DE3877818T2 - Verfahren zur beseitigung von pertussisendotoxin, ein pertussistoxoid und seine herstellung. - Google Patents
Verfahren zur beseitigung von pertussisendotoxin, ein pertussistoxoid und seine herstellung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen von Pertussisendotoxin, ein Pertussistoxoid, und ein Verfahren zur Herstellung desselben.
- Pertussis/Keuchhusten ist eine ansteckende infektiöse Krankheit, die von Bordetella pertussis hervorgerufen wird, und hat bei Säuglingen und kleinen Kindern einen schweren Verlauf.
- Bisher sind zur Vorbeugung gegen diese Krankheit Impfstoffe verwendet worden. Jedoch erzeugt jeder unter Verwendung des gesamten B. pertussis-Organismus hergestellte Impfstoff intensive Gegenreaktionen wie Fieber, und um diesen Nachteil zu beseitigen, ist ein azellularer Pertussisimpfstoff (ACP-Vakzin) entwickelt und eingesetzt worden, der im wesentlichen frei von Endotoxin (ET) ist, das hauptsächlich für Fieber und andere Gegenreaktionen verantwortlich ist, indem die antiinfektive Fraktion (die in der Folge manchmal als Schutzfraktion bezeichnet wird) isoliert wurde, wie filamentöses Hämagglutinin (FHA), Pertussistoxin (PT) und Fimbriae.
- Der entscheidendste Schritt bei der Herstellung eins ACP-Impfstoffes ist die Trennung von Endotoxin (ET) von der antiinfektiven Fraktion, und im allgemeinen ist zu diesem Zweck Saccharaosegradientenzentrifugation durchgeführt worden (japanische ungeprüfte Patentveroffentlichung Nr. 57-50925, die der EP-A-0047802 entspricht).
- Des weiteren ist als eine Technik zum Entfernen von Pyrogen das Verfahren bekannt geworden, bei dem Kalziumphosphatgel eingesetzt wird (japanische Patentveröffentlichung Nr. 34-2149). Es ist auch bekannt, daß Hydroxylapatitgel, eine stabilisierte Variante von Kalziumphosphatgel, für die Abtrennung von filamentösem Hämagglutinin (FHA) von Pertussistoxin (PT) wirksam ist und daß ein endotoxinfreies (im wesentlichen freies) filamentöses Hämaglutinin vom Pertussistoxin durch Chromatographie auf Hydroxylapatitgel und weitere Reinigung durch Affinitätschromatographie und Saccharaosegradientenzentrifugation abgetrennt werden kann (Japanese Journal of Bacteriology, 38 (1), 423, 1983).
- Saccharaosegradientenzentrifugation alleine ist fähig, etwa 99,995% des Endotoxins (ET) zu entfernen, aber da das rohe antiinfektive Fraktion enthaltende Fluid reich an Endotoxin (ET) ist, ist die vollstände Abtrennung der Schutzfraktion vom Endotoxin (ET) schwer zu erreichen, und die Ausbeute an antiinfektiver Fraktion ist demgemäß nicht hoch. Darüber hinaus ist das Verfahren, da das Produktionsvolumen gering ist und hohe Kosten und viel Zeit erforderlich sind, für kommerzielle Zwecke nicht zufriedenstellend.
- Anderseits wird lediglich durch Behandlung mit Kalziumphosphatgel nur eine geringe Endotoxineliminationsrate von etwa 90 bis 99,9 % gewährleistet und diese ist daher für praktische Zwecke nicht nützlich. Es ist im Labormaßstab möglich, ziemlich endotoxinfreies Hämagglutinin (FHA) durch Isolation vom Pertussistoxin (PT) abzutrennen und zu reinigen durch eine Kombination aus Hydroxylapatitsäulenchromatographie, Affinitätschromatographie und Saccharosegradientenzentrifugation, aber dieses Verfahren gewährleistet keine kommerziell nützliche Ausbeute. Des weiteren unterscheidet sich die eingesetzte Technik was das Ziel betrifft von der vorliegenden Erfindung, die auf das Entfernen von Endotoxin (ET) von einer Flüssigkeit gerichtet ist, welche die Schutzfraktion und Endotoxin (ET) enthält.
