DE19938767C2 - Spaltimpfstoffe - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Spaltimpfstoffen und die
damit hergestellten Impfstoffe.
Als Spaltimpfstoffe oder Spaltvakzine bezeichnet man Impfstoffe, die statt des
nativen Antigens dessen durch Spaltung gewonnene, immunogene Untereinheiten
enthalten. Virusspaltimpfstoffe werden aus der immunogenen Lipidhülle von mit
einer Hüllmembran umgebenen Viren gewonnen. Zur Herstellung des Impfstoffes
wird zuerst das Virus in einer geeigneten Zellkultur oder einem geeigneten
Medium in an sich bekannter Weise gezüchtet. Die Viruspartikel werden dann
durch Maßnahmen, wie Zentrifugation mit Gradienten, Filtration und/oder
Adsorption/Elution, an geeigneten Adsorbentien aufkonzentriert und gereinigt.
Anschließend wird die Hüllmembran aufgebrochen, und die Bruchstücke werden
gewonnen. Bei den bisher bekannten Verfahren erfolgte die Spaltung der Viruspartikel
bzw. der Hüllmembran durch oberflächenaktive Substanzen mit dem
Ziel, die Reaktogenität der Impfstoffzubereitung zu vermindern. So ist ein Ver
fahren bekannt, bei dem Tween 80® in Verbindung mit Ethylether verwendet
wird. Die Verwendung von Ether wirft jedoch sicherheitstechnische Probleme bei
der Produktion auf.
Weiterhin ist aus US-Patent Nummer 3 962 421 die Verwendung einer Kombi
nation aus Tween 80® mit Tri-(n-butyl)-phosphat bekannt. Bekannt ist auch die
Verwendung von Desoxycholsäure (DE-OS 16 17 288, DD 211 444), von
Cetylammoniumbromid (DE 25 00 785 A1), Triton N101® (DE 24 49 530 A1) sowie
Triton X100® (US PS 4 327 182, EP 0 041 880 A1, EP 0 776 362 A1, DE 30 14 189 A1).
Die Detergenzien müssen dazu in einer Konzentration von mindestens
0,5% verwendet werden. Gleichzeitig darf die Viruskonzentration nicht zu hoch
sein, da sonst die Spaltung unvollständig erfolgt. Mehr als 1 mg/ml
Viruskonzentration ist für diese Verfahren nicht geeignet.
All diese Verfahren haben den Nachteil, daß für eine Verwendung als Impfstoff
die Detergenzien entfernt werden müssen und die Beseitigung der zur
Virusspaltung eingesetzten Detergenzien mit erheblichen Schwierigkeiten
verbunden ist. Die Schwierigkeiten beruhen auf der sehr niedrigen, kritischen
Micellenkonzentration dieser Substanzen, die extreme Dialysebedingungen oder
Fällungsoperationen für eine hinreichende Verminderung ihrer Konzentration
erfordern. So liegt die kritische Micellenkonzentration für Triton X100® bei 0,24 mM,
für Tween 20® bei 0,06 mM und für Tween 80® sogar bei nur 0,012 mM.
Die Erfinder haben sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren bereitzustellen,
mit dem Virusspaltimpfstoffe in einem einfachen, reproduzierbaren Verfahren
hergestellt werden können, ohne daß aufwendige Reinigungsschritte zur Entfer
nung von Detergenzien durchgeführt werden müssen.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren zur Herstellung von Spaltimpf
stoffen, bei dem die Lipidhülle von Viruspartikeln in Untereinheiten aufgespalten,
die Bruchstücke von unerwünschten Bestandteilen befreit und dann als Impfstoff
eingesetzt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Spaltung der
Lipidhülle eine Fettsäure R-COOH, deren Rest R eine geradkettige oder
verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 2-17 Kohlenstoff
atomen ist, oder Salze davon verwendet werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Verwendung einer Fettsäure oder
eines Fettsäuresalzes eine sehr effektive Aufspaltung der Lipidhülle bewirkt.
Dabei werden sowohl die Hülle als auch das Capsid aufgebrochen. Durch die
Aufspaltung werden sowohl Hämagglutinin als auch Neuraminidase freigesetzt
und können in einfacher Weise ohne Anwendung extremer Bedingungen von den
unerwünschten Bestandteilen, z. B. den Lipidbestandteilen abgetrennt werden.
