NO128874B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved isolering av dobbeltstrenget

ribonucleinsyre (DS-RNA).

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved isolering og utvinning av dobbeltstrenget ribonucleinsyre fremstilt av Escherichia coli-celler infisert med MS2-colifag eller MU-9-mutan-ten av denne colifag.

Det forhold at dobbeltstrenget ribonucleinsyre kan komme fra denne kilde, er anfort i en artikkel med tittelen "Inducers of Interferon and Host Resistance, IV, Double-stranded Replicative Form RNA (MS2-RF-RNA) from E. coli infected with MS2 coliphage",

av A.K. Field, G.P. Lampson, A.A. Tytell, M.M. Nemes, og M.R. Hilleman, i Proceedings of the National Academy of Sciences (U.S.), Vol. 58, No. 5, s. 2102-2108, (November, 1967). I denne artikkel

er angitt at MS2 colifag når dyrket i celler av E. Coli frem-

bringer en dobbeltstrenget RNA under sin reproduksjonscyklus. Denne dobbeltstrengede RNA viser seg etter isolering og rensing å be-virke dannelse av interferon når den administreres til dyr.

Nevnte publikasjon beskriver dyrkningsmåten av E. coli, dens infeksjon med MS2 colifag, lysering av cellene, gjentatte ekstrak-sjoner med fenol for å fjerne protein, behandling med pancreatisk ribonuclease for å oppslutte enkeltstrenget ribonucleinsyre, behandling med deoxyribonuclease for å nedbryte cellulær deoxyri-bonucleinsyre, påfolgende behandling med bentonit (for eksempel "MacaloicPjl eller en lignende ribonucleaseinhibitor, og anvendelsen av gelfiltrering (for eksempel "Sephadex G200") for å utvinne den dobbeltstrengede ribonucleinsyre i renhet form. Videre rensning som der beskrevet oppnåes ved kromatografi av det hoymolekylære materiale (eluert i tomvolumfraksjonen fra gelfiltreringen) på en kolonne av cellulose som på forhånd er behandlet med triethanolamin og epiklorhydrin (for eksempel "Ecteola" cellulose). Cellulosen hjalp til i den delvise fjernelse av forurensende polysaccharide materiale og tillot også utvinning av den dobbeltstrengede ribonucleinsyre (heretter kalt DS-RNA) i en mere konsentrert form. Den tidligere rensnings- eller isoleringsmetode er også angitt i folgende publikasjoner: Weissman, C., P. Borst, R.H. Bardon, M.A. Billeter og S. Ochoa, Proe. Nucleic Acid Research, £1, 682 (196U-); Billeter, M.A., C. Weissman og R.C. Warner, J. Mole. Biol. 1Z, 1^5 (1966); Billeter, M.A. og C. Weissman, Proe. Nucleic Acid Research, Harper and Row, New York, 1966.

Isoleringsmetoden beskrevet i disse publikasjoner er til-fredsstillende for gjæringsvæsker med de relativt fortynnede celle-konsentrasjoner som der behandles. En gjæringsvæske som imidlertid inneholder betraktelig mer cellevekst, og som folgelig er temmelig konsentrert av karakter, egner seg ikke for rensningsmetoden i publikasjonene. Eksempelvis har senere fremskritt på dette felt gjort av Dr. Barbara Lago vist at veksten av E. coli i et mais-stopvæskemedium og infisert med MU-9-mutanten av MS2-colifag, gir en okning av opp til 10 ganger så meget, eller endog mere cellevekst og en tilsvarende storre mengde DS-RNA. Under disse forhold blir gjæringsvæsken så tett at den tidligere isoleringsmetode blir utilstrekkelig, uøkonomisk og vanskelig å utfore.

Grunnen til denne uanvendbarhet av en tidligere metode på en gjæringsvæske inneholdende store mengder bakterier synes å ligge i dannelsen av en tung viskos skilleflate av denaturert protein under den forste fenolekstraksjon som fjerner protein. Denne skilleflate gjor det meget vanskelig å skille den vandige fase (inneholdende nucleinsyre) fra fenolfasen. Videre blir mye av nuclein-syren, innbefattende DS-RNA, innesluttet i skilleflatematerialet. Vasking av skilleflaten, som foreslått i de opprinnelige metoder, frigjor bare delvis den innesluttede nucleinsyre. Videre nødvendig-gjor vanskeligheten ved å skille vannfasen og fenolfasen anvendelsen av flere fenolekstraksjoner i isoleringsrutinen. Som folge derav kreves det mange alkoholfeininger og medfolgende sentrifugeringer for å hjelpe på fjernelsen av fenolen fra nucleinsyreopp-losningene.

