FR2475572A1 - Procede pour l'obtention de fragments de virus a enveloppe lipidique, en particulier d'antigenes utilisables comme vaccins, produits obtenus et applications - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR L'OBTENTION DE FRAGMENTS DE VIRUS A ENVELOPPE LIPIDIQUE. LE PROCEDE CONSISTE, A PH NEUTRE OU BASIQUE: 1.A DISSOUDRE, DANS UNE SUSPENSION AQUEUSE DE VIRUS, UN HYDROCARBURE HALOGENE INFERIEUR, A UNE CONCENTRATION EGALE OU VOISINE DE SA LIMITE DE SOLUBILITE, PUIS 2.A METTRE EN CONTACT, SOUS AGITATION, LA PREPARATION AINSI OBTENUE AVEC UN DETERGENT NON IONIQUE A LA CONCENTRATION MINIMALE EFFICACE POUR REALISER L'ECLATEMENT DES VIRIONS EN FRAGMENTS LOURDS, PENDANT UN TEMPS SUFFISANT POUR PERMETTRE LEDIT ECLATEMENT ET 3.A SEPARER LES FRAGMENTS LOURDS AINSI OBTENUS DU MILIEU REACTIONNEL. APPLICATION: PREPARATION D'ANTIGENES ECLATES PURIFIES UTILES COMME VACCINS, NOTAMMENT GRIPPAUX.

Description

L'invention concerne l'obtention de fragments de virus à enveloppe

lipidique,supportant les antigènes de

surface du virus et plus particulièrement l'obtention d'an-

tigènes utilisables comme vaccins.Le procédé de l'invention présente un intérêt tout particulier pour le traitement des virus,en particulier des virus grippaux permettant

l'obtention de vaccins à fragment de virus grippal.

Une particule de virus grippal est constituée

d'un génome à acides ribonucléiques,associé à une nucléopro-

téine qui en détermine la spécificité de type,laquelle est entourée d'une part d'une membrane interne protéique et d'autre part d'une membrane externe lipidique sur laquelle

sont dressées les projections (ou spicules)glycoprotéiques.

La membrane interne est communément appelée protéine matri-

cielle (ou matrice,ou encore protéine M),la membrane lipidi-

que est appelée enveloppe et les spicules 'appartenant à deux classes distinctes de glycoprotéines sont dénommées

respectivement neuraminidase {NA) et hémagglutinine (HA).

Il est bien établi que la neuraminidase et l'hémag-

glutinine sont les antigènes du virus grippal nécessaires

pour induire une bonne immunité chez l'homme contre la mala-

die. Par conséquent,tout vaccin anti-grippal doit contenir

ces deux types d'antigènes,en quantités suffisantes.

On peut considérer qu'il existe à l'heure actuelle

trois types de vaccins à antigènes inactivés.

Le premier type est constitué d'antigènes à virions entiers. Ce type de vaccin est connu pour engendrer des effets réactogènes non désirables après injection à l'homme,

liés à la particule virale complète.

Un deuxième type de vaccin est constitué de virions éclatés et partiellement délipidés:la membrane lipidique des virions préalablement purifiés est rompue par l'action combinée d'un solvant des lipides,tel que l'éther,et d'un détergent. Pratiquement,l'extraction des lipides se fait en système biphasique solvant-échantillon,nécessitant

l'emploi de 1 à 2 volumes d'éther pour un volume de prépara-

tion du virus et cette opération peut être répétée deux à

trois fois. La préparation ainsi obtenue contient les anti-

gènes HA et NA,ainsi que tous les constituants internes

à l'enveloppe,et il contient de plus le détergent utilisé.

Bien qu'une telle préparation contienne donc tous les constituants du virion à l'exception d'une partie de ses

lipides,ce deuxième type de vaccin est réputé moins réacto-

gêne que le premier type. Enfin,un troisième type de vaccin est constitué

des seules glycoprotéines HA et NA; pratiquement,les vi-

rions préalablement purifiés sont traités par un agent tensio-actif de manière telle que seules les spicules soient détachées du noyau viral constitué par l'enveloppe lipidique renfermant tous les constituants internes du virion et cette préparation est ensuite soumise à un fractionnement zonal obtenu par ultracentrifugation de l'échantillon sur un gradient de densité,la fraction légère du gradient contenant les antigènes HA et NA et la fraction lourde contenant les noyaux. Du fait que les antigènes HA et NA se retrouvent dans la fraction légère du gradient, on doit noter que les éventuelles protéines de l'oeuf contaminantes,ainsi que le détergent,sont récupérés dans cette kaction,ce qui constitue un handicap pour ce type de vaccin. Enfin,son pouvoir immunogène est connu pour être plus faible que celui du vaccin à virions entiers,à doses égales d'antigènes HA et NA, du fait vraisemblablement que lesdits antigènes ont perdu leur arrangement originel sur

l'enveloppe lipidique du virion.

Les indications ci-dessus,bien que brièvement résumées,ont pour but de situer l'état de la technique dans le domaine de l'invention. A titre illustratif,on citera également un certain nombre de références bibliographiques matérialisant l'art antérieur. Un article récent de Peter A. Gross et Francis A. Ennis,dans "The New England Journal of Medicine" 10 Mars 1977,Volume 296 n10 lO,pages 567-568, établit une comparaison entre les vaccins grippaux prépares

à partir de virus entier et de virions éclatés.Les référen-

ces bibliographiques qui accompagnent cet article font également le point sur la technique de fabrication des

vaccins grippaux.

