DE2024586C3 - - Google Patents
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Description
2. Verfahren zum Herstellen der langsamen tx- und
J3-Glykoproteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sich an die Stufe c) eine zweite Auslaugung mit einem anderen sauerstoffhaltigen
Lösungsmittel anschließt.
3. Verfahren zum Herstellen der langsamen «- und ß-Glykoprotcine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reinigung der nach Stufe e) erhaltenen langsamen /x- und ^-Glykoproteine durch
Dialyse mit einer Cellulosemembran und durch Chromatographie über Sephadex 200®, gefolgt von
der Eluierung, erfolgt.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung zur perkutanen, transkutanen, perlingualen, topischen oder
permucosen Verabreichung, enthaltend die langsamen Oi- und /3-Glykoproteine nach den Ansprüchen 1
bis 3.
In der Literatur ist bereits eine große Anzahl von Präparationen mikrobiellen Ursprungs beschrieben, die
durch Mikrobenkörper gebildet werden, die auf chemische oder physikalische Weise lysiert wurden.
Dies ist z. B. beschrieben in den speziellen französischen Heilmittel-Patenten 5488 M (Canadian Patents
and Development Limited), 6495 M (Institut de Recherches Scientifiques) und 6513 M (Institut de Recherches
Scientifiques).
Diese Mikrobcnlysatc, die allein oder in Verbindung
mit einem Antibiotikum oder mit einem polaren Lösungsmittel vorliegen können, dienen dazu, eine
schnelle Immunisierungsreaktion in Gang zu bringen, oder dazu, die Abwehrkräfte des Organismus gegenüber
einem mikrobiellen Angriff zu steigern. Diese Lysate stammen im allgemeinen von einer bestimmten
Mikrobenart und rufen eher eine spezifische als eine allgemeine Immunisierung hervor. Sie besitzen außerdem
den Nachteil, daß sie im allgemeinen Allergien hervorrufen. Zu ihrer wiederholten Anwendung kann
aus diesem Grunde nicht geraten werden.
Weiterhin stellen diese Lysate Mischungen proteinartiger Fraktionen dar, die sehr verschiedenartig sind, wie
Lipoproteine, Mucopolysaccharide, Nucleoproteine, von denen die einen immunaktiv sind und die anderen
inaktiv sind. Die Verabreichung derartiger Mischungen kann zu unerwünschten Nebenwirkungen führen.
Es ist daher wünschenswert im Hinblick auf die therapeutische Anwendung, nicht nur über ein mikrobielles
Lysat zu verfügen, das gleichwohl antigene Eigenschaften besitzt, sondern auch über eine gereinigte
Fraktion eines derartigen Lysats zu verfügen, die die eigentliche aktive Fraktion darstellt.
Diese gereinigte Fraktion hätte außerdem den Vorteil, daß sie eine sehr starke, schnelle und genügend
dauerhafte Immunität hervorrufen würde.
Ein erster Versuch zur Lösung dieses Problems wurde von p. Lalouette (Revue d'lmmunologie, 32, (1968),
S. 105 bis 150) unternommen, ausgehend von einem somalischen Antigenextrakt, der aus dem Stamm
Bacillus subtilis L herrührte. Das hierbei verwendete Verfahren umfaßt auch eine Lysierung und Fraktionierung
der Mikrobenkörper. Die Glykoproteinfraktion, die dieser Autor erhielt, besitzt eine gewisse nichtspczi-
j(i fische antigene Aktivität. Sie besitzt außerdem eine
antiinflammatorische Wirkung.
Die Erfindung soll demgegenüber eine zufriedenstellendere und allgemeinere Lösung dieses Problems
geben und die Gewinnung von langsamen a- und
j5 J8-Glykoproleinen mit ausgeprägter Immunwirkung und
starker antiirflammatorischer Wirkung gestatten.
Indem man erfindungsgemäß nicht mehr einen Extrakt eines speziellen nichtpathogenen Stamms
verwendet, sondern einen Extrakt, der von einem oder mehreren saprophyten oder pathogenen Stämmen
herrührte, kann man eine Glykoproteinfraktion erhalten, die eine ausgeprägtere und allgemeinere Immunwirkung
und eine stärkere antiinflammtorische Wirkung besitzt.
Gegenstand der Erfindung sind somit langsame «- und j3-Glykoproteine aus Mikrobenkörpern, erhältlich
durch
a) Kultivierung eines Mikrobenstammes, ausgewählt aus der Gruppe von Pneumokken, Streptokokken,
Neisseria, Staphylokokken, Mikrokokken, Klebsiel-Ia pneumoniae und Haemophilus influenzae oder
einer Mischung von zwei oder mehreren dieser Stämme oder einer Mischung von verschiedenen
Typen eines dieser Stämme, wobei man die Mikrobenkörper nach vollständiger Kultivierung
manuell oder automatisch sammelt und in einem wäßrigen Medium suspendiert,
b) in der Suspension die Mikrobenkörper chemisch, physikalisch und/oder enzymatisch lysiert und die
Reste der Mikrobenkörper physikalisch abtrennt,
c) die so erhaltene klare Lösung eindampft, den Rückstand mit Lipoidlösungsmilteln behandelt,
d) das von Lipoiden befreite Produkt in einem wäßrigen Lösungsmittel löst, daraus die F.iweißkörper
physikalisch fällt und entfernt und
e) aus der erhaltenen klaren, wäßrigen Lösung die langsamen Glykoproteine durch Zugabe eines mit
Wasser mischbaren Lösungsmittels oder einer Mischung derartiger Lösungsmittel ausfällt und
gegebenenfalls durch in der Biochemie übliche Verfahren weiter reinigt.
