NO142024B - Fremgangsmaate for fremstilling av en vaksine, saerlig influensavaksine, ved aa dyrke et virus - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte

for fremstilling av en vaksine, spesielt

influensavaksine.

De influensavaksiner som for tiden anvendes er inaktiverte, helvirusvaksiner som ved siden av influensavirioner inneholder noe eggprotein som er oppnådd fra allantoinvæsken som viruset høstes fra. Ved injeksjon kan denne type virus forårsake hypersensitivitet ved de eggprotein- og pyrogene effekter som forårsakes av virionene.

Influensaviruset og liknende vira av samme type,

dvs. ortomyxovira og paramyxovira, er karaktérisert ved et ytre membran som har "pigger" av antigener med hæmaglutinerende og

neuraminidaseaktivitet. Dette ytre membran kan oppbrytes av løsnings'-midler som for eksempel eter eller av overflateaktive midler for å frigi som (under)sub-enheter slike antigener som har hæmaglutinerende og neuraminidaseaktivitet. De såkalte "spaltet virus"-vaksiner som hittil er fremstilt på denne måten er funnet å ha lavere pyrogenisitet enn tilsvarende helvirus-vaksiner, selv om det ikke er gjort forsøk på å skille antigener med neuraminidase-

og hæmaglutinerende aktivitet fra pyrogener og andre uønskede materialer som for eksempel andre antigener og nukleinsyrer.

Det er imidlertid funnet at antigenene med hæmaglutinerende og neuraminidase-aktivitet ikke i seg selv er pyrogene eller på annen måte toksisk og at derfor en videre reduksjon i pyrogenisitet kan oppnås ved å oppnå de ønskede antigener i det vesentlige frie fra annet uønsket materiale.

Vi har forsøkt å skille komponentene i et spaltet viruspreparat ved soneultrasentrifugering. Satsvis påfylling i en ultrasentrifugerotor ble imidlertid funnet ugjennomførlig for produksjon i stor skala og det ble funnet nødvendig å anvende en sonesentrifuge for kontinuerlig påfylling hvor den relativt fortynnede suspensjon av virus-sub-enheter føres inn i rotoren og strømmer på tvers av den sentripetale ende av konsentrasjons-gradient. Det ble imidlertid funnet at de meget små partikler av de ønskede antigener med hæmaglutinerende og neuraminidaseaktivi-

tet vanskelig lot seg overføres til gradienten ved de strømnings-hastigheter som behøvdes ved produksjon i stor skala.

Vi har nå imidlertid funnet at vira av influensa- og liknende typer, som lett kan innføres i gradienten i en soneultrasentrifuge med kontinuerlig påfylling, med hell kan spaltes når de føres gjennom gradienten dersom det er en overflateaktiv substans til stede i gradientløsningen. Dette forenkler fremstilling i stor skala av sub-enhetsvaksiner som er i det vesentlige frie for eggprotein, pyrogener og virion-nukleinsyrer og som i hovedsak bare inneholder de ønskede beskyttelsesantigener med hæmaglutinin- og neuraminidaseaktivitet. Hæmaglutininet som finnes i de såkalte "piggene", spaltes av det overflateaktive midlet til en monovalent form som ikke lenger oppviser hæmaglutinering men innehar de krevede antigene egenskaper.

Generelt kan alle eter-følsomme vira spaltes ved

behandling med detergenter og i tillegg til de ovennevnte orto-

og paramyxovira kan de følgende vira gi sub-enhetsvaksiner som inneholder beskyttende antigene komponenter analoge hæmaglutinin og neuraminidase, nemlig:

