DE1948826A1

DE1948826A1 - Verfahren zur Herstellung von Ribonucleinsaeureprodukten

Info

Publication number: DE1948826A1
Application number: DE19691948826
Authority: DE
Inventors: Jerome Birnbaum; Lampson George Peter
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1968-09-27
Filing date: 1969-09-26
Publication date: 1970-04-02
Also published as: DK122821B; NO128874B; FR2019035A1; NL6913715A; CH542924A; BE739424A; ZA695957B; IL32997A; IL32997A0; ES371839A1; GB1230065A; US3582468A; BR6912610D0

Description

Verfahren zur Herstellung von Ribonueleinsäureprodukten

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Interferon-Erzeugern und Insbesondere ein Verfahren zur Isolierung und Gewinnung von doppelfasrlger Bibonuolelnsäure, die durch Esoherichia ooli (E. coil)-Zellen« die mit MS2-Collphag· oder anderen MS2-ähnllohen Phagen^ wie dem MU-9-Mutanten, modifiziert worden sind , produziert wird.

Die Tatsaohe, dass doppelfasrige Ribonucleinsäure aus dieser Quelle stammt, wird in dem Artikel "Erzeugung von Interferon und Resistenz des Wirtes, IV, Doppelfasrige Repllkativform RNA (MS2-RF-RNA) aus E. coil, die mit MS2=Coliphage infiziert sind", von A. K. Field, Q. P. Lampson, A. A. Tytell, M. M. Nemes und H. R» Hilleman/ dor in "Proceedings of the National Aoademy of Sciences"(U.S.)· Band 58, Nr. 5, Selten 2102 bis 2108 (November 1967) erschienen 1st, festgestellt· In diesem Artikel wird berichtet, dass MS2-Coliphage in Zellen von B. ooli gewachsen, eine doppelfasrige RNA während des Wiederholungssyklus produziert. Diese doppelfasrige HNA hat sioh nach ihrer Isolierung und Reinigung als ein ausgezeich- .

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neter Erzeuger von Interferon herausgestellt, wenn man sie Tieren einverleibt. .v

Der Artikel beschreibt die Art der E. coil-Kultur, seine Infizierung mit MS2-Coliphage, die Lysis der Zellen, wieder- ■-A holte Extraktionen mit Phenol* um das Protein zu entfernen, die Behandlung mit pankreatischer Ribonuoleaee zur Verdauung der einfasrigen Ribonuel®ins££ure, die Behandlung mit Desoxy« rlbonuolease zum Abbau der zellfuraslgen Desosyribonuoleinsäure, die ansohliessende Behandlung mit Bentonit (d. h. Maoaloid) oder einem ähnliehen Ribonuelease-Inhibitor und die Anwendung der Gelfiltration (d. h. Sephadex 0200) zur Gewinnung der doppelfasrigen Hibonueleinsäure in einer gereinigten Forme Eine weitere Reinigung eis die vorbeschriebene erzielt man durch Chromatographie des hoohmolekulargewiohtigen Materials (elulert in der ausgeschiedenen ITolumenfraktion der Seifiltration) über eine Cellulosesäule, die vorher mit Triäthanol und Ipiohlorhydrln (d. h. Ecteola-CeXlulose) behandelt worden ist. Die Cellulose hilft dabei, verunreinigende Folysaooharldanteile zu entfernen und erlaubt auch die Gewinnung der doppelfasrlgen Hibonuoleinsäure (im nachfolgenden als DS-RNA bezeichnet) in konzentrierterer Form· Das vorherige Relnigungs- oder. Isolierverfahren wird auöh in den fol« genden weiteren Yeröffentlichungen besehriebens C. Weissm&n, P. Borst, R* H. Bardon, M. A. Billeter und S. Ochoa, "Proc. Nucleiο Acid Research", 51» 602 (1964); M; A.^ Billeter, C» Weisswan und R. C. Warner, "J. Hole Biol." 17, 145 (10β6)|