Die erfindungsgemäßen Glykoproteine entfalten neben den antiinflammatorischen Eigenschaften schnell
wirkende und nicht spezifische immunisierende Eigenschaften. Sie besitzen außerdem den Vorteil, daß sie
weder Allergien hervorrufen noch hyperthermisch wirken und daß sie keine Unverträglichkeitserscheinungen
an der Injektionsstelle hervorrufen.
Unter bestimmten experimentellen Bedingungen kann man somit eine oder mehrere Molekülarten
glykoproteinartiger Natur isolieren, die verantwortlich sind für die antigenen und antiinflammatorischen
Eigenschaften der mikrowellen Präparatior.en. Eine derartige Glykoproteinfraktion ist auf Grund des
unterschiedlichen Ursprungs der Mikrobenkulturen verschieden von jener, die P. L a 11 ο u e 11 e erhalten
hat.
Die Erfindung erlaubt es somit, zu gereinigten standardisierbaren Fraktionen zu gelangen, deren
Immunwirkung gegenüber pathogenen Mitteln reproduzierbar ist und deren Gehalt an aktiven Glykoproteinen
mit Präzision durch chemische, physikalische, immunologische oder bakteriologische Untersuchungen
bestimmt werden kann.
Die unter den genannten Bedingungen erhaltenen Glykoproteine sind eine Mischung aus langsamen λ-
und /?-Glykoproteinen. Ihre Struktur kann durch das Verhalten bei der Elektrophorese gegenüber Vergleichs-Glykoproteincn
und insbesondere gegenüber Serumglykoproteinen gezeigt werden.
Die chemische Natur dieser Substanzen wird auch angegeben durch chemische Reaktionen, wie durch
ihren Gehalt an Hexosen, Pentosen, und durch die ungefähre Bestimmung des Molekulargewichts unter
Verwendung von selektiven chromatographischen Mitteln, wie modifizierte Cellulosen, Sephadex oder
Molekularsiebe, durch den Gehalt an Proteinfraktion des Moleküls, der bestimmt wird durch die biuretogene
Wirkung, berechnet im Vergleich zu der Serumalbumineichung, durch den Gehalt an Hexosaminen und an
Sialsäure. Die Fraktion, die durch Glykoproteine gebildet wird, die man ausgehend von einem oder
mehreren der erwähnten pathogenen Stämme erhalten hat, kann dadurch definiert werden, daß sie aus
langsamen α- und /?-Glykoproteinen, die thermostabil,
säurelöslich und löslich in Lösungen von Ammoniumsulfal sind, besteht.
Das Molekulargewicht der λ- und ^-Glykoproteine wird bewertet durch die Chromatographie über
SEPHADEX. Die Filtrationschromatographie gestattet es, ein Molekularvolumen .,L zu definieren, das eine
Vi)
Beziehung darstellt zwischen dem Volumen an Lösungsmittel,
das notwendig ist zur Desorption der Glykoproleine (Ve) und dem Lösungsmittelvolumen, das notwendig
ist, um ein großes Molekül zu eluieren, das völlig aus dem SEPHADEX-GeI G 100(Vo) vertrieben ist.
Vc
Das Molekularvoliimen v ^ für derartige Glykoproteine,
wie man sie gemäß Beispiel I erhält, liegt /.wischen 2,5 und 3 im Vergleich zu einem Puffer von
pH =8, der gebildet wird durch die folgende Mischung:
Tris-(hydroxyniethyl)-aininomethan
Natriumchlorid
Natriumchlorid
0,1 m 0.1 m Das Molekulargewicht der α- und ^-Glykoproteine
kann auch bestimmt werden durch Chromatographie über SEPHADEX G 200.
Das Molekularvolumen ^ auf SEPHADEX G 200
für derartige Glykoproteine, wie man sie gemäß den Beispielen 2 bis 7 erhält, liegt zwischen 1 und 1,2,
bezogen auf den oben angegebenen Puffer bzw. einen Puffer vom pH = 8.
ίο Die Glykoproteine werden auch definiert durch ihren
Gehalt an gebundenen Hexosen, bestimmt durch eine spezifische Reaktion, wie z. B. durch die Färbereaktion
mit Methylresorcin. Gemäß diesen Bestimmungen haben die gemäß Beispiel 1 erhaltenen Glykoproteine
einen Gehalt an gebundenen Hexosen zwischen 4 und 20 g pro 100 g. Dieser GehaM variiert mit dem Grad der
Reinigung der betrachteten Fraktion und mit der Menge der Mineralsalze, die in der Glykoproteinfraktion
enthalten sind.
