DE2056294A1

DE2056294A1 - Verfahren zur Herstellung antiviraler zweistrangiger Ribonucleinsäuren

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Publication number: DE2056294A1
Application number: DE19702056294
Authority: DE
Inventors: Karl Heinz Rickmansworth Hertfordshire Sutherland Elisabeth Sinclair Iver Heath Fildes Robert Anthony Romamle Wall Wilfred Frank Kilmarnock Buckinghamshire Fantes, (Großbritannien)
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1969-11-17
Filing date: 1970-11-16
Publication date: 1971-07-15
Also published as: FR2073366A1; NL7016747A; FR2073366B1; GB1331933A; BE758977A

Description

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Case 25.96-757

GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex/Großbritannien Verfahren zur Herstellung antiviraler zweinträngiger

Ribonucleinsäuren

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zürn Isolieren von virusartigen Teilchen aus Penicillium chrysogenum als Quelle antiviraler Nucleinsäuren.

In der britischen Patentschrift Nr. 1 170 939 wurde die Isolierung von neuen antiviralen Nucleinsäuren aus dem Mycel von P. chrysogenum beschrieben, das der zur Herstellung des Antibiotikums Penicillin verwendete Organismus ist und daher billig in großen Mengen zugänglich ist. Es wurde gefunden und auch in der .oben erwähnten Patentschrift beschrieben, daß das neue antivirale Material auf Grund seiner Widerstandsfähigkeit gegenüber Desoxyribonuclease und auf Grund seiner langsamen Inaktivierung durch Ribonuclease unter physiologischen Bedingungen als auch durch seine physikalischen Eigenschaften eine zweisträngige (double-stranded) Ribonucleinsäure ist. Es sind Nucleinsäuren von verschiedenem Molekulargewicht vorhanden, und, wie im folgenden gezeigt wird, ist das Material mit einem Mo-

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BAD ORlGiNAl,

leJculargewicht von etwa 200 000 oder mehr das aktivste. Der Ausdruck "Molekulargewicht", wie er hierin verwendet wird, bedeutet das Molekulargewicht, wie es bestimmt wurde durch Abtrennung (exclusion) in 0,1m wäßriger Natriumchloridlösung mit Hilfe eines vernetzten Dextrangels, z.B, Sephadex G 200, das Globuline mit einem minimalen Molekulargewicht von 200 abtrennt.

In der obigen Patentschrift wurde die Isolierung des neuen antiviralen Material durch Zerbrechen des Mycels und Fraktionieren des Zellinheilts nach dem Abtrennen der Mycelreste gewonnen, wodurch Protein und Polysaccharide abgetrennt werden. " Die Quelle des antiviralen Materials in dem Mycel scheinen gewisse virusartige Teilchen zu sein, die entweder als Infektion oder als normale Zellbestandteile vorhanden sein können, und alle bekannten Stämme von P. chrysogenum, die untersucht wurden, enthielten diese Teilchen, obwohl es möglich ist, Sporen oder Mycel in verschiedener Art und Weise zu behandeln, so daß das anschließende Wachstum in Abwesenheit der virusartigen Teilchen abzulaufen scheint. Derartige Kulturen, bei denen die virusartigen Teilchen inaktiviert wurden, scheinen das antivirale Material mit hoher antiviraler Aktivität, das mit hohem Molekulargewicht verbunden ist, zu produzieren.

In dem früher beschriebenen Verfahren führten die Stufen, die verwendet wurden, um den Mycelgehalt zu fraktionieren, entweder dazu, daß der Proteinüberzug der virusartigen Teilchen abgestreift wurde, wodurch das zweistrangige Nucleinsaurematerial freigesetzt wurde, oder einfach dazu, das freie doppel— strängige Nucleinsaurematerial aus natürlich von Überzug befreiten virusartigen Teilchen zu isolieren. Es wurde nun gefunden, daß durch Zerstören der Zellen, ohne daß der Überzug der virusartigen Teilchen entfernt wird,die letzteren von den freien einzelsträngigen Nucleinsäuren als auch vielen anderen Zellbestandteilen abgetrennt werden können. Nach einer derartigen Abtrennung können die virusartigen Teilchen von ihrem Überzug befreit werden und die zweisträngigen Ribonu-

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cleinsäuren von Proteinen und - wenn notwendig - von Polysacchariden abgetrennt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von antiviralen zweisträngigen Ribonucleinsäuren aus P. chrysogenum geschaffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) einen Stamm von P. chrysogemum in oder auf einem geeigneten Nährmedium züchtet, wodurch sich darin virusartige Teilchen entwickeln;

b) die Zellen von P- chrysogenum zerstört, ohne den Überzug der virusartigen Teilchen zu entfernen, und die Zellreste abtrennt;

c) teilweise oder vollständig die virusartigen Teilchen von den freien Nucleinsäuren und den anderen gelösten Materialien abtrennt;

d) die virusartigen Teilchen von ihrem Überzug befreit; und

e) eine Fraktionierung durchführt, so daß man die gewünschten antiviralen zweisträngigen Ribonucleinsäuren erhält.

Dadurch, daß man die unerwünschten Nucleinsäuren durch das neue erfindungsgemäße Verfahren abtrennt, erhält man ein Material von gesteigerter Reinheit und von verbesserter antiviraler Aktivität.

Die Kultur von P. chrysogenum ist gut bekannt, und es ist daher ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß man verbrauchtes Mycel aus der Penicillinproduktionsindustrie als Ausgängsmaterial verwenden kann. Es ist bevorzugt, einen Thorn-Stam« von P. chrysogenura zu verwenden, z.B. ATCC 9480, 10 23 8, 10 003, 10 002, 11 707 oder 13 799, am bevorzugtesten ATCC 10 O02 oder eine Mutante davon.

Bas Wachstum des Organismus kann in üblicher Weise entweder durch Oberflächenkultur oder durch Submerskultur durch chargenweise oder kontinuierliche Arbeitsweisen erreicht werden.

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Das Nährmedium enthält eine Stickstoffquelle, wie Nitrat, Pepton, Hefe-oder Malzextrakt, Ammoniumsalze, Maisquellflüssigkeit und dergleichen, und eine Kohlenstoff- und Energiequelle, z.B. ein Kohlehydrat, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose und dergleichen, oder Maisöl. Spurenelemente sind normalerweise ebenfalls anwesend, z.B. Kalium, Natrium, Magnesium, zweiwertiges Eisen, Chlorid oder Phosphat. Besonders brauchbare Medien für die Submerskultur schließen die folgenden ein:

Medium 1	JL.
Saccharose	3
Natriumnitrat	0,2
Kaliumdihydrogenphosphat	0,1
Kaliumchlorid	0,05
Magnesiumsulfat	0,05
Hefeextrakt (Difco)	0,5
Eisen-II-sulfat	0,001

p_H-Wert auf 6,8 eingestellt.

Medium 2 %

Maltose 4

Pepton 1

Malzextrakt (Oxoid) 2,4

p_H-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt.

Die Kulturen können geerntet werden, wenn die Kulturen zwischen 24 und 150 Stunden alt sind.

Der Organismus kann auch in einer kontinuierlichen Kultur unter Verwendung eines geeigneten Mediumsgezogen werden, z,B.

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Medium 3 · .%

Natriumacetat 1

Ammoniumsulfat 0,85

Kaliumdihydrogenphosphat 0,11

Maisquellflüssigkeit zu 0,0025 % N

p„-Wert auf 6,5 eingestellt,

plus Glucose (getrennt

sterilisiert) 2,2 %

plus Maisöl 0,16 %

Die Zellen werden vorzugsweise vor dem Bruch oder der Lyse gewonnen, um die Notwendigkeit der Abtrennung der Nährstoffe aus dem gewünschten Produkt zu vermeiden, und können kurz, z.B. mit destilliertem Wasser oder verdünnter Salzlösung gewaschen werden. Sie können dann direkt einer Extraktion zugeführt werden oder sie können gelagert werden, z.B. in gefrorener Form oder in Form eines Acetonpulvers, d.h. eines Pulvers, das gebildet wird durch Wasserfredwaschen des Mycels mit Aceton. Derartige Acetonpulver können ohne Aktivitätsverlust bei 4°C gelagert werden.

Der Bruch der Zellen kann z.B. durch Schallbehandlung (sonication), durch mechanische Homogenisierung, z.B. Vermählen in einer Kolloidmühle oder Hochdruckhomogenisierung, durch Einfrieren und Auftauen, durch Lyse durch Behandlung mit einem wäßrigen Netzmittel, z.B. mit einem langkettigen anionischen Netzmittel, z.B. einem langkettigen Alkylsulfat, wie Natriumlaurylsulfat, durch Autolyse, z.B. durch Behandlung mit einem wäßrigen Medium geringer Ionenstärke, z.B. destilliertem Wasser oder einer schwachen Pufferlösung; oder durch Behandlung mit einem die Lyse bewirkenden Enzym, wie Trypsin oder Pc;psin, bewirkt werden. Die virusartigen Teilchen sind tatsächlich, obwohl sie einen proteinartigen Überzug aufweisen, reiiistent gegenüber Angriffen durch proteolytische Enzyme. Bei der Verwendung einet; Netzrni It eis zur I/yse sollte der Zeil Inhalt fraktioniert werden, bevor die virusar tig on TeiLchc-n durch cias Netzmittel von ihrem Überzug befreit werden. Ei In Hakt er io;. ta-

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tikum, z.B. ein p-Hydroxybenzoesäureester, wird vorteilhafterweise zugesetzt. Dieser Verfahrensschritt und insbesondere alle Verfahrensschritte werden vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen,
zu vermeiden.

Temperaturen, z.B. bei 4 C, durchgeführt, um eine Infektion

Die Abtrennung der Zellreste muß im wesentlichen ohne Adsorption der virusartigen Teilchen an das vorhandene feste Material bewerkstelligt werden. Es wurde gefunden, daß die virusartigen Teilchen bei einem p„-Wert unterhalb 5,5 hochsorptiv sind, und daher sollte die Abtrennung der Zellreste bei einem ρ -Wert oberhalb 6,0 und vorzugsweise unterhalb 9,0 (urn die Zerstörung der Teilchen zu vermeiden) durchgeführt, werden.

Die erforderlichen p,.~Bedingungen können z.B. durch Zugabe von Alkali oder wäßriger Pufferlösung, z.B. einem Phosphatoder tris-(Hydroxymethyl)-amino-methan-Puffer, eingestellt werden, wobei der bevorzugte p.,-Berei.ch 7,5 bis 8,5, vorteilhaft 7,8 bis 8,2, z.B. etwa 8,0, beträgt.

Die Zellreste können aus der überstehenden Flüssigkeit z.B. durch Filtration oder Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit abgetrennt werden. Die Filtration kann durch ein Filtertuch oder ein Millipor-Filter oder ein Filterbett aus z.B. Diatomeenerde, wie Cellit oder Kieselgur, bewirkt werden.

