NO178423B - Fremgangsmåte for fjerning av pertussisendotoksin og fremgangsmåte for fremstilling av pertussistoksoid - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fjerning av endotoksin fra et fluid inneholdende anti infeksjons-fraksjonen og endotoksin i stammer av fase I Bordella pertussis samt en fremgangsmåte for fremstilling av et pertussistoksoid.

Pertussis er en smittsom, infektiøs sykdom som skyldes Bordetella pertussis, og har et alvorlig forløp hos spedbarn og små barn.

For å hindre denne sykdommen har det hittil vært benyttet vaksiner. En hvilken som helst vaksine fremstilt ved bruk av de hele organismene av B. pertussis gir imidlertid intense, uheldige reaksjoner slik som feber, og for å over-komme denne ulempen har det blitt utviklet og benyttet en acellulaer pertussisvaksine (ACP-vaksine) som er vesentlig fri for endotoksin (ET) som hovedakelig er ansvarlig for feber og andre uheldige reaksjoner, ved isolasjon av den antiineffek-tive fraksjonen (i det følgende enkelte ganger betegnet beskyttende fraksjon) slik som filamentformig hemagglutinin (FHA), pertussistoksin (PT) og fimbriae.

Det mest avgjørende trinn i fremstillingen av en ACT-vaksine er separeringen av endotoksin (ET) fra den antiinfektiøse fraksjon, og generelt har sukrose-gradientsentrifugering blitt benyttet for dette formål (JP patent 57-50925 tilsva-rende EP-publikasjon 0047802).

Videre, som en teknikk for fjerning av pyrogen, har den metode som benytter kalsiumfosfat, vært kjent (JP patent 34-2149). Det er også kjent at hydroksylapatittgel, en stabi-lisert versjon av kalsiumfosfatgel, er effektiv i separeringen av filamentformig hemagglutinin (FHA) fra pertussis toksin (PT), og at endotoksinfri (vesentlig fri) filamentformig hemagglutinin kan separeres fra pertussistoksinet ved kromatografi på hydroksylapatittgel og videre rensing ved affinitetskromatografi og sukrose-gradientsentrifugering (Japanese Journal of Bacteriology, 38 (1), 423, 1983).

Sukrose-gradientsentrifugering alene er i stand til å fjerne ca. 99,995$ av endotoksinet (ET), men siden det urene fluidet som inneholder antiinfeksjonsfraksjonen er rik på endotoksin (ET), er fullstendig separering av den beskyttende fraksjonen fra endotoksinet (ET) vanskelig, og utbyttet av antiinfeksjonsfraksjonen er følgelig ikke høyt. Dessuten, siden produksjonsvolumet er lite, og store kostnader og tid er involvert, så er metoden ikke tilfredsstillende for kommer-sielle formål.

På den annen side sikrer den blotte behandling med kalsium-fosfgatgel bare en lav endotoksinfjerningsgrad på 90-99,9$, og er derfor ikke nyttig for praktiske formål. På labora-torienivå er det mulig å separere og rense filamentformig hemagglutinin (FHA) temmelig fritt for endotoksin ved isolering fra pertussistoksinet (PT) ved en kombinasjon av hydroksylapatitt-kolonnekromatografi, affinitetskromatografi og sukrose-gradientsentrifugering, men metoden sikrer ikke et kommersielt nyttig resultat. Videre har den teknologi som er involvert et annet formål enn foreliggende oppfinnelse, som er rettet mot fjerning av endotoksin (ET) fra et fluid inneholdende den beskyttende fraksjon og endotoksin (ET).

Mot den ovenfor angitte tekniske bakgrunn har man søkt å til-veiebringe en effektiv metode for fjerning av endotoksinet (ET) og funnet at en kalsiumfosfatgelbehandling som går forut for sukrose-gradientsentrifugeringen, resulterer i en meget fordelaktig separering av den beskyttende fraksjonen fra endotoksin (ET) og videre gir forbedringer i både produksjonsvolumet og fjerningsgraden av endotoksin (ET) i forhold til sukrose-densitetssentrifugering. Disse funn ble fulgt av ytterligere forskning som kulminerte i foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fjerning av endotoksin fra et fluid inneholdende antiinfeksjonsfraksjonen og endotoksin i stammer av fase I Bordetella pertussis, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved

a) at det til nevnte fluid tilsettes kalsiumion i nærvær av overskudd fosfation slik at det oppnås et forhold for fosfation til kalsiumion som er fra 1,25 til 30 ekvivalenter fosfation til hver ekvivalent kalsiumion; b) sonesentrifugering av det således oppnådde fluid; c) gradvis dannelse av et bunnfall som er 0,01-0,1 milliekvivalent/ml av kalsiumfosfatgel ved en temperatur i området

fra 4°C til romtemperatur og ved en pH-verdi i området fra 6,5 til 9 i fra 20 min. til 2 timer; og

d) kassering av nevnte resulterende bunnfall.

Ved pertussisendotoksinfjerningsmetoden ifølge oppfinnelsen

kan separeringen av antiinfeksjonsfraksjonen fra endotoksinet gjøres mer sikker og fordelaktig med det resultat at den beskyttende fraksjonen lett kan isoleres i forbedret i ut-bytte. Videre, siden et stort volum av utgangsmateriale kan underkastes sonesentrifugering, kan utbyttet av pertussis-toksoid bli mer enn fordoblet, idet endotoksinet fjernes med høy effektivitet. Derfor er den industrielle verdi av foreliggende oppfinnelse betydelig.

Videre er endotoksininnholdet i pertussis-toksoidet mindre enn 1/10 sammenlignet med det konvensjonelle toksoidet, og bruken av pertussistoksoidet gjør det mulig for industrien å fremstille vaksiner som har den samme immunologiske virk-ningseffekt som de konvensjonelle vaksinene, og har allikevel redusert toksisitet.

Ovennevnte fluid som inneholder antiinfeksjonsfraksjonen og endotoksin fra stammer av fase I Bordetella pertussis kan f.eks. være supernatanten av et kulturmedium som kan oppnås ved dyrking av stammer av fase I B. pertussis eller et kon-sentrat derav, og spesielt er konsentratet foretrukket. Dyrking av stammer av fase I Bordetelle pertussis kan utføres på konvensjonell måte. Således blir f.eks. organismene dyrket i et medium (slik som Cohen-Wheeler-medium eller Stainer-Scholte-medium) ved 35-37°C i 5-7 dager. Supernatanten til et således oppnådd kulturmedium oppsamles, f.eks. ved filtrering eller sentrifugering. Denne supernatanten kan direkte, eller etter konsentrasjon, underkastes det neste trinnet for fjerning av endotoksin. Konsentreringen for dette formål kan foretas ved å anvende den i og for seg kjente utsaltingsteknikken. F.eks. blir 2-5 kg ammoniumsulfat tilsatt hver 10 1 av kul tur supernatanten, og det resulterende bunnfall oppsamles, f.eks. ved filtrering eller sentrifugering. Dette bunnfallet oppløses deretter i en passende mengde av 1 M natriumklorid-0,05 M fosfatbuffer, og oppløsningen sentrifugeres eller behandles ellers for å separere supernatanten.

Fjerningen av endotoksin ifølge foreliggende oppfinnelse inn-befatter at et fluid inneholdende antiinfeksjonsfraksjonen og endotoksin fra stammer av fase I Bordetella pertussis til-føres kalsiumion i nærvær av et overskudd fosfation, det resulterenede bunnfall fjernes, og moderfluidet underkastes sonesentrifugering.

Dersom fosfation ikke er til stede i materialfluidet, blir en fosfatbufferoppløsning slik som f.,eks. 0,05 M fosfatbuffer supplert med 1 M natriumklorid tilsatt til fluidet, og deretter tilføres kalsiumion. Det kalsiumion som skal tilføres, kan være av hvilke som helst slike oppløselige kalsiumsalter som kalsiumacetat, kalsiumklorid, kalsiumnitrat, osv., og uoppløselig kalsiumsalter slik som kalsiumfosfat, osv. Særlig foretrukket er kalsiumacetat og kalsiumklorid.

Forholdet for fosfation til kalsiumion er fra 1,25 til 30 ekvivalenter, fortrinnsvis fra 1,5 til 7,5 ekvivalenter, fosfation til hver ekvivalent kalsiumion, og det anbefales å sikre at fra 0,01 til 0,1 milliekvivalent/ml, fortrinnsvis fra 0,02 til 0,07 milliekvivalent, kalsiumfosfatgel dannes.