M. Ax Billeter ujjd C. Veieeaca "Proc. Mueleio Acid Researoh", Harper und Roü« New York, 1966.

Das laoliervarfahren, wie es in den Berichten wird» 1st ausreichend ftf? ftenBentationsbrfihen, in denen ver-

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hältnismässig verdünnte ZeI!konzentrationen gehandhabt werden» Eine Fermentatlonsbrlihe, die Jedoch erheblich mehr Zellwaohstura enthült und die darum ziemlich konzentriert 1st» lässt sich naoh des in den Aufsätzen beschriebenen Verfahren nicht reinigen. Beispielsweise sind kurzlich Fortschritte von Dr. Barbara Lago berichtet worden* aus denen hervorgeht» dass das Wachstum von E. coil in einem flüssigen Maisbaaemedium und die Infizierung mit dem MU-9-Mutanten des MS2-Collphage eine bis zu zehnfache Erhöhung, die mit dem Zellwachstum noch grosser wird, und eine entsprechend grSssere Menge von DS-BNA produziert. Tinter diesen Umständen wird die Fermentationsbrühe so dicht, dass die bisherige Isolationsmethode unzureichend, unökonomisoh und nur schwer durchführbar wird.

Der Grund für die Undurchführbarkeit der bisherigen Verfahren für Fernentatlonsbrühen, welche grosse Mengen an Bakterien enthalten, liegt wahrscheinlich in der Bildung von sehr viscosen Zwischenphasen des denaturierten Proteins während der ersten Phenolextraktion, bei der das Protein entfernt wird. Diese Zwischenphase macht es ausserordentlich schwierig, die wässrige Phase (enthaltend Nucleinsäure) von der Phenolphase abzutrennen· Ausserdem wird ein grosser Teil der Nucleinsäure, einsohllessllch DS-BNA, in dem Zwischenphasenmaterial festgehalten. Durch Waschen der Zwischenphase, wie dies bei den früheren Verfahren vorgeschlagen wurde, kann man nur einen Teil der eingeschlossenen Nucleinsäure befreien. Ausserdem wird durch die Schwierigkeit beim Trennen der wässrigen von der Fhenolphase die Anwendung von sieben Phenolextraktionen bei der Isolierung erforderlich. Als Ergebnis werden darum viele Ausfällungen mit Alkohol und entsprechend viele Zentrifugen« stufen erforderlich, um die Entfernung des Phenols aus der NucleinsäurelBsung zu bewerkstelligen.

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Die Verminderung oder Verhinderung des Zwischenphasenmaterials stellt eine wesentliche Verbesserung bei der Isolierung dar. 0emäs8 der vorliegenden Erfindung wird dies ermöglicht, indem man Pronase oder eine ähnliche Proteinaee zu der Zeil» aufschlämmung während der Lysis der Zellen durch Natriümdodecylsulfat hinzufügt. Die Promise wird in einer Menge zugegeben, dass man eine 0,25- bis 1,0 mg/ml-Aufschlämmung erhält, wobei eine 0,50 mg/ml-Aufschlämmung bevorzugt wird. Aktivere oder weniger aktive Proteinasen, die man auch verwenden kann, erfördern eine proportioneile Änderung in der rag/ml-Konzentration.

Pronase, einj proteolytisches Enzym, das aus Streptomyoes griseus extrahiert wird, stellt ein äusserst aktives, nichtspezifisches proteolytisches Enzym dar, welches Nucleinsäure nicht abbaut· Die Pronase-Behandlung baut das Protein in dem Lysat vollständig ab und verhindert dadurch die Zwischenphase während der ersten Phenolextraktion· Die Verminderung der Zwischenphasenbildung ist so gross, dass alle bis auf eine Phenolextraktion vermieden werden können. Dadurch wiederum wird die Notwendigkeit für zwei Ausfällungen mit Alkohol vermieden und auch die Zahl der Zentrlfugatlonen herabgesetzt. Die Vorteile des Pronase-Verfahrens sind die folgenden:

1) Verhinderung von Protein in der Zwischenphase während der Phenolextraktion, wodurch die wässrige Phase, welche DS-RNA enthält, leicht gewonnen werden kann;

2) Erhöhung der insgesamt Isolierten Menge an DS-RNA;

3) Kostenverminderung durch Ausschalten von sechs der sieben Phenolbehandlungen, Verminderung der Zahl der Ausfällungen mit Alkohol und der Zentrlfugationen;

4) Ausschalten von allen möglichen Abbaueffekten, die E.

