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Die Erfindung betrifft ein multivalentes Pneumokokkenvakzin,
bestehend aus gereinigtem Pneumokokken-Kapselpolysaccharid,
bei dem das "C"-Polysaccharid im wesentlichen fehlt. Diese
Erfindung betrifft auch die spezifische Reinigung von jedem
der 10 Pneumokokkentypen, die nach der dänischen Bezeichnung
die Typen 2, 5, 9V, 10A, 11A, 15B, 17F, 19A, 22F und 33F
sind, um die erfindungsgemäßen, immunogenen Polysaccharide
zu erhalten. Andere Pneumokokkentypen, die in dem
multivalenten Pneumokokkenvakzin gefunden werden, die nach
dänischer Bezeichnung die Typen 1, 2, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 12F,
14 18C, 19F, 20, 23F und 25 sind, können gemäß US-A-
4,242,501 gereinigt werden.
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Pneumokokken-Kulturen von jedem der bei der vorliegenden
Erfindung brauchbaren Typen sind gelagert und weltweit von
einer großen Zahl von Kultur-Hinterlegungsstellen erhältlich.
Die American Type Culture Collection (ATCC) führt alle der
erfindungsgemäßen Pneumokokkentypen als frei verfügbar.
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Im ATCC-Katalog von 1978 sind diese Typen wie folgt
bezeichnet: (siehe Tabelle I)
Tabelle I
Dänische Nomenklatur
U.S. Nomenklatur
Katalognummer
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Der kritische Schritt bei der Herstellung eines Vakzins ist
die Reinigung des immunogenen Materials in der Weise, daß
äußeres Material entfernt wird ohne das die Eigenschaften
des zurückbleibenden Materials verlieren gehen, welche die
zweckentsprechende Antikörperproduktion verursachen.
Derartige Eigenschaften des Polysaccharids scheinen in der
Bewahrung dessen zu liegen, was man mit "natürlicher Zustand der
Konfiguration" der Polysaccharide bezeichnet.
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Unter den Materialien, die von den Polysacchariden
abgetrennt werden sollen, sind Proteine, Nukleinsäuren und "C"-
Polysaccharid. "C"-Polysaccharid findet sich in hohen
Konzentrationen bei den Pneumokokkentypen (dänische
Bezeichnung) 4, 7F und 14 und kann daher daraus wie in U.S.-A-
4,242,501 gezeigt, abgetrennt werden.
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Nukleinsäuren, (welche Licht bei 260 MU absorbieren) sind
bei der Herstellung von Pneumokokkenpolysacchariden
schwierig auf ein zufriedenstellendes Niveau zu reduzieren. Dieses
Problem steht im Gegensatz zu der Situation, die bei
Meningokokken-Polysacchariden vorliegt, die leichter gereinigt
werden können unter Bewahrung von Immunogenizität.
Meningokokken-Polysaccharide können mittels relativ drastischer
Methoden gereinigt werden, wie sie in U.S.-A-3 636 192
(Gotschlich) beschrieben sind. Es gibt 85 spezifische Typen von
Pneumokokkus. Diese Typen werden sowohl nach dem
amerikanischen als auch dem dänischen Bezifferungssystem bezeichnet.
Die hier angegebenen Typenbezeichnungen sind die der
dänischen Bezifferung. Jeder Typ scheint eine spezielle Methode
zur Entfernung von Verunreinigungen zur erfordern und keine
einzige Methode ist auf alle Typen der
Pneumokokkenpolysaccharide anwendbar. Ferner scheint die spezielle
zweckentsprechende Methode nicht voraussagbar zu sein.
Beispielsweise erfordern einige der verschiedenen Verfahren, die zur
Reinigung verschiedener Pneumokokkenpolysaccharide verwendet
wurden, große Mengen an Ethanol für die Fällung. Auf diese
Weise kann eine teilweise Trennung von Nukleinsäuren durch
fraktionierte Fällung erreicht werden, da die Nukleinsäuren
im niedrigen Alkoholbereich unter Verwendung von 3A-Alkohol
gefällt werden. 3A-Alkohol ist 5 % absolutes Methanol und 95
% absolutes Ethanol. Absolutes Ethanol würde sich im
wesentlichen in identischer Weise verhalten und wird als
vollständig äquivalent angesehen. In der vorliegenden Beschreibung
wird mit dem Ausdruck "Alkohol" 3A-Alkohol bezeichnet, falls
nichts anderes angegeben ist.
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Bei anderen Typen werden Polysaccharide in dem 30-50 %
Bereich gefällt. Alkohol ist somit als Trennungsfällmittel
nicht wirksam. Andererseits können andere Typen von
Nukleinsäuren abgetrennt werden durch sorgfältig gesteuerte Mengen
an Protaminsulfat. Bei diesen Typen werden bei einer
optimalen Konzentration von Protaminsulfat (0,02 bis 0,20 %)
Nukleinsäuren gefällt und können durch
Hochgeschwindigkeitszentrifugieren pelletisiert werden. Jeglicher Überschuß an
Protaminsulfat im System über die minimale Menge, die zur
Fällung des Bestandteils Nukleinsäure erforderlich ist,
führt jedoch zu einer zusätzlichen Fällung des
Polysaccharids. Ein Beispiel eines weiteren Typs von Reinigung von
Pneumokokkenpolysaccharid wird dargestellt durch die
Reinigung, die oft für Typ 3 Pneumokokkus verwendet wird, welcher
schwierig von Nukleinsäure abgetrennt werden kann. Falls
Calciumacetat an Stelle von Natriumacetat als Elektrolyt in
der Lösung von Typ 3 Pneumokokkenpolysaccharid verwendet
wird, kann das Polysaccharid mit einer minimalen Menge an
Alkohol (10 bis 12 %) gefällt werden. Diese Methode
gestattet jedoch manchmal, daß wesentliche Mengen an Nukleinsäure
in der überstehenden Phase gelöst bleiben. Das Verhalten der
verschiedenen Pneumokokkenpolysaccharidtypen bei einer
Reaktion des Polysaccharid-Nukleinsäuregemisches mit
Ammoniumsulfat ist ebenfalls unterschiedlich. Einige Polysaccharide
werden durch Ammoniumsulfatsalz bei 50 bis 60 % Sättigung
gefällt, während andere nicht gefällt werden. Typ 1
Polysaccharid
wird nicht mit Ammoniumsulfat gefällt, während Typ
3 und Typ 4 durch 50 % Sättigung mit Ammoniumsulfat zu einem
gewissen Ausmaß von Nukleinsäuren getrennt werden. Aus der
vorstehenden Darstellung und aus den folgenden
Literaturstellen [Guy, R.C.W., How, J., Stacey, M., Heidelberger, M., J.
