DE3485778T2 - Vielwertiges pneumokokken-vakzin und herstellung desselben. - Google Patents

Vielwertiges pneumokokken-vakzin und herstellung desselben.

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DE3485778T2 DE8484105559T DE3485778T DE3485778T2 DE 3485778 T2 DE3485778 T2 DE 3485778T2 DE 8484105559 T DE8484105559 T DE 8484105559T DE 3485778 T DE3485778 T DE 3485778T DE 3485778 T2 DE3485778 T2 DE 3485778T2
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Description

  • Die Erfindung betrifft ein multivalentes Pneumokokkenvakzin, bestehend aus gereinigtem Pneumokokken-Kapselpolysaccharid, bei dem das "C"-Polysaccharid im wesentlichen fehlt. Diese Erfindung betrifft auch die spezifische Reinigung von jedem der 10 Pneumokokkentypen, die nach der dänischen Bezeichnung die Typen 2, 5, 9V, 10A, 11A, 15B, 17F, 19A, 22F und 33F sind, um die erfindungsgemäßen, immunogenen Polysaccharide zu erhalten. Andere Pneumokokkentypen, die in dem multivalenten Pneumokokkenvakzin gefunden werden, die nach dänischer Bezeichnung die Typen 1, 2, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 12F, 14 18C, 19F, 20, 23F und 25 sind, können gemäß US-A- 4,242,501 gereinigt werden.
  • Pneumokokken-Kulturen von jedem der bei der vorliegenden Erfindung brauchbaren Typen sind gelagert und weltweit von einer großen Zahl von Kultur-Hinterlegungsstellen erhältlich. Die American Type Culture Collection (ATCC) führt alle der erfindungsgemäßen Pneumokokkentypen als frei verfügbar.
  • Im ATCC-Katalog von 1978 sind diese Typen wie folgt bezeichnet: (siehe Tabelle I) Tabelle I Dänische Nomenklatur U.S. Nomenklatur Katalognummer
  • Der kritische Schritt bei der Herstellung eines Vakzins ist die Reinigung des immunogenen Materials in der Weise, daß äußeres Material entfernt wird ohne das die Eigenschaften des zurückbleibenden Materials verlieren gehen, welche die zweckentsprechende Antikörperproduktion verursachen. Derartige Eigenschaften des Polysaccharids scheinen in der Bewahrung dessen zu liegen, was man mit "natürlicher Zustand der Konfiguration" der Polysaccharide bezeichnet.
  • Unter den Materialien, die von den Polysacchariden abgetrennt werden sollen, sind Proteine, Nukleinsäuren und "C"- Polysaccharid. "C"-Polysaccharid findet sich in hohen Konzentrationen bei den Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung) 4, 7F und 14 und kann daher daraus wie in U.S.-A- 4,242,501 gezeigt, abgetrennt werden.
  • Nukleinsäuren, (welche Licht bei 260 MU absorbieren) sind bei der Herstellung von Pneumokokkenpolysacchariden schwierig auf ein zufriedenstellendes Niveau zu reduzieren. Dieses Problem steht im Gegensatz zu der Situation, die bei Meningokokken-Polysacchariden vorliegt, die leichter gereinigt werden können unter Bewahrung von Immunogenizität. Meningokokken-Polysaccharide können mittels relativ drastischer Methoden gereinigt werden, wie sie in U.S.-A-3 636 192 (Gotschlich) beschrieben sind. Es gibt 85 spezifische Typen von Pneumokokkus. Diese Typen werden sowohl nach dem amerikanischen als auch dem dänischen Bezifferungssystem bezeichnet. Die hier angegebenen Typenbezeichnungen sind die der dänischen Bezifferung. Jeder Typ scheint eine spezielle Methode zur Entfernung von Verunreinigungen zur erfordern und keine einzige Methode ist auf alle Typen der Pneumokokkenpolysaccharide anwendbar. Ferner scheint die spezielle zweckentsprechende Methode nicht voraussagbar zu sein. Beispielsweise erfordern einige der verschiedenen Verfahren, die zur Reinigung verschiedener Pneumokokkenpolysaccharide verwendet wurden, große Mengen an Ethanol für die Fällung. Auf diese Weise kann eine teilweise Trennung von Nukleinsäuren durch fraktionierte Fällung erreicht werden, da die Nukleinsäuren im niedrigen Alkoholbereich unter Verwendung von 3A-Alkohol gefällt werden. 3A-Alkohol ist 5 % absolutes Methanol und 95 % absolutes Ethanol. Absolutes Ethanol würde sich im wesentlichen in identischer Weise verhalten und wird als vollständig äquivalent angesehen. In der vorliegenden Beschreibung wird mit dem Ausdruck "Alkohol" 3A-Alkohol bezeichnet, falls nichts anderes angegeben ist.