a) Togavira

b) Rhabdovira

c) Leukovira

d) Coronovira

e) Arenovira

f) Herpesvira

g) Poxvira

Ifølge foreliggende oppfinnelse skaffes det derfor en

fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, særlig en influensavaksine, ved å dyrke et virus, særlig influensavirus, i en veykultur eller i allantois fra fjærfe-egg med embryo, oppsamle væsken inneholdende virioner, og eventuelt inaktivere, klargjøre og konsentrere fraksjonen(e) inneholdende virionene. Fremgangsmåten karakteriseres ved at fraksjonene inneholdende virionene innføres i en ultrasentrifuge med kontinuerlig fylling som er utstyrt med en tetthetsgradientløsning inneholdende et hæmolytisk overflateaktivt middel, hvorved virionene går over i tetthetsgradienten og spaltes av det overflateaktive midlet, og de antigene sub-enhetene danner isopykniske bånd, og de fraksjoner eller den fraksjon som inneholder beskyttelsesantigen-subenheter, oppsamles og overføres på kjent måte i en som vaksine egnet administrasjonsform.

Mens det er mulig å fylle hele virioner direkte fra et relativt forynnet kulturmedium som f.eks. allantoinvæske, foretrekkes det vanligvis å gjennomføre en viss rensning av helvirus-preparatet før det spaltes i ultrasentrifugen.

For en slik rensing kan det hele, intakte, inaktiverte virus isoleres på vanlig måte. Influensavirus kan således eksempelvis dyrkes i 10 til 11 dager gamle hønseegg med embryo.

Den høstede allantoinvæsken kan så behandles, f.eks. med p-propiolakton og/eller formalin, for å inaktivere eller "drepe" viruset og så klarne ved sentrifugering, f.eks. i en "Westphalia" (varemerke) kontinuerlig strømsentrifuge.

Viruset kan så renses ytterligere. Mens dette kan gjennomføres ved å anvende kontinuerlig sedimenteringssentrifu-gering, behandling med fluorkarboner, gelfiltrering eller adsorpsjon på røde blodlegemer eller mineraler som for eksempel barium-sulfat og etterfølgende eluering, foretrekkes det for å oppnå rask og enkel behandling i større mengder å anvende kontinuerlig sonesentrifugering, eksempelvis ved å anvende et "KII"-apparat (fremstilt i Molecular Anatomy Program, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee 37830, USA og beskrevet av Anderson et al. i Analytical Biochem. 32, 400-494 og 495-511

(1969) og tilgjengelig fra Electro-Nucleonics Inc., 368 Passaic Avenue, Fairfiels, New Jersey, 07006, USA.)

En "KII"-rotor med 3,2 liters kapasitet med en sukrosetetthetsgradient er spesielt effektiv. Den anvendte metode kan være den til Reimer et al. (Journal of Virology, Vol 1, nr. 6, sidene 1207 - 1216). Etter rensing kan fraksjonene som inneholder virionene bestemt ved hæmaglutineringstiter, samles og fortynnes eller dialyseres for å minske tettheten til et nivå som passer for innføring til en gradient i det andre ultrasentrifugerings-trinn.

For spaltningstrinnet blir virionene påfylt, fortrinnsvis etter rensing som beskrevet ovenfor, på tetthetsgradi-entløsningen i en soneultrasentrifuge for kontinuerlig påfylling. Som ved virusrensing er det hensiktsmessige medium for

gradienten en sukkerløsning, spesielt sukrose, fortrinnsvis i bufret saltløsning ved et passende pH for viruset. Vanligvis er pH litt over 7 ønskelig og det er hensiktsmessig å anvende 0,01m fosfat som buffer ved pH 7,2. En tetthetsgradient på 1,02 til 1,24 g/ml er passende. Andre løsninger som kan anvendes som tetthetsgradient av denne størrelsesorden omfatter polyoler som for eksempel glyceroler og salter som for eksempel tartrater eller cesiumklorid. Gradienten kan fremstilles ved å fylle rotoren halvt med en løsning med den laveste tetthet av den ønskede gradient og tilsette et like stort volum av den høyeste tettheten. Kjøring av rotoren med moderat hastighet vil så gjøre gradienten ferdig.

