CN1019979C - 一种除去百日咳内毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了明确而有效地除去百日咳内毒素的方法，特征在于在进行区域离心前，在过量磷酸根离子存在下向含Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分及内毒素的液体中加入钙离子，同时提供了一种内毒素含量为每10μg蛋白氮不超过0.5ng的百日咳类毒素及其生产方法。

Description

本发明涉及一种除去百日咳内毒素的方法、一种百日咳类毒素及其生产方法。

百日咳是一种由百日咳博德特氏菌（Bordetella    pertussis）引起的传染性疾病，其可在患儿体内造成严重的病理过程。

已经使用疫苗来预防这种疾病，但使用任何一种由百日咳博德特氏菌整个菌体生产的疫苗时，都会出现发烧等强烈的不良反应，为了克服这一缺点。目前已通过分离细菌的抗感染部分（下文中亦称之为保护部分）-如菌丝血凝素（FHA）、百日咳毒素（PT）及菌毛而生产了一种基本上没有内毒素（ET）（其为引起发烧等不良反应的主要因素）的无细胞百日咳疫苗（ACP疫苗），并已在临床上付诸使用。

生产ACP疫苗的最关键性步骤是从抗感染部分中分离出内毒素（ET），而为此目的已普遍使用了蔗糖梯度离心法（日本未审查专利公开57-50925号，即相当于EPC公开0047802号）。

此外，作为一种除去热原的技术，已知有使用磷酸钙凝胶的方法（日本专利公开34-2149号）。也知道羟基磷灰石凝胶-磷酸钙凝胶的一种稳定化变化，在从百日咳毒素（PT）中分离菌丝血凝素（FHA）上是有效的，而且已知可在羟基磷灰石凝胶柱上由百日咳毒素中层析分离出无内毒素（或基本上无内毒素）的菌丝血凝素，并可经亲合层析和蔗糖梯度离心进一步纯化之（Japanese    journal    of    Bacteriolcgy，38（1），423，1983）。

单用蔗炉梯度离心法虽然能除去99。995%的内毒素（ET），但作为含抗感染部分的液体粗提物，其仍富含内毒素（ET），可见很难将保护性部分与内毒素（ET）完全分离开，而且抗感染部分的产率也不高。再者，因为生产体积小而且成本高耗时多，所以这种方法不能够满足商业代生产的需要。

另一方面，单用磷酸钙凝胶处理只能保证达到90～99.9%的低内毒素排除率，因此没有什么实用价值。联合使用羟基磷灰石柱层析、亲合层析及蔗糖梯度离心方法，有可能在实验室水平上在与百日咳毒素（PT）的分离中分离和纯化出完全没有内毒素的菌丝血凝素（FHA），但这种方法所获产品的产量却不能符合商品化生产的要求。此外，所涉及的技术在目的上，亦不同于本发明由含有保护性部分及内毒素（ET）的液体除去内毒素（ET）这一发明目的。

与上述技术背景不同，我们则是探索除去内毒 素（ET）的有效方法，并发现在进行蔗糖梯度离心之前先用磷酸钙凝胶处理，可以很彻底地将保护性部分与内毒素（ET）分离开，而且可经蔗糖梯度离心进一步提高产量和内毒素（ET）的清除率。针对这些发现作进一步的研究，最后确立了本发明。

因此本发明提供了（1）一种经区域离心由含有Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染性部分和内毒素的液体中除去内毒素的方法，特征在于于区域离心前在过量磷酸跟离子存在下向所说的液体内加入钙离子，并弃去所形成的沉淀;（2）一种生产百日咳类毒素的方法，特征在于对依照上述方法制得的含抗感染部分的液体作解毒处理;以及（3）一种其内毒素含量为每10μg蛋白氮不超过0.5ng的百日咳类毒类。

使用本发明的除去百日咳内毒素的方法，可以使从内毒素中分离抗感染部分的工作做得更为肯定和彻底，结果是能比较容易地以更高收率分离到保护性部分。此外，因为可进行区域离心的原料量大并能以高效率除去内毒素，从而可使百日咳类毒素的产量增加两倍以上。因此，本发明的工业价值是很大的。

再者，与以常规方法生产的类毒素相比，依据本发明的方法生产的百日咳类毒素中内毒素含量不超过前者的十分之一，而且使用本发明的百日咳类毒素能在工业水平上生产出与常规疫苗有同样免疫学作用的疫苗，且降低了产品的毒性。