- Gegenüber dem obigen technischen Hintergrund haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes ein wirksames Verfahren zum Entfernen des Endotoxins (ET) erforscht und herausgefunden, daß eine Behandlung mit Kalziumphosphatgel, die der Saccharosegradientenzentrifugation vorangeht, zu einer sehr sauberen Abtrennung der Schutzfraktion vom Endotoxin (ET) führt und des weiteren, sowohl was das Produktionsvolumen, als auch was die Entfernungsrate von Endotoxin (ET) über Saccharosedichtezentrifugation betrifft, Verbesserungen bringt. Diesen Erkenntnissen folgte weitere Forschung, deren Höhepunkt die vorliegende Erfindung bildete.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich daher auf (1) ein Verfahren zum Entfernen von Endotoxin aus einem Fluid, das die antiinfektive Fraktion und Endotoxin von Stämmen von Phase I Bordetella pertussis enthält, durch Zonenzentrifugation, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Fluid vor der Zonenzentrifugation mit Kalziumion in der Gegenwart von überschüssigem Phosphation versetzt und der resultierenae Niederschlag verworfen wird; (2) ein Verfahren zur Herstellung eines Pertussistoxoids, gekennzeichnet durch das Entgiften eines antiinfektive Fraktion enthaltenden Fluids, das durch obiges Verfahren erhalten wurde und (3) ein Pertussistoxoid, dessen Endotoxingehalt pro 10 ug Eiweißstickstoff nicht mehr als 0,5 ng beträgt.
- Durch das Pertussisendotoxin-Entfernungsverfahren gemäß vorliegender Erfindung kann die Abtrennung der antiinfektiven Fraktion vom Endotoxin sicherer und sauberer gemacht werden, mit dem Ergebnis, daß die Schutzfraktion leicht in verbesserter Ausbeute isoliert werden kann. Des weiteren kann, da ein großes Volumen an Ausgangsmaterial der Zonenzentrifugation unterworfen werden kann, die Ausbeute an Pertussistoxoid mehr als verdoppelt werden, wobei das Endotoxin mit hoher Effizienz entfernt wird. Deshalb ist der industrielle Wert der vorliegenden Erfindung beträchtlich.
- Des weiteren beträgt der Endotoxingehalt des Pertussistoxoids gemäß vorliegender Erfindung im Vergleich zum herkömmlichen Toxoid weniger als 1 Zehntel, der Einsatz des erfindungsgemäßen Pertussistoxoids ermöglicht der Industrie, Impfstoffe zu erzeugen, welche die gleiche immunologische Potenz besitzen wie herkömmliche Impfstoffe und dennoch verringerte Toxizität aufweisen.
- Das obengenannte Fluid, das die antiinfektive Fraktion und Endotoxin von Stämmen von Phase I Bordetella pertussis enthält, kann beispielsweise der Überstand einer Kulturbrühe sein, die durch Züchten von Stämmen von Phase I B.pertussis erhältlich ist, oder ein Konzentrat davon, und im speziellen wird das Konzentrat bevorzugt. Die Kultur aus Stämmen von Phase I Bordetella pertussis kann auf herkömmliche Weise gezüchtet werden. So werden die Organismen beispielsweise in einem Brühemedium (wie Cohen-Wheeler-Medium oder Stainer-Scholte-Medium) bei etwa 35-37ºC etwa 5-7 Tage gezüchtet. Der Überstand einer so erhaltenen Kulturbrühe wird gesammelt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Dieser Überstand kann direkt oder nach der Einengung dem nächsten Schritt unterworfen werden, um Endotoxin zu entfernen. Die Einengung zu diesem Zweck kann unter Einsatz der an sich bekannten Aussalzungstechnik durchgeführt werden. Zum Beispiel werden jeweils 10 l des Kulturüberstands 2 bis 5 kg Ammoniumsulfat hinzugefügt, und der resultierende Niederschlag wird gesammelt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Dieser Niederschlag wird dann in einer geeigneten Menge 1 M Natriumchlorid-0,05 M Phosphatpuffer aufgelöst, und die Lösung wird zentrifugiert oder auf andere Weise behandelt, um den Überstand abzutrennen.