Som angitt ovenfor, inneholder gradientløsningen

et overflateaktivt middel for å spalte viruset mens det går gjennom gradienten. Vanligvis kan det overflateaktive midlet i vannløsning innføres i gradienten og sentrifugerotoren kjøres i så lang tid at det overflateaktive midlet trenger inn i gradi-entløsningen. Alternativt kan det overflateaktive midlet være tilstede i gradientløsningen når den påfylles på rotoren. Mange av

de hæmolytiske overflateaktive midlene som kan anvendes i denne oppfinnelse danner distinkte bånd i gradienten, selv om bånddannelse ikke er en avgjørende egenskap. Båndets stilling i gradienten er ikke kritisk siden virionene som er relativt tunge, vil gå gjennom gradienten inntil de når dette båndet. Etter spaltning kan sub-enheter bevege seg til soner med passende tetthet som kan være på lavtetthetssiden av båndet med det overflateaktive midlet.

Som angitt bør det overflateaktive midlet være et hæmolytisk overflateaktivt middel. Med dette menes et overflateaktivt middel som vil gi et positivt resultat i følgende test: Røde blodlegemer fra kylling (0,5% volum/volum i 0,01m fosfat-bufret saltløsning med pH 7,0, 0,25 ml) tilsettes

til en 1%-ig vekt/volum vannløsning av det overflateaktive midlet (0,25 ml). For at resultatet skal være positivt må fullstendig hæmolyse inntre i løpet av 5 minutter ved 22°C.

Innbefattet i denne kategori er følgende typer av overflateaktive midler:

Ikkeioniske forbindelser.

Blandede forbindelser:

Vanligvis bør den minimale effektive mengde overflateaktivt middel anvendes for å minske problemet med å fjerne det etter på. For det foretrukne overflateaktive midlet, et aryleteraddukt av etylenoksyd, spesielt "Trton N101", er den totale konsentrasjonen i gradienten fortrinnvis minst 0,5% volum/volum, fordelaktig 1,0% volum/volum. Konsentrasjonen i det lokaliserte bånd på gradienten vil naturligvis være høyere enn dette. Noe overflateaktivt middel vil normalt være tilstede gjennom hele gradienten hvor ønskede sub-enheter av virionene danner bånd og dette hindrer eller minsker gjenforening av sub-enhetene. Dersom slik forening opptrer er sep-arasjonen fra uønsket antigent materiale dårlig.

Mediet som inneholder de rensede virioner føres så gjennom soneultrasentrifugen slik at de trenger inn i gradienten og spaltes av det overflateaktive midlet og danner bånd som sub-enheter. Vanligvis skal virionene påfylles med en mengde av 2,8 rotoryplumer pr. time, for eksempel ca. 10 liter pr. time for en 3,6 liters "KU" rotor. (Når virioner skal renses uten spalting, kan påfyllingsmengden være større, for eksempel 30 liter/time). Vanligvis er omdreiningshastigheten under påfylling av gradienten minst 20000 omdreininger/minutt, hensiktsmessig 3500 omdreinger/minutt som gir 90000 g i "KII"-sentrifugen.

Etterat "påfyllingen" er ferdig kjøres ultrasentrifugerotoren ytterligere en tid, for eksempel 2 til 3 timer, for ytterligere å skille og konsolidere båndene og, etter at rotoren langsomt er blitt bremset og stanset, skilles gradienten i fraksjoner. De fraksjonene som inneholder de ønskede sub-enheter kan så oppsamles.

I tilfelle av vira som avgir neuraminidase eller analoge materialer, kan dette fastslås ved standard prøvemetoder, for eksempel metoden til Warren (J. Biol. Chem. 234, 1959, s. 1971). I tilfelle av vira som frigir monovalent hæmaglutinin eller analogt materiale, kan dette ikke identifiseres ved prøve på hæmaglutina-sjon idet det oppnådde hæmaglutinin er i monovalent form og ikke oppviser slik aktivitet. Det er derfor nødvendig å bestemme den antigene effekten av prøvene (for eksempel ved hæmaglutinasjons-inhiberingstiter eller den enkle radialdiffusjonstest) eller måle en fysisk egenskap som for eksempel optisk tetthet, ultrafiolett-absorbsjon e.l. I noen tilfeller vil det finnes hæmaglutinin i de samme fraksjoner som neuraminidase.