En typisk fremgangsmåte er som følger. Ved å anta at når bunnfallet oppnådd ved fraksjonert utfelling av supernatanten til et kulturmedium av stammer av fase I Bordetella pertussis ved bruk av ammoniumsulf at er oppløst i 1 mM natriumklorid-0,05 M fosfatbuffer, så tilsettes kalsiumacetat ved sluttkonsentrasjonen fra 0,1 til 1,0 vekt/vol-prosent, fortrinnsvis fra 0,2 til 0,6 vekt/vol-prosent, ved pH på 6,5-9, og blandingen får reagere gradvis ved fra 4°C til romtemperatur ifra 20 min. til 2 timer til dannelse av en kalsiumfosfatgel. Etter denne reaksjonen fjernes det resulterende bunnfall på i og for seg kjent måte slik som filtrering eller sentrifugering. Ved denne fremgangsmåten kan fra 90 til 99,9$ av endotoksinet selektivt fjernes uten noe særlig tap av den beskyttende fraksjon.

Semiråproduktet oppnådd som angitt ovenfor, underkastes videre sonesentrifugering, fortrinnsvis etter ytterligere konsentrasjon ved ammoniumsulfatsalting (fraksjonert utfelling).

Sonesentrifugeringstrinnet kan være en hvilken som helst sukrosegradientsentrifugering, kaliumtartratdensitets-sentrifugering, cesiumkloridgradientsentrifugering, osv., skjønt sukrosegradientsentrifugering er særlig foretrukket. De vanlige betingelsene for sukrosegradientsentrifugering er: densitetsgradient: 0-30 vekt/vekt prosent, Rmaks: 60.000-122.000 G; tid: 10-24 timer.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av et pertussistoksoid, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved detoksifisering av et antiinfeksjonsfraksjonsholdig fluid oppnådd etter kassering av den utfelte kalsiumfosfatgel som definert i krav 1, ved (i) tilsetning av formaldehyd ved et nivå fra 0,1 til 0,6 vol/vol prosent i vesentlig fravær av basiske aminosyrer til nevnte fluid oppnådd ved sukrose-densitetssentrifugering under betingelsene: sukrose-gradient: 0-30 vekt/vekt prosent; Rmaks: 60.000-122.000 g; tid: 10-24 timer, (ii) inkubering av blandingen ved 32-42°C i 3-14 dager for å bevirke flokkulering;

(iii) splitting av det flokkaktige toksoid, og

(iv) suspendering av dette i et vandig medium.

Det således oppnådde fluid inneholdende pertussis-antiinfeksjonsfraksjonen detoksifiseres med formaldehyd og deretter blir overskuddet av formaldehyd fjernet ved hjelp av en i og for seg kjent metode slik som dialyse, sentrifugering eller ultrafiltrering, osv., for oppnåelse av et pertussistoksoid. Detoksikasjonsmetoden omfatter, som beskrevet i JP patent-publikasjon 57-50925, tilsetning av formaldehyd til et pertussiseksotoksinholdig fluid ved et nivå på 0,1-0,6 vol/vol prosent i vesentlig fravær (dvs. ikke mer enn 10 mM) av basiske aminosyrer (f.eks. L-lysin, glycin, osv.), inkubering av blandingen ved 32-42°C i 3-14 dager for å bevirke flokkulering, splitting av det flokkaktige toksoid på egnet måte (f.eks. ultralydbehandling ved 10-50 kilocykler), og suspendering av det samme i et passende vandig medium (f.eks. M/100-M/2250 fosfatbufret saltoppløsning) til dannelse av et toksoidfluid.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan det fremstilles et pertussistoksoid hvis endotoksininnhold pr. 10 jjg av proteinisk nitrogen ikke er mer enn 0,5 ng, fortrinnsvis ikke mer enn 0,1 ng, som bestemt ved limuluslysattest. M.a.o. kan endotoksinfjerningsgrad forbedres til ikke mindre enn 99,9994$ eller fortrinnsvis til minst 99,9998$. Pertussistoksoidet kan bearbeides ved den etablerte metoden til en utfelt pertussisvaksine eller en utfelt pertussis-difteri-tetanus-trippelvaksine for vaksinasjon av mennesker.