Die Abtrennung der virusartigen Teilchen von den freien Nucleinsäuren und anderen gelösten Materialien wird vortei.1 hafterweise unter Nutzung der Eigenschaften des proteinartigen Überzugs der Teilchen durchgeführt. So kann z.B. nach der Abtrennung der Zellreste die Lösung mit einem Proteinkoagulierungsmittel behandelt werden, wodurch die Teilchen zusammenballen, und aus der Lösung, z.B. durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindkgkeit, bei saurem p,.-Wert, z.B. bei 2C)C)O bis JOOO g, abgetrennt werden, oder man kann die hohe Sorpt: ion.sf Uh icjkel t der Teilchen bei einem μ,-Wort von 4,5 bis 5,5 beimI y.i-.n , und die Lc>:;unr; kann bei diesem P₁₁-

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Wert mit einem Adsorbens behandelt werden oder einer Membran-Filtration unterworfen werden, und das Adsorbat oder die Filtriermembran wird vorteilhafterweise bei dem gleichen p^-Wert gewaschen, so daß man die Abtrennung des gelösten Materials bewirkt.

Das Proteinkoagulierungsmittel ist vorzugsweise ein PoIyalkylenglykol, am bevorzugtesten Polyäthylenglykol, vorteilhafterweise mit einem Molekulargewicht im Bereich von 4000 bis 10 000. Eine Konzentration im Medium von 3 bis 5 Gewichts-/ Volumen-%, vorteilhafterweise etwa 4 %, ist bevorzugt. Die Filtration zur Gewinnung der zusammengeballten Teilchen kann z«B. durchgeführt werden, indem man ein Millipor-Filter oder ein Filterbett, z.B. ein Bett von Cellit oder Kieselgur, verwendet. Die Zusammenballung bzw. Aggregation wird vorzugsweise in Anwesenheit eines Elektrolyten, z.B. eines Alkalimetallhalogenids, z.B. mit einer Ionenstärke im Bereich von 0,10 bis 0,25m, geeigneterweise 0,2m, durchgeführt. Der p_H-Wert sollte im Bereich von 4,5 bis 9,0 liegen; obwohl ein p„-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 nicht wichtig ist, sind derartige saure p„-Werte bevorzugt. Die Zentrifugierung der zusammengeballten Teilchen kann vorteilhafterweise bei einem p„-Wert im Bereich von 3,5 bis 5,5 und vorzugsweise'im Bereich von 4,5 bis 5,0, durchgeführt werden.

In Abwesenheit eines Proteinkoagulierungsmittels sollte, wie oben angegeben, der p_H~Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 liegen. Dies kann erreicht werden durch Zugabe von Säure, z.B. einer Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder einer organischen Säure, wie Essigsäure oder Propionsäure, oder durch Zugabe eines geeigneten Puffers, z.B. Dihydrogenphsophat-Puffer. Das Adsorbens kann z.B. Aluminiumhydroxyd oder ein Aluminosilicat sein, wie Natriumaluminiumsilicat oder Kieselgur.

Ein bevorzugtes Adsorbens ist Aluminiumphosphatgel. Dieses Material kann durch das Verfahren von Fantes (J.Hyg.Camb., (50,

— ο —

123, 1962) hergestellt werden. Das Adsorbens wird vorzugsweise in seinem ursprünglichen wäßrigen Medium ohne eine zwischendurch durchgeführte Trockenstufe verwendet. Konzentrationen an Adsorbens von 0,5 bis 2,0 mg/ml, z.B. etwa 1,0 mg/ml, sind bevorzugt.

Die Ionenstärke der Lösung, die adsorbiert wird, ist vorteilhafterweise relativ niedrig, z.B. geringer als 0,1m.

Die Abtrennung der virusartigen Teilchen aus der Lösung kann unter Verwendung eines Elektronenmikroskops oder durch immunofc logische Techniken, wie Gelfällung oder Komplementfixierung, nachgewiesen werden.

Wenn man eine Membranfiltration durchführt, kann eine relativ feinporige Filtermembran, wie eine Millipor-Membran (Porengröße etwa 0,45 u ) die Teilchen entweder auf Grund ihrer Zu-· sammenballung oder ihrer Adsorption an die Filtermembran zurückhalten.

Das obengenannte Adsorptions- oder Aggregationsverfahren dient dazu, die virusartigen Teilchen von den meisten freien Nucleinsäuren und einem großen Teil des zellulären Polysaccharids und des Proteingehaltes abzutrennen, jedoch wird ein Teil des zel-P lulären Proteins gleichzeitig adsorbiert oder koaguliert. Das Adsorbat oder die Filtermembran oder das abgetrennte Aggregat der virusartigen Teilchen muß anschließend behandelt werden, um den proteinartigen Überzug der virusartigen Teilchen zu entfernen,und eine weitere Abtrennung von Protein und möglichen anderen Materialien, wie Polysacchariden kann auch durchgeführt werden. Die abgetrennten virusartigen Teilchen, die durch das obengenannte Verfahren hergestellt werden, stellen eine wertvolle Quelle für antivirales Material dar, das dasaus mit Hilfe der beschriebenen Verfahrensweisen gewonnen werden kann .

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Die virusartigen Teilchen können von dem Adsorbens desorbiert oder von der Filtermembran abgewaschen werden unter Verwendung eines Eluierungsmittels mit einem p_H~Wert im Bereich von 7,0 bis 9,0, vorzugsweise 7,5 bis 8,5, z.B. etwa 8,0. Zur EIuierung von Aluminiumphosphat oder ähnlichen Adsorbentien ist die Ionenstärke des Eluierungsmittels vorzugsweise relativ hoch, z.B. im Bereich von 0,05m bis 1,0m, z.B. etwa 0,5m. Zur Eluierung von Kieselgur und/oder zum Waschen der Filtermembranen können geringere Ionenstärken verwendet werden, z.B. bis hinab zu 0,1m. Die hohe Ionenstärke kann geeigneterweise durch den Puffer oder Alkali geschaffen werden, die verwendet werden, um den p„—Wert einzustellen; geeignete Puffer schließen z.B. ein Natrium- oder Kaliumphosphat· Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze, insbesondere die Acetate, Thiocyanate oder Jodide, können auch als Eluierungsmittel verwendet v/erden, wobei der p„-Wert dann mit Alkali eingestellt wird» Im allgemeinen ist es bevorzugt, daß das Eiuierungsmittel nicht während der anschließenden Ausfällung der Nucleinsäuren mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel ausfällt. Eine 20%-ige wäßrige PyridinlÖsung kann auch als Eluierungsmittel verwendet werden. Die Menge an Eluierungsmittel ist vorzugsweise so gering wie möglich, und auf diese Weise kann eine Konzentrierung des aktiven Materials in Hinsicht auf Wasser leicht erzielt werden.

Im allgemeinen ist Natriumacetat der bevorzugte Puffer für Eluierungsmittel zur Eluierung von Kieselgur oder zum Waschen von Filtermembranen. Bei der Eluierung von Aluminiumphosphat ist das bevorzugte Eluierungsmittel Kaliurnthiocyanat, das den zusätzlichen Vorteil, wie im folgenden gezeigt wird, auf v/eist, das en unerwünschtes Protein ausfällt, wenn das Medium anschließend angesäuert wird, wobei relativ geringe Mengen der virusartigen Teilchen ausfallen.

Es ist auch möglich, die Entfernung des Überzugs der vLrusartigen Teilchen zu bewirken, wenn sie noch aiii: dnr F'i I U"i nn mbran oder dorn Adroil.i-m; f< .'.Iqeha! ten vR-iiU-n* Verίaln. t η ,.him

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Entfernen des Überzugs virusartiger Teilchen sind gut bekannt und schließen z.B. ein Erhitzen, z.B. auf 60 bis 90 C, vorzugsweise bei relativ hohen Ionenstärken, um die antiviralen Nucleinsäuren zu stabilisieren; Behandlung mit einem Netzmittel, z.B. einem langkettigen Alkylsulfat, wie Natriumlaurylsulfat; oder Behandlung mit einem Proteinlösungsmittel, z.B. einem Hydroxybenzol, wie Phenol, wobei 80%-iges wäßriges Phenol besonders gute Ergebnisse liefert. Nach der Zerstörung des Überzugs werden die Nucleinsäuren leicht von dem Adsorbens oder dem Filter abgewaschen und der Fraktionierung unterworfen, um Protein und andere Materialien abzutrennen.

Wenn KCNS oder KJ als Eluierungsmittel verwendet werden, führt die anschließende Ansäuerung, z.B. auf einen p„~Wert von 3,0 bis 4,0, vorzugsweise etwa 3,5, zur Ausfällung einiger unerwünschter Proteine und verbessert die spezifische Aktivität der Nucleinsäuren, obwohl etwas von dem aktiven Material gleichzeitig mit ausgefällt wird.

Ob die virusartigen Teilchen ohne Entfernung des Überzugs eluiert werden oder ob die Entfernung des Überzugs durchgeführt wird und die Nucleinsäure freigesetzt wird, ist es besondern bequem, das assoziierte Protein abzutrennen, z.B. durch Behandeln der eluierten Feststoffe in wäßriger Lösung mit einem " im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Proteinlösungsmittel, z.B. einem Hydroxybenzol, wie Phenol. Das Proteinlösungsmittel bildet eine getrennte Phase, die Protein abtrennt, wogegen die von der Umhüllung befreiten Nucleinsäuren in der wäßrigen Lösung verbleiben. Wenn nötig, kann diese Verteiluncjc-stufe mehreremnle widerholt werden, wobei die Phasen -δ.YS. durch Zentrifugieren, getrennt werden. Ls ist manchmal vorteilhaft, ein lnncjkett icjes Alkylsulfat zu dem Phenol zuzusetzen, um die Entfernung der Umhüllung zu verbessern. Die wäßrige Lösung eiiLhnlt. vorzugsweise, einen Elektrolyten, beispielsweise ein ALkaliinetallaceLat_v und dieser Elektrolyt ist vorzugsweise mit Hilfe von mit W<i:.-.';et m L schlmren organische!. LösurKjr.mit L t:In aus der Wcißi" i (Jt-η Lösung nicht austä L H.at . i'.h >. <;nn ! < ·.<.. ι zug t. sein,

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die eluierten Feststoffe auszufällen, z.B. durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie einem Alkanol oder Keton, z.B. Äthanol oder bevorzugter Isopropylalkohol, wonach man, bevor man eine Verteilung durchführt, bei höherer Konzentration wieder auflöst.

Andere Verfahren zur Abtrennung von Protein schließen z.B. ein Proteolyse, z.B. unter Verwendung von Trypsin, Papain oder Pronase; Behandlung mit Protein-Ausfällungsmitteln oder Denaturierungsmitteln, wie Chloroform; oder durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen.

Nach der Behandlung mit dem Protein-Lösungsmittel kann die wäßrige Phase, die die antiviralen Nucleinsäuren enthält, mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z-B. einem Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, 2-Methoxyäthanol oder 2-Äthoxyäthanol, oder einem Keton, wie Aceton oder Methylethylketon, behandelt v/erden. Die Reinigung kann durch Wiederauflösen in Wasser und Wiederausfällen mit weiterem Lösungsmittel verbessert werden. Der Niederschlag wird vorzugsweise einmal oder mehrmals mit einem mit V/asser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Diäthyläther, extrahiert, um das verbleibende Phenol abzutrennen.