Det anvendte virus er eter-sensitivt og som sådant vil det ha det nødvendige fjernbare belegg som inneholder antigent materiale. Det foretrukne virus er et influensavirus, men andre passende vira omfatter mesling- og kusma-virus hos mennesker og Newcastle-sykdomsvirus (NDV) hos fjærkre (som alle er myxovira)

og kveg-rhinotracheitisvirus (som er et Herpesvirus).

For anvendelse som vaksine må de oppsamlede antigene sub-enhetsfraksjoner være i det vesentlige frie for overflateaktivt middel og dette kan oppnås ved i tilfelle av ikke-ioniske overflateaktive midler, som for eksempel "Triton N101", å

senke uklarhetspunktet ved tilsetning av ionisk materiale til det fortynnede vandige medium, slik at det overflateaktive midlet

skiller seg ut som en ny fase. Det er imidlertid fordelaktig å skille sub-enhetene ved selektiv adsorpsjon på kolloidalt aluminiumhydroksyd (for eksempel "Alhydrogel") og la det overflateaktive midlet for-bli i løsningen. Denne fremgangsmåte kan ønskelig utføres som et andre trinn etter senkning av uklarhetspunktet, i de tilfeller den kan anvendes. Anvendelse av aluminiumhydroksydet har den fordel at antigenene oppnås i en form hvor de foreligger i kombinasjon med tilsetningsmidler slik at de kan anvendes som vaksine i foreliggende form. Alternativt kan antigenene, etter at de overflateaktive midlene er fjernet, tilsettes andre passende tilsetningsmidler som for eksempel oljeemulsjoner, for eksempel emulsjoner av vann i en oljeformig fettsyreglycerid, som for eksempel peanøttolje. Slike emulsjoner kan inneholde ikke-ioniske emulgeringsmidler som for eksempel sorbitan-trioleat og en stabilisator som for eksempel aluminiummonostearat.

Styrken av "Alhydrogel"-adsorbert influensa sub-enhets-vaksine ble sammenliknet med vandig hel influensavirionvaksine. Resultatene gjengis i den følgende tabell. Styrken ble fastslått

ved å inpjculere grupper på 5 kyllinger intramuskulært i benet med 0,5 ml vaksinefortynninger på dag 0 og dag 14 og blødende på dag 28. Haemaglutinasjonsinhibering og antineuraminidaseantilegemer ble fastslått.

Vandig virus av enkel styrke, basert på hæmaglutina-sjonstiter, inneholdt 400 i.e./ml. Sub-enhetsvaksinen av enkel styrke inneholdt en ekvivalent mengde antigen. Disse resultater viser at den adsorberte sub-enhetsvaksinen har like stort eller større antigeninnhold enn vandig helvirusvaksine.

Ifølge oppfinnelsen skaffes

en fremgangsmåte for fremstilling av en tilsetningsmiddelholdig sub-enhetsvirusvaksine som inneholder beskyttende antigene komponenter og den er i det vesentlige fri for pyrogener, nukleinsyrer og uønskede antigener, omfattende trinnet å adsorbere den ønskede beskyttende antigene komponent oppnådd ved den foregående fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen på kolloidalt aluminiumhydroksyd, fortrinnsvis etter først å ha fjernet det meste av eventuelt gjen-værende overflateaktivt middel. Ikke-ioniske overflateaktive midler kan eksempelvis fjernes ved uklarhetspunkts-senkning.

