物形式)包括来源于皂皮树莫利纳(Molina)的树皮，称为QuilA及其分离部分，如以下文献中所述：美国专利第5,057,540号及"Saponins as vaccineadjuvants",Kensil,C.R.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2):1-55；及EP0 362 279 B1。Quil A的例示性分离部分为QS21、QS7及QS17。
β-七叶素(β-Escin)为用于手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物的佐剂组成中的另一种溶血性皂素。七叶素在Merck索引(第12版：条目3737)中描述为皂素混合物，其存在于七叶树(Lat:Aesculus hippocastanum)的种子中。其分离描述为藉由层析及纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))及离子交换树脂(Erbring等人，美国专利第3,238,190号)达成。七叶素的分离部分已纯化且显示具有生物学活性(Yoshikawa M等人,(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996年8月；44(8):1454-1464))。β-七叶素亦称为七叶皂苷(aescin)。
用于手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物中的另一种溶血性皂素为毛地黄皂苷(Digitonin)。毛地黄皂苷在Merck索引(第12版，条目3204)中描述为皂素，其来源于毛地黄(Digitalis purpurea)的种子且根据Gisvold等人,J.Am.Pharm.Assoc.,1934,23,664；及Ruhenstroth-Bauer,Physiol.Chem.,1955,301,621所述的程序纯化。其用途描述为供胆固醇测定用的临床试剂。
达成佐剂效应的另一种受关注的可能性为使用Gosselin等人,1992中所述的技术。简言之，相关抗原(诸如本发明的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物中的抗原)的呈递可藉由使抗原与针对单核球/巨噬细胞上的FC受体的抗体(或抗原结合性抗体片段)结合来增强。特定言之，抗原与抗FCRI之间的结合物已证明可增强用于疫苗接种目的之免疫原性。抗体可在产生之后或作为产生的一部分与手、足及口病疫苗或免疫原性组合物抗原结合，包括作为与手、足及口病疫苗及免疫原性组合物抗原的多肽组分中的任一者融合来表现。其它可能性包括使用靶向及免疫调节物质(亦即细胞激素)。另外，亦可使用细胞激素的合成诱导剂，诸如聚I:C。
适合的分支杆菌衍生物可选自由以下组成的群：胞壁酰二肽、完全弗氏佐剂、RIBI(Ribi ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Mont.)及海藻糖二酯，诸如TDM及TDE。
适合免疫靶向佐剂的实例包括CD40配位体及CD40抗体或特别是其结合片段(参见上文论述)、甘露糖、Fab片段及CTLA-4。
适合聚合物佐剂的实例包括碳水化合物，诸如聚葡萄糖、PEG、淀粉、甘露聚糖及甘露糖；塑料聚合物；及乳胶，诸如乳胶珠粒。
调节免疫反应的又一受关注方式为将免疫原(视情况与佐剂及医药学上可接受的载剂及媒剂一起)包括于「虚拟淋巴结」(VLN)(ImmunoTherapy,Inc.开发的专有医学装置,360Lexington Avenue,New York,N.Y.10017-6501)中。VLN(薄管装置)仿真淋巴结的结构及功能。将VLN插入皮肤下，使用细胞激素及趋化激素的上升产生无菌炎症位点。T细胞及B细胞以及APC对危险信号快速作出反应，回归至发炎位点且在VLN的多孔基质内积聚。已显示当使用VLN时，建立针对抗原的免疫反应所需要的必要抗原剂量减少，且使用VLN、藉由疫苗接种赋予的免疫保护作用超过使用Ribi作为佐剂的习知免疫接种。该技术简单描述于Gelber C等人,1998,"Elicitation of Robust Cellular and Humoral ImmuneResponses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node",于:"From the Laboratory to the Clinic,Bookof Abstracts,1998年10月12日至15日,Seascape Resort,Aptos,Calif."。
寡核苷酸可作为佐剂联合手、足及口病疫苗及免疫原性组合物抗原使用且可含有藉由至少三个或三个以上或甚至至少六个或六个以上核苷酸分离的两个或两个以上二核苷酸CpG基元。含CpG寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未发生甲基化)诱导主要的Th1反应。此类寡核苷酸已熟知且描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488及美国专利第6,008,200号及第5,856,462号中。
此类寡核苷酸佐剂可为去氧核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸中的核苷酸主链为二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，然而亦可使用磷酸二酯及其它核苷酸主链，诸如具有混合主链键联的含PNA寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于美国专利第5,666,153号、美国专利第5,278,302号及W095/26204中。
例示性寡核苷酸具有以下序列。序列可含有经硫代磷酸酯修饰的核苷酸主链：
(SEQ ID NO:10)OLIGO 1:TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)；
(SEQ ID NO:11)OLIGO 2:TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)；
(SEQ ID NO:12)OLIGO 3:ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG；
(SEQ ID NO:13)OLIGO 4:TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)；及
(SEQ ID NO:14)OLIGO 5:TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)。
替代性CpG寡核苷酸包括其中具有不连贯缺失或添加的上述序列。作为佐剂的CpG寡核苷酸可藉由此项技术中已知的任何方法(例如EP 468520)合成。举例而言，此类寡核苷酸可使用自动化合成仪合成。此类寡核苷酸佐剂可具有10-50个碱基长度。另一佐剂系统包括含CpG寡核苷酸与皂素衍生物的组合，特定言之，CpG与QS21的组合揭示于WO00/09159中。
已描述许多单相或多相乳化系统。熟习此项技术者可容易调适用于手、足及口病疫苗及免疫原性组合物抗原的此类乳化系统，以使得乳化不会破坏抗原结构。水包油乳化佐剂本身已表明适用作佐剂组合物(EPO 399 843B)，水包油乳液与其它活性剂的组合亦已描述为疫苗佐剂(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。其它油乳化佐剂已有描述，诸如油包水乳液(美国专利第5,422,109号；EP 0 480 982 B2)及水包油包水乳液(美国专利第5,424,067号；EP 0 480 981 B)。
用于本文所述的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物的油乳化佐剂可为天然或合成的，且可为无机或有机的。无机及有机油的实例对于熟习此项技术者而言为显而易见的。
为了使任何水包油组合物适于投与人类，乳化系统中的油相可包括可代谢的油。术语可代谢油的含义在此项技术中已熟知。可代谢可定义为「能够藉由代谢转化」(Dorland's Illustrated Medical Dictionary,W.B.Sanders Company,第25版(1974))。油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对于接受者而言无毒且能够藉由代谢转化。坚果(诸如花生油)、种子及谷粒为植物油的常见来源。合成油亦可使用且可包括市售油，诸如
Figure BDA0001342303280000301
及其它。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯)为一种不饱和油，其大量发现于鲨鱼肝油中且少量发现于橄榄油、麦胚芽油、稻糠麸油及酵母中，且可结合手、足及口病疫苗及免疫原性组合物抗原使用。角鲨烯为可代谢的油，实情在于其为胆固醇生物合成中的中间物(Merck索引，第10版，条目第8619号)。
例示性油乳液为水包油乳液，且特定言之，水包角鲨烯乳液。
另外，用于手、足及口病疫苗及免疫原性组合物抗原的油乳化佐剂可包括抗氧化剂，诸如油α-生育酚(维生素E，EP 0 382 271 B1)。
WO 95/17210及WO 99/11241揭示基于角鲨烯、α-生育酚及TWEEN 80(TM)、视情况与免疫刺激剂QS21及/或3D-MLA一起调配的乳化佐剂。WO 99/12565揭示经由添加固醇至油相中来改善此等角鲨烯乳液。另外，可向油相中添加三酸甘油酯(诸如三辛酸甘油酯(C27H50O6))，以便使乳液稳定(WO 98/56414)。
稳定的水包油乳液内所发现的油滴尺寸可小于1微米，其直径范围可为实质上30-600nm，实质上约30-500nm，或实质上150-500nm，且特定而言，约150nm，如藉由光子相关光谱学所量测。就此而言，80％油滴的数值可在此等范围内，大于90％或大于95％油滴的数值在所定义的尺寸范围内。存在于油乳液中的组分的量习知地在2至10％油(诸如角鲨烯)；及(存在时)2至10％α生育酚；及0.3至3％界面活性剂(诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)的范围内。油:α生育酚的比率可等于或小于1，因为此提供更稳定的乳液。SPAN 85(TM)亦可以约1％的含量存在。在一些情况下，本文所揭示的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物进一步含有稳定剂可为有利的。
产生水包油乳液的方法已为熟习此项技术者所熟知。通常，该方法包括如下步骤：将油相与界面活性剂(诸如PBS/
Figure BDA0001342303280000311
溶液)混合，随后使用均质器进行均质化，熟习此项技术者显而易知包含将混合物传送通过注射器针两次的方法适用于使小体积的液体均质化。同样，熟习此项技术者可调适微流体化床(M110S微流体学机器，在6巴的最大压力输入端(输出压力为约850巴)下，最大通过50次，时间为2分钟)乳化制程，以产生较小或较大体积的乳液。此调适可藉由常规实验实现，包含量测所得乳液直至实现具有所需直径的油滴的制剂。
或者，可将手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物与由以下组成的疫苗媒剂合并：聚葡萄胺糖(如上文所述)或其它聚阳离子聚合物、聚丙交酯及聚(丙交酯-共-乙交酯)、基于聚N-乙酰基葡糖胺的聚合物基质、由多醣或经化学修饰的多醣组成的颗粒、基于脂质体及脂质的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等。皂素亦可在胆固醇存在下调配以形成微粒结构，诸如脂质体或ISCOM。此外，可将皂素与聚氧乙烯醚或酯一起调配成非微粒溶液或悬浮液，或调配成微粒结构，诸如少片层脂质体或ISCOM。
用于如本文所述的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物中的其它说明性佐剂包括SAF(Chiron,Calif.,United States)、MF-59(Chiron，参见例如Granoff等人(1997)Infect Immun.65(5):1710-1715)、SBAS佐剂系列(例如SB-AS2(含有MLA及QS21的水包油乳液)；SBAS-4(含有明矾及MLA的佐剂系统)，获自SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium)；Detox
Figure BDA0001342303280000323
(GlaxoSmithKline)、RC-512、RC-522、RC-527、RC-529、RC-544及RC-560(GlaxoSmithKline)及其它胺基烷基胺基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)，诸如申请中的美国专利申请案第08/853,826号及第09/074,720号中所述的彼等物。
佐剂的其它实例包括(但不限于)Hunter的
Figure BDA0001342303280000321
佐剂(CytRx Corp.,Norcross,Ga.)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH,Gaiberg,Germany)；硝化纤维(Nilsson及Larsson(1992)Res.Immunol.143:553-557)；基于明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)乳液的调配物，包括矿物油、非矿物油、油包水或水包油乳液，诸如Seppic ISA系列的Montamide佐剂(例如ISA-51、ISA-57、ISA-720、ISA-151等；Seppic,Paris,France)；及
Figure BDA0001342303280000322
(IDEC Pharmaceuticals)；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二醣)；利什曼原虫伸长因子(Leishmania elongation factor)；形成微胞的非离子嵌段共聚物，诸如CRL 1005；及Syntex佐剂调配物。参见例如O'Hagan等人(2001)Biomol Eng.18(3):69-85；及"VaccineAdjuvants:Preparation Methods and Research Protocols"D.O'Hagan编(2000)HumanaPress。
其它例示性佐剂包括以下通式的佐剂分子：
HO(CH2CH2O)n-A-R， (I)
其中，n为1-50，A为一键或--C(O)--，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
一个实施例由包含通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗调配物组成，其中n为1与50之间、4-24，或9；R组分为C1-50、C4-C20烷基，或C12烷基，且A为一键。聚氧乙烯醚的浓度应在0.1-20％、0.1-10％范围内，或在0.1-1％范围内。例示性聚氧乙烯醚选自以下群组：聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-9-十八烷基醚、聚氧乙烯-8-十八烷基醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷基醚，及聚氧乙烯-23-十二烷基醚。聚氧乙烯醚(诸如聚氧乙烯十二烷基醚)描述于Merck索引(第12版：条目7717)中。此等佐剂分子描述于WO 99/52549中。
根据上述通式(I)的聚氧乙烯醚必要时可与另一佐剂合并。举例而言，佐剂组合可包括如上文所述的CpG。
适用于本文所揭示的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物中的医药学上可接受的赋形剂的其它实例包括水、磷酸盐缓冲盐水、等张性缓冲溶液。
本发明的方法
本发明的其它态样是关于使用含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原的本发明疫苗及/或免疫原性组合物治疗或预防有需要的个体的手、足及口病及/或诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应的方法。在一些实施例中，本发明是关于治疗或预防有需要的个体的手、足及口病的方法，藉由向个体投与治疗有效量的含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原的本发明疫苗及/或免疫原性组合物。在一些实施例中，本发明是关于诱导有需要的个体发生针对手、足及口病的免疫反应的方法，藉由向该个体投与治疗有效量的含有一或多种来自引起手、足及口病的至少一种病毒的抗原的本发明疫苗及/或免疫原性组合物。
在一些实施例中，投药步骤诱导个体发生保护性免疫反应。在一些实施例中，保护性免疫反应包括针对EV71、CA6及CA16中的一或多者的免疫反应。在一些实施例中，保护性免疫反应包括针对一或多种EV71病毒基因型(诸如B4、C2、C4及C5)的免疫反应。
本文所揭示的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物可用于保护或治疗易患或罹患病毒感染的哺乳动物或鸟类，其藉助于鼻内、经口、口服、颊内、舌下、肌肉内、腹膜内、皮内、经皮(transdermal)、皮下、阴道内、肛门、颅内、静脉内、经皮(transcutaneous)或皮下投药来投与疫苗。全身性投与本发明的疫苗及/或免疫原性组合物的方法可包括习知注射器及针，或经设计可弹道式递送固体疫苗的装置(WO99/27961)，或无针压力液体喷射装置(美国专利第4,596,556号；美国专利第5,993,412号)，或经皮贴片(WO 97/48440；WO 98/28037)。本发明的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物亦可施用于皮肤(经皮(transdermal或transcutaneous)递送，WO 98/20734；WO 98/28037)。本发明的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物因此可包括预填装手、足及口病疫苗或免疫原性组合物的全身性投药递送装置。相应地，提供治疗或预防个体(诸如哺乳动物或鸟类)的手、足及口病及诱导个体发生免疫反应的方法，包括向个体投与本发明的疫苗或免疫原性组合物(视情况包括佐剂及/或载剂)的步骤，其中疫苗或免疫原性组合物经由非经肠或全身性途径投与。
本发明的疫苗及/或免疫原性组合物可用于保护或治疗易患或罹患病毒感染的哺乳动物或鸟类，经由粘膜途径(诸如口服/消化途径或经鼻途径)投与疫苗或免疫原性组合物。替代性粘膜途径为阴道内及直肠内途径。粘膜投药途径可经由经鼻途径，称为鼻内疫苗接种。鼻内疫苗接种方法在此项技术中已熟知，包括将液滴、喷雾剂或干粉形式的疫苗投与欲免疫的个体鼻咽内。雾化或气溶胶化疫苗调配物为本文所揭示的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物的潜在形式。经肠调配物(诸如口服的耐胃酸胶囊及颗粒)、直肠或阴道投与的栓剂亦为本发明的疫苗及/或免疫原性组合物的调配物。
本发明的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物亦可经由经口途径投与。在此等情况下，医药学上可接受的赋形剂亦可包括碱性缓冲液，或经肠胶囊或微粒。本发明的手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物亦可经由阴道途径投与。在此等情况下，医药学上可接受的赋形剂亦可包括乳化剂、聚合物(诸如
Figure BDA0001342303280000341
)，及阴道乳膏及栓剂的其它已知稳定剂。手、足及口病疫苗及/或免疫原性组合物亦可藉由直肠途径投与。在此等情况下，赋形剂亦可包括此项技术中已知用于形成直肠栓剂的蜡及聚合物。
在一些实施例中，投药步骤包括一或多次投药。投药可依循单次剂量时程或多次剂量(初打-加打)时程。在多次剂量时程中，各种剂量可藉由相同或不同途径给予，例如非经肠初打及粘膜加打、粘膜初打及非经肠加打等。典型地，其将藉由相同途径给予。多次剂量的投与典型地相隔至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)。两次剂量相隔25-30天(例如28天)特别适用。
本发明的方法包括投与治疗有效量或免疫原性量的本发明疫苗及/或免疫原性组合物。治疗有效量或免疫原性量可为诱导所投与的未感染、感染或未暴露的个体发生保护性免疫反应的本发明疫苗及/或免疫原性组合物的量。此类反应通常将使得个体中产生针对疫苗的分泌性、细胞及/或抗体介导的免疫反应。通常，此类反应包括(但不限于)以下效应中的一或多者；产生任一免疫类别的抗体，诸如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B及T淋巴球增殖；提供活化、生长及分化信号至免疫细胞；辅助T细胞、抑制T细胞及/或细胞毒性T细胞的扩增。
较佳地，治疗有效量或免疫原性量足以达成疾病症状的治疗或预防。确切需要量将视以下而变化：所治疗的个体；所治疗的个体的年龄及一般状况；个体免疫系统合成抗体的能力；所要保护程度；所治疗的病状的严重程度；所选特定的手、足及口病抗原多肽及其投与方式，及其它因素。适当的治疗有效量或免疫原性量可容易由熟习此项技术者确定。治疗有效量或免疫原性量的范围相对广泛，其可经由常规试验确定。
所列举实施例
以下所列举实施例代表本发明的一些态样。
1.一种手、足及口疫苗，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种病毒的抗原，其中该一或多种抗原包含至少一个非人类细胞适应突变。
2.一种手、足及口免疫原性组合物，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种病毒的抗原，其中该一或多种抗原包含至少一个非人类细胞适应突变。
3.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒选自EV71、CA6及CA16中之一或多者。
4.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含EV71、CA6及CA16。
5.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含EV71及CA6。
6.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含EV71及CA16。
7.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含CA6及CA16。
8.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒为EV71。
9.如实施例1或实施例2之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原选自EV71、CA6、CA16及其任何组合。
10.如实施例9之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原来自EV71。
11.如实施例1至10中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含EV71之VP1多肽，且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
12.如实施例11之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ ID NO:1之位置7，或与SEQ ID NO:1之位置7对应的位置；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ ID NO:1之位置7、14、145或282或与SEQ ID NO:1之位置7、14、145或282对应之位置中的两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
13.如实施例12之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置7或与SEQ ID NO:1之位置7对应之位置的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代。
14.如实施例12之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置14或与SEQ ID NO:1之位置14对应之位置的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代。
15.如实施例12之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置145或与SEQ ID NO:1之位置145对应之位置的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代。
16.如实施例12之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置282或与SEQ ID NO:1之位置282对应之位置的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
17.如实施例1至16中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP1多肽且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
18.如实施例17之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时，发生于SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268或与SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268对应的位置中之一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
19.如实施例18之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置46或与SEQ ID NO:2之位置46对应之位置的突变为丙氨酸经缬氨酸取代。
20.如实施例18之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置90或与SEQ ID NO:2之位置90对应之位置的突变为麸氨酸经离氨酸取代。
21.如实施例18之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置96或与SEQ ID NO:2之位置96对应之位置的突变为苏氨酸经丙氨酸取代。
22.如实施例18之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置268或与SEQ ID NO:2之位置268对应之位置的突变为缬氨酸经异白氨酸取代。
23.如实施例1至22中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP2多肽且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
24.如实施例23之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时，发生于SEQ ID NO:3之位置144，或与SEQ IDNO:3之位置144对应的位置。
25.如实施例24之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:3比对时位于SEQ ID NO:3之位置144或与SEQ ID NO:3之位置144对应之位置的突变为麸酰氨酸经离氨酸取代。
26.如实施例1至25中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP3多肽且其中该VP3多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
27.如实施例26之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时，发生于SEQ ID NO:4之位置102，或与SEQ IDNO:4之位置102对应的位置。
28.如实施例27之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:4比对时位于SEQ ID NO:4之位置102或与SEQ ID NO:4之位置102对应之位置的突变为异白氨酸经缬氨酸取代。
29.如实施例1至28中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之5'未转译区(UTR)，且其中CA6之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
30.如实施例29之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之该5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:8之位置1、13、14、15、16、21、23、34或40中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上、五个或五个以上、六个或六个以上、七个或七个以上、八个或八个以上或所有九个位置，或与SEQ ID NO:8之位置1、13、14、15、16、21、23、34或40对应的位置。
31.如实施例30之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置1或与SEQ ID NO:8之位置1对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置13或与SEQ ID NO:8之位置13对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置14或与SEQ ID NO:8之位置14对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ IDNO:8之位置15或与SEQ ID NO:8之位置15对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置16或与SEQ ID NO:8之位置16对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置21或与SEQ ID NO:8之位置21对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置23或与SEQID NO:8之位置23对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置34或与SEQ ID NO:8之位置34对应之位置的突变为鸟嘌呤经胸腺嘧啶取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置40或与SEQ ID NO:8之位置40对应之位置的突变为胞嘧啶经鸟嘌呤取代。