- Das Entfernen von Endotoxin gemäß vorliegender Erfindung umfaßt das Versetzen eines Fluids, das die antiinfektive Fraktion und Endotoxin von Stämmen von Phase I Bordetella pertussis enthält, mit Kalziumion in der Gegenwart eines Überschusses an Phosphation, das Verwerfen des resultierenden Niederschlags und das Unterwerfen des Mutterfluids der Zonenzentrifugation.
- Wenn im Materialfluid kein Phosphation vorhanden ist, wird eine Phosphatpufferlösung wie beispielsweise 0,05 M Phosphatpuffer, ergänzt mit 1 M Natriumchlorid, dem Fluid hinzugefügt, und dann wird Kalziumion zugefügt. Das zuzufügende Kalziumion kann ein jedes solcher löslicher Kalziumsalze wie Kalziumacetat, Kalziumchlorid, Kalziumnitrat usw. und unlöslicher Kalziumsalze wie Kalziumphosphat usw. sein. Besonders bevorzugt werden Kalziumacetat und Kalziumchlorid.
- Das Verhältnis zwischen Phosphation und Kalziumion beträgt etwa 1,25 bis 30 Äquivalente, vorzugsweise etwa 1,5 bis 7,5 Äquivalente an Phosphation pro Äquivalent Kalziumion, und es wird empfohlen, sicherzustellen, daß etwa 0,01 bis 0,1 Milliäquivalente/ml, vorzugsweise etwa 0,02 bis 0,07 Milliäquivalente/ml Kalziumphosphatgel gebildet wird.
- Eine typische Vorgangsweise ist die folgende. Man geht davon aus, daß, wenn der durch fraktionierte Ausfällung des Überstands einer Kulturbrühe aus Stämmen von Phase I Bordetella pertussis unter Einsatz von Ammoniumsulfat erhaltene Niederschlag in 1 M Natriumchlorid-0,05 M Phosphatpuffer aufgelöst wird, Kalziumacetat mit einer Endkonzentration von etwa 0,1 bis 1,0 % (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 0,2 bis 0,6 % (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert von etwa 6,5-9 hinzugefügt wird, und die Mischung wird allmählich bei etwa 4ºC - Raumtemperatur etwa 20 Minuten bis 2 Stunden lang umsetzen gelassen, um ein Kalziumphosphatgel zu ergeben. Nach dieser Reaktion wird der resultierende Niederschlag durch ein an sich bekanntes Verfahren wie Filtration oder Zentrifugation entfernt. Durch diese Vorgangsweise können etwa 90 bis 99,9 % des Endotoxins ohne wesentliche Verluste an Schutzfraktion selektiv entfernt werden.
- Das wie oben erhaltene halb-rohe Produkt wird weiter der Zonenzentrifugation unterworfen, vorzugsweise nach weiterer Einengung durch Ammoniumsulfataussalzen (fraktionierte Ausfällung).
- Bei der erfindungsgemäßen Zonenzentrifugation kann es sich um jede aus Saccharosegradientenzentrifugation, Kaliumtartratdichtezentrifugation, Cäsiumchloridgradientenzentrifugation usw. handeln, obwohl Saccharosegradientenzentrifugation besonders bevorzugt wird. Die üblichen Bedingungen der Saccharosegradientenzentrifugation sind: Dichtegradient: 0-30 Gew.-%, Rmax: etwa 60.000 - 122.000 G; Zeit etwa 10-24 h.
- Erfindungsgemäß wird das so erhaltene Fluid, das die Pertussis-antiinfektive Fraktion enthält, mit Formaldehyd, Glutaraldehyd, Brenztraubensäurealdehyd oder ähnlichem entgiftet, und dann wird der Überschuß an Formaldehyd, Glutaraldehyd, Brenztraubensäurealdehyd oder ähnlichem nach einem an sich bekannten Verfahren wie Dialyse, Zentrifugation oder Ultrafiltration usw. entfernt, um ein Pertussistoxoid zu ergeben. Ein empfohlenes exemplarisches Entgiftungsverfahren umfaßt, wie in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 57-50925 beschrieben, das Hinzufügen von Formaldehyd zu einem Pertussisendotoxin enthaltenden Fluid in einer Menge von etwa 0,1-0,6 Vol.-% im wesentlichen in Abwesenheit (d.h. nicht mehr als 10 mM) von basischen Aminosäuren (beispielsweise L-Lysin, Glycin usw.), das Inkubieren der Mischung bei etwa 32-42ºC für etwa 3-14 Tage, um Flockung zu verursachen, das Aufbrechen des flockenden Toxoids durch ein geeignetes Mittel (z.B. Ultrabeschallung mit etwa 10-50 kHz), und das Suspendieren desselben in einem geeigneten wässerigen Medium (beispielsweise M/100-M/250 phosphatgepufferter Salzlösung), um ein Toxoidfluid zu ergeben.