Durch die Behandlung erfolgt außerdem eine Ablösung der Capsomeren von der
RNA oder DNA, so daß die dann schutzlos vorliegende Nucleinsäure von den
ubiquitär vorhandenen RNasen bzw. DNasen schnell und weitgehend zerstört
wird. Das Nucleoprotein der Capsomeren kann, soweit es nicht in aggregierter
Form vorliegt, durch Filtration entfernt werden. Damit kann erfindungsgemäß
Hämagglutinin und Neuraminidase in guter Ausbeute in einfacher Weise
gewonnen werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Viruspartikel behandelt, die in an
sich bekannter Weise, wie oben ausgeführt, gewonnen wurden. Das erfindungs
gemäße Verfahren ist zur Herstellung von Impfstoffen von Viren, z. B. DNA- oder
RNA-Viren, geeignet, die eine Hüllmembran aufweisen. Als Beispiele können
Influenza- und Herpesviren genannt werden. Die Viren werden in an sich
bekannter Weise gezüchtet. So erfolgt die Züchtung von Influenzaviren
beispielsweise bevorzugt in der Allantoisflüssigkeit embryonierter Hühnereier.
Die Viruspartikel werden mit der Fettsäure oder mit dem Fettsäuresalz in Kontakt
gebracht. Entweder wird eine Viruspartikelsuspension mit der erfindungsgemäß
verwendeten Fettsäure oder dem Fettsäuresalz in Kontakt gebracht und dann
eine Auftrennung der aufgebrochenen Lipidhülle bewirkt. Ebenso kann die Fett
säure oder das Fettsäuresalz einer Viruspartikelsuspension zugegeben werden,
während diese durch Zentrifugation mit einem Gradienten behandelt wird. Wich
tig ist nur der Kontakt der Fettsäure oder des Fettsäuresalzes mit der Lipidhülle
der Viruspartikel. Die Behandlung der Virussuspension sollte bei neutralen, leicht
sauren oder leicht basischen pH-Werten stattfinden, da stark saure oder stark
basische pH-Werte zu unerwünschten Nebenreaktionen führen können. Bevor
zugt wird der pH-Wert in einem Bereich zwischen 6 und 8,5 eingestellt.
Wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung
einer Fettsäure oder eines Fettsäuresalzes, um die Lipidhülle aufzuspalten. Als
Fettsäure wird eine Säure der Formel R-COOH verwendet, deren Rest R eine
geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 2 bis
17 Kohlenstoffatomen ist, oder ein Salz davon. Wesentlich ist, daß die Fettsäure
auf die Lipidhülle einwirken kann. Als besonders geeignet haben sich Fettsäuren
mit einer ungeraden, gesättigten Alkylgruppe erwiesen, wobei die Alkylgruppe
besonders bevorzugt 3 bis 11 Kohlenstoffatome, insbesondere 5 bis 11 Kohlen
stoffatome aufweist. Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden mit Caprylsäure
oder einem Caprylsäuresalz erzielt.
Als Salze der Fettsäure kommen vor allem aufgrund ihrer Verfügbarkeit die Al
kali- und Ammoniumsalze in Betracht, die außerdem auch leicht abzutrennen
sind und physiologisch keine nachteiligen Wirkungen hervorrufen. Aufgrund
seiner Verfügbarkeit und der physiologischen Eigenschaften ist das Natriumsalz
besonders bevorzugt.
Um die Lipidhülle der Viruspartikel zu spalten, wird die Fettsäure oder das Fett
säuresalz in einem hierzu geeigneten Anteil eingesetzt. Als geeignet hat sich ein
Anteil von 0,01 bis 1 M/l erwiesen. Bevorzugt wird die Fettsäure oder das
Fettsäuresalz mit einem Anteil von 0,05 bis 0,3 M/l eingesetzt.
Damit das Verfahren wirtschaftlich durchgeführt werden kann, sollte die Konzen
tration der Viruspartikelsuspension nicht zu gering sein. Andererseits sollte die
Konzentration nicht zu hoch sein, um eine quantitative Reaktion zu gewährlei
sten. Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik kann erfindungs
gemäß eine Konzentration bis zu 6 mg/ml eingesetzt werden und trotzdem eine
praktisch vollkommene Spaltung erreicht werden. Bevorzugt wird eine
Viruspartikelsuspension eingesetzt, die 0,2 bis 6 mg/ml an Viruspartikeln enthält.
Die Spaltung der Membranhülle erfolgt bevorzugt bei Temperaturen in einem
Bereich von 4° bis 30°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur, d. h. bei
einer Temperatur im Bereich von 20 bis 25°C. Die Fettsäure oder das Fettsäure
salz wird solange einwirken gelassen, bis Bruchstücke der Hüllmembran erhalten
werden. Dies ist in der Regel nach 5 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise
nach 30 Minuten bis zu 2 Stunden der Fall.