32.如实施例1至31中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之2A多肽，且其中该2A多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
33.如实施例32之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:5比对时，发生于SEQ ID NO:5之位置2，或与SEQ ID NO:5之位置2对应的位置。
34.如实施例33之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:5比对时位于SEQ ID NO:5之位置2或与SEQ ID NO:5之位置2对应之位置的突变为离氨酸经麸氨酸取代。
35.如实施例1至34中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之VP2多肽，且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
36.如实施例35之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:6比对时，发生于SEQ ID NO:6之位置161，或与SEQ IDNO:6之位置161对应的位置。
37.如实施例36之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:6比对时位于SEQ ID NO:6之位置161或与SEQ ID NO:6之位置161对应之位置的突变为甲硫氨酸经苏氨酸取代。
38.如实施例32至37中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步在CA16之VP1多肽中包含至少一个另外的非人类细胞适应突变。
39.如实施例38之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时，该至少一个另外的非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:7之位置99或145中的一或多者或两者，或与SEQ ID NO:7之位置99或145对应的位置。
40.如实施例39之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置99或与SEQ ID NO:7之位置99对应之位置的突变为天冬氨酸经甘氨酸取代。
41.如实施例39之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置145或与SEQ ID NO:7之位置145对应之位置的突变为缬氨酸经麸氨酸取代。
42.如实施例1至41中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之5'未转译区(UTR)，且其中CA16之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
43.如实施例42之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:9之位置6或33中之一者或两者，或与SEQ ID NO:9之位置6或33对应的位置。
44.如实施例43之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置6或与SEQ ID NO:9之位置6对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置33或与SEQ ID NO:9之位置33对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代。
45.如实施例1至44中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为哺乳动物细胞。
46.如实施例1至44中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为猴细胞。
47.如实施例46之疫苗或免疫原性组合物，其中该猴细胞来自Vero细胞株。
48.如实施例47之疫苗或免疫原性组合物，其中该Vero细胞株系选自WHO Vero10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC寄存编号CRL-1587)，及Vero C1008(ATCC寄存编号CRL-1586)。
49.如实施例1至48中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原藉由培养非人类细胞而产生。
50.如实施例49之疫苗或免疫原性组合物，其中该细胞在无血清培养基中培养。
51.如实施例1至50中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物为经纯化之抗原疫苗或免疫原性组合物、次单位疫苗或免疫原性组合物、不活化完整病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。
52.如实施例1至51中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒是以化学方式达成不活化。
53.如实施例52之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上是用β-丙内酯(BPL)、福尔马林或二元伸乙基亚胺(BEI)中之一或多者达成不活化。
54.如实施例52之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用BPL达成不活化。
55.如实施例52之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用福尔马林达成不活化。
56.如实施例52之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用BPL与福尔马林之组合达成不活化。
57.如实施例53、54或56中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由BPL达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
58.如实施例57之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
59.如实施例58之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
60.如实施例57之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
61.如实施例60之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之多肽包含经修饰之氨基酸残基，该氨基酸残基选自半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、酪氨酸、离氨酸、丝氨酸及苏氨酸中之一或多者。
62.如实施例53、55或56中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由福尔马林达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
63.如实施例62之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
64.如实施例62之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含交联多肽。
65.如实施例62至64中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物进一步包含福尔马林。
66.如实施例52之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用BEI达成不活化。
67.如实施例53或实施例66之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由BEI达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
68.如实施例67之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
69.如实施例68之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
70.如实施例66至69中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中未反应之BEI是用硫代硫酸钠进行水解。
71.如实施例1至70中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含有效浓度的清洁剂。
72.如实施例71之疫苗或免疫原性组合物，其中该清洁剂包含聚山梨醇酯[80]。
73.如实施例72之疫苗或免疫原性组合物，其中该有效浓度在约0.001％至约0.01％范围内。
74.如实施例1至73中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
75.如实施例74之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自由以下组成之群：铝盐、铎样受体(TLR)促效剂、单磷酰基脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞激素、皂素、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌之脂多醣(LPS)、聚膦氮烯、乳液、病毒颗粒、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)。
76.如实施例75之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂为铝盐。
77.如实施例75之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85。
78.如实施例76或实施例77之疫苗或免疫原性组合物，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至佐剂。
79.如实施例75之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂为单磷酰基脂质A(MLA)及其衍生物。
80.一种用于治疗或预防有需要的个体之手、足及口病的方法，包含向该个体投与治疗有效量之如实施例1至79中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
81.一种诱导有需要的个体发生免疫反应的方法，包含向该个体投与免疫原性量之如实施例1至79中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
82.如实施例80或实施例81之方法，其中该投药诱导该个体发生保护性免疫反应。
83.如实施例82之方法，其中该免疫反应包含针对EV71、CA6及CA16中之一或多者的免疫反应。
84.如实施例82之方法，其中该免疫反应包含针对一或多种选自B4、C2、C4及C5之EV71病毒基因型的免疫反应。
85.如实施例80至84中任一例之方法，其中该投药选自由以下组成之群：皮下递送、经皮递送、皮内递送、皮下递送、肌肉内递送、经口递送、口服递送、鼻内递送、颊内递送、舌下递送、腹膜内递送、阴道内递送、肛门递送及颅内递送。
86.如实施例80至85中任一例之方法，其中该投药包含一或多次投药。
87.一种手、足及口疫苗，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为EV71、CA16或两者，且其中该至少一种病毒是用β-丙内酯(BPL)达成不活化。
88.一种手、足及口免疫原性组合物，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为EV71、CA16或两者，且其中该至少一种病毒是用β-丙内酯(BPL)达成不活化。
89.如实施例87或实施例88之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种不活化病毒包含一或多个修饰。
90.如实施例89之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
91.如实施例90之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
92.如实施例89之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
93.如实施例92之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之多肽包含经修饰之氨基酸残基，该氨基酸残基选自半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、酪氨酸、离氨酸、丝氨酸及苏氨酸中之一或多者。
94.如实施例87至93中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含一或多种来自CA6的抗原。
95.如实施例94之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含至少一个非人类细胞适应突变。
96.如实施例95之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含EV71之VP1多肽，且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
97.如实施例96之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ ID NO:1之位置7，或与SEQ ID NO:1之位置7对应的位置；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ ID NO:1之位置7、14、145或282或与SEQ ID NO:1之位置7、14、145或282对应之位置中的两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
98.如实施例97之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置7或与SEQ ID NO:1之位置7对应之位置的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代。
99.如实施例97之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置14或与SEQ ID NO:1之位置14对应之位置的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代。
100.如实施例97之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置145或与SEQ ID NO:1之位置145对应之位置的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代。
101.如实施例97之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置282或与SEQ ID NO:1之位置282对应之位置的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
102.如实施例95至101之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP1多肽且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
103.如实施例102之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时，发生于SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268或与SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268对应之位置中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
104.如实施例103之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置46或与SEQ ID NO:2之位置46对应之位置的突变为丙氨酸经缬氨酸取代。
105.如实施例103之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置90或与SEQ ID NO:2之位置90对应之位置的突变为麸氨酸经离氨酸取代。
106.如实施例103之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置96或与SEQ ID NO:2之位置96对应之位置的突变为苏氨酸经丙氨酸取代。
107.如实施例103之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置268或与SEQ ID NO:2之位置268对应之位置的突变为缬氨酸经异白氨酸取代。
108.如实施例95至107之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP2多肽且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
109.如实施例108之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时，发生于SEQ ID NO:3之位置144，或与SEQ IDNO:3之位置144对应的位置。
110.如实施例109之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:3比对时位于SEQ ID NO:3之位置144或与SEQ ID NO:3之位置144对应之位置的突变为麸酰氨酸经离氨酸取代。
111.如实施例95至110之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP3多肽且其中该VP3多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
112.如实施例111之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时，发生于SEQ ID NO:4之位置102，或与SEQ IDNO:4之位置102对应的位置。
113.如实施例112之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:4比对时位于SEQ ID NO:4之位置102或与SEQ ID NO:4之位置102对应之位置的突变为异白氨酸经缬氨酸取代。
114.如实施例95至113之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之5'未转译区(UTR)，且其中CA6之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
115.如实施例114之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之该5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:8之核酸位置1、13、14、15、16、21、23、34或40中之一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上、五个或五个以上、六个或六个以上、七个或七个以上、八个或八个以上或所有九个核酸位置，或与SEQ ID NO:8之位置1、13、14、15、16、21、23、34或40对应的位置。
116.如实施例115之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置1或与SEQ ID NO:8之位置1对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置13或与SEQ ID NO:8之位置13对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置14或与SEQ ID NO:8之位置14对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ IDNO:8之位置15或与SEQ ID NO:8之位置15对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置16或与SEQ ID NO:8之位置16对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法SSEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置21或与SEQ ID NO:8之位置21对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置23或与SEQ IDNO:8之位置23对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置34或与SEQ ID NO:8之位置34对应之位置的突变为鸟嘌呤经胸腺嘧啶取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置40或与SEQ ID NO:8之位置40对应之位置的突变为胞嘧啶经鸟嘌呤取代。
117.如实施例95至116之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之2A多肽，且其中该2A多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
118.如实施例117之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:5比对时，发生于SEQ ID NO:5之位置2，或与SEQ IDNO:5之位置2对应的位置。
119.如实施例118之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:5比对时位于SEQ ID NO:5之位置2或与SEQ ID NO:5之位置2对应之位置的突变为离氨酸经麸氨酸取代。
120.如实施例95至119之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之VP2多肽，且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
121.如实施例120之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:6比对时，发生于SEQ ID NO:6之位置161，或与SEQ IDNO:6之位置161对应的位置。
122.如实施例121之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:6比对时位于SEQ ID NO:6之位置161或与SEQ ID NO:6之位置161对应之位置的突变为甲硫氨酸经苏氨酸取代。
123.如实施例117至122中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步在CA16之VP1多肽中包含至少一个另外的非人类细胞适应突变。
124.如实施例123之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时，该至少一个另外的非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:7之位置99或145中的一或多者或两者，或与SEQ ID NO:7之位置99或145对应的位置。
125.如实施例124之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置99或与SEQ ID NO:7之位置99对应之位置的突变为天冬氨酸经甘氨酸取代。
126.如实施例124之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置145或与SEQ ID NO:7之位置145对应之位置的突变为缬氨酸经麸氨酸取代。
127.如实施例95至126之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之5'未转译区(UTR)，且其中CA16之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
128.如实施例127之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:9之位置6或33中之一者或两者，或与SEQ ID NO:9之位置6或33对应的位置。
129.如实施例128之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置6或与SEQ ID NO:9之位置6对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置33或与SEQ ID NO:9之位置33对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代。
130.如实施例87至129中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为哺乳动物细胞。
131.如实施例87至129中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为猴细胞。
132.如实施例131之疫苗或免疫原性组合物，其中该猴细胞来自Vero细胞株。
133.如实施例132之疫苗或免疫原性组合物，其中该Vero细胞株选自WHO Vero10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC寄存编号CRL-1587)，及Vero C1008(ATCC寄存编号CRL-1586)。
134.如实施例87至133中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原藉由培养该非人类细胞而产生。
135.如实施例134之疫苗或免疫原性组合物，其中该细胞在无血清培养基中培养。
136.如实施例87至135中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物为经纯化之抗原疫苗或免疫原性组合物、次单位疫苗或免疫原性组合物、不活化完整病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。
137.如实施例87至136中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒是用BPL与福尔马林之组合达成不活化。
138.如实施例137之疫苗或免疫原性组合物，其中由福尔马林达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
139.如实施例138之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
140.如实施例138之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含交联多肽。
141.如实施例137至140中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物进一步包含福尔马林。
142.如实施例87至141中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含有效浓度的清洁剂。
143.如实施例142之疫苗或免疫原性组合物，其中该清洁剂包含聚山梨醇酯[80]。
144.如实施例143之疫苗或免疫原性组合物，其中该有效浓度在约0.001％至约0.01％范围内。
145.如实施例87至144中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
146.如实施例145之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自由以下组成之群：铝盐、铎样受体(TLR)促效剂、单磷酰基脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞激素、皂素、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌之脂多醣(LPS)、聚膦氮烯、乳液、病毒颗粒、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)。
147.如实施例146之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂为铝盐。
148.如实施例146之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85。
149.如实施例147或实施例148之疫苗或免疫原性组合物，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至佐剂。
150.如实施例146之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂为单磷酰基脂质A(MLA)及其衍生物。
151.一种用于治疗或预防有需要的个体之手、足及口病的方法，其包含向该个体投与治疗有效量之如实施例87至150中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
152.一种诱导有需要的个体免疫反应的方法，其包含向该个体投与免疫原性量之如实施例87至150中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
153.如实施例151或实施例152之方法，其中该投药诱导该个体发生保护性免疫反应。
154.如实施例153之方法，其中该免疫反应包含针对EV71、CA6及CA16中之一或多者的免疫反应。