- Gemäß vorliegender Erfindung kann ein Pertussistoxoid erzeugt werden, dessen Endotoxingehalt pro 10 ug Eiweißstickstoff nicht mehr als 0,5 ng, vorzugsweise nicht mehr als 0,1 ng, wie nach dem Limuluslysattest bestimmt, beträgt. Mit anderen Worten, die Endotoxineliminationsrate kann auf nicht weniger als 99,9994 % oder vorzugsweise auf zumindest 99,9998 % verbessert werden.
- Das erfindungsgemäße Pertussistoxoid kann nach dem bekannten Verfahren in einen ausgefällten Pertussisimpfstoff oder einen ausgefällten Pertussis-Diphterie-Tetanus-Dreifachimpfstoff zum Impfen von Menschen verarbeitet werden.
- Die Figuren 1 und 2 zeigen die Saccharosegradientenzentrifugations-Profile der Kalziumphosphatgelierungsgruppe bzw. Kontrollgruppe in Beispiel 1.
- Die folgenden Bezugs- und Arbeitsbeispiele veranschaulichen die Erfindung weiter, schränken sie aber keinesfalls ein.
- Die Eigenschaften von in den folgenden Beispielen und Bezugsbeispielen eingesetzem Bordetella pertussis-Tohama Phase I-Stamm werden in z.B. Infection and Immunity, 6, 899 (1972) geoffenbart. Dieser Stamm wird im National Institute of Health, Tokio, Japan (NIHJ) aufbewahrt und ist seit 13. August 1980 auch im Institute for Fermentation, Osaka, Japan, unter der Zugangsnummer IFO 14073 hinterlegt.
- Bordetella pertussis-Tohama Phase I-Stamm (IFO 14073) wurde auf aus Kartoffel, Pepton, Natriumchlorid, Agar und Rinderblut hergestelltes Bordet-Gengou-Medium geimpft und bei 35ºC 2 Tage lang inkubiert. Dann wurden transparente kreisförmige Kolonien entnommen und eine, die mit K-Agglutininantikörper reagiert, wurde wieder auf Bordet-Gengou-Medium verteilt, um eine Impfkultur herzustellen. Dann wurde diese Impfkultur wieder in Cohen-Wheeler-Brühemedium transplattiert und bei 35ºC 1 Tag lang inkubiert. Die resultierende bakterielle Suspension wurde mit der Endkonzentration von etwa 1 Milliarde Zellen/ml Stainer-Scholte-Brühemedium hinzugefügt und unter Verwendung einer Rouxflasche bei 35ºC 5 Tage lang inkubiert. Die Kulturbrühe wurde geerntet und etwa 20 % (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat wurde dem Überstand hinzugefügt. Nach gründlichem Mischen wurde die Mischung bei 4ºC stehengelassen. Nach etwa 14 Tagen wurde die Mischung zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment wurde geerntet. Dann wurde ein Zehntel Volumen, basierend auf der gesammelten Lösung, an 1 M Natriumchlorid-0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0) dem Sediment hinzugefügt, und die Mischung wurde gut gerührt und bei 4ºC 4 Tage lang stehengelassen. Die Mischung wurde dann wieder zentrifugiert und der Überstand (Extrakt I) wurde gesammelt. Dieser Extrakt I war reich an Schutzfraktion, die filamentöses Hämagglutinin (FHA) und Pertussistoxin (PT) sowie Endotoxin enthielt, war aber frei von Zellen.