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coli-Nuoleasen bei DS-RNA. bewirken können. Enzyme, welche native DS-RNA abbauen können« wurden in E« ooli gefunden· Die Behandlung mit Pronase würde eine solche Aktivität vernichten (siehe Robertson und Hitarbeiter, "J. Biol, Chan "242, 82-91, 1968);

5) Vermeidung der Anwendung eines Ribonuclease-Inhibitors, wie Macaloidj

6) Erleichterung bei der Handhabung der konzentrierten Zellpasten in geringen Extraktionsvoluraina.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden) Erfindung besteht in der Anwendung einer quaternären Ammoniumverbindung mit einem Cetylrest an vierwertigen Stickstoff als Fällungemittel für die letzte Reinigung und Konzentration der doppelfasrigen Ribonucleinsäuren Diese quaternäre Ammoniumverbindung wird anstelle einer Säulenchromatographie auf Ecteola-Cellulos© verwendet. Die Vorteile, die durch die Verwendung der quaternären Ammoniumverbindung mit dem Cetylrest erzielt werden, sind die folgenden:

1) Diese Verfahrensweise ist wesentlich weniger kostspielig in ihrer Durchführung, weil die quaternäre Ansmoniunverfaindung weniger kostet als die verhältnismässig teure Ecteola-Cellulose.

2) Die Anzahl der Arbeitsstunden, die für die Behandlung mit der quaternären Ammoniumverbindung benötigt wird, ist erheblioh geringer als bei einer Chromatographie·

3) Duron die Anwendung der quaternären Ammoniumverbindung erhält man ein trookenes pulvriges Produkt mit guter chemie oher Stabilität« während ein chromatographiertes Material in Lösung 1st und eine weitere Trocknungastufe erfordert» di« sowohl zeitraubend als auch kostspielig ist.

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Durch die Behandlung mit der quaternären Asraoniusverbin» dung werden 100 % des Endotoxinmaterials (gemessen in Abwesenheit von Methylpentene enthaltenden Stoffen) ent· fernt, wodurch die GS-RKA erheblioh weniger toxisch für Versuchstiere wird. Eoteola-Celluloseohromatographle entfernt nur einen Teil der verunreinigenden Lipopolysaccharide (Endotoxin) aus der DS-RNA-Hersteilung nach der Sephadex-Cforomatographle. Eine solche DS-HNA-Zubereitung ist gegenüber Tieren bei der Injizierung in hohen Dosen to»

5) Vor der Eeteola-Chroiaatographie ist eine Dialysestufe erforderlich, Diese Dialysestufe entfällt bei der Anwendung einer quaternaVen Aiaooniuonrerbindung·

Bine bevorzugte eetyl-quaternäre AosBoniuniverbindung 1st CetyltrinethylamBoniuiBbroiiiid (im nachfolgenden GTAB genannt)» aber anstelle von Trimethyl können die drei Reste auch Xthyl, Propyl, Butyl oder Benzyl und das Kation kann anstelle von Brom auoh Chlor sein. Ein Beispiel hierfür ist CetyldlSthylbenzylammoniumchlorld·

Die Menge urne sugegebenen quaternären Aisioniumverbindiing bestimmt si oh durch die Menge der anwesenden DS-RNA und diese wird an einfachsten durch Messung der optischen Dichte (O.D.) der AufeohlManung, zu welcher die quaternäre AoBonlunverblndung gegeben wird» bestimmt. Hierfür wird nonochrematisohes Licht von 260 mu durch eine Staadardapparatur zar Messung der optischen Dicht· projiziert und für jede gemessen· 21-0.D.Einheiten werden 0,05 bis 0*2 ml (vorzugsweise 0,1 wH) wässriges, 2jÜges Oetyltrlmethylaneoniunbromid hinzugegeben. Bei anderen Konzentrationen wird eine entsprechende Anpassung der zugegebenen Meng· vorgenommen, so dass das gleich· Trockengewicht des CTAS zugefügt wird. Dies bezieht sich auf die vorher genann· ten Squivalenten CTAB-Verbindungen, die verwendet werden können.