Polysaccharide, die nach der Abtrennung der virusartigen Teilchen durch die obengenannten Verfahren verbleiben, können in jeder Stufe durch Verteilung zwischen einer konzentrierten wäßrigen Lösung eines Elektrolyten und einem geeigneten Alkanol, das eine getrennte Phase bildet, z.B. 2-Methoxyäthanol, abgetrennt werden. Die Polysaccharide sammeln sich in der unteren Schicht, und das aktive Material kann aus der oberen Schicht, z.B. durch Gefriertrocknen nach einer Dialyse, gewonnen werden.

Wie bereits angegeben, besitzen die 2weisträngigen Ribonucleinsäuren, die aus P. chrysogenum isoliert werden, nicht alle das gleiche Molekulargewicht, und weitere Fraktionierungsverfahren sind möglich, die eine zusätzliche Auftrennung bewirken. Es

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sei jedoch angegeben, daß reine zweisträngige Ribonucleinsäure in destilliertem Wasser nicht sehr stabil ist, und alle wäßrigen Lösungen, die das reine Material enthalten, sollten Elektrolyt enthalten, um die Ionenstärke zu steigern.

So kann z.B. das isolierte antivirale Nucleinsäurematerial einer Gelfiltration unterworfen werden. Unter Verwendung eines Gels, das sphärische Moleküle mit einem Molekulargewicht im Bereich von 15 χ 10 , abtrennt, ergibt sich eine Hauptfraktion, die abgeschieden wird und die ein sehr hohes Maß an antiviraler Aktivität zeigt. Unter Verwendung einer Säule mit ™ einem derartigen Gel wurde gefunden, daß drei Hauptfraktionen isoliert werden können. Fraktion I, die zuerst eluiert wird, ist das im wesentlichen abgetrennte Material, das bereits oben genannt wurde. Fraktion II besitzt ein geringeres, jedoch immer noch sehr hohes Molekulargewicht und ist bei antiviralen Untersuchungen hochaktiv. Fraktion III, die als letzte eluiert wird, hat ein sehr viel niedrigeres Molekulargewicht und ist weit weniger aktiv.

Das zur Fraktionierung verwendete Gel kann z.B. ein vernetztes Dextran der Sephadex-Art oder ein Polyacrylamid sein. Es ist bevorzugt, Agarosegel zu verwenden, z.B. das Produkt Biob Gel A 15 m, das durch die Biorad Laboratories Inc. vertrieben wird. Die Fraktionierung wird vorzugsweise bei Ionenstärken im Bereich von 0,015m bis 2m, geeigneterweise 0,1 bis 0,5 m, z.B. etwa 0,15 m durchgeführt. Der p„-Wert ist nicht kritisch, jedoch ist eine Eluierung im Bereich von 6 bis 8 bevorzugt, und ein Puffer kann vorhanden sein. Der zur Einstellung der Ionenstärke verwendete Elektrolyt ist vorzugsweise ein Alkalimetallhalogenid, z.B. Chlorid, Acetat oder Thiocyanat; wobei der Elektrolyt vorzugsweise nicht durch mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel aus der wäßrigen Lösung ausgefällt wird, um die endgültige Gewinnung der Nücleinsäure, die relativ frei von Elektrolyt ist, zu erleichtern.

Nach der Fraktionierung können die Nucleinsäuren atls den ge-

eigneterweise gesammelten Fraktionen durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels der oben beschriebenen Art, vorzugsweise Äthanol, und vorteilhafterweise nach einer Aufkonzentrierung im Vakuum gewonnen werden. Nach dem Waschen mit Äthanol können die ausgefällten Feststoffe in destilliertem Wasser gelöst, wenn nötig, um die Konzentration des verbleibenden Elektrolyten zu vermindern, dialysiert und dann gefriergetrocknet werden.

Die Fraktionen I und II (Peaks I und II), auf die oben Bezug genommen wurde, zeigten die in Beispiel 11 angegeben physikalischen, bibcfremisehen und biologischen Eigenschaften.

Das rohe Nucleihsäurematerial kann nach der Abtrennung der Polysaccharide und des größeren Teils des unerwünschten Proteins fraktioniert werden, so daß man die obengenannten Peak I- und Peak II-Materialien erhält, ohne daß man eine Gelfiltration durchführt, die manchmal schwierig im technischen Maßstab durchzuführen ist, und diese Fraktionierung kann z.B. durch fraktionierte Ausfällung bewerkstelligt werden. Somit kann man das Material in einem wäßrigen Medium lösen, das vorzugsweise einen Elektrolyt enthält, der die Nucleinsäure stabilisiert, z.B. Natriumchlorid bei etwa 2m, und dann wird zunächst ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zugegeben, um das unerwünschte Material auszufällen, dann wird bei einer höheren Konzentration die Nucleinsäure des Peaks I und schließlich bei einer noch höheren Konzentration die Nucleinsäure des Peaks II ausgefällt. Das bevorzugte Ausfällungsmittel ist Äthanol. Somit fallen in 2m wäßrigem Natriumchlorid etwa 5 bis 10 Volumen-% Äthanol die unerwünschten Materialien aus, die z.B. durch Zentrifugieren abgetrennt werden können. Bei weiterer Zugabe von Äthanol in einer Menge von bis zu 14 bis 16 %, z.B. etwa 15 % Volumen/Volumen, fällt im wesentlichen das Material des Peaks I aus, und durch Auflösen in 2m wäßrigem Natriumchlorid und Wiederausfällen bei der gleichen Äthanolkonzentration kann ein Material, das etwa 95 % Nucleinsäure des Peaks I enthält, erhalten werden.

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Durch Zusatz weiteren Äthanols zu der ursprünglichen überstehenden Flüssigkeit, die die Nucleinsäure des Peaks II enthält, werden die letzteren Nucleinsäuren in relativ reiner Form bei einer Äthanolkonzentration von 18 bis 22 % Volumen/ Volumen, z.B. 20 % Volumen/Volumen, ausgefällt. Durch V/i ed erauflösen des Niederschlags in Salzlösung und Wicderausfallen bei etwa der gleichen Äthanolkonzentration können die Nucleinsäuren des Peaks II mit einer etwa 95%-igen Reinheit isoliert werden.

Das Äthanol wird vorzugsweise in jedem Fall bei Raumtemperatur zugegeben, und die Lösung wird dann auf eine niedrige TcsT.peratur, z.B. etwa 4 C abgekühlt, um die Ausfällung zu bewirken. Der Elektrolyt kann durch Dialyse von den Niederschlagen abgetrennt werden.

Diese Fraktionen erscheinen in verschiedenen Verhältnissen in dem Material, das durch die verschiedenen Ver fahr en swei seen, die oben angegeben oder in der genannten Patentschrift angegeben sind, isoliert wurde.

Das neue Material zeigt z.B. Aktivität in Gewebekulturen gegenüber Semliki Forest-Virus, Influenza-Virus, z.B. A 2, Parainfluenza-I-Virus, Coxsackie-Virus A 21, Poliovirus Typ I Brunenders, Rubella-Virus, Maul- und Klauenseuchen-Virus, Hundestaupe-Virus (Canine Distemper virus) und Rhinovirus-Arten 1 B und 5, die alle RNA-Viren sind, sowie gegenüber Vaccinia, Adenovirus SV 17, Herpes simiae (Virus B) und Herpes simplex-Viren, die alle DNA-Viren sind. Zu Gewebekulturen, in denen das neue antivirale Material erfolgreichen Schutz liefert, gehören primäre Affenniere, primäres Kückenembryo, menschliche embryonale Lungenzellenstämme, Maus-L-Zellen und Kaninchennierenzellen Sorte RK.. ο (Glaxo Laboratories Limited). Kein erfolgreicher Schutz ergab sich bei Junghamsternierenzellen-Sorte und einer Äffenniorenzellen-Sorte. Mäuse, duien f'^s antivirale Material verabreicht worden war, überlebten 14 Tage nach der Begegnung mit 100 χ LD₁. Semliki Forest-Virus, während die

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Vergleichi-tiere am dritten oder vierten Tag · eingehen. Die Verbindung erhöht die Überlebenszeit von noch nicht entwöhnten Jungmäusen, die von Coxsackie Virus A 21 oder Semliki Forest-Virus angegriffen werden, und die Überlebenszeit von entwöhnten Mausen, die von Herpes simpex oder Semliki Forest-Virus angegriffen werden.

Im allgemeinen ist das neue antivirale Material am wirksamsten bei der prophylaktischen Behandlung, obwohl gegen Herpes-Augeninfektionen die Behandlung nach der Infektion besonders erfolgreich verlief, und das neue Material ist auf ophthalrnischen Gebiet von besonderem Interesse.

Das neue antlvirale Material kann zur Verabreichung, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutischen Trägern oder Bindemitteln oder anderen midizinisehen Mitteln, beispielsweise für orale, topische, rektale, intravaginale oder parenterale Verabreichung, formuliert werden. Es kann zusammen mit anderen medizinischen Mitteln, beispielsweise antiinflammetorischen Mitteln, wie Steroiden, z.B. ß-Methason-21-phosphat, oder Antibiotika, wie Tetracyclin', verwendet werden· Die Zusammensetzungen liegen zweckmäßigerweise in Dosierungseinheitsformen vor, und jede Dosierungεeinheit enthält vorzugsweise mindestens 1 mg, vorteilhafterweise mindestens 10 mg, z.B. mindestens 50 mg und vorzugsweise nicht mehr als 500 mg, vorteilhafterweise nicht mehr als 250 mg, z.B. nicht mehr als 100 mg des aktiven Materials. Der Träger oder das Bindemittel ist im allgemeinen ein fester Träger oder ein festes Bindemittel oder sterile Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die ein oder mehrere Stabilisierungsmittel, Geschmacksstoffe, Suspendierungsmittel, Süßstoffe, Emulgiermittel oder Konservierungsmittel enthält.

Feste Präparate zum oralen Verbrauch liegen gewöhnlich in Dosiseinheitsformen vor, dazu gehören beispielsweise Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten, Kaugummi und Medizinalsüßigkeitent Übliche Trägerstoffe für derartige Präparate können Zucker, Stärken, Zuckeralkohole, Gelatine, Kaugummi, Kakaobutter etc.