Biol. Chem. 242: 21 (1967); Brown, R., J. Immunol. 37: 445
(1939); Glaudemans, C.P.J., Treffers, H.P., Carbohydrate
Res. 4, (1967); Kabat, E.A., Exp. Immunochemistry, Charles
C. Thomas, Herausgeber, Seiten 838 bis 842 (1967)] kann man
erkennen, daß es keine einzelne zufriedenstellende Methode
gibt, mit der die Verunreinigung von
Pneumokokkenpolysaccharid entfernt werden, und die auf alle Typen anwendbar ist,
insbesondere im Hinblick auf die Tatsache, daß es 85 oder
mehr Typen von Pneumokokken gibt und die Herstellung eines
praktisch brauchbaren Vakzins gewöhnlich ein multivalentes
Vakzin erfordert, welches Polysaccharidfraktionen von vielen
Spezies des Pneumokokkus umfaßt, von denen jeder einen
relativ natürlichen Zustand der Konfiguration bewahrt hat.
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Eine weitere Verunreinigung von Pneumokokkenpolysaccharid
ist Protein. Wenn auch die Alkoholfällung wirksam ist bei
der Verringerung des Pegels an Proteinverunreinigung, so ist
sie doch nicht in der Lage, die Verunreinigung auf ein
Niveau zu verringern, das für ein parenterales Produkt
zufriedenstellend ist. Eine Methode, die gebräuchlicherweise
angewandt wird, um den Pegel an Protein zu verringern, besteht
darin, ein Gemisch von Pneumokokkenpolysacchariden und
Protein mit organischen Lösungsmitteln zu behandeln. So ist
beispielsweise das "Sevag" Verfahren bekannt [Sevag, M. G.,
Biochem. Z., 272: 419 (1934)]. Das Verfahren umfaßt die
Extraktion von Chloroform- und Butanolgemischen, die heftig
während 6 Stunden geschüttelt wurden und anschließend einer
Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit unterworfen
werden. Denaturiertes Protein, das an der Grenzfläche
gesammelt wird, kann dann von der wässrigen Phase mit den
Polysacchariden abgetrennt werden. Dieses Verfahren ist jedoch
nicht zufriedenstellend, da die Extraktion oft die
Pneumokokkenpolysaccharide nachteilig beeinflußt und ihren
Zusammenbruch, ihre Depolymerisation oder den Verlust des
natürlichen Konfigurationszustands verursacht. Das Ergebnis sind
Polysaccharide, die als Immunogene nicht wirksam sind.
Andere Verfahren können angewandt werden, um die
Proteinverunreinigung zu reduzieren, beispielsweise
Ammoniumsulfatfällung und Molekularsieben. Derartige Verfahren sind jedoch
spezifisch für jede Gruppe von Proteinen und Peptiden unter
den vielen verschiedenen Größen und Typen von Proteinen in
der Lösung. Auch hier bestimmt die Variabilität der
Polysakcharide, die abhängig ist von dem Stamm, die Wirksamkeit der
angewandten speziellen Proteinabtrennungsstufen. Man kann
schließlich den Schluß ziehen, daß es kein einziges
Verfahren gibt, das wirksam ist bei der Reinigung sämtlicher
Pneumokokken-Kapselpolysaccharide und es scheint unmöglich zu
sein, eine Vorhersage hinsichtlich des Verhaltens eines
speziellen Pneumokokken-Kapselpolysaccharids zu machen.
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Es wurde jedoch jetzt eine Anzahl von Methoden entdeckt, mit
denen Pneumokokken-Kapselpolysaccharide mit hoher Reinheit
und Bewahrung der immunogenen Eigenschaften erhalten werden
können. Diese Reinigungsverfahren sind speziell gerichtet
auf die Reinigung von 10 Typen von Pneumokokkus. Diese Typen
sind 3, 5, 9V, 10A, 11A, 15B, 17F, 19A, 22F und 33F
(dänische Bezeichnung).
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein multivalentes
Vakzin von einer Kombination von effektiven immunogenen
Mengen der Pneumokokken-Kapselpolysaccharide aus der Gruppe,
gemäß dänischer Bezeichnung, der Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B,
7F,8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 20,
22F, 23F und 33F, und von keinem bis zu einem oder beiden
von 6A und 25, und im wesentlichen ohne "C"-Polysaccharid,
eine Hauptverunreinigung der Typen 4, 7F und 14. Im Sinne
der vorliegenden Beschreibung bedeutet im wesentlichen ohne
"C"-Polysaccharid weniger als 0,5 % "C"-Polysaccharid. Im
Mittelpunkt der Herstellung dieses multivalenten Vakzins
steht das Verfahren zur Herstellung des gereinigten Kapsel-
Polysaccharids von jedem der 10 Typen, die bei diesem Vakzin
verwendet werden. Nachdem das Pneumokokkusbakterium mit
beliebigen geeigneten Methoden der Fermentierung zu einer
stationären Wachstumsphase aufgezogen wurde, wird die
Fermentation gestoppt durch Zugabe von wirksamen Mengen an
Natriumdesoxycholat, um alle Bakterienzellen zu lysieren und
Zellassozierte Polysaccharide in das Medium freizusetzten.
Cellulare Debris wird aus dem Medium entfernt, gefolgt von
einer oder zwei Alkoholfällungen. Dieses Verfahren entfernt
einen großen Anteil der Verunreinigungen, einschließlich
Protein, aus den Pneumokokkenpolysacchariden.
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Die sorgfältig kontrollierte Akoholfällung ist eine
Hauptstufe des vorliegenden Verfahrens bei der Reinigung
sämtlicher der Polysaccharide, wobei jedes Polysaccharid
mindestens 5 mal durch Alkohol gefällt wird. Auf diese Weise wird
die rauhere Chloroform-Butanol-Extraktion vermieden.
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Es werden 2 Typen von Akoholfällung angewendet. Bei der
ersten wird ausreichend Alkohol zu der Probe zugesetzt, um die
Polysaccharide auszufällen. Das Pellet wird anschließend von
dem Überstand durch Zentrifugieren getrennt und in
destilliertem Wasser wieder aufgelöst.
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Der zweite Typ ist eine fraktionierte Alkoholfällung. Die
maximale Menge an Alkohol wird zugesetzt, bei der noch keine
Ausfällung der Polysaccharide stattfindet. Das Pellet der
Verunreinigungen wird anschließend durch Zentrifugieren
entfernt. Zu dem Überstand wird dann ausreichend Alkohol
zugesetzt, um die Polysaccharide auszufällen. Das Polysaccharid-
Pellet wird dann durch Zentrifugieren geerntet und die
Polysaccharide werden in destilliertem Wasser wieder aufgelöst.