  • Bei anderen Typen werden Polysaccharide in dem 30-50 % Bereich gefällt. Alkohol ist somit als Trennungsfällmittel nicht wirksam. Andererseits können andere Typen von Nukleinsäuren abgetrennt werden durch sorgfältig gesteuerte Mengen an Protaminsulfat. Bei diesen Typen werden bei einer optimalen Konzentration von Protaminsulfat (0,02 bis 0,20 %) Nukleinsäuren gefällt und können durch Hochgeschwindigkeitszentrifugieren pelletisiert werden. Jeglicher Überschuß an Protaminsulfat im System über die minimale Menge, die zur Fällung des Bestandteils Nukleinsäure erforderlich ist, führt jedoch zu einer zusätzlichen Fällung des Polysaccharids. Ein Beispiel eines weiteren Typs von Reinigung von Pneumokokkenpolysaccharid wird dargestellt durch die Reinigung, die oft für Typ 3 Pneumokokkus verwendet wird, welcher schwierig von Nukleinsäure abgetrennt werden kann. Falls Calciumacetat an Stelle von Natriumacetat als Elektrolyt in der Lösung von Typ 3 Pneumokokkenpolysaccharid verwendet wird, kann das Polysaccharid mit einer minimalen Menge an Alkohol (10 bis 12 %) gefällt werden. Diese Methode gestattet jedoch manchmal, daß wesentliche Mengen an Nukleinsäure in der überstehenden Phase gelöst bleiben. Das Verhalten der verschiedenen Pneumokokkenpolysaccharidtypen bei einer Reaktion des Polysaccharid-Nukleinsäuregemisches mit Ammoniumsulfat ist ebenfalls unterschiedlich. Einige Polysaccharide werden durch Ammoniumsulfatsalz bei 50 bis 60 % Sättigung gefällt, während andere nicht gefällt werden. Typ 1 Polysaccharid wird nicht mit Ammoniumsulfat gefällt, während Typ 3 und Typ 4 durch 50 % Sättigung mit Ammoniumsulfat zu einem gewissen Ausmaß von Nukleinsäuren getrennt werden. Aus der vorstehenden Darstellung und aus den folgenden Literaturstellen [Guy, R.C.W., How, J., Stacey, M., Heidelberger, M., J. Biol. Chem. 242: 21 (1967); Brown, R., J. Immunol. 37: 445 (1939); Glaudemans, C.P.J., Treffers, H.P., Carbohydrate Res. 4, (1967); Kabat, E.A., Exp. Immunochemistry, Charles C. Thomas, Herausgeber, Seiten 838 bis 842 (1967)] kann man erkennen, daß es keine einzelne zufriedenstellende Methode gibt, mit der die Verunreinigung von Pneumokokkenpolysaccharid entfernt werden, und die auf alle Typen anwendbar ist, insbesondere im Hinblick auf die Tatsache, daß es 85 oder mehr Typen von Pneumokokken gibt und die Herstellung eines praktisch brauchbaren Vakzins gewöhnlich ein multivalentes Vakzin erfordert, welches Polysaccharidfraktionen von vielen Spezies des Pneumokokkus umfaßt, von denen jeder einen relativ natürlichen Zustand der Konfiguration bewahrt hat.
  • Eine weitere Verunreinigung von Pneumokokkenpolysaccharid ist Protein. Wenn auch die Alkoholfällung wirksam ist bei der Verringerung des Pegels an Proteinverunreinigung, so ist sie doch nicht in der Lage, die Verunreinigung auf ein Niveau zu verringern, das für ein parenterales Produkt zufriedenstellend ist. Eine Methode, die gebräuchlicherweise angewandt wird, um den Pegel an Protein zu verringern, besteht darin, ein Gemisch von Pneumokokkenpolysacchariden und Protein mit organischen Lösungsmitteln zu behandeln. So ist beispielsweise das "Sevag" Verfahren bekannt [Sevag, M. G., Biochem. Z., 272: 419 (1934)]. Das Verfahren umfaßt die Extraktion von Chloroform- und Butanolgemischen, die heftig während 6 Stunden geschüttelt wurden und anschließend einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit unterworfen werden. Denaturiertes Protein, das an der Grenzfläche gesammelt wird, kann dann von der wässrigen Phase mit den Polysacchariden abgetrennt werden. Dieses Verfahren ist jedoch nicht zufriedenstellend, da die Extraktion oft die Pneumokokkenpolysaccharide nachteilig beeinflußt und ihren Zusammenbruch, ihre Depolymerisation oder den Verlust des natürlichen Konfigurationszustands verursacht. Das Ergebnis sind Polysaccharide, die als Immunogene nicht wirksam sind. Andere Verfahren können angewandt werden, um die Proteinverunreinigung zu reduzieren, beispielsweise Ammoniumsulfatfällung und Molekularsieben. Derartige Verfahren sind jedoch spezifisch für jede Gruppe von Proteinen und Peptiden unter den vielen verschiedenen Größen und Typen von Proteinen in der Lösung. Auch hier bestimmt die Variabilität der Polysakcharide, die abhängig ist von dem Stamm, die Wirksamkeit der angewandten speziellen Proteinabtrennungsstufen. Man kann schließlich den Schluß ziehen, daß es kein einziges Verfahren gibt, das wirksam ist bei der Reinigung sämtlicher Pneumokokken-Kapselpolysaccharide und es scheint unmöglich zu sein, eine Vorhersage hinsichtlich des Verhaltens eines speziellen Pneumokokken-Kapselpolysaccharids zu machen.
  • Es wurde jedoch jetzt eine Anzahl von Methoden entdeckt, mit denen Pneumokokken-Kapselpolysaccharide mit hoher Reinheit und Bewahrung der immunogenen Eigenschaften erhalten werden können. Diese Reinigungsverfahren sind speziell gerichtet auf die Reinigung von 10 Typen von Pneumokokkus. Diese Typen sind 3, 5, 9V, 10A, 11A, 15B, 17F, 19A, 22F und 33F (dänische Bezeichnung).
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein multivalentes Vakzin von einer Kombination von effektiven immunogenen Mengen der Pneumokokken-Kapselpolysaccharide aus der Gruppe, gemäß dänischer Bezeichnung, der Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F,8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 20, 22F, 23F und 33F, und von keinem bis zu einem oder beiden von 6A und 25, und im wesentlichen ohne "C"-Polysaccharid, eine Hauptverunreinigung der Typen 4, 7F und 14. Im Sinne der vorliegenden Beschreibung bedeutet im wesentlichen ohne "C"-Polysaccharid weniger als 0,5 % "C"-Polysaccharid. Im Mittelpunkt der Herstellung dieses multivalenten Vakzins steht das Verfahren zur Herstellung des gereinigten Kapsel- Polysaccharids von jedem der 10 Typen, die bei diesem Vakzin verwendet werden. Nachdem das Pneumokokkusbakterium mit beliebigen geeigneten Methoden der Fermentierung zu einer stationären Wachstumsphase aufgezogen wurde, wird die Fermentation gestoppt durch Zugabe von wirksamen Mengen an Natriumdesoxycholat, um alle Bakterienzellen zu lysieren und Zellassozierte Polysaccharide in das Medium freizusetzten. Cellulare Debris wird aus dem Medium entfernt, gefolgt von einer oder zwei Alkoholfällungen. Dieses Verfahren entfernt einen großen Anteil der Verunreinigungen, einschließlich Protein, aus den Pneumokokkenpolysacchariden.
  • Die sorgfältig kontrollierte Akoholfällung ist eine Hauptstufe des vorliegenden Verfahrens bei der Reinigung sämtlicher der Polysaccharide, wobei jedes Polysaccharid mindestens 5 mal durch Alkohol gefällt wird. Auf diese Weise wird die rauhere Chloroform-Butanol-Extraktion vermieden.