- Zu Aliquoten dieses Extrakts I wurde allmählich Kalziumacetat mit den Endkonzentrationen von 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 % (Gew./Vol.) hinzugefügt, und jede Mischung wurde bei Raumtemperatur etwa 1 Stunde lang leicht gerührt. Dann wurde der resultierende Niederschlag unter Verwendung eines Filterpapiers abgefiltert, um einen Überstand zu ergeben. Unter Verwendung eines jeden der so erhaltenen Überstände wurden Chick-Hämagglutinin(HA)-Titer, PT-Gehalt und ET-Gehalt bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Der PT-Gehalt wurde durch ELISA getestet und der ET-Gehalt wurde durch das Limuluslysatverfahren (Mallinckrodtkit) unter Verwendung von E.coli-Endotoxin (Difco 055-B5) als Standard getestet.
- Aus Tabelle 1 ist klar, daß ET durch die Schritte des Zufügens des Kalziumsalzes in der Gegenwart eines Phosphationüberschusses und Verwerfen des Niederschlags selektiv eliminiert werden kann. Darüber hinaus können durch Hinzufügen von 0,2 bis 0,6 % (Gew./Vol.) Kalziumacetat etwa 99 % des ETs entfernt werden, ohne daß ein Verlust an Schutzfraktion (HA-Titer und PT-Gehalt) auftritt. Tabelle 1 Menge an hinzugefügtem Kalziumacetat % (Gew./Vol.) Endotoxingehalt (ng/ml) Entfernung von Endotoxin (%) HA-Titer* (HAE/ml) PT-Gehalt (EE/ml) *: Der HA-Titer gibt hauptsächlich den FHA-Gehalt wieder.
- Das Verfahren von Bezugsbeispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert mit Natriumhydroxid oder Salzsäure auf 5,0-10,0 eingestellt wurde und die Hinzufügungsmenge an Kalziumacetat auf 0,5 % (Gew./Vol.) eingestellt wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
- Bei pH 6,0 beginnend fand Gelierung statt und die Entfernung von Endotoxin nahm mit steigendem pH-Wert zu. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß der optimale pH-Wert 7-9 beträgt. Tabelle 2 pH Endotoxingehalt (ng/ml) Entfernung von Endotoxin (%) HA-Titer* HAE/ml) (vor der Behandlung)
- Das Verfahren von Bezugsbeispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 5 % (Gew./Vol.) Hydroxylapatit (BDH) anstelle von 0,5 % (Gew./Vol.) Kalziumacetat eingesetzt wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
- Aus Tabelle 3 geht klar hervor, daß im Vergleich zur Hinzufügung von Kalziumacetat zur Bildung von Kalziumphosphatgelen in der Lösung die Hinzufügung von Hydroxylapatit ein weniger wirksames Entfernen von Endotoxin bewirkt und die Umkehrung der oben festgestellten pH-Abhängigkeit zeigt. Tabelle 3 pH Endotoxingehalt (ng/ml) Entfernung von Endotoxin (%) HA-Titer* (HAE/ml) (vor der Behandlung)
- Jedes von Extrakt I (Kontrollgruppe), der durch das in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Verfahren erhalten wurde, und des durch Hinzufügen von Kalziumacetat zu Extrakt I mit der Endkonzentration von 0,5 % (Gew./Vol.) und darauffolgendes Behandeln der Mischung wie in Bezugsbeispiel 1 beschrieben erhaltenen Materials wurde mit einem gleichen Volumen an gesättigter wässeriger Ammoniumsulfatlösung gemischt, und die Mischung wurde 7 Tage lang bei 4ºC stehengelassen. Das Ammoniumsulfat-ausgefällte Material wurde 20 Minuten lang bei 10.000 UpM zentrifugiert und das Sediment gesammelt. Dann wurde etwa 1/300 Volumen, ausgehend vom Volumen der Lösung, an 1 M Natriumchlorid-0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0) hinzugefügt. Nach gründlichem Rühren wurde die Mischung in einer Röhre unter Verwendung von 1 M Natriumchloridlösung (pH 8,0) als Außenfluid dialyisiert Das Dialysat wurde der Saccharosegradientenzentrifugation unter folgenden Bedingungen unterworfen:
- Saccharosedichtegradient = 1-30 Gew.-%, Rmax = 69,400 G und Zeit = etwa 18 h. Die Beladung für die Kalziumphosphatgelierungsgruppe wurde gegenüber der Beladung für die Kontrollgruppe verdoppelt. Nach dem Zentrifugieren wurden 34 Gew.-% Saccharoselösung zur fraktionierten Ernte in den Rotor zugeführt. Jede so gesammelte Fraktion wurde durch ELISA auf FHA-Gehalt und durch das gleiche Verfahren wie in Bezugsbeispiel 1 beschrieben auf PT- und ET-Gehalt bestimmt. Die Ergebnisse werden in den Figuren 1 und 2 gezeigt. In den Diagrammen sind FHA-, PT- und ET-Gehalt durch -0-, -Δ- bzw. - - gekennzeichnet.