D'autres articles plus spécialisés sont notamment les suivants: R.G. WEBSTER et W.G. LAVER dans "The Journal of ImmUnologyt", 1966,Volume 96, n 4,pages 596 et suivantes; "Influenza virus subunit vaccines; immunogenicity and lack of toxicity or rabbits of ether- and

detergent disrupted virus".

Cet article est consacré à l'étude de vaccins comprenant des sous-unités de virus obtenues par éclatement avec de

l'éther et des détergents. Il est mentionné que le traite-

ment de mixovirus avec de l'éther permet d'éliminer leur activité pyrogène bien que le produit résultant conserve

son pouvoir d'antigène vis-à-vis des animaux et de l'homme.

Il est noté que les détergents provoquent également l'écla-

tement des virions et la libération des sous-unités hémag-

glutinantes. Les détergents sont considérés comme moins

dangereux/qul eëther pour la fabrication des vaccins.Les -

auteurs ont plus particulièrement réalisé des travaux visant à déterminer si les virus grippaux éclatés ou scindés par des détergents sont toxiques chez les lapins et ils

ont comparé quantitativement l'immunogénicité des sous-uni-

tés virales avec les virus intacts entiers et les virus traités à l"éther. Les détergents utilisés ont été le

dodécylsulfate de sodium et le déoxycholate de sodium.

_L'article de B.A. RUBIN, W.A. PIERZCHALA et A.R.

NEURATH,"Elicitation of antibody response against influenza viruses by different viral subunit preparations" dans "Archiv. f.virusforschung vol. 20 H2 pages 268 et suivantes. Les auteurs étudient des préparations virales obtenues par traitement du virus avec des combinaisons de"'en" et d'éther ainsi que du déoexycholate de sodium,suivie de la purification des antigènes HA par adsorption-désorption sur des globules rouges. Ils constatent que les préparations d'antigènes HA obtenues par traitement au déoxycholate de sodium sont moins immunogènes que celles obtenues par

traitement au Tween-éther.

-L'article de A.R. NEURATH et al dans "Microbios" 1970 7-8 209-224 volume 2,sous le titre "The effect of non aqueous solvents on the quaternary structure of viruses: properties of haemagglutinins obtained by disruption of influenza viruses with tri(n-butyl)phosphate" décrit

l'éclatement de virus grippaux par le tri(n-butyl)phospha-

te (TNBP) en présence de "Tween 80". Les auteurs étudient les propriétés des hémagglutinines obtenues après éclatement et constatent que ces hémagglutinines HA res- semblent à celles obtenues par traitement avec l'éther diéthylique. Cependant,le TNBP est beaucoup moins nuisible à la neuraminidase que l'éther en ce qui concerne le virus

type B/Mass.

-L'article de Frederik L. RUBEN et George Gee JACKSON dans "The Journal of Infectious diseases" vol.125 n 6,Juin 1972 pages 656 à 664 sous le titre " A new subunit influenza vaccine: Acceptability compared with standard vaccines and effect of dose on antigenicity" est relatif à des travaux sur le virus grippal éclaté à l'aide de tri(n-butyl)phosphate. Les auteurs constatent le bon pouvoir vaccinant des préparations obtenues et laréduction

des réactions pyrogènes lors de l'administration.

-L'article de H.FUKUMI,dans le compte-rendu de "International Symposium on Influeuza Vaccines for Men and Horses",London 1972;Symp. Series Immunobiol.Standard Vc. 20 pp.99-105 (Karger,Basel/Nûnchen/Paris/London/ New York/Sydney 1973),sous le titre "Production and Potency

standardization of hemagglutinin sub-unit influenza vacci-

ne" étudie les sous-unités obtenues par traitement à

l'éther du virus grippal entier.

-L'article de W.G. LAVER et R.Go WEBSTERdans "Virology 69", 511-522 (1976) sous le titre "Preparation and immunogenicity of an influenza virus hemagglutinin and meuraminidase subunit vaccine" concerne la préparation

de virus grippal par traitement au déoxycholate d'ammonium.

D'autres détergents,tels que le dodécylsulfate de sodium et le "Triton X100" sont également cités. Les auteurs constatent que le déoxycholate d'ammonium conduit à un vaccin à virions éclatés dans lequel l'hémagglutinine et la neuraminidase sont aussi efficaces que dans le vaccin

à virion entier inactive.

-L'article de H. BACHMAYER et al dans "Postgraduate Medical Journal" (Juin 1976 vol.52, pages 360-367 sous le titre "Preparation and properties

of a novel influenza subunit vaccine" décrit la solubilisa-

tion sélective de l'hémagglutinine et de la neuraminidase

à partir de virus grippaux entiers par l'action d'un déter-

gent cationique,le CTAB (cétyl-triméthyl-bromure d'ammonium).

Ils constatent que la technique de solubilisation n'influen-

ce pas défavorablement les propriétés immunogènes des deux antigènes HA et NA. Ces travaux sont confirmés et complétés par M.JUST et al dans Medical Microbiology and Immunology 164,277-284 (1978)sous le titre "A New Jersey/76 Influenza Vaccine Trial in Seronegative School children:Comparaison of a subunit vaccine with a whole-virus Vaccine". Cet article compare en effet les propriétés du vaccin entier etdu vaccin à sous-unités obtenu par le procédé de H. BACHMAYER et al.

-L'article de M.LEIGH HAMMOND et al,dans Med.J.

