DE69926648T2

DE69926648T2 - Nukleinsäure-isolierung

Info

Publication number: DE69926648T2
Application number: DE69926648T
Authority: DE
Inventors: James Neil BUTT; Peter Christopher Heydon JONES
Original assignee: Whatman International Ltd
Current assignee: Whatman International Ltd
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2019-11-18
Also published as: WO2000029563A1; GB9825215D0; GB2346615A; US7129344B1; WO2000029563A8; EP1131420A1; GB2346615B; DE69926648D1; EP1131420B1; AU1169900A; ATE301710T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren und insbesondere ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus einem Plasmid-DNA-enthaltenden Material.
Herkömmliche Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäuren, wie bspw. DNA, benötigen im Allgemeinen mehrere Schritte, einschließlich der Lysis des Ausgangsmaterials, gefolgt von Fraktionierungsschritten, welche eine Säulenchromatographie umfassen können. Wenn eine DNA-Manipulierung durchgeführt werden soll, werden routinemäßig DNA-Präparationen im Kleinmaßstab benötigt, oftmals jedoch in großen Mengen, um die DNA aus den Ausgangzellen zu screenen. Diese Verfahren sind zeitaufwändig und arbeitsintensiv.
Für die Reinigung solcher DNA wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, einschließlich einem Fällungs-Verfahren in der EP-A-0376080, einem Verfahren mit Ultrafiltration in der WO-A-87/07645 und in der EP-A-0517515, sowie kationische Austau scherharze in der EP-A-0281390 und der EP-A-0366438. Ein vereinfachtes Verfahren, bei welchem ein Filter eingesetzt wird, und welches automatisierbar ist, ist in der WO-A-95/02049 offenbart.
Jedes dieser Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass eine Reihe von Schritten benötigt wird und/oder spezielle Geräte eingesetzt werden müssen, um eine hinreichende Reinigung der Plasmid-DNA zu erreichen. Daher besteht ein Bedürfnis für ein bedeutend einfacheres Verfahren, bei welchem bereits verfügbare Geräte und relativ günstige Reagenzien miteinbezogen werden. In einem bekannten Ansatz für eine schnelle Reinigung genomischer DNA, RNA oder von Proteinen, wird eine Mischung aus Phenol, Chloroform und Guanidin eingesetzt (Chomczynski, P. und Sacchi, N., 1987 Anal Biochem. 162: 156, Chomczynski, P. 1993 Biotechniques 15: 532), bei welchem die DNA in die wässrige Phase extrahiert wird. Dieses Verfahren ist jedoch zur Isolierung von Plasmid-DNA ungeeignet. Darüber hinaus ist der Einsatz von Phenol und Chloroform nicht wünschenswert, da diese Substanzen toxisch sind.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und ein vereinfachtes Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA bereitzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus DNA-enthaltendem Material bereitgestellt, welches Plasmid-DNA und genomische DNA enthält, mit den folgenden Schritten:

(i) Extrahieren der Plasmid-DNA in Butanol durch Mischen des Materials mit Butanol, einem Chaotrop und Wasser unter Bedingungen, unter welchen genomische DNA denaturiert wird; ggf. Trennen der organischen und der wässrigen Phasen des Schritts (i); und
(ii) Gewinnen der Plasmid-DNA aus dem Butanol.