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Am Ende beider Fällungstypen ist jegliches Material, das in
Wasser ungelöst ist, kein Polysaccharid und wird durch
Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt.
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Die Hexadecyltrimethylammoniumbromid(Cetavlon)-Behandlung
schließt sich den mehreren Alkoholfällungen an und ist dann
am wirksamsten, sie stellt eine Verbesserung gegenüber der
Verwendung bei früheren Stufen des Reinigungsverfahrens dar.
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Cetavlon ist bei den meisten der Pneumokokkentypen der
vorliegenden Erfindung eine kritische Trennstufe. Bei diesen
Typen dient diese Stufe unter sorgfältig kontrollierten
Bedingungen dazu, entweder das Polysaccharid bevorzugt
gegenüber den Protein- und Nukleinsäureverunreinigungen
auszufällen oder umgekehrt bevorzugt die Verunreinigungen
auszufällen. Solche Polysaccharide, welche ausgefallen, können
anschließend solubilisiert werden, und zwar in Natriumchlorid
(gewöhnlich 0,25M), und zentrifugiert werden, um die
verunreinigenden Makromoleküle zu entfernen, welche in dem Salz
unlöslich sind. Wenn auch die Konzentration an
Hexadecyltrimethylammoniumbromid und Salz für optimale Reinigung des
Polysaccharids variieren kann, so hat sich das Verfahren doch
als wirksam erwiesen für die Typen 3, 5, 11A, 15B, 17F und
22F, welche ausgewählt werden.
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Vier Typen (9V, 19A, 23F und 33F) werden nicht durch
Hexadecyltrimethylammoniumbromid ausgefällt. Im Falle dieser vier
Typen wird das Hexadecyltrimethylammoniumbromid zugesetzt
und das resultierende Verunreinigungspräzipitat das durch
Zentrifugieren abgetrennt wurde, wird verworfen. Da
Hexadecyltrimethylammoniumbromid in Alkohol löslich ist, sind
anschließende Alkoholfällungen wirksam sowohl für die weitere
Reinigung des Polysaccharids als auch bei der Entfernung des
zurückbleibenden Hexadecyltrimethylammoniumbromids. Dieses
allgemeine Schema ist das breite Verfahren, das mit
Variationen auf eine Anzahl der Pneumokokkenpolysaccharidtypen
anwendbar ist. Typ 10A ist eine Besonderheit dahingehend,
daß er nicht durch die Verwendung von Cetavlon gereinigt
wird.
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Nach der Behandlung mit Alkohol, die in wirksamer Weise das
Cetavlon entfernt, können verschiedene Stufen angewandt
werden, um die bei den spezifischen Stämmen einzigartigen
Verunreinigungen zu entfernen. Die Pneumokokkenpolysaccharide
können anschließend dialysiert, lyophilisiert und als
trokkenes Pulver bei -20 ºC oder darunter gelagert werden.
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Ein Vakzin kann hergestellt werden, indem man die
Polysakcharide in einen zweckentsprechenden Puffer, wie
beispielsweise Phosphatpuffer, mit einem Gehalt eines
Konservierungsmittels, auflöst und anschließend steril filtriert. Ein
gemeinsames Reinigungsschema für ein Pneumokokkenpolysaccharid
kann wie folgt zusammengefaßt werden:
Kultur lysiert mit Desoxycholat
zwei fraktionierte Alkoholfällungen
Cetavlon-Behandlung
drei Alkoholfällungen
Aktivkohle
Dialyse
Gefriertrocknung
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Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von hochgereinigtem,
effektiv immunogenem, multivalentem
Pneumokokkenpolysaccharidvakzin, bei dem im wesentlichen keine
"C"-Polysaccharidverunreinigung vorliegt, für die Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B,
7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F,
20, 22F, 23F und 33F und von keinem bis zu einem oder beiden
von 6A und 25 Pneumokokkus.
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Es ist insbesondere Aufgabe der Erfindung, ein in hohem Maße
immunogenes Pneumokokkenpolysaccharidvakzin zu schaffen, daß
im wesentlichen keine "C"-Polysaccharidverunreinigung
aufweist, für Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A,
12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F, und
von keinem bis einem oder beiden von 6A bis 25.
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Weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines
Verfahrens zur Reinigung von immunologisch aktiven
Kapselpolysacchariden der Pneumokokkustypen 3, 5, 9V, 10A, 11A, 15B,
17F, 19A, 22F und 33F.
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Ein wirksames, multlvalentes Pneumokokkenvakzin ohne
"C"-Polysaccharid kann hergestellt werden, indem man zu einer
Lösung von 0,1 M Phosphatpuffer, enthaltend 0,01 % Thimerosal,
ausreichend lyophilisiertes immunologisch aktives
Pneumokokkenpolysaccharid gibt, um eine Endkonzentration von etwa 100
ug/ml/Typ zu erhalten. Dies ist eine allgemein wirksame
Menge als die Extraktkonzentration eines Polysaccharids, um
Immunität zu schaffen, variiert jedoch sowohl mit dem
Pneumokokkentyp als auch mit dem zu immunisierenden Patienten.
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Dieses Gemisch wird etwa 4 Stunden bei etwa 4 ºC gerührt und
steril filtriert. Bei einer Ausführungsform werden 1,0 mg
des jeweiligen lyophilisierten Pneumokokkenpolysaccharids
der Typen 1, 2, 3, 4, 5, 6A, SB, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A,
12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 25 und 33F
kombiniert mit 0,1 m Phosphatpuffer, enthaltend 0,01 %
Thimerosal, auf ein Endvolumen von 10 ccm. Das ganze wird
etwa 4 Stunden bei 4 ºC gerührt. Typen 4, 7F und 14 werden
in einem Zustand zugesetzt, der im wesentlichen frei
(weniger als 0,5 % "C"-Polysaccharid liegt vor) von
"C"-Polysaccharid
ist und eine effiziente Immunogenizität zeigt.