Aust.1978,1:301-303" Effective protection against influenza after vaccination with subunit vaccine" rend compte d'une étude clinique sur les résultats de vaccination contre la grippe. Les articles mentionnés précédemment contiennent également de nombreuses références bibliographiques que l'homme de l'art pourra consulter si besoin est. Ces éléments

de la technique antérieure révèlent un consensus pratique-

ment universel sur l'intérêt des vaccins à virions éclatés ou à sousunités HA et NA. Toutefois,tous les chercheurs s'efforcent de perfectionner la technique d'éclatement des virions qui est connue d'une manière générale,en particulier en trouvant des réactifs d'éclatement plus commodes à manipuler et autorisant des conditions opératoires ultérieures plus efficaces d'élimination des produits

secondaires souvent responsables d'effets réactogènes indési-

rables lors de l'administration du vaccin.

La présente invention a précisément pour objet un

tel procédé perfectionné pour l'obtention d'antigènes puri-

fiés utilisables comme vaccins,en particulier comme vaccin à fragments de virus grippal. Les résultats améliorés sont obtenus,conformément à l'invention,grâce àla mise en oeuvre d'un réactif d'éclatement résultant d'une combinaison de moyens. Plus précisément,la présente invention concerne un pro- cédé d'éclatement ménagé des virions conduisant à libérer

des fragments lourds d'enveloppe virale supportant les spi-

cules glycoprotéiques HA et NA,suivi de leur enrichissement

par les moyens classiques de fractionnement adaptés aux com-

posés de très hauts poids moléculaires.On notera en effet quedans le cadre de l'invention,l'obtention des immunogènes

en fragments lourds permet leur séparation des composants lé-

gers, en particulier du détergent et du solvant utilisés, et

des protéines de l'oeuf, si elles sont présentes dans l'é-

chantillon initial ainsi traité, et d'une partie des compo-

sants constitutifs du virion non immunogènes. De plus, ces fragments, du fait de leur taille plus faible que celle du virion entier et d'une rigidité moindre, sont filtrables sur membrane stérilisante,par exemple sur membrane de porosité

0,22 micron, ce qui permet d'assurer une stérilité quasi ab-

solue des préparations antigéniques obtenues selon le procédé

de l'invention.

L'invention a également pour objet les produits ainsi

obtenus, et en particulier des fragments de virus purifiés a-

vantageusement utilisables pour la préparation de vaccins,tels

que le vaccin grippal. Elle concerne toutes les formes pharma-

ceutiquement acceptableset notamment les préparations aqueu-

ses et lyophilisées et les solutés injectables.

L'invention a encore pour objet les applications des pro-

duits ainsi obtenus, spécialement des antigènes viraux purifiés

qui conservent leurs propriétés immunogènes.

Sous sa forme la plus générale, le procédé selon la pré-

sente invention pour l'obtention de fragments de virus à enve-

loppe lipidique consiste à opérer les étapes ci-après dans l'ordre indiqué, à pH neutre ou basique: 1) à dissoudre,dans une suspension aqueuse de virus,un hydrocarbure halogéné inférieur,tel que le chloroforme, à une concentration égale ou voisine de sa limite de solubilité; 2)à mettre en contact,sous agitation,la préparation

ainsi obtenue avec un détergent non ionique à la concentra-

tion minimum efficace pour réaliser l'éclatement des virions en fragments lourds pendant un temps suffisant pour permettre ledit éclatement; 3) à séparer les fragments lourds ainsi obtenus du milieu réactionnel. pour l'obtention pour l'obtention

Dans le procédé de l'invention/de fragments puri-

fiés de virus à enveloppe lipidique,en particulier d'anti-

gênes utilisables comme vaccins,par la technique générale d'éclatement des virions suivie d'une purification en vue de concentrer et d'isoler les fragments de l'enveloppe

virale,l'éclatement des virions est réalisé en systè-

me réactionnel monophasique, à un pH neutre ou basique, par

mise en oeuvre d'un détergent non ionique,et d'un hydrocar-

bure inférieur halogén6,ce dernier étant utilisé à une concentration égale ou voisine de sa limite de solubilité dans l'eau. L'hydrocarbure inférieur halogéné mis en oeuvre selon l'invention doit être tel qu'il n'apporte aucune toxicité au produit final. A titre d'exemple d'hydrocarbure

halogéné inférieur approprié on peut citer le chloroforme.

La description détaillée qui suit sera faite en référence

au chloroforme sans pour autant limiter la portée de l'inven-

tion à ce seul hydrocarbure halogéné inférieur.

La demanderesse a en effet trouvé que l'action combinée d'un détergent non ionique,tel que par exemple le polysorbate 80,et d'un hydrocarbure halogéné inférieur,tel que le chloroforme,à une concentration égale ou proche de sa limite de solubilité dans l'eau,suffisait i scinder l'enveloppe lipidique et à en solubiliser une faible partie

pour que la quasi totalité des antigènes HA et NA se re-

trouvent supportés par des fragments lourds d'enveloppe lipidique, permettant ainsi leur séparation quantitative par une étape de fractionnement adaptée.Il faut noter que

le système utilisé est un système monophasique ne nécessi-

tant pas la séparation de deux phases non miscibles solvant-

eau;la préparation d'antigènes éclatés est ainsi directement

utilisable pour l'étape de fractionnement ultérieure.

Selon le procédé de l'invention, on opère à un pH neutre ou basique, par exemple à un pH compris entre 7,5

et 8,7 environ. En général, on ajuste le pH du milieu ré-

actionnel après la dissolution du chloroforme.Cependant, on peut aussi d'abord ajuster le pH de la suspension vira- le de départ. Cet ajustement de pH est réalisé par tous

moyens classiques appropriés.

Selon une variante du procédé de l'invention, on peut ajouter une quantité supplémentaire de chloroforme après

l'addition du détergent non ionique si le pH du milieu ré-

actionnel est basique.