Die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Glykoproteine haben einen Gehalt an gebundenen Hexosen um 50%
bei einem Produkt, das unvollständig von Mineralsalzen befreit ist; er liegt in der Gegend von 60% bei einem
Produkt, das vollständig von Mineralsalzen befreit ist.
2r> Die Glykoproteine lassen sich auch durch die
folgende Beziehung definieren:
Gehalt an gebundenen Hexosen
Biuretbildungsvermögen
Biuretbildungsvermögen
ίο Der Gehalt an biuretogenen Substanzen, bestimmt im
Vergleich zur Serumalbumineichung, liegt für die Glykoproteine gemäß Beispiel 1 im Bereich von 10%.
Die Beziehung
gebundene Hexosen
r> Biuretbildungsvcrmögen
variiert zwischen 0,25 und 2 in Abhängigkeil vom Reinheitsgrad.
Für die gemäß Beispiel 2 erhaltenen Glykoproteine ist die Beziehung
gebundene Hexosen
Biuretbildungsvermögen
Biuretbildungsvermögen
kleiner oder gleich 3. Sie kann auch einen Wert
•r> zwischen 2,8 und 3 annehmen.
Die Glykoproteine werden weiterhin definiert durch ihre Löslichkeitseigenschaften. Sie geben in destilliertem
Wasser eine leicht opalisierende Lösung, die beim Erwärmen nicht denaturiert wird.
•in Die Glykoproteine sind löslich in Lösungen von
Perchlorsäure, Trichloressigsäure und Phytinsäure. Insbesondere kann man die Glykoproteine aus einer
Lösung von Phytinsäure mit einem pH-Wert von 2,10 ohne Denaturierung zurückgewinnen.
Yt Des weiteren werden die Glykoproteine definiert
durch die Intensität ihrer antiinflammatorischen Wirkung, die durch Standardversuche, wie das experimenta-Ie
Karragheen-Ödem, bestimmt wird. Die antiinflammatorische
Aktivität läuft parallel der Reinheit der
M) Glykoproteinfraktion.
Weiterhin ist es nicht unmöglich, daß diese Glykoproteine eine spezifische Methylpentose und insbesondere
Fucose enthalten.
Die erfindungsgeinäßen langsamen Glykoproteine
Die erfindungsgeinäßen langsamen Glykoproteine
μ st. nmen her von Mikrobenkulturen auf festem oder
flüssigem Medium, wie z. B. auf angereicherter oder nicht angereicherter Nährgelose in einer Petrischale
oder durch Kultivierung in Schüttelvorrichtungen oder
in industriellen Fermentierungsvorrichtungen in einem
flüssigen Medium.
In der Stufe b) werden die Mikrobenkörper, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Puffers, wie z. B.
eine Lösung von Dinatriumphosphat, oder in Anwesenheit eines Antiseptikums, wie Thimerosal, wieder in
Wasser in Suspension gebracht. Die so erhaltenen Suspensionen werden pholometrisch titriert, um die
Konzentration an Bakterienkörpern zu bestimmen. Man kann diese Konzentration auf einen gewünschten
Wert einstellen. Die Suspension dieser Mikrobenkörper wird dann lysiert.
Die Lysierung der Mikrobenkörper dieser Suspension kann auf verschiedene Art bewirkt werden, sei es auf
chemischem Wege, wie durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels, z. B. eines Polyäthylenglykolsorbats,
oder eines Antiseptikums, insbesondere eines quecksilberhaltigen Antiseptikums, sei es auf physikalischem
Wege mit Hilfe von Ultraschall oder durch Erwärmen oder durch durchdringende Strahlung, sei es
auch auf diastatischem oder enzymatischem Wege durch Zugabe proteolytischer oder polymuco-saccharolytischer
Enzyme oder auch auf jede andere Weise, die es gestattet, den Zellinhalt der Mikroben ohne
Veränderung möglichst vollständig zu gewinnen.
Die Lysierung der Mikrobenkörper kann auch in gemischter Weise erfolgen, indem man zunächst eine
enzymatische Lysierung durchführt und dann eine chemische Lysierung durch Kombination eines oberflächenaktiven
Mittels mit einem quecksilberhaltigen Antiseptikum. Hierbei kann sie nacheinander mit Hilfe
eines proteolytischen Enzyms, wie Trypsin, Papain. Bromelain, «-Chymotrypsin oder Pronase, oder mit
Hilfe eines polymuco-saccharolytischen Enzyms, wie Lysozym oder Hyaluronidase, bewirkt und dann mit
Hilfe eines chemischen Mittels, wie quecksilberorganische Antiseptika, Trichloressigsäure, Phytinsäure oder
Perchlorsäure, weitergeführt werden.
Anstelle von Trypsin kann man auch Pankreatin oder Streptokinase oder Streptodornase verwenden.
Der Grad und die Qualität der mikrowellen Lysierung kann photometrisch verfolgt werden.