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sein, die zusammen mit anderen Kompound.lerungsmitteln, die notwendig sind, verwendet werden, wie Bindemittel, Gleitmittel, Stabilisatoren, Überzugsmittel, Geschmacks- und Färbestoffe. Die Zusammensetzungen können auch die Form von flüssigen oralen Präparaten zur Einnahme annehmen, wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe, Elixiere, Emulsionen, Granulate zur Herstellung vor der Anwendung etc., die Suspendierungs-, Ernulgierungs-, Stabilisierungs- und Konservierungsmittel enthalten, die auch verträgliche Süß- und Geschmacks- oder Färbestoffe enthalten. Die Verbindungen können zur lokalen Anwendung auf die Schleimhäute der Nase und des Rachens präpariert werden, und sie können die Form von Flüssigsprays oder PulverinsuffIationen, Nasentropfen oder -salben, Rachenpinselungsrnitteln, Mundwässern oder ähnlichen Präparaten annehmen. Topische Formulierungen zur Behandlung der Augen und Ohren und für äußerliche Anwendungen können in öligen, wäßrigen oder pulverförmigen Medien in Form von üblichen ophthalmischen Präparaten und Augenwässern, Hauttinkturen, Lotionen, Cremes, Salben, Stäubepulvern, Arzneistoffe enthaltenden Verbänden, Augentropfen und -lotionen und dergleichen hergestellt werden. Aerosolforrnen der Präparate für lokale Anwendung können auch vorteilhaft sein. Suppositorien und Pessare können einen üblichen Grundstoff, beispielsweise Theobroniaöl, Polyglykole, Glyko-Gelatine-Grundstoffe, falls notwendig, zusammen mit oberflächenaktiven Mitteln enthalten. Die injizierbaren Präparate können in Form von wäßrigen oder öligen Lösungen, Emulsionen, Suspensionen oder Feststoffen zur Herstellung einer Lösung vor der Verwendung vorliegen. Geeignete Trägerstoffe schließen z.B. ein steriles pyrogenfreies Wasser, parenteral verträgliche Öle, ölige Ester oder andere nicht-wäßrige Medien, wie z.B. Propylengylkol, die gewünschtenfalls Suspendierungs-, Dispergierungs-, Stabilisierungs-, Konservierungs-, löslichmachende Mittel, Emulgierungs- oder Puffermittel enthalten.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten vorzugsv/eise das aktive Material in einer Konzentration

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von 0,1 bis 95 Gewichts-%, vorteilhafterweise 0,5 bis 40 %.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern, wobei alle Temperaturen in ⁰C angegeben sind. Das Penicillium chrysogenum Thorn Mycel wird, wie in der oben angegebenen britischen Patentschrift beschrieben, hergestellt:

Beispiel 1

Mycel Penicillium chrysogenum Thorn (15 kg Naßgewicht), suspen~ diert in 30 1 alkalischem Wasser (p_H 8) (oder verdünntem Phocphatpuffer), wurde zwischen rotierenden Carborund-Rädern vermählen. Die Mischung wurde durch Filtration durch ein Kieselgurbett geklärt. Zu dem FiItrat wurde Aluminiumphosphat-(AlPO-)-Gel (zur Herstellung vgl. Fantes, J.Hyg.Camb., 60, 123, 1962) mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. (Bei einer derartigen AlPO.-Konzentration wurden bei einem p_H~Wert von 5 alle virusartigen Teilchen aus der Flüssigkeit abgetrennt, wie es mit Hilfe des Elektronenmikroskops bestätigt werden konnte.) Der p„-Wert der Mischung wurde auf 5 eingestellt (Essigsäure); und die Mischung wurde etwa eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und das AlPO.-Adsorbat ließ man dann bei 4 C über Nacht absitzen. Die Hauptmenge der überstehenden Flüssigkeit (die keine beobachtbaren virusartigen Teilchen enthielt) wurde abgehebert, und der verbleibende AlPO.-Schlamm wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Der Rückstand wurde durch Wiedersuspendieren in physiologischer Salzlösung (1,5 1) unter Rühren und Resedimentieren durch Zentrifugieren gewaschen. Die virusartigen Teilchen wurden von dem Adsorbat eluiert, indem man den Rückstand in 0,5m Kaliumthiocyanat-Lösung (4,2 1) suspendierte, den p_H-Wert (mit NaOH) auf 7,5 bis 8,0 einstellte und während 1 Stunde oder langer bei Raumtemperatur rührte.

Der verbrauchte AlPO₄-Rückstand wurde abzentrifugiert.

Das KSCN-Eluat wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt (A und B).

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A. Zu dieser Lösung (2,1 1) gab man bei 4 C 2 l/2 Volumen kaltes Isopropanol, und der entstehende Niederschlag wur^.e nach wenigen Stunden bei 4°C gesammelt. Er wurde in 160 ml 0,1m Natriumacetat suspendiert und durch l/2 stündiges Schütteln rvit 80%-igem wäßrigen Phenol (80 ml) extrahiert. Die zwei Phasen wurden durch Zentrifugieren getrennt, und die wäßrige Schicht wurde noch zweimal mit 80 ml-Portionen 80%-igem wäßrigen Phenol extrahiert. Sie wurde dann von wenig unlöslichem Material befreit, und ir.an gab 2 l/2 Volumen Äthanol hinzu, und der entstehende Niederschlag wurde mehrfach mit

^ absolutem Alkohol und dann mit Äther gewaschen. Der Äther wurde in einem Vakuum-Exsikkator abgetrennt, und man erhielt 163 mg eines weißlichen Feststoffs, die 118 mg RNA (unter

257 1
der Annahme: E. = 200) oder 15,8 rng RNA pro kg feuchtem Mycel entsprechen.

B. Die andere Hälfte des Eluats (2,1 1, 0,5m KSCN) wurde bei 4°C mit HCl auf einen p„-Wert von 3,5 angesäuert, wodurch eine gewisse Ausfällung hervorgerufen wurde. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 4°C gehalten, und der Niederschlag wurde dann durch Zentrifugieren abgetrennt.

Der ρ -Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde mit NaOH auf 7,8 eingestellt, und dann wurde diese Flüssigkeit genau wie unter A angegeben behandelt. Man erhielt 127 mg eines weißen Feststoffs, die 100 mg RNA oder 13,4 mg RNA pro kg feucht era Mycel entsprechen.

Der Niederschlag mit einem p,,-Wert von 3,5 wurde in 0,1m Natriumacetat (80 ml) suspendiert, und der p„-Wert der Mischung wurde auf 7,8 eingestellt. Dann wurden 200 ml Isopropanol hinzugegeben, und der sich ergebende Niederschlag wurde nach wenigen Stunden bei 4 C gesammelt. Er wurde in 'J 20 ml 0,'lin Natriumacetat resuspendiert und dreimal mit 80%-igem wäßrigen Phenol (jeweils 60 ml) wie oben angegeben extrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann wieder mit Äthanol behandelt, und man erhielt 40 mg eines dunklon Feststoffs, dLe 2 7 mg RNA oder

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- 19 3,6 mg RNA pro kg feuchtem Mycel entsprechen.

Bezogen auf e"} = POO, betrugen die "Reinheiten" des aus A und der über π teilenden Flüssigkeit mit dem p_H~Wert von 3,5 und dem Niederschlag mit einem p^-Wert von 3,5 erhaltenen RNA 73 %_t 79 % bzw. 6 8 %. Es sei jedoch bemerkt, daß die Materialien nicht stark genug getrocknet waren, so daß die wirklichen "Reinheiten" größer sind.

Die Ansäuerung des KSCN-Eluats fällt Protein, Pigmente und einen kleinen Anteil des RNA aus. Das aus der überstehenden Flüssigkeit mit einem ρ.,-Wert von 3,5 erhaltene RNA wies die hellste Farbe auf und hatte die höchste "Reinheit". Das RNA aus der überstehenden Flüssigkeit mit einem p.,-Wert von 3,5 hatte den höchsten Anteil an RNA mit hohem Molekulargewicht und das aus dem Niederschlag mit einem p„~Wert von 3,5 gewonnene die niedrigsten Molekulargewichte. Bei den ersten zwei dieser Herstellungen war der Anteil an RNA mit hohem Molekulargewicht weit höher als bei dem Material, das man gemäß dem Verfahren erhielt, wie es in der genannten britischen Patentschrift beschrieben ist. Diese Materialien waren ebenfalls sehr viel wirksamer gegenüber Semliki Forest-Virus in Mäusen.

Beispiel 2

ALP0₄-Adsorbate wurden, wie in Beispiel 1 angegeben, hergestellt, indem man bei einem p„-Wert von 5 200 ml-Portionen Mycel-Extrakt ( S 100 g feuchtes Mycel) an 200 mg AlPO₄ adsorbierte und die überstehenden Flüssigkeiten verwarf.

Einzelne Adsorbate wurden erfolgreich (gezeigt durch den Schutz von Mäusen gegen Semliki Forest-Virus) in folgender Weise eluiert:

a) durch Schütteln in 20 ml 0,5m Phosphat-Losung, p 7,5

b) durch Schütteln in 20 ml 0,1m Natriumacetat/20 ml 80%iges

Phenol

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c) durch Schütteln in 20 ml 20%-igem Pyridin

d) durch Schütteln in 20 ml 0_f5m Kaliumthiocyanatlösung, p,, 8

e) durch Erhitzen während l/2 Stunde auf 60 C in 0>25m Natriumacetat.

Die Extrakte wurden dann anschließend durch Dialyse (wenn nötig) durch AlkoholausfMllungen, durch Phenolextraktionen (mit Ausnahme von b) etc. aufgearbeitet, so daß man freie Nucleinsäurelösungen zur Untersuchung in Mäusen erhielt.

Bei den Beispielen b) und e) ist es wahrscheinlich, daß eher freie RNA als virusartige Teilchen von den Adsorbaten eluiert wurden.

Beispiel 3

Geklärte Mycelextrakte (p„ ~ 7,5) wurden 1 Minute bei 10 000 UpM (9000 g) in einem "30"-Rotor zentrifugiert: es konnten keine virusartigen Teilchen sediment!ert werden. Wenn die gleichen Extrakte, die jedoch 0,2m NaCl und 2 % oder 4 % Polyäthylenglykol 6000 enthielten, in gleicher Weise zentrifugiert wurden, wurde der Hauptteil der virusartigen Teilchen sedimentiert; wenn 6 % oder 8 % Polyäthylenglykol vorhanden war, wurden alle Teilchen sedimentiert.

Die Verteilung der virusartigen Teilchen wurde mit Hilfe des Elektronenmikroskops bestimmt.

Hefe-RNA (40 Ajg/ml) wurde aus 0,2m NaCl in Anwesenheit von 0,25 % bis 4 % Polyäthylenglykol (gezeigt durch UV-Abaorρtion) bei 10 000 g in 5 Minuten nicht sedirnontiert, was zeigt, daß die Zentrifugierung unter diesen Bedingungen virusartige Teilchen von RNA der Hefe-RNA-Art trennt.

Beispiel 4

Drei 10 ml-Proben geklärter Mycel extrakte, deren p.,-Werte auf 8, 6 und 5 eingestellt waren, wurden durch Mil]ipor-Mem-

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branen (0,45 η) filtriert. Die Filtrate mit einem p^-Wert von 6 und 8 enthielten augenscheinlich alle ursprünglich vorhandenen virusartigen Teilchen, und das FiItrat mit einem p„-Wert von 5 enthielt kaum virusartige Teilchen. Hefe-RNA wurde bei einem p_H-Wert von 5 nicht durch die Membranen zurückgehalten-.

Beispiel 5

50 ml geklärter Mycelextrakt, der mit Essigsäure auf p^ 5 eingestellt war, wurde durch eine Millipormembran (0,45 n) filtriert. Dabei erhielt man sehr wenig virusartige Teilchen in dem Filtrat.

Beim Durchleiten von 5 ml Phosphatpuffer oder Natriumacetat (0,1m, p_H 8) durch die Membran ergab sich eine vollständige Wiedergewinnung der virusartigen Teilchen in dem Filtrat (verifiziert mit Hilfe des Elektronenmikroskops).

Beispiel 6

Geklärte Mycelextrakte (25 ml-Anteile), die 0,2m NaCl und 4 % Polyäthylenglykol 6000 enthielten, wurden bei p_H 7,5 und bei p_H 5 während 20 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Bei einem p„ - Wert von 5 wurde die Hauptmenge der virusartigen Teilchen sedimentiert, wogegen bei einem p_H-Wert von 7,5 nur wenige(geschätzt mit Hilfe des Elektronenmikroskops) sedimentiert werden konnten.