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Bei der bevorzugten Ausführungsform wird das obige Verfahren
angewandt, es werden jedoch nur 23 Pneumokokkentypen
verwendet. Bei diesen Typen handelt es sich um die Typen 1, 2, 3,
4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C,
19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F. Kritisch für die obigen
Präparationen eines effektiven multivalenten Vakzins, ist die
Reinigung des jeweils genutzten Pneumokokkentyps ohne
Verlust des natürlichen Konfigurationszustands und dem damit
einhergehenden Verlust an effektiver Immunogenizität. Von
den nachfolgenden Beispielen erläutern 10 die spezifischen
Methoden, um reines immunologisch aktives Polysaccharid aus
spezifischen Pneumokokkentypen zu erhalten. Diese Typen
können genutzt werden, um spezifische immunogen Antwort bei
warmblütigen Tieren hervorzurufen oder können in
Kombinationen als multivalente Vakzine genutzt werden. Die beiden
multivalenten Vakzine, die oben beschrieben wurden dienen
lediglich als erläuternde Beispiele der vielen Kombinationen
von multivalenten Vakzinen, welche hergestellt werden können
unter Nutzung aller oder eines Teils der 25 gereinigten
Pneumokokken-Kapselpolysacchariden der vorliegenden Erfindung.
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Diese Beispiele sind in der folgenden Reihenfolge
angeordnet:
Beispiele
Dänische Typen
Amerikanische Typen
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Pneumokokkentypen, die gemäß dänischer Bezeichnung Typen 1,
2, 4, 8, 12F, 25, 6A, 6B, 7F, 9N, 14, 19F, 20, 23F und 18C
sind, können hergestellt werden wie in U.S. Patent Nr. 4 242
501 beschrieben, auf das hiermit Bezug genommen wird.
Beispiel 1
Typ-3 Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
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300 bis 500 l Medium werden verwendet, um Typ 3 Pneumokokkus
unter Bedingungen aufzuziehen, die geeignet sind, um eine
stationäre Wachstumsphase zu erreichen. Die Bakterien werden
dann lysiert durch die Zugabe einer 10 %igen sterilen,
filtrierten Lösung eines geeigneten Lysationsmittels, in diesem
Falle Natriumdesoxycholat. Viele Verfahren zur Lysierung,
beispielsweise mit anderen Detergentien, und mechanische
Methoden, wie beispielsweise Zerstörung mit Schall und
französischen Druckzellen können verwendet werden. In allen Fällen
würden vollständig äquivalente Materialien für die Verfahren
dieser Erfindung erhalten werden. Falls Natriumdesoxycholat
verwendet wird, ist eine geeignete Lysierkonzentration etwa
0,1 bis 0,2 %. Alle Bakterienzellen werden lysiert, wobei
das zellassoziierte Polysaccharid in das Medium freigesetzt
wird. Das trübe Medium wird durch Zentrifugieren geklärt. Es
wird hier eine Modell 16 Sharples-Zentrifuge mit 16 000
U/min und bei einer Fließrate von 36 bis 40 l/h unter
Aufrechterhaltung einer Temperatur von 2 bis 10 ºC verwendet.
Die so gesammelten Zelltrümmer (debris) werden verworfen.
Die das Polysaccharid tragende, überstehende Flüssigkeit
wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt. In diesen
Beispielen wird die pH-Einstellung im allgemeinen durch Zugabe
von 0,8 M Essigsäure erreicht. Es ist wichtig, darauf
hinzuweisen, daß die bei den Vorstufen angegebenen exakten pH
Werte allgemein sind und lediglich den bevorzugten Bereich
angeben. Bei allen Pneumokokkentypen ist eine große
Variationsbreite bei den brauchbaren pH-Bereichen vorhanden.
Lediglich die Präzipitationsstufen unter Verwendung von
Cetavlon fordern eine in hohem Maße spezifische
pH-Einstellung. In ähnlicher Weise ist Essigsäure lediglich ein
Beispiel für eines der möglichen Säuerungsmittel. Essigsäure
ist bevorzugt, da es die Verwendung von Natriumacetat mit
der damit einhergehenden Pufferungsaktion ermöglicht. Für
die Fachleute ist jedoch selbstverständlich, daß andere pH-
Einstellsysteme mit anderen Säuren, Basen und Puffern leicht
verwirklicht werden können. Auf die obige Weise wird ein
roher Polysaccharidüberstand für das erfindungsgemäße
Reinigungsverfahren hergestellt.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 3
(A) Erste Alkoholfällung
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Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %, bezogen auf
Überstand und Alkohol. Der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt
und in der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau mit 8
M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,15 Vol. bis 0,5
Vol. und vorzugsweise 0,25 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und bei der bevorzugten Ausführungsform
auf ± 0,1 genau mit 8 M Essigsäure. Das
Polysaccharidpräzipitat bildet sich langsam und das Gemisch wird über Nacht
stehengelassen, etwa 16 bis 20 Stunden, und dann
zentrifugiert. Da die Pneumokokkenpolysaccharide labil sind, werden
sie bei reduzierten Temperaturen gehandhabt. Das Präzipitat
sollte daher während der 16 bis 20 Stundenperiode gekühlt
gehalten werden, in diesem Falle bei 4 ºC. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren aufgelöst in ausreichend 4
%iger Natriumacetatlösung, gewöhnlich etwa 100 l, wobei
reduzierte Temperaturen von etwa 4 ºC bevorzugt sind. Eine
kurze mechanische Agitation in einem Mischer (4 bis 6 Sek.)
hilft bei dieser Auflösung. Falls Trübung erscheint, kann
die Lösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren bei
reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und bei einer Fließrate
von etwa 16 bis 18 l/h geklärt werden.
(B) Zweite Alkoholfällung
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Diese wird wie die erste Alkoholfällung durchgeführt, indem
man den oben gebildeten, polysaccharidhaltigen Überstand auf
einen pH von etwa 6,6 einstellt und bei der bevorzugten
Ausführungsform auf ± 0,1 genau. Das wird erreicht mit 8 M
Essigsäure. Natriumacetat wird zugegeben bis zu einer
Endkonzentration von etwa 4 % und der pH wird auf etwa 6,7
eingestellt, wobei wie oben eine Genauigkeit von ± 0,1
bevorzugt ist. Alkohol wird mit etwa 0,25 bis 0,6 Vol. zugesetzt
und bei der bevorzugten Ausführungsform mit 0,4 Vol. und der
pH wird auf 7 eingestellt. Die Behandlung erfolgt wie bei
der ersten Alkoholfällung beschrieben, unter Rühren, Kühlen,
pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch Filtration
oder Zentrifugieren. Das so entfernte
Polysaccharidpräzipitat wird in 50 l Wasser wieder aufgelöst, und das Wasser
wird durch Gefriertrocknung entfernt. Das trockene Pulver
wird in 200 l Wasser wieder aufgelöst und zentrifugiert, um
Trübung zu entfernen. Der überstand wird filtriert unter
Verwendung einer Niagra-Filterpresse, die mit CPX 10C und
CPX 70C Kissen beladen ist (AMF CUNO ) oder einem
äquivalenten Mittel. Teilweise gereinigte
Polysaccharidüberstandflüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau. Um
das Polysaccharid vollständig auszufällen, wird
Natriumacetat zugesetzt bis zu einer etwa 4 %igen Endkonzentration und
der pH wird auf 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
Alkoholfällung beschrieben und mit einer Genauigkeit von ± 0,1 bei
der bevorzugten Ausführungsform. Alkohol wird mit 0,1 bis
0,5 Vol. addiert zu einer minimalen Endkonzentration von 0,5
Vol. bei der bevorzugten Ausfuhrungsform und der pH wird auf
7 eingestellt. Daran schließt sich an das Stehenlassen wie
bei der ersten Alkoholfällung, Zentrifugieren und das
Wiederauflösen in etwa 200 l kaltem Pyrogen-freien Wasser,
und zwar bei etwa 4 ºC bei der bevorzugten Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
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Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25º C) erwärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1 mit
Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration von
0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese Einstellungslösung
als geeignet erwiesen.