Il faut noter que l'ordre des étapes du procédé est critique pour réaliser un système réactionnel monophasique

et qu'il est indispensable de solubiliser l'hydrocarbure ha-

logéné inférieur dans la suspension de virus avant d'ajouter le détergent non ionique. En effet, on a trouvé que l'addition de chloroforme à une solution de polysorbate 80 précipitait

le détergent, et ainsi on ne peut pas obtenir un système ré-

actionnel monophasique.

Comme indiqué précédemment, on peut ajouter un excès

de chloroforme, mais cette addition complémentaire ne peut e-

tre réalisée que lorsque le pH est basique- En effet, lors-

qu'on opère dans de telles conditions, le système réactionnel

reste monophasique et il n'y a donc pas précipitation du dé-

tergent. Ainsi, la saturation en chloroforme peut être assurée

sans modifier la concentration du détergent.

Ainsi qu'on l'a mentionné précédemment, le procédé de l'invention est utilisable pour le traitement des virus à

enveloppe lipidique, et plus spécialement du virus grippal.

Parmi les virus qui peuvent être traités par le procédé se-

lon l'invention, on citera notamment les virus susceptibles d'engendrer des vaccins à fragments, contenant les antigènes de surfacesupportés par des fragments d'enveloppe lipidique, tels que par exemple les virus ciaprès:Togavirus, Rhabdovirus, Leukovirus,Coronavirus,Adenovirus,Virus de l'Herpès,

virus vaccinal et virus de l'hépatite de type B,(parti-

cules de DANE)qui sont tous des virus accessibles à l'hom-

me de 1'art.

La matière première mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est constituée par une suspension d'un

virus mentionné ci-dessus obtenue selon des moyens classi-

ques,à la seule condition que lacontamination en lipides non constitutifs du virion soit modérée de manière à ce que le chloroforme ne soit pas excessivement consommé par ces lipides.On peut par exemple utiliser une suspension

de virus grippal multiplié sur oeufs,concentré et/ou puri-

fié selon des méthodes classiques.

Selon l'invention,on peut utiliser un détergent

non ionique quelconque.

A titre de détergent non ionique approprié,on

utilise de préférence un agent tensioactif à base de déri-

vés polyoxyéthyldniques d'esters partiels d'acides gras

et d'anhydrides d'hexitol dérivés du sorbitol,et spéciale-

ment le produit disponible sous la dénomination commerciale "Tween 80" qui est un monooléate de polyoxyéthylène (20)

sorbitanne également dénommé polysorbate 80.

Parmi les autres détergents non ioniques qui con-

viennent aux fins de l'invention on peut citer: l)les condensats d'alkylphénols et d'oxyde d'éthylène; 2)les produits d'addition d'éthers aliphatiques et d'oxyde d'éthylène; 3)les produits d'addition d'esters et d'oxydes d'éthylène; 4) les produits d'addition d'amines et d'oxyde d'éthylène;et ) les produits d'addition d'alcanolamides et d'oxyde d'éthylène. On pourra à cet effet se référer au brevet FR 74 35 179 publié sous le n 2.248.054,dans lequel sont donnés des exemples de tels agents non ioniques appropriés. Comme indiqué ci-dessus,le détergent non ionique est utilisé à la concentration minimale efficace pour réaliser l'éclatement des virions en fragments lourds. Il sera aisé à l'homme de l'art de déterminer,par des essais de routine,la concentration à mettre en oeuvre pour un dé- tergent non ionique donné. On indiquera que lorsque le détergent non ionique est le polysorbate 80, sa concentration minimum efficace est comprise entre 0,02 et 0,2%. Le temps de contact de la suspension virale

chloroformée avec le détergent non ionique doit ere suffi-

sant pour permettre l'éclatement des virions. En général, ce temps de contact est compris entre 1 et20 heures. La température du milieu réactionnel n'est pas critique,mais elle ne doit pas entraîner une dénaturation du virion à traiter. En généraleon opère à + 4 C pour des raisons

de commodité.

Le chloroforme est utilisé,comme indiqué précédem-

ment,à une concentration égale ou voisine de son maximum de solubilité dans le milieu aqueux. Avantageusement,cette concentration est compriseentre environ 0,4 et 0,7% en volume/ volume. Avantageusementgle chloroforme peut être ajouté à la suspension de virus,par chromatographie d'exclusion en tampon chloroformé à 0,5%,la chromatographie d'exclusion étant réalisée par exemple selon le mode opératoire décrit dans le brevet FR 77 12 518. On réalise ainsien même temps que l'addition de chloroforme à la matière première,une

pr6-purification très poussée ce celle-ci.

Comme indiqué précédemment,le procédé de l'inven-

tion est particulièrement approprié au traitement du virus grippal en vue de l'obtention de fragments de virus pour la fabrication de vaccins antigrippaux,et le détergent

préféré dans ce cas est le polysorbate 80.

Ainsi,selon une variante préférée,le procédé de l'invention consiste: 1) à ajouter,à une suspension de virus grippal, du chloroforme à une concentration comprise entre environ 0,4 et 0,5% (volume/volume) il 2) à ajouter,lorsque le chloroforme est totalement dissous et après ajustement du pH à une valeur comprise entre 7,5 et 8,7,un détergent non ionique,tel que le polysorbate 80 à une concentration comprise entre environ 0,02 et 0,2%, 3) à agiter le milieu réactionnel résultant qui se présente sous la forme d'un système monophasique,pendant 1 à 20 heures,

4) à purifier la préparation de virions éclatés.