155.如实施例153之方法，其中该免疫反应包含针对一或多种选自B4、C2、C4及C5之EV71病毒基因型的免疫反应。
156.如实施例151至155中任一例之方法，其中该投药选自由以下组成之群：皮下递送、经皮递送、皮内递送、皮下递送、肌肉内递送、经口递送、口服递送、鼻内递送、颊内递送、舌下递送、腹膜内递送、阴道内递送、肛门递送及颅内递送。
157.如实施例151至156中任一例之方法，其中该投药包含一或多次投药。
158.一种用于使手、足及口病毒制剂达成不活化的方法，包含：
(a)自一或多个非人类细胞中分离出手、足及口病毒制剂，其中该等细胞用于产生该病毒制剂；
(b)用有效量之β-丙内酯(BPL)处理该病毒制剂；及
(c)用有效量之福尔马林处理该病毒制剂，其中福尔马林处理步骤与步骤(b)同时发生或在步骤(b)之后发生，及
其中该病毒选自EV71、CA6及CA16中之一或多者。
159.如实施例158之方法，其中该方法进一步包含将该病毒制剂在37℃之温度下加热足以使BPL水解的时间段。
160.如实施例159之方法，其中该时间段在约1小时至约6小时范围内。
161.如实施例158至160中任一例之方法，其中该不活化病毒制剂包含一或多个修饰。
162.如实施例161之方法，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
163.如实施例162之方法，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
164.如实施例161之方法，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
165.如实施例164之方法，其中该经修饰之多肽包含经修饰之氨基酸残基，该氨基酸残基选自半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、酪氨酸、离氨酸、丝氨酸及苏氨酸中之一或多者。
166.一种手、足及口疫苗，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为CA6、CA16或两者，且其中该至少一种病毒是用福尔马林达成不活化。
167.一种手、足及口免疫原性组合物，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种不活化病毒的抗原，其中该至少一种病毒为CA6、CA16或两者，且其中该至少一种病毒是用福尔马林达成不活化。
168.如实施例166或实施例167之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由福尔马林达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
169.如实施例168之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
170.如实施例168之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含交联多肽。
171.如实施例166至170中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物进一步包含福尔马林。
172.如实施例166至171中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含一或多种来自EV71的抗原。
173.如实施例172之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含至少一个非人类细胞适应突变。
174.如实施例173之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含EV71之VP1多肽，且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
175.如实施例174之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ ID NO:1之位置7，或与SEQ IDNO:1之位置7对应的位置；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ IDNO:1之位置7、14、145或282或与SEQ ID NO:1之位置7、14、145或282对应之位置中的两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
176.如实施例175之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置7或与SEQ ID NO:1之位置7对应之位置的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代。
177.如实施例175之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置14或与SEQ ID NO:1之位置14对应之位置的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代。
178.如实施例175之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置145或与SEQ ID NO:1之位置145对应之位置的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代。
179.如实施例175之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置282或与SEQ ID NO:1之位置282对应之位置的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
180.如实施例173至179之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP1多肽且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
181.如实施例180之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时，发生于SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268或与SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268对应之位置中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
182.如实施例181之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置46或与SEQ ID NO:2之位置46对应之位置的突变为丙氨酸经缬氨酸取代。
183.如实施例181之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置90或与SEQ ID NO:2之位置90对应之位置的突变为麸氨酸经离氨酸取代。
184.如实施例181之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置96或与SEQ ID NO:2之位置96对应之位置的突变为苏氨酸经丙氨酸取代。
185.如实施例181之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置268或与SEQ ID NO:2之位置268对应之位置的突变为缬氨酸经异白氨酸取代。
186.如实施例173至185之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP2多肽且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
187.如实施例186之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时，发生于SEQ ID NO:3之位置144，或与SEQ IDNO:3之位置144对应的位置。
188.如实施例187之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:3比对时位于SEQ ID NO:3之位置144或与SEQ ID NO:3之位置144对应之位置的突变为麸酰氨酸经离氨酸取代。
189.如实施例173至188之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP3多肽且其中该VP3多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
190.如实施例189之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时，发生于SEQ ID NO:4之位置102，或与SEQ IDNO:4之位置102对应的位置。
191.如实施例190之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:4比对时位于SEQ ID NO:4之位置102或与SEQ ID NO:4之位置102对应之位置的突变为异白氨酸经缬氨酸取代。
192.如实施例173至191之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之5'未转译区(UTR)，且其中CA6之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
193.如实施例192之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之该5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:8之核酸位置1、13、14、15、16、21、23、34或40中之一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上、五个或五个以上、六个或六个以上、七个或七个以上、八个或八个以上或所有九个核酸位置，或与SEQ ID NO:8之位置1、13、14、15、16、21、23、34或40对应的位置。
194.如实施例193之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置1或与SEQ ID NO:8之位置1对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置13或与SEQ ID NO:8之位置13对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置14或与SEQ ID NO:8之位置14对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ IDNO:8之位置15或与SEQ ID NO:8之位置15对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置16或与SEQ ID NO:8之位置16对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置21或与SEQ ID NO:8之位置21对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置23或与SEQID NO:8之位置23对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置34或与SEQ ID NO:8之位置34对应之位置的突变为鸟嘌呤经胸腺嘧啶取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置40或与SEQ ID NO:8之位置40对应之位置的突变为胞嘧啶经鸟嘌呤取代。
195.如实施例173至194之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之2A多肽，且其中该2A多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
196.如实施例195之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:5比对时，发生于SEQ ID NO:5之位置2，或与SEQ IDNO:5之位置2对应的位置。
197.如实施例196之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:5比对时位于SEQ ID NO:5之位置2或与SEQ ID NO:5之位置2对应之位置的突变为离氨酸经麸氨酸取代。
198.如实施例173至197之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之VP2多肽，且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
199.如实施例198之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:6比对时，发生于SEQ ID NO:6之位置161，或与SEQ IDNO:6之位置161对应的位置。
200.如实施例199之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:6比对时位于SEQ ID NO:6之位置161或与SEQ ID NO:6之位置161对应之位置的突变为甲硫氨酸经苏氨酸取代。
201.如实施例195至200中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步在CA16之VP1多肽中包含至少一个另外的非人类细胞适应突变。
202.如实施例201之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时，该至少一个另外的非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:7之位置99或145中的一或多者或两者，或与SEQ ID NO:7之位置99或145对应的位置。
203.如实施例202之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置99或与SEQ ID NO:7之位置99对应之位置的突变为天冬氨酸经甘氨酸取代。
204.如实施例202之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置145或与SEQ ID NO:7之位置145对应之位置的突变为缬氨酸经麸氨酸取代。
205.如实施例173至204之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之5'未转译区(UTR)，且其中CA16之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
206.如实施例205之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:9之位置6或33中之一者或两者，或与SEQ ID NO:9之位置6或33对应的位置。
207.如实施例206之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置6或与SEQ ID NO:9之位置6对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置33或与SEQ ID NO:9之位置33对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代。
208.如实施例166至207中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为哺乳动物细胞。
209.如实施例166至207中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为猴细胞。
210.如实施例209之疫苗或免疫原性组合物，其中该猴细胞来自Vero细胞株。
211.如实施例210之疫苗或免疫原性组合物，其中该Vero细胞株选自WHO Vero10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC寄存编号CRL-1587)，及Vero C1008(ATCC寄存编号CRL-1586)。
212.如实施例166至211中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原是藉由培养该非人类细胞而产生。
213.如实施例212之疫苗或免疫原性组合物，其中该细胞在无血清培养基中培养。
214.如实施例166至213中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物为经纯化之抗原疫苗或免疫原性组合物、次单位疫苗或免疫原性组合物、不活化完整病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。
215.如实施例166至214中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒是用福尔马林与BPL之组合达成不活化。
216.如实施例215之疫苗或免疫原性组合物，其中由BPL达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
217.如实施例216之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
218.如实施例217之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
219.如实施例216之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
220.如实施例219之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之多肽包含经修饰之氨基酸残基，该氨基酸残基选自半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、酪氨酸、离氨酸、丝氨酸及苏氨酸中之一或多者。
221.如实施例166至215中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含有效浓度的清洁剂。
222.如实施例221之疫苗或免疫原性组合物，其中该清洁剂包含聚山梨醇酯[80]。
223.如实施例222之疫苗或免疫原性组合物，其中该有效浓度在约0.001％至约0.01％范围内。
224.如实施例166至223中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
225.如实施例224之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自由以下组成之群：铝盐、铎样受体(TLR)促效剂、单磷酰基脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞激素、皂素、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌之脂多醣(LPS)、聚膦氮烯、乳液、病毒颗粒、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)。
226.如实施例225之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂为铝盐。
227.如实施例225之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85。
228.如实施例226或实施例227之疫苗或免疫原性组合物，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至佐剂。
229.如实施例225之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂为单磷酰基脂质A(MLA)及其衍生物。
230.一种用于治疗或预防有需要的个体之手、足及口病的方法，包含向该个体投与治疗有效量之如实施例166至229中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
231.一种诱导有需要的个体发生免疫反应的方法，包含向该个体投与免疫原性量之如实施例166至229中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
232.如实施例230或实施例231之方法，其中该投药诱导该个体发生保护性免疫反应。
233.如实施例232之方法，其中该免疫反应包含针对EV71、CA6及CA16中之一或多者的免疫反应。
234.如实施例232之方法，其中该免疫反应包含针对一或多种选自B4、C2、C4及C5之EV71病毒基因型的免疫反应。
235.如实施例230至234中任一例之方法，其中该投药选自由以下组成之群：皮下递送、经皮递送、皮内递送、皮下递送、肌肉内递送、经口递送、口服递送、鼻内递送、颊内递送、舌下递送、腹膜内递送、阴道内递送、肛门递送及颅内递送。
236.如实施例230至235中任一例之方法，其中该投药包含一或多次投药。
237.一种用于使手、足及口病毒制剂达成不活化的方法，包含：
(a)自一或多个非人类细胞中分离出手、足及口病毒制剂，其中该等细胞用于产生该病毒制剂；
(b)用有效量之福尔马林处理该病毒制剂；及
(c)自福尔马林中纯化该病毒制剂，其中该病毒选自EV71、CA6及CA16中之一或多者。
238.如实施例237之方法，其中该不活化病毒制剂包含一或多个修饰。
239.如实施例238之方法，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
240.如实施例238之方法，其中该一或多个修饰包含交联多肽。
241.如实施例237至240中任一例之方法，其中该疫苗或免疫原性组合物进一步包含福尔马林。
242.一种手、足及口疫苗，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种病毒的抗原及铝盐佐剂，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂。
243.一种手、足及口免疫原性组合物，其包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种病毒的抗原及铝盐佐剂，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂。
244.如实施例242或实施例243之疫苗或免疫原性组合物，其中该佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85。
245.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒选自EV71、CA6及CA16中之一或多者。
246.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含EV71、CA6及CA16。
247.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含EV71及CA6。
248.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含EV71及CA16。
249.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒包含CA6及CA16。
250.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒为EV71。
251.如实施例242至244中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原选自EV71、CA6、CA16及其任何组合。
252.如实施例251之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原来自EV71。
253.如实施例242至252中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含至少一个非人类细胞适应突变。
254.如实施例253之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含EV71之VP1多肽，且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
255.如实施例254之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ ID NO:1之位置7，或与SEQ IDNO:1之位置7对应的位置；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:1比对时，发生于SEQ IDNO:1之位置7、14、145或282或与SEQ ID NO:1之位置7、14、145或282对应之位置中的两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
256.如实施例255之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置7或与SEQ ID NO:1之位置7对应之位置的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代。
257.如实施例255之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置14或与SEQ ID NO:1之位置14对应之位置的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代。
258.如实施例255之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置145或与SEQ ID NO:1之位置145对应之位置的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代。
259.如实施例255之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:1比对时位于SEQ ID NO:1之位置282或与SEQ ID NO:1之位置282对应之位置的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
260.如实施例253至259中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP1多肽且其中该VP1多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
261.如实施例260之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对时，发生于SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268或与SEQ ID NO:2之位置46、90、96或268对应之位置中的一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上或所有四个位置。
262.如实施例261之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置46或与SEQ ID NO:2之位置46对应之位置的突变为丙氨酸经缬氨酸取代。
263.如实施例261之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置90或与SEQ ID NO:2之位置90对应之位置的突变为麸氨酸经离氨酸取代。
264.如实施例261之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置96或与SEQ ID NO:2之位置96对应之位置的突变为苏氨酸经丙氨酸取代。
265.如实施例261之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:2比对时位于SEQ ID NO:2之位置268或与SEQ ID NO:2之位置268对应之位置的突变为缬氨酸经异白氨酸取代。
266.如实施例253至265之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP2多肽且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
267.如实施例266之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时，发生于SEQ ID NO:3之位置144，或与SEQ IDNO:3之位置144对应的位置。
268.如实施例267之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:3比对时位于SEQ ID NO:3之位置144或与SEQ ID NO:3之位置144对应之位置的突变为麸酰氨酸经离氨酸取代。
269.如实施例253至268之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之VP3多肽且其中该VP3多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
270.如实施例269之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对时，发生于SEQ ID NO:4之位置102，或与SEQ IDNO:4之位置102对应的位置。
271.如实施例270之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:4比对时位于SEQ ID NO:4之位置102或与SEQ ID NO:4之位置102对应之位置的突变为异白氨酸经缬氨酸取代。
272.如实施例253至271之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA6之5'未转译区(UTR)，且其中CA6之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
273.如实施例272之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之该5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:8之核酸位置1、13、14、15、16、21、23、34或40中之一或多个、两个或两个以上、三个或三个以上、四个或四个以上、五个或五个以上、六个或六个以上、七个或七个以上、八个或八个以上或所有九个核酸位置，或与SEQ ID NO:8之位置1、13、14、15、16、21、23、34或40对应的位置。