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein „Ein-Schritt"-Verfahren bereit, welches einfach durchzuführen ist und welches keine spezialisierten Laborgeräte benötigt. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass mit diesem Verfahren Plasmid-DNA mit großer Reinheit und mit besonders niedriger oder keiner Verunreinigung aus genomischer DNA extrahiert werden kann, welche in dem Plasmid-DNA-enthaltendem Material vorliegen kann. Das Butanol kann dabei die Plasmid-DNA mit Ausnahme der genomischen DNA, welche in dem Plasmid-DNA-enthaltendem Material vorliegt, selektiv unterstützen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann im kleinen, routinemäßigen Labormaßstab durchgeführt werden, wobei mit Lösungsvolumen von Mikrolitern oder Millilitern gearbeitet werden kann. Alternativ kann das Verfahren auf einen Pilotstudien- oder industriellen Maßstab heraufgesetzt werden, bei welchem Liter-Volumen oder noch größere Volumen eingesetzt werden.
Im Extraktionsschritt (i) wird das DNA-enthaltende Material mit Reagenzien unter Bedingungen gemischt, bei welchen genomische DNA normalerweise denaturiert, wobei die Plasmid-DNA in eine organische Phase abgeteilt wird und die genomische DNA in die wässrige Phase abgeteilt wird. Solche Bedingungen schließen basische Bedingungen oder erhöhte Temperaturen mit ein. Geeignete erhöhte Temperaturen sind mindestens 65°C und bevorzugter im Bereich 70 bis 95°C für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Plasmid-DNA zu denaturieren, wie bspw. von ungefähr 30 s bis ungefähr 10 min, vorzugsweise ca. 5 min. Inkubationszeiten, die bei erhöhten Temperaturen länger als ungefähr 10 Minuten dauern, sollten die Plasmid-DNA nicht nachteilig beeinflussen, sind jedoch für die Verwendung des organischen Lösungsmittels nicht wünschenswert. In einer bevorzugten Ausführung werden die basischen Bedingungen verwendet, bei welchem eine Base vorliegt. Die Base ist typischerweise ein Hydroxid, wie bspw. ein Alkalimetallhydroxid, vorzugsweise Natriumhydroxid. Die Base liegt vorzugsweise mit einer Konzentration im Bereich 100 mM bis 200 mM vor. Die Inkubationszeit liegt gewöhnlich im Bereich von ungefähr 30 s bis ungefähr 10 min, vorzugsweise ca. fünf Minuten. Eine übermäßige Inkubation unter basischen Bedingungen kann die Plasmid-DNA beschädigen.
Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, wird vorgeschlagen, dass die unterschiedliche Lösbarkeit zwischen Plasmid- und genomischer DNA unter denaturierenden Bedingungen dahin rühren kann, dass die Plasmid-DNA in einen nicht denaturierten oder reversibel denaturierten Zustand geführt wird, welcher in die organische Phase abgetrennt wird. Im Gegensatz dazu wird die genomische DNA in die wässrige Phase abgeteilt.
Das Chaotrop kann jedes normal-bekannte Chaotrop sein und ist vorzugsweise ausgewählt aus Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat, Natriumperchlorat und Mischungen davon. Ein bevorzugtes Chaotrop ist Guanidinhydrochlorid. Typischerweise liegt das Chaotrop mit einer Konzentration im Bereich von 0,7 M bis 1,2 M vor, basierend auf der Kombination aus organischen Lösungsmitteln, Chaotrop und Wasser. Die Konzentration des Chaotrops beträgt vorzugsweise ungefähr 0,9 M.
Die Menge an Butanol liegt typischerweise im Bereich von 20 bis 70%, basierend auf dem Volumen der Kombination von organischem Lösungsmittel, Chaotrop oder Wasser und ist vorzugsweise im Bereich von 35 bis 50%, bevorzugter bei ca. 42%.
Das spezifische Chaotrop, die Base und deren Mengen sowie die Menge an Butanol können durch routinemäßige Versuche einfach bestimmt werden. Jedes dieser Reagenzien kann mit dem DNA-enthaltendem Material in beliebiger Reihenfolge gemischt werden oder kann vor Hinzufügen zu dem Plasmid-enthaltendem Material vorgemischt werden. In einer zweckmäßigen Gestaltung werden das Butanol, das Chaotrop, die Base und das Wasser kombiniert, um eine Extraktionsmischung zu bilden. Bei dieser Ausführung umfasst der Extraktionsschritt (i) das Mischen der Extraktionsmischung mit dem DNA-enthaltendem Material.