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Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam
bis zu einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 Vol. % zugesetzt,
wobei die bevorzugte Konzentration 0,3 Vol. % beträgt. Nach
dem Stehenlassen bis zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird die Mischung wieder auf 4 ºC
abgekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC werden bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird Typ 3-Pneumokokkenpolysaccharid durch Cetavlon
gemeinsam mit einigen Verunreinigungen gefällt. Das Präzipitat
wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst und
kalt gerührt, in diesem Fall bei etwa 4 ºC. Die trübe
Suspension wird filtriert oder kalt zentrifugiert, in diesem
Fall mit einer Fließrate von 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12
ºC. Das Polysaccharid ist jetzt in Lösung während die
Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem
Zentrifugationspellet vorliegen und verworfen werden können. Dieses
Verfahren entfernt den größten Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen, die nach der Alkoholfällung
zurückgeblieben sind.
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Das Polysaccharid wird anschließend wieder gefällt, der
Überstand wird auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt und
Natriumacetat wird langsam bis etwa 4 % zugesetzt. Der pH wird dann
auf etwa 6,7 gesteigert und etwa 0,50 Vol. Alkohol werden
zugesetzt und der pH wird auf 7 eingestellt bei etwa 4 ºC 16
bis 20 Stunden. Das Polysaccharid wird zentrifugiert und in
Pyrogen-freiem Wasser wieder aufgelöst, wobei etwa 40 l
zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 mal wiederholt, um
eine weitere Reinigung des Polysaccharids zu erreichen und
Spuren von Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird
in etwa 20 l Wasser wieder aufgelöst.
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Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden
Konzentrationen an Cetavlon ausgedrückt als %-Werte, basierend auf einer
10 %igen Cetavlonlösung. Es sei darauf hingewiesen, daß eine
Änderung der Konzentrationen der Cetavlonlösung eine
entsprechende Änderung der zugesetzten Menge einer derartigen
Lösung zur Folge hat, um eine äquivalente Konzentration zu
erreichen.
(D) Aktivkohle-Reinigung
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Die Polysaccharidlösung, die immer noch gekühlt ist, wird
anschließend auf einen pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M
Essigsäure und Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M
Konzentration. Eine 20 %ige Suspension von Aktivkohle wird unter
Rühren zugesetzt, um eine 3 bis 7 %ige Konzentration von
Aktivkohle zu erhalten, wobei 5 % bevorzugt ist. Das Gemisch wird
gekühlt stehen gelassen bei etwa 4 ºC während etwa 30 Min.
Dieses Gemisch wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen.
Eine weitere Klärung erfolgt mittels Passage durch eine
Serie von Patronen und/oder Membranfiltern. Bei der
bevorzugten Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO )
Filterkissen verwendet, gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0.22u
Millipore-Membranen. Während dieses Verfahrens kann die optische
Dichte bei 260 mu verwendet werden, als eine Kontrolle der
Nukleinsäurekonzentration und das Verfahren von Lowra et al.
kann verwendet werden, um den Proteingehalt zu beobachten.
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Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC erwärmt, bevor die Dialyse durchgeführt wird.
Hierzu wird eine Modell DC 30 Amicon Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Filterpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Es wird sämtliches restliches Natriumchlorid
entfernt. Das Diafiltrat wird dann schnell gefroren und
gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Falle von Typ 3, zurückbleibt. Dieses
Pulver wird geerntet, und zwar unter niedrigen
Feuchtigkeitsbedingungen in Flaschen, die dann dicht verschlossen
werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Bei dem obigen Verfahren, werden mehr als 99 % von
verunreinigendem Protein und Nukleinsäure entfernt, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
-
In der vorliegenden Beschreibung werden Konzentrationen an
Aktivkohle ausgedrückt in Vol.%, basierend auf einer 20
%igen Aktivkohlesuspension. Es sei darauf hingewiesen, daß
durch Veränderung der Konzentration einer derartigen
Suspension sich entsprechend die Menge einer derartigen Suspension
ändert, die erforderlich ist, um eine äquivalente
Endkonzentration zu erreichen.
Beispiel 2
Typ-5 Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-5
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 5
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,8
Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M
Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird
das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil
zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen
gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte
daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden,
und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei
der Pneumokokkenpolysaccharidreinigung. Die Variabilität des
obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie,
jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol
und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen
Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen
werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer
Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte
Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC
bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. für Typ 5 wird Alkohol zugesetzt, mit
mindestens
etwa 0,9 Vol. bis etwa 1,4 Vol. Der pH wird auf 7 ein
gestellt. Bei Typ 5 muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,25 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung
durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,80 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,5 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 0,9 bis 1,4 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,25 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlan langsam
zugesetzt bis zu einer Konzentration von 1,0 bis 5,0 Vol.%,
wobei die bevorzugte Konzentration 2,00 Vol.% beträgt. Nach
dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC
gekühlt und das Präzipitat ward durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird das Typ 5 Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit
einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das Präzipitat
wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wiederaufgelöst und
kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird kalt
filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer Fließrate
von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das Polysaccharid
befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und
andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet
vorliegen,
welches verworfen werden kann. Mit dieser
Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der
Alkoholfraktionierung zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,25 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt
bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in
pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei. etwa 40 l geeignet
sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um
das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon
zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser
wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 2 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293 mm)-
Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 5,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 90 % des
verunreinigenden Proteins und 99 % der verunreinigenden Nukleinsäure,
während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 3
Typ-9V Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-9V
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 9V
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 vol. bis 0,8
Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa
7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M
Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird
das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil
zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen
gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte
daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden,
und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei
der Pneu-mokokkenpolysaccharidreinigung. Die Variabilität
des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie,
jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol
und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen
Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen
werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer
Fließ-rate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte
Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC
bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. für Typ 9V wird Alkohol zugesetzt, mit
mindestens etwa 1,25 Vol. bis etwa 2.25 Vol. und der pH wird
auf 7 eingestellt. Bei Typ 9V muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,75 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrlfugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhniich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung
durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,15 bis 0,35 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,25 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt, vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,25 bis 2,25 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,75 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällun mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam
zugesetzt bis zu einer Konzentration von 0,05 bis 1,0 Vol.%,
wobei die bevorzugte Konzentration 0,2 Vol.% beträgt. Nach
dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC
gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird das Typ 9V Pneumokokkenpolysaccharid nicht durch
Cetavlon gefällt. Das Präzipitat wird verworfen. Das
Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure
und andere Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet
vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser
Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der
Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
-
Aus dem Überstand wird das Polysaccharid anschließend wieder
ausgefällt und die überstehende Flüssigkeit wird auf einen
pH von etwa 6,6 mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %.