274.如实施例273之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置1或与SEQ ID NO:8之位置1对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置13或与SEQ ID NO:8之位置13对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置14或与SEQ ID NO:8之位置14对应之位置的突变为胸腺嘧啶经鸟嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ IDNO:8之位置15或与SEQ ID NO:8之位置15对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置16或与SEQ ID NO:8之位置16对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置21或与SEQ ID NO:8之位置21对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置23或与SEQID NO:8之位置23对应之位置的突变为胞嘧啶经胸腺嘧啶取代；当使用成对比对算法与SEQID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置34或与SEQ ID NO:8之位置34对应之位置的突变为鸟嘌呤经胸腺嘧啶取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:8之位置40或与SEQ ID NO:8之位置40对应之位置的突变为胞嘧啶经鸟嘌呤取代。
275.如实施例253至274之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之2A多肽，且其中该2A多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
276.如实施例275之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:5比对时，发生于SEQ ID NO:5之位置2，或与SEQ IDNO:5之位置2对应的位置。
277.如实施例276之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:5比对时位于SEQ ID NO:5之位置2或与SEQ ID NO:5之位置2对应之位置的突变为离氨酸经麸氨酸取代。
278.如实施例253至277之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之VP2多肽，且其中该VP2多肽包含至少一个非人类细胞适应突变。
279.如实施例278之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一个非人类细胞适应突变当使用成对比对算法与SEQ ID NO:6比对时，发生于SEQ ID NO:6之位置161，或与SEQ IDNO:6之位置161对应的位置。
280.如实施例279之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:6比对时位于SEQ ID NO:6之位置161或与SEQ ID NO:6之位置161对应之位置的突变为甲硫氨酸经苏氨酸取代。
281.如实施例275至280中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步在CA16之VP1多肽中包含至少一个另外的非人类细胞适应突变。
282.如实施例281之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时，该至少一个另外的非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:7之位置99或145中的一或多者或两者，或与SEQ ID NO:7之位置99或145对应的位置。
283.如实施例282之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置99或与SEQ ID NO:7之位置99对应之位置的突变为天冬氨酸经甘氨酸取代。
284.如实施例282之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:7比对时位于SEQ ID NO:7之位置145或与SEQ ID NO:7之位置145对应之位置的突变为缬氨酸经麸氨酸取代。
285.如实施例253至284之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原包含CA16之5'未转译区(UTR)，且其中CA16之该5'UTR包含至少一个非人类细胞适应突变。
286.如实施例285之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法将CA6之5'UTR与SEQ ID NO:8比对时，该至少一个非人类细胞适应突变发生于SEQ ID NO:9之位置6或33中之一者或两者，或与SEQ ID NO:9之位置6或33对应的位置。
287.如实施例286之疫苗或免疫原性组合物，其中当使用成对比对算法与SEQ IDNO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置6或与SEQ ID NO:9之位置6对应之位置的突变为鸟嘌呤经腺嘌呤取代；或当使用成对比对算法与SEQ ID NO:8比对时位于SEQ ID NO:9之位置33或与SEQ ID NO:9之位置33对应之位置的突变为鸟嘌呤经胞嘧啶取代。
288.如实施例242至287中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为哺乳动物细胞。
289.如实施例242至287中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该非人类细胞为猴细胞。
290.如实施例289之疫苗或免疫原性组合物，其中该猴细胞来自Vero细胞株。
291.如实施例290之疫苗或免疫原性组合物，其中该Vero细胞株选自WHO Vero10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC寄存编号CRL-1587)，及Vero C1008(ATCC寄存编号CRL-1586)。
292.如实施例242至291中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多种抗原是藉由培养该非人类细胞而产生。
293.如实施例292之疫苗或免疫原性组合物，其中该细胞在无血清培养基中培养。
294.如实施例242至293中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物为经纯化之抗原疫苗或免疫原性组合物、次单位疫苗或免疫原性组合物，或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。
295.如实施例242至294中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒是以化学方式达成不活化。
296.如实施例295之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上是用β-丙内酯(BPL)、福尔马林或二元伸乙基亚胺(BEI)中之一或多者达成不活化。
297.如实施例295之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用BPL达成不活化。
298.如实施例295之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用福尔马林达成不活化。
299.如实施例295之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用BPL与福尔马林之组合达成不活化。
300.如实施例296、297或299中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由BPL达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
301.如实施例300之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
302.如实施例301之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
303.如实施例300之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
304.如实施例303之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之多肽包含经修饰之氨基酸残基，该氨基酸残基选自半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、麸氨酸、酪氨酸、离氨酸、丝氨酸及苏氨酸中之一或多者。
305.如实施例296、298或299中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由福尔马林达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
306.如实施例305之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之多肽。
307.如实施例305之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含交联多肽。
308.如实施例305至307中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中该疫苗或免疫原性组合物进一步包含福尔马林。
309.如实施例295之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种病毒在化学上用BEI达成不活化。
310.如实施例296或实施例309之疫苗或免疫原性组合物，其中藉由BEI达成不活化的该至少一种病毒包含一或多个修饰。
311.如实施例310之疫苗或免疫原性组合物，其中该一或多个修饰包含经修饰之核酸。
312.如实施例311之疫苗或免疫原性组合物，其中该经修饰之核酸为烷基化核酸。
313.如实施例309至312中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其中未反应之BEI是用硫代硫酸钠进行水解。
314.如实施例242至313中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含有效浓度的清洁剂。
315.如实施例314之疫苗或免疫原性组合物，其中该清洁剂包含聚山梨醇酯[80]。
316.如实施例315之疫苗或免疫原性组合物，其中该有效浓度为约0.001％至约0.01％。
317.如实施例242至316中任一例之疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含至少一种其它佐剂。
318.如实施例317之疫苗或免疫原性组合物，其中该至少一种其它佐剂选自由以下组成之群：铎样受体(TLR)促效剂、单磷酰基脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞激素、皂素、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡核苷酸、革兰氏阴性细菌之脂多醣(LPS)、聚膦氮烯、乳液、病毒颗粒、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)。
319.一种用于治疗或预防有需要的个体之手、足及口病的方法，包含向该个体投与治疗有效量之如实施例242至318中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
320.一种诱导有需要的个体发生免疫反应的方法，包含向该个体投与免疫原性量之如实施例242至318中任一例之疫苗或免疫原性组合物。
321.如实施例319或实施例320之方法，其中该投药诱导该个体发生保护性免疫反应。
322.如实施例321之方法，其中该免疫反应包含针对EV71、CA6及CA16中之一或多者的免疫反应。
323.如实施例321之方法，其中该免疫反应包含针对一或多种选自B4、C2、C4及C5之EV71病毒基因型的免疫反应。
324.如实施例319至323中任一例之方法，其中该投药选自由以下组成之群：皮下递送、经皮递送、皮内递送、皮下递送、肌肉内递送、经口递送、口服递送、鼻内递送、颊内递送、舌下递送、腹膜内递送、阴道内递送、肛门递送及颅内递送。
325.如实施例319至324中任一例之方法，其中该投药包含一或多次投药。
326.一种制备有佐剂之手、足及口疫苗的方法，包含：
(a)将疫苗与铝盐佐剂混合，其中该疫苗包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种病毒的抗原；及
(b)将混合物在适合条件下培育约16小时至约24小时范围内之时间段，
其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂，及
其中至少一种引起手、足及口病的病毒选自EV71、CA6及CA16中之一或多者。
327.一种制备有佐剂之手、足及口免疫原性组合物的方法，包含：
(a)将免疫原性组合物与铝盐佐剂混合，其中该免疫原性组合物包含一或多种来自引起人类之手、足及口病之至少一种病毒的抗原；及
(b)将混合物在适合条件下培育约16小时至约24小时范围内之时间段，
其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％抗原吸附至铝盐佐剂，及
其中至少一种引起手、足及口病的病毒选自EV71、CA6及CA16中之一或多者。
328.如实施例326或实施例327之方法，其中该混合物在约2℃至约8℃范围内的温度下培育。
329.如实施例326至328中任一例之方法，其中该佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸钾铝及Alhydrogel 85。
参考以下实例将更充分地理解本发明。然而其不应解释为以任何方式限制本发明的任何态样或范畴。
实例
实例1：EV71在Vero细胞中的适应
对肠病毒71(EV71)进行两轮完整病毒基因组RNA萃取且转染于Vero细胞中，随后进行两轮空斑纯化，产生子基因组B2EV71的新适应株系，如下文所述。对病毒基因组测序，鉴别VP1多肽中的四个适应性突变。适应性病毒用于产生主病毒种原(pre-Master VirusSeed，pre-MVS)，其随后用于制造EV71疫苗。
源病毒株
用于制备适应性病毒的EV71/7423/MS/87病毒种株获自John Hopkins'sInstitute,Singapore。[GenBank寄存编号U22522]。
Vero细胞株
EV71/7423/MS/87株适应及病毒产生所用的Vero细胞株来源于Vero细胞株WHOVero 10-87，WHO Vero 10-87来源于ATCC CCL-81 Vero细胞株。
转染及空斑纯化
获自John Hopkins's Institute,Singapore的EV71病毒种用于感染T25烧瓶中的伊格尔氏最小必需培养基(MEM)+10％胎牛血清(FBS)中所生长的80％汇合Vero细胞单层。涉及EV71传播的所有程序中所用的FBS获自澳大利亚来源以最小化原材料所产生的传染性海绵状脑病的风险。吸附1.5小时之后，抽吸病毒上清液且添加MEM+2％FBS培养基。感染之后第3及6天，当观测到细胞病变效应(CPE)时，收集病毒上清液。第6天收集的病毒在Vero细胞(另外继代四次)中、使用类似程序进一步扩增。
使用用于回收EV71病毒及RNA转染的Roche高纯度病毒RNA套组萃取病毒RNA。得自SVCR0059的Vero细胞在含有10％FBS的MEM中生长，以每孔5×105个细胞接种于6孔盘上，且在36±1℃培育一天。此培育之后，各孔中的细胞已生长至>90％汇合。使用QiagenTransMessengerTM转染试剂将EV71完整基因组RNA转染至Vero细胞中。约3小时之后，用PBS洗涤细胞且向各孔中添加2.5mL MEM(无血清)。转染后第4天，观测到CPE且收集细胞及病毒上清液，在≤-60℃冷冻1小时，接着解冻。将样品离心且将继代1次(PN 1)病毒上清液储备液等分试样且在≤-60℃储存直至进一步使用。使用PN 1储备液重复RNA萃取及转染程序以产生PN 2病毒储备液。
在6孔盘中进行空斑纯化，其中中性红染色的Sea plaque琼脂糖覆叠于Vero细胞单层上。使用PN 2病毒储备液产生4个经充分分离的空斑(PN 3)，个别地在Vero细胞中扩增。含有细胞及病毒的所扩增个别搜集物各自进行冷冻-解冻处理及核酸酶(benzonase)处理，随后离心以分离出含病毒上清液(PN 4)，在≤-60℃储存。针对Vero细胞测定PN 4病毒储备液在50％组织培养感染性剂量(TCID50)下的效价。
效价最高的两个病毒储备液使用相同程序再次进行空斑纯化且作为PN 6病毒储备液储存。此第二轮空斑纯化之后，选择产生最高TCID50效价的纯系病毒群用于在Vero细胞中以0.1的感染倍率(MOI)进一步扩增。感染后第4天，细胞显示90％CPE，且收集且进行一次冷冻-解冻循环。离心之后，收集含有上清液的病毒储备液(PN 7)且在≤-60℃储存。PN 7病毒储备液用于在两层细胞工厂(1,264cm2表面积)中以0.1的MOI感染Vero细胞以便产生pre-MVS。感染后第3天，观测到培养物中的CPE。如上文所述，对所感染培养物进行相同的冷冻-解冻循环及离心，随后将病毒上清液分配于40×5mL及126×1.5mL等分试样中且在≤-60℃储存。此PN 8病毒储备液指定为适应性EV71，且随后用作pre-MVS。
适应性EV71的测序
使用QIAmp病毒RNA微套组(Qiagen目录号52904)，根据制造商说明书，自适应性EV71(PN8)中分离出病毒RNA。使用RNA随机引子进行两次逆转录反应及缺乏逆转录酶的对照反应。所得cDNA产物接着在PCR扩增中用作模板，PCR扩增使用基于EV71/7423/MS/87株系[GenBank寄存编号U22522]的参考序列所设计的引子对。扩增产物是藉由琼脂糖凝胶电泳目测且使用ExoSAP-IT PCR产物清除套组(GE Healthcare目录号US78200)、根据制造商说明书加以纯化。接着使用BigDye终止子v1.1循环测序套组(Applied Biosystems目录号4337451)对PCR扩增子进行测序且使用Applied Biosystems 3730xl DNA分析仪侦测序列。使用Sequencher软件4.9版将所产生的序列资料组装成邻接序列。获得最小四倍覆盖度，病毒序列的各DNA股为两倍覆盖率，例外之处为几个较短内部片段在单一方向上以及在序列的5'及3'端处的覆盖率为四倍。藉由Beckman Coulter Genomics (BioOutsource的分包商)测定适应性EV71的完整核苷酸序列。
基于VP1基因的序列分析的基因分组展现适应性EV71株系归类为B2子基因组。VP1基因序列与株系MS/7423/87的比较展现12个核苷酸差异。其中8个差异为静默的且4个变化导致VP1中的四个氨基酸差异。四个氨基酸取代及其在SEQ ID NO:1内的相应位置显示于下表1中。
表1.EV71的全长基因组测序：P-0相对于P-8
Figure BDA0001342303280000641
实例2：疫苗制造及调配
实例1中所产生的适应性EV71病毒用于制造不活化的手、足及口病疫苗。为了制造疫苗，使病毒在Vero细胞中生长，收集且用二元伸乙基亚胺(BEI)达成不活化。接着纯化非感染性不活化病毒颗粒且用氢氧化铝调配。
制备主细胞库及主病毒种
制备Vero主细胞库(MCB)
将得自ATCC的一瓶Vero(WHO)10-87细胞种储备液在37±1℃快速解冻，离心且再悬浮于杜尔贝科氏修饰的伊格尔氏培养基(DMEM)+10％FBS+L-麸酰氨酸(DGEM)中，随后接种于T150烧瓶中(指定为PN 135)。烧瓶在5±0.5％CO2氛围保温箱中、在36±1℃培育。第4天，当细胞达到汇合时，使用TrypLE
Figure BDA0001342303280000642
溶液将Vero细胞自烧瓶移出且分入五个T225烧瓶中(PN 136)。汇合单层形成之后，自保温箱移除烧瓶，用TrypLE
Figure BDA0001342303280000643
溶液移出细胞且分入一个具有6,320cm2表面积的10层细胞工厂(CF10)中(PN 137)。以类似方式进行另一次继代，其中将细胞接种至四个CF10中(PN 138)。
使用TrypLE
Figure BDA0001342303280000644
溶液移出四个CF10中的Vero细胞且收集。进行细胞计数且添加冷冻培养基(DMEM+20％FBS+20％DMSO)以将细胞浓度调节至1.0×107个细胞/毫升。将细胞以每个小瓶1mL的体积等分至224个小瓶中且指定为MCB。
制备适应性EV71主病毒种。
将来自PN 138的一瓶MCB的Vero细胞解冻，离心且用于接种含有DGEM的2个T25烧瓶(PN 139)。在37±1℃、在5±1％CO2氛围下培育5天之后，使细胞单层在1个T225烧瓶中继代(PN 140)。在此次及所有随后的细胞继代中，细胞单层用不含Ca及Mg的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤，用TrypLE
Figure BDA0001342303280000651
溶液处理，随后添加新鲜DGEM且在37±1℃、在5±1％CO2氛围下培育。培育3天之后，细胞于1个T150及8个T225烧瓶中第二次继代(PN141)。培育3天之后，细胞于1个2层细胞工厂(CF2；1,264cm2表面积)中第三次继代(PN142)。培育4天之后，细胞于1个T225及2个10层细胞工厂(CF10；6,320cm2表面积)中第四次继代(PN 143)。
当单层为约90至100％汇合时，将T225烧瓶及2个CF10培育3天。藉由用TrypLE
Figure BDA0001342303280000652
溶液处理而自1个T225烧瓶中移出细胞且计数以测定CF10中的每平方公分表面积的近似细胞密度。各细胞工厂中的单层用不含Ca及Mg的DPBS洗涤以移除任何残余生长培养基。制备两瓶感染培养基，各含有1L新鲜无血清DMEM+L-麸酰氨酸，用于感染CF10。将两瓶得自实例1的适应性EV71pre-MVS解冻且添加0.95mL至两瓶感染培养基中的每一者中以实现约0.05的MOI。根据制造商说明书添加感染培养基至2个CF10中。所感染的CF10在37±1℃、在5±1％CO2氛围下培育。培育3天之后，自保温箱中移除CF10且收集所感染的培养上清液，合并且分配于4个离心瓶中。粗收集物质以1,424×g离心10分钟且收集上清液且在5±3℃暂时储存。将各细胞集结粒再悬浮于100mL DMEM中且进行3次冷冻-解冻循环，随后以1,424×g离心10分钟。收集此等上清液且与得自第一离心步骤的上清液合并在一起。接着经由具有标称0.22μm孔径的millipak 100过滤器组合件过滤溶液且收集滤液。将此本体MVS溶液以每个小瓶4mL的体积等分至506个冷冻小瓶(5mL)中。所有小瓶转移至SAFC(CarlsbadCalifornia,USA)在≤-60℃进行可控储存。
疫苗制造
步骤1：Vero细胞起始
PN 138的一瓶VERO MCB(LN 173-09001)在37±3℃、在恒定涡旋下快速解冻，直至剩有少量冰。接着自水浴中移出小瓶，允许静置直至完全解冻且内容物直接添加至含有9mLDGEM的拋弃式15mL无菌离心管中。细胞在18±3℃以200×g离心5分钟。移除上清液且将细胞集结粒再悬浮于2.0mL DGEM中。将所再悬浮细胞的全部内容物添加至含有15mL DGEM的T75烧瓶中且烧瓶在5±2％CO2保温箱中、在37±2℃培育。
步骤2：培养基更换
培育3-4天之后，进行培养基更换。藉由抽吸移除细胞培养基且将15mL新鲜DGEM添加至T75烧瓶中。
步骤3：第一次细胞继代
观测到T75烧瓶中有单层形成。一旦单层为约80-100％汇合(典型地在第6天)，则抽吸消耗培养基且细胞用不含Ca及Mg的10mL DPBS洗涤一次以移除细胞碎片。移除DPBS之后，藉由添加3mL TrypLE
Figure BDA0001342303280000661
溶液移出细胞，来回摇荡烧瓶以分散溶液。烧瓶在37±1℃培育4±2分钟，随后轻缓地敲打烧瓶以悬浮细胞。添加9mL新鲜DGEM至烧瓶中且将细胞湿磨以破碎任何细胞凝块。全部体积(约12mL)添加至15mL锥形离心管中且在16±2℃、以200×g离心5分钟。抽吸上清液且小心地将细胞集结粒再悬浮于2mL DGEM中。移除细胞悬浮液样品用于细胞计数及存活率测定。基于细胞计数，使用最大量的细胞悬浮液、以每平方公分约1×104个细胞的接种密度分别接种适当数目个各含15mL、35mL或45mL DGEM的T75、T175及T225烧瓶。烧瓶在5±2％CO2保温箱中、在37±2℃培育直至汇合(典型地为3天)。
步骤4：第二次细胞继代
观测到步骤3的组织培养烧瓶中有单层形成。一旦单层为约80-100％汇合(典型地在第9天)，抽吸消耗培养基且用适量的DPBS(T75烧瓶各用10mL且T175及T225烧瓶各用20mL)洗涤细胞。移除DPBS之后，藉由添加适量的TrypLE
Figure BDA0001342303280000663
溶液(T75烧瓶各用5mL且T175及T225烧瓶各用7mL)来移出细胞，来回摇荡烧瓶以分散溶液。烧瓶在37±1℃培育4±2分钟，随后轻缓地敲打烧瓶以悬浮细胞。添加12mL DGEM至各烧瓶(不论尺寸)中，且湿磨细胞以破碎任何细胞凝块。将细胞悬浮液合并于50mL拋弃式无菌离心管中且在16±2℃、以200×g离心5分钟。移除上清液且将细胞集结粒再悬浮于3.0mL DGEM中。移除细胞悬浮液样品用于细胞计数及存活率测定。基于细胞计数，使用适量的细胞悬浮液、以每平方公分约1×104个细胞的密度接种各含有45mL新鲜DGEM的8-10x T225烧瓶。烧瓶在5±2％CO2保温箱中、在37±2℃培育直至汇合(典型地为3天)。
步骤5：第三次细胞继代
观测到8-10x T225烧瓶中有单层形成。一旦单层为约80-100％汇合(典型地在第12天)，则抽吸消耗培养基且用20mL DPBS洗涤各烧瓶中的细胞。移除DPBS之后，藉由添加7.0mL TrypLE
Figure BDA0001342303280000662
溶液至各烧瓶中来移出细胞且在37±2℃培育4±2分钟，随后轻缓地敲打烧瓶以悬浮细胞。添加28mL DGEM至各烧瓶中且湿磨细胞以破碎任何细胞凝块。将细胞悬浮液合并于500mL无菌离心瓶中且在16±2℃、以200×g离心5分钟。抽吸上清液且将细胞集结粒再悬浮于10mL DGEM中且将悬浮液转移至50mL拋弃式无菌管中。用20mL DGEM冲洗500mL离心瓶且添加冲洗液至上述50mL管中。轻缓地混合细胞悬浮液且移出样品用于细胞计数及存活率测定。基于细胞计数，使用适量的细胞悬浮液、以每平方公分约1×104个细胞的密度接种2x 10层细胞工厂(CF10，6,320cm2表面积)。对于各CF10而言，经由含有2,000mL新鲜DGEM的5L Stedim袋的注入口无菌添加适量的细胞悬浮液。将袋轻缓地混合且根据制造商说明书将内容物无菌转移至CF10。CF10在5±1％CO2保温箱中、在37±2℃培育直至汇合(典型地为4天)。
步骤6：第四次细胞继代
观测到2x CF10中有单层形成。一旦单层为约80-100％汇合(典型地在第16天)，则如下依序移出各CF10中的细胞：自第一CF10移除消耗培养基且根据制造商说明书用400mLDPBS洗涤细胞。移除DPBS之后，藉由添加150mL TrypLE
Figure BDA0001342303280000671
溶液至第一CF10中来移出细胞。允许TrypLE
Figure BDA0001342303280000672
溶液在各托盘的整个表面上均匀扩散且0.5-1分钟之后移除过量溶液。CF10在37±2℃培育4±1分钟以促使细胞分离。此培育期之后，在相差显微镜下观测细胞以监测细胞分离。根据制造商说明书添加300mL DGEM至第一CF10中且允许在各托盘的整个表面上均匀扩散。此时，第一CF10搁置一旁，同时以相同方式处理第二CF10。将来自两个CF10的细胞悬浮液合并于2L拋弃式无菌锥形瓶(Erlenmeyer flask)中且轻缓地混合。合并的细胞悬浮液无菌转移至2×500mL离心瓶中且在16±2℃、以200×g离心5分钟。抽吸上清液且将各细胞集结粒再悬浮于40.0mL DGEM中且合并。轻缓地混合所合并的细胞悬浮液且移出样品用于细胞计数及存活率测定。基于细胞计数，使用适量的细胞悬浮液、以每平方公分约1×104个细胞的密度接种10x CF10。对于各CF10而言，经由含有2,000mL新鲜DGEM的5L Stedim袋的注入口无菌添加适量的细胞悬浮液。将袋轻缓地混合且根据制造商说明书将内容物无菌转移至CF10。CF10在5±1％CO2保温箱中、在37±2℃培育直至汇合(典型地为4天)。
步骤7：细胞感染
计划感染之前日(典型地为第19天)，在37±2℃培育各含有2,000mL无血清DMEM的10x 5L Stedim袋以预温热培养基用于感染。感染当天，当单层为约90至100％汇合(典型地在第20天)时，将2个含有EV71MVS(LN 173-10001)的小瓶在37±2℃水浴中快速解冻且经由各Stedim袋的注入口添加0.6mL MVS，以使得MOI为约0.03。此MOI是基于如下假设来计算：平均细胞密度为每平方公分2×105个细胞且EV71MVS病毒效价为3.4×107TCID50/mL。对于各CF10而言，移除消耗培养基且用400mL DPBS洗涤细胞，如上述步骤6中所述。根据CF10制造商说明书，藉由添加2,000mL上述含病毒无血清DMEM制剂之一来感染各CF10。所感染的CF10在5±1％CO2保温箱中、在37±2℃培育直至观测到100％CPE(典型地为4天)。
步骤8：病毒收集
病毒感染期结束时(典型地在第24天)，在相差显微镜下观测各细胞工厂以确保100％CPE。无菌收集来自10x CF10的上清液且根据CF10制造商说明书合并于Stedim 20LFlexboy袋中。此代表粗病毒收集物。
步骤9：核酸酶处理
经由含有粗病毒收集物的20L Stedim袋的注入口无菌添加适量的250,000U/mL核酸酶溶液及1M MgCl2溶液，以分别达成20U/ml及2mM的最终浓度。混合袋内容物，随后在37±1℃培育18-24小时。
步骤10：病毒不活化
即将使用之前，藉由添加6.2g的2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)至300mL的175mM NaOH中且在37±1℃水浴中培育来制备BEI不活化溶液。一旦BEA溶解，则常规地检查BEI溶液的pH值，直至pH下降至pH 8-9范围内。BEI溶液在pH值落入此范围的60分钟内用于不活化，此藉由使用蠕动泵抽吸溶液直接通过0.2μm过滤器囊盒进入含有经核酸酶处理的粗病毒收集物的20L袋中来达成。手动混合BEI粗病毒收集物至少5分钟，接着为了促进进一步混合，将BEI粗收集物溶液抽吸至新的20L Stedim Flexboy袋中。BEI粗病毒收集物再次手动混合至少5分钟，接着在37±1℃培育6-7小时。