  • Es werden 2 Typen von Akoholfällung angewendet. Bei der ersten wird ausreichend Alkohol zu der Probe zugesetzt, um die Polysaccharide auszufällen. Das Pellet wird anschließend von dem Überstand durch Zentrifugieren getrennt und in destilliertem Wasser wieder aufgelöst.
  • Der zweite Typ ist eine fraktionierte Alkoholfällung. Die maximale Menge an Alkohol wird zugesetzt, bei der noch keine Ausfällung der Polysaccharide stattfindet. Das Pellet der Verunreinigungen wird anschließend durch Zentrifugieren entfernt. Zu dem Überstand wird dann ausreichend Alkohol zugesetzt, um die Polysaccharide auszufällen. Das Polysaccharid- Pellet wird dann durch Zentrifugieren geerntet und die Polysaccharide werden in destilliertem Wasser wieder aufgelöst.
  • Am Ende beider Fällungstypen ist jegliches Material, das in Wasser ungelöst ist, kein Polysaccharid und wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt.
  • Die Hexadecyltrimethylammoniumbromid(Cetavlon)-Behandlung schließt sich den mehreren Alkoholfällungen an und ist dann am wirksamsten, sie stellt eine Verbesserung gegenüber der Verwendung bei früheren Stufen des Reinigungsverfahrens dar.
  • Cetavlon ist bei den meisten der Pneumokokkentypen der vorliegenden Erfindung eine kritische Trennstufe. Bei diesen Typen dient diese Stufe unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen dazu, entweder das Polysaccharid bevorzugt gegenüber den Protein- und Nukleinsäureverunreinigungen auszufällen oder umgekehrt bevorzugt die Verunreinigungen auszufällen. Solche Polysaccharide, welche ausgefallen, können anschließend solubilisiert werden, und zwar in Natriumchlorid (gewöhnlich 0,25M), und zentrifugiert werden, um die verunreinigenden Makromoleküle zu entfernen, welche in dem Salz unlöslich sind. Wenn auch die Konzentration an Hexadecyltrimethylammoniumbromid und Salz für optimale Reinigung des Polysaccharids variieren kann, so hat sich das Verfahren doch als wirksam erwiesen für die Typen 3, 5, 11A, 15B, 17F und 22F, welche ausgewählt werden.
  • Vier Typen (9V, 19A, 23F und 33F) werden nicht durch Hexadecyltrimethylammoniumbromid ausgefällt. Im Falle dieser vier Typen wird das Hexadecyltrimethylammoniumbromid zugesetzt und das resultierende Verunreinigungspräzipitat das durch Zentrifugieren abgetrennt wurde, wird verworfen. Da Hexadecyltrimethylammoniumbromid in Alkohol löslich ist, sind anschließende Alkoholfällungen wirksam sowohl für die weitere Reinigung des Polysaccharids als auch bei der Entfernung des zurückbleibenden Hexadecyltrimethylammoniumbromids. Dieses allgemeine Schema ist das breite Verfahren, das mit Variationen auf eine Anzahl der Pneumokokkenpolysaccharidtypen anwendbar ist. Typ 10A ist eine Besonderheit dahingehend, daß er nicht durch die Verwendung von Cetavlon gereinigt wird.
  • Nach der Behandlung mit Alkohol, die in wirksamer Weise das Cetavlon entfernt, können verschiedene Stufen angewandt werden, um die bei den spezifischen Stämmen einzigartigen Verunreinigungen zu entfernen. Die Pneumokokkenpolysaccharide können anschließend dialysiert, lyophilisiert und als trokkenes Pulver bei -20 ºC oder darunter gelagert werden.
  • Ein Vakzin kann hergestellt werden, indem man die Polysakcharide in einen zweckentsprechenden Puffer, wie beispielsweise Phosphatpuffer, mit einem Gehalt eines Konservierungsmittels, auflöst und anschließend steril filtriert. Ein gemeinsames Reinigungsschema für ein Pneumokokkenpolysaccharid kann wie folgt zusammengefaßt werden: Kultur lysiert mit Desoxycholat zwei fraktionierte Alkoholfällungen Cetavlon-Behandlung drei Alkoholfällungen Aktivkohle Dialyse Gefriertrocknung
  • Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von hochgereinigtem, effektiv immunogenem, multivalentem Pneumokokkenpolysaccharidvakzin, bei dem im wesentlichen keine "C"-Polysaccharidverunreinigung vorliegt, für die Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F und von keinem bis zu einem oder beiden von 6A und 25 Pneumokokkus.
  • Es ist insbesondere Aufgabe der Erfindung, ein in hohem Maße immunogenes Pneumokokkenpolysaccharidvakzin zu schaffen, daß im wesentlichen keine "C"-Polysaccharidverunreinigung aufweist, für Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F, und von keinem bis einem oder beiden von 6A bis 25.
  • Weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Reinigung von immunologisch aktiven Kapselpolysacchariden der Pneumokokkustypen 3, 5, 9V, 10A, 11A, 15B, 17F, 19A, 22F und 33F.
  • Ein wirksames, multlvalentes Pneumokokkenvakzin ohne "C"-Polysaccharid kann hergestellt werden, indem man zu einer Lösung von 0,1 M Phosphatpuffer, enthaltend 0,01 % Thimerosal, ausreichend lyophilisiertes immunologisch aktives Pneumokokkenpolysaccharid gibt, um eine Endkonzentration von etwa 100 ug/ml/Typ zu erhalten. Dies ist eine allgemein wirksame Menge als die Extraktkonzentration eines Polysaccharids, um Immunität zu schaffen, variiert jedoch sowohl mit dem Pneumokokkentyp als auch mit dem zu immunisierenden Patienten.
