DE2737060C2

DE2737060C2 - Escherichia coli-Neurotoxin

Info

Publication number: DE2737060C2
Application number: DE2737060A
Authority: DE
Inventors: Lucia Brüssel/Bruxelles Dobrescu; Constant Huldenberg Huygelen; Frans Ottenburg Van Wijnendaele
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-08-18
Filing date: 1977-08-17
Publication date: 1986-07-31
Also published as: JPS6141324B2; NL7709085A; FR2448902A1; US4136181A; DE2737060A1; FR2361913B1; JPS5324011A; GB1581776A; BE857794A; FR2361913A1; FR2448902B1

Description

Die Ödemkrankheit der Ferkel, die auch als Enterotoxämie bezeichnet wird, ist eine akute Erkrankung mit klinischen Symptomen wie Ataxie, Krämpfen und partieller oder vollständiger Paralyse. Die pathologisch-anatomischen Charakteristika sind Ödeme verschiedener Organe, hauptsächlich der Magenwand, des Mesenteriums vom gewundenen Colon und des Hirns.

Über die Ätiologie der Krankheit gibt es verschiedene Arbeitshypothesen. Heute weiß man, daß diese Krankheit durch ein spezifisches Toxin hervorgerufen wird, das als Neurotoxin bezeichnet und durch pathogene Stämme von Escherichia coli erzeugt wird.

W. ]. Sojka hat in Res. Vet. Sei., Bd. 1 (1960), S. 17 bis 27, die am häufigsten vorkommenden E. coli-Serotypen

beschrieben, die bei Fällen von Ödemkrankheit bei Ferkel isoliert wurden. H. Schimmelpfennig hat im ZbI. Vet.

Med., Bd. 18 (1971), S. 622 bis 633, aufgezeigt, daß das Neurotoxin durch die E. coli-Serotypen erzeugt wird, die

von an Ödemkrankheit leidenden Ferkeln überwiegend isoliert wurden, nämlich den Serotypen 0138, 0139 und

Es wurde von mehreren Forschern vermutet, daß das Neurotoxin die Lipoprotein-Fraktion des gesamten E. coli-Endotoxinkomplexes sei; vgl. Doktorarbeit von H. van Haeringen: E. coli infecties bij biggen, frequentie en pathogeniteit van verschillende typen, Utrecht 1974; H. Schimmelpfennig: Untersuchungen zur Ätiologie der Ödemkrankheit des Schweines, Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg; 1970; L. Mesrobseanu u. Mitarb., Ann. N. Y. Acad. Sei., Bd. 133 (1966), S. 658 bis 699. Versuche zur Abtrennung des Neurotoxins vom Endotoxinkomplex blieben jedoch erfolglos; vgl. H. Schimmelpfennig, a.a.O.

Die aktive Immunisierung gegen die Ödemkrankheit der Ferkel wurde mit verschiedenen E. coli-Präparaten versucht, die entweder aus vollständigen E. coli-Keimen oder deren Lysaten bestanden; vgl. W. J. Sojka, E. coli in domestic animals and poultry; herausgegeben vom Connonwealth Agricultural Bureau, 1965, S. 124; E. Kauker: Dtsch. Tierärztl. Wochenschr., Bd. 78 (1971), S. 182 bis 184, und K. Lutter: Mhft. Vet. Med., Bd. 29 (1974), S. 694 bis 699. Diese Präparate ergaben jedoch entweder keinerlei Schutz bei den Ferkeln oder riefen nur eine serotypspezifische Immunität hervor, die dem im Präparat verwendeten E. coli-Serotyp entsprach.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Escherichia coli-Neurotoxin mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 100 000 aus E. coli-Zellen eines Serotyps zu schaffen, der die Ödemkrankheit bei Ferkeln hervorruft. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Lösung dieser Aufgabe beruht darauf, daß es jf|

nach der von ]. Sourek u. Mitarb., Ann. Biol. Inst. Pasteur, Bd. 124 A (1973), S. 45 bis 60, beschriebenen Methode p_

zur Abtrennung von Shigella-Neurotoxin aus Shigella-Endotoxin erfindungsgemäß gelungen ist, das E. coli- fjj