步骤11：BEI中和
残余BEI经由添加1L 32mM硫代硫酸钠而水解。含有经BEI处理的粗收集物的Flexboy袋与含有1L 32mm硫代硫酸钠的袋使用Y连接器并联连接。Y连接器的管道下游包括管线内静态混合器。经BEI处理的粗收集物及32mM硫代硫酸钠溶液分别以1L/min及50mL/min、经由静态混合器同时抽吸至Y连接器中且收集至新的Flexboy袋中。不活化且经中和的粗收集物接着立即如下文所述澄清。
步骤12：澄清
使用4阶段过滤组合件来澄清经核酸酶处理、不活化、经中和的病毒池。组合件由上游的Sartorius Sartoclean GF过滤器囊盒与Sartorious Sartopore 2过滤器囊盒串联而组成。前两个过滤阶段容纳于具有标称3.0μm及0.8μm乙酸纤维素过滤器的SartocleanGF囊盒中。第三及第四阶段容纳于具有标称0.45μm及0.2μm聚醚砜过滤膜的Sartopore 2过滤器囊盒中。经由过滤组合件抽吸病毒池且收集于5×5L Flexboy袋(各约4L)中。最后5LFlexboy袋连接至过滤组合件的出口且经由组合件抽吸3L PBST以洗涤过滤器且收集任何残余的不活化病毒。
步骤13：浓缩及透滤
三个各具有0.1m2、100kDa分子量截止Sartorius Hydrosart膜的SartoriusSlice拋弃式扫流过滤匣并联连接，以经由切向流过滤(TFF)将经澄清的不活化病毒池浓缩10倍(体积)。TFF之后，使用10个体积的PBS-Tween 80(10mM Na-PO4、150mM NaCl、0.002％Tween 80)pH 7.5进行恒定体积透滤。在整个运作中维持每小时300L/m2(LMH)的恒定通量及0.40至0.45巴的跨膜压力(TMP)。使用相等体积的缓冲液洗涤TFF卡匣组合件以便改善病毒回收。最终滞留物浓度为经由0.45μm及0.2μm无菌过滤器过滤之前的约5倍。经过滤的滞留物在层析纯化之前，在5±3℃储存不超过7天或在≤-60℃储存长达4周。
步骤14：阴离子交换层析
利用阴离子交换层析、经由
Figure BDA0001342303280000692
EMD TMAE(Merck)介质进行第一纯化步骤以捕捉EV71，部分地移除污染性宿主细胞蛋白质及任何残余的宿主核酸。在产物形成之此阶段，阴离子交换层析(AEX)介质视为单次使用的且产物专用的管柱在每次生产运作时再装填。GE Healthcare 70x 500mm(ID x高度)INdEX管柱用约390mL
Figure BDA0001342303280000693
EMD TMAE层析介质装填以产生约100mm的床层高度。装填之后，用4mL AEX测试溶液(20mM磷酸钠缓冲液、2mM MgCl2、1M NaCl，pH 7.5)装载管柱以量测理论盘等效高度(HETP)及不对称性(As)。若HETP及As分别为>3,000个盘/m及0.8-1.8，则管柱为使用所接受的。管柱在室温下以150cm/h(约96mL/min)的线性流速操作，且使用设定在2,000mAU范围的GE HealthcareUVis 920侦测器、在215nm监测管柱溶离液的吸光度。管柱用2个管柱体积(CV)的0.5M NaOH消毒且用3-5CV的结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液、2mM MgCl2、100mM NaCl，pH 7.5)平衡，随后装载得自步骤13的经过滤的滞留物。此管柱的结合容量为每毫升树脂约1.96mg蛋白质且样品是在40-80％管柱穿透率下装载。得自步骤13之经过滤的滞留物装载至AEX管柱上，其中降低流速(必要时)以避免引入空气。经过滤的滞留物装载之后，用结合缓冲液洗涤管柱直至获得基线吸光度(约2-5CV)。含有EV71抗原的材料以阶段梯度方式、使用溶离缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液、2mM MgCl2、250mM NaCl，pH 7.5)溶离。当侦测器指示100mAU时开始收集溶离份且持续至吸光度下降低于100mAU(约2-4CV)。得自步骤13之经过滤滞留物的体积大小及蛋白质浓度，综合AEX管柱尺寸及结合容量而言，典型地必需2轮AEX层析循环以完成所有材料的处理。第一次运作结束时，使用5CV再生缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液、2mM MgCl2、2M NaCl，pH 7.5)洗提AEX管柱，随后用3-5CV结合缓冲液平衡(直至获得基线吸光度)，随后装载经过滤的滞留物的其余部分。所有AEX运作完成之后，合并含有EV71的溶离份且管柱用5CV再生缓冲液洗提且用2CV的0.5m NaOH及5CV的0.01M NaOH消毒，随后储存。合并的AEX溶离份在如下文所述的阳离子交换层析之前，在5±3℃储存不超过3天。
步骤15：阳离子交换层析
利用阳离子交换层析、使用
Figure BDA0001342303280000691
EMD SO3(Merck)介质进行第二纯化步骤以进一步移除流过物溶离份中存在的杂质。在产物形成之此阶段，阳离子交换层析(CEX)介质视为单次使用的且产物专用的管柱在每次生产运作时再装填。Omnifit 35x 250mm(ID x高度)BenchMark管柱用约100mL
Figure BDA0001342303280000701
EMD SO3层析介质装填以产生约100mm的床层高度。结合缓冲液、溶离缓冲液、再生缓冲液、线性流速(150cm/h，约24mL/min)及监测条件与上述阴离子交换纯化步骤14中所用者相同。装填之后，用0.5mL再生缓冲液装载管柱以量测HETP及As。若HETP及As分别为>4,000个盘/m及0.8-1.8，则管柱为使用所接受的。管柱在装载样品之前，用2个管柱体积(CV)的0.5M NaOH消毒且用3-5个管柱体积(CV)的结合缓冲液平衡。得自上述阴离子交换步骤的含EV71溶离份(250mM NaCl)在装载之前用20mM磷酸钠缓冲液、2mM MgCl2(pH 7.5)稀释(约3次)以降低盐浓度。此管柱的结合容量为每毫升树脂2.7mg蛋白质且经稀释的EV71溶离液以40-80％管柱穿透率装载至CEX管柱上，其中降低流速(必要时)以避免引入空气。经稀释的AEX样品装载之后，用结合缓冲液洗涤管柱直至获得基线吸光度(约2-5CV)。使用溶离缓冲液自阳离子交换管柱溶离含有EV71抗原的材料。当侦测器指示50mAU时开始收集溶离份且持续至吸光度下降低于50mAU(约3-5CV)。得自步骤14之所合并滞留物的体积大小及蛋白质浓度，综合CEX管柱尺寸及结合容量而言，典型地必需2轮CEX层析循环以完成所有材料的处理。在首次运作结束时，CEX管柱用5CV再生缓冲液洗提，随后用3-5CV的结合缓冲液平衡(直至获得基线吸光度)，随后装载所合并AEX溶离份的其余部分。所有CEX运作完成之后，合并含有EV71的溶离份且管柱用5CV再生缓冲液洗提且用2CV的0.5m NaOH及5CV的0.01M NaOH消毒，随后储存。合并的CEX溶离份在如下文所述的尺寸排阻层析之前，在5±3℃储存不长于3天。
步骤16：尺寸排阻层析
使用Sephacryl S-400HR(GE Healthcare)介质的尺寸排阻层析在EV71抗原纯化方法中作为最后精制步骤使用。在产物形成之此阶段，尺寸排阻层析(SEC)介质视为单次使用的且产物专用的管柱在每次生产运作时再装填。两个GE Healthcare 100x 500mm(ID x高度)BPG管柱用约2.35L各种Sephacryl S-400HR层析介质装填以产生每个管柱250-300mm的床层高度。装填之后，管柱个别地用25mL各种SEC测试溶液(10mM Na-PO4、2M NaCl、0.002％Tween 80，pH 7.5)装载，以量测HETP及As。若HETP及As分别为>4,000个盘/m及0.8-1.8，则管柱为使用所接受的。两个管柱个别地用1CV的0.5M NaOH消毒，用3-5CV的运作缓冲液(PBST：10mM Na-PO4、150mM NaCl、0.002％Tween 80，pH 7.5)平衡，接着串联组装供使用。得自上述步骤16的所合并CEX溶离份以总管柱体积的2.5-5.0％装载至SEC管柱组合件上且管柱在室温下利用24cm/h(31.4mL/min)的线性流速等度操作。使用设定在100mAU范围的GE Healthcare UVis 920侦测器、在215nm监测管柱溶离液的吸光度。自所观测到的溶离峰各收集50-100mL溶离份。基于层析图的形态来调节溶离份大小。根据先前经验，以约0.450.60CV溶离≥90％纯度的EV71溶离份。所合并的CEX溶离份的体积大小及管柱尺寸典型地必需4轮SEC层析循环以完成所有材料的处理。在每个循环结束时，管柱用3-5CV的运作缓冲液再平衡直至获得基线吸光度。所有SEC运作完成之后，管柱用1CV的0.5m NaOH消毒，随后用2CV 0.01M NaOH消毒，随后储存。藉由SDS PAGE及西方墨点法分析个别溶离份，以允许选择及合并含有≥90％纯度的EV71抗原的彼等溶离份。合并所选≥90％纯度的适应性EV71疫苗溶离份且在浓缩之前，在5±3℃储存不超过3天。
步骤17：浓缩
使用TFF进行浓缩，其中2x 30kDa分子量截止Sartorius Hydrosart膜匣组装于Sartorius
Figure BDA0001342303280000711
Slice 200固持器中。在整个制程中维持300LMH的恒定通量且TMP在0.40-0.45巴之间波动。浓缩倍率在10-40倍范围内，此视得自步骤16之所选经合并SEC溶离份中的总蛋白质浓度及调配物需要而定。浓缩溶液经由0.2μm过滤器过滤且在<-60℃储存长达6个月或在5±2℃储存长达2周。
疫苗调配物
步骤1：吸附至氢氧化铝
自储存中移出适量的适应性EV71疫苗产物且与PBST(PBS+0.002％Tween 80)混合以产生剂量特异性稀疫苗产物供用氢氧化铝调配。添加Tween 80以减少疫苗聚集。稀疫苗产物直接经由0.2μm孔径过滤器(Pall Acropak)过滤进入混合容器中。添加十分之一体积的无菌氢氧化铝悬浮液(Alhydrogel 85)至混合容器中且内容物在搅拌盘上、在5±3℃混合16-24小时。用于制备适应性EV71疫苗的氢氧化铝佐剂是由Brenntag Biosector,Frederiksund Denmark制造且依Alhydrogel 85的商标，以2％(w/v)溶液形式出售。约100％吸附至Alhydrogel 85上。
步骤2：填充
适应性EV71疫苗使用经验证之手动填充操作无菌填充至3mL无菌玻璃(USP I型)小瓶(Schott)中。填充操作是在位于10,000级(ISO 7)室中的100级(ISO 5)生物安全柜中进行。填充小瓶用无菌氯丁基橡胶塞(West Pharma)塞住且使用半自动小瓶卷边站(KebbyPro-Seal)、用无菌铝易拉型密封件(West Pharma)密封。密封之后，小瓶用1.50"x 0.75"不透明白色雷射印刷Cryo-Tag卷标(Diversified Biotech,LCRY-1200)手动打上卷标。
步骤3：目视检验及储存
所有小瓶进行目视检验且若其未填满、盖子松散、玻璃件松散或具有其它颗粒，则退回。目视检验之后，疫苗产物在5±3℃储存。
适应性疫苗的质谱
藉由M-Scan(United Kingdom)对适应性疫苗原料药进行质谱(MS)分析。样品在二硫苏糖醇中发生还原，用碘乙酸发生羧甲基化，在碳酸氢铵缓冲液中经由离心管柱(3kDa截止膜)浓缩，在膜上用胰蛋白酶进行消化，且所得肽藉由LC-ES-MS/MS(高压液相层析-电喷雾四极子飞行时间质谱)加以溶离及分析。根据使用高能MS所得的质谱产生肽序列，且所得序列用于询问NCBI数据库(使用MASCOT软件)。根据上文所述，MS分析证明衣壳蛋白VP1、VP2、VP3及VP4为测试样品中的主要组分。
实例3：免疫效能研究
免疫效能测试用于证明适应性EV71疫苗的效能。设计分析以藉由评估适应性EV71疫苗接种的小鼠随时间有规律地发生特异性EV71免疫反应来报导适应性EV71疫苗的有效性及稳定性。因而，该分析内亦并有TCID50病毒中和方法。
简言之，小鼠(每组六只)各在第0天及第14天接种低剂量或高剂量的适应性EV71疫苗，此经由在相同肢体进行2x 50μL IM注射以靶向相同淋巴结来达成。由于小鼠的注射体积限制(总共100μL)，因此动物接受1/5的所调配疫苗剂量，其中低剂量免疫小鼠接受每剂量0.12μg蛋白质及0.1mg铝胶且高剂量免疫动物接受每剂量0.6μg蛋白质及0.1mg铝胶。六只动物的对照组接受每剂量含有0.1mg铝胶的单独铝胶调配物。为了评估免疫效能，在以下三个时机自各动物收集血清：第0天及第14天的免疫接种前放血及第28天的最后放血。来自各群组的血清样品进行热不活化且合并。来自各群组的合并血清在Vero细胞分析培养基(含有2％FBS的MEM)中连续稀释且向此等样品中添加已知量的适应性EV71活病毒(100TCID50/50μL)且培育混合物1.5小时。接着将此等样品及对照样品(EV71 100 TCID50/50μl作为阳性对照物；分析培养基作为阴性对照物)添加至96孔盘中的Vero细胞中，如针对TCID50所述。第3-5天观测CPE且结果以血清中和效价表示，血清中和效价定义为最大血清稀释度，其中三个复本中的至少两者对于CPE呈阴性。此等实验的结果提供于下表2-4中。
表2.来自对照组的血清中和效价
Figure BDA0001342303280000721
单独明矾对照组的第5天结果；NT＝未测试，NR＝抗体反应<1/128。
如表2中所示，阴性对照组的六只个别动物中的每一者在第0天与第28天均提供阴性反应，证明单独明矾未引起抗EV71抗体增加。
表3.来自低剂量组的血清中和效价
Figure BDA0001342303280000731
低剂量组的第5天结果；NA＝用于分析的样品体积不足，NR＝抗体反应<1/128。
如表3中所示，在第0天收集的预放血中未侦测到来自低剂量组的中和抗体反应，表明该等动物先前尚未暴露于EV-71样病毒。第14天亦获得阴性结果，证明14天间隔时间之后的单一剂量不足以产生可侦测的免疫反应。然而，第28天，6只动物中有5只提供可量测的抗血清中和效价。当利用低剂量组中的6只动物中的每一者制备池时，侦测到可量测的中和抗血清反应。
表4.来自高剂量组的血清中和效价
Figure BDA0001342303280000732
高剂量组的第5天结果；NR＝抗体反应<1/128。
如表4中所示，在第0天收集的预放血中未侦测到来自高剂量组的中和抗体反应，表明该等动物先前尚未暴露于EV-71样病毒。第14天亦获得阴性结果，证明14天间隔时间之后的单一剂量不足以产生可侦测的免疫反应。然而，第28天，所有动物均提供可量测的抗血清中和效价。当利用高剂量组中的6只动物中的每一者制备池时，产生1/512之中和抗体效价。当利用在第14天接受高剂量的4只动物中的每一者制备池时，产生1/1,024的中和抗体效价。
此等结果证明适应性EV71疫苗的免疫效能。低剂量与高剂量处理诱导可量测的中和抗体反应。
实例4：使用及不使用明矾佐剂调配的3种剂量水准的EV71抗原
此实例评估在使用或不使用明矾佐剂调配的适应性EV71疫苗抗原在各种剂量水准下、在雄性Balb/c小鼠中的免疫反应。用动物评估三种剂量水准(0.12、0.6及3μg EV71抗原/剂量)；各组动物由每组8只小鼠组成。不具有明矾(第1组)及具有明矾(第5组)的调配物的阴性对照物分别为PBST(磷酸盐缓冲盐水+0.002％v/v Tween 80)及氢氧化铝。明矾(Alhydrogel 85)在含有此佐剂的所有调配物中的量为恒定的(每剂量0.5mg)。第0天及第28天藉由IM注射来使小鼠免疫。第0天(免疫接种前)、第28天(加打免疫接种前)及第56天(末端放血)收集血清以评估各处理组在各剂量水准下的中和抗体效价及血清转化率。使用基于TCID50的中和分析来测定血清中和抗体效价。根据中和抗体效价的免疫反应与对照进行比较，对照为不使用佐剂调配的EV71抗原。利用个别的倒数(reciprocal)中和效价计算各组的几何平均效价(GMT)。血清转化率定义为指定群组中的倒数中和效价≥128的动物百分比。
此研究的结果呈现于下表5中。
表5.具有及不具有明矾佐剂的EV71抗原的免疫原性
Figure BDA0001342303280000741
aPBST＝磷酸盐缓冲盐水+0.002％(v/v)Tween 80，经纯化的不活化EV71的缓冲基质
b血清转化率(SCR)定义为倒数中和效价≥128的动物百分比
所有动物在免疫接种之前的第0天无可量测的中和抗体。相较于接受相同剂量的无佐剂的EV71抗原的小鼠，使用氢氧化铝调配的EV71抗原在所有剂量水准下、在小鼠中产生较高中和抗体效价。添加明矾佐剂亦影响血清转化率，如依0.6μg及3μg剂量水准投与单一剂量(第28天样品)之后所注意到。
结果表明，EV71抗原调配物中包含明矾佐剂使适应性EV71疫苗的总免疫原性改善。使用明矾佐剂的群组中出现的较高GMT中和效价证明了此结果，效价范围为第28天的GMT的11至23倍(1次剂量之后)、第42天的GMT的4至6倍(2次剂量之后)及第56天的GMT的2.4至9倍(2次剂量之后)。此为重要的，特别是关于免疫反应的长寿命及疫苗提供针对流行中的异源EV71子基因组的保护作用的能力而言。
实例5：对小鼠进行的剂量范围研究
此实例证明使用明矾佐剂调配的不同剂量的适应性EV71疫苗诱导小鼠产生中和抗体的能力。雄性Balb/c小鼠经由IM注射、用每剂量0.12、0.6、3、9及15μg的适应性EV71疫苗免疫两次(第0天及第28天)。明矾在所有调配物中的量恒定为每剂量0.5mg。使用TCID50EV71病毒中和分析来测定第0、28及56天的倒数中和抗体效价。此研究所产生的资料用于确定人类试验中所用的剂量水准。所有动物在免疫接种之前的第0天无可量测的中和抗体(表6)。
表6.对INV21疫苗在小鼠中的剂量范围研究
Figure BDA0001342303280000751
a血清转化率(SCR)定义为倒数中和效价≥128的动物百分比
单独明矾对照组(0μg剂量的适应性EV71疫苗抗原)在所分析的任何时间点均未产生任何中和抗体。一次剂量的适应性EV71疫苗之后，仅3μg及15μg剂量水准产生高含量的中和抗体，如第28天的GMT≥128所指示。两次剂量的疫苗之后，观测到接受0.6μg或高于0.6μg的剂量的动物中出现高含量的中和抗体(第56天的GMT≥128)。在接受15μg最高剂量的动物组中发现最高GMT(2702)。在所有剂量组中，第二疫苗投与的强化效应在第56天为显而易见的。
出于计算血清转化率的目的，倒数中和效价≥128用于将个别动物归类为已血清转化。一次剂量的疫苗之后(第28天)，在所有剂量水准(范围为10％(0.12μg剂量水准)至80％(15μg剂量水准))下发现不完全的血清转化。两次剂量的适应性EV71疫苗之后，在各剂量水准下达成的SCR(第56天)高于第28天，其中50％动物在0.12μg剂量下、90％动物在0.6μg剂量下且100％动物在3、9及15μg剂量水准下出现血清转化。相较于128倒数中和效价(虚线)，所有剂量组的GMT显示于图3中。
该等结果类似于上述实例4的结果，证明两剂的适应性EV71疫苗对于产生高量的中和抗体效价为最佳。尚未确立针对EV71的中和抗体量在人类的保护性效价；然而，Yu等人(2000)描述在EV71感染的小鼠攻击模型中，倒数(reciprocal)中和效价≥128为最小保护性效价。Wu等人(2002)描述在EV71被动疫苗接种及攻击的相关小鼠模型中类似保护性效价。此效价水准在图3中以水平虚线表示。此研究的结果显示，在两次免疫接种之后，0.6μg及高于0.6μg的适应性EV71疫苗剂量能够产生超过此临限值的GMT。综合而言，此研究的数据连同实例4的数据一起能够得到以下结论：适应性EV71疫苗的低剂量及高剂量调配物(分别为每剂量0.6μg及3.0μg)适用于人类测试。
实例6：适应性EV71疫苗针对所选EV71子基因组的免疫反应的交叉中和
分析来自使用适应性EV71疫苗免疫的动物的低效价大鼠血清及高效价兔血清在活体外中和三株其它子基因组(B4、B5及C4)的EV71的能力。包括与该疫苗株相同的B2子基因组作为阳性对照。此实验中所用的分析为TCID50中和分析，其经修改以允许感染后的较长观测时间(长达10天而非5天)，因为B4、B5及C4株分离物引起Vero细胞发生细胞病变效应所需的时间较长。测试样品的中和效价定义为≥50％复本中抑制Vero细胞感染的最高稀释度。
兔抗EV71血清针对B4及B5子基因组的倒数中和效价与针对同源B2子基因组所得的效价相同(图4)。该兔血清针对C4子基因组的倒数中和效价为B2效价的约1.4倍。大鼠抗血清针对B4、B5及C4病毒的倒数中和效价分别为针对同源B2子基因组所得效价的约0.25、0.18及2.8倍(表7)。
表7.针对同源及异源EV71子基因组的INV21的倒数中和效价
Figure BDA0001342303280000761
总之，结果证明，针对适应性EV71疫苗产生的血清可诱导至少两种动物物种中产生针对异源EV71株系的交叉中和抗体。
实例7：毒理学研究
对兔进行的毒理学研究
进行毒理学研究，其中使用NZW兔作为适当物种来进行初始评价，对NZW兔进行毒性评估以支持在人类中的给药。在此研究中，三次剂量的适应性EV71疫苗之后，评估NZW兔的免疫反应。两组动物(每组2只雄兔)用以下免疫：用每剂量0.5mg明矾调配的15μg适应性EV71疫苗或单独明矾对照调配物(每剂量0.5mg于PBS中)，藉由IM注射。动物在第0、28及56天免疫，且在长达84天的整个研究期间中的不同时间点测定中和抗体含量。包括第三次免疫接种以为产生具有高抗体效价的血清以用作分析显色试剂及参考标准。使用TCID50中和分析量测中和抗体效价。
接受适应性EV71疫苗的所有动物均诱发良好的免疫反应，如第14天(一次免疫接种之后)起始及直至第84天终末放血(三次免疫接种之后)的高倒数中和抗体效价所指示(表8)。
表8.INV21在NZW兔中的免疫原性
Figure BDA0001342303280000771
倒数中和抗体效价在投与第二剂量的适应性EV71疫苗之后的第42、14天最高。第三剂量的适应性EV71未引起在第84天所量测的倒数中和效价增加(图5)。在所分析的所有时间点，明矾对照组动物中未侦测到中和抗体。
结果证明NZW兔适用作其中进行GLP毒理学研究的物种，如免疫接种适应性EV71疫苗之后的高含量中和抗体所证明。
GLP毒理学研究及局部耐受
进一步评价适应性EV71疫苗在NZW兔中的毒性。另外，评价对疫苗的局部耐受。此研究的目标为，重复IM免疫接种之后，评估适应性EV71疫苗的毒性及局部耐受；及评估任何效应在两至四周无处理时段期间的可逆性。此研究中所用的测试物为低剂量及高剂量适应性EV71疫苗调配物，其分别由每剂量0.6μg EV71及每剂量3.0μg EV71组成，用每剂量0.5mg的明矾佐剂调配(表9)。
表9.INV21(NC-NSP-007)的重复及局部耐受研究中的处理组
Figure BDA0001342303280000781
M-雄性；F-雌性
a最后免疫接种之后的2天(第30天或第44天(G4))，各组中的动物数目一半被处死，且各组的其余部分在第56天处死(终末处死)。
b疫苗安慰剂组接受单独明矾佐剂调配物。
所包括的对照物为生理盐水安慰剂(PBS)及单独明矾佐剂调配物(每剂量0.5mg)，后者在此研究中称为疫苗安慰剂。所有群组动物在第0天及第28天以IM注射方式给予测试物及对照物。第4组动物(高剂量疫苗)在第42天接受额外的免疫接种，其超过1期研究中的预定两剂量方案一个剂量。观测所有动物的任何总体临床变化、注射位点处的局部反应、死亡率及罹病率、临床病理学、血液学、临床化学、总体病理学及病理组织学。
就适应性EV71疫苗的总体毒性而言，在两个及三个时机藉由IM注射至NZW兔而分别给予的低剂量(每剂量0.6μg)与高剂量(每剂量3.0μg)调配物未引起死亡或罹病且血液学或临床化学不存在与处理相关的显著变化。另外，平均体重、食物消耗、呼吸速率或直肠温度以及总体病理学检查、绝对及相对器官重量不存在与处理相关的变化。此外，研究中未观测到与处理相关的神经毒性、肾或血液副作用。就局部耐受而言，任何动物中均未观测到红斑或水肿。用显微镜在注射位点处观测到一些肌肉病变，然而在最后免疫接种之后的14或28天无处理时段中，此等效应为可逆的。在接受含有明矾佐剂的调配物的所有群组中，在动物亚群中观测到发生或未发生单核细胞(MNC)/嗜伊红血球浸润的肌肉变性。在接受生理盐水安慰剂(PBS)的群组G1中未观测到发生或未发生MNC/嗜伊红血球浸润的肌肉变性。观测到肌肉变性的动物数目显示于表10中。
表10.注射位点处发生肌肉变性的兔数目
Figure BDA0001342303280000791
a值是以具有至少一个观测结果的动物数目/每个处理组动物总数呈现
b在总计下所示的值为发生与未发生MNC/嗜伊红血球浸润的肌肉变性观测结果的总数。
c疫苗安慰剂组接受单独明矾佐剂调配物。
在除G1(生理盐水PBS对照物)之外的所有群组中，注射位点处的肌肉病变包含发生或未发生MNC/嗜伊红血球浸润的不同程度的变性。此等病变与已知和疫苗制剂中的铝盐佐剂相关的变化一致(Gherardi 1998；Gherardi 2001；Verdier 2005)。此外，在第56天处死的所有动物中均注意到病变消退。因此推断，注射位点处的肌肉病变视为用于调配适应性EV71疫苗的明矾佐剂的效应且并非EV71抗原存在的结果，且该等效应为可逆的。
在低剂量疫苗及高剂量疫苗组动物的内脏器官中观测到不同的组织病理学变化，其类似于疫苗安慰剂及生理盐水组。此外，该等病变视为非特异性、不显著且不依循任何模式，且因而，此等变化在性质上视为自发或偶发的。
结果表明，在注射位点处观测到用明矾调配的疫苗制剂典型的局部反应，其中低剂量及高剂量适应性EV71疫苗调配物以及单独明矾对照调配物发现具可逆性。另外，低剂量与高剂量适应性EV71疫苗调配物未诱导与处理相关的任何生理学或病理学变化。总体而言，此研究的结果证明适应性EV71疫苗为安全的且耐受性良好。
实例8：适应性EV71疫苗在成人自愿者中为安全的、具有免疫原性且诱导交叉中和抗体反应
在健康成人的I期临床试验中，评价实例1-7中所述的适应性EV71疫苗。在新加坡国立大学医院医学研究单位(Investigational Medicine Unit,National UniversityHospital,Singapore)募集年龄为21至45岁的三十六位健康男性及女性加入随机、双盲、安慰剂对照研究。此研究为适应性EV71疫苗的首次人类研究。动物研究资料已证明，适应性EV71疫苗在多个动物物种中引发高含量病毒中和抗体且为选择免疫原性终点的基础。
个体
签署知情同意书之后，筛选适于研究的个体，如下文所述。筛选访视时，程序包括身体检查、生命体征、ECG及实验室测试。筛选可在疫苗接种之前的至多42天进行。
为了适于研究，个体须满足以下标准：男性或女性年龄在筛选时为21至45岁(包含21岁及45岁)；健康良好，如根据医疗史及身体检查所确定；普通临床安全实验室检查[Na、K、Cl、葡萄糖、BUN、肌酐、磷酸盐、钙、蛋白质、白蛋白、丙氨酸转胺酶(ALT)、天冬氨酸转胺酶(AST)、胆红素、白血球(WBC)、血红蛋白、血小板及尿分析。安全实验室测试的正常范围是根据执行安全实验室测试的实验室中所用的彼等范围。若此等实验室结果中的任一者超出正常范围，则重复测试。若重复结果超过正常范围，则可募集个体，但惟根据研究者与医学监测者的批准；具有19-28kg/m2范围内的身体质量指数(BMI)；有对人类免疫缺陷病毒(HIV)、C型肝炎抗体及B型肝炎表面抗原呈血清阴性记录；有生育潜力的女性在筛选期间必须具有阴性尿液妊娠测试结果且即将接种疫苗之前进行阴性尿液妊娠测试且愿意自筛选直至最后血液样品(第196天)之后使用口服、可植入、经皮或可注射避孕药或研究者所批准的其它可靠避孕方式(子宫内装置、女性避孕套、杀精子隔膜、子宫颈帽、性伴侣或无菌性伴侣使用避孕套，或禁欲)；愿意且能够出示欲参与的书面知情同意书；愿意且能够与研究者交流且了解研究的需要；且显示低含量的EV71中和抗体，如下文所述。
理想上，此研究仅募集未经EV71感染的个体以便获得免疫原性的早期指示。虽然一些个体对于EV71具有预免疫力，但研究中仅包括具有倒数中和效价≤8或最低倒数中和效价(以现场筛选的健康自愿者群体中先出现者为准)的个体，以能够在缺乏预存在免疫力的情况下对免疫原性达成一些评估。
满足以下任一标准的个体不适于参与研究：研究者判断为方案参与的禁忌症或降低自愿者出示知情同意书的能力的任何医学、精神病学、社交病状、职业性原因或其它责任；根据研究者的判断，临床上显著的血液(包括出血病症)、肾、肝、肺(包括哮喘)、中枢神经系统(包括癫痫症、癫痫发作、痉挛，或慢性偏头痛)、心血管或胃肠病症；进行中的皮疹或其它皮肤病；异常ECG，如研究者所评估；疫苗接种之前的三天内出现发热性疾病(体温≥38℃)或中度或重度急性疾病或感染；糖尿病病史；对任何疫苗过敏；伴有CNS受累的重度HFMD病史；第一次试验疫苗接种之前的4周内接受任何疫苗；此研究中每次疫苗接种之后的4周内计划接受任何疫苗；已知或怀疑有先天性或后天性免疫缺乏；在首次疫苗接种之前的前6个月内经历免疫抑制性或细胞毒性疗法，诸如抗癌化学疗法或放射疗法；或在首次疫苗接种之前经历长期(前3个月内的至少2周)全身性皮质类固醇疗法(剂量为至少每天0.5mg/kg)；胸腺病理学、胸腺切除术、肌无力或任何免疫缺乏的病史；复发性偏头痛病史或服用治疗复发性头痛或偏头痛的处方药物；每次疫苗接种之前的3天立即使用任何非类固醇消炎药(NSAID)、乙酰胺苯酚或抗组织胺；首次疫苗接种(第0天)之前的7天使用处方或非处方药，不包括避孕药；针对可卡因(cocaine)、安非他明(amphetamines)、鸦片剂(opiates)或大麻素(cannabinoids)进行的阳性尿液测试；参与或计划参与任何临床试验，包括首次疫苗接种之前一个月直至最后疫苗接种之后一个月接受其它研究性产物；首次疫苗接种(第0天)之前8周接受血液制品或免疫球蛋白或在研究期间计划使用；首次疫苗接种(第0天)之前的6周或在研究期间的任何时间献血；或女性怀孕或处于哺乳期。
试验方案由独立的伦理委员会批准。完全根据『赫尔辛基宣言(Declaration ofHelsinki)(1964)』(包括后续修订版)的原则或地方法律及法规来进行研究。此研究完全依循『Guideline for Good Clinical Practice』International conference onHarmonization(ICH)Tripartite(1996)中所概述的原则或地方法律及法规。所有有希望的个体均提供信息表及同意书的批准版复本供阅读。研究调查者有责任确保进入试验的所有参与者理解其担当且已阅读信息表。告知个体其可自由拒绝参与研究或在任何时间退出研究，且其接受的医学照护不受其同意或拒绝参与研究的影响。
产物投与
募集之后，将个体分入第1组(低剂量)或第2组(高剂量)且随机接受适应性EV71疫苗或安慰剂，但其中守望个体首先接受适应性EV71疫苗接种，随后各组中的其余个体在两个时机(第0天及第28天)接受疫苗接种。低剂量组包括12位个体接受适应性EV71疫苗(每剂量0.6μg EV71)及6位个体接受安慰剂；高剂量组包括12位个体接受适应性EV71疫苗(每剂量3μg EV71)及6位个体接受安慰剂。安慰剂处理为磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其根据测试产物来投与。在各剂量水准(低或高)下，募集个体分成两组18位个体。在每组中，一位守望个体在该组其余个体之前接受初打剂量。因而，随机分组时程确定各组内其余个体(N＝17)的治疗。个体随机分组以接受疫苗或安慰剂。不涉及研究分析的随机统计学家制备随机分组清单以将个体编号随机赋予群组及疗法。适当方框图用于确保治疗分配之间的平衡得以维持。所有疗法的组合物及剂量体积提供于下表11中。
表11.