Selon une autre variante,le procédé consiste: 1) à ajouter,à une suspension de virus grippal, du chloroforme à une concentration comprise entre environ 0,4 et 0,5% (volume/volume), 2) à ajouter,lorsque le chloroforme est totalement dissous et après ajustement du pH à une valeur comprise entre 8 et 8,7,un détergent non ionique,tel que le polysorbate 80 à une concentration comprise entre environ 0,02 et 0,2%,

3) à ajouter une quantité supplémentaire de chloro-

forme allant jusqu'à 0,2%, 4) à agiter le milieu réactionnel résultant qui se présente sous la forme d'un système monophasique,pendant 1 à heures, ) à purifier la préparation de virions éclatés. Selon une autre variante préférée de mise en oeuvre du procédé de l'invention,on ajoute au milieu réactionnel, à un moment quelconque du procédé,un agent d'inactivation,

tel que le formaldéhyde ou la P-propiolactone (P-PPL),en veil-

lant toutefois à ce que le pH du milieu réactionnel soit maintenu à une valeur neutre ou basique. De préférence,on

ajoute l'agent d'inactivation après le détergent non ioni-

que. Dans le cas o l'on utilise de la P-propiolactone comme agent d'inactivation,on aura soin de réguler le pH du milieu réactionnel par addition d'une base par des moyens appropriés,pour prévenir une chute du pH due à

l'autohydrolyse de l'agent inactivant. L'agent d'inactiva-

tion,tel que le formaldéhyde ou la P-propiolactone (f-PPL) est utilisé aux concentrations usuelles pour obtenir l'effet d'inactivation. En général,on utilise la P-propiolactone

ou le formaldéhyde à la concentration de 0,02% environ.

Le milieu réactionnel obtenu après l'étape 2) du procédé de l'invention est ensuite soumis à une étape de fractionnement pour séparer les fragments lourds dudit

milieu. Cette étape est une étape de fractionnement adap-

tée à la purification des composés de hauts poids moléculaires. Selon l'invention,on peut mettre en oeuvre deux systèmes de purification applicables industriellement: 1) le premier système consiste en une séparation par ultracentrifugation de zone sur gradient de densité;on choisira de préférence un gradient de saccharose,autoformé dynamiquement dans un rotor à réorientation type K2

(Eléctronucléo-n-ics)et alimenté à débit continu en échan-

tillon. Les activités hémagglutinante et neuraminidasique sont retrouvées dans les fractions denses du gradient,

tandis que,dans les couches légères ainsi que dans l.'ef-

fluent,sont retrouvés le chloroforme et le polysorbate 80 ainsi que des constituants non immunogènes issus de l'éclatement des virions et des ovoprotéines éventuellement

présentes dans l'échantillon traité.

Les fractions contenant les immunogènes sont rassemblées et le mélange est dilué dans une solution saline physiologique;une filtration stérilisante sur membranes de

porosité 0,22 micron achève la préparation des antigènes.

2)le deuxième système de séparation est dans son principe celui appliqué à la purification du virus grippal qui est décrit dans le brevet FR 77 12 518et son certificat

d'addition FR 78 10 769.

Le principe de ce système de séparation est une chromatographie d'exclusion en phase liquide sur billes de silice poreuse,de préférence de diamètre poreux moyen de nanomètres et de taille de 100 à 200 microns. Les sites

adsorbants de la silice sont préalablement bloqués par passa-

ge d'une solution aqueuse d'un agent polyoxyéthyl6né,tel

que le polyéthylène glycol 20 OOO;on notera que cette passi-

vation de la silice n'est pas altérée par les passages répétés de l'échantillon à fractionner quiau contraire apporte à chaque injection une charge supplémentaire d'agent polyoxyéthyléné représenté par le polysorbate 80 qu'il contient,ce qui ne peut que renforcer la passivation initiale. Le tampon de chromatographie est une solution saline tamponnée de préférence à pH 8,0- 8,2 et contenant 0,5% de chloroforme qui est utilisé ici comme agent antiseptique de manière à garantir une stérilité absolue

au cours des opérations.

L'appareil chromatographique est pourvu de disposi-

tifs automatiques permettant un fonctionnement continu,la préparation d'antigènes à fractionner étant injectée à

intervalles de temps réguliers,les phases exclue et retar-

dée respectivement en sortie de colonne étant distribuées dans des récipients distincts par des électrovannes

commandées par un programmateur.

La phase exclue contient les antigènes à activités hémagglutinante et neuraminidasique en tampon chloroformé, tandis que la phase retardée contient le "polysorbate 80 ainsi que des constituants non immunogènes issus de l'éclatement des virions et des ovoprotéines éventuellement

présentes dans l'échantillon traité.

La préparation d'antigènes ainsi purifiés est débarrassée du chloroforme par évaporation sous vide partiel, puis dialysée par diafiltration avec une solution saline physiologique tamponnée,et enfin filtrée sur membranes

stérilisantes de porosité 0,22 micron.

Dans tous les cas,le procédé de l'invention aboutit à l'obtention de structures lipoglycopeptidiques de haut poids moléculaire dont la composition et la structure sont très analogues à celles de l'enveloppe du virion.Le pouvoir immunogène est donc similaire ou égal à celui

du virion complet.

Le procédé de l'invention permet de récupérer, après purification de la préparation de virions éclatés, une préparation présentant une concentration en protéines pouvant contenir jusqu'à deux fois moioede protéines et de lipides que la préparation initiale à quantité égale

d'activité antigénique.