Neurotoxin zu isolieren, das für die Ödemkrankheit der Ferkel verantwortlich ist. $j

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die Isolierung des E. coli-Neurotoxins aus einer |i

Kultur eines E. coli-Serotyps, der die Ödemkrankheit bei Ferkeln hervorzurufen vermag, beispielsweise dem K^

Serotyp 0138,0139 oder 0141 und die Verabfolgung des isolierten Neurotoxins mit einem Adjuvans auf subcuta- ||

bo nem oder intramuskulärem Weg Ferkel gegen die Ödemkrankheit wirksam geschützt werden. ψ

Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände. jp

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht somit in der Isolierung von E. coli-Neurotoxin und seine '*>"

Verwendung in einem Impfstoff zum Schutz von Ferkel gegen die Ödemkrankheit.

Das E. coli-Neurotoxin der Erfindung hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 000, bestimmt durch Gelchromatographie an Agaroseperlen mit einem Agarosegehalt von etwa 6% (Sepharose 6B). Es wird aus dem von Zelltrümmern befreiten Überstand von aufgebrochenen Zellen einer Kultur eines E. coli-Serotyps erhalten, der die Ödemkrankheit der Ferkel hervorruft, beispielsweise E. coli vom Scrotyp 0138,0139 oder 0141. ' ·

Das rohe Neurotoxin wird mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Die Fällung wird abgetrennt und in Celluloseacetat- ^!

Schläuchen gegen fließendes Wasser dialysiert Sodann wird die Lösung, d. h. das Retentat, sterilisiert und gefriergetrocknet. Das Rohpräparat wird in einer wäßrigen Pufferlösung gelöst, beispielsweise einem 0,2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure-Puffer (Tris-HCl) vom pH-Wert 8. ergänzt mit 0,15 M Natriumchlorid und 1% Natrium-dodecylsulfat (SDS). Die Lösung wird an Agarosegelperlen mit beispitlsweise einem Agarosegehait von 6%, wie Sepharose 6B, chromatographisch gereinigt und mit Tris-NaCI eluiert. Diese Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 000 wird schließlich durch Ultrafiltration, insbesondere an einer Diaflo-Membran, konzentriert. Es stellt das vom E. coli-Endotoxinkomplex abgetrennte Neurotoxin dar.

Zur Herstellung eines Impfstoffs wird der pH-Wert der konzentrierten Lösung beispielsweise mit 1 N-SaIzsäure auf einen Wert von 63 ±0,1 eingestellt und die Lösung bis zur Sättigung und vorzugsweise am Sättigungspunkt an Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat als Adjuvans adsorbiert. Vorzugsweise wird als Adjuvans ein Aluminiumhydroxidgel verwendet, das unter dem Namen Alhydrogel im Handel erhältlich ist

Das Mengenverhältnis von Neurotoxin zu Adjuvans wird vorzugsweise so eingestellt, daß eine maximale Adsorption des Neutrotoxins an das Adjuvans erfolgt; vgl. Symp. Series Immunobiol. Standard, Bd. 6 (1967), S. 173 bis 180.

Beispielsweise wird 1 Volumteil einer konzentrierten Neurotoxiniösung, die 4 mg Protein pro ml enthält, mit 0,4 Volumteiien einer 2prozentigen wäßrigen Lösung des Aluminiumhydroxidgels versetzt und die Adsorption des N euro toxins an das Gel durch einen Ausfällungstest mit Trichloressigsäure verfolgt. Zur Abtrennung des Endotoxins vom Neurotoxin kann auch ein Gemisch eines Aluminiumhydroxidgels und pulverisierter Cellulose verwendet werden.

Der Impfstoff der Erfindung enthält somit eine wirksame Menge von E. coli-Neurotoxin aus einer Kultur eines E. coli-Serotyps, der die Ödemkrankheit der Ferkeln hervorrufen kann, beispielsweise den Serotypen 0138,0139 oder 0141, insbesondere den Serotypen 0139, d. h. dem E. coli-Stamm ATCC 31165, adsorbiert an einer wirksamen Menge Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, insbesondere Aluminiumhyroxidgel als Adjuvans. Die wirksame Menge des E. coli-Neurotoxins beträgt mindestens 80 mg, berechnet auf der Basis seines Proteingehalts.

Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff kann Ferkeln intramuskulär oder subcutan verabreicht werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

B e i s ρ i e 1 1

Präparation der Einsaat-Kulturen

Der E. coli-Stamm ATCC 31165 wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung rehydratisiert und 18 Stunden bei 37°C in Petrischalen inkubiert, die jeweils 20 ml Tryptose-Agar als festen Nährboden enthalten. Dieser Nährboden wird durch Vermischen von 26 g Tryptose-Brühe, 30 g Agar und Auffüllen mit Wasser auf 1 Liter und 45minütiges Erhitzen auf 115°C hergestellt.

Sodann wird ein flüssiges Kulturmedium (nachstehend kurz mit PP3 bzeichnet) folgendermaßen hergestellt: 30 g Proteose-Pepton Nr. 3,4 g Hefeextrakt und 5 g Dextrose werden in 1 Liter Wasser bei 6O⁰C gelöst. Nach dem Abkühlen werden 5 g Natriumchlorid, 5,05 g NaHPC>4 und 1,2 g KH2PO4 zugegeben. Das Kulturmedium, dessen pH-Wert 6,9 bis 7,0 beträgt, wird durch ein Seitz-EKS-Filter filtriert und in 100 ml fassende Kulturkolben abgefüllt.

Diese Kulturkolben werden mit den auf den Petrischalen erhaltenen E. coli-Kolonien beimpft. Es wird eine Kolonie pro 20 ml PP3 flüssiges Medium verwendet. Das beimpfte Kulturmedium wird 6 Stunden bei 37° C unter Schütteln auf einer Drehnschüttelmaschine (22 bis 24 Anschläge pro Minute) geschüttelt.

Produktionsphase von E. coli

6 ml Anteile des E. coli enthaltenden Nährmediums einer Einsaatdichte von etwa 6 · 10⁹ werden in Produktionsflaschen überimpft, die 300 ml PP3 flüssiges Medium enthalten. Die Kulturen werden 24 Stunden unter Schütteln auf einer Drehschüttelmaschine mit 22 bis 24 Ausschlägen pro Minute inkubiert.

Die Ernte von 5 Produktionskolben (eine Reihe) wird gepolt und jede Erntereihe 2 Stunden bei 2000 g zentrifugiert. Das Sendiment wird in 150 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Die Zellensuspension wird 30 Minuten bei einem Branson-Europa-Ultraschallgerät, Modell J 22, beschallt. Das Medium wird dabei im schmelzenden Eisbad gehalten.

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension 2 Stunden bei 5°C und 2000 g zentrifugiert, um die Zelltrümmer abzutrennen. Der Überstand wird durch ein Bakterienfilter einer Porenweite von 0,45 Mikron filtriert. Es werden 100 ml Filtrat erhalten.

Mit Äthylenoxid sterilisiertes Ammoniumsulfat wird dem Filtrat bis zur 50prozentigen Sättigung zugegeben; hierzu sind 380 g Ammoniumsulfat pro Liter Filtrat erforderlich. Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperutur stehengelassen. Das erhaltene Präzipitat wird 2 Stunden bei 5°C und 2000 g zentrifugiert.

Das erhaltene Sediment wird in einen Celluloseacetat-Dialyseschlauch eingegossen, dessen Porosität einem Molekulargewicht von 10³ bis 1510³ entspricht, und gegen laufendes Wasser dialysiert, bis die Ammoniumsulfat-Konzentration auf 0,1 bis 0,01 Gewichtsprozent pro Volumen vermindert ist. Der Ammoniumsulfatgehalt wird mit Nesslers Reagens bestimmt. öS

Das erhaltene Neurotoxinpräparat wird durch ein Bakterienfilter mit einer Porenweite von 0,45 Mikron filiriert und das erhaltene sterile Filtrat gefriergetrocknet.