Im Labormaßstab kann der Schritt (ii), nämlich das Trennen der organischen und der wässrigen Phasen, dadurch praktisch ausgeführt werden, indem man die Phasen trennen lässt oder aber die Trennung basierend auf der Dichte durch kurzes Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge beschleunigt. Typischerweise wird entweder die organische oder die wässrige Phase von der anderen entfernt, bevor der Schritt (iii), nämlich die Gewinnung, folgt. So kann bspw. die organische Phase, welche die Plasmid-DNA enthält, vor der Gewinnung mit der Pipette von einem Behältnis zu einem anderen übertragen werden. Im größeren Maßstab könnte das Entfernen der einen Phase von der anderen durch jedes herkömmliche Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Pumpen oder Schwerkraft-Ablaufen der einen von beiden Phasen.
In einer Ausführung schließt der Gewinnungsschritt (iii) das Fällen der Plasmid-DNA aus dem Butanol mit ein. So kann bspw. die DNA-enthaltende organische Phase mit einem Fällungsagens gemischt werden, welches die Plasmid-DNA aus dem Butanol fällt und die gefällte Plasmid-DNA wird aus dem Butanol getrennt. Die gefällte Plasmid-DNA kann ferner in einem Waschschritt gewaschen werden. Das Fällungsagens kann einen Alkohol aufweisen, wie bspw. Ethanol, und kann ferner ein Acetatsalz umfassen, wie bspw. Natriumacetat.
Das DNA-enthaltende Material kann jedes bekannte DNA-enthaltende Material umfassen, wie bspw. eine lysierte oder unlysierte bakterielle Kultur.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Extraktionsmischung zur selektiven Extraktion von Plasmid-DNA aus einem DNA-enthaltenden Material bereit, wobei die Extraktionsmischung Butanol umfasst, ein Chaotrop und Wasser. Die Extraktionsmischung enthält vorzugsweise ferner eine Base.
Das Butanol, Chaotrop, die Base und deren Mengen sind üblicherweise solche, die zuvor beschrieben wurden.
Die vorliegende Erfindung wird nun – lediglich beispielhaft – detaillierter beschrieben werden, wobei auf die folgenden Beispiele Bezug genommen wird.
Beispiel 1
Allgemeines Verfahren
Eine bakterielle Kultur (E. coli enthaltend pBluescript; 0,5 ml) wurde in einem Eppendorf-Röhrchen unter Verwendung einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in TE-Puffer (Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8,0; 200 μl) resuspendiert, um ein resuspendiertes Pellet zu bilden, welches sowohl genomische als auch Plasmid-DNA enthielt. Eine Extraktionsmischung wurde gemäß der nachstehenden Tabelle ausgewählt, sorgfältig gemischt, und 0,5 ml davon wurden zu dem resuspendierten Pellet hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Das Eppendorf-Gefäß, welches die Mischung enthielt, wurde in einer Mikrozentrifuge 30 Sekunden lang zentrifugiert, wodurch zwei Phasen entstanden; eine obere organische Phase und eine untere wässrige Phase. Die organische Phase wurde vorsichtig in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt, wobei jegliche verunreinigende Zelltrümmer vermieden wurden. Nach einer Messung des Volumens der abgenommenen organischen Phase wurden Natriumacetat (0,1 Volumen; 3 M) und Ethanol (2 Volumen) hinzugefügt, um die Plasmid-DNA zu fällen. Das Eppendorf-Röhrchen wurde 20 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Ethanol-Überstand entfernt. Das Pellet wurde mit frischem Ethanol (70%; 200 μl) gewaschen und 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Ethanol wurde entfernt und das Pellet getrocknet sowie in Wasser (20 μl) resuspendiert. Die resultierende Plasmid-enthaltene DNA-Lösung konnte dann durch Sichtbarmachung auf einem Agarosegel untersucht und die Menge der DNA durch Spektrophotometrie oder durch Fluoreszenz quantitativ gemessen werden. Tabelle der getesteten Extraktionsmischungen