Ein typisches Beispiel ist di* folgende Verfahrensweise für die Isolierung von MU-9-DS-RNA aus E, coll JOOO nach dreistündiger Infizierung in einem flüssigen Medium aus Maislauge.

Beispiel 1

1. Zellen aus 1 1 Brühe (etwa 3 S Trockengewicht) werden in 36 ml 0,02 m Tris, pH 7,8, 0,001m Xthylendiamintetraessigsäure (EDTA) suspendiert. Nachdem man eine homogene Aufschlämmung der Zellen erreicht hat, werden unter heftigem Rühren 4 ml lodges Natrlumlauryl-(Dodecyl)-sulfat zugegeben. Man fügt Pronase (fest) Ms zu einer Menge von 0,5 mg/ml hinzu und lässt die Mischung bei 37 ⁰C wenigstens 7 Stunden inkubieren· "

2. 14 ml Phenol (vor der Verwendung mit 0,05 M Tr is -0,005m EDTA pH 8, ins Gleichgewicht gebracht) «erden hinzugefügt und man schüttelt heftig. Dann wird mit einer solchen Geschwindigkeit zentrifugiert, dass die Emulsion bricht, und die wässrige Phase wird abgetrennt und in einen sauberen Kessel gegeben. Die wässrige Phase stellt zu diesem Zeitpunkt eine milchige viscose Aufschlämmung dar.

3* Unter heftigem Rühren werden 2 Volumenteile kaltes 95/Ö-ges Xthanol hinzugegeben, das Ganze wird gut geschüttelt und dann wenigstens 2 Stunden bei -20 ⁰C stehengelassen. Dann wird mit einer solchen Geschwindigkeit zentrifugiert, dass eine Trennung eintritt, und die Uberfliessende Flüssigkeit wird abgetrennt.

4. Der Niederschlag, enthaltend DS-RNA₄ wird In 50 ml 0,005m Tris, 0,005a EDTA pH 8,0 suspendiert. Da es vorkommen

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kann, dass der Alkoholfeststoff sich nicht vollständig auflöst, soll er zentrifugiert und das Sediment (ZeIlrüokstände) verworfen werden.

5. Man gibt ausreichend Kaliumaoetat hinzu (aus 4m -Vorrat), ' um die überfliessende Flüssigkeit 0,2m zu machen und rührt 5 Minuten. Dann gibt man 2 Volumina kaltes Äthanol hinzu, schüttelt die Mischung gut und lässt sie wenigstens 2 Stunden bei -20 ⁰C stehen. Man zentrifugiert mit niedriger Geschwindigkeit und verwirft das Überfliessende·

6. Der Niederschlag wird in 56 ml 0,02m Tris—0,005m MgCl₂ pH 7$2 suspendiert. Er lust sich nicht vollständig, aber man erhält eine homogene Suspension. Dann werden 1 bis 20 mg/ml Rinderpankreas Desoxyribonuclease hinzugegeben und die Präparation wird eine Stunde unter gelegentlichem Rühren bei 25 ⁰C inkubiert.

7. 4 ml 10 X SSC (IX SSC »0,15 m NaCl—0,015 « Natrium-

citrat pH 7»ö) werden zugegeben. Die Rinderpankreas-riboßuclease A wird zu 20 mg/ml zugegeben und die Mischung wird eine Stunde bei 37 ⁰C unter gelegentlichem Rühren inkubiert.

8. Der Auszug wird zentrifugiert, um alles unlusllohe Material zu entfernen. Man gibt 2 Volumina kaltes Xthanol hinzu, um die Flüssigkeit zu klären und schüttelt diese tüchtig. Man lässt sie mindestens 2 Stunden bei -20 ⁰C stehen· Eine Zentrifugierung wird mit niedriger Geschwindigkeit durchgeführt und Uberflleasende Flüssigkeit wird verworfen.