Herstellung des rohen Neurotoxinpräparates

Eine Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 100 cm wird mit Agarosegelperlen mit einem Agarosegehalt von etwa

6% (Sepharose 6B), suspendiert in Tris-HCl-Puffer (0,2 M, pH-Wert 8,0) und ergänzt mit 0,15 M NaCi, gefüllt.

Nach dem Äquilibrieren bei 4^CC werden auf die Säule 170 mg rohes Neurotoxinpräparat, gelöst in 5 ml Tris-NaCl-Puffer ergänzt mit 2,5 ml SDS 1%, gegeben. Die Säule wird mit Tris-NaCl-Puffer in einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 ml pro Stunde eluiert. Im Eluierungsprofil treten zwei Hauptmaxima auf. Das eine wird mit einem Volumen entsprechend einem Molekulargewicht (Mgw.) von 10^b bis 4 · 10⁶ eluiert während das andere mit einem Volumen entsprechend einem Mgw. von etwa 100 000, beide berechnet nach der Elutionsvoiumentechnik.

ίο eluiert

Das Produkt mit einem Mgw. von etwa 100 000, das als Neurotoxin durch seine in-vivo-Wirkungen identifiziert wurde, wird auf Diaf!o-UM-20E-Membranfiltern konzentriert

Der pH-Wert des konzentrierten Präparats wird mit 1 N-Salzsäure auf 6,3 eingestellt, und 1 Volumteil (4 mg

Protein pro ml) ues Neurotoxinpräparats wird mit 0,4 Volumteilen einer 2prozentigen wäßrigen Lösung eines Aluminiumhydroxidgels versetzt. Die Adsorption des Neurotoxins am Aluminiumhydroxidgel wird durch den Präzipitationstest mit Trichloressigsäure verfolgt Das Sediment wird isoliert, getrocknet und in Ampullen abgefüllt, die Dosierungseinheiten oder ihr Mehrfaches enthalten.

Vor der Schutzimpfung wird das Sediment mit einem Gemisch gleicher Volumteile Sörensen-Puffer (Na₂HPO₄ M/10: 22%, KH₂PO₄ M/10: 78%) vom pH-Wert 6,3 und physiologischer Kochsalzlösung rehydratisiert

Beispiel 2

5 Wochen alte Ferkel werden subcutan mit 80 mg (berechnet durch den Proteingehalt) des an Aluminiumhydroxidgel als Adjuvans adsorbierten Neurotoxins geimpft.

Einen Monat später wird eine Dosis von 20 mg adjuvansfreiem Neurotoxin intravenös injiziert.
Eine Woche nach der Auffrischimpfung werden die geimpften Ferkel und die Kontrolltiere intravenös mit 1,5 mg Neurotoxin pro kg Körpergewicht belastet.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle I

Ferkel Ergebnisse des Belastungstests

Mortalität ohne Augenlidödem Ataxie Krämpfe Lähmung

vorherige Symptome

Impfling

2

3 - - -

A __

Kontrolltier

7 +

11 - + + + +

12 - -

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß keines der geimpften Ferkel die Symptome der Ödemkrankheit zeigt, während 6 von 8 Kontrolltieren die Symptome der Krankheit zeigen und eines stirbt.

Beispiel 3

5 Wochen alte Ferkel werden gemäß Beispiel 2 geimpft, jedoch mit einer intravenösen Auffrischimpfung von 10,8 mg anstelle von 20 mg.

2 Wochen nach der Auffrischimpfung werden die geimpften Ferkel und die Kontrolltiere gemäß Beispiel 2 belastet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Ferkel Ergebnisse des Belastungstests

Mortalität ohne Augenlidödem Ataxie Krämpfe Lähmung

vorherige Symptome

Impfling

15 - -

16 - -

17 - ____₁₀

Kontrolltier

18 - + +

20 - 15

Keines der geimpften Ferkel zeigt Symptome der Ödemkrankheit, während zwei der drei Kontrolltiere erkrankten.