Gut: Ungefähr 1 μg DNA-Gewinn
OK: Ungefähr 200 μg DNA-Gewinn
Wenig: Lediglich durch Agarosegel-Elektrophorese sichtbar

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass jedes benannte Chaotrop funktioniert und dass Guanidinhydrochlorid gegenüber Guanidinthiocyanat vorzuziehen ist, welches wiederum hinsichtlich der DNA-Gewinnung gegenüber Natriumperchlorat zu bevorzugen ist. Bezüglich der Lösungsmittel stellte sich heraus, dass Butanol am besten funktionierte, wohingegen Pentanol lediglich eine geringe DNA-Ausbeute erzielte. Ethanol und Isopropanol konnten nicht mit Wasser gemischt werden. Unter den Butanolen war N-Butanol besser als sowohl Butan-2-ol oder 2-Methylpropanol.
Auch wenn TE als Resuspensions-Puffer im Verfahren verwendet wurde, so könnte auch Wasser benützt werden, genauso wie jeder andere Resuspensions-Puffer.
Beispiel 2
Allgemeines Verfahren zur Extraktion unter Verwendung von Hitze anstelle eines alkalischen pH-Wertes
Eine bakterielle Kultur (E. coli enthaltend pBluescript; 0,5 ml) wurde in einem Eppendorf-Röhrchen unter Verwendung einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert und der Überstand verwor fen. Das Pellet wurde in TE-Puffer (Tris[hydroxymethyl]aminomethanhydrochlorid 10 mM, EDTA 1 mM; pH 8,0; 200 μl) resuspendiert, um ein resuspendiertes Pellet zu bilden, welches sowohl genomische als auch Plasmid-DNA enthielt. Eine Extraktionsmischung wurde gemäß der obenstehenden Tabelle ausgewählt, gut gemischt und 0,5 ml hinzugefügt, um das Pellet zu resuspendieren und anschließend vorsichtig gemischt. Das Eppendorf-Röhrchen wurde dann in ein heißes Wasserbad mit einer Temperatur im Bereich von 70 bis 95°C fünf Minuten lang gegeben und die Inhalte regelmäßig gemischt. Dabei wurde auf den Deckel des Eppendorf-Röhrchens aufgrund der Expansion des Lösungsmittels in dem Röhrchen besonders aufgepasst. Das Röhrchen wurde dann schnell auf Eis drei Minuten lang abgekühlt, wodurch die Plasmid- und die genomische DNA getrennt werden konnten. Das Eppendorf-Gefäß, welches die Mischung enthielt, wurde in einer Mikrozentrifuge 30 Sekunden lang zentrifugiert, wodurch zwei Phasen gewonnen wurden; eine obere organische Phase und eine untere wässrige Phase. Die organische Phase wurde vorsichtig in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt, wobei jegliche verunreinigende Zelltrümmer vermieden wurden. Nach Messen des Volumens der überführten organischen Phase wurde Natriumacetat (0,1 Volumen; 3 M) und Ethanol (2 Volumen) hinzugefügt, um die Plasmid-DNA zu fällen. Das Eppendorf-Röhrchen wurde in einer Mikrozentrifuge 20 Minuten lang zentrifugiert und der Ethanol-Überstand entfernt. Das Pellet wurde mit frischem Ethanol (70%; 200 μl) gewaschen und 5 Minuten lang zentrifugiert. Das Ethanol wurde abgenommen, das Pellet getrocknet und in Wasser (20 μl) resuspendiert. Die erhaltene Plasmid-enthaltende DNA-Lösung konnte dann durch Sichtbarmachung auf einem Agarosegel untersucht und die Menge der DNA durch Spektrophotometrie oder Fluoreszenz quantitativ bestimmt werden.
Es wurden Ergebnisse erzielt die mit denjenigen aus Beispiel 1 vergleichbar sind, obwohl die Ausbeuten etwas niedriger waren und eine leichte Verunreinigung mit genomischer DNA beobachtet wurde.