Der pH wird dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa
1,75 Vol. Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt,
man läßt bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen
und zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in
pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40
l geeignet sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male
wiederholt, um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von
Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20
l Wasser wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 2 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu zur Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 9V,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % von
verunreinigendem
Proteins und Nukleinsäure, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 4
Typ-10A Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-10A
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 10A
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis 0,8
Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M
Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird
das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil
zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen
gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte
daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden,
und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei
der Pneu-mokokkenpolysaccharidreinigung. Die Variabilität
des obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie,
jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol
und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen
Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen
werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer
Fließ-rate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte
Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC
bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 10A wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,0 Vol. bis etwa 1,5 Vol. und der pH wird auf
7 eingestellt. Bei Typ 10A muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,50 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und mit einer
Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung
durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,8 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,5 Vol.. Der
pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie bei
der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt, vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,0 bis 2,0 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,5 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,5 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei
etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem
Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 20 l geeignet
sind.
(C) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 4 bis 8 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 6 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO( ) )-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 10A, zu
rückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % der
verunreinigenden Nukleinsäure und 90 % des verunreinigenden Proteins,
während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 5
Typ-11A Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-11A
Fermentationsbrühenlysat
auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 11A
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,75 Vol. bis
1,25 Vol. und vorzugsweise 1,0 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8
M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet,
wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen,
labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten
Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode
sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt
gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die
Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die
Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in
erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den
Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei
dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten
Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch
Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man
eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte
Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 11A wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,5 Vol. bis etwa 2,25 Vol. Der pH wird auf 7
eingestellt. Bei Typ 11A muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 2,0 Vol übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung
durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, uberstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,75 bis 1,25 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 1,0 Vol..
Der pH ward auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,50 bis 2,25 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 2,00 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem,
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam
zugesetzt bis zu einer Konzentration von 1,5 bis 5,0 Vol.%,
wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach
dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC
gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird das Typ 11A Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit
einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das
Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst
und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird
kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer
Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das
Polysaccharid
befindet sich jetzt in Lösung, während die
Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem
Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser
Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der
Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 2 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei
etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem
Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l geeignet
sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um
das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon
zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser
wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 2 bis 5 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 3 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet
und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 11A,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des
verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 6
Typ- 15B Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-15B
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 15B
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,4 Vol. bis 1,0
Vol. und vorzugsweise 0,75 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M
Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird
das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil
zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen
gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte
daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden,
und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei
der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des
obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie,
jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol
und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen
Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen
werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer
Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte
Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC
bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 15B wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,5 Vol. bis etwa 2,25 Vol. Der pH wird auf 7
eingestellt. Bei Typ 15B muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,75 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid,
das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten Temperaturen,
wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt, kann
die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei
reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird die erste fraktionierte Alkoholfällung
durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentratlon von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol, von etwa 0,4 bis 1,0 Vol., wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,75 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,5 bis 2,25 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,75 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem,
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam
zugesetzt bis zu einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%,
wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach
dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC
gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird das Typ 15B Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit
einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das
Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst
und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird
kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer
Fließrate von etwa 5 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 C. Das
Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die
Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem
Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser
Verfahrensweise wird der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der
Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,75 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt
bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in
pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l geeignet
sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um
das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon
zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser
wieder aufgelöst. Falls Trübung auftritt, kann die Lösung
durch Filtration oder durch Zentrifugieren bei reduzierter
Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und bei einer Fließrate von 6
bis 7 l/h geklärt werden.
(D) Diafiltration und Trocknung
-
Die Polysaccharidlösung wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 15B,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 98 % des
verunreinigenden Proteins und 99 % der verunreinigenden Nukleinsäure,
während die Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 7
Typ-1 7F Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-17F
Fermentationsbrühenlysat
auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 17F
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis
0,75 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8
M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet,
wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen,
labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten
Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode
sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt
gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die
Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die
Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in
erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den
Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei
dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten
Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch
Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man
eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte
Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 17F wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,0 Vol. bis etwa 1,5 Vol. Der pH wird auf 7
eingestellt. Bei Typ 17F muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,25 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte
Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,75 Voi. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,5 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,0 bis 1,5 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,25 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem,
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam
zugesetzt bis zu einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%,
wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach
dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC
gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird das Typ 17F Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit
einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das
Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst
und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird
kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer
Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das
Polysaccharid
befindet sich jetzt in Lösung, während die
Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem
Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser
Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der
Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,25 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt
bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in
pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l
zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt,
um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von
Cetavlon zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l
Wasser wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 3 bis 6 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 4 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet
und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 17F,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des
verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 8
Typ- 19A Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-19A
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 19A
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,5 Vol. bis 1,5
Vol. und vorzugsweise 0,75 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8 M
Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet, wird
das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen, labil
zu sein, werden sie am besten bei reduzierten Temperaturen
gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode sollte
daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt gehalten werden,
und z war bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die Alkoholfällungsstufen bei
der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die Variabilität des
obigen Schemas für andere Typen besteht in erster Linie,
jedoch nicht ausschließlich, in den Volumenmengen an Alkohol
und der Reihenfolge der Schritte, die bei dem spezifischen
Typ verwendet werden. Die ausgefällten Verunreinigungen
werden einförmig eliminiert durch Zentrifugieren bei einer
Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man eine reduzierte
Temperatur einhält, wobei die bevorzugte Temperatur von 2 ºC
bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 19A wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,5 Vol. bis etwa 2,0 Vol. Der pH wird auf 7
eingestellt. Bei Typ 19A muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,75 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid,
das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysakcharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und bei einer
Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte
Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0 1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,75 bis 1,25 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 1,0 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,5 bis 2,0 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,75 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem,
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Natriumchlorid wird unter Rühren bis 0,1 M zugesetzt und
eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam zugesetzt bis zu
einer Konzentration von 0,05 bis 0,2 Vol.%, wobei die
bevorugte Konzentration 0,075 Vol.% beträgt. Nach dem
Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90
Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das
Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine
Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird
bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese
Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ
19A Pneumokokkenpolysaccharid nicht durch Cetavlon gefällt.