B e i s ρ i e 1 4 20

5 Woche alte Ferkel werden subcutan mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten an Adjuvans adsorbierten Neurotoxin geimpft. Eine Tiergruppe erhielt zwei Impfdosen von jeweils 80 mg, während die andere Tiergruppe Dosen von jeweils 20 mg erhielt. Einen Monat nach der Impfung werden die geimpften Ferkel und die Kontrolltiere gemäß Beispiel 2 und 3 belastet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle III zusammengefaßt. 25

Tabelle III

Ferkel Ergebnisse des Belastungstests

Mortalität ohne Augenlidödem Ataxie Krämpfe Lähmung jq

vorherige Symptome

Impfling mit
80 mg Neurotoxin 35

21 - - -

22 - -

23 - -

Impfling mit 40

20 mg Neurotoxin

24 - -

25 - -

26 - 45

Konirolltier

27 - + +

28 - -

29 - 50

Aus den Beispielen 2,3 und 4 ist ersichtlich, daß keines der geimpften Tiere die Symptome der Ödemkrankheit nach intravenöser Belastung mit E. coli-Neurotoxin zeigt, während 9 von 14 Kontrolltieren eines oder mehrere klinische Merkmale der Krankheit zeigen.

55 Beispiel 5

Ein Neurotoxin-Rohpräparat wird gemäß Beispiel 1 hergestellt und gefriergetrocknet.

50 ml Aluminiumhydroxidgel in 0,08 M Phosphatpuffer (KH₂P(VNaOH, pH-Wert 8) werden mit 100 g CeI-luoscpulver D-510 vermischt. Eine Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 30 cm wird mit dem Gemisch gefüllt und bei 60 4"C mit 0.01 M Phosphatpulver(KH₂P(VNaOH,pH-Wert 8)äquilibriert.

Ein 43-mg-Anteil des Rohpräparats wird in 43 ml eines 0,01-M-Phosphatpuffers (pH-Wert 8) gelöst. Die Lösung wird auf die Säule gegossen, die sodann mit einem linearen Gradienten von 0,01 M bis 0,4 M Phosphatpuffer eluiert wird.

Unter diesen Bedingungen treten im Eluierungsprofil zwei Hauptmaxima auf. Das erste Maximum wird bei 65 der 0,01-M-Phosphatpufferkonzentration eluiert Es enthält das Endotoxin. Das zweite Maximum wird bei der Konzentration zwischen 0,25 M und 0,4 M Phosphatpuffer eluiert, und es enthält das vom Endotoxin befreite Neurotoxin.

Claims

Patentansprüche:

1. Escherichia coli-Neurotoxin, dadurch gekennzeichnet, daß es erhalten worden ist aus der von Zelltrümmern gereinigten Suspension aufgebrochener Zellen einer Kultur eines E. coli-Serotyps, der die

Ödemkrankheit bei Ferkeln hervorruft. Fällung des rohen Neurotoxins mit Ammoniumsulfat, Abtrennen der Fällung und Dialyse cer Fällung im Celluloseacetat-Schlauch gegen laufendes Wasser, Sterilisieren und Gefriertrocknen des Retentats, Auflösen des Rohpräparates in einer wäßrigen Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8, Reinigung der erhaltenen Lösung durch Säulenchromatographie, Eluieren mit dem gleichen Lösungsmittel und Konzentrieren der Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 000

ίο auf Membranfiltern.

2. Verfahren zur Herstellung des Escherichia coli-Neurotoxins gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der von Zelltrümmern gereinigten Suspension aufgebrochener Zellen einer Kultur von E. coli eines Serotyps, der die Ödemkrankheit bei Ferkeln hervorruft, das rohe Neurotoxin mit Ammoniumsulfat ausfällt und die Fällung abtrennt, sie im Celluloseacetat-Schlauch gegen laufendes Wasser dialysiert, das Retentat sterilisiert und gefriertrocknet, das Rohprodukt in einer wäßrigen Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8 auflöst, die erhaltene Lösung durch Säulenchromatographie und Eluieren mit dem gleichen Lösungsmittel reinigt und die Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 000 auf Membranfiltern konzentriert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm E. coli ATCC 31165 einsetzt.

4. Verwendung des Escherichia coli-Neurotoxins nach Anspruch 1, adsorbiert an Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat als Adjuvans, in Form eines intramuskulär oder subcutan verabreichbaren Impfstoffs zur Bekämpfung der Ödemkrankheit bei Ferkeln.