Claims

Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus einem DNA-enthaltenden Material, welches Plasmid-DNA und genomische DNA enthält, mit den folgenden Schritten: (i) Extrahieren der Plasmid-DNA in Butanol durch Mischen des Materials mit Butanol, einem Chaotrop und Wasser unter Bedingungen, unter welchen genomische DNA denaturiert wird; und (ii) Gewinnen der Plasmid-DNA aus dem Butanol.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen zur Denaturierung der DNA alkalische Bedingungen oder eine Temperatur von zumindest 65°C umfassen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Bedingungen zur Denaturierung der DNA alkalische Bedingungen umfassen, in welchen eine Base vorliegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Butanol n-Butanol, 2-Methylpropanol oder Butan-2-ol ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Chaotrop ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat, Natriumperchlorat und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Chaotrop Guanidinhydrochlorid aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Base ein Hydroxid aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Hydroxid Natriumhydroxid aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das Butanol, das Chaotrop, die Base und das Wasser zur Bildung einer Extraktionsmischung vereinigt werden und wobei der Extraktionsschritt (i) das Mischen der Extraktionsmischung mit dem Plasmid-DNA-enthaltenden Material umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Anteil des Butanols im Bereich von 20 bis 70% liegt, basierend auf dem Volumen der Kombination aus Butanol, Chaotrop und Wasser.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Anteil des Butanols im Bereich von 35 bis 50% liegt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Anteil des Butanols ungefähr 42% beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Chaotrop in einer Konzentration von 0,7 M bis 1,2 M vorliegt, basierend auf der Kombination von Butanol, dem Chaotrop und Wasser.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Konzentration des Chaotrops ungefähr 0,9 M beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Gewinnungsschritt (ii) das Mischen der DNA-enthaltenden Butanolphase mit einem Fällungsagens umfasst, welches die Plasmid-DNA aus dem Butanol fällen kann, und das Trennen der gefällten Plasmid-DNA vom Butanol.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Gewinnungsschritt (ii) ferner einen Waschschritt umfasst, in welchem die gefällte Plasmid-DNA gewaschen wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Fällungsagens einen Alkohol aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Alkohol Ethanol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Fällungsagens ferner ein Acetatsalz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Acetatsalz Natriumacetat aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches vor der Gewinnung der Plasmid-DNA ferner einen Schritt der Trennung der organischen und wässrigen Phasen des Schritts (i) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Schritt der Trennung der organischen und wässrigen Phasen ferner Zentrifugieren der in Schritt (i) gebildeten Mischung umfasst, um die Trennung der Mischung in die organische und wässrige Phasen zu erleichtern.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das DNA-enthaltende Material eine lysierte oder nicht lysierte Bakterienkultur umfasst.
Extraktionsmischung zum selektiven Extrahieren von Plasmid-DNA aus einem DNA-enthaltenden Material, wobei die Extraktionsmischung Butanol, ein Chaotrop und Wasser aufweist.
Extraktionsmischung nach Anspruch 24, welche ferner eine Base aufweist.
Extraktionsmischung nach Anspruch 25, wobei die Base ein Hydroxid aufweist.
Extraktionsmischung nach Anspruch 26, wobei das Hydroxid Natriumhydroxid aufweist.
Extraktionsmischung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das Butanol n-Butanol, 2-Methylpropanol oder Butan-2-ol ist.
Extraktionsmischung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei das Butanol einen Anteil von 20 bis 70% ausmacht, basierend auf dem Volumen der Extraktionsmischung.
Extraktionsmischung nach Anspruch 29, wobei das Butanol einen Anteil von 35 bis 50% der Extraktionsmischung ausmacht.
Extraktionsmischung nach Anspruch 29, wobei das Butanol einen Anteil von ungefähr 42% der Extraktionsmischung ausmacht.
Extraktionsmischung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei das Chaotrop ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat, Natriumperchlorat und Mischungen davon.
Extraktionsmischung nach Anspruch 32, wobei das Chaotrop Guanidinhydrochlorid umfasst.
Extraktionsmischung nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die Konzentration des Chaotrops in der Extraktionsmischung von 0,7 M bis 1,2 M beträgt.
Extraktionsmischung nach Anspruch 34, wobei die Konzentration des Chaotrops in der Extraktionsmischung ungefähr 0,9 M beträgt.