  • Dieses Gemisch wird etwa 4 Stunden bei etwa 4 ºC gerührt und steril filtriert. Bei einer Ausführungsform werden 1,0 mg des jeweiligen lyophilisierten Pneumokokkenpolysaccharids der Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6A, SB, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 25 und 33F kombiniert mit 0,1 m Phosphatpuffer, enthaltend 0,01 % Thimerosal, auf ein Endvolumen von 10 ccm. Das ganze wird etwa 4 Stunden bei 4 ºC gerührt. Typen 4, 7F und 14 werden in einem Zustand zugesetzt, der im wesentlichen frei (weniger als 0,5 % "C"-Polysaccharid liegt vor) von "C"-Polysaccharid ist und eine effiziente Immunogenizität zeigt.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform wird das obige Verfahren angewandt, es werden jedoch nur 23 Pneumokokkentypen verwendet. Bei diesen Typen handelt es sich um die Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F. Kritisch für die obigen Präparationen eines effektiven multivalenten Vakzins, ist die Reinigung des jeweils genutzten Pneumokokkentyps ohne Verlust des natürlichen Konfigurationszustands und dem damit einhergehenden Verlust an effektiver Immunogenizität. Von den nachfolgenden Beispielen erläutern 10 die spezifischen Methoden, um reines immunologisch aktives Polysaccharid aus spezifischen Pneumokokkentypen zu erhalten. Diese Typen können genutzt werden, um spezifische immunogen Antwort bei warmblütigen Tieren hervorzurufen oder können in Kombinationen als multivalente Vakzine genutzt werden. Die beiden multivalenten Vakzine, die oben beschrieben wurden dienen lediglich als erläuternde Beispiele der vielen Kombinationen von multivalenten Vakzinen, welche hergestellt werden können unter Nutzung aller oder eines Teils der 25 gereinigten Pneumokokken-Kapselpolysacchariden der vorliegenden Erfindung.
  • Diese Beispiele sind in der folgenden Reihenfolge angeordnet: Beispiele Dänische Typen Amerikanische Typen
  • Pneumokokkentypen, die gemäß dänischer Bezeichnung Typen 1, 2, 4, 8, 12F, 25, 6A, 6B, 7F, 9N, 14, 19F, 20, 23F und 18C sind, können hergestellt werden wie in U.S. Patent Nr. 4 242 501 beschrieben, auf das hiermit Bezug genommen wird.
  • Beispiel 1 Typ-3 Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • 300 bis 500 l Medium werden verwendet, um Typ 3 Pneumokokkus unter Bedingungen aufzuziehen, die geeignet sind, um eine stationäre Wachstumsphase zu erreichen. Die Bakterien werden dann lysiert durch die Zugabe einer 10 %igen sterilen, filtrierten Lösung eines geeigneten Lysationsmittels, in diesem Falle Natriumdesoxycholat. Viele Verfahren zur Lysierung, beispielsweise mit anderen Detergentien, und mechanische Methoden, wie beispielsweise Zerstörung mit Schall und französischen Druckzellen können verwendet werden. In allen Fällen würden vollständig äquivalente Materialien für die Verfahren dieser Erfindung erhalten werden. Falls Natriumdesoxycholat verwendet wird, ist eine geeignete Lysierkonzentration etwa 0,1 bis 0,2 %. Alle Bakterienzellen werden lysiert, wobei das zellassoziierte Polysaccharid in das Medium freigesetzt wird. Das trübe Medium wird durch Zentrifugieren geklärt. Es wird hier eine Modell 16 Sharples-Zentrifuge mit 16 000 U/min und bei einer Fließrate von 36 bis 40 l/h unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von 2 bis 10 ºC verwendet. Die so gesammelten Zelltrümmer (debris) werden verworfen. Die das Polysaccharid tragende, überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt. In diesen Beispielen wird die pH-Einstellung im allgemeinen durch Zugabe von 0,8 M Essigsäure erreicht. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß die bei den Vorstufen angegebenen exakten pH Werte allgemein sind und lediglich den bevorzugten Bereich angeben. Bei allen Pneumokokkentypen ist eine große Variationsbreite bei den brauchbaren pH-Bereichen vorhanden. Lediglich die Präzipitationsstufen unter Verwendung von Cetavlon fordern eine in hohem Maße spezifische pH-Einstellung. In ähnlicher Weise ist Essigsäure lediglich ein Beispiel für eines der möglichen Säuerungsmittel. Essigsäure ist bevorzugt, da es die Verwendung von Natriumacetat mit der damit einhergehenden Pufferungsaktion ermöglicht. Für die Fachleute ist jedoch selbstverständlich, daß andere pH- Einstellsysteme mit anderen Säuren, Basen und Puffern leicht verwirklicht werden können. Auf die obige Weise wird ein roher Polysaccharidüberstand für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren hergestellt.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 3 (A) Erste Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %, bezogen auf Überstand und Alkohol. Der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt und in der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,15 Vol. bis 0,5 Vol. und vorzugsweise 0,25 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau mit 8 M Essigsäure. Das Polysaccharidpräzipitat bildet sich langsam und das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, etwa 16 bis 20 Stunden, und dann zentrifugiert. Da die Pneumokokkenpolysaccharide labil sind, werden sie bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Das Präzipitat sollte daher während der 16 bis 20 Stundenperiode gekühlt gehalten werden, in diesem Falle bei 4 ºC. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren aufgelöst in ausreichend 4 %iger Natriumacetatlösung, gewöhnlich etwa 100 l, wobei reduzierte Temperaturen von etwa 4 ºC bevorzugt sind. Eine kurze mechanische Agitation in einem Mischer (4 bis 6 Sek.) hilft bei dieser Auflösung. Falls Trübung erscheint, kann die Lösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und bei einer Fließrate von etwa 16 bis 18 l/h geklärt werden.