Figure BDA0001342303280000821
适应性EV71疫苗的剂量是基于调配物中的EV71抗原量。此研究评价适应性EV71疫苗在两种剂量水准(低剂量调配物及较高剂量调配物)下的安全性及免疫原性，其中各剂量水准之间的EV71蛋白质绝对量相差5倍。在两种剂量水准下，明矾佐剂的量为恒定的(每剂量0.5mg)。
希望低剂量调配物的组成提供对适应性EV71疫苗在人类自愿者中的安全性的初始评估。低剂量与高剂量调配物均在兔中所进行的关键安全性研究加以测试。此外，在兔研究中投与三次剂量，其比此研究中所用的预定两次剂量方案多一次剂量。
此研究中所测试的建议剂量水准是基于小鼠剂量范围研究，其中两次剂量的适应性EV71疫苗之后诱发足够中和效价的最低剂量(基于文献中所报导的1:128的保护性效价)为每剂量0.6μg。除9微克/剂量水准(其中倒数中和效价及血清转化率(SCR)低于3微克/剂量的倒数中和效价及血清转化率)之外，3及15微克/剂量水准未引起中和效价及SCR出现明显差异。因此，选择3μg作为此研究中欲评价的高剂量水准。
个体在三角肌区域中接受两次肌肉内注射(第0天为初打剂量；第28天为加打剂量)。每隔一定时间获得血液样品，用于评估安全(血液学、血清化学)及免疫原性(针对EV71的中和抗体)。给予个体日记，日记在每次疫苗接种之后14天完成以记录口腔温度及疫苗接种之后所经历的任何症状(局部及全身性)。记录在研究期间发生的任何不良事件。
研究中不允许在每次疫苗接种之前的3天服用以下药物：NSAID、乙酰胺苯酚或抗组织胺。此研究中允许存在以下用药及疗法：若个体发热≥37.8℃或若个体有明显的臂痛、肌痛或头痛，则可在每次疫苗接种之后的前7天期间使用NSAID、乙酰胺苯酚或抗组织胺。NSAID或乙酰胺苯酚仅在个体日记记录症状或发热之后服用且并非为了预防而服用；每天一次不超过100mg的低剂量阿司匹林(aspirin)及低剂量麻醉剂(诸如含有羟考酮(oxycodon)及乙酰胺苯酚的扑热息痛(Percocet))仅在个体日记记录症状之后服用且不应为了预防而服用。
为了制备研究性产物，藉由使用非盲研究协调者或被指派者而使个体及研究者对于疗法(疫苗或安慰剂)不知情，包括遮蔽注射器及用特有注射器编号及个体标识标记注射器。含有产物的注射器用卷标遮蔽以防止内容物颜色可视。由于样品仅用个体特有的标识号、日期及方案编号标记，因此执行血液学、血清化学、尿分析及中和抗体分析的实验室对于疗法不知情。投与研究性产物的人员(研究者或合格被指派者)及涉及安全评估的人员在整个研究中保持不知情。
随机分组时程不供研究者、不知情监测者使用或在研究期间不供研究团队使用。非盲仅在严重不良事件或医学应急的情况下，经研究者特别请求时发生。在打破治疗法则的情况下，仅针对所述个体且经研究者或助理研究者向非盲研究协调者或随机化统计学家提出书面请求后才可打破以便能够作出关于继续研究的决定。
需要个体在最后剂量之后的2个月(第84天)及6个月(第196天)返回至现场以便进行随访安全及免疫原性评估。各个体参与总共约8.5个月，包括42天筛选及最后剂量之后的6个月随访(第196天访视)。
事件(包括所有安全及功效量测)的研究时程概述于下文表12及13中。
表12.研究第-42天至第14天的事件时程(初打剂量)
Figure BDA0001342303280000831
Figure BDA0001342303280000841
1未随机分入低剂量组的适合个体若其处于42天筛选期间内，则可随机分入高剂量组。若其处于42天筛选期之外，则对其再筛选，其中除知情同意程序及收集人口统计资料之外，重复所有测试及程序。
2各组中的守望个体在该组其余个体之前首先给药。观测守望个体2天且守望个体需在第1天及第2天需要返回至单位进行安全评估。
3疫苗接种之前，审查或进行纳入/排除(I/E)标准及身体检查。疫苗投与之前，收集样品用于滥用药物测试、血清化学、血液学、尿分析及血清中和抗体分析。
4疫苗投与之前获得尿液妊娠测试结果且对于继续进行研究的个体而言呈阴性。
5记录疫苗所投与的手臂。
6疫苗投与之前及疫苗投与之后的5、30及60分钟。
7疫苗投与之后的5、30及60分钟。
8为了尿分析，记录女性个体在样品收集时是否月经。
9第14天访视时，自个体收集个体日记。
10身体检查、疫苗接种及注射位点评价是由研究者或其指派者进行。
表13.研究第28天至第196天的事件时程(加打剂量)
Figure BDA0001342303280000851
1针对加打剂量的第28天访视可在第28天±3天发生
2第56天访视可在第56天±3天发生
3第84天访视可在第84±5天发生
4第196天访视可在第196天±7天发生
5访视7始终在加打后第3天发生(亦即，若加打在第28天投与，则访视7在第31天发生；若加打在第30天投与，则访视7在第33天发生；若加打在第26天投与，则访视7在第29天发生)
6访视8始终在加打后第7天发生(亦即，若加打在第28天投与，则访视8在第35天发生；若加打在第30天投与，则访视8在第37天发生；若加打在第26天投与，则访视8在第33天发生)
7访视9始终在加打后第14天发生(亦即，若加打在第28天投与，则访视9在第42天发生；若加打在第30天投与，则访视9在第44天发生；若加打在第26天投与，则访视9在第40天发生)
8随访访视仅在个体未完成直至第196天的研究或较早中断研究(较早终止)时才适用
9身体检查必须在疫苗接种之前进行。疫苗投与之前，必须收集样品用于滥用药物测试、血清化学、血液学、尿分析及血清中和抗体分析
10疫苗投与之前必须获得尿液妊娠测试结果且对于继续进行研究的个体而言必须呈阴性
11记录疫苗所投与的手臂
12疫苗投与之前及疫苗投与之后的5、30及60分钟
13疫苗投与之后的5、30及60分钟
14若较早终止发生于第一或第二次疫苗接种的14天内，则评价注射位点
15为了尿分析，记录女性个体在样品收集时是否月经
16若较早终止发生于第一或第二剂量疫苗的14天内，则收集血液用于血清中和抗体分析
17第42天访视时，自个体收集个体日记
18记录第一次疫苗接种(第0天)至最后剂量后第28天(第56天)的所有不良事件
19在第84天及第196天访视时，对个体就其在最后剂量之后的6个月内可能经历的任何SAE而言进行质疑
20身体检查、疫苗接种及注射位点评价是由研究者或其指派者进行。
安全量测结果评估
评估完整医疗史，包括审查所有主要身体系统。在筛选访视期间藉由面诊获得重要的过去及当前医疗史。在筛选访视期间记录目前使用或筛选之前三(3)个月预先使用的处方及非处方药物(包括维生素及补充剂)的详情。在每次访视时审查伴随用药记录且记录任何新的用药。
人口统计资料包括如个体所述的年龄、身高、体重、BMI及人种。个体在穿轻便装且脱鞋的同时量测体重及身高。使用下式计算BMI(公制单位)：BMI＝体重(kg)/身高(m)2。在筛选期间获得人口统计资料。
在筛选时由研究者或其指派者对各个体进行全面身体检查，随后在第0天及第28天及第56天投与疫苗。检查由以下器官/系统的评估组成：头；眼；耳、鼻、喉；颈；心血管；胸；呼吸系统；腹部；泌尿生殖系统；肢体；肌骨胳；神经系统；皮肤；及其它值得注意的条件。在身体检查期间自预先检查中注意到的任何变化均记录。
生命体征包括口腔温度、血压、脉动速率及呼吸速率。在筛选时、在第0天(疫苗投与之前及疫苗投与之后的5、30及60分钟)、第1天(仅守望者)、第2天(仅守望者)、第3、7、14天、第28天(疫苗投与之前及疫苗投与之后的5、30及60分钟)及第31、35、42、56、84及196天，获得生命体征。在个体就座且休息5分钟之后，自个体手臂量测血压，其中手臂支撑在心脏高度。依最近的mmHg记录血压。当安排生命体征与血液收集同时进行时，首先获得生命体征，但第0天及第28天除外，此时在疫苗接种前及疫苗接种后获得生命体征。
所有个体在募集加入研究之前需要具有正常ECG。在筛选时进行标准的12引线ECG。审查各ECG说明且由研究者确认。机器说明只要其经研究者确认，为可接受的。
注射之前，负责投与研究性产品的研究人员使用不能拭除的标记物围绕实际注射位点画圆(直径约1")。程序详述于研究程序手册中。记录注射所投与的手臂。
第0天(疫苗接种后的5、30及60分钟)、第1天(仅守望者)、第2天(仅守望者)、第3、7、14天、第28天(疫苗接种后的5、30及60分钟)、第31、35及42天，使用评估量表评价注射位点的局部反应原性。在观测到注射位点反应的情况下，研究者提供适当照护。对注射位点反应进行摄像，其中标尺清晰可见于像片中。像片仅根据个体标识代码、访视编号及日期来鉴别，以确保对个体身分的保护。
要求个体完成日记(「症状日记」)，此日记始于每次疫苗接种日及其后14天(第0至14天及第28至42天)。在此时间期间，需要个体获取其口腔温度(在每天相同的时间)且将其记录于日记中。另外，要求其记录其在此时间段期间经历的任何症状，包括：注射位点反应，诸如疼痛、发红(红斑)、肿胀(水肿/硬结)及搔痒(搔痒症)；一般身体症状，诸如头痛、肌肉疼痛(肌痛)、疲劳(疲乏)、身体皮疹、恶心及呕吐(次数)；及其它症状。要求个体将其日记带至各访视点，由研究者或其指派者在访视期间审查。
临床实验室评价
临床实验室评价由血液学、血清化学及尿分析组成。在筛选时及在第0天(给药前)、第7、14、28天(给药前)、第35、42及56天进行血液学、血清化学及尿分析。测试参数列举于表14中。
表14.临床实验室、尿分析及其它测试的清单
Figure BDA0001342303280000881
*获自女性的被鳞状上皮细胞污染的清洁收集尿分析可重复进行以获得不含鳞
状上皮细胞的清洁试样。对于女性而言，记录个体在样品收集时是否月经。
要求所有女性个体在筛选时及在第0天及第28天投与研究性产品之前具有阴性的尿液妊娠测试结果。第56天重复进行尿液妊娠测试。任何阳性测试结果均相应地进行随访。
在筛选参与研究时，要求所有个体对于滥用药物(可卡因、鸦片剂、大麻素及安非他明)具有阴性测试结果。另外，第0天及第28天给药之前进行此测试。任何阳性测试结果均向适当当局报导。
第0天(给药前)、第14、28天(给药前)、第42及56天获得血液样品，用于量测针对EV71的中和抗体含量。藉由量测第84天及第196天所得的样品中的中和抗体含量来评估较长术语免疫原性。功效终点包括：基于初打疫苗接种之后第14、28、42及56天的中和抗体效价的几何平均中和抗体效价(GMT)；量测针对EV71的中和效价相对于基线的增加倍数；及免疫反应耐久性，如根据加打疫苗接种之后的2个月(第84天)及6个月(第196天)时的针对EV71的中和抗体及GMT所评估。
数据质量及保证
藉由根据源文献检验及交叉检查个案报告表(Case Report Forms，CRF)(源资料检验)来保证准确且可靠的资料收集。将所收集的资料输入电子数据库且在数据库锁定的前进行品质保证检查。
在研究期间，定期对研究现场进行监测访视以确保依循方案的所有方面。主持人员或其指派者(研究监测者)接触且访视研究者且允许在请求时检验各种研究相关记录及源文献，其限制条件为根据本地要求维持个体机密性。源文献定义为原始文献、资料及记录，包括(但不限于)研究者档案、研究用药、个体记录、知情同意文件以及CRF及相关文献的审查。
监测者的责任为在整个研究中每隔一定时间检验CRF，以验证对方案的依循及输入其中的资料的完整性、一致性及准确性。监测者存取实验室测试报导及为验证CRF输入项所需的其它记录。重要的是，在监测访视期间，研究者及其它研究人员为可获得的，且有足够的时间致力于该程序以确保在此等监测访视期间内所侦测的任何问题均得到解决。
研究现场亦可由主持者或由独立稽核员进行品质保证稽核，以验证研究已根据方案、GCP、ICH要求及适用法规进行。在此类情形中，主持者所指定的稽核员预先接触现场以安排稽核性访视。稽核员可请求访视收集实验室样品、储存及制备药物的机构，及研究期间所用的任何其它机构。另外，存在此研究已经国家或国际监管机构稽核的可能性。若任何监管机构为了检验而接触研究现场，则应立即告知主持者。允许研究者在检验及稽核期间直接存取研究文献。
数据库锁定之前，由Copper Rock Research,Inc.编制研究统计分析计划(SAP)。其包括以下规范。
安全群体由以下组成：接受至少一次剂量的研究疫苗及其给药后安全资料已获得的所有随机分组个体。根据实际上接受的疗法来分析个体。
全分析组是由以下组成：接受至少一次剂量的研究疫苗及已收到就免疫原性而言有效的给药前及给药后血液样品的所有随机分组个体。根据随机分组所指定的疗法来分析个体，不论其实际上所接受的疗法。
符合方案群是由以下组成：在数据库锁定之前未发生所定义的任何重大方案违规的情况下完成研究的所有随机分组个体。个体是根据其实际上接受的疗法来分析。募集、配置及重要方案偏离的概述向所有随机分组个体呈现。人口统计、基线特征及安全资料的概述是基于安全群体。免疫原性资料的概述是基于全分析组以及符合方案群。数据清单显示所有随机分组个体的所有可获得资料。
个体配置的概述显示经随机分组、接受研究疫苗、完成研究或中断的个体的数目。此概述中亦包括个体中断，其显示根据研究终止/中断的原因未完成研究的个体的数目。各分析组中所包括的个体的数目及百分比的概述为所有随机分组个体的治疗组的概述。亦提供个体清单及自任何分析组排除的原因。个体配置、随机分组排除情况及理由、治疗组分配、分析组纳入及排除理由，以及研究完成情况及较早终止理由，均呈现于数据清单中。
记录在研究期间所报导的重要方案偏离。重要方案偏离(IPD)定义为可潜在影响研究结论的偏离。研究数据库锁定之前，审查方案偏离且鉴别IPD。此等IPD概述于数据清单中。医疗史呈现于数据清单中。
人口统计资料(年龄、性别及人种)及基线特征(身高、体重、身体质量指数[BMI])是利用描述性统计学及频率表来概述。
藉由使用对数转换计算各研究日的GMT来概述针对EV71的中和抗体，且求其幂函数以恢复为原始单位用于报导目的。描述性统计学包括个体数目(n)、几何平均值，及几何平均值的95％信赖区间。
使用未转换效价值，藉由将基线后各研究日的效价值除以基线值来计算各研究日的针对EV71的中和抗体效价相对于基线的增加倍数。使用描述性统计学来概述研究日及治疗组的相对于基线的增加倍数。另外，概述在各研究日达成血清转化(定义为相对于基线的四倍增幅)的个体的数目及百分比。提供在首次疫苗接种之后的任何时间达成血清转化的个体的数目及百分比的总体概述。藉由重复进行上述分析，根据几何平均中和抗体效价(GMT)、相对于基线的增加倍数以及加打疫苗接种之后2个月(研究第84天)及6个月(研究第196天)的血清转化百分比来评估免疫反应的持久性。
根据MedDRA(12.0版)系统器官类别(SOC)及较佳术语分类的治疗引发的未请求不良事件列举且概述于频率表中。频率表包括事件数目、经历各事件一或多次的独特个体的数目，及治疗组中经历各事件一或多次的个体的百分比。亦提供与研究药物有关的不良事件(AE)的频率表。
亦根据最大强度经历事件的个体的数目及百分比对不良事件进行列表。在根据最大强度所列的表中，根据相同较佳术语编码的事件超过一个的个体是根据最严重事件分类。各不良事件的持续时间是以AE终止日期-AE起始日期+1来计算。持续时间是根据SOC、较佳术语及疗法、使用描述性统计学来概述。严重AE、死亡及导致过早中断研究的AE呈现于数据清单中。
请求性不良事件是根据疫苗接种剂量(首次或第二次)及治疗组来概述。此等频率表包括事件数目、经历各事件一或多次的独特个体的数目，及各疫苗接种剂量及治疗组中的经历各事件一或多次的个体的百分比。百分比的分母为相关概述表中的接受疫苗接种剂量的个体数目。请求AE亦根据最高强度来概述。在此表中，经历AE多次的个体是根据最密集的AE来分类。
在每个14天随访时段期间报导的各症状累积天数是根据症状、治疗组及疫苗接种剂量、使用描述性统计学来概述。各随访时段的第14天所报导的任何症状均呈现于单独的数据清单中。个体日记的其它项目，包括口腔温度、发红及肿胀的大小、呕吐次数及疫苗耐受性的总体评估，均根据疫苗接种剂量及治疗组来概述。个体症状日记(包括个体所报导的请求AE及任何其它症状及评论)显示于数据清单中。
使用频率表概述疼痛、压痛、红斑/发红、硬结/肿胀、及搔痒症/搔痒的注射位点反应，频率表显示在各研究日及时间点经历各反应(根据严重度等级)的个体的数目及百分比。两位守望个体在研究第1天及第2天所记录的注射位点反应未概述，但显示于数据清单中。两位守望个体在所有其它研究日所记录的注射位点反应包括于概述表中，概述表是根据疫苗接种剂量及治疗组来概述。
身体检查结果(正常、异常)是根据身体系统及研究日而概述于频率表中。
描述性统计学(例如N、平均值、SD、最小值、中值、最大值)的两个概述表呈现所观测的生命体征资料。第一个表包括各研究日至第196天针对口腔温度(℃)、脉动速率(每分钟跳动数)、呼吸速率(每分钟呼吸)及血压(收缩压及舒张压，mmHg)所观测的描述性统计学之值的概述。
第二概述表包括上文提及的生命体征参数在基线观测值相对于各给药日的各剂量后时间点(直至第196天)的变化的描述性统计学概述。两位守望个体在研究第1天及第2天所记录的生命体征未如上文所述概述，但显示于数据清单中。所有其它研究日的守望个体资料包括于概述表中。筛选时所进行的12引线ECG结果的结果仅呈现于数据清单中。
血液学及临床化学观测资料是根据研究日及治疗组的观测值及相对于基线的变化、使用描述性统计学(平均值、SD、中值、最小值及最大值)来概述。血液学、临床化学及尿分析资料亦概述于比较毒性等级相对于基线的转移的转移表中。
所有其它临床实验室资料仅呈现于数据清单中。在所有实验室数据清单中，若指定参数有正常范围可供利用，则该正常范围包括于清单中。另外，超出范围值是用「L」或「H」(分别为小于正常值下限或大于正常值上限)标记。清单亦提供毒性等级、相对于基线的最大等级转移及相对于基线的结果变化。若重复进行血液学或临床化学测试，则统计学概述中使用得自初始预定集合的值。所有值均包括于数据清单中。
第一剂量的研究疫苗之前停止的用药视为先前用药。第一剂量的研究疫苗之前开始且持续至研究的用药，或始于第一剂量的研究疫苗或第一剂量的研究疫苗之后的用药，是以伴随用药报导。先前用药及伴随用药是由个体呈现于单独的数据清单中。
以下其它资料仅作为数据清单、由个体呈现：纳入及排除标准、随机分组及知情同意书、研究药物投与、评论日志，及日志完成核验。
此研究为探索性试验，以评估使用两种剂量水准的不活化EV71疫苗在健康成人中进行疫苗接种的短期安全性及耐受性及免疫原性。因此，此研究不旨在侦测潜在安全性及免疫原性资料在各处理组之间的任何差异。为了提供关于安全及耐受性的早期资料，样品大小选36，以提供得自最少数目个个体的资料。
募集总共36位个体加入研究。36位个体中有35位依计划完成研究(亦即完成直至第56天的研究)且依计划接受两种剂量的研究性产物。高剂量组中的一位个体由于第一剂量之后的投药而撤回知情同意书。
方案偏离清单获自研究监测者在现场所得的观测结果及对研究数据库的审查。36位个体中有28位报导有方案偏离。方案偏离的大部分与合格性偏离及后期个体访视相关。
功效评价
所有个体包括于安全群体、全分析组及符合方案群体中，且因此使用所有个体的所有资料集进行分析。对此研究中所获得的功效资料不进行正式的统计学分析。对于自研究早期退出的任何个体而言，在早期终止访视时所收集的所有免疫原性及安全资料自概述表中排除，但呈现于数据清单中。
各剂量组的性别、年龄、身高、体重及BMI的平均人口统计资料的概述呈现于表15中。
表15.平均(SD)人口统计资料的概述
Figure BDA0001342303280000921
Figure BDA0001342303280000931
研究中募集的所有个体均为亚洲人。整个处理组的个体在年龄、身高、体重及BMI方面均为良好匹配的。适应性EV71疫苗组的平均年龄为31-34岁且安慰剂组的平均年龄为30-31岁。所有处理组的BMI范围为22.5-23.8。适应性EV71疫苗剂量组的个体在性别方面的匹配为相对良好的。安慰剂组中的男性个体比例较高。筛选时记录医疗史。此研究中的目标群体为健康成人。研究中募集的个体在筛选时不具有临床上任何显著的持续医疗史。在筛选时进行标准的12引线ECG。所有个体在募集加入研究之前具有正常ECG。在筛选时量测EV71倒数中和抗体效价的水准且呈现于表16中。
表16.筛选时的EV71倒数中和抗体效价
Figure BDA0001342303280000932
如表16中所示，在低剂量组中，大部分个体(72.2％)在筛选时具有具有低含量的EV71中和抗体，其中6位(33.3％)个体的倒数EV71效价为8，5位(27.8％)个体的倒数EV71效价为16且2位(11.1％)个体的倒数EV71效价为32。类似地，在高剂量组中，大部分个体在筛选时具有低含量的EV71中和抗体，其中2位(11.1％)个体的倒数EV71效价为<8，5位(27.8％)个体的倒数EV71效价为8，2位(11.1％)个体的倒数EV71效价为16且3位(16.7％)个体的倒数EV71效价为32。
利用在第0天(给药前)、第14、28天(给药前)、第42、56、84及196天获得的血液样品制备血清，用于分析EV71中和抗体含量。免疫原性数据是在下表17中以GMT及GMT增加倍数及血清转化率呈现。
表17.EV71中和抗体效价的几何平均值的概述
Figure BDA0001342303280000941
aGMT(95％ CI)＝几何平均效价(95％信赖区间)
在低剂量组与高剂量组中，以GMT呈现的EV71中和抗体含量在第42天(第二剂量之后的14天)均为最高的。在低剂量组中，在一次剂量的适应性EV71疫苗之后，GMT自20.2提高至给药后14天时的128.0。第二剂量之后，GMT自80.6(第28天；给药前)提高至在疫苗接种后14天(第42天)时的322.5。虽然GMT在第56天至第196天时稍微降低(分别为203.2及80.6)，但其在第二剂量之后的长达6个月仍然较高且为基线值的约四倍。在研究期间所分析的所有时间点，安慰剂组中的GMT类似于基线值。