Det kolloidale aluminiumhydroksydet som anvendes inneholder hensiktsmessig ca. 24 som A1(0H)3, for eksempel "Alhydrogel". Sluttkonsentrasjonen av den 2%-ige aluminiumhydroksydgelen i vaksinen bør vanligvis fortrinnsvis være fra 6,0 til 18% volum/volum, fortrinnsvis ca. 12,5% volum/volum. Den adsorberte vaksinen kan om ønsket vaskes fr^ for eventuelle forurensninger, for eksempel rester av overflateaktive midler, ved å sentrifugere aluminiumhydroksydet og suspendere den på nytt i fersk fosfatbufret salt-løsning. Optimalt pH i sluttvaksinen er fra 7 til 8, fordelaktig ca. 7,6.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1

Influensavirustype A/Hong Kong/l/68X ble dyrket i 11 dager gamle hønseegg med embryo. Allantoinvæsken ble høstet etter 48 timer, inaktivert med 6-propiolakton (1 ml/1000 ml allantoinvæske) over natten ved romstemperatur og så klaret ved hjelp av en "Westphalia" (varemerke) kontinuerlig strømsentrifuge. Den klare, inaktiverte allantoinvæsken fikk strømme med 10 l/time over en gradient fremstilt fra 60% vekt/volum sukrose i 0,01m fosfatbufret saltløsning pH 7,2 (1,8 liter) og ren O.Olm fosfatbufret salt-løsning pH 7,2 (1,4 liter) i en "KII"-rotor. Rotorhastigheten var 35000 omdr./min. (90000g) og den ble kjørt i2 timer etter at all allantoinvæsken var tilsatt. De fraksjoner som inneholdt influensavirioner, som bestemt av deres hæmaglutinintitre ble oppsamlet (13500 i.e./ml,. ialt 1500 ml).

Virionene fantes i de fraksjoner som inneholdt 40% vekt/volum sukrose og ble fortynnet 1:8 i 0,01m fosfatbufret saltløsning med pH 7,2 til en sukrosekonsentrasjon på 5% vekt/volum. De fortynnede virionene fikk strømme over en sukrosegradient inneholdende 1% "Triton N101" i "KII"-rotoren med 10 liter/time. sukrose-gradienten ble fremstilt ved å fylle den stasjonære rotor med 1,8 liter 60%-ig vekt/volum sukrose i 0,01m fosfatbufret salt-løsning med pH 7,2 som også inneholder "Triton NlOl" (1% volum/volum), og 1,4 liter 0,01m fosfatbufret saltløsning med pH 7,2 øverst og så akselerere rotoren til 90000g (35000 omdr./min.). Rotoren ble kjørt med 35000 omdr./min. i 2 timer etter at all influensavirus var tilsatt. De fraksjoner som inneholder dé store neuraminidase-og "Triton"-toppene ble oppsamlet. Hæmaglutinin var også til stede (504 av startmengden ifølge hæmaglutinintiter). Til 3 deler av de oppsamlede fraksjoner ble det tilsatt 1 del l,6m fosfatbuffer med pH 7,6. Blandingen ble uklar og fasene ble separert ved ro-tering ved 2000g i 20 minutter. Den underste fasen ble oppsamlet

og inneholdt neuraminidasen og hæmaglutininet med bare ca. 0,054 volum/volum "Triton N101" (utbytte 40%). Til en alikvot (10 ml)

ble det tilsatt et like stort volum "Alhydrogel" og blandingen fikk adsorbere over natten ved 4°C. Fortynninger ble gjort og styrken av fortynningen bestemt på kyllinger. Etter at den for-tynning som ga en adekvat vaksine var bestemt, ble all vaksinen fortynnet til denne styrke, men den sluttlige "Alhydrogel"-konsentrasjonen ble holdt på 12,54. Før vaksinen ble tilsatt hjelpemidler ble styrken bestemt ved enkelradialdiffusjonsmetoden til Schild (J. Gen. Virology, 16, (1972) s. 231-236).

Eksempel 2

Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt bortsett fra at "Ethomeen 18/25" erstattet "Triton N101"i gradienten.