Beispiel 7

Ein Kieselgurbett (5 cm Durchmesser und 0,6 cm Dicke) wurde hergestellt und mit 250 ml 0,01m Natriumacetat bei einem p„-Wert von 5 gewaschen.

Dann wurden 200 ml-Portionen geklärten Mycelextraktes, dessen p„-Wert auf 5 eingestellt worden war, langsam durch das Bett geleitet. In den Filtraten waren keine virusartigen Teilchen vorhanden.

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Das Durchleiten von zweimal 20 ml 0,5m Natriumacetat (p 7,8) oder sechsmal 20 ml 0,1m Phosphat (p„ 8) durch das fiett eluierte alle virusartigen Teilchen, wie es mit Hilfe dos Elektronenmikroskops gezeigt werden konnte.

In ähnlicher Weise waren Eluierungen bei einem p„-Wert von 0 mit 0,5m Tris-(hydroxymethyl )-methylamin, 0,5m Citrat, 0,5rn Natriumacetat, 0,5m Phosphat oder 0,Im. Phosphatpuffer in allen Fällen wirksam.

κ Einige Filterbetten wurden mit Wasser gewaschen, und ein Anteil der virusartigen Teilchen wurde auf diese Weise eluiert., Im Ge-

I J

gensatz dazu führte ein Waschen mit 0_t5m Natriumacetat bei einem p_H-Wert von 5 nicht zu einer Eluierung der virusartiqen Teilchen,

Beispiel 8

50 ml-Anteile Mycelextrakte, die 0,2m NaCl und 4 % Polyäthylenglykol 6000 enthielten, wurden bei einem ρ .-Wert von 7,5 durch Millipormembranen (0,45 η) filtriert. Unter diesen Bedingungen wurde die Mehrzahl der virusartigen Teilchen zurückgehalten.

Eluierungen mit zweimal 5 ml-Anteilen 0,1m Phosphat (p.. 8) oder ^ 0,5m Natriumacetat ergaben offensichtlich eine vollständige Wiedergewinnung des Materials, wogegen 0,1m Natriumacetat als Eluierungsmittel weniger wirksam erschien.

Andererseits wurde Hefe RNA (40 ug/ml) in O,2m NaCl bei einem p„-Wert von 5 mit oder ohne 4 % Polyäthylenglykol 6000 nicht durch die Millipormembranen (0,45yu) zurückgehalten, was darauf hinweist, daß die Milliporfiltration unter den obigen Bedingungen die virusartigen Teilchen von den freien RNA der Hefe-RNA-Art trennt.

Beispiel 9

15 kg Mycel von PeniciIlium chrysogenum Thorn wurden in 36 1 destilliertem Wasser suspendiert und mit einer 4n-NaOH-Lösung

,_ώ 109828/1566

auf einen p„-Wert von 8,0 eingestellt. Dann gab man 3,9 1 0,5m Phosphatpuffer mit einem p_H~Wert von 8,0 und 20 g Nipastat (gemischte Methyl-, Äthyl-, Propyl- und Butylester von p-Hydroxybenzoesäure) hinzu, und nach gutem Vermischen wurde die Suspension zweimal in einer Kolloidmühle bei 8000 UpM behandelt. Der Extrakt wurde mit 0,5 kg Kieselgur vermischt und unter Vakuum über ein 1,2? cm (l/2 ") dickes Kieselgurbett in einem Filter mit einem Durchmesser von 61,0 cm (24") filtriert. Der· geklärte Extrakt (42 1) wurde mit 500 g Natriumchlorid auf eine Konzentration von 0,2m NaCl gebracht. Die virusartigen Teilchen wurden ausgefällt, indem man 1,68 kg Polyäthylenglykol 6000 hinzugab, 20 Minuten gilt ver mischte und 60 Minuten stehen ließ, bevor man den p_H~Wert mit Eisessig auf 5,0 einstellte, und weitere 60 Minuten stehen ließ Die ausgefällten virusartigen Teilchen wurden in einer Zentrifuge bei 3500 g gewonnen und in 2,1 1 0,1m Natriumacet:atlösung bei einem p..-Wert von 7,0 wieder in Suspension gebracht. Das Protein wurde von den vii~usartigen Teilchen abgetrennt durch Verrühren der Suspension mit einem gleichen Volumen (2,1 1) Phenol während 30 Minuten. Die zwei flüssigen Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 2100 g während 60 Minuten getrennt, und die obere wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit 2 Volumen Industriebrennspiritids vermischt. Nach Lagern über Nacht bei 4 C wurde die ausgefällte Nucleinsäure durch Zentrifugieren bei 2100 g während 10 Minuten gewonnen. Der Feststoff wurde in destilliertem Wasser gelöst, gegen zweimal 100 1 destilliertes Wasser dialysiert und schließlich gefriergetrocknet. Die Ausbeute an festem Material betrug 930 rag, wovon 593 mg Nucleinsäure waren (bezogen auf ein E₁ von 200). Andere Eigenschaften

waren.: Ej[ bei 258 mu = 128, E^ bei 280 mu = 73, E^mf^x = .2,25. *■ ■ ■ ',■ / .--■"* l / ⁷ min · » ι

Protein 2,9 %, Kohlehydrate 14 %.

Analytische Gelfiltration

3-5 mg-Proben (bezogen auf Nucleinsäure = E. 200) wurden in 0,5 ml Acetatpuffer (2 % Natriumacetattriliydrat, 0,2 % Magnesiuinacetattetrahydrat) gelöst. Die Lösung wurde in eine 500 rnl~ Säule (650 χ 32 mm) BioRad Bio-Gel A 15m, Korngrößen 0,15 bis

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0,3 mm (50 bis 100 mesh)] eingebracht, die mit Acetatpuffer ins Gleichgewicht gebracht und entgast wurde. Die Probe wurde mit 0,5 ml Puffer aufgewaschen und das Chromatogramm mit 500 ml Puffer während 18 bis 24 Stunden entwickelt. Säulenabstrom-Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt und im UV bei 260 mu auf den Gehalt analysiert.

Die Ergebnisse sind als Prozentsatz ausgedrückt, bezogen auf die UV-Absorption bei 260 mu im Peak, geteilt durch die Gesamtabsorption bei 260 mu.

W Peak I ist der erste Haupt-UV-Peak, der in dem Abstrom erscheint, Peak II ist der zweite, während der Rest als Peak III bezeichnet wird.

Die Ergebnisse zeigten 51,3 % Peak I, 27,5 % Peak II und 21,2 % Peak III.

Beispiel 10

5 kg Mycel Penicilliurn chrysogenum Thorn wurden in 12 1 destilliertem Wasser suspendiert und mit einer 4n-NöOH-Lösung auf einen p„-Wert von 8,0 gebracht. Die Suspension wurde mit 1,3 0,5m Phosphatpuffer mit einem p„-Wert von 8,0 und mit 6,5 g ψ Nipastat (gemischte Methyl-, Äthyl-, Propyl- und Butylestcr von p-Hydroxybenzoesäure) vermischt und dann dreimal bei 562 kg/cm (8000 p.s.i.) in einem Homogenisierer homogenisiert« Der Extrakt wurde mi 250 g Kieselgur vermischt und unter Vakuum auf einem 1,27 cm (l/2 ") dicken Kieselgurbett in einem Filter mit einem Durchmesser von 61,0 cm (24") filtriert. Der geklärte Extrakt (12 1) wurde mit 144 g Natriumchlorid 0,2m gemacht. Die virusartigen Teilchen wurden durch Zusatz von 4 80 g Polyäthylenglykol 6000 durch Verrühren während 20 Minuten und durch Stehenlassen während 60 Minuten, bevor man den p_H~Wert durch Zugabe von Eisessig auf 5,0 einstellte, und weiteres Stehenlassen während 60 Minuten abgetrennt. Die ausgefällten virusartigen Teilchen wurden in einer Zentrifuge bei 35OC g gewonnen und in 1 1 0,1m Natriumacetatlösung bei einem p. --l>'ort

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von 7,0 wieder in Suspension gebracht. Das Protein wurde von den virusartigen Teilchen abgetrennt durch Verrühren der Suspension mit einem gleichen Volumen Phenol (11) während 30 Minuten. Die zwei flüssigen Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 2100 g während 60 Minuten getrennt, und die obere wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit 2 Volumen Industriebrennspiritus vermischt. Nach einer Lagerung über Nacht bei 4°C wurde die ausgefällte Nucleinsäure durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 2100 g und 4°C gewonnen. Der Feststoff wurde in destilliertem Wasser gelöst, gegen zweimal 100 1 destilliertes Wasser dialysiert und schließlich gefriergetrocknet. Die Ausbeute an Feststoff betrug 1,79 g, wovon 314 mg Nucleinsäure waren (bezogen auf E^ von 200). Andere Eigenschaften waren die folgenden: E^ bei 25 8 mu = 35, E^ bei 280 mu = 18, E™J* = 2,0, Protein 4,7 %, Kohlehydrate 40 %. Die Gelfiltration, wie in Beispiel 9 durchgeführt, ergab: 51 % Peak I, 47,8 % Peak II und 1,2 % Peak III.

Beispiel 11 Aqarose-Gel-Filtration

i) Eine Probe (100 optische Dichte-Einheiten bei 260 mu) Nucleinsäuren, extrahiert, wie in Beispiel 1 A angegeben, wurden in 5 ml 0,15m Natriumacetat gelöst und auf eine etwa 800 ecm fassende Säule kugelförmiger 4%-iger Agarose (Bio-Gel A 15m), die in 0,15m Natriumacetat gepackt war, aufgebracht. Die Säule wurde im Aufwärtsstrom unter Verwendung der gleichen Salzlösung als Eluierungsmittel entwickelt, und 10 ml-Proben wurden gesammelt. Der Abstrom wurde mit Hilfe der Absorption bei 254 mu untersucht, und in dieser Weise konnte man drei Fraktionen von UV-absorbierendem Material feststellen.

Der erste Peak (Peak I), der aus der Säule in den Fraktionen 30 bis 36 eluiert wurde, bestand aus einem Material, das vollständig von dem Gel abgetrennt war, und dieses Material war für etwa 50 % der gesamten optischen Dichte verantwortlich.

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Der zweite Peak (Peak II) erschien in den Fraktionen 53 bis und machte etwa 20 % der optischen Dichte aus.

ii) 16 mg Nucleinsäure (E₁ 164), isoliert aus virusartigen Teilchen von Penicillium chrysogenum, wie in Beispiel 1 A beschrieben, wurden gelöst und mit 0,2m Natriumacetat und 0,001m Äthylendiamintetraacetatdinatriumsalz auf 10 ml gebracht. Die Probe wurde auf eine etwa 800 ecm fassende Säule von Bio-Gel A 15m aufgebracht, gepackt und in der gleichen Salzlösung bei 20 bis 25°C eluiert, wobei 10 ml-Fraktionen abgenommen wurden. ^ Die folgenden Fraktionen wurden kombiniert:

Fraktion 30 bis 40 116 Einheiten der optischen Dichte= 43%

Fraktion 41 bis 50 22 " " " " = 8%

Fraktion 51 bis 59 87 " " » " = 32%

Fraktion 60 bis 81 46 " " " " = 17%

Die "Peak !"-Fraktionen 30 bis 40 wurden vereinigt, auf etwa l/lO ihres ursprünglichen Volumens aufkonzentriert, mit 2 Volumen Äthanol ausgefällt und bei 5 C gelagert; andere ähnliche Fraktionen wurden zugesetzt, wobei ähnliche Säulenchromatographien durchgeführt wurden.