  • (B) Zweite Alkoholfällung
  • Diese wird wie die erste Alkoholfällung durchgeführt, indem man den oben gebildeten, polysaccharidhaltigen Überstand auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau. Das wird erreicht mit 8 M Essigsäure. Natriumacetat wird zugegeben bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wobei wie oben eine Genauigkeit von ± 0,1 bevorzugt ist. Alkohol wird mit etwa 0,25 bis 0,6 Vol. zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform mit 0,4 Vol. und der pH wird auf 7 eingestellt. Die Behandlung erfolgt wie bei der ersten Alkoholfällung beschrieben, unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Filtration oder Zentrifugieren. Das so entfernte Polysaccharidpräzipitat wird in 50 l Wasser wieder aufgelöst, und das Wasser wird durch Gefriertrocknung entfernt. Das trockene Pulver wird in 200 l Wasser wieder aufgelöst und zentrifugiert, um Trübung zu entfernen. Der überstand wird filtriert unter Verwendung einer Niagra-Filterpresse, die mit CPX 10C und CPX 70C Kissen beladen ist (AMF CUNO ) oder einem äquivalenten Mittel. Teilweise gereinigte Polysaccharidüberstandflüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau. Um das Polysaccharid vollständig auszufällen, wird Natriumacetat zugesetzt bis zu einer etwa 4 %igen Endkonzentration und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wie bei der ersten Alkoholfällung beschrieben und mit einer Genauigkeit von ± 0,1 bei der bevorzugten Ausführungsform. Alkohol wird mit 0,1 bis 0,5 Vol. addiert zu einer minimalen Endkonzentration von 0,5 Vol. bei der bevorzugten Ausfuhrungsform und der pH wird auf 7 eingestellt. Daran schließt sich an das Stehenlassen wie bei der ersten Alkoholfällung, Zentrifugieren und das Wiederauflösen in etwa 200 l kaltem Pyrogen-freien Wasser, und zwar bei etwa 4 ºC bei der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25º C) erwärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam bis zu einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 Vol. % zugesetzt, wobei die bevorzugte Konzentration 0,3 Vol. % beträgt. Nach dem Stehenlassen bis zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird die Mischung wieder auf 4 ºC abgekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC werden bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird Typ 3-Pneumokokkenpolysaccharid durch Cetavlon gemeinsam mit einigen Verunreinigungen gefällt. Das Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst und kalt gerührt, in diesem Fall bei etwa 4 ºC. Die trübe Suspension wird filtriert oder kalt zentrifugiert, in diesem Fall mit einer Fließrate von 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das Polysaccharid ist jetzt in Lösung während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen und verworfen werden können. Dieses Verfahren entfernt den größten Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen, die nach der Alkoholfällung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder gefällt, der Überstand wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird langsam bis etwa 4 % zugesetzt. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und etwa 0,50 Vol. Alkohol werden zugesetzt und der pH wird auf 7 eingestellt bei etwa 4 ºC 16 bis 20 Stunden. Das Polysaccharid wird zentrifugiert und in Pyrogen-freiem Wasser wieder aufgelöst, wobei etwa 40 l zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 mal wiederholt, um eine weitere Reinigung des Polysaccharids zu erreichen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden Konzentrationen an Cetavlon ausgedrückt als %-Werte, basierend auf einer 10 %igen Cetavlonlösung. Es sei darauf hingewiesen, daß eine Änderung der Konzentrationen der Cetavlonlösung eine entsprechende Änderung der zugesetzten Menge einer derartigen Lösung zur Folge hat, um eine äquivalente Konzentration zu erreichen.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die Polysaccharidlösung, die immer noch gekühlt ist, wird anschließend auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 3 bis 7 %ige Konzentration von Aktivkohle zu erhalten, wobei 5 % bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen bei etwa 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen. Eine weitere Klärung erfolgt mittels Passage durch eine Serie von Patronen und/oder Membranfiltern. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO ) Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0.22u Millipore-Membranen. Während dieses Verfahrens kann die optische Dichte bei 260 mu verwendet werden, als eine Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration und das Verfahren von Lowra et al. kann verwendet werden, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC erwärmt, bevor die Dialyse durchgeführt wird. Hierzu wird eine Modell DC 30 Amicon Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Filterpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Es wird sämtliches restliches Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird dann schnell gefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Falle von Typ 3, zurückbleibt. Dieses Pulver wird geerntet, und zwar unter niedrigen Feuchtigkeitsbedingungen in Flaschen, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Bei dem obigen Verfahren, werden mehr als 99 % von verunreinigendem Protein und Nukleinsäure entfernt, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • In der vorliegenden Beschreibung werden Konzentrationen an Aktivkohle ausgedrückt in Vol.%, basierend auf einer 20 %igen Aktivkohlesuspension. Es sei darauf hingewiesen, daß durch Veränderung der Konzentration einer derartigen Suspension sich entsprechend die Menge einer derartigen Suspension ändert, die erforderlich ist, um eine äquivalente Endkonzentration zu erreichen.
  • Beispiel 2 Typ-5 Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-5 Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 5 (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,8 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccharidreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. für Typ 5 wird Alkohol zugesetzt, mit mindestens etwa 0,9 Vol. bis etwa 1,4 Vol. Der pH wird auf 7 ein gestellt. Bei Typ 5 muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,25 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,80 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,5 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 0,9 bis 1,4 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,25 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlan langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 1,0 bis 5,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 2,00 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat ward durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 5 Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wiederaufgelöst und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkoholfraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,25 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei. etwa 40 l geeignet sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 2 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)- Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 5, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 90 % des verunreinigenden Proteins und 99 % der verunreinigenden Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 3 Typ-9V Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-9V Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 9V (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 vol. bis 0,8 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneu-mokokkenpolysaccharidreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließ-rate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. für Typ 9V wird Alkohol zugesetzt, mit mindestens etwa 1,25 Vol. bis etwa 2.25 Vol. und der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 9V muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,75 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrlfugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhniich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,15 bis 0,35 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,25 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt, vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,25 bis 2,25 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,75 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällun mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 0,05 bis 1,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 0,2 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 9V Pneumokokkenpolysaccharid nicht durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird verworfen. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Aus dem Überstand wird das Polysaccharid anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,75 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l geeignet sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 2 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu zur Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 9V, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % von verunreinigendem Proteins und Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 4 Typ-10A Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-10A Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 10A (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,8 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneu-mokokkenpolysaccharidreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließ-rate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 10A wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,0 Vol. bis etwa 1,5 Vol. und der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 10A muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,50 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und mit einer Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,8 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,5 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt, vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,0 bis 2,0 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,5 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,5 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 20 l geeignet sind.