Fig. 1 og 2 viser sukrose-gradientsentrifugeringsprofiler av kalsiumfosfatgeldannelsesgruppen og kontrollgruppen, respektivt, i eksempel 1.

Eksempel

Følgende referanse- og arbeidseksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere.

Egenskapene til Bordetella pertussis Tohama fase I stammen benyttet i de følgende eksempler og referanseeksemplene er beskrevet f.eks. i Infection and Immunity, 6, 899 (1972). Denne stammen har vært oppbevart ved National Institute of Health, Tokyo, Japan (NIHJ), og er også deponert ved Institute for Fermentation, Osaka, Japan under aksesjons-nummer IFO 14073, 13. august 1980.

Referanseeksempel 1

Bordetella pertussis Tohama fase I stamme (IFO 14073) ble inokulert på Bordet-Gengou-medium fremstilt fra potet, pepton, natriumklorid, agar og bovinblod, og inkubert ved 35°C i 2 dager. Deretter ble gjennomskinnelige sirkulære kolonier utplukket, og en som reagerte overfor K-agglutinin-antistoff, ble på nytt utspredt på Bordet-Gengou-medium for fremstilling av en kimkultur. Deretter ble denne kimkulturen overført til Cohen-Wheeler-medium og inkubert ved 35°C i 1 dag. Den resulterende bakteriesuspensjon ble tilsatt til Stainer-Scholte-medium ved sluttkonsentrasjonen på ca. 1 milliard celler/ml, og ved bruk av en Roux-flaske ble den inkubert ved 35°C i 5 dager. Kulturmediet ble innhøstet, og ca. 20 vekt/vol prosent ammoniumsulfat ble tilsatt til supernatanten. Etter grundig blanding ble blandingen hensatt ved 4°C. Etter ca. 14 dager ble blandingen sentrifugert, supernatanten ble kassert eller fjernet, og sedimentet ble innhøstet. Deretter ble 1/10 volum, basert på den oppsamlede oppløsning, av 1 M natriumklorid-0,05 M fosfatbuffer (pH 8,0) tilsatt til sedimentet, og blandingen ble godt omrørt og hensatt ved 4°C i 4 dager. Blandingen ble deretter sentrifugert på nytt, og supernatanten (ekstrakt I) ble oppsamlet. Dette ekstrakt I var rikt på den beskyttende fraksjon inneholdende filamentformig hemagglutinin (FHA) og pertussistoksin (PT) samt endotoksin, men var fri for celler.

Til aliquoter av dette ekstrakt I ble det gradvis tilsatt kalsiumacetat ved sluttkonsentrasjonene 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1,0 vekt/vol prosent, og hver blanding ble forsiktig om-rørt ved romtemperatur i ca. 1 time. Deretter ble det resulterende bunnfall frafiltrert ved bruk av et filterpapir til oppnåelse av en supernatant. Ved bruk av hver av de således oppnådde supernatanter ble kylling-hemagglutinin (HA)-titer, PT-innhold og ET-innhold bestemt. Resultatene er vist i tabell 1. PT-innholdet ble analysert ved ELISA, og ET-innholdet ble analysert ved limuluslysat-metoden (Mallinck-rodt-utstyr) ved bruk av E. coli endotoksin (Difco 0.55-B5) som standard.

Det fremgår klart fra tabell 1 at ET kan elimineres selektivt ved trinnene med tilførsel av kalsiumsaltet i nærvær av et overskudd av fosfation og kassering av bunnfallet. Dessuten, ved tilsetning av 0,2-0,6 vekt/vol prosent kalsiumacetat, kan ca. 99$ av ET-materialet fjernes uten å påføre et tap av den beskyttende fraksjonen (HA-titer og PT-innhold).

Referanseeksempel 2

Metoden i referanseeksempel 1 ble gjentatt med unntagelse av at pH-verdien ble justert til 5,0-10,0 med natriumhydroksyd eller saltsyre, og tilsetningsnivået for kalsiumacetat ble satt til 0,5 vekt/vol prosent. Resultatene er vist i tabell 2.