) In ähnlicher Weise wurden die Fraktionen 51 bis 59 aufkonzentriert und als eine Quelle für Peak II gelagert.

Herstellung der Probe von Peak I

Die Fraktionen 30 bis 40 von 12 ähnlichen Abtrennungen wurden vereinigt und einer weiteren Fraktionierung unterworfen.

Zwischen 200 und 250 optische Dichte-Einheiten zu 10 ml wurden auf eine etwa 800 ecm fassende Säule Bio-Gel A 50m aufgebracht, gepackt und in 0,15m Natriumacetat bei 20 bis 25 C eluiert. 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt, und die 10 Fraktionen, die nach dem ersten Anstieg der optischen Dichte (Fraktionen 30 bis 39) erfolgten, wurden vereinigt, aufkonzentriert und mit 2 Vo lumen Äthanol wieder ausgefällt. Die Fraktionen 30 bis 39 von ^cünf ähnlichen Abtrennungen wurden vereinigt. Der auf der

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Oberfläche schwimmende Niederschlag wurde mit Hilfe eines Glasstabs von der ,Oberfläche abgenommen und in einem geringen Volumen destilliertem Wasser gelöst. Er wurde 18 Stunden gegen 5 1 destilliertes Wasser dialysiert, das 0,5 g Natriumacetattrihydrat enthielt, bei 39 000 g während 60 Minuten bei 5°C zur Klärung zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde gefriergetrocknet.

Ausbeute 45,8 mg, E^ 148, S_0n 12,0, wobei S_0n die Sedi-

j. *iu,w <;u,w

mentationskonstante in Svedberg-Einheiten bedeutet, bestimmt in 0,01m Phosphatpuffer (p„ 7) bei sehr geringer Nucleinsäurekonzentration, auf seinen Wert in einem Lösungsmittel mit der Dichte und der Viskosität von V/asser bei 20°C korrigiert.

Eine optische Dichte-Einheit, wie sie hierin angegeben ist, ist die Menge an Nucleinsäure, die in 1 ml 0,15m Natriumacetat gelöst eine Absorption von 1,0 in einer 1 cm-Zelle ergibt.

Herstellung der Probe von Peak II

Ausgefällte Fraktionen 51 bis 59 von neun gleichartigen Abtrennungen auf Bio-Gel A 15m, wie in ii beschrieben, wurden vereinigt und in 0,15m Natriumacetat wieder aufgelöst, und die entstehende Lösung wurde als Beschickungsmaterial für vier Abtrennungen an einer 800 ccm-Säule von Bio-Gel A 15m verwendet.

Die Säule wurde gepackt und mit 0,15m Natriumacetat bei 20 bis 25 C eluiert, und 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die optische Dichte-Verteilung war die folgende:

Fraktionen 32 bis 38 14 optische Dichte-Einheiten " 39 bis 46 150 " « ·' ¹¹ 47 bis 54 8 " » »

Die Fraktionen 39 bis 46 wurden vereinigt, aufkonzentriert und mit 2 Volumen Äthanol wieder ausgefällt. Die vereinigten

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Nieuarschläge aus den vier Säulen wurden in einem geringen Volumen destilliertem Wasser wieder gelöst und während 18 Stunden gegen 5 1 destilliertes Wasser, das 0,5 g Natriumacetattrihydrat enthielt, dialysiert. Die Lösung wurde dann bei 000 g während 60 Minuten bei 5°C zentrifugiert, und die überstehende Lösung wurde gefriergetrocknet.

Ausbeute: 34 mg, EjT 152, S_nr. 7,0.

Eigenschaften des Peak I- und Peak.II-Materials

Die Proben der fraktionierten Nucleinsäuren wurden wie oben ψ beschrieben hergestellt und den folgenden Untersuchungen unterzogen:

1. Widerstandsfähiqkeit gegenüber Ribonuclease

Die Nucleinsäuren wurden in Standard-Salz/Citrat-Lösungen (SSC, 0,15m Natriumchlorid, 0,015m Natriumeitrat, p_H 7,0) bei einer Konzentration gelöst, so daß sich eine optische Dichte von etwa 1,0 bei 260 rau ergab, und mit 0,2 xig/ml Pankreas-Ribonuclease (Boehringer Corporation: Analytische Reinheit) bei 25°C während 1 Stunde behandelt. Weder das Material des Peaks I noch das des Peaks II ergab unter diesen Bedingungen einen Anstieg der optischen Dichte.

Wenn die Salzlösung 1:10 (0,1 χ SSC) verdünnt wurde, die Bedingungen sonst jedoch die gleichen waren, stieg die optische Dichte-Absorption der Probe des Peaks II in Anwesenheit von Ribonugleose schnell an und hatte im Verlaufe einer Stunde um über 15 % zugenommen. Unter diesen Bedingungen zeigte die Probe des Peaks I ebenfalls einen gewissen Anstieg der optischen Dichte, jedoch betrug die in diesem Fall beobachtete Hyperchromie lediglich 9 % pro Stunde.

2. Biologische Aktivität des Materials der Peaks I und II in Mäusen

Die Bestimmung der Blutinterferonmengen in jungen erwachsenen Mäusen zu verschiedenen Zeiten nach der interperitone-

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alen Injektion der Materialien der Peaks I und Peaks II in physiologischer Salzlösung zeigte Unterschiede zwischen den Zeiten der maximalen Interferontiter, wie im folgenden angegeben ist:

Peak I: Seruminterferonspitze 6 bis 18 Stunden nach der (1 mg/kg) Injektion.

Peak II: Seruminterferonspitze l/2 bis 6 Stunden nach der (1mg/kg) Injektion.

Die optimale Zeit zur intraperitonealen Injektion der Materialien des Peaks I und Peaks II in jungen erwachsenen Mäusen, um einen Schutz gegen Semliki Forest-Virus zu ergeben, wurde wie folgt bestimmt:

Peak I: optimale Zeit zur Dosierung 12 bis 18 Stunden vor dem Virusancjriff.

Peak II: optimale Zeit zur Dosierung 4 bis 6 Stunden vor dem Virusangriff.

3· Thermische Denaturierunq

Die Wirkung von Hitze auf die UV-Absorption einer Nucleinsäure in Lösung in definierten Salzkonzentrationen ist charakteristisch für die Nucleinsäure und wird durch den Grad der Ordnung der Sekundärstruktur der Nucleinsäure bestimmt.

Wenn das Material des Peaks I in 1,0 SSC, 0,1 SSC oder 0,01 SSC (wie oben definiert) erhitzt wurde, zeigte sich kein Absorptionsanstieg bei einer Temperatur unterhalb 60 C. Bei 0,01 SSC betrug die Tm (Temperatur, die erforderlich ist, die halbe maximale Hyperchromie bei 259 rau zu ergeben)

etwa 79°C.

Die Probe des Peaks II, die in 0,01 SSC erhitzt wurde, zeigte unterhalb 50°C keinen A]
Lösung betrug die Tm 69°C.

te unterhalb 50°C keinen Absorptionsanstieg, und in dieser

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4. Verhalten bei der Elektrophorese in Polyacrylamidqel

Die folgenden Lösungen waren erforderlich, um die PoIyacrylamidgele herzustellen:

a) 10 % umkristallisiertes Acrylamid und 0,5 % umkristallisiertes Methylen-bis-acrylamid in Wasser.

b) Pufferlösung: 0,2m Tris

0,1m Natriumacetat

10m Natriumäthylendiamintetraacetat, mit Essigsäure auf einen p„-Wert von 7,8 eingestellt.

c) Ν,Ν,Ν·,N'-Tetramethyläthylendiainin, auf 1 bis 3 Volumen/ Volumen mit destilliertem Wasser verdünnt.

d) Wäßriges Ammoniumpersulfat, 1 % Gewicht/Volumen.

Herstellung von 5% Polyacrylamidqelen

10 ml der Acrylamidlösung, 4 ml Puffer und 4,3 ml destilliertes Wasser wurden vermischt und entgast; dann wurden O,l ml der Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 1,6 ml der Ammoniumpersulfatlösung eingemischt und die Lösung schnell ±n vorher vorbereitete Siliciumdioxydröhrchen mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Länge von 8 cm, die zeitweilig einseitig verschlossen waren, eingebracht. Die Röhrchen wurden bis zu einer Hlhe von 6 cm gefüllt, und »an ließ den Inhalt polymerisieren, nachdem man einige wenige Tropfen Wasser vorsichtig auf der Oberfläche in Form einer Schicht aufgebracht hatte. Die Gele wurden vorzugsweise vor der Verwendung über Nacht gelagert und dann 2 Stunden bei 5 mA pro Röhrchen elektrophoretisch zum Laufen gebracht. Der Laufpuffer, der verwendet wurde, um die Reservoire zu füllen, war der gleiche, der bei der Herstellung der Gele verwendet wurde, jedoch war dieser Puffer 1:5 (Volumen/Volumen) verdünnt.

Nach einem Vorlauf wurde der Puffer, mit dem die Röhrchen gefüllt waren, entfernt, und die oberen Oberflächen der Gele wurden mit Filterpapierstreifen getrocknet. Dann wur-

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den Nucleinsaureproben in 20%-iger Saccharoselösung, vorzugsweise in Form eines einzigen Tropfens, der 25 bis 100 /ug Nucleinsäure enthielt, aufgebracht. Der laufende Puffer wurde dann vorsichtig über der Probe in Form einer Schicht aufgebracht, und frischer Puffer wurde für beide Reservoire verwendet. Nach Durchführung der Elektrophorese während 180 Minuten bei 5 mA pro Röhrchen (100 Volt) bei 25°C wurden die Röhrchen entnommen, und die UV-Absorption. der Nucleinsäure-Banden wurde unter Verwendung einer Joyce-Loebl-Chromoscan-UV-Aufzeichnungsvorrichtung bestimmt. Alternativ wurden die Gele aus den Röhrchen ausgepreßt, 1 Stunde in 7%-iger (Volumen/Volumen) Eisessig-Lösung eingebracht, über Nacht mit 0,2 % (Gewicht/Volumen) Methylen-Blau-Lösung (0,4m Acetatpuffer, p_H 4,7) gefärbt und durch wiederholtes Waschen entfärbt.

Die Probe des Peaks I ergab unter diesen Bedingungen offensichtlich eine Mehrfach-Bande, die 5 bis 6 mm vom Ursprung gewandert war. Die Probe des Peaks II zeigte eine wohldefinierte Einzelbande, die 37 bis 39 mm vom Ursprung sich entfernt hatte. Beide Proben zeigten nur geringe diffuse Färbung, abgesehen von den beschriebenen Hauptbanden.

Wenn die Probe des Peaks I in dem gleichen System, jedoch bei 2,5 mA pro Röhrchen 16 Stunden bei 5°C elektrophoretisch untersucht wurde, zeigte das Färben des Gels mit Methylen-Blau eine starke Doppelbande 15 bis 16 mm vom Ursprung entfernt und eine schwächere Einzelbande bei etwa 1 mm weniger weit entfernt.