Eksempel 3

Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt, men "Triton N101" ble ikke separert ved uklarhetspunkts-senkning. Isteden ble det til fraksjonene fra "KII"-sentri|ugen inneholdende hæmaglutininet, neuraminidasen og "Triton N101" tilsatt 12,54 volum/volum "Alhydrogel". Blandingen ble holdt ved 4°C over natten og "Alhydrogel"-en utsentrifugert. Den overliggende væske inneholdt "Triton N101". Pelleten ble suspendert i sitt opprinnelige volum 0,01m fosfatbufret saltløsning med pH 7,2, sentrifugert og pelleten gjensuspehdert i dens opprinnelige volum 0,01m fosfat-bufret saltløsning. Styrken til vaksinen ble bestemt som i eksempel 1 og vaksinen fortynnet på tilsvarende måte idet sluttkonsentrasjonen av "Alhydrogel" ble holdt på 12,5% volum/volum.

Eksempel 4

Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt med influensavirus stammen B/Hong Kong/8/73 slik at det ble oppnådd en potent vaksine.

Eksempel 5

Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt med influensavirusstammen B/Victoria/98926/70 slik at det ble oppnådd en potent vaksine.

Eksempel 6

Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt med influensavirus stamme A/England/42/72 slik at det ble oppnådd en potent vaksine.

Eksempel 7

Newcastle-sykdomsvirus ble dyrket i 10 dager gamle hønseegg med embryo. Allantoinvæsken ble høstet etter 96 timers forløp, inaktivert med g-propiolakton (1 ml pr. 1000 ml væske) i 2 timer ved 37°C. Løsningen ble sentrifugert ved 1000g ved en strømningshastighet på 20 liter/time for å klarne og fjerne urater fra løsningen.

Den klarnede allantoinløsningen ble ført i en strøm over en sukrosegradient fremstilt som i eksempel 1 i "KII"-rotoren med 10 liter/time. Rotoren ble sentrifugert med 35000 omdr./min. i 2 timer etter at all allantoinvæsken var tilsatt.

De fraksjoner som inneholdt sub-enhetene, bestemt ved neuramini-daseinnholdet, ble oppsamlet. Resten av fremgangsmåten var som i eksempel 1.

Eksempel 8

De fraksjoner/som inneholdt influensaneuraminidase

og -hæmaglutinin fra eksempel 1 etter at "Triton N101" hadde

blitt fjernet ved uklarhetspunktssenkning, ble oppsamlet og fortynnet med 0,01m fosfatbufret saltløsning med pH 7,2 slik at det ble oppnådd en væske inneholdende 1600 i.e. hæmaglutinin/ml. Den ble så homogenisert i følgende mengdeforhold.

(Aluminiummonostearatet ble oppvarmet i den vegetabilske oljen for å bli dispergert og sorbitantrioleatet ble tilsatt før inn-blandingen i den vandige fasen).

Antigenisiteten for denne vaksinen ble bekreftet i kyllinger.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, særlig en influensavaksine, ved å dyrke et virus, særlig influensavirus, i en vevkultur eller i allantois fra fjærfe-egg med embryo, oppsamle væsken inneholdende virioner, og eventuelt inaktivere, klargjøre og konsentrere fraksjonen(e) inneholdende virionene, karakterisert ved at fraksjonene inneholdende virionene innføres i en ultrasentrifuge med kontinuerlig fylling som er utstyrt med en tetthets-gradientløsning inneholdende et hæmolytisk overflateaktivt middel, hvorved virionene går over i tetthetsgradienten og spaltes av det overflateaktive midlet, og de antigene sub-enhetene danner isopykniske bånd, og de fraksjoner eller den fraksjon som inneholder beskyttelsesantigen-subenheter, oppsamles og overføres på kjent måte i en som vaksine egnet administrasjonsform.

2. • Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som tetthetsgradient-løsning anvendes en sukrose-løsning.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som overflateaktivt middel anvendes nonylfenol-9-10-oksyetylen.