Das erfindungsgemäße Verfahren kommt völlig ohne die Verwendung der im
Stand der Technik verwendeten Detergenzien aus. In einer bevorzugten Ausfüh
rungsform wird jedoch der Viruspartikelsuspension während oder nach der Auf
spaltung mit einer Fettsäure oder einem Fettsäuresalz eine geringe Menge eines
Detergenzes zugesetzt, um eine Reaggregation der Spaltprodukte zu verhindern.
Für diesen Zweck ist eine Menge von weniger als 0,3 Gew.-% eines Detergen
zes ausreichend. Als Detergenzien geeignet sind z. B. Triton X100®, Triton N101®,
Tween 80® oder Tween 20®.
Zur Herstellung der Virusspaltimpfstoffe wird in einer bevorzugten Ausführungs
form eine in an sich bekannter Weise gereinigte Viruspartikelsuspension mit
Fettsäure oder einem Fettsäuresalz bis zu einer Konzentration von 0,3 M/l bei
einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 versetzt, wobei eine sehr effektive Aufspaltung
der Viren in ihre Untereinheiten erfolgt.
In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform wird eine Viruspartikelsuspen
sion auf einen Saccharosegradienten zusammen mit einer Fettsäure oder einem
Fettsäuresalz in einem Anteil von 0,3 M/l aufgegeben und in einem Zonalrotor
zentrifugiert. Nach der Zentrifugation können dann die Fraktionen, die die Ober
flächenantigene des Virus enthalten, gesammelt werden. Dieses Verfahren kann
bis zu einer Viruskonzentration von 10 mg/ml durchgeführt werden.
Bei beiden Varianten wird nach der Spaltung eine Aufreinigung des Präparates
durchgeführt. Dazu wird die antigenhaltige Suspension durch Tangentialfiltration
unter Verwendung von Membranen, die bevorzugt Proteinmoleküle mit einer
Größe von 100 kD und mehr zurückhalten, gereinigt. Insbesondere sollen durch
diese Filtration die Fettsäure oder das Fettsäuresalz und gegebenenfalls
Detergenzien entfernt werden. Diese Tangentialfiltration (Diafiltration) erfolgt
unter Durchsatz des 10- bis 20-fachen Volumens an PBS. Auf diese Weise
können sehr reine Präparate von Hüllmembranbruchstücken erhalten werden, die
daher auch wenig Nebenwirkungen erzeugen. Anschließend kann dann noch die
Hämagglutininkonzentration eingestellt werden, und in der Regel schließt sich
dann noch eine Endsterilfiltration durch Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm
an.
Unter Umständen kann es erwünscht sein, daß in dem Spaltimpfstoffpräparat
nicht nur Bruchstücke der Hüllmembran enthalten sind, sondern auch ein kleiner
Anteil von gespaltenen Nucleoproteinen, um die T-Zell-Antwort weiter zu
stimulieren. In dieser besonderen Ausführungsform wird die Tangentialfiltration
bevorzugt unter Verwendung von Membranen durchgeführt, die Proteinmoleküle
einer Größe von ≧ 50 kD zurückhalten.
Die erfindungsgemäß hergestellten Spaltimpfstoffe haben einen hohen Gehalt an
Hämagglutinin und sind daher aufgrund ihrer hohen Immunogenität gut als Impf
stoffe geeignet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Als Ausgangsmaterial wurde Influenzavirus A/Sydney VR 108 (H3N2) verwen
det, das in 11 Tage vorbebrüteten, embryonierten Hühnereiern während
72 Stunden bei 35°C angezüchtet worden war. Die Allantoisflüssigkeit wurde durch
Filtration und Zentrifugation geklärt und anschließend durch Tangentialfiltration
unter Verwendung einer Membran, die Proteinmoleküle der Größen von 100 kD
und größer zurückhält, 20-fach konzentriert. Anschließend erfolgte eine
Virusreinigung im Saccharosegradienten (10-60%) im Zonalrotor. Die
Fraktionen, die dem Viruspeak entsprachen, wurden einer Tangentialfiltration zur
Reduktion der Saccharose unter 5% unterworfen und erneut über einen
Saccharosegradienten im Zonalrotor gereinigt.
Die virushaltigen Hauptfraktionen, insgesamt 300 ml, wurden mit einer 4,8-fach
konzentrierten Spaltlösung versetzt, so daß eine Endkonzentration von Octanoat
von 0,3 M, von Triton X100® von 0,25% und von Tween 80® von 0,02% resul
tierte. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei Zimmertemperatur wurde
das Lysat durch Tiefenfilter mit einer Durchlaßfähigkeit von bis zu 0,65 µm fil
triert und anschließend durch Tangentialfiltration über eine Membran, die Pro
teinmoleküle der Größen von 100 kD und größer zurückhält, von unerwünschten
Komponenten (Octanoat, Saccharose, Triton X100®, Tween 80®), soweit erforder
lich, befreit. Nach Einstellung des Antigengehaltes auf 100 µg Hämagglutinin pro
ml, Formaldehydbehandlung (0,01%) und Sterilfiltration resultierte ein Monobulk.