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9· Der Niederschlag wird im Vakuum über KOH-Plättoben teilgetrooknet· Es sind mehrere Stunden erforderlich, um den grossten Anteil des Alkohols zu entfernen.

10. Der Niederschlag wird wieder suspendiert und in SSC aufgelöst· Man gibt nur soviel SSC hinzu» um den Niederschlag aufzulösen. Der Grund hierfür ist, dass man dieses Volumen so klein wie möglich halten möchte und doch eine vollständige Auflösung des Niederschlags erzielen will.

11. Die Lösung wird auf eine Säule von Sephadex 0200 (hydriert und Im Oleichgewicht mit SSC) aufgebracht. Die Säule wird mit SSC eluiert und die ablaufenden Volumenfraktionen werden zusammengegeben.

12. Festes Natriumchlorid wird auf die vereinten Fraktionen gegeben, bis es 0,3mol&p wird. Die optische Dichte wird gemessen bei 260 mu und für jede 21-0.D.-Einheit gibt man 0,1 ml 2#lges Cetyltriaetliylammoniumbromid (CTAB) hisrsu. Dabei bildet sich sofort ein Niederschlag. Man lässt ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen und zentrifugiert ihn, wobei die abfliessende Flüssigkeit verworfen wird.

Der Niederschlag wird in O NaCl--0,005m phosphat, pH 7 suspendiert (man verwendet das gleiche Volumen wie das der vereinten verworfenen Volumenfraktionen). Genau 5 Minuten wird gerührt, denn wird wieder sentrifugiert und das überfliessende wird verworfen.

Der Niederschlag wird in 0,3m NaCl—0,005m Phosphat, pH 7 unter Verwendung von 1/10 bis 1/5 des Volumens der ursprünglich vereinten, verworfenen Volumenfraktionen

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Dazu gibt man 3 Volumina kaltes Xthanol und

schüttelt die Mischung gut. Sie wird 2 Stunden bei »20 ⁰C gehalten« ansohliessend zentrifugiert und das überfliessende verworfen.

15· Der Niedersohlag wird einmal mit kaltem 95$Cigem Xthanol und einmal mit kaltem absolutem Xthanol gewaschen.

Il 16. Der Niederschlag wird dann im Vakuumexsiccator über KOH-Plättehen getrocknet.

Die nach diesen verbesserten Qewlnnungsverfahren erhaltene gereinigte DS-RNA 1st praktisch identisch mit der nach der alten Verfahrensweise erhaltenen. Das Material zeigt eine relative Rlbonuelease-Beatändlgkelt und eine hohe thermische Übergangskurve mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 105 bis 107 °C in SSC. Wird sie Tieren In Mikrogrammengen verabreicht, so bewirkt sie die Bildung von Interferon und schützt dadurch die Tiere vor Virusinfektionen.

Bin drittes Merkmal der Erfindung besteht darin» dass gege~ W benenfalls oder gewUnschtenfalls eine weitere Reinigung des MÜ-9 DS-RNA erzielt werden kann durch Chromatographie über Hydroxylapatitpulver (HTP). Dieses Verfahren kann mit dem Produkt des Beispiels 1 wie folgt durchgeführt Werdens

Beispiel S

1. Bereiten der HTP-SMuIe «Ein Tell BTP wird unter leichtem Rühren zu 4 Teilen 0,005m Phosphatpuffer, ph 6,7* gegeben und über Nacht quellen gelassen. Nach mehrmaligen

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Entfernung der feinen Verunreinigungen wird die HTP-Aufschlämmung auf eine Säule gegossen« die einen Durchmesser von 3 era und eine Höhe von 7,5 cm hat. Die Säule wird mit dem 4- oder 5-fachen Säulenvolumen 0,005m Phosphatpuffer gewaschen,

2. Chromatographie auf der HTP-Säule. 40 mg trockene MlJ-9 DS-RNA werden in 20 ml 0,005m Phosphatpuffer gelöst und durch die Säule laufen gelassen, wobei man eine gleiche Volumenmenge des Puffers hinterher schickt. Die Verunreinigungen werden aus der Säule gewaschen, indem man das 5-faohe Säulenvolumen (1 Säulenvolumen » 50 ml) 0,13m Phosphatpuffer, pH 6,7 bis 6,8, durch die Säule schickt. Die DS-RNA wird aus der Säule durch die Zugabe von 2 Säulenvolumina eines 0,2m Phosphats, pH 6,7 bis 6,8, eluiert.