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5. Gel-Filtrations-Eiqenschaften des Materials des Peaks I
und des Peaks II

GeI- Filtra- tions- medium	Salz lösung	Tem pera tur OC	Zur Eluierung der Frak tion erforderliches Vo lumen (% des Gesamt-Säu- lenvolumens)	Peak II	I
Bio-Gel A 1,5m	0,15m Natrium acetat	20-25	Peak I	48-58
Bio-Gel A 5m	0,2m Natrium acetat -0,001m EDTA	20-25	abgetrennt	56-67
Bio-Gel A 15m	0,2m Natrium acetat -0,001m EDTA	20-25	40-52	62-75
Bio-Gel A 15m	0,15m Natrium acetat	20-25	39-50	61-72
Bio-Gel A 50m	0,15m Natrium acetat	20-25	38-49
41-54

Die angegebenen Eluierungseigenschaften sind jene, die beobachtet wurden unter Verwendung verschiedener im Handel erhältlicher Gel-Filtratlonsmedien. Da wesentliche Unterschiede zwischen verschiedenen Packungen derartiger Materialien auftreten können, sollten die in der Tabelle angegeben EIuierungsvolumina als Maß für die zu erwartende Verzögerung
gewertet werden und nicht als absolute reproduzierbare Eigenschaften.

Im allgemeinen erscheinen die Nucleinsäuren in kompakterer Form, je höher die Ionenstärke und je höher das Ausmaß der Verzögerung ist, jedoch ist dieser Effekt weniger deutlich bei doppelsträngigen Nucleinsäuren als bei einfachsträngigen Nucleinsäuren.

Bio-Gel A ist ein Agarose-Gel, wobei die damit zusammen angegebene Zahl auf das minimale Molekulargewicht in 10 -Einheiten Globulin Bezug nimmt, das dadurch getrennt wird. So-

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mit trennt Bio-Gel A 15m Globulin mit einem Molekulargewicht von 15 χ IO ab.

6. Basen-Analyse

Die Basen-Analysennach der Hydrolyse von Smith und Markham (Bio.J. 1950, 46_, 509) und Papierchromatographie gemäß Wyatt (Bio.J. 1951, 4_8, 584) ergaben die folgenden Ergebnisse:

Peak I: Guanin 25,0 ± 1,0 (26,1) Adenin 25,0 - 1,0 (24,2) Cytosin 25,0 ± 1,0 (24,8) Uracil 25,0 t 1,0 (24,9)

Peak II: Guanin 18,0 ί 1,0 (18,7) Adenin 32,0 ί 1,0 (31,4) Cytosin 18,0 ? 1,0 (17,7) Uracil 32,0 ί 1,0 (32,3)

Die in Klammern angegebenen Werte sind jene für eine Einzelbestimmung und sind nicht für Verluste während der Hydrolyse korrigiex-t, wobei die Ergebnisse als Mol Base pro 100 Mol gewonnenes Material angegeben sind.

7. Sedimentations—Konstanten

Die S₂₀ -Werte, die einen Hinweis auf das Molekulargewicht der Nucleinsäuren geben, variieren innerhalb der folgenden Bereiche, teilweise in Abhängigkeit von dem Ausmaß, in dem geringe Mengen unerwünschter Nucleinsäuren vorhanden sind:

Peak I; 11,7 bis 12,3; Peak II: 6,7 bis 7,3.

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Beispiel 12

Freisetzung von virusartiqen Teilchen aus Mycel Penicillium chrysoqenum Thom

a) 15 g Mycel, suspendiert in 45 ml Wasser, bei einem p„-Wert von 8,0 wurden 8 Minuten mit Schall behandelt. Die Suspension wurde auf einem Kieselgurbett mit einer Dicke von 0,635 cm (1/4 ") filtriert, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf virusartige Teilchen untersucht. Ergebnis: 25,6 Einheiten/ml.

b) Eine Probe des Mycels wurde 10 Minuten mit einem Glas/Glas-Mahlwerk mit 3 Volumen Wasser bei einem p„-Wert von 8,0 vermählen. Nach dem Filtrierten auf einem Kieselgurbett mit einer Dicke von 0,63 5 cm (1/4 ") wurde die überstehende Flüssigkeit auf virusartige Teilchen untersucht. Ergebnis: 25,6 Einheiten/ml.

c) 1,0 kg Mycel wurde in 2 1 Wasser bei einem p..-Wert von 8,0 suspendiert und mit einem Phosphatpuffer von einem p.,-Wert von 8,0 0,05m gemacht. Die Suspension wurde in einer Hoitiogenisiervorrichtung 5 Minuten mit einem Schneidkopf und 25 Minuten mit einem axialen Flußkopf behandelt. Die Aufschlämmung wurde über ein Kieselgurbett mit einer Dicke von 0,635 cm (1/4 ") filtriert und auf virusartige Teilchen untersucht. Ergebnis: 4,8 Einheiten/ml.

d) 2,0 kg Mycel wurde mit 4,0 1 Wasser 1 Stunde ausgelaugt. Die Suspension wurde über ein Kieselgurbett filtriert und auf virusartige Teilchen untersucht. Ergebnis: 0,3 Einheiten/ml.

e) 1,0 kg Mycel wurde in 2,0 1 Wasser suspendiert und mit einem Phosphatpuffer mit einem p_H~Wert von 8,0 auf eine Konzentration von 0,05m gebracht. Die Aufschlämmunh wurde in einer 7,62 cm (3")-Kolloidmühle 30 Minuten behandelt und dann über ein Kieselgurbett filtriert, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf virusartige Teilchen untersucht. Ergebnis: 12,8 Einheiten/ml.

f) 5 kg Mycel, suspendiert in 13 1 0,05m Phosphatpuffer mit einem p_H-Wert von 8,0, wurden in einem Druck-Homogenisierer

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bei einem Druck von 562 kg/cm (8000 p.s.i.) behandelt. Die Aufschlämmung wurde über ein Kieselgurbett filtriert und die überstehende Flüssigkeit auf virusartige Teilchen untersucht. Ergebnis: 12,8 Einheiten/ml.

Der Ausdruck "Einheiten", die er in diesem Beispiel verwendet wird, steht für die Zahl der Häufigkeiten, mit der die Probe verdünnt werden kann, so daß sie gerade als eine Ausfällungslinie in einer Geldiffusions-Analyse erkennbar ist. Verschiedene Ansätze von Mycel wurden bei den verschiedenen Verfahren verwendet, und demzufolge sind die angegebenen Ausbeuten an virusartigen Teilchen nicht miteinander zu vergleichen.

Beispiel 13

1,39 g rohe Mycophag-Nucleinsäure (E^ bei 259 nm 64), erhalten wie in Beispiel 10 beschrieben, jedoch mit einem Nucleinsäure-Gehalt von 450 mg, wurden in 80 ml destilliertem Wasser gelöst, und zu der Lösung gab man 80 ml 2,5m Dikaliumhydrogenphosphat, 80 ml 2-Methoxyäthanol und 4 ml 33% Volumen/Volumen Phosphorsäure. Nach gutem Schütteln wurde die Mischung während 20 Minuten mit 2100 g und bei einer Temperatur von 25°C zentrifugiert, und die obere Phase wurde sowohl von der unteren Phase als auch dem Zwischenphasen-Niederschlag abgetrennt. Dann gab man 120 rnl Äthanol zu der abgetrennten oberen Phase, und nach dem Vermischen wurden die ausgefällten Nucleinsäuren (in der Zwischenphase) durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 2100 g getrennt. Sowohl die oberen als auch die unteren Phasen wurden von dem Niederschlag abdekantiert, der dann in destilliertem Wasser gelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert wurde, bis er frei war von einer zu starken Salzverunreinigung.

Ausbeute: 0,40 g, E^ 170 bei 259 NM

Beispiel 14

1,8 g Nucleinsäure (E^ 172, von der angenommen wird, daß sie 52 % Peak I- und 36% Peak II-Material enthält), die durch das

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in Beispiel 13 angegebene Verfahren erhalten worden war, wurden in 300 ml destilliertem V/asser gelöst. Dann wurden, während man alle Lösungen bei etwa 25°C hielt, 300 ml 4m-Natriumchloridlö~ sung zugegeben, gefolgt von 60 ml Äthanol, und die Lösung wurde gut vermischt und während 18 Stunden bei 4 C gelagert, bevor man sie während 1 Stunde bei 5 C zentrifugierte (35 000 g). Das kleine Körnchen mit dem festen Material wurde verworfen. Die dekantierte überstehende Flüssigkeit ließ man dann auf Raumtemperatur sich erwärmen (etwa 25 C), bevor man weitere 45 ml Äthanol hinzugab. Es trat keine dauernde Ausfällung bei ^ 25°C auf, jedoch beim Kühlen während 18 Stunden auf 5 C bildete sich ein schwerer gelartiger Niederschlag, der durch Zentrifugieren während 1 Stunde bei 5°C bei 35 000 g abgetrennt wurde. Das ausgefällte Material bestand im wesentlichen aus Nucleinsäure des Peaks I. Durch Wiederauflösen des Niederschlags in destilliertem Wasser, Abtrennung aller Äthanolspuren im Vakuum und Einstellen auf 2m Natriumchlorid vor der Zugabe von 17,5 % seines Volumens Äthanol enthielt der wie zuvor abgetrennte Niederschlag 95 % Peak I, bestimmt durch Gelfiltration. Der Niederschlag wurde in destilliertem Wasser wieder aufgelöst und dialysiert, um starke Salzverunreinigungen abzutrennen. Ausbeute: 0,80 g, E^ 167 bei 259 NM.

P Die Nucleinsäuren aus den überstehenden Flüssigkeiten der an Peak I angereicherten Niederschläge wurden durch Ausfällung mit einem gleichen Volumen Äthanol gewonnen. Der Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, und alle Spuren von Äthanol wurden im Vakuum abgetrennt und das Volumen auf 100 ml eingestellt. Nach Zugabe von 100 ml 4m Natriumchloridlösung, wobei die Lösung auf Raumtemperatur gehalten wurde, wurden 35 ml Äthanol hinzugegeben, und der nach 18 Stunden bei 4°C ausgefallene Niederschlag wurde bei 35 000 g während 1 Stunde und bei 5 C abzentrifugiert und verworfen. Die überstehende Lösung wurde auf 25 C erwärmt, und zusätzlich wurden 15 ml Äthanol zugegeben. Nach mehr als 18-stündigem Stehen bei 4°C wurde der Niederschlag abzentrifugiert (35 000 g, 1 Stunde, 5°C) und die Körnchen an festem Material in destilliertem Was»

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ser gelöst und dialysiert, bis das Material im wesentlicheil frei von Salzverunreinigungen war. Das Produkt enthielt 96 % Material des Peaks II, gezeigt durch Gelfiltration. Es enthielt weniger als 1 % Material des Peaks I. Ausbeute: 0,37 g, E^ 173 bei 259 NM.