Reduksjon eller eliminering av skilleflatematerialet er så-ledes en tydelig forbedring ved isoleringen. I henhold til foreliggende oppfinnelse oppnåes dette ved at lysatet for fenolekstrak-.sjonen behandles med et proteolytisk enzym som er erholdt ved dyrkning av Streptomyces griseus.

Det proteolyt.iske enzym "Pronase" tilsettes for å få en 0,25 til 1,0 mg/ml suspensjon, og en 0,50 mg/ml suspensjon foretrekkes. Mindre eller mere aktive proteinaser som anvendes istedet, vil kreve en forholdsmessig forandring i mg/ml konsentrasjonen.

"Pronase", et proteolytisk enzym ekstrahert fra Streptomyces griseus, er representativ for hoyaktive, ikke-spesifikke proteoly-tiske enzymer som ikke nedbryter nucleinsyre. "Pronase"-behandlingen nedbryter proteinet fullstendig i lysatet, og eliminerer derved skilleflaten under den forste fenolekstraksjonen. Så stor er re-duksjonen av skilleflaten at alle unntagen en fenolekstraksjon kan sloyfes. Dette eliminerer i sin tur behovet for to alkoholfeininger og reduserer antallet av sentrifugeringer. Fordelene ved "Pronase"-metoden er som folger: 1) Eliminering av proteinet i skilleflaten under fenolekstraksjonen tillater lett utvinning av vannfasen inneholdende DS-RNA,

2) Okning i det endelige isolerte utbytte av DS-RNA,

3) Nedsettelse av omkostningene ved isolering ved å eliminere 6 av 7 fenolbehandlinger, nedsettelse av antallet alkoholfeininger og sentrifugeringer,

h) Eliminering av eventuelt mulige nedbrytningsvirkningor av E. coli-ribonucleaser på DS-RNA. Enzymer som er i stand til å nedbryte naturlig DS-RNA, er blitt funnet i E. coli. "Pronase"- be-

handling ville odelegge denne aktivitet (se Robertson et al.,

J. BioUChem. 2j+3_, 82-91, 1968),

5) Eliminering av bruken av ribonucleaseinhibitorer som "Macaloid', etc.,

6) Lettelse ved behandlingen av konsentrerte cellepastaer

i små ekstraksjonsvolumer.

Ved endelig rensning og konsentrering av den dobbeltstrengede ribonucleinsyre er det fordelaktig å anvende en kvartær ammoniumforbindelse inneholdende en cetylgruppe bundet til det fireverdige nitrogen, som et felningsmiddel. Denne kvartære ammoniumforbindelse anvendes istedenfor kolonnekromatografi på "Ecteola" cellulose. Fordelene ved metoden med cetyl-kvartærammoniumforbindelse er som folger: 1) Den er betraktelig mindre kostbar å utfore på grunn av den lave pris på den kvartære ammoniumforbindelse og relative hoye pris på "Ecteola" cellulose. 2) Antallet arbeidstimer som er nodvendige for å utfore den kvartære ammoniumbehandling, er betraktelig lavere enn for kromatografi. ' 3) Den kvartære ammoniummetode resulterer i et tort pulver-formig produkt med god kjemisk stabilitet idet kromatografert materiale er i opplbsning og krever ytterligere torre trinn som er både tidskrevende og kostbare. h) Den kvartære ammonium-metode fjerner 100% endotoxinmateri-ale (målt ved fravær av methylpentoseholdig materiale) og gjor

DS-RNA betraktelig mindre giftig overfor laboratoriedyr. "Ecteola" cellulosekromatografi fjerner bare en del av det forurensende lipto-polysaccharid (endotoxin) fra DS-RNA-preparatet etter "Se.phadex"-kromatografi. Slikt DS-RNA-preparat er giftig overfor dyr når det injiseres i hoye doser. 5) Feir "Ecteola" kromatografi er et dialysetrinn nodvendig. Ved den kvartære ammoniumforbindelse er dialysetrinnet unodvendig.

En foretrukken cetyl-kvartær ammoniumforbindelse er cetyltrimethylammoniumbromid (nedenfor kalt CTAB), men istedenfor tri-methyl kan de tre grupper være ethyl, propyl, butyl og benzyl, og kationet kan være klor istedenfor brom. Den kan for eksempel være cetyldiethylbenzylammoniumklorid.