  • (C) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 4 bis 8 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 6 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO( ) )-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 10A, zu rückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % der verunreinigenden Nukleinsäure und 90 % des verunreinigenden Proteins, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 5 Typ-11A Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-11A Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 11A (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,75 Vol. bis 1,25 Vol. und vorzugsweise 1,0 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 11A wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,5 Vol. bis etwa 2,25 Vol. Der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 11A muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 2,0 Vol übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, uberstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,75 bis 1,25 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 1,0 Vol.. Der pH ward auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,50 bis 2,25 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 2,00 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem, pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 1,5 bis 5,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 11A Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 2 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l geeignet sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 2 bis 5 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 3 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 11A, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 6 Typ- 15B Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-15B Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 15B (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,4 Vol. bis 1,0 Vol. und vorzugsweise 0,75 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 15B wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,5 Vol. bis etwa 2,25 Vol. Der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 15B muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,75 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentratlon von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol, von etwa 0,4 bis 1,0 Vol., wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,75 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,5 bis 2,25 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,75 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem, pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 15B Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer Fließrate von etwa 5 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 C. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise wird der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,75 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l geeignet sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und bei einer Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
  • (D) Diafiltration und Trocknung
  • Die Polysaccharidlösung wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 15B, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 98 % des verunreinigenden Proteins und 99 % der verunreinigenden Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 7 Typ-1 7F Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-17F Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 17F (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,75 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 17F wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,0 Vol. bis etwa 1,5 Vol. Der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 17F muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,25 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,75 Voi. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,5 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,0 bis 1,5 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,25 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem, pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 17F Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,25 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 3 bis 6 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 4 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 17F, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 8 Typ- 19A Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-19A Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 19A (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,5 Vol. bis 1,5 Vol. und vorzugsweise 0,75 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und z war bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 19A wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,5 Vol. bis etwa 2,0 Vol. Der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 19A muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,75 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysakcharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und bei einer Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0 1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,75 bis 1,25 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 1,0 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,5 bis 2,0 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,75 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem, pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Natriumchlorid wird unter Rühren bis 0,1 M zugesetzt und eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 0,05 bis 0,2 Vol.%, wobei die bevorugte Konzentration 0,075 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 19A Pneumokokkenpolysaccharid nicht durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird verworfen. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkoholfraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,75 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschliefßend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letze Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 5 bis 9 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 7 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungs form wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekularge wicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlo rid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, diesem Fall das von Typ 19A, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 9 Typ-22F Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-22F Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 22F (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,75 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 22F wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,25 Vol. bis etwa 1,75 Vol. Der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 22F muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,5 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und mit einer Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,75 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,50 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,25 bis 1,75 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,50 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem, pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 22F Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,5 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 3 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 22F, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
  • Beispiel 10 Typ-33F Pneumokokkus Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
  • Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-33F Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
  • Reinigung des Polysaccharids: Typ 33F (A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
  • Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7 und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,75 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
  • Der überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6 ºC eingestellt und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 % zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert. Für Typ 33F wird Alkohol zugesetzt mit mindestens etwa 1,25 Vol. bis etwa 1,75 Vol. Der pH wird auf 7 eingestellt. Bei Typ 33F muß die bevorzugte Endalkoholkonzentration etwa 1,50 Vol. übersteigen, um das gesamte Polysaccharid auszufällen.
  • Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und mit einer Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
  • (B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
  • Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,75 Vol. wird zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,50 Vol.. Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren, Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1 genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,25 bis 1,75 Vol. Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration von 1,50 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung, Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem, pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten Ausführungsform.
  • (C) Fraktionierte Fällung mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
  • Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
  • Natriumchlorid wird unter Rühren bis zu 0,15 M zugesetzt und eine 10 %ige Lösung von Cetavlon wird langsam zugesetzt bis zu einer Konzentration von 1,0 bis 5,0 Vol.%, wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ 33F Pneumokokkenpolysaccharid nicht durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird verworfen. Das Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkoholfraktionierung zurückgeblieben sind.
  • Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,5 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
  • (D) Aktivkohle-Reinigung
  • Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um eine 3 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten, wobei 4,5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um den Proteingehalt zu beobachten.
  • Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21 bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt. Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet, enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 33F, zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC sich als zweckmäßig erwiesen hat.
  • Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.

Claims (10)

  1. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokker- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 52, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33 und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 3-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) Fällung mit 0,15 und 0,5 Volumen Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 5,7 aufweist und eine flnale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und
    (b) Wiederauflösung des erhaltenen Präzipitats, und
    (c) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,25 bis 0,6 Vol. Alkohol, und
    (d) Wiederholung von Stufe (b), und
    (e) Wiederholung von Stufe (a) mit 0,1 bis 0,5 vol. Alkohol und
    (f) Wiederholung von Stufe (b), und
    (g) fraktionierte Fällung von Verunreinigungen aus dem Polysaccharid von (f) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bs 25 ºC und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethyiammoniumbromid-Konzentration von 0,1 bis 0,5 Vol.%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrmethylammoniumbromid-Lösung, und
    (h) Wiederausfällung des Polysaccarids bei einem pH von etwa 5,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 0,50 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser und
    (i) Wiederholung der Stufe (h) zwei Mal, und
    (j) Reinigung der Polysaccharidlösung von (i) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M, durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer konzentration von 3% bis 7%, bezogen auf eine 20%ige Aktivkohlesuspension und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (k) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (l) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  2. 2. Muitivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (Im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 2, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N,- 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 52, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiaen von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 5-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärtem Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,25 bis 0,8 Volumen Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 5-Polysaccharid mit von etwa 0,9 bis etwa 1,4 Vol . Alkohol bei einem pH von etwa 6,7 und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,25 bis 0,80 Vol. Alkohol, und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) und bei 0,9 bis 1 ,4 Vol. Alkohol und dann Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) fraktionierte Fällung des wiederaufgelösten Präzipitats von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bis 25 ºC und einem pH von 7,4+0,1 und einer Hexadecyltrlmethylammoniumbromid-Konzentratlon von 1,0 5,0 Vol.% und bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethylammoniumbromid Lösung, und
    (g) Entfernung des ausgefällten Polysaccharids und Wiederauflösung des Polysaccharids in etwa 0,25M Natriumchlorid unter Kühlung, und
    (h) Wiederausfällung des Polysaccarids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 1,25 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser und
    (i) Wiederholung der Stufe (h) zwei Mal, und
    (j) Reinigung der Polysaccaridlösung von (i) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 2% bis 7%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkohlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (k) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser und
    (l) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  3. 3. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (däniscne Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 152, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 9V-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,25 und 0,8 Vol. Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 5 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 9V-Polysaccharid mit von etwa 1,25 bis etwa 2,25 Vol. Alkohol bei einem pH von etwa 6,7 und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,15 bis 0,25 Vol. Alkohol, und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) und Wiederholung von Stufe (c) und
    (f) fraktionierte Fällung von Verunreinigungen aus dem Polysaccharid von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur vor 21 bis 25 ºC und 0,15M Natriumchlorid und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 0,05 bis 1 ,0 Vol .%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Wiederausfällung des Polysaccharids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 1,75 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (h) Wiederholung von Stufe (g) zwei Mal , und
    (i) Reinigung der Polysaccharidlösung von (h) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M, durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 2% bis 6%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkohlesuspension und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 20 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (j) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (k) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  4. 4. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 2, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 11A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 10A-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,25 und 0,8 Vol. Alkoho, wobei das Lysat einen pH von etwa 5,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 10A-Polysaccharid mit von etwa 1,0 bis etwa 1,5 Vol . Alkohol bei einem pH von etwa 6,7, und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,25 bis 0,8 Vol . Alkohol , und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) bei etwa 1,0 bis 2,0 Vol. Alkohol und Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) Wiederholung von Stufe (e), und
    (g) Reinigung der Polysaccharidlösung von (f) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M, durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 2% bis 6%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkohlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (h) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (i) Einfrieren und Gefriertrocknung des resulterenden Produkts.