前述含Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分和内毒素的液体，例如可以是经培养Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株所得培养物的上清液或其浓缩液，且最好是浓缩液。可依照常规方法培养Ⅰ期百日咳博德特氏菌的菌株。例如，可使微生物在液体培养基（如Cohen-Wheeler培养基或Stainer-Scholte培养基）中于35-37℃下生长约5-7天。可用过滤或离心方法收集如此得到的培养物的上清液。可直接或于浓缩后，对上清液作进一步处理以除去内毒素。为此目的，可用已知的盐析技术进行浓缩。例如，可将2至5kg硫酸铵加到各10升培养物上清液中，并用过滤或离心等方法收集所产生的沉淀物。然后将该沉淀物溶解在适当量的1M氯化钠-0.05M磷酸盐缓冲液中，并以离心或其他方法处理溶液，以分离上清液。

依据本发明的除去内毒素的方法包括：在过量磷酸根离子存在下，向含有Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分和内毒素的液体中添加钙离子，弃去所形成的沉淀并对母液作区域离心。

如果材料液体中没有磷酸根离子，可向其中加入磷酸盐缓冲液，如含1M氯化钠的0.05M烯酸盐缓冲液，然后添加钙离子。所补入的钙离子可以是任何可溶性钙盐如醋酸钙、氯化钙、硝酸钙等，或者是不溶性钙盐如磷酸钙等。其中特别优选的是醋酸钙和氯化钙。

磷酸根离子对钙离子的比例为1.25至30当量，最好是1.5至7.5当量磷酸根离子比1当量钙离子，并推荐应保证形成0.01至0.1毫当量/ml，最好为0.02到0.07毫当量的磷酸钙凝胶。

除去内毒素的典型操作程序如下：假定将用硫酸铵分级沉淀Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之培养物的上清液所得到的沉淀物溶解在1M氯化钠-0.05M磷酸盐缓冲液中，则加入磷酸钙至终浓度约为0.1至1.0W/V%，最好是0.2至0.6W/V%（pH约6.5-9），并于4℃至室温下逐步反应大约20分钟至2小时以得到磷酸钙凝胶。该反应完成后，用已知方法如过滤或离子法除去所形成的沉淀物。用这一方法，可选择性地除去大约90至99.9%的内毒素，而没有任何可见的保护性部分的丢失。

对如上制得的半粗产物进一步进行区域离心，最好是在用硫酸铵盐析法（分级沉淀法）进一步浓缩之后进行。

根据本发明的区域离心，其可以是蔗糖梯度离心、酒石酸钾梯度离心、氯化铯梯度离心等，但优选的是蔗糖梯度离心。蔗糖梯度离心的一般条件是：密度梯度：0-30W/W%;Rmax：约60，000-122，000G;时间：约10-24小时。

根据本发明，首先用甲醛、戊二醛、丙酮醛或类似化合物处理如此得到的含百日咳抗感染部分的液体以解毒，然后用已知方法如透析、离心或超滤法除去过量的甲醛、戊二醛、丙酮醛或类似物，以得到百日咳类毒素。一种被推荐的典型解毒方法（如日本未审查专利公开57-50925号所述）包括，在基本上没有（即不超过10mM）碱性氨基酸（如L-赖氨酸，甘氨酸等）的情况下向含百日咳内毒素的液体内加入总量约0.1-0.6V/V%的 甲醛，于32-42℃下将混合物保温3-14天以引起絮凝作用，用适当方法（如以10-50千周频率的超声振荡法）破坏絮凝的类毒素。并将其悬浮于适当的培养液（如M/100-M/250磷酸盐缓冲盐水）中以得到含类毒素液体。

依据本发明可生产出按鲎溶解物试验法检测内毒素含量为每10μg蛋白氮不超过0.5ng，最好不超过0.1ng的百日咳类毒素。换句话说，内毒素排除率可提高到不低于99.9994%，或最好不低于99.9998%。

可用已建立的方法将本发明的百日咳类毒素加工成用于给人进行免疫接种的沉淀的百日咳疫苗或沉淀的百日咳-白喉-破伤风三联疫苗。

图1和图2分别显示了实施例1中磷酸钙凝胶化组和对照组的蔗糖梯度离心分布型。

实施例

下列参考和操作实施例旨在进一步阐明而不是限定本发明。

Infection    and    Immunity，6，899（1972）中描述了用于下列实施例和参考实施例的百日咳博德特氏菌Tohama    Ⅰ期菌株的性质。该菌株已保存在National    Institute    of    Health，Tokyo，Japan（NIHJ），自1980年8月3日起寄存在Institute    for    Fermentation，Osaka，Japan，寄存号为IFO14073，并于1988年6月4日寄存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），寄存号为M88052。