Ved å begynne ved pH 6,0 fant geldannelse sted, og fjerningen av endotoksin øket med økende pH. Det fremgår klart fra tabell 2 at den optimale pH-verdien er 7-9.

Referanseeksempel 3

Metoden i referanseeksempel 2 ble gjentatt med unntagelse for at 5 vekt/vol prosent hydroksylapatitt (BDH) ble benyttet istedenfor 0,5 vekt/vol prosent kalsiumacetat. Resultatene er vist i tabell 3.

Det fremgår klart fra tabell 3 at sammenlignet med tilsetningen av kalsiumacetat for dannelse av kalsiumfosfatgeler i oppløsningen, så gir tilsetningen av hydroksylapatitt en mindre effektiv fjerning av endotoksin og viser det motsatte av den ovenfor angitte pH-avhengighet.

Eksempel 1

Hvert av ekstrakt I (kontrollgruppe) oppnådd ved fremgangsmåten beskrevet i referanseeksempel 1 og materialet oppnådd ved tilsetning av kalsiumacetat til ekstrakt I ved sluttkonsentrasjonen på 0,5 vekt/vol prosent, og deretter behandling av blandingen som beskrevet i referanseeksempel 1, ble blandet med et likt volum av en mettet vandig oppløsning av ammoniumsulfat, og blandingen ble hensatt ved 4°C i 7 dager. Dette ammoniumsulfatutfelte materialet ble sentrifugert ved 10.000 omdr./min. i 20 min., og sedimentet ble oppsamlet. Deretter ble ca. 1/300 volumdeler, basert på volumet av opp-løsningen, av 1 M natriumklorid-0,05 M fosfatbuffer (pH 8,0) tilsatt. Etter grundig omrøring ble blandingen dialysert i et rør ved bruk av 1 M natriumkloridoppløsning (pH 8,0) som det eksterne fluid. Dialysatet ble underkastet sukrose-gradientsentrifugering under betingelser for sukrose-densitetsgradient = 1-30 vekt/vekt prosent, Rmaks = 69.400 G, og tid = ca. 18 timer. Mengden eller belastningen for kalsiumfosfatgeldannelsesgruppen ble doblet i forhold til mengden eller belastningen for kontrollgruppen. Etter sentrifugering ble 34 vekt/vekt prosent sukroseoppløsning tilført til rotoren for fraksjonert innhøsting. Hver således oppsamlet fraksjon ble bestemt med henblikk på FHA-innhold ved ELISA og for PT- og Et-innhold ved den samme metoden som beskrevet i referanseeksempel 1. Resultatene er vist på fig. 1 og 2. Her er FHA-, PT- og Et-innholdene vist ved -0-,

-A- og -[]-, respektivt.

Det fremgår fra fig. 1 og 2 at til tross for doblingen av den påførte mengde eller belastning, ga kalsiumfosfat-geldannelsesgruppen en klart mer adskilt separering av den beskyttende fraksjonen (FHA, PT) fra endotoksinet enn det som var tilfellet med kontrollgruppen.

I hver av kalsiumfosfatgruppen og kontrollgruppen ble fraksjonen som var fattig på ET og rik på FHA, oppsamlet, og dens proteiniske nitrogeninnhold ble justert til ca. 50 ug/ml. Til dette ble det tilsatt 0,02 vekt/vol prosent gelatin, 0,05 vekt/vol prosent Tween 80 og 0,4 vol/vol prosent formaldehyd, og blandingen ble inkubert ved 39°C i noen dager. Det resulterende toksoidfluidet ble dialysert og bestemt med henblikk på ET. Resultatene er vist i tabell 4. Et-innholdet ble analysert ved hjelp av limulus-lysattesten (Wako Pure Chemical-utstyr) ved bruk av E. coli endotioksin (Difco 055-B5) som standard.

Det fremgår klart fra tabell 4 at sammenlignet med ET-innholdet i pertussistoksoid-forrådsfluid ved vaksinenivå

(proteinisknitrogeninnhold 10 jjg/ml), så har ET-innholdet i kalsiumfosfat-geldannelsesgruppen blitt forbedret til mindre enn 1/40 av det i kontrollgruppen.