Wenn man die Lysierung als zufriedenstellend ansieht, kann man ein Konservierungs- oder Stabilisierungsmittel
hinzugeben.
Die so erhaltenen bakteriellen Lysate liegen vor in Form einer wäßrigen Präparation, die gegebenenfalls
gepuffert ist, aus der die Reste der Mikrobenkörper ausfallen. Diese Reste können durch übliche Mittel, wie
Filtration oder Zentrifugierung entfernt werden.
Ausgehend von diesem von Mikrobenkörpern befreiten Lysat extrahiert man die Glykoproteine. Diese
Extraktion wird bewirkt an dem Rücks:and, den man durch Eindampfen oder Lyophilisierung des Lysats
nrhält. Der Rückstand wird von Lipoiden durch ein oder mehrere Lösungsmittel, insbesondere sauerstoffhaltige
Lösungsmittel, wie z. B. Äther oder Aceton, oder durch eine Mischung von Methylal und Methanol befreit.
Diese Operation kann gegebenenfalls wiederholt werden. Das so von Lipoiden befreite Pulver wird dann
wieder in wäßrige Lösung gebracht.
Die Befreiung von Lipoiden kann in zwei Stufen erfolgen. In einer ersten Stufe laugt man das
Mikrobenlysat durch eine Mischung von Mcthylal/Methanol
aus. die den größten Teil der Lipoide. Phospholipoidc und Lipoproteine löst. Die Glykoproicinfraktion
isi dagegen in dieser Mischung unlöslich und kann daher abgetrennt werden.
Die zweite Delipoidisierung wird am Rückfluß bewirkt durch ein sauerstoffhaltig« Lösungsmittel, das
die Auslaugung der aktiven Fraktion vervollständigt. Die so isoliertes Glykoproteinfraktion ist nur noch
verunreinigt durch mehr oder weniger denaturierte Proteine und durch Mineralsalze.
Dann führt man die Befreiung dieser Lösung von Eiweiß durch auf physikalischem oder chemischem
Wege.
ι» Die Befreiung von Eiweiß kann bewirkt werden durch
Erhitzen, nachdem man den pH-Wert der Lösung auf einen Wert um 5 gebracht hat, und insbesondere auf
einen Wert zwischen 5 und 6. Die Eiweißentfernung kann auch bewirkt werden durch einfaches Erhitzen
oder durch Kälte oder durch die Zugabe von Lösungsmitteln, durch Zugabe einer wäßrigen Mineralsäure
oder einer wäßrigen organischen Säure bei einem pH-Wert zwischen einschließlich 5 und 6 oder durch
biochemische Reinigung.
2(i Bevorzugt ist die Entfernung des Eiweißes durch
Kälte bei einer Temperatur von wenig oberhalb 00C. Diese Arbeitsweise hat den Vorteil, daß die Proteine
und der größte Teil der Mineralsalze gleichzeitig entfernt werden.
2) Man eliminiert den Niederschlag der Eiweißkörper
oder der Nucleoproteine durch Filtration oder Zentrifugieren. Die klare Lösung wird abgetrennt. Sie besteht im
wesentlichen aus einer Mischung von Glykoproteinen und Mineralsalzen.
in Man geht dann weiter vor mit selektiver Ausfällung
der Glykoproieinc, indem man der Lösung ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel oder eine Mischung
von derartigen Lösungsmitteln zugibt. Man verwendet zu diesem Zweck eine Mischung von Alkohol,
ii insbesondere Äthanol und Aceton, oder eine Mischung
von Methylal und Methanol.
Der Niederschlag von Glykoproteinen, der bei diesen
Bedingungen auftritt, wird abgetrennt, mit dem gleichen Lösungsmittel oder der gleichen Lösungsmittelmi-
•4(1 schung gewa~rhcn und dann getrocknet.
Die Glykoproteinfraktion wird schließlich gereinigt durch eine der selektiven biochemischen Methoden
(Dialyse. Chromatographie auf Silieiumdioxyd oder Cellulose, Elektrophorese, Ultrazentrifugicrung). So
4ϊ kann man eine Glykoproicinfraktion erhalten, die stark
angereichert ist und von Mineralsalzen befreit ist. Eine letzte Reinigung wird bewirkt durch Filtration über eine
Kolonne von chemisch modifizierter Cellulose (Äthylccllulosc, Dirnethylaminoäthylcellulose) mit einer gceig-
Id neten Korngröße und geeignetem Molekulargewicht.
Die bevorzugte Methode besteht darin, daß man eine
Lösung der Glykoproteinfraktion über eine Kolonne von SEPHADEX G 200 filtriert. Die aktive Fraktion
wird nicht adsorbiert und kann daher selektiv
V) abgetrennt werden. Die aktive Fraktion, die man so
erhält, enthält nur eine geringe Menge an Verunreinigungen,
wie Mineralsalze oder Nucleoproteine. Eine Ausfällung dieser Verunreinigungen durch Zusatz von
Mangansalzen oder qualernären Ammoniumsalzen, wie
wi Zcphirol oder Cetavlon. gcsiattet es. eine noch reinere
Glykoproteinfraktion zu erhalten.