- Aus den Figuren 1 und 2 ist ersichtlich, daß trotz der Verdopplung der angewandten Beladung die Kalziumphosphatgelierungsgruppe eine deutlich diskretere Abtrennung der Schutzfraktion (FHA, PT) vom Endotoxin bot als die Kontrollgruppe.
- Bei jeder der Kalziumphosphatgruppen und der Kontrollgruppen, wurde die Fraktion arm an ET und reich an FHA gesammelt und ihr Eiweißstickstoffgehalt wurde auf etwa 50 ug/ml eingestellt. Dazu wurden 0,02 % (Gew./Vol.) Gelatine, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 80 und 0,4 Vol.-% Formaldehyd hinzugefügt, und die Mischung wurde einige Tage bei 39ºC inkubiert. Das resultierende Toxoidfluid wurde dialysiert und auf ET überprüft. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Der ET-Gehalt wurde mit dem Limulus-Lysattest (Wako Pure Chemical-Kit) unter Verwendung von E.coli-Endotoxin (Difco 055-B5) als Standard bestimmt.
- Aus Tabelle 4 geht klar hervor, daß beim Vergleich des ET-Gehalts von Pertussistoxoidstammfluid als Impfstoff (Eiweißstickstoffgehalt 10 ug/ml), der ET-Gehalt in der Kalziumphosphatgelierungsgruppe auf weniger als 1/40 desjenigen der Kontrollgruppe verbessert worden ist. Tabelle 4 Ca-Phosphatgelierungsgruppe Kontrollgruppe Endotoxingehalt Entfernung von Endotoxin Vers. *: Die Zahl in Klammern stellt den Endotoxingehalt pro 10 ug/ml Eiweißstickstoff dar.
- Nach dem Original-Levineverfahren (Reo Levine, Joseph L. Stone & Louise Wyman: Factors affecting the efficiency of the aluminium adjuvant in diphtheria and tetanus toxoids. J. Immunology 75, 301-307, 1955) wurde jede von 2 Chargen Pertussistoxoidstammfluid mit M7250 Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,0) verdünnt, um einen Eiweißstickstoffgehalt von etwa 10 ug/ml zu ergeben, gefolgt vom Hinzufügen von Aluminiumchlorid mit der Endkonzentration von 0,18 % (Gew./Vol.). Die Mischung wurde gut gerührt und mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt, um etwa 0,2 mg/l aluminiumadsorbierten Impfstoff herzustellen.
- Die Haupteigenschaften dieses Impfstoffes waren: pH 7,0, Kaninchenpyrogenität: negativ, Mausgewichtsreduktion: 10 BWDE/ml oder weniger, Mausleukozytenzunahme: 0,5 LPE/ml oder weniger, Maushistaminsensibilisierung: 8 HSE/ml oder weniger und Pertussistoxoidpotenz: 8 IE/ml oder mehr. Somit entsprachen beide Chargen den im Standard of Biological Products angegebenen Normwerten.