参考实施例1

将百日咳博德特氏菌Tohama    Ⅰ期菌株（IFO14073）接种在由马铃薯、蛋白胨、氯化钠、琼脂和牛血制得的Bordet-Gengou培养基上，并于35℃下保温2天。然后摘取半透明环形菌落并将一个与K凝集素抗体反应的菌落再次分散于Bordet-Gengou培养基上，以制备种子培养物。再将该种子培养物移入Cohen-Wheeler培养液中并于35℃下保温1天。将所得细菌悬液加到Stainer-Scholte培养液中达到终浓度均每毫升十亿个细胞，并使用Roux培养瓶于35℃保温5天。收获培养物并向上清液中加入约20W/V%的硫酸铵。彻底混合后将混合物4℃下放置大约14天。然后将混合物离心、弃去上清液并收获沉淀物。根据所收集的溶液体积，向沉淀物中加入十分之一体积的1M氯化钠-0.05M磷酸盐缓冲液（pH8.0），将混合物搅拌均匀并于4℃下放置4天。然后再次离心混合物并收集上清液（提取物Ⅰ）。该提取物Ⅰ富集了含菌丝血凝集（FHA）的保护性部分、百日咳毒素（PT）以及内毒素，但其中没有细胞。

向该提取物Ⅰ的等分样品中逐步加入醋酸钙，分别达到终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0W/V%，并将每份混合物于室温下轻轻搅拌约1小时。然后用滤纸滤除所得沉淀以得到上清液。检测如此得到的每份上清液中小鸡血凝素（HA）滴度、PT含量和ET含量。结果示于表1中。用大肠杆菌内毒素（Difco    O    55-B5）作为标准品对照，以ELISA法检测PT含量并以鲎溶解物检测法（Mallinckrodt试剂盒）检测ET含量。

由表1可以明显看出，通过在过量磷酸根离子存在下提供钙盐及弃去沉淀物等步骤即可选择性地除去ET。另外，通过加入0.2至0.6W/V%的醋酸钙，可在不丢失保护性部分（HA滴度和PT含量）的情况下除去大约99%的ET（见表1）。

参考实施例2

重复参考实施例1的程序，所不同的是用氢氧化钠或盐酸将pH调到5.0-10.0，并将所加醋酸钙的水平定为0.5W/V%。结果示于表2中。

在达到pH6.0时发生凝胶化作用并随着pH增加内毒素的排除量增加。由表2可以看出，排除内毒素的最佳pH为7-9（见表2）。

参考实施例3

重复参考实施例2的程序，所不同的是用5W/V%的羟基磷灰石（BDH）代替0.5W/V%的醋酸钙。结果示于表3中。

由表3可以看出，如在溶液内形成磷酸钙凝胶，加羟基磷灰石除去内毒素的效率要比加醋酸钙的效率低，而且与上面记录的pH依赖性相反（见表3）。

实施例1

将按照参考实施例1所述方法制得的提取物Ⅰ（对照组）以及向提取物Ⅰ中加入醋酸钙（终浓度0.5W/V%）然后按参考实施例1所述方法处理混合物所得到的材料分别与等体积硫酸铵饱和水溶液混合，并将混合物于4℃下放置7天。将该硫酸铵沉淀的材料以10，000rpm离心20分钟并收集 沉淀物。然后加入约1/300体积（基于溶液的体积）的1M氯化钠-0.05M磷酸盐缓冲液（pH8.0）。彻底搅拌后，将混合物倾入透析管中用1M氯化钠溶液（作为外部液体）（pH8.0）透析。在蔗糖密度梯度＝1-30W/W%、Rmax＝69，400G及时间＝大约18小时的条件下将透析液作蔗糖梯度离心。磷酸钙凝胶化组的加样量为对照组加样量的两倍。离心后向离心管内加入34W/W%蔗糖溶液以分级收获。以ELISA法测定所收集的各部分的FHA含量，并按照参考实施例1中所述的方法测定PT和ET含量。结果示于图1和2中。其中FHA、PT和ET含量分别用-○-、-△-和-■-标示。

从图1和2中可以看出，尽管是对照组加样量的两倍，但磷酸钙凝胶化组在从内毒素中分离保护性部分（FHA、PT）方面却比对照组提供了显然更好的不连续分离效果。

在磷酸钙组和对照组中，分别收集其缺乏ET而富含FHA的部分，并将蛋白氮含量调到大约50μg/ml。向其中加入0.02W/V%明胶、0.05W/V%Tween80和0.4V/V%甲醛，并将混合物于39℃下保温数日，透析所得类毒素液体并测定ET。结果示于表4中。使用大肠杆菌内毒素（Difco    O55-B5）作标准对照，以鲎溶解物检测法（Wako    Pure    Chemical试剂盒）检测ET含量。

从表4中可以看出，当在疫苗水平上（蛋白氮含量为10μg/ml）比较百日咳类毒素母液的ET含量时，磷酸钙凝胶化组的ET含量已改善为对照组ET含量的1/40以下。（见表4）