So erhält man die erfindiingsgcmäßcn Glykoproteine
in praktisch reinem Zustand.
Die letzte Reinigung ist eine wünschenswerte, aber
ι,-, nicht obligatorische Operation, wobei insbesondere eine
Fraktionierung über einem selektiven Träger geeignet ist.
In einer besonders bevorzugten Alisführungsform
kann das Verfahren in folgender Weise definiert werden:
Der oder die verwendeten Mikrobenstämme werden aus der folgenden Gruppe ausgewählt:
Pneumokokken Siro vom Typ I, II. Ill, V
und VIII
Streptokokken der Gruppen A, C und G
Neisseria Catarrhalis
Staphylococcus aureus
Klebsellia Pneumoniae
Hämophilus lnfluenzae.
Die Lysierung der Mikrobenkörper wird bewirkt durch Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels;
die Lysierung der Mikrobenkörper wird bewirkt durch Zusatz eines quecksilberorganischen Antiseptikums;
die Lysierung der Mikrobenkörper wird bewirkt durch Zusatz eines quecksilberorganischen Antiseptikums;
die Lysierung der Mikrobenkörper wird bewirkt durch ein gemischtes Verfahren, das zunächst eine
enzymatische Lysierung und dann eine chemische Lysierung umfaßt, die bewirkt wird durch die
Verbindung eines oberflächenaktiven Mittels mit einem quecksilber-antiseptischen Mittel, wie z. B.
Natriummercuriäthylthiosalicylat;
die Lysierung wird bewirkt während einer Zeitdauer von 8 bis 15 Tagen bei einer mäßigen Temperatur um 40° C;
die Lysierung wird bewirkt während einer Zeitdauer von 8 bis 15 Tagen bei einer mäßigen Temperatur um 40° C;
die Lipoidentfernung wird bewirkt durch Auslaugen mit Äther;
die Lipoidentfernung wird bewirkt durch Auslaugen mit Aceton;
die Lipoidentfernung wird bewirkt durch Auslaugen mit Hilfe einer Mischung aus Methylal und
Methanol;
die Lipoidentfernung wird vervollständigt durch eine zweite Auslaugung mit Hilfe eines anderen
sauerstoffhaltigen Lösungsmittels, wie z. B. Aceton; die Entfernung der Eiweißkörper des von Lipoiden
befreiten Produktes wird bewirkt durch physikalische Mittel, wie durch Hitze oder Kälte im
neutralen oder sauren Milieu;
die F.iweißkörperentfernung wird bewirkt durch Erhitzen auf 1000C;
die F.iweißkörperentfernung wird bewirkt durch Erhitzen auf 1000C;
die Eiweißentfernung wird bewirkt durch Ansäuern mit Hilfe vonTrichloressigsäure;
die selektive Ausfällung von langsamen λ- und /3-Glykoproteinen wird bewirkt durch Zusatz einer
Mischung von Methyla'./Methano! zur wäßrigen
Lösung;
die selektive Ausfällung der langsamen <x- und ß-Glykoproteine wird bewirkt durch Zusatz einer
Mischung von Alkohol und Aceton zur wäßrigen Lösung;
die Mischung von Alkohol und Aceton wird in Mengen zugegeben, die variieren können zwischen
1 und 20 Volumen Lösungsmittel pro 1 Volumen wäßriger Lösung;
die erfindungsgemäßen langsamen «- und ji-Glykoproteine
werden durch Dialyse mit einer Cellulosemembran und dann durch Chromatographie über
SEPHADEX® 200, gefolgt von der Eluierung,
gereinigt.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen zur perkutanen, transkutanen.
perlingualen, topischen oder permucosen Verabreichung, die die langsamen <x- und |3-Glykoproteine
enthalten, die durch das oben beschriebene Verfahren erhalten werden. Ihre immunisierenden und antiinflammatorischen
Eigenschaften und ihre Reizwirkung auf das rcliculo-endotheliale System machen sie brauchbar
zur Steigerung der Abwehrkräfte des Organismus. Sie besitzen eine schnelle antigene Wirkung und steigern
dadurch die Widerstandskraft des Organismus gegenüber mikrobiellen Angriffen.
Die antiinflammatorischen Eigenschaften dieser Zusammensetzungen machen sie besonders brauchbar zur
Behandlung von Knochengelenkleiden, Infektionen der Atemwege, chronischen Leiden der Luftwege, Infektionen
der oberen Atemwege, gegen Venenleiden und in der Phlebologie, zur Behandlung von Störungen, die
hervorgerufen werden durch Infektion des Genitaloder Harntraktes. Auf Grund dieser Eigenschaften
werden sie auch in der Dermatologie angewandt.
Auf Grund ihrer antigenen Eigenschaften finden sie Verwendung bei der Behandlung von akutem Bronchialkatarrh,
bei Dermatitis, Verbrennungen, mikrobiellen Infektionen des Uro-Genital-Traktes und in der
Stomatologie.