Das Präzipitat wird verworfen. Das Polysaccharid befindet
sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere
Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen,
welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise
werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkoholfraktionierung
zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,75 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt
bei etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert
die Polysaccharide, die anschliefßend in
pyrogenfreiem Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l
zweckmäßig sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt,
um das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von
Cetavlon zu entfernen. Das letze Präzipitat wird in etwa 20 l
Wasser wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 5 bis 9 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 7 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten Ausführungs
form wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000 Molekularge
wicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche Natriumchlo
rid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, diesem Fall das von Typ 19A,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen
werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des
verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 9
Typ-22F Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-22F
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 22F
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
Überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis
0,75 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8
M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet,
wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen,
labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten
Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode
sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt
gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die
Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die
Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in
erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den
Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei
dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten
Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch
Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man
eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte
Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der Überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 22F wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,25 Vol. bis etwa 1,75 Vol. Der pH wird auf 7
eingestellt. Bei Typ 22F muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,5 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und mit einer
Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte
Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,75 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,50 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,25 bis 1,75 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,50 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem,
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Unter Rühren wird eine 10 %ige Lösung von Cetavlon langsam
zugesetzt bis zu einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 Vol.%,
wobei die bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach
dem Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem
Falle etwa 90 Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC
gekühlt und das Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt.
Eine Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis
14 ºC wird bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet.
Diese Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren
wird das Typ 22F Pneumokokkenpolysaccharid zusammen mit
einigen Verunreinigungen durch Cetavlon gefällt. Das
Präzipitat wird in 40 l etwa 0,25 M Natriumchlorid wieder aufgelöst
und kalt gerührt, etwa bei 4 ºC. Die trübe Suspension wird
kalt filtriert oder zentrifugiert, und zwar mit einer
Fließrate von etwa 6 bis 7 l/h und bei 7 bis 12 ºC. Das
Polysaccharid befindet sich jetzt in Lösung, während die
Nukleinsäure und andere Verunreinigungen in dem
Zentrifugationspellet vorliegen, welches verworfen werden kann. Mit dieser
Verfahrensweise werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der
Alkohol -fraktionierung zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,5 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei
etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem
Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l zweckmäßig
sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um
das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon
zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser
wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 3 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 22F,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des
verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.
Beispiel 10
Typ-33F Pneumokokkus
Herstellung der rohen Polysaccharidsuspension
-
Das rohe Polysaccharid wird aus einem Typ-33F
Fermentationsbrühenlysat auf die gleiche Weise hergestellt wie in
Beispiel 1 für Typ 3 beschrieben.
Reinigung des Polysaccharids: Typ 33F
(A) Erste fraktionierte Alkoholfällung
-
Zu dem rohen Polysaccharidüberstand gibt man Natriumacetat
bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 % gegenüber dem
überstand und Alkohol. Der pH wird eingestellt auf etwa 6,7
und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1 genau, mit
8 M Essigsäure. Alkohol wird zugesetzt von 0,25 Vol. bis
0,75 Vol. und vorzugsweise 0,5 Vol., und zwar langsam unter
Rühren bei einer Temperatur von 2 bis 6 ºC. Der pH wird auf
etwa 7,0 eingestellt und vorzugsweise auf ± 0,1 genau, mit 8
M Essigsäure. Während sich das Präzipitat langsam bildet,
wird das Gemisch über Nacht, etwa 16 bis 20 Stunden, stehen
gelassen. Da die Pneumokokkenpolysaccharide dazu neigen,
labil zu sein, werden sie am besten bei reduzierten
Temperaturen gehandhabt. Während der 16- bis 20-Stundenperiode
sollte daher die polysaccharidhaltige Lösung gekühlt
gehalten werden, und zwar bei 4 ºC. Das oben beschriebene
Fraktionierungsschema ist der Standard für die
Alkoholfällungsstufen bei der Pneumokokkenpolysaccaridreinigung. Die
Variabilität des obigen Schemas für andere Typen besteht in
erster Linie, jedoch nicht ausschließlich, in den
Volumenmengen an Alkohol und der Reihenfolge der Schritte, die bei
dem spezifischen Typ verwendet werden. Die ausgefällten
Verunreinigungen werden einförmig eliminiert durch
Zentrifugieren bei einer Fließrate von etwa 16 bis 20 l/h, wobei man
eine reduzierte Temperatur einhält, wobei die bevorzugte
Temperatur von 2 ºC bis etwa 6 ºC beträgt.
-
Der überstand, der das teilweise gereinigte Polysaccharid
enthält, wird wie oben auf einen pH von etwa 6 ºC eingestellt
und Natriumacetat wird bis zu einer Konzentration von 4 %
zugesetzt, und zwar gegen das Endvolumen, wenn der Alkohol
der nächsten Stufe zugesetzt ist. Der pH wird dann auf etwa
6,7 gesteigert. Für Typ 33F wird Alkohol zugesetzt mit
mindestens etwa 1,25 Vol. bis etwa 1,75 Vol. Der pH wird auf 7
eingestellt. Bei Typ 33F muß die bevorzugte
Endalkoholkonzentration etwa 1,50 Vol. übersteigen, um das gesamte
Polysaccharid auszufällen.
-
Das Gemisch wird anschließend bei einer reduzierten
Temperatur und während einer vergleichbaren Zeit wie bei der ersten
Alkoholfraktionierungsfällung stehengelassen und wird in
ähnlicher Weise zentrifugiert. Dieses ist jedoch das
Polysaccharid, das in dieser Stufe ausgefällt wird. Das
Polysaccharidpräzipitat wird unter Rühren in ausreichend Wasser
aufgelöst, gewöhnlich etwa 40 l, bei reduzierten
Temperaturen, wobei etwa 4 ºC bevorzugt sind. Falls Trübung auftritt,
kann die Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren
bei reduzierter Temperatur, etwa 2 bis 6 ºC, und mit einer
Fließrate von 6 bis 7 l/h geklärt werden.