3. Gewinnung von DS-RNA aus dem 0,2m Phosphatpuffer. Für jede 21-0.D.-Einheit werden 0,1 ml 2#iges CTAB zugegeben. Nach 10- bis 20-minütigem Stehen bei Raumtemperatur wird der RNA-CTAB-Niedersohlag 20 Minuten mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Der CTAB-Niederschlag wird einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und in einer kleinen Volumenmenge (5 bis 10 ml) 0,5m NaCl-O,005m Phosphat, pH 7* gelöst· DS-RNA fällt bei der Zugabe von 2 Volumenteilen kaltem absolutem Xthanol aus. Der Niederschlag wird einmal' mit 953figem Xthanol gewaschen, einmal mit absolutem Xthanol und dann über KOH-Plättohen in einem Vakuumexsic« cator getrocknet.

Die Bedingungen im Beispiel 2 sind nicht unbedingt kritisch und eine mehr oder weniger grosse Abweichung In der QrOesenordnung von etwa 5 % von den vorstehend genannten Zahlen 1st für die Durchführung der Erfindung möglich.

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Die vorstehenden Beispiele zeigen die Möglichkeiten für Variationen an_s welche innerhalb der vorher genannten Bereiche und Äquivalente möglich sind. Die relativen Mengen der Pro= nase und der ihr äquivalenten Protelnase kann innerhalb der vorher genannten Bereiche variiert werden. In gleicher Weise kann auoh die relative Menge der quaternfiren Ammonluraverbindung oder einer äquivalenten, den Cetylrest enthaltenden Verbindung in dem vorstehend genannt3n Bereich variiert werden.

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Claims

407 26. September 19^9

Pat entansprüche

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1. Verfahren zur Gewinnung der doppelfasrigen Rlbonuoleinsäure (DS-RHA) aus einer FermentationsbrUhe von E. ooli-Zellen, die mit MS2-Coliphage oder dem MU-9-Mutanten dieses CoIlphage infiziert sind, daduroh gekennzeichnet, dass man die Zellen zur Freigabe der DS-ItNA einer Lysisstufe unterwirft« dass man ein proteolytlsohen Enzym, welches die Nuoleinsäure nicht abbaut, hinzugibt, dass man die Mischung zum Abbau des Proteins inkubiert, dass man Phenol zur Extraktion des abgebauten Proteins hinzugibt und dass man das Ganze zentrifugiert und die wässrige Phase mit der DS-RNA gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die rohe DS-RNA aus der genannten wässrigen Phase abgetrennt wird durch Zugabe einer quaternären, einen Cetylrest enthaltenden Ammoniumverbindung zu einer rohen D3-RNA enthaltenden Zubereitung, um die DS-RNA auszufällen und dass »an den Niederschlag gewinnt.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass das Enzym in einer solchen Menge zugegeben wird, dass «an eine 0,25- bis 1,0 mg/ml-Konzentratlon erhält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, dass das genannte Enzyn in einer Menge zugegeben wird« dass nan eine 0,30 mg/el-Konzentration erhält.

5· Verfahren naoh Anspruch 2, daduroh gekennzeichnet, dass die Zugabe der quaternären A—onlwerhi ndung in eines Ver-

hältnla von 0,05 bis 0,2 ml einer Saigon wässrigen Lösung für jede 21-0. P. »Einheit, gemessen mit 260 mu monochromatischem Licht, erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Weitere Reinigung von DS-RNA erzielt, indem man sie an Hydroxylapatit absorbiert, die Verunreinigungen davon durch anschllessende 21ution entfernt und ansohlles· send die DS-RNA In reiner Form elulert.

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