Die Kombination der antiinflammatorischen und antigenen Eigenschaften ist darüber hinaus besonders
vorteilhaft bei der Behandlung von Knochengelenkleiden, wo die Phase der Entzündung oft begleitet wird von
einer Autolyse-Phase, die die Erscheinungen der Autosensibilisation hervorruft.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die langsamen «- und /3-Glykoproteine enthalten, sind
bestimmt zur Injektion in allgemeiner oder lokaler Weise, zur perkutanen, lokalen, permucosen oder
pulmonalen Anwendung oder in Form von Perlingualtabletten
oder Tabletten für Auflösung in dem Darm.
Die pharmazeutischen Formen, wie Salben, Nasentropfen, Ohrentropfen, injizierbare Lösungen, sterile
lyophilisierte Pulver zur Injektin, Sublingualtabletten, Aerosole, Suppositorien oder Kugeln, werden hergestellt
durch übliche pharmakotechnische Verfahren. Sie bestehen im allgemeinen darin, daß man die langsamen
«- und/?-Glykoproteine in einem wäßrigen Lösungsmittel
in Lösung bringt und die Konservierungs- oder Verdickungsmittel oder Haftmittel oder Emulgiermittel
hinzugibt, so daß man die gewünschte pharmazeutische Form erhält.
Die Produkte können außerdem kombiniert werden
mit einem Mittel, das eine bessere Verteilung in Geweben sicherstellt, wie einem polaren Lösungsmittel.
Die Dosierung ist im wesentlichen abhängig von dem
Weg und der Form der Verabreichung.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern.
Gewinnung der Glykoproteinfraktion ausgehend von einem Mikrobenlysat
Das Lysat, das man erhält ausgehend von 1 1 des Konzentrats der Kulturen der folgenden Stämme
Pneumokokken | 5 χ | lOVccm |
Streptokokken | 5 χ | lOVccm |
Micrococcus Catarrhalis | 5 χ | lOVccm |
Staphylokokken | 108ZcCm | |
Klebsellia Pneumoniae | lOVccm | |
Hämophilus lnfluenzae | lOs/ccm | |
durch Zusatz von Natriummethiolat wird im Vakuum eingeengt bis zu einer sirupartigen Konsistenz mit
einem Volumen von etwa 160 ecm.
Dieser Rückstand wird dann in etwa dem fünffachen Volumen von eisgekühltem Aceton aufgenommen. Man
gewinnt eine unlösliche Fraktion, die in die Hülse eines SOXHLET-Extraktors eingebracht wird. Man laugt
dann diese Fraktion während 8 Stunden mit siedendem Aceton kontinuierlich aus.
Nach dem Auslaugen mit Aceton führt man eine erneute Extraktion mit Äthyläther durch. Die so
entfettete feste Fraktion wiegt 20 bis 30 g. Sie wird aus der Hülse entnommen und bei 37°C getrocknet. Man
bringt sie dann in destilliertem Wasser in Lösung, so daß man eine 2O°/oige (Gewicht/Volumen) Lösung erhält.
Diese Lösung, die 24 Stunden bei 4°C gehalten wird, liefert einen starken kristallinen Niederschlag, der
hauptsächlich aus Natriumphosphat und Natriumsulfat besteht. Die überstehende Flüssigkeit wird durch
Filtration gewonnen.
Dann bewirkt man die Entfernung der Eiweißkörper aus dem Filtrat durch Erhitzen auf 1000C während 30
Minuten. Der proteinhaltige Niederschlag wird dann durch Zentrifugieren entfernt.
Die klare überstehende Flüssigkeit enthält im wesentlichen die Glykoproteinfraktion, die man durch
Zusatz einer Mischung aus gleichen Teilen Alkohol und Aceton ausfällt. Man erhält einen flockigen Niederschlag,
den man sich während 65 Minuten entwickeln läßt. Dieser Niederschlag wird dann durch Zentrifugieren
abgetrennt und bei 37°C getrocknet. Man gewinnt so 2 bis 4 g der Glykoproteinfraktion.
Diese Fraktion wird gereinigt durch Auflösen in Wasser, so daß man eine 20%ige Lösung erhält, und
durch Dialyse gegen Wasser.
Die so erhaltene Lösung wird durch Lyophilisierung zur Trockne gebracht. Man erhält so eine sehr
gereinigte Fraktion, die 1,4 bis 1,5 g wiegt.
Durch Filtration einer wäßrigen Lösung dieser letzten Fraktion über Cellulose SEPHADEX G 200 und
Eluierung mit Hilfe einer Pufferlösung vom pH =8 erhält man etwa 0,15 g einer sehr reinen Glykoproteinfraktion.
Diese Fraktion, die durch langsame α- und /J-Glykoproteine gebildet wird, enthält 20% gebundene
Hexosen. Ihr Gehalt an biuretogenen Substanzen, bestimmt durch Vergleich mit Serumalbumin als
Vergleichssubstanz, beträgt 10%.