(B) Zweite fraktionierte Alkoholfällung
-
Diese Fällung wird wie die erste fraktionierte
Alkoholfällung durchgeführt, indem man die oben gebildete
polysaccharidhaltige, überstehende Lösung auf einen pH von etwa 6,6
einstellt und bei der bevorzugten Ausführungsform auf ± 0,1
genau, was mit 8 M Essigsäure erreicht wird. Natriumacetat
wird zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von etwa 4 %
und der pH wird auf 6,7 eingestellt, wobei ± 0,1 wie oben
bevorzugt ist. Alkohol von etwa 0,25 bis 0,75 Vol. wird
zugesetzt und bei der bevorzugten Ausführungsform 0,50 Vol..
Der pH wird auf 7 eingestellt und die Behandlung erfolgt wie
bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung unter Rühren,
Kühlen, pH-Einstellung, Stehenlassen und Klärung durch
Zentrifugieren. Das Präzipitat wird entfernt, die überstehende
Flüssigkeit mit dem partiell gereinigten Polysaccharid wird
auf einen pH von etwa 6,6 eingestellt vorzugsweise ± 0,1
genau. Zur vollständigen Fällung des Polysaccharids wird
Natriumacetat bis zu einer etwa 4 % Endkonzentration zugesetzt
und der pH wird auf etwa 6,7 eingestellt, wie bei der ersten
fraktionierten Alkoholfällung beschrieben, und vorzugsweise
mit ± 0,1 Genauigkeit. Es werden von etwa 1,25 bis 1,75 Vol.
Alkohol zugesetzt bis zu einer finalen Minimalkonzentration
von 1,50 Vol. bei der bevorzugten Ausführungsform. Der pH
wird auf 7 eingestellt. Dieses wird gefolgt von
Stehenlassen, wie bei der ersten fraktionierten Alkoholfällung,
Zentrifugieren und Wiederauflösen in etwa 40 l kaltem,
pyrogenfreiem Wasser, bei etwa 4 ºC in der bevorzugten
Ausführungsform.
(C) Fraktionierte Fällung mit
Hexadecyltrimethylammoniumbromid (Cetavlon)
-
Die Polysaccharidlösung wird anschließend auf
Zimmertemperatur (21 bis 25 ºC) aufgewärmt und der pH wird auf 7,4 ± 0,1
mit Natriumcarbonatlösung eingestellt. Eine Konzentration
von 0,4 % Natriumcarbonat hat sich für diese
Einstellungslösung als geeignet erwiesen.
-
Natriumchlorid wird unter Rühren bis zu 0,15 M zugesetzt und
eine 10 %ige Lösung von Cetavlon wird langsam zugesetzt bis
zu einer Konzentration von 1,0 bis 5,0 Vol.%, wobei die
bevorzugte Konzentration 3,0 Vol.% beträgt. Nach dem
Stehenlassen zur Bildung des Präzipitats, in diesem Falle etwa 90
Min., wird das Gemisch wieder auf etwa 4 ºC gekühlt und das
Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. Eine
Fließrate von 6 bis 8 l/h und eine Temperatur von 7 bis 14 ºC wird
bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet. Diese
Bereiche sind jedoch allgemein. Mit diesem Verfahren wird das Typ
33F Pneumokokkenpolysaccharid nicht durch Cetavlon gefällt.
Das Präzipitat wird verworfen. Das Polysaccharid befindet
sich jetzt in Lösung, während die Nukleinsäure und andere
Verunreinigungen in dem Zentrifugationspellet vorliegen,
welches verworfen werden kann. Mit dieser Verfahrensweise
werden der größte Teil der Nukleinsäure- und
Proteinverunreinigungen entfernt, die nach der Alkoholfraktionierung
zurückgeblieben sind.
-
Das Polysaccharid wird anschließend wieder ausgefällt und
die überstehende Flüssigkeit wird auf einen pH von etwa 6,6
mit Natriumacetat eingestellt, bis etwa 4 %. Der pH wird
dann auf etwa 6,7 gesteigert und es werden etwa 1,5 Vol.
Alkohol zugesetzt. Der pH wird auf 7 eingestellt, man läßt bei
etwa 4 ºC das Ganze 16 bis 20 Stunden stehen und
zentrifugiert die Polysaccharide, die anschließend in pyrogenfreiem
Wasser wieder aufgelöst werden, wobei etwa 40 l zweckmäßig
sind. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt, um
das Polysaccharid weiter zu reinigen und Spuren von Cetavlon
zu entfernen. Das letzte Präzipitat wird in etwa 20 l Wasser
wieder aufgelöst.
(D) Aktivkohle-Reinigung
-
Die immer noch kalte Polysaccharidlösung wird dann auf einen
pH von etwa 6,1 eingestellt mit 0,3 M Essigsäure und
Natriumchlorid bis zu einer 0,15 M Konzentration. Eine 20 %ige
Suspension von Aktivkohle wird unter Rühren zugesetzt, um
eine 3 bis 7 %ige Konzentration der Aktivkohle zu erhalten,
wobei 4,5 %ig bevorzugt ist. Das Gemisch wird gekühlt stehen
gelassen, etwa bei 4 ºC während etwa 30 Min. Dieses Gemisch
wird filtriert, um Aktivkohle zu entfernen und wird weiter
geklärt, indem man es durch eine Serie von Filterkissen oder
Membranen hindurchleitet. Bei der bevorzugten
Ausführungsform wird ein CPX-10C (AMF-CUNO)-Filterkissen verwendet,
gefolgt von 1,2, 0,65, 0,45 und 0,22u Millipore(293
mm)-Membranen. Während dieses Verfahrens wird die optische Dichte
bei 260 mu als Kontrolle der Nukleinsäurekonzentration
beobachtet
und das Verfahren von Lowry et al. wird verwendet, um
den Proteingehalt zu beobachten.
-
Das resultierende Filtrat wird auf Zimmertemperatur, etwa 21
bis 25 ºC, aufgewärmt, bevor die Diafiltration erfolgt.
Hierzu wird eine Modell DC30 Amicon-Einheit verwendet,
enthaltend eine hohle Faserpatrone mit einem 10 000
Molekulargewicht-Schnitt. Dabei wird das gesamte restliche
Natriumchlorid entfernt. Das Diafiltrat wird anschließend rasch
eingefroren und gefriergetrocknet, wobei gereinigtes
Pneumokokkenpolysaccharidpulver, in diesem Fall das von Typ 33F,
zurückbleibt. Dieses Pulver wird unter Bedingungen niedriger
Feuchtigkeit in Flaschen geerntet, die dann dicht
verschlossen werden und superkalt gelagert werden, wobei unter -20 ºC
sich als zweckmäßig erwiesen hat.
-
Das obige Verfahren entfernt mehr als 99 % des
verunreinigenden Proteins und Nukleinsäure, während die
Immunogenizität des Produkts erhalten bleibt.