Claims (16)
1. Verfahren zum Entfernen von Endotoxin aus einem Fluid, das die antiinfektive
Fraktion und Endotoxin der Stämme von Phase I Bordetella pertussis enthält,
durch Zonenzentrifugation, dadurch gekennzeichnet, daß dem genannten Fluid
Kalziumion in Gegenwart von überschüssigem Phosphation zugefügt wird, wobei
der resultierende Niederschlag verworfen und das Mutterfluid der
Zonenzentrifugation unterworfen wird, wodurch der Endotoxingehalt um zumindest
99,9994 % des ursprünglichen Endotoxingehalts verringert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verhältnis zwischen Phosphation und
Kalziumion 1,25 bis 30 Äquivalente Phosphation pro Äquivalent Kalziumion
beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Verhältnis 1,5 bis 7,5 Äquivalente
Phosphation pro Äquivalent Kalziumion beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das zuzufügende Kalziumion ein Kalziumion
von Kalziumacetat oder Kalziumchlorid ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der resultierende Niederschlag 0,01 bis
0,1 Milliäquivalente/ml Kalziumphosphatgel beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der resultierende Niederschlag 0,02 bis
0,07 Milliäquivalente/ml Kalziumphosphatgel beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der resultierende Niederschlag allmählich
bei einer Temperatur im Bereich von 4ºC bis Raumtemperatur und dem pH-Wert
im Bereich von 6,5 bis 9 während 20 Minuten bis 2 Stunden gebildet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der resultierende Niederschlag
Kalziumphosphatgel ist, das entsteht durch Auflösen des Niederschlags, der
durch fraktionierte Ausfällung des Überstandes einer Kulturbrühe aus Stämmen
von Phase I Bordetella pertussis unter Verwendung von Ammoniumsulfat erhalten
wurde, in 1 M Natriumchlorid-0,05 M Phosphatpuffer, Hinzufügen von
Kalziumacetat mit einer Endkonzentration von 0,1 bis 1,0 % (Gew./Vol.) zu
der Lösung bei pH 6,5 bis 9 und allmähliches Umsetzenlassen der Mischung bei
4ºC bis Raumtemperatur während 20 Minuten bis 2 Stunden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Endkonzentration an hinzuzufügendem
Kalziumacetat 0,2 bis 0,6 % (Gew./Vol.) beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zonenzentrifugation eine
Saccharosegradientenzentrifugation ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Saccharosegradientenzentrifugation
unter folgenden Bedingungen durchgeführt wird: Dichtegradient: 0 bis 30 Gew.-%,
Rmax: 60.000 bis 122.000 G; Zeit: 10 bis 24 Stunden.
12. Verfahren zur Herstellung eines Pertussistoxoids, gekennzeichnet durch
das Entgiften eines antiinfektive Fraktion enthaltenden Fluids, das nach dem
Verfahren nach Anspruch 1 erhalten wurde.
13. Verfahren nach Anspruch 12, welches umfaßt:
a) das Auflösen des Niederschlags, der durch fraktionierte Ausfällung des
Überstandes einer Kulturbrühe aus Stämmen Phase I Bordetella pertussis unter
Verwendung von Ammoniumsulfat erhalten wurde, in 1 M Natriumchlorid-0,05 M
Phosphatpuffer,
b) das Hinzufügen von Kalziumacetat mit einer Endkonzentration von 0,2 bis
0,6 % (Gew./Vol.) zu der Lösung bei pH 6,5 bis 9,
c) das allmähliche Umsetzenlassen der Mischung bei 4ºC bis Raumtemperatur
während 20 Minuten bis 2 Stunden,
d) das Verwerfen des resultierenden Kalziumphosphatgels und das Durchführen
von Saccharosedichtezentrifugation unter folgenden Bedingungen:
Saccharosedichte: 0 bis 30 Gew.-%, Rmax: 60.000 bis 122.000 G; Zeit: 10 bis
24 Stunden, gefolgt vom Hinzufügen von Formaldehyd in der Menge von 0,1 bis
0,6 Vol.-% in wesentlicher Abwesenheit von basischen Aminosäuren zum
antiinfektive Fraktion enthaltenden Fluid, das durch die
Saccharosedichtezentrifugation erhalten wurde,
e) das Inkubieren der Mischung bei 32 bis 42ºC während etwa 3 bis 14 Tagen,
um Flockung zu bewirken,
f) das Aufbrechen des ausflockenden Toxoids und
g) das Suspendieren desselben in einem wässerigen Medium.
14. Pertussistoxoid, dessen Endotoxingehalt um zumindest 99,9994 % des
ursprünglichen Endotoxingehalts verringert ist.
15. Toxoid nach Anspruch 14, worin der Endotoxingehalt um zumindest 99,9998
% des ursprünglichen Endotoxingehalts verringert ist.
16. Toxoid nach Anspruch 14, das nach dem Verfahren nach Anspruch 13 erzeugt
wurde.
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