Mengden av kvartær ammoniumforbindelse som skal tilsettes, bestemmes av mengden av tilstedeværende DS-RNA, og dette fast-slåes lettest ved den optiske tetthet (O.D.) av suspensjonen til tilsetningen skjer. For å gjore dette projiseres monokromatisk lys av 260 nm gjennom et standard optisk tetthetsapparat og for hver målt 21 O.D. enheter tilsettes fra 0,05 til 0,2 ml (fortrinnsvis 0,1 ml) vandig 2% cetyltrimethylammoniumbromid. For andre kon-sentrasjoner gjores en tilsvarende avpasning i mengden som tilsettes, slik at den samme torrvekt av CTAB tilsettes. Dette gjelder de ekvivalente CTAB forbindelser, nevnt ovenfor, som kan anvendes i stedet.

Et representativt eksempel er folgende metode for isolering av MU-9-DS-RNA fra E. coli 3000 infisert i 3 timer i maisstopvæske.

Eksempel 1

1. Celler fra 1 liter gjæringsvæske (ca. 3 g torrvekt) ble suspendert i 36 ml 0,02 M Tris, pH 7,8, 0,001 M ethylendiamintetra-eddiksyre (EDTA). Etter at den homogene suspensjon av celler var erholdt ble h ml 10% natriumlaurylsulfat tilsatt ved en kraftig omroring. Fast "Pronase" ble tilsatt for å få 0,5 mg/ml og blandingen ble inkubert ved 37°C i minst 7 timer.

2. <1>+0 ml fenol (brakt i likevekt med 0,05 M Tris-0,005 M

EDTA pH 8 for bruk) ble tilsatt og rystet kraftig. Sentrifugering ved en hastighet tilstrekkelig til å bryte emulsjonen ble utfort,

og vannfasen ble fraskilt og anbragt i et rent kar0 Den vandige fasen var en melkeaktig viskos oppslemning på dette punkt. 3. 2 volum kold 95% ethanol ble tilsatt under kraftig omroring, ble så rystet godt og derpå hensatt ved -20°C i minst 2 timer. Sentrifugering ved en hastighet som bevirket adskillelse, ble utfort og den overstående væske ble vasket.

<1>+. Bunnfallet som inneholdt DS-RNA ble suspendert i 50 ml 0,05 M Tris, 0,005 M EDTA pH 8,0. Da alkoholfaststoffene kanskje ikke opploses fullstendig, bor det sentrifugeres og bunnfallet (celleav-fall) kastes.

5. Tilstrekkelig kaliumacetat ble tilsatt (fra-l+ M stamopp-lbsning) til å gjore den overstående væske 0,2 M, og der ble om-rort i 5 minutter. Derpå ble 2 volum kald ethanol tilsatt, blandingen ble rystet godt og så lagret i minst 2 timer ved -20°C. Sentrifugering ved lav hastighet ble utfort og den overstående

væske kastetc *

6. Bunnfallet ble suspendert i 36 ml 0,02 M Tris - 0,005

M MgCl2 pH 7,2. Det opplbses ikke fullstendig, men en homogen suspensjon fåes. Derpå tilsettes oksekjbtt-pancreas-desoxyribonu-clease 1-20 Mg/ml, og preparatet inkuberes ved 25°C i 1 time under leilighetsvis omroring. 7. h ml 10 X SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl-0,015 M Na-citrat pH 7,0) ble tilsatt. Derpå ble oksekjott-pancreas-ribonuclease A tilsatt til 20 Mg/ml, og blandingen ble inkubert i 1 time ved 37°C under leilighetsvis omroring. 8. Oppslutningen ble sentrifugert for å fjerne alt uoppløselig materiale. 2 volum kold ethanol ble tilsatt for å klare den overstående væske og rystet godt. Dette ble hensatt ved -20°C i minst 2 timer. Sentrifugering ved lav hastighet ble utfort, og den overstående væske ble kastet. 9. Bunnfallet ble tbrret delvis i vakuum over KOH-pellets. Flere timer var nbdvendig for å fjerne det meste av alkoholen. 10. Bunnfallet resuspenderes og opplbses i SSC. Akkurat nok SSC -ble tilsatt til å opplbse bunnfallet. Hensikten er å holde dette volum så lite som mulig og allikevel tillate fullstendig opplbsning av bunnfallet. 11. Opplbsningen påfbres på en kolonne av "Sephadex G200r.' (hydra-tisert og likevektsinnstillet i SSC ). Kolonnen elueres med SSC og tomvolumfraksjonene forenes. 12. Fast NaCl tilsettes til de forenede fraksjoner slik at de blir 0,3 M. En optisk tetthetsmåling taes ved 260 nm og for hver 21 O.D.-enheter tilsettes 0,1 ml 2% cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Et bunnfall vil straks dannes. Det hensettes ved værelsetemperatur i 10 minutter og sentrifugeres, og den overstående væske kastes. 13. Bunnfallet suspenderes i 0,3 M NaCl-0,005 M fosfat pH 7, (samme volum som de sammenslåtte tomvolumfraks joner anvendes).