Herstellung der Glykoproteine ausgehend
von einer Kultur von Klebsellia Pneumoniae
von einer Kultur von Klebsellia Pneumoniae
Herstellung des Kulturmediums
Fleischextrakt | 5g |
Natriumchlorid | 5g |
Caseinpepton | 5g |
Hefeautoiysat | 5g |
Bikaiiumphosphat | 3.5 g |
Monokaliumphosphat | 1.5 g |
Glucose | 10g |
Phyton | 20 g |
Destilliertes Wasser | |
zur Auffüllung auf | 1000 ecm |
werden zu dem Medium gegeben im Moment des Ansetzens, nachdem sie vorher in der Hitze während 20
Minuten sterilisiert worden waren.
Der Stamm von Klebsellia, der auf einem Geloser>
Nährboden kultiviert wurde, wird in 10 ecm Kulturbouillon, die mit Glaskügelchen versehen ist, verdünnt.
Dann vermischt man mit 50 ecm Bouillon. Diese Lösung dient als Inokulum durch Ausheberung für den Rest der
Kulturbouillon. Das Kulturmedium wird auf 37°C
i<) gehalten. Der pH-Wert des Kulturmediums wird durch
automatische Einstellung auf 7,4 bis 7,6 gehalten. Vorsichtshalber gibt man ein Antischaummittel hinzu
und regelt den Luftverbrauch und die Rührgeschwindigkeit in geeigneter Weise.
Γι Das Wachstum der Keime wird verfolgt mit Hilfe des
Photometers, und die Anzahl der Keime wird berechnet als Funktion der optischen Dichte, die bestimmt wurde
im Vergleich zu einer Eichkurve. Die Kultur erfordert etwa 7 Stunden. Nach vollständiger Entwicklung
2» enthalten die Kulturen ungefähr 120 Milliarden Keime
pro ecm.
Lysierung
Nach Beendigung der Kultur fügt man 80y/ccm
2r> Lysozymhydrochlorid, gelöst in einigen ecm sterilen
Salzwassers, zu.
Man läßt während 1 Stunde bei 56°C einwirken, und nach Überprüfung der Sterilität fügt man eine 2,5%ige
Lösung von Natriumäthylmercurithiosalicylat und eine to 33%ige Lösung von Polyäthylenglykolsorbat, im Handel
erhältlich als TWEEN 80, hinzu.
Man läßt die Lysierung bei diesen sterilen Bedingungen während 8 bis 15Tagen bei etwa 40°C ablaufen.
Der pH-Wert des Mediums wird anfänglich auf 7,4 bis 7,6 eingestellt Die Lösungen von Glucose und Phyton
Extraktion
Der bei der Lysierung entstehende Saft wird im Vakuum in einem Rotationsverdampfer oder durch
Lyophilisierung bis zu einem Drittel seines ursprünglidien Volumens eingeengt. Man erhält so ein rohes
Produkt von dunkler Färbung und sehr dicker Konsistenz.
Man kann gewünschtenfalls vor der Konzentrierung durch Zentrifugieren die Mikrobenkörper abtrennen.
Die überstehende Flüssigkeit wird dann konzentriert.
Lipoidentfcrnung
Der konzentrierte Saft wird in 5 Volumentcilen einer
w Mischung aus 1 Volumen Methanol und 4 Volumen Methylal in Suspension gebracht, die man langsam bei
Raumtemperatur unter heftigem Rühren hinzugibt.
Fortschreitend fällt ein dichter, manchmal zusammcnhaftender,
stark gefärbter Niederschlag aus. Die
« überstehende Flüssigkeit selbst ist braun gefärbt.
Man läßt den Niederschlag während 15 Minuten absitzen und zieht den größten Teil der überstehenden
flüssigen Phase ab.
Die feste Fraktion wird dann in einen Filtertrichter
Die feste Fraktion wird dann in einen Filtertrichter
bo überbracht und im Vakuum abgesaugt. Anschließend wäscht man zweimal mit 5 Volumen Aceton. Man bringt
dann den Niederschlag in einem minimalen Volumen Aceton in Suspension und führt ihn in die Hülse einer
Vorrichtung zur kontinuierlichen Extraktion über.
Man laugt diese Fraktion während 3 Tagen mit Aceton aus. Nach Ablauf dieser Zeit beendigt man das
Erwärmen, nimmt die Hülse und isoliert die feste Fraktion. In diesem Stadium der Reinigung zeigt sich die
Glykoproteinfraklion in Form eines mehr oder weniger agglomerierten Pulvers von brauner oder gelbbrauner
Farbe.
Eiweißkörperentfernung
Die von Lipoiden befreite Glykoproteinfraktion wird in einer Menge Wasser, die dem Vierfachen seines
Gewichts entspricht, in Lösung gebracht und dann während 3 Tagen im Eisschrank bei etwa 4°C
aufbewahrt.
Es entsteht eine schlammige Masse, die durch proteinartige denaturierte Verbindungen gebildet wird,
und eine kristalline Masse, die durch Mineralsalze und im wesentlichen durch Alkaliphosphate gebildet wird.
Man filtriert den Niederschlag durch ein Papier- oder Gazefilter, um die feste Fraktion abzutrennen. Das
Filtrat wird dann zentrifugiert.