Die Ausbeute an Hämagglutinin betrug 42,6 mg aus 12 Litern Rohallantoisflüssig
keit.
Als Ausgangsmaterial wurde Influenzavirus B/Harbin/7/94 verwendet, das in
11 Tage vorbebrüteten, embryonierten Hühnereiern während 72 Stunden bei 33°C
angezüchtet worden war. Die Aufarbeitung erfolgte in der gleichen Weise wie in
Ausführungsbeispiel 1.
Es resultierte ein Monobulk mit insgesamt 43,2 mg Hämagglutinin aus 12 Litern
Rohallantoisflüssigkeit.
Als Ausgangsmaterial wurde Influenzavirus A/Sydney VR 108 (H3N2) verwen
det, das in 11 Tage vorbebrüteten Hühnerembryonen während 72 Stunden bei
35°C angezüchtet worden war. Die Allantoisflüssigkeit wurde durch Filtration
und Zentrifugation geklärt und anschließend durch Tangentialfiltration unter
Verwendung einer Membran, die Proteinmoleküle der Größen von 100 kD und
größer zurückhält, 20-fach konzentriert. Anschließend erfolgte eine Virusreini
gung im Saccharosegradienten (10-60%) im Zonalrotor. Die Fraktionen, die
dem Viruspeak entsprachen, wurden einer Tangentialfiltration zur Reduktion der
Saccharose unter 5% unterworfen und im Durchlaufverfahren auf einen 10- bis
60%-igen Saccharosegradienten im Zonalrotor aufgetragen. Dieser enthielt im
Bereich der 50%-igen bis 30%-igen Saccharosekonzentration eine Endkonzentra
tion von Octanoat von 0,3 M, von Triton X100® von 0,25% und von Tween 80®
von 0,02%. Nach Beendigung der Zentrifugation wurde der Gradient fraktioniert,
und die hämagglutininhaltigen Fraktionen wurden durch Tangentialfiltration über
eine Membran, die Proteinmoleküle der Größen von 100 kD und größer zurückhält,
von unerwüschten Komponenten (Octanoat, Saccharose, Triton X100®,
Tween 80®) soweit erforderlich befreit. Nach Einstellung des Antigengehaltes auf
100 µg Hämagglutinin pro ml, Formaldehydbehandlung (0,01%) und Sterilfiltra
tion resultierte ein Monobulk, Die Ausbeute an Hämagglutinin betrug 50,1 mg
aus 12 Litern Rohallantoisflüssigkeit.
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung von Spaltimpfstoffen, bei dem die Lipidhülle von
Viruspartikeln in Untereinheiten aufgespalten, von unerwünschten
Bestandteilen befreit und dann als Impfstoff eingesetzt wird,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Spaltung die Lipidhülle eine Fettsäure R-
COOH, deren Rest R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder
ungesättigte Alkylgruppe mit 2-17 Kohlenstoffatomen ist, oder Salze davon
verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R der Fettsäure 3-11 Kohlenstoff
atome aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure Caprylsäure ist.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure oder das Fettsäuresalz in einem
Anteil von 0,05 bis 0,3 M pro Liter verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung bei einem pH-Wert von 6 bis
8,5 durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Viruspartikel auf 0,2
bis 6 mg/ml eingestellt wird.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Detergenz in einer
Konzentration von ≦ 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtlösung,
verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung mit der Fettsäure oder dem Salz
davon in einem Saccharosegradienten in einem Zonalrotor durchgeführt
wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure oder deren Salz vorwiegend in
den Zonen der Saccharosekonzentration auf 30 bis 50% vorhanden ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß nach Durchführung des Spaltens die Dis
persion durch Filtration und/oder Diafiltration von unerwünschten Sub
stanzen befreit wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, daß für die Filtration Filter mit einer Porengröße
von 0,6 bis 0,3 µm verwendet werden und die Diafiltration gegen das
10- bis 20-fache Volumen an PBS über Membranen mit einer Ausschluß
grenze von ≦ 100 kD durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß die Diafiltration mit einer Membran mit einer
Ausschlußgrenze ≦ 60 kD durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß als Virus Influenza-Virus verwendet wird.
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- 1999-08-16 DE DE19938767A patent/DE19938767C2/de not_active Expired - Fee Related
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DE19938767A1 (de) | 2001-03-29 |
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