  5. 5. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 11A-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,75 bis 1,25 Vol . Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 11A-Polysaccharid mit von etwa 1,50 bis etwa 2,25 Vol. Alkohol bei einem pH von etwa 6,7, und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,75 bis 1,25 Vol . Alkohol und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) bei etwa 1,50 bis 2,25 Vol. Alkohol und dann Wiederholung von Stufe (c) und
    (f) fraktionierte Fällung des wiederaufgelösten Präzipitats von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 Bis 25 ºC und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 1,5 bis 5,0 Vol.%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Entfernung des ausgefällten Polysaccharids und Wiederauflösung des Polysaccharids in etwa 0,25M Natriumchlorid unter Kühlung, und
    (h) Wiederausfällung des Polysaccarids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 2,0 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (i) Wiederholung der Stufe (h) zwei Mal, und
    (j) Reinigung der Polysaccaridlösung von (i) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 2% bis 5%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkohlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle und
    (k) Diafiltrieren der Lösung gegen destillertes Wasser und
    (l) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  6. 6. Multlvalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapseipolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 15B-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,4 bis 1,0 Vol. Alkohol, wobei das Lysat einen PH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 15B-Polysaccharid mit von etwa 1,50 bis etwa 2,25 Vol . Alkohol , und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,4 bis 1,0 Vol. Alkohol und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) und dann Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) fraktionierte Fällung des wiederaufgelösten Präzipitats von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bis 25 ºC und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadeoyltrimethylammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Entfernung des ausgefällten Polysaccharids und Wiederauflösung des Polysaccharids in etwa 0,25M Natriumchlorid unter Kühlung, und
    (h) Wiederausfällung des Polysaccarids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 1,75 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (i) Wiederholung der Stufe (h) zwei Mal, und
    (j) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (k) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  7. 7. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunoiogisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 17F-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,25 und 0,75 Vol. Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 17F-Polysaccharid mit von etwa 1,0 bis etwa 1 ,5 Vol . Alkohol bei einem pH von etwa 6,7, und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,25 bis 0,75 Vol. Alkohol, und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) bei etwa 1,0 bis 1,5 Vol. Alkohol und Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) fraktlonlerte Fällung des wiederaufgelösten Präzipitats von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bis 25 ºC und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Entfernung des ausgefällten Polysaccharids und Wiederauflösung des Polysaccharids in etwa 0,25M Natriumchlorid unter Kühlung, und
    (h) Wiederausfällung des Polysaccarids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 1,25 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (i) Wiederholung der Stufe (h) zwei Mal, und
    (j) Reinigung der Polysaccaridlösung von (i) mit Aktivkohle bei einem PH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 3,0% bis 6,0%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkonlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (k) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (i)Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  8. 8. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 19A-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,5 bis 1,0 Vol. Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 19A-Polysaccharin mit von etwa 1,5 bis etwa 2,0 Vol. Alkohol bei einem pH von etwa 6,7, und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,75 bis 1,25 Vol . Alkohol , und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) und Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) fraktionierte Fällung von Verunreinigungen aus dem Polysaccharid von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bis 25 ºC und 0,15M Natriumchlorid und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 0,05 bis 0,2 Vol.%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Wieaerausfällung des Polysaccharids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 1,75 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (h) Wiederholung der Stufe (g) zwei Mal, und
    (i) Reinigung der Polysaccaridlösung von (h) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 5% bis 9%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkohlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (j) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (k) Zugabe von 0,01 bis 25% Glycin zu dem Filtrat, und
    (i) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  9. 9. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 2, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden vor 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 22F-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentatonslysat mit dem folgender Verfahren:
    (a) fraktionerte Fällung mit 0,25 bis 0,75 Vol. Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6 ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 22F-Polysaccharid mit von etwa 1,25 bis etwa 1,7 Vol . Alkohol bei einem pH von etwa 6,7, und
    c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,25 bis 0,75 Vol . Alkohol, und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) bei etwa 1,25 bis 1,75 Vol . Alkohol und Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) fraktionierte Fällung des wiederaufgelösten Präzipitats von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bis 25 ºC und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol .%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethyl-ammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Entfernung des ausgefällten Polysaccharids und Wiederauflösung des Polysaccharids in etwa 0,25M Natriumchlorid unter Kühlung und
    (h) Wiederausfällung des Polysaccharids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Natriumacetat und etwa 1,5 Vol . Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (i) Wiederholung oer Stufe (h) zwei Mal, und
    (j) Reinigung der Polysaccaridlösung von (i) mit Aktivkohle bei einem pH von 6,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M duron Zugabe von Aktivkohle in Suspension bes zu einer Korzentration von 3% bis 7%, bezogen au eine 20%-ige Aktivkohlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (k) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
    (l) Einfrieren und Gefriertrocknung des resultierenden Produkts.