Eksempel 2

Ifølge originalmetoden til Levine (Reo Levine, Joseph L. Stone & Louise Wyman: Factors affecting the efficiency of the aluminium adjuvant in diphtheria and tetanus toxoids. J. Immunology 75, 301-307, 1955) ble hver av 2 porsjoner av pertussis toksoid-forrådsfluid fortynnet med M/250 fosfatbufret saltoppløsning (pH 7,0) til oppnåelse av et proteinisk nitrogeninnhold på ca. 10 ug/ml, fulgt av tilsetning av aluminiumklorid ved sluttkonsentrasjonen på 0,18 vekt/vol prosent. Blandingen ble godt omrørt og justert til pH 7,0 med saltsyre eller natriumhydroksyd for dannelse av ca. 0,2 mg/l aluminiumadsorbert vaksine.

Hovedegenskapene til denne vaksinen var:

pH 7,0, kanin-pyrogenisitet: Negativ, musevekt-reduksjon: 10 BWDU/ml eller mindre, museleukocytt-økning: 0,5 LPU/ml eller mindre, musehistamin-sensitivering: 0,8 HSU/ml eller mindre, og pertussis toksoid-virkningsgrad: 8 IU/ml eller mer. Således tilfredsstilte begge porsjoner de standardverdier som er spesifisert i Standard of Biological Products.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fjerning av endotoksin fra et fluid inneholdende antiinfeksjonsfraksjonen og endotoksin i stammer av fase I Bordetella pertussis, karakterisert ved: a) at det til nevnte fluid tilsettes kalsiumion i nærvær av overskudd fosfation slik at det oppnås et forhold for fosfation til kalsiumion som er fra 1,25 til 30 ekvivalenter fosfation til hver ekvivalent kalsiumion; b) sonesentrifugering av det således oppnådde fluid; c) gradvis dannelse av et bunnfall som er 0,01-0,1 milliekvivalent/ml av kalsiumfosfatgel ved en temperatur i området fra 4°C til romtemperatur og ved en pH-verdi i området fra 6,5 til 9 i fra 20 min. til 2 timer; og d) kassering av nevnte resulterende bunnfall.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et forhold for ekvivalenter fosfation til hver ekvivalent kalsiumion fra 1,5 til 7,5.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kalsiumionet som tilsettes er et kalsiumion av kalsiumacetat eller kalsiumklorid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det dannes et bunnfall av 0,02-0,07 milliekvivalent/ml av kalsiumfosfatgel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det resulterende bunnfallet av kalsiumfosfatgel oppnås ved oppløsning av bunnfallet, som oppnås ved faksjo-nert utfelling av supernatanten av et kulturmedium av nevnte stammer av fase I Bordetella pertussis ved bruk av ammoniumsulfat, i 1 M natriumklorid-0,05 M-fosfatbuffer, og tilsetning av kalsiumacetat ved sluttkonsentrasjonen på 0,1-1,0 vekt/vol prosent til oppløsningen ved de betingelser som er definert i trinn c) i krav 1.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at av kalsiumacetat tilsettes til en sluttkonsen-trasjon i området 0,2-0,6 vekt/vol prosent.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som sonesentrifugering anvendes sukrose-gradientsentrifugering .

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at sukrose-gradientsentrifugeringen utføres under følgende betingelser: densitetsgradient: 0-30 vekt/vekt-prosent; Rmaks: 60.000-122.000 G; tid: 10-24 timer.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et pertussistoksoid, karakterisert ved detoksifisering av et antiinfeksjonsfraksjonsholdig fluid oppnådd etter kassering av den utfelte kalsiumfosfatgel som definert i krav 1, ved (i) tilsetning av formaldehyd ved et nivå fra 0,1 til 0,6 vol/vol prosent i vesentlig fravær av basiske aminosyrer til nevnte fluid oppnådd ved sukrose- densitetssentrifugering under betingelsene: sukrose-gradient: 0-30 vekt/vekt-prosent; Rmaks: 60.000-122.000 g; tid: 10-24 timer, (ii) inkubering av blandingen ved 32-42°C i 3-14 dager for å bevirke flokkulering; (iii) splitting av det flokkaktige toksoid, og (iv) suspendering av dette i et vandig medium.