L'invention présente de nombreux avantages pour la préparation d'antigènes purifiés utilisables comme vaccins, en particulier dans son application au vaccin grippal. Au

niveau des conditions de la réaction d'éclatement, tout d'a- bord le procédé de l'invention met en oeuvre un système réac- tionnel

monophasique parce que le chloroforme est utilisé au voisinage de sa concentration maximale de solubilité dans l'eau. Dans les systèmes classiques de l'art-antérieur, tels

que des systèmes Tween-éther, le mélange réactionnel est bi-

phasique et les fragments libérés ne sont pas tous de hauts

poids moléculaires, ce qui ne permet pas une séparation quan-

titative des antigènes par une seule étape de fractionnement.

Au contraire, selon l'invention, il est possible de purifier simplement ensuite la suspension virale en raison

de la taille relativement importante de l'antigène obtenu.

On peut ainsi éliminer des contaminants-: Tweenchloroforme, protéines contaminantes du milieu, lipides, ainsi qu'une

partie des produits d'éclatement du virus. Dans les techni-

ques de l'art antérieur, le détergent utilisé est conservé

dans la préparation virale, ainsi que les produits d'écla-

tement du virus. Grâce au procédé de l'invention,on aboutit

à une déprotéinisation plus poussée, alors quedans la tech-

nique connue,il n'était pas possible de purifier les anti-

gènes éclatés avec un rendement satisfaisant.

De plus, on peut obtenir la stérilité de l'antigène éclaté par filtration sur membrane stérilisante. Il y a donc élimination des éventuelles bactéries tuées qui-auraient poussé dans un milieu de culture du virus grippal, ce qui permet donc d'éliminer un risque d'effets réactogènes lors

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de l'administration du vaccin par exemple. Dans les vaccins à virus entier, la suspension virale est le plus souvent stérilisée par action de rayons ultraviolets. Les bactéries

éventuellement présentes dans les suspensions ainsi stéri-

lisées peuvent induire, lors de la vaccination, un effet réactogène. Les exemples suivants illustrent la présente invention

* sans aucunement en limiter la portée. En particulier, le pro-

cédé est appliqué à du virus grippal multiplié sur oeufs,

concentré ou/et purifié selon des méthodes connues. Les mé-

thodes de titrage i*itro des antigènes sont l'hémagglutina-

tion ou bien l'immunodiffusion radiale en gélose contenant

un sérum anti-hémagglutinine pure (Schild et al. 1972, Jour-

nal of General Virology 16, 231-236) (J. Biol. Chem. 234,

1959, p. 1971) pour la détection de la neuraminidase.

EXEMPLE 1

On a multiplié du virus influenza sur des oeufs de pou-

le embryonnés par incubation à + 34,5 C pendant deux à trois jours. On a retroifi les oeufs à + 4 C pendant une nuit et on a réuni les liquides allantoiques infectés, qui ont été

clarifiés par centrifugation. Les virions du liquide allan-

toique ont été ensuite adsorbés sur hématies de poule puis dé-

sorbés par des techniques connues de l'homme de l'art, et le

jus virulent ainsi obtenu a enfin été concentré par ultrafil-

tration. Ce concentrat virulent a été additionné de 0,5% de

chloroforme,puis,après dissolution du solvant, le pH a été a-

justé à 8,2,et ensuite ila été additionné de 0,1% de polysor-

bate 80; le mélange a été agité à +4 C pendant une nuit,puis

ila été clarifié par centrifugation et ensuite injecté à un dé-

bit de 12 1/h dans un rotor K2 (Electronucléonics)tournantà

3500 t/minute et contenant un gradient de saccharose (2 à 55%).

Après passage de la totalité de l'échantillon, le rotor a été décéléré dans les conditions connues qui permettent une réorientation adéquate du gradient. Après arrêt du rotor, son contenu a été siphoné par le bas et l'on a recueilli des fractions de 100 ml. Les fractions du gradient, généralement de 20 à 45% de saccharose,contenant les antigènes HA et NA, ont été rassemblées et le mélange a été dialysé par diafiltration avec une solution saline physiologique tamponnée,et enfin la suspension d'antigènes a été filtrée sur membranes stérilisantes de porosité

0,22 micron.

EXEMPLE2-

On a opéré dans les conditions de l'exemple 1, excepté que de la P-PPL a été ajoutée à la concentration de 0,02% après addition du "Tween 80" et que le pH a été

régulé à 8,2 par addition d'une base.

EXEMPLE 3-

On a opéré dans les conditions de l'exemple 1, excepté que le pH du concentrat virulent chloroformé a été ajusté à pH 8,7 et que la P-PPL a été ajoutée à la concentration de 0,02% après addition du polysorbate 80; au cours de l'autohydrolyse de la -PPL,le pH s'est abaissé progressivement jusqu'à pH 7,6-7,7 et il a été ajusté à nouveau à pH 8,2 par addition d'une base avant l'étape

de purification.

EXEMPLE 4

On a opéré dans les conditions de l'exemple 1, excepté que du formaldéhyde a été ajouté à la concentration

de 0,02% après addition du polysorbate 80.

EXEMPLE 5

Le concentrat virulentobtenu comme indiqué dans l'exemple 1 a été additionné de 0,5% de chloroforme; après dissolution du chloroforme,le pH a été ajusté à 8,2, puis du polysorbate 80 a été ajouté à la concentration de 0,1%;le mélange a été maintenu sous agitation magnétique pendant une nuit,puis il a été clarifié successivement par centrifugation et par filtration sur membranes de porosité 0,45 micron.La préparation d'antigènes ainsi obtenue a été soumise à une étape de fractionnement par chromatographie d'exclusion sur billes de silice poreuse en tampon chloroformé à 0,5% et de pH 8,2.La fraction exclue,qui contenait les antigènes HA et NA a été débarassée du chloroforme par évaporation sous vide,puis dialysée par diafiltration avec une solution saline physiologique tamponnée et enfin filtrée sur membranes

stérilisantes de porosité 0,22 micron.