  10. 10. Multivalentes Pneumokokkenvakzin, umfassend wirksame Mengen von immunologisch aktivem, gereinigtem Pneumokokken- Kapselpolysaccharid (im wesentlichen abwesendes "C" Polysaccharid) von Pneumokokkentypen (dänische Bezeichnung), bestehend aus 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F und aus keinem bis einem oder beiden von 6A und 25, wobei effektiv immunogenes Typ 33F-Pneumokokkenpolysaccharid gereinigt wird aus einem geklärten Fermentationslysat mit dem folgenden Verfahren:
    (a) fraktionierte Fällung mit 0,25 bis 0,75 Vol. Alkohol, wobei das Lysat einen pH von etwa 6,7 aufweist und eine finale Natriumacetatkonzentration von etwa 4% hat und eine Temperatur von 2 bis 6ºC aufweist, und Entfernung der so ausgefällten Verunreinigungen, und
    (b) Ausfällung von Typ 33F-Polysaccharid mit von etwa 1,25 bis etwa 1,75 Vol. Alkohol bei einem pH von etwa 6,7, und
    (c) Sammeln und Wiederauflösen des erhaltenen Präzipitats, und
    (d) Wiederholung von Stufe (a) bei etwa 0,25 bis 0,75 Vol. Alkohol, und
    (e) Wiederholung von Stufe (b) und Wiederholung von Stufe (c), und
    (f) fraktionierte Fällung von Verunreinigungen aus dem Polysaccharid von (e) mit Hexadecyltrimethylammoniumbromid bei einer Temperatur von 21 bis 25ºC und 0,15M Natriumchlorid und einem pH von 7,4±0,1 und einer Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Konzentration von 1,0 bis 5,0 Vol.%, bezogen auf eine 10%-ige Hexadecyltrimethylammoniumbromid-Lösung, und
    (g) Wiederausfäilung des Polysaccharids bei einem pH von etwa 6,7 mit etwa 4% Nariumacetat und etwa 1,5 Vol. Alkohol und Wiederauflösung in Pyrogen-freiem Wasser, und
    (h) Wiederholung der Stufe (g) zwei Mal, und
    (i) Reinigung der Polysaccaridlösung von (h) mit Aktivkohle bei einem pH von 5,1 und einer Natriumchloridkonzentration von 0,15M durch Zugabe von Aktivkohle in Suspension bis zu einer Konzentration von 3% bis 7%, bezogen auf eine 20%-ige Aktivkohlesuspension, und Stehenlassen der Lösung in der Kälte während etwa 30 Minuten und Abfiltrieren der Aktivkohle, und
    (j) Diafiltrieren der Lösung gegen destilliertes Wasser, und
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Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877613A (en) * 1987-08-05 1989-10-31 Biotech Connections, Inc. Process for preparing veterinary acellular vaccines against gram-negative nonenteric pathogenic bacilli
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) * 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
US5314811A (en) * 1992-07-13 1994-05-24 Merck & Co., Inc. Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide
US5371197A (en) * 1991-09-24 1994-12-06 Merck & Co., Inc. Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine
US5314822A (en) * 1992-10-15 1994-05-24 Merck & Co., Inc. Method of clonal growth of Streptococcus pneumoniae
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5714354A (en) * 1995-06-06 1998-02-03 American Home Products Corporation Alcohol-free pneumococcal polysaccharide purification process
US6410025B1 (en) 1996-02-14 2002-06-25 Merck & Co., Inc. Polysaccharide precipitation process
PT897427E (pt) * 1996-02-14 2005-01-31 Merck & Co Inc Processo de precipitacao de polissacarideos
US6224880B1 (en) 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US6737524B2 (en) 2002-03-25 2004-05-18 Paul K. Smith Activated polyethylene glycol compounds
US7144989B2 (en) 2002-03-25 2006-12-05 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Pegylated non-hypertensive hemoglobins, methods of preparing same, and uses thereof
DK1625135T3 (da) * 2003-02-27 2009-06-22 Glaxo Group Ltd Fondaparinux-natrium af höj renhed
US7320874B2 (en) * 2003-07-08 2008-01-22 Aventis Pasteur Sa Assaying the teichoic acids of gram+ bacteria
ATE537813T1 (de) * 2005-09-30 2012-01-15 Lipoxen Technologies Ltd Liposomale impfstoff-zusammensetzung aus einem polysaccharid-antigen und einem protein-adjuvans
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
HUE039169T2 (hu) 2007-03-23 2018-12-28 Wyeth Llc Rövidített tisztítási eljárás Streptococcus pneumoniae tok-poliszacharidok elõállítására
WO2009023300A2 (en) 2007-04-13 2009-02-19 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Mutants of cholesterol-dependent cytolysins and uses thereof
AU2009335824B2 (en) * 2008-12-18 2013-07-04 Wyeth Llc Method for controlling Streptococcus pneumoniae polysaccharide molecular weight using carbon
KR20110091546A (ko) * 2008-12-18 2011-08-11 와이어쓰 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19a 폴리사카라이드 분자량을 조절하는 방법
CA2900008A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 Children's Medical Center Corporation Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease
PL3096785T3 (pl) * 2014-01-21 2021-03-08 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne zawierające skoniugowane antygeny sacharydów otoczkowych i ich zastosowania
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PL3583947T3 (pl) * 2014-01-21 2024-04-02 Pfizer Inc. Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty
CA2968398A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Pneumolysin mutants and methods of use thereof
MY192183A (en) * 2015-07-21 2022-08-05 Pfizer Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
JP7164200B2 (ja) 2016-03-31 2022-11-01 ポゴナ, エルエルシー サッカライド-ポリペプチドコンジュゲートの組成物およびその使用の方法
US11246918B2 (en) 2017-02-03 2022-02-15 Eva Barbara Schadeck Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
BR112019022868A2 (pt) 2017-05-05 2020-05-19 Serum Institute Of India Private Limited método para remoção de impurezas de preparações à base de polissacarídeo capsular bacteriano
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
BR112019026192B1 (pt) 2017-06-10 2022-05-10 Inventprise, Llc Vacinas de conjugado multivalente com polissacarídeos de conjugado bivalente ou multivalente que fornecem imunogenicidade e avidez melhoradas
CN116693706A (zh) * 2022-02-24 2023-09-05 成都生物制品研究所有限责任公司 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1115210A (en) * 1977-11-28 1981-12-29 Dennis J. Carlo Pneumococcal vaccine
US4242501A (en) * 1979-08-08 1980-12-30 American Cyanamid Company Purification of pneumococcal capsular polysaccharides
BE889979A (fr) * 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
ATA109085A (de) 1994-11-15
JPH0641422B2 (ja) 1994-06-01
DE3485778D1 (de) 1992-07-23
AU569946B2 (en) 1988-02-25
CA1216235A (en) 1987-01-06
ZA852724B (en) 1985-11-27
AU4101685A (en) 1985-10-17
EP0157899B1 (de) 1992-06-17
ES8602417A1 (es) 1985-12-16
AT399655B (de) 1995-06-26
JPS60218325A (ja) 1985-11-01
EP0157899A3 (en) 1987-09-09
US4686102A (en) 1987-08-11
EP0157899A2 (de) 1985-10-16
ES533263A0 (es) 1985-12-16

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