Der omrbres i nbyaktig 5 minutter, derpå sentrifugeres igjen og den overstående væske kastes.

lh. Bunnfallet opplbses i 0,5 M NaCl-0,005 M fosfat pH 7, under anvendelse av 1/10 til 1/5 av volumet av de opprinnelige sammenslåtte tomvolumfraksjoner. Til dette tilsettes 3 volum kold ethanol og blandingen rystes godt. Blandingen holdes ved -20°C i 2 timer hvoretter den sentrifugeres og den overstående væske kastes. 15. Bunnfallet vaskes en gang med kold 95% ethanol og derpå en gang med kold absolutt ethanol. 16. Bunnfallet tbrres så i en vakuumekssikator over KOH-pellets.

Den rensede DS-RNA erholdt ved denne forbedrede isoleringsmetode er i det vesentlige identisk med den erholdt ved den gamle metode. Dette materiale viser en relativ ribonuclease-motstands-dyktighet og en hoy termisk overgangskurve med en smeltetemperatur (Tm) på 105 til 107°C i SSC. Administrert til dyr i mikrogram-mengder utlbser det dannelsen av interferon og beskytter derved dyrene mot virusinfeksjon.

Om nodvendig eller om onskes kan ytterligere rensning av

MU-9 DS-RNA oppnåes ved kromatografi på hydroxylapatitt-pulver (HTP). Metoden kan utfores på produktet fra eksempel 1 og er som folger: 1. Fremstilling av HTP-kolonne. En del HTP tilsettes under forsiktig omroring til h deler 0,005 M fosfatpuffer, pH 6,7, og får lov til å svelle over natten. Etter flere dekanteringer og resus-pensjoner i fosfatpuffer for å fjerne fint materiale helles HTP-oppslemningen i en kolonne av 3 cm diameter og en hbyde på 7,5 cm. Kolonnen vaskes med h eller 5 kolonnevolum 0,005 M fosfatpuffer. 2. Kromatografi på HTP-kolonne. ^0 mg torret MU-9 DS-RNA ble opplost i 20 ml 0,005 M fosfatpuffer og fort gjennom en kolonne fulgt av et like stort volum puffer. Forurensninger ble vasket fra kolonnen ved å fore 5 kolonnevolum (1 kolonnevolum = 50 ml) 0,13 M fosfatpuffer, pH 6,7-6,8, gjennom kolonnen. DS-RNA ble eluert fra kolonnen ved tilsetting av 2 kolonnevolum 0,2 M fosfat, pH 6,7-6,8. 3. Utvinning av DS-RNA fra 0,2 M fosfatpuffer. For hver 21 .O.D.-enheter ble tilsatt 0,1 ml 2% CTAB. Etter henstand i 10-20 minutter ved værelsetemperatur ble RNA-CTAB-bunnfallet sentrifugert i 20 minutter ved lav hastighet. CTAB-bunnfallet ble vasket en gang med destillert vann og opplost i et lite volum (5-10 ml) 0,5 M NaCl-0,005 M fosfat, pH 7. DS-RNA ble felt ved tilsetning av 2 volum kold absolutt ethanol. Bunnfallet ble vasket en gang med 95% ethanol, en gang med absolutt ethanol og torret over KOH-pellets i en vakuumekssikator.

Det skal pekes på at betingelsene ved den like ovenfor beskrevne rensning ikke er absolutt kritiske da en pluss- eller minusvariasjon av størrelsesorden ca. 5% fra de der angitte tall vil tillate ut-førelse av fremgangsmåten.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved isolering av dobbeltstrenget ribonucleinsyre (DS-RNA) fra en gjæringsvæske inneholdende Escherichia coli-celler som er blitt infisert med MS2-colifag eller MTJ-9-mutanten av denne colifag, ved hvilken fremgangsmåte "cellene lyseres for å frigjore DS-RNA, lysatet ekstraheres med fenoi og vannfasen inneholdende DS-RNA fraskilles ved sentrifugering, hvorefter den rå DS-RNA utvinnes og vidererenses, karakterisert ved at lysatet for fenolekstraksjonen behandles med et proteolytisk enzym som er erholdt ved dyrkning av Streptomyces griseus.