EXEMPLE 6

On a opéré dans les conditions de l'exemple 5, excepté que de la P-PPL a été ajoutée comme indiqué dans

l'exemple 2.

EXEMPLE 7

On a opéré dans les conditions de l'exemple 5, excepté que de la P-PPL a été ajoutée comme indiqué dans

l'exemple 3.

EXEMPLE 8

On a opéré dans les conditions de l'exemple 5, excepté que du formaldéhyde a été ajouté comme indiqué

dans l'exemple 4.

EXEMPLE 9

On a préparé un vaccin en mélangeant les prépara-

tions d'antigènes ainsi obtenus de chaque souche virale recommandée par l'O.M.S. et correspondant à la situation épidémiologique en cours,et en ajustant leur concentration soit en unités internationales d'hémagglutinine,soit en microgrammesd'hémagglutinine,dans un volume de 0, 5 ml en solution saline physiologique tamponnée à pH 7,3 et contenant de l'éthylmercurithiosalycilate de sodium à une concentration inférieure ou égale à 1/10 OOO.L'efficacité

de ce type de vaccin a été démontrée chez l'homme.

Par exemple3on a préparé de cette façon un vaccin trivalent à partir des antigènes monovalents éclatés et purifiés selon l'invention par mélange et dilution avec le tampon de dilution du vaccin de manière à obtenir dans 0,5ml de mélange final: 300 UI de type A/URSS/H1N1 500 UI de type A/TEXAS/H3N2

400 UI de type B/HK.

56 personnes adultes, appartenant à un groupe de popu-

lation active, ont reçu une dose (0,5 ml) de vaccin par voie sous-cutanée. Un contrôle sérologique a été effectué par des prélèvements sanguins pratiqués le jour de la vaccination et 30 jours plus tard. Un titrage des anticorps inhibant l'hé- magglutinine a été réalisé vis-à-vis des 3 antigènes selon la

méthode recommandée par l'O.M.S. Les taux de conversion sé-

rologique ainsi que les moyennes géométriques des titres en anticorps avant et après vaccination ont été calculé; les

résultats sont présentés dans le tableau ci-après et dé-

montrent une bonne immunogénécité de ce type de vaccin.

A/URSS/H N A/TEXAI B/HK

H3N2 Taux de séro- 92,8% 91,0% 89,3% conversion

4,4 3,9 6,0 avant vacci-

Moyenne géomé- _________ nation

trique des an- 183 27 109 après vacci-

ticorps nation Au terme de cette étude, on peut conclure à la bonne tolérance de ce vaccin qui n'a entraîné que quelques rares

et bénigmes réactions post-vaccinales.

EXEMPLE 10

Dans le but de démontrer le gain de purification obte-

nu par le procédé de la présente invention, on a-réalisé la

première étape du procédé selon l'invention par chromatogra-

phie d'émulsion en tampon chloroformé à 0,5% (vol/vol) sui-

vant le procédé décrit dans le brevet FR 77.12.518, d'un con-

centrat virulant tel que défini dans l'exemple 1. On a ainsi

obtenu une préparation de virus hautement purifié (DO) conte-

nant donc 0,5% de chloroforme. On a ensuite ajusté le pH de

cette préparation à 8,7, puis on a ajouté 0,1% de polysor-

bate 80 et enfin 0,02% de P-propiolactone.

Le mélange ainsi obtenu a été agité pendant 18 heures,

puis le pH a été ajusté à 8,2 par l'addition d'une base ap-

propriée. La préparation d'antigènes éclatés ainsi obtenue a été soumise à un fractionnement par centrifugation zonale, sur

gradient de saccharose,dans les conditions indiquées à l'ex-

emple 1.

Les opérations consécutives de l'exemple 1 ont été appliquées pour obtenir la préparation d'antigènes éclatés purifiés (D). Ce protocole a été appliqué à trois couches de virus grippal correspondant à la situation épidémiologique en Europe de la période 1978-1979 Virus A/URSS/H N1

A/TEXAS/H3N2

B/HK.

Pour chaque préparation de virus purifié (D) d'une partet pour chaque préparation d'antigènes éclatés purifiés (D) obtenus selon le procédé de l'invention, d'autre part, on a déterminé l'activité hémagglutinante (exprimée en unités

internationales UI) ainsi que les concentrations en protéi-

nes et en phospholipideset on a calculé les activités spéci-

fiques UI/mg de protéines (Tableau I) et UI/nM de phospho-

lipides (tableau II).

Les résultats des tableaux I et II montrent que les préparations d'antigènes é_clatés purifiés (D) obtenues selon

le procédé de l'invention possèdent un taux d'antigène hémag-

glutinant supérieur à celui des préparations de virus hautement

purifiés (Do) à quantités égales de protéines ou de phospho-

lipides.

TABLEAU I

Activité spécifique en UI/mg protéines A/URSS/H N1 A/Texas/H3N2 B/HK Do 9 245 8 957 24 980

D 15 584 15 131 42 256

D/Do 1,69 1,69 1,69

TABLEAU II

Activité spécifique en UI/nM phospholipides A/URSS/111N1 A/Texas/X3N2 B/HK Do 61 45 ND

D 139 121 533

D/Do 2,3 2,7 ND ND: non déterminé Do: préparation de virus hautement purifié obtenu par chromatographie d'exclusion D: préparation d'antigènes éclatés purifiés obtenus selon

le procédé de l'invention.