实施例2

按照Levine的原始方法（Reo    Levine，Joseph    L.Stone和Louise    Wyman：Factors    affecting    the    efficiency    of    the    aluminum    adjuvant    in    diphtheria    and    tetanus    toxoids.J.Immunology    75，301-307，1955），各用M/250磷酸盐缓冲盐水（pH7.0）稀释2批类毒素母液，以使蛋白氮含量达到约10μg/ml，然后加氯化铝至终浓度为0.18W/V%。充分搅拌混合物并用盐酸或氢氧化钠将pH调到7.0，以制得大约0.2mg/L的铝吸附的设苗。

该疫苗的基本性质是：pH7.0、兔热原性试验：阴性、小鼠体重降低：10BWDU/ml或低于该值、小鼠白细胞增加：0.5LPU/ml或低于该值、小鼠组胺致敏作用：0.8HSU/ml或低于该值、百日咳类毒素效价：8IU/ml或高于该值。可见，这两批产品均符合生物学产品质检标准所规定的标准值。

表1

所加醋酸钙的量    内毒素含量    内毒素的排除率    HA滴度＊    PT含量

（W/V%）    （ng/ml）    （%）    （HAu/ml）    （Eu/ml）

0    87，800    -    1200    1220

0.2    1，043    98.2    1100    1140

0.4    960    98.9    1400    1400

0.6    78    99.2    1200    1080

0.8    ＜20    99.9    400    1210

1.0    ＞99.9    ＜200    1030

＊HA滴度主要反映FHA含量。

表2

pH    内毒素含量    内毒素排除率    HA滴度

（ng/ml）    （%）    （HAu/ml）

（处理前）    334，000    -    3，000

5.0    195，000    41.6    2，700

6.0    108，000    67.7    3，000

6.5    53，000    84.1    ，3，000

7.0    24，000    92.8    3，000

8.0    22，000    93.4    ，3，200

9.0    18，00    94.6    3，000

10.0    268，000    19.8    3，000

表3

pH    内毒素含量    内毒素排除率    HA滴度

（ng/ml）    （%）    （HAu/ml）

（处理前）    334，000    -    3，000

6.0    160，000    52.1    3，000

7.0    195，000    41.6    3，000

8.0    264，000    21.0    3，000

9.0    294，000    12.0    3，000

表4

磷酸钙凝胶化组    对照组

内毒素含量    内毒素排除率    内毒素含量    内毒素排除率

实验1    0.3ng/ml    99，99994%    19，0ng/ml    99，99591%

（0.06ng/ml）＊    （3.8ng/ml）

实验2    0.3ng/ml    99.99988%    12.8ng/ml    99.99458%

（0.06ng/ml）＊    （2.6ng/ml）

＊括号内的数据代表每10μg/ml蛋白氮的内毒素含量。

Claims (11)

1、一种通过区域离心由含有Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分及内毒素的液体中除去内毒素的方法，其特征在于在过量磷酸根离子存在下向所说液体内供入钙离子，然后进行区域离心并弃去所得沉淀物。

2、根据权利要求1的方法，其中磷酸根离子对钙离子的比例为1.25至30当量磷酸根离子比1当量钙离子。

3、根据权利要求2的方法，其中比例约为1.5至7.5当量磷酸根离子比1当量钙离子。

4、根据权利要求1的方法，其中所提供的钙离子是醋酸钙的钙离子。

5、根据权利要求1的方法，其中所得沉淀物为大约0.01至0.1毫克当量/ml的磷酸钙凝胶。

6、根据权利要求5的方法，其中所得沉淀物为大约0.02至0.07毫克当量/ml的磷酸钙凝胶。

7、根据权利要求1的方法，其中所得沉淀物是在室温约6.5至9的pH值条件下在约1小时内逐渐形成的。

8、根据权利要求1的方法，其中所得沉淀物是经溶解不溶物而产生的磷酸钙凝胶，所说的凝胶在1M氯化钠-0.05M磷酸盐缓冲液中溶解用硫酸铵分级沉淀Ⅰ期百日咳博德特氏菌菌株之培养物的上清液所得到的沉淀物、以大约0.1至1.0W/V%的终浓度向pH约6.5至9的溶液内加入醋酸钙并使混合物于大约4℃至室温下逐步反应大约20分钟至2小时而制得的。

9、根据权利要求8的方法，其中所加醋酸钙的终浓度为大约0.2至0.6W/V%。

10、根据权利要求1的方法，其中区域离心是蔗糖梯度离心。

11、根据权利要求10的方法，其中蔗糖梯度离心是在下列条件下进行的，密度梯度：0至30W/V%;Rmax：69400G;时间：约18小时。

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