类似地，在高剂量组中，在一次剂量的适应性EV71疫苗之后，GMT自第0天时(给药前)的28.5提高至疫苗接种后第14天的143.7。第二剂量之后，GMT自99.5(第28天；给药前)提高至在疫苗接种后14天(第42天)时的451.4。虽然GMT在第56天至第196天时稍微降低(分别为203.2及145.2)，但其在第二剂量之后的长达6个月仍然较高且为基线值的至少五倍。在研究期间所分析的所有时间点，安慰剂组中的GMT类似于基线值。
在各研究日计算GMT随时间增加的量值(以针对EV71的中和抗体效价相对于基线(第0天)的增加倍数表示)且使用描述性统计学概述。表18提供各处理组之间的GMT随时间的增加倍数的概述。
表18.平均(SD)中和抗体效价的概述：相对于基线的增加倍数
Figure BDA0001342303280000951
如表18中所示，第28天至第196天，观测到高剂量组的GMT增幅(以相对于基线的增加倍数表示)高于低剂量组。第42天观测到低剂量组与高剂量组均出现最大的GMT增幅，其中效价相较于第0天分别出现23倍及32倍增幅。第42天的高抗体含量可藉由在第28天给予的加打剂量的适应性EV71疫苗来解释。在安慰剂组中，GMT增幅最小。
血清转化定义为至少4倍的基线后抗体效价增幅。血清转化率(SCR)的概述呈现于表19中。总体研究SCR定义为在研究的任何时间点实现血清转化的个体的百分比。
表19.血清转化率的概述
Figure BDA0001342303280000961
此等结果证明，在第14、28、42、56及84天，在适应性EV71疫苗低剂量组与高剂量组之间，达成血清转化的个体百分比相似。第196天，高剂量组中实现血清转化的个体百分比高于低剂量组(分别为81.8％相对于58.3％)。低剂量安慰剂组中的个体在研究期间的任何时间均未实现血清转化。高剂量安慰剂组中一位个体在第84天实现血清转化，然而安慰剂组的GMT在直至第196天的整个研究期间仍为较低的。
对于自研究早期较早退出的个体而言，在早期终止访视时所收集的所有免疫原性及安全资料自概述表中排除，但呈现于数据清单中。缺失值定义为空白、未知、未进行CRF或对CRF不适用的值。除非相同评估存在筛选措施，否则不估算缺失基线评估，且在第一剂量的研究疫苗的日期之前的42天内进行筛选访视。不估算在预定访视时缺失的免疫原性终点。低于侦测极限的针对EV71的中和抗体效价报导为<8。此等效价设定等于8以用于分析目的。数据清单在适用情况下显示该资料为「<8」。出于确立与研究疗法相关的事件时间的目的，估算未请求AE及伴随用药的缺失日期。所有数据清单显示所估算日期，而非如CRF上所报导的资料。对免疫原性资料进行三次非盲中期分析。
免疫原性结论
此研究的另一个目标为藉由量测在整个研究中的不同时间点所收集的血清中的EV71中和抗体含量来评估适应性EV71疫苗的免疫原性。
高剂量组中所观测的GMT高于低剂量组。在低剂量组与高剂量组中，依据中和效价所观测的免疫反应依循类似模式，其中在第一剂量后14天(第14天)及第二剂量后14天(第42天)观测到GMT增加。第42天观测到两个剂量组中均出现最高GMT。两个剂量组的GMT自第56天至第196天随时间稍微降低；然而，其在此期间仍然充分高于基线值。两个安慰剂组(低剂量与高剂量)的GMT在整个研究期间中保持在基线水准。
第14、28、42、56及84天，在高剂量组与低剂量组之间，血清转化(定义为EV71中和抗体的含量相对于基线增加≥4倍)相似。第196天，高剂量组中实现血清转化的个体百分比高于低剂量组(分别为81.8％相对于58.3％)。低剂量组及高剂量组中的所有个体在第42天(第二剂量之后的14天)实现血清转化。安慰剂组中一位个体在第84天实现血清转化，然而安慰剂组的GMT在直至第196天的整个研究期间仍为较低的。
概言之，高剂量组中所观测的GMT高于低剂量组。在低剂量组与高剂量组中，依据中和效价所观测的免疫反应依循类似模式。第42天观测到两个剂量组中均出现最高GMT。低剂量组及高剂量组中的所有个体在第42天(第二剂量之后的14天)实现血清转化且高剂量组与低剂量组之间的血清转化率相似。两个剂量组的GMT自第56天至第196天随时间稍微降低；然而，其在此期间仍然充分高于基线值。
安全评价
安全分析中包括总共36位个体。36位个体中有35位接受两次剂量(第0天及第28天)的适应性EV71疫苗。高剂量组中的分配适应性EV71疫苗的个体147由于收回同意书而未接受第二剂量。
横跨两个剂量组的36位个体中有22位报导总共42个AE(直至第56天)。在低剂量组中，18位个体中有11位报导总共22个AE。在高剂量组中，18位个体中有11位报导总共20个AE。
除一个事件的严重度为中度(痔疮)之外，所有AE的严重度均被认为是轻度。仅两个事件被认为与研究性产物相关。两个事件均发生于低剂量组的随机分入安慰剂组的个体中。此等个体的一经历肌骨胳僵硬，且其它个体经历头痛。
最常报导的不良事件属于『呼吸、胸部及纵隔病症』的系统器官类别且包括咳嗽、流鼻涕及口咽疼痛。此研究中无显著不良事件(SAE)报导。无个体因AE而退出研究。所有处理组中发生的最常报导的AE呈现于表20中。
表20.不良事件的概述
Figure BDA0001342303280000981
Figure BDA0001342303280000991
来自「呼吸、胸部及纵隔病症」的系统器官类别的不良事件为高剂量组与低剂量组中最常报导的事件。此系统器官类别中最常报导的AE为咳嗽及口咽疼痛，其中在低剂量组中的发生率最大，两个事件在3位(25％)个体中均观测到。低剂量安慰剂组中的一位个体(17％)亦报导有咳嗽。在高剂量组中，无个体报导口咽疼痛且仅1位(8％)个体报导咳嗽。高剂量组中仅观测到流鼻涕。适应性EV71疫苗组中有2位(17％)个体且安慰剂组有2位(33％)个体经历此事件。
最常报导的AE归类于「胃肠病症」的系统器官类别内。此等AE在高剂量组中报导的频率最大：4位(33％)个体，相比之下，低剂量组中为1位(8％)个体且安慰剂组中无一者。高剂量组中的胃肠病症包括腹胀、胃食道逆流病、痔疮、口腔溃疡及呕吐。在低剂量组中，一位个体经历上部腹痛及腹泻。
一般病症及投药位点病状在高剂量组中报导的频率最大：3位(25％)，相比之下，低剂量组中为1位(8％)个体。在低剂量组中，适应性EV71疫苗组中有1位(8％)个体且安慰剂组中有1位(17％)个体经历发热。在高剂量组中，2位(17％)个体报导发热。
除经历一个中度严重度事件之外，所有AE的严重度为轻度。该事件为痔疮，其发生于第一次疫苗接种之后的8天且持续2天。
若不良事件被认为是明确地或可能与研究性产物的投与相关，则认为不良事件为相关的。仅存在2个不良事件被认为与研究性产物投与相关，两位个体均属于低剂量组且分配至安慰剂组。事件为颈部僵硬及头痛。两个事件的严重度为轻度。
评价注射位点在第0天(疫苗接种后的5、30及60分钟)、第3、7、14天、第28天(疫苗接种后的5、30及60分钟)、第31、35及42天出现的疼痛、压痛、红斑、硬结及搔痒症。
表21及22提供具有注射位点反应的个体数目的概述。由研究者进行评估且各症状使用以下等级：1级(轻度)、2级(中度)、3级(重度)或4级(威胁生命)。疼痛、压痛及搔痒症是根据症状严重度分级，而红斑及硬结是根据影响区域的大小分级(1级＝2.5-5cm；2级＝5.1-10cm；3级＝>10cm；4级＝坏死)。
表21.第一剂量之后的注射位点反应
Figure BDA0001342303280001001
a评估第0天给药后5、30及60分钟时的注射位点；b一位个体未完成第14天的评估。
表22.第二剂量之后的注射位点反应
Figure BDA0001342303280001002
Figure BDA0001342303280001011
a评估第0天给药后5、30及60分钟时的注射位点；b一位个体在第28天之前退出；
c一位个体未完成第31天评估；d一位个体未完成第35天评估
总体而言，存在几个注射位点反应报导。任何治疗组(适应性EV71疫苗或安慰剂)中至多仅一位个体在指定评估时间点报导任何症状。适应性EV71疫苗组与安慰剂组之间或低剂量组与高剂量组之间或第一剂量与第二剂量之间不存在反应频率的差异。
利用个体日记收集请求性不良事件。要求个体完成日记，该日记始于各疫苗接种日且其后持续14天(第0天至第14天及第28天至第42天)。应注意，此等事件为除未请求事件之外的事件。表23提供个体日记中捕捉的所记录症状的概述。
表23.日记症状的概述
Figure BDA0001342303280001012
Figure BDA0001342303280001021
个体日记中捕捉频率最大的事件为注射位点的疼痛。各治疗组之间的发生率相似，且据报导，适应性EV71疫苗低剂量组中有10位(83％)个体发生且适应性EV71疫苗高剂量组中有9位(75％)个体发生。低剂量与高剂量安慰剂组中经历注射位点的疼痛的个体较少：低剂量安慰剂组中有2位(33％)个体且高剂量安慰剂组中有1位(17％)个体。
在适应性EV71疫苗低剂量组与高剂量组之间，肌肉疼痛及疲劳的发生率亦相似。相较于适应性EV71疫苗治疗组，两个安慰剂组中经历肌肉疼痛及疲劳的个体较少。适应性EV71疫苗高剂量组中有4位(33％)个体报导头痛，相比之下，适应性EV71疫苗低剂量组中有1位(8％)个体报导头痛。各安慰剂组中有一位个体1(17％)经历头痛。惟适应性EV71疫苗高剂量组(4位[33％]个体)报导注射位点的水肿。类似地，惟适应性EV71疫苗高剂量组个体报导恶心(2位[17％]个体)。
在低剂量组与高剂量组之间，注射位点的搔痒症及红斑的发生率相同(各组中有1位[8％]个体报导)，但安慰剂组个体无报导。概言之，高剂量及低剂量治疗组所记录日记的症状数目大于安慰剂组。
对研究组中少数者出现的不良事件频率或严重度进行非正式的统计学分析。在此研究期间无死亡或SAE报导。
实验室参数的评价
各实验室参数的毒性等级是使用不良事件的常见术语标准(Common TerminologyCriteria for Adverse Events，CTCAE)第4版(2009)或食品与药物管理局(FDA)行业导引：预防性疫苗临床试验中所募集的健康成人及青少年自愿者的毒性分级量表(Food andDrug Administration(FDA)Guidance for Industry:Toxicity Grading Scale forHealthy Adult and Adolescent Volunteers Enrolled in Preventive VaccineClinical Trials)(2007年9月)来确定。对第0天后的所有毒性等级与基线等级进行比较且分析毒性等级的任何变化或转移。
相较于适应性EV71疫苗高剂量组，适应性EV71疫苗低剂量组个体经历的血清化学值相对于基线的变化频繁。在低剂量组中，葡萄糖增加为最常报导的事件，继的为钾减少、钠增加及葡萄糖减少。在高剂量组中，葡萄糖增加及减少为最常报导的值转移。大部分变化为1级或2级。
此研究中仅报导一个4级变化：葡萄糖增加。此个体随机分入适应性EV71疫苗低剂量组。此个体在第0天时，葡萄糖含量较低：3.5mmol/L(正常范围4-7.8mmol/L)，且在第7天与第35天之间恢复至正常限值内，且再次下降至3.4mmol/L而低于正常范围。第56天，葡萄糖含量显著提高至8.8mmol/L。第56天相较于第0天的总体变化导致在此时间段期间发生4级转移。此事件未作为不良事件加以报导且未被研究者视为临床上显著的。
血红蛋白发生的最显著血液学变化减少。高剂量组与低剂量组中均观测到血红蛋白出现相似的值转移频率(主要为1级)。尿分析中最常报导之值变化为泌尿红血球的存在的变化。适应性EV71疫苗高剂量组与安慰剂剂量组与适应性EV71疫苗低剂量组中均注意到此等1级变化。血清化学、血液学及尿分析的最常报导值相对于基线的转移的概述呈现于表24中[报导疫苗(V)与安慰剂(P)组的此等转移]。
表24.常报导值相对于基线转移的概述
Figure BDA0001342303280001031
*实验室结果，其中标注任何剂量组中之大于20％个体的值
评估直至第196天之整个研究中的生命体征，包括温度、脉动速率、呼吸速率及血压(收缩压及舒张压)。对于所记录的任一种生命体征而言，临床上无显著发现。脉动速率、呼吸速率及血压随时间相对保持恒定且各治疗组之间未观测到有差异。对温度随时间发生的相对于基线的变化的审查证明，观测到适应性EV71疫苗高剂量组在第0天(亦即大于0.5℃)、给药后5及30分钟出现稍微较大的增幅(平均变化分别为0.53℃及0.55℃)；相比之下，在相同时间点，低剂量组的平均增幅为0.29℃及0.24℃，安慰剂低剂量组的平均增幅为0.25℃及0.37℃且安慰剂高剂量组的平均增幅为0.25℃及0.48℃。
在筛选时由研究者或其指派者对各个体进行全面身体检查，随后在第0天及第28天及第56天投与疫苗。第56天，适应性EV71疫苗低剂量组的个体仅存在一个异常身体发现(耳、鼻、喉及颈)，其随后作为不良事件扁桃腺炎加以报导。任一个体在任何时间点均无其它显著身体发现的报导。
安全性结论
横跨两个剂量组的36位个体中有23位报导总共42个AE(直至第56天)。在低剂量组中，18位个体中有12位报导总共22个AE。在高剂量组中，18位个体中有11位报导总共20个AE。
除一个中度严重度的事件之外，所有AE的严重度视为轻度。仅两个事件被认为与研究性产物相关，两者均发生于低剂量组中。一位个体经历肌骨胳僵硬，且另一个体经历头痛。两位个体随机分入安慰剂组。最常报导的AE为咳嗽、流鼻涕、发热及口咽疼痛。
注射位点反应的发生率较低，其中在任一时间点经历反应的个体至多为17％。注射位点反应最常发现于初打剂量与加打剂量(第0天及第28天)的疫苗接种之后的60分钟内。适应性EV71疫苗组与安慰剂组之间或低剂量组与高剂量组之间或初打剂量与加打剂量之间不存在反应频率的差异。
低剂量组中经历相对于基线之值转移的个体多于高剂量组。葡萄糖增加为最常报导的血清化学变化。亦观测到血液学及尿分析参数的值变化。低剂量组与高剂量组之间的发生率相似。无一个值变化作为不良事件报导或被认为是临床上显著的。
第56天(适应性EV71疫苗低剂量组)，存在仅一个异常身体发现(耳、鼻、喉及颈)，其随后作为不良事件扁桃腺炎报导。任一个体在任何时间点均无其它显著身体发现的报导。概言之，低剂量水准与高剂量水准下的适应性EV71疫苗被认为是安全及良好耐受的。
总体结论
此为适应性EV71疫苗的首次人类研究。此研究的一个目标为评估适应性EV71疫苗在健康成人中的安全性及耐受性。希望低剂量组合物提供对适应性EV71疫苗安全性的初始评估。
审查AE证明，治疗组之间、剂量组之间及第一剂量与第二剂量之间的AE发生率相似。除一个中度严重度的事件之外，所有AE的严重度视为轻度。仅两个事件被认为与研究性产物相关。低剂量组中发生的事件肌骨胳僵硬及头痛的严重度均为轻度的且接受安慰剂的两位个体均有报导。
所有剂量组及治疗组的注射位点反应的发生率相似且为最小的，其中在任一时间点经历反应的个体仅为17％。大部分注射位点反应发生于初打剂量与加打剂量(第0天及第28天)的疫苗接种之后的60分钟内。实验室参数值的所观测变化无一者作为不良事件报导或被研究者认为是临床上显著的。
此研究的另一目标为评估适应性EV71疫苗的免疫原性，此藉由量测在研究期间的不同时间所收集的血清中的EV71中和抗体含量来达成。高剂量组中所观测的GMT高于低剂量组。在低剂量组与高剂量组中，依据中和效价所观测的免疫反应依循类似模式。第42天观测到两个剂量组中均出现最高GMT。低剂量组及高剂量组中的所有个体在第42天(第二剂量之后的14天)实现血清转化且高剂量组与低剂量组之间的血清转化率相似。两个剂量组的GMT自第56天至第196天随时间稍微降低；然而，其在此期间仍然充分高于基线值。
概言之，低剂量水准与高剂量水准下的适应性EV71疫苗被认为是安全及良好耐受的。在低剂量与高剂量水准下投与一次及两次剂量的适应性EV71疫苗之后，就EV71中和效价及血清转化而言观测到良好的免疫反应(持续至第196天)。
实例9：CVA6在Vero细胞中的适应
藉由使源病毒在Vero细胞中继代11次来进行CVA6的适应。类似于实例1中所述的适应方案，对CVA6使用两轮转染。然而，由于CVA6在Vero细胞中未形成空斑，因此在两轮转染之后，藉由限制稀释法进行两轮选殖。
针对不同继代次数的适应性病毒进行的TCID50中和分析的结果显示于表25中。
表25.CVA6的适应
Figure BDA0001342303280001051
Figure BDA0001342303280001061
CVA6P-11病毒引起整个单层发生广泛的细胞圆化，但未使Vero细胞展现明显的CPE。使用CVA6P-11进行将来的再衍生化及纯系选择。
适应性CVA6的全长基因组的测序
一个冷冻-解冻循环之后，自经澄清的收集物纯化RNA。藉由RT-PCR，自RNA扩增4个涵盖全长基因组的DNA片段(图6)。
在UW-Biotech中心，藉由Sanger的循环测序方法进行测序。使用DNAstar(Laser基因)软件组装序列且在PubMed使用BLAST程序进行比较。在CVA6P-0与CVA6P-11之间发现总共21个核苷酸变化(图7)。
表26.CVA6:P-0相对于P-11的全长基因组的测序
Figure BDA0001342303280001062
Figure BDA0001342303280001071
5'UTR区域中丛集了较高数目个变化(9个核苷酸)(表26)。适应性CVA6株系中所鉴别的九个核酸取代位于5'未转译区(UTR)的位置1、13、14、15、16、21、23、34及40。在VP1蛋白质中观测到最高数目个氨基酸突变(4)。四个氨基酸取代及其在SEQ ID NO:2内的相应位置显示于上表26中。基于测序结果，CVA6P-11的VP1蛋白质中的所有氨基酸突变(46A-V、90E-K、96T-A、268V-I)为独特的且未在任何流行株系中发现(图7)。在VP2及VP3蛋白质中的每一者中观测到一个突变。所测试的所有野外分离株及CVA6已完成此等氨基酸的保守性。因此，在Vero细胞中的适应产生此等突变。在位置5、10、14、33、98、160、174、194、261、279、283、305，CVA6P-0及P-11具有相同序列，但不同于野外分离株。野外分离株n28297及n40428的序列在位置：98、160、174及194与CVA6P-0及P-11相似。
实例10：CVA16在Vero细胞中的适应
藉由使源病毒在Vero细胞中继代3次来进行CVA16的适应。类似于实例1中所述的适应方案，在Vero细胞中适应之后，萃取RNA且藉由将RNA转染至Vero细胞中连续两次来使病毒再衍生化。接着经由两轮空斑纯化来分离单一病毒纯系。针对不同继代次数的适应性病毒进行的TCID50中和分析的结果显示于表27中。类似于适应性EV71病毒，适应性CVA16P-3病毒使Vero细胞展现广泛的CPE。CVA16P-3用于将来的再衍生化及纯系选择。
表27.CVA16株系在Vero细胞中的适应
Figure BDA0001342303280001072
适应性CVA16的全长基因组的测序
用于对适应性CVA16基因组进行测序的引子显示于图8中。藉由RT-PCR扩增涵盖全长基因组的DNA片段(图9)。CVA16P-0与CVA16P-3之间发现总共6个核苷酸变化。四个氨基酸取代及其在SEQ ID NO:5-7内的相应位置(2A对应于SEQ ID NO:5，VP2对应于SEQ ID NO:6，且VP1对应于SEQ ID NO:7)显示于下表28中。
表28.CVA16:P-0相对于P-3的全长基因组的测序
Figure BDA0001342303280001081
在适应性CVA16病毒的5UTR区域中，在位置6及33鉴别出两个核酸取代(表28)。另外，在VP1蛋白质中的位置99及145鉴别出两个氨基酸取代，在VP2蛋白质中的位置161鉴别出一个氨基酸取代，且在2A蛋白质中的位置2鉴别出一个氨基酸取代(表28)。所得P3病毒的VP1蛋白质中的两个突变存在于流行株系中，而VP2及2A多肽中的突变为独特的且不存在于流行株系中(图10)。基于VP1基因的系谱分类(图11)，CVA16株系归类为基因组C。
实例11：针对其它CVA16分离株的抗CVA16抗体的交叉反应性
将不活化CVA16疫苗接种后第42天所收集的血清样品合并且藉由微量中和分析进行测试。针对CVA16产生的抗体有效地中和其它CVA16分离株(表29)。
表29.针对其它CVA16分离株的抗CVA16/P-0抗体的交叉反应性
Figure BDA0001342303280001082
实例12：Vero适应性病毒的抗原稳定性
用不活化CVA16(P-0)或CVA6(P-0)连同明矾一起接种小鼠。将两次免疫接种(第0天、第28天)之后所收集的血清样品合并且使用基于TCID50的习知分析来测试中和抗体效价(表30)。在适应性病毒与未适应病毒之间，未观测到中和效价存在显著差异，表明对抗原性无影响。
表30.Vero适应性病毒的抗原稳定性。
Figure BDA0001342303280001091
实例13：适应性CVA6及CVA16株系的再衍生化及选殖
适应性CVA6及CVA16株系自经纯化的病毒RNA、经由两轮转染而再衍生化。经适应性CVA6(P11)及CVA16(P3)转染的细胞在收集日、在-80℃冷冻，解冻，澄清且等分试样。将一个等分试样解冻且针对病毒效价进行滴定。病毒效价结果显示于表31中。CVA6及CVA16在经病毒RNA转染的Vero细胞中所显现的细胞病变效应显示于图12中。
表31.CVA6及CVA16自经纯化RNA的再衍生化
Figure BDA0001342303280001092
藉由限制稀释法选殖CVA6