Claims (16)

1. REVENDICATIONS

   l.Procédé pour l'obtention de fragments de virus à enveloppe lipidique, caractérisé en ce qu'il consiste, à pH neutre ou basique: (1) à dissoudredans une suspension aqueuse de virus,un hydrocarbure halogéné inférieur,Aà une concentration égale ou voisine de sa limite de solubilité,puis (2) à mettre en contact,sous agitation,la préparation

   ainsi obtenue avec un détergent non ionique à la concentra-

   tion minimale efficace pour réaliser l'éclatement des virions en fragments lourds,pendant un temps suffisant pour permettre ledit éclatement et (3) à séparer les fragments lourds ainsi obtenus

   du milieu réactionnel.
2. 2.Procédé selon la revendication l,caractérisé en ce

   que l'hydrocarbure halogéné inférieur est le chloroforme.
3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2,

   caractérisé en ce que la suspension de virus est une suspen-

   sion de l'un des virus ci-après;Togavirus,Rhabdovirus, Leucovirus, Coronavirus,Adenovirus,Virus de l'Herpes, virus vaccinal et virus de l'hépatite de type B.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

   tions 1 à 3,caractérisé en ce qu'en outre on ajoute un agent d'inactivation au cours de l'une quelconque des

   étapes (1) à (3).
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

   tions 1 à 4,caractérisé en ce que l'agent d'inactivation

   est le formaldéhyde ou la -propiolactone.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications

   1 à 5,caractérisé en ce que la séparation des fragments lourds

   est effectuée par fractionnement à l'aide d'une centrifuga-

   tion zonale ou par chromatographie d'exclusion.
7. 7. Procédé selon la revendication 1 pour l'obten-

   tion d'une préparation d'antigènes éclatés purifies de virus grippal, caractérisé en ce qu'il consiste: (1) à ajouter,A une suspension de virus grippal, du chloroforme à une concentration comprise entre environ 0,4 et 0,7% (volume/volume);

   (2) à ajouter,lorsque le chloroforme est totale-

   ment dissous et après ajustement du pH à une valeur comprise

   entre 7,5 et 8,7,un détergent non ionique,tel que du poly-

   sorbate 80,à une concentration comprise entre environ 0,02 et 0,2%; (3) à agiter le milieu réactionnel résultant qui se présente sous la forme d'un système monophasique,pendant 1 à 20 heures;

   (4) à purifier la préparation de virions éclatés.
8. 8. Procédé selon la revendication l,pour l'obten-

   tion d'une préparation d'antigènes éclatés purifiés de virus grippal, caractérisé en ce qu'il consiste: (1) à ajouter,à une suspension de virus grippal, du chloroforme à une concentration comprise entre environ 0,4 et 0,5% (volume/volume);

   (2) à ajouter,lorsque le chloroforme est totale-

   ment dissous et après ajustement du pH à une valeur comprise entre 8 et 8, 7,un détergent non ionique,tel que du polysorbate 80,à une concentration comprise entre environ 0,02 et 0,2%;

   (3) à ajouter une quantité supplémentaire de chloro-

   forme allant jusqu'à 0,2%; (4) à agiter le milieu réactionnel résultant qui se présente sous la forme d'un système monophasique,pendant 1 à 20 heures;

   (5) à purifier la préparation de virions éclatés.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

   tions 1 à 8,caractérisé en ce que l'agent d'inactivation est la Ppropiolactone et en ce qu'elle est ajoutée après l'addition du détergent non ionique à raison de 0,02% environ.
10. 10.Procédé selon l'une quelconque des revendica-

    tions 1 à 9,caractérisé en ce que la suspension aqueuse de virus grippal est obtenue à partir d'une solution allantoique de virus grippal,laquelle est de manière connue,après sa préparation,soumise à des opérations d'adsorption-élution sur hématies,puis de clarification

    par centrifugation et filtration, conduisant ainsi à un con-

    centrat contenant le virion, qui est utilisé pour former la

    suspension aqueuse utilisée comme matière de départ.
11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications

    1 à 10, caractérisé en ce que le détergent non ionique est un agent tensio-actif à base de dérivés polyoxyéthyléniques d'esters partiels d'acides gras et d'anhydrides d'hexitol

    dérivés du sorbitol, notamment le polysorbate 80.
12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications

    1 à 10, caractérisé en ce que le détergent non ionique est choisi parmi:

    (1) les condensats d'alkylphénols et d'oxyde d'éthy-

    lène; (2) les produits d'addition d'éthers aliphatiques et d'oxyde d'éthylène;

    (3) les produits d'addition d'esters et d'oxyde d'é-

    thylène, (4) les produits d'addition d'amines et d'oxyde d'éthylène;

    (5) les produits d'addition d'alcanolamides et d'oxy-

    des d'éthylène.
13. 13. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, ca-

    ractérisé en ce que l'addition de chloroforme est réalisée

    au cours d'une chromatographie d'exclusion en tampon chloro-

    formé à 0,5% environ.
14. 14. Produits obtenus par le procédé selon l'une quel-

    conque des revendications 1 à 13, sous toute forme de prépa-

    ratiom pharmaceutiquement acceptables contenant des antigènes

    éclatés purifiés.
15. 15. Produits selon la revendication 14, caractérisés

    en ce qu'ils se présentent sous la forme de préparations a-

    queuses, de préparations lyophilisées ou de solutés injecta-

    bles.
16. 16. Application des produits selon l'une des revendi-

    cations 14 ou 15, à titre de vaccins monovalents et poly-

    valents spécialement de vaccins grippaux.