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Claims

- 38 Patentansprüche

1.) Verfahren zur Herstellung von antiviralen zweisträngigen (doppelsträngigen) Ribonucleinsäuren aus P. chrysogenum, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Stamm P. chrysogenum in oder auf einem Nährmed.ium dafür kultiviert, wodurch sich darin virusartige Teilchen entwickeln j

b) die Zellen von P. chrysogenum ohne Entfernung des Über- ^ zugs der virusartigen Teilchen zerbricht und Zellreste abtrennt;

c) die virusartigen Teilchen von den freien Nucleinsäuren und anderen gelösten Materialien entweder teilweise oder gänzlich abtrennt;

d) die virusartigen Teilchen von ihrer Umhüllung befreit; und

e) eine Fraktionierung durchführt, um die gewünschten anti~ viralen doppelsträngigen Ribonucleinsäuren zu gewinnen.

2.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das P. chrysogenum ein Thom-Stamm ist.

3.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das P. chrysogenum vom Thom-Stamm ATCC 9480, 10 238, 10 002, 10 003, 11 707 oder 13 799 oder einer Mutante davon ist.

4.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor ihrer Zerstörung geerntet werden.

5.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zerstörung bzw. das Zerbrechen der Zellen durch Schallbehandlung, durch mechanische Homogenisierung, durch Einfrieren und Wiederauftauen, durch Lyse unter Behandlung mit einem wäßrigen Netzmittel, durch Autolyse oder durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym

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- 39 bewirkt wird.

6.) Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse durch Behandlung der Zellen mit einem langkettigen anionischen oberflächenaktiven Mittel bewirkt wird.

7.) Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Netzmittel Natriumlaurylsulfat ist.

8.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellüberreste bei einem p_H~Wert oberhalb 6,0 und unterhalb 9,0 abgetrennt werden.

9.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der virusartigen Teilchen durch Aggregation dieser Teilchen mit einem Protein-Koagulierungsmittel nach der Abtrennung der Zellüberreste bewirkt wird.

LO.) Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein-Koagulierungsmittel ein Polyalkylenglykol ist.

11.) Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein-Koagulierungsmittel ein Polyäthylenglykol ist.

12.) Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein-Koagulierungsmittel ein Molekulargewicht im Bereich von 4000 bis 10 000 aufweist.

13.) Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein-Koagulierungsmittel in einer Konzentration im Bereich von 3 bis 5 % Gewicht/Volumen vorliegt.

14.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der saure p„-Wert im Bereich von 4,5 bis 9,0 liegt.

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15.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die zusammengeballten Teilchen durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit abgetrennt werden.

16. ) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregation in Anwesenheit eines Elektrolyten durchgeführt wird.

17.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregation in Anwesenheit eines ψ Alkalimetallhalogenids durchgeführt wird.

18.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregation in Anwesenheit eine;: Alkalimetallhalogenids mit einer lonenstärke im Bereich von 0,10 bis 0,25m durchgeführt wird.

49.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Aggregation bei einem p.,-Wert irn Bereich von 4,5 bis 5,5 durchgeführt wird.

2o.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch ge-. kennzeichnet, daß die Zentrifugierung bei geringer Geschwindigkeit bei einem p„-Wert im Bereich von 3,5 bis 5,5 durchgeführt wird.

£l. ) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zusammengeballten Teilchen durch Filtration durch eine Filtermembran oder ein Bett aus Diatomeenerde oder Kieselgur bei einem ρ -Wert von 4,5 bis 5,5 abgetrennt werden.

22.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die virusartigen Teilchen nach der Abtrennung der Zellüberreste bei einem p„-Wert von 4,5 bis 5,5 an ein Adsorbens adsorbiert oder einer Membranfiltration unterworfen werden.

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23.) Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens Aluminiumhydroxyd, Aluminiumsilicat oder Kieselgur ist.

24.) Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens Aluminiumphosphatgel ist.

25.) Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Aluminiumphosphatgel mit einer Konzentration von 0,5 bis 2,0 mg/ml vorliegt.

26.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke der Lösung vor der Adsorption geringer als 0,1m ist.

gekennzeichnetj 27.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch/ daß die virusartigen Teilchen von den Adsorbens desorbiert oder von der Filtermembran abgewaschen werden unter Verwendung eines Eluierungsmittels mit einem ρ,.-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,0.

28.) Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluierungsmittel zur Eluierung der virusartigen Teilchen von einem Aluminiumadsorbens eine Ionenstärke im Bereich von 0,05m bis 1,0m aufweist.

29.) Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluierungsmittel eine wäßrige Lösung eines Ammonium- oder eines Alkalimetallacetats, -thiocyanats oder -jodids ist.

30.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die virusartigen Teilchen vor oder nach der Abtrennung von der Pilterinembran oder dem Adsorbens von ihrem Überzug befreit werden.

e\ α r% f% t «t

IU bH 7 9 U

31.) Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekenn ^ ti .ehrtet, daß die Entfernung des Überzugs dadurch bewerkstelligt wird, daß man das Material erhitzt, mit einem Netzmittel oder
mit einem Protein-Lösungsmittel behandelt.

32.) Verfahren gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Erhitzen auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 90' C und bei einer lonenstärke, die ausreicht, um die Nucleinsäuren zu stabilisieren, durchgeführt wird.

33.) Verfahren gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß ψ das Netzmittel ein langkettiges Alkylsulfat Lst.

34.) Verfahren gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein-Lösungsmittel ein Hydroxybenzot ist«

35.) Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydroxybenzol 80%-iges wäßriges Phenol i.st.

36.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dd~
durch gekennzeichnet, daß die virusar tiejen Tei Ich en von
dem Adsorbens oder der FiI termerabraii mit einer Joelid-·
oder Thiocyanat-Lösung eluiert werden und anschließend
auf einen ρ -Wert von 3,0 bis 4,0 angesäuert werden, urn
das nicht gewünschte Protein auszufällen.

37.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Entfernung des Überzugs der virusartigen Teilchen das damit verbundene Protein abgetrennt wird durch Verteilen der Teilchen in wäßriger Lösung mit einer getrennten Phase des flüssigen Protein-Lösung ami ttels.

38.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3f>, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht gewünschte Materia] durch
fraktionierte Fällung der Nucleinsäuren entfernt wird.

BAD ORIGINAL

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IU t> b 2 9 4

39.) Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.

40.) Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel ein Alkanol oder Keton ist.

41.) Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Isopropanol, 2-Methoxyäthanol, 2-Xthoxyäthanol, Aceton oder Methyläthylketon ist.

42.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß verbleibendes Polysaccharid aus dem Nucleinsäurematerial durch Verteilen zwischen einer wäßrigen Lösung und einem Alkanol, das eine getrennte Phase bildet, abgetrennt wird.

43.) Verfahren gemäß Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkanol 2-Methoxyäthanol ist.

44.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das abgetrennte Nucleinsäurematerial durch Gelfiltration weiter gereinigt wird.

45.) Verfahren gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel ein vernetztes Dextran oder ein Polyacrylamid ist.

46.) Verfahren gemäß Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelfiltration bei einer lonenstärke im Bereich von 0,015m bis 2m durchgeführt wird.

47.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierung so durchgeführt wird, daß man die Nucleinsäuren erhält, die als Peak I- und/oder Peak !!-Nucleinsäuren angegeben sind.

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48.) Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierung durch fraktionierte Fällung aus einer wäßrigen Lösung mit Hilfe eines mit Wcnsser mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.

49.) Verfahren gernäß Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Äthanol ist.

50.) Verfahren gemäß Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung, die Peak I- und Peak II-Nucleinsäuren enthalt, mit Äthanol vermischt wird, so daß man eine

' Äthanolkonzentration im Bereich von 14 bis 16 % Volumen/

Volumen erhält, so daß die Nucleinsäuren des Peaks I ausgefällt werden.

51.) Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Abtrennung der ausgefällten Peak I-Nucleinsäuren die Lösung mit weiterem Äthanol vermischt wird, so daß man eine Äthanolkonzentration im Bereich von 18 bis 22 % VoIumen/Volumen erhält, so daß die Peak Il-Nucleinsäuren ausgefällt werden.

52.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 49 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß die Niederschläge bei niederer Temperatur stehengelassen werden und bei dieser Temperatur abgetrennt werden.

53.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 49 bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Äthanol bis zu einer Konzentration von etwa 5 bis 10 % Volumen/Volumen zugesetzt wird, um die nicht erwünschten Materialien auszufällen, die vor der Ausfällung der Peak I-Nucleinsäuren abgetrennt werden.

'54/0 Peak I-Nucleinsäure, erhalten von Penicillium chrysogenum, mit den folgenden Eigenschaften:

BAD ORlOiNAt 1 0 9 8 2 9 / Ί 5 6 6

^S2O w ^{<wie vorher} definiert) = 11,7 bis 12,3

Basen-Analyse und Mol-%: Guanin 25,0 % ί 1,0,

Adenin 25,0 % - 1,0 Cytosin 25,0 % - 1,0 Uracil 25,0 % ± 1,0

Zweisträngige Ribonucleinsaurestruktur, antivirale Aktivität in Säugern.

55.) Peak II-Nucleinsäure, erhalten von Penicillium chrysogenum, mit den folgenden Eigenschaften:

S_nn (wie vorher definiert) =6,7 bis 7.3

20,W ' '

Basen-Analyse: Guanin 18,0 % - 1,0

Adenin 32,0 % ί 1,0

Cytosin 18,0 % ί 1,0

Uracil 32,0 % i 1,0

Doppelsträngige Ribonucleinsaurestruktur und antivirale Aktivität in Säugern.

56.) Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Peak I- und/oder Peak II-Nucleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 54 bis 55 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutischen Trägern oder Bindemitteln und/oder anderen Arzneimitteln enthalten.

57.) Zusammensetzungen gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß die Arzneimittel antiinflammatorische Steroide und/oder Antibiotika sind.

58.) Zusammensetzungen gemäß Anspruch 56 oder 57, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Dosiseinheitsformen vorliegen.

59.) Zusammensetzungen gemäß Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß jede DofiLseinheLt 1 bis 500 mg Peak I- und/odtjr Peak II^Nuclninsäure enthält.

109829/1566 ««OR.G.NAL

ZUbb 2 9 4

60.) Zusammensetzungen gernäß Anspruch 58, dadurch c<okc nnzeict'--net, daß jede Dosiseinheit 10 bis 250 mg Peak T- und/odrr Peak II-Nucleinsäure enthält.

61.) Zusammensetzungen gemäß Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß jede Dosiseinheit 50 bis 100 ing Peak I- und/oder Peak II-Nucleinsäure enthält.

62.) Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 56 bis 61, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von Tabletten, Kapseln, Lutschtabletten, Kaugummi, Medizinalsüßigkeiten, Lösungen, Suspensionen, Sirupen, Elixieren, Emulsionen, Granulaten zur Herstellung, Flüssigsprays, PulverinsuffIationen, Nasentropfen oder -salben, Rachenpinsolungsrnitte] n, Mundwässern, ophthalmischen Präparaten und Augenwässern, Hauttinkturen, Lotionen, Cremes, Salben, Stäubepulvern, Arzneistoffe enthaltenden Verbänden, Aerosolen, Suppositorien, Pessaren oder injizierbaren wäßricjen oder öligen Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen vorliegen.

63.) Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 56 bis 62, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 95 Gewichts-% Peak I- und/oder Peak II-Nucleinsäure enthalten.

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