使用限制稀释技术制备适应性CVA6主病毒种原。对病毒进行连续稀释且鉴别支持病毒生长的最后一个孔。在Vero细胞中培育14天之后，将细胞及上清液冷冻。如下鉴别阳性孔：将细胞溶胞物转移至RD细胞中，培育4-5天，且随后自对Vero细胞中的病毒CPE呈阳性的孔中扩增病毒。病毒效价定量之后，选择纯系1B7、1C3、1G3及2D6进行第二轮限制稀释。选择纯系1B7F3及2D6G4进行第三轮限制稀释。将来自此等纯系的病毒扩增，定量且藉由第三轮限制稀释来进一步选殖。限制稀释技术的图标显示于图13A-13C中。Vero及RD细胞中的RNA再衍生CVA6的效价的比较显示于图14中。RD细胞及Vero细胞的病毒效价计算值不同。重复进行限制稀释，其中已知TCID50值是藉由Vero细胞中的病毒滴定来计算。已完成两轮限制稀释。扩增之后，基于病毒效价来选择纯系且生长以制备储备液用于表征。
藉由空斑纯化选殖CVA16
Vero细胞用适应性CVA16病毒的10倍稀释液感染且用含有0.5％Sea Plaque琼脂糖的无血清培养基覆盖。感染后第4-5天挑选空斑且在37摄氏度(degrees Celsius)下培育24小时。藉由接种250/750μl量的Vero细胞来扩增病毒且当CPE为90-100％时收集。在4摄氏度下核酸酶处理隔夜之后，将病毒等分试样且在-85摄氏度下储存。进行两轮空斑纯化，如图15A-15B中所示。相较于上述P-3病毒，所选殖CVA16(纯系1-250)未显示VP1蛋白质中有任何氨基酸变化，如图16中所示。进一步表征适应性CVA16病毒且用于制备pre-MVS，如实例1中针对适应性EV71病毒所述。
实例14：三价HFMD疫苗的免疫原性
以下实例证明不活化EV71、CVA6及CVA16三价HFMD疫苗在成年小鼠中的功效。主动免疫接种与被动转移研究均使用成年小鼠进行。
如实例1-14中所述调配不活化单价EV71、CA6及CA16疫苗。三种单价疫苗以1:1:1的比率组合以产生不活化三价疫苗。不活化单价疫苗中的每一者用作对照物。此实例所述的研究中使用成年A129(α/β干扰素(IFN)受体缺乏)及AG129(α/β，γIFN受体缺乏)小鼠。
免疫接种单价疫苗之后的血清交叉中和潜力
AG129小鼠群组在第0天及第28天接种1.5μg EV71、CVA16或CVA6单价疫苗。将疫苗接种后第42天收集的血清根据群组合并且藉由针对各病毒的微量中和分析进行测试。结果描绘于表32中。
表32
Figure BDA0001342303280001101
表32中的结果表明，未观测到所测试病毒之间存在交叉中和。
HFMD疫苗的免疫原性
AG129小鼠在第0天及第28天接种1.5μg单价疫苗的一或1.5μg EV71、CVA6及CVA16中的每一者的三价混合物。第42天自小鼠收集血清样品。三价免疫血清是针对EV71、CVA16及CVA6加以测试。各单价免疫血清是针对其同源病毒加以测试。各疫苗的几何平均效价描绘于图17中。
在小鼠模型中针对EV71及CVA16的疫苗功效
接着测试三价疫苗在EV71及CVA16感染的鼠类模型中的功效。四周龄AG129小鼠群组(n＝5-6)肌肉内(IM)接种疫苗。上述单价及三价疫苗是以相等体积的明矾(Alhydrogel85)为佐剂，其藉由在旋转器上、在4℃混合4小时来达成，如实例2中所述。小鼠接种每只动物1.5μg剂量的单价疫苗、每只动物4.5μg总剂量的三价疫苗混合物(每只动物1.5μg各种单价疫苗)，或明矾佐剂作为对照物。小鼠经由腹膜内(IP)注射9.8×105TCID50/400μl病毒的攻击剂量的病毒来攻击。各小鼠组的处理及攻击以及处理及攻击的时程描绘于图18中。
如图19所示，接种EV71单价疫苗或三价疫苗的六只小鼠中的六只在小鼠适应性EV71攻击后均存活至少25天。然而，在EV71攻击后，接种CVA16疫苗的六只小鼠中仅有两只存活20天，且接种CVA6疫苗的小鼠均未存活20天，指示未观测到交叉保护。
亦测试疫苗抑制EV71病毒血症的能力。EV71攻击后第1、3及5天量测病毒效价(图20)。EV71攻击后第1、3及5天收集得自所接种小鼠的血清样品且使用SYBR Green套组(Qiagen)、藉由实时RT-PCR测定病毒效价。利用连续稀释的小鼠适应性病毒储备液产生标准曲线。正常小鼠血清用作阴性对照物，以测定截止值。结果表明EV71单价疫苗与三价疫苗均能够使血清中的病毒效价降低至约零，如根据TCID50/ml等效物所量测(图20)。
如图21中所示，接种CVA16单价疫苗或三价疫苗的五只小鼠中有五只在小鼠适应性CVA16攻击后存活至少20天。然而，接种CVA6疫苗的小鼠在EV71攻击后未存活15天，指示未观测到交叉保护。
亦测试疫苗抑制CVA16病毒血症的能力。CVA16攻击后第1、3及5天量测病毒效价(图22)。CVA16攻击后第1、3及5天收集得自所接种小鼠的血清样品且使用SYBR Green套组(Qiagen)、藉由实时RT-PCR测定病毒效价。利用连续稀释的小鼠适应性病毒储备液产生标准曲线。正常小鼠血清用作阴性对照物，以测定截止值。结果表明CVA16单价疫苗与三价疫苗均能够使血清中的病毒效价降低至约零，如根据TCID50/ml等效物所量测(图22)。
针对CVA6的疫苗功效(使用被动转移)
接着测试三价疫苗在CVA6感染的鼠类模型中的功效。经由腹膜内(IP)注射中和抗体血清而使三周龄A129小鼠群组(n＝5-6)被动免疫。藉由用每只动物1.5μg剂量的CVA6单价疫苗或用每只动物4.5μg总剂量的三价疫苗混合物(每只动物1.5μg的各种单价疫苗)接种小鼠而在小鼠中产生中和抗体血清。接着在疫苗接种后第42天收集各组的含有中和抗体的血清样品且根据群组合并且藉由微量中和测试进行测试。在三价血清中，针对EV71的几何平均抗体效价为640，针对CVA16的几何平均抗体效价为1280，且针对CVA6的几何平均抗体效价为1280。在CVA6单价血清中，针对CVA6的几何平均抗体效价为5120。小鼠经由腹膜内(IP)注射2.31×104TCID50/200μl CVA6的攻击剂量而用小鼠适应性CVA6病毒攻击。各小鼠群组的被动转移及攻击以及处理及攻击的时程描绘于图23中。
图24描述使用三价血清或CVA6单价血清进行被动免疫接种的结果。经三价血清或CVA6单价血清免疫的六只小鼠中有六只在CVA6攻击后存活20天，而经得自正常小鼠的对照血清免疫的六只小鼠中仅有一只小鼠在CVA6攻击后存活20天(图24)。结果表明，得自经三价疫苗接种的小鼠的血清的被动转移具有针对CVA6同源病毒攻击的保护性。
亦测试保护性血清抑制CVA6病毒血症的能力。CVA6攻击后第1、3及5天量测病毒效价(图25)。CVA6攻击后第1、3及5天收集得自所接种小鼠的血清样品且使用SYBR Green套组(Qiagen)、藉由实时RT-PCR测定病毒效价。利用连续稀释的小鼠适应性病毒储备液产生标准曲线。正常小鼠血清用作阴性对照物，以测定截止值。结果表明，得自CVA6单价疫苗或三价疫苗接种的小鼠的血清能够使血清中的病毒效价降低至约零，如根据TCID50/ml等效物所量测(图25)。
结论
结果证明，针对HFMD病毒EV71、CVA16或CVA6的抗体不能发生活体外交叉中和或交叉保护小鼠以防致死性攻击，且EV71、CVA16及CVA6的不活化制剂当以单价或多价疫苗调配物形式投与时在小鼠中具有免疫原性。结果亦表明，EV71、CVA16及CVA6的不活化制剂100％有效抵御EV71及CVA16在AG129小鼠模型中及CVA6在A129小鼠模型中的同源性攻击。
序列表
<110> 苏巴许查达拉达斯
裘瑟芬大卫圣塔奇洛
丹汤玛斯史汀奇科毕
裘奇E奥索里欧
<120> 手、足及口疫苗及其制备及使用方法
<130> 606772000940
<140> 还未指定
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/077,139
<151> 2014-11-07
<160> 44
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> 肠病毒71
<400> 1
Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val
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Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr
20 25 30
Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Glu Val Pro Ala Leu Gln
35 40 45
Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Thr Ser Asp Glu Ser Met Ile
50 55 60
Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu
65 70 75 80
Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro
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Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp
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Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr
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Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly
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Pro Lys Pro Glu Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn
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Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Ser
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Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys
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Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys
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Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp
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275 280 285
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Phe
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<213> 柯沙奇病毒A6
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<212> PRT
<213> 柯沙奇病毒A6
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Claims (28)

1.一种手、足及口免疫原性组合物或疫苗，其包含一或多种来自至少一种引起人类手、足及口病的病毒的抗原，其中该至少一种病毒包含不活化肠病毒71 (EV71)且来自该EV71的抗原为VP1多肽，所述EV71的VP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且该多肽位置7的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代，该多肽位置14的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代，该多肽位置145的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代，且该多肽位置282的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
2.一种手、足及口免疫原性组合物或疫苗，其包含一或多种来自至少一种不活化的引起人类的手、足及口病的病毒的抗原，其中该至少一种病毒包含用β-丙内酯(BPL)不活化的EV71，且来自该EV71的抗原为VP1多肽，所述EV71的VP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且该多肽位置7的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代，该多肽位置14的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代，该多肽位置145的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代，且该多肽位置282的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗，其进一步包含：
a.有效浓度的清洁剂，视情况其中该清洁剂包含聚山梨醇酯80及/或该有效浓度在0.001%至0.01%范围内；及/或
b.佐剂，视情况其中该佐剂选自由以下组成的群：铝盐、铎(toll)样受体(TLR)促效剂、单磷酰基脂质A (MLA)、合成脂质A、细胞激素、皂素、胞壁酰二肽(MDP)、CpG寡核苷酸(oligos)、革兰氏阴性细菌(gram-negative bacteria)的脂多醣(LPS)、聚膦氮烯、病毒颗粒(virosomes)、脂质卷(cochleates)、聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒(poloxamer particles)、脂质体、完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)，及不完全弗氏佐剂(IFA)。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该铝盐佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝及硫酸钾铝。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该氢氧化铝为Alhydrogel 85。
6.根据权利要求4所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该硫酸钾铝为明矾。
7.根据权利要求3所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该佐剂包括铝盐，且其中至少80%的该抗原吸附至该铝盐。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该铝盐佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝及硫酸钾铝。
9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该氢氧化铝为Alhydrogel 85。
10.根据权利要求8所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该硫酸钾铝为明矾。
11.一种手、足及口免疫原性组合物或疫苗，其包含一或多种来自至少一种引起人类手、足及口病的病毒的抗原及铝盐佐剂，其中至少80%的该抗原吸附至该铝盐佐剂，其中该至少一种病毒包含EV71，且来自该EV71的抗原为VP1多肽，所述EV71的VP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且该多肽位置7的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代，该多肽位置14的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代，该多肽位置145的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代，且该多肽位置282的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该铝盐佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝及硫酸钾铝。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该氢氧化铝为Alhydrogel85。
14.根据权利要求12所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该硫酸钾铝为明矾。
15.根据权利要求1至2中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该一或多种抗原是由在非人类细胞中培养EV71产生，且视情况其中该细胞是在无血清培养基中培养。
16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该非人类细胞为猴细胞。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该猴细胞为Vero细胞株。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该Vero细胞株选自WHO Vero10-87、ATCC CCL-81、Vero 76及Vero C1008。
19.根据权利要求1至2中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该免疫原性组合物或疫苗为次单位免疫原性组合物或疫苗，或不活化完整病毒免疫原性组合物或疫苗。
20.根据权利要求19所述的免疫原性组合物或疫苗，其中该次单位免疫原性组合物或疫苗为经纯化的抗原免疫原性组合物或疫苗。
21.根据权利要求1至2中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗在制备在用于诱导有需要的个体免疫反应或用于治疗或预防有需要个体的手、足及口病的方法中使用的药物中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中该药物在用于诱导有需要的个体免疫反应的方法中使用，且该免疫反应为该个体发生保护性免疫反应，视情况其中该免疫反应包含针对一或多种选自B2、B4、B5、C2及C4的EV71病毒基因型的免疫反应。
23.一种制备含佐剂的手、足及口免疫原性组合物或疫苗的方法，其包含：
(a)将根据权利要求1至2中任一项所述的手、足及口免疫原性组合物或疫苗与铝盐佐剂混合；及
(b)将该混合物在适合条件下培育16小时至24小时范围内的时间段，
其中至少80%的该抗原吸附至该铝盐佐剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该混合物在2℃至8℃范围内的温度培育。
25.一种用于使手、足及口病毒制剂不活化的方法，其包含：
(a)自一或多个非人类细胞中分离该手、足及口病毒制剂，其中该等细胞用于产生该病毒制剂；
(b)用有效量的β-丙内酯(BPL)处理该病毒制剂；及
(c)用有效量的福尔马林处理该病毒制剂，其中该福尔马林处理步骤与步骤(b)同时发生或在步骤(b)之后发生，
其中该病毒包含EV71，且其中该EV71的VP1多肽氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且该多肽位置7的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代，该多肽位置14的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代，该多肽位置145的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代，且该多肽位置282的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
26.根据权利要求25所述的方法，其中该方法进一步包含将该病毒制剂在37℃的温度加热足以使该BPL水解的时间段，视情况其中该时间段在1小时至6小时范围内。
27.一种用于使手、足及口病毒制剂不活化的方法，其包含：
(a)自一或多个非人类细胞中分离该手、足及口病毒制剂，其中该等细胞用于产生该病毒制剂；
(b)用有效量的福尔马林处理该病毒制剂；及
(c)自该福尔马林中纯化该病毒制剂，其中该病毒包含EV71，其中该EV71的VP1多肽氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，并且该多肽位置7的突变为缬氨酸经甲硫氨酸取代，该多肽位置14的突变为天冬氨酸经天冬酰胺取代，该多肽位置145的突变为麸氨酸经麸酰氨酸取代，且该多肽位置282的突变为天冬酰胺经天冬氨酸取代。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该病毒制剂进一步包含福尔马林。
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