Ausfällung der Glykoproteine
Die überstehende klare Lösung wird mit 5 Volumen einer Mischung behandelt aus 1 Volumen Methanol und
4 Volumen Methylal, die im Verlauf 1 Stunde unter hefigem Rühren zugegeben wird.
Der gebildete sandgelbe Niederschlag wird gewonnen, schnell mit Aceton gewaschen und über Phosphorpentoxyd
im Vakuum während 24 bis 48 Stunden getrocknet.
Nach der fast vollständigen Entwässerung wird das Produkt verrieben und erneut bei 45°C während 3 bis 4
Tagen getrocknet.
Man erhält so 6 bis 12 g Glykoproteine, die leicht gelblich gefärbt sind, aus 1 I Kulturmedium.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von Pneumokokken
ausgehend von Pneumokokken
Die Verfahrensweise ist identisch, mit der einzigen Ausnahme, daß das Inoculum mit 3,5% einer zusätzlichen
Nährlösung versetzt wird. Man stellt eine Mutterlösung her aus:
Kulturdauer beträgt etwa 20 Stunden. Das Medium enthält dann 120 Milliarden Keime pro ecm.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von einer Streptokokkenkultur
ausgehend von einer Streptokokkenkultur
Die Verfahrensweise ist identisch mit der, die in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Züchtungsdauer beträgt
in 20 Stunden. Das Medium enthält dann 100 Milliarden
Keime pro ecm.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von Staphylokokkenkulturen
ausgehend von Staphylokokkenkulturen
Das Medium wird entsprechend dem in Beispie! 2 beschriebenen Verfahren angesetzt.
Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf 7.2 gehalten. Die Züchtungszeit beträgt 7 Stunden. Das
Medium enthält dann 80 Milliarden Keime pro ecm.
Die darauf folgenden Stufen sind identisch mit den in Beispiel 2 beschriebenen.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von Neisseria Catarrhalis
ausgehend von Neisseria Catarrhalis
Die Verfahrensweise ist die gleiche, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist. Das Medium wird im Moment des
Ansetzens durch Zugabe von 3% steriler Bauchwassersucht-Flüssigkeit angereichert.
Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf 7 eingestellt. Die Züchtungsdauer beträgt 25 Stunden.
Die Kultur enthält am Ende dieser Zeit 80 Milliarden Keime pro ecm.
Herstellung einer Glykoproteinfraktion
ausgehend von einer Mischung von Mikrobenstämmen,
die aus
Backhefe
Destilliertes Wasser
Destilliertes Wasser
250 g
2000 ecm
2000 ecm
Man läßt während 5 Minuten unter dauerndem Rühren sieden. Man filtriert in der Wärme über ein
Papierfilter. Zu 100 ecm dieser Lösung gibt man 40 g
Glucose und füllt mit destilliertem Wasser auf 1000 ecm auf.
Der pH-Wert der Lösung wird auf 8 eingestellt. Man
sterilisiert diese Lösung 1 Stunde bei 1100C. Die
Pneumokokken
Staphylokokken
4> Streptokokken
Pneumokokken
Neisseria Catarrhalis
Klebsellia pneumoniae
Staphylokokken
4> Streptokokken
Pneumokokken
Neisseria Catarrhalis
Klebsellia pneumoniae
120 ■ 109Keime/ccm
80 ■ 109Keime/ccm
80 ■ 109Keime/ccm
100 · 109Keime/ccm
120 · 109Keime/ccm
80 · 109Keime/cem
80 · 109Keime/cem
120 - lO'Keime/ccm
besteht.
Die Verfahrensweise ist identisch mit der, die in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Ausbeute der aktiven
Fraktion beträgt etwa 8 g.
Claims (1)
1. Langsame α- und j3-Glykoproteine aus Mikrobenkörpern,
erhältlich durch
a) Kultivierung eines Mikrobenstammes, ausgewählt aus der Gruppe von Pneumokokken,
Streptokokken, Neisseria, Staphylokken, Mikrokokken, Klebsieila pneumoniae und Haemophilus
influenzae oder einer Mischung von zwei oder mehreren dieser Stämme oder einer
Mischung von verschiedenen Typen eines dieser Stämme, wobei man die Mikrobenkörper
nach vollständiger Kultivierung manuell oder automatisch sammelt und in einem wäßrigen
Medium suspendiert,
b) in der Suspension die Mikrobenkörper chemisch, physikalisch und/oder enzymatisch Iysiert
und die Reste der Mikrobenkörper physikalisch abtrennt,
c) die so erhaltene klare Lösung eindampft, den Rückstand mit Lipoidlösungsmitteln behandelt,
d) das von Lipoiden befreite Produkt in einem wäßrigen Lösungsmittel löst, daraus die Eiweißkörper
physikalisch fällt und entfernt und
e) aus der erhaltenen klaren, wäßrigen Lösung die langsamen Glykoproteine durch Zugabe eines
mit Wasser mischbaren Lösungsmittels oder einer Mischung derartiger Lösungsmittel ausfällt
und gegebenenfalls durch in der Biochemie übliche Verfahren weiter reinigt.
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |