RU2135208C1

RU2135208C1 - Способ получения ви-антигена

Info

Publication number: RU2135208C1
Application number: RU98101075/14A
Authority: RU
Inventors: А.П. Аллилуев; М.В. Далин; Н.Г. Фиш; О.В. Котельникова; Э.Г. Кравцов
Original assignee: Аллилуев Александр Павлович
Priority date: 1998-01-20
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 1999-08-27

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, и касается способа получения ВИ-антигена. Сущность изобретения: микробную массу суспендируют в дистиллированной воде до концентрации (0,5-2,5)•10¹¹ кл/мл, насыщают суспензию поваренной солью, переосаждают микробную массу спиртом в интервале 27,3-71,5% насыщения. Ресуспендируют осадок и диализируют полученную суспензию против дистиллированной воды, добавляют к диализованной суспензии уксусную кислоту до 0,1 М конечной концентрации и проводят повторное переосаждение спиртом в интервале 27,3 - 71,5 % насыщения. Осадок вновь ресуспендируют в дистиллированной воде, добавляют уксусную кислоту до 1 М концентрации и проводят гидролиз при 100^oС. Гидролизат нейтрализуют, снова диализуют против дистиллированной воды, а интервал заключительного переосаждения спиртом устанавливают в диапазоне 27,3 - 52,0% насыщения, выделенный осадок растворяют в дистиллированной воде, подвергают полученный раствор ультрафильтрации на мембранах, отделяют фракцию биополимера с мол.м. более 300 КдН. В качестве антигена отбирают продукт, полностью блокирующий реакцию торможения прямой агглютинации эритроцитов морской свинки суспензией микроорганизмов культурой Escherichiacoli штамм 815 в дозе не более 5-10 мкг/мл по сухому весу. Технический результат заключается в повышении качества препарата за счет снижения примесей и обеспечении стабильной конформационной структуры. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а точнее к иммунологии, и может быть использовано в производстве вакцин и диагностических препаратов.

Предшествующий уровень техники
В настоящее время ВИ-антиген, являющийся протективным антигеном, используется в практике как вакцина против брюшного тифа, так и в качестве компонента обогащенной корпускулярной вакцины. Низкая реактогенность препарата позволяет использовать его для профилактики в детском контингенте. Кроме этого, ВИ-антиген входит в состав диагностикумов, характеризующихся высокой специфичностью (E. Jawetz, J.L.Melnic, E.A.Adelberg "Review of Medical Microbiology", 17 ed., Appleton & Lange, 1987, p.241). Не снижает актуальности в поиске ВИ-антигена и антител к нему внедряемые в практику методы генной диагностики, позволяющие идентификацию возбудителя по комплиментарности стандартного и искомого геномов (WO 95/24475 Al, TITBALL, C 12 N 15/10, A 61 K 39/02, 14.09.95). Однако в последнем случае невозможно оценить динамику течения болезни и степень защищенности пробанда от брюшного тифа, не располагая иммунохимическими диагностикумами на основе ВИ-антигена, входящими в состав высокочувствительных тест-систем.

Иммуногенность, безвредность и специфичность ВИ-антигена определяются степенью его очистки. Биохимическими методами экстрагирования и последовательного осаждения удается освободить ВИ-антиген от основной массы сопутствующих примесей (Э.Г.Кравцов и др. "VI-антиген и факторы адгезии микробов. Выявление адгезинов в коммерческих препаратах Vl-антигена", Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии, N 11, 1985, с. 33-37; А.П.Аллилуев и др. "Протективные свойства препаратов VI-антигена в зависимости от содержания в них адгезина", там же, N 12, 1988, с. 21-26). Однако наибольшую сложность представляет очистка от O-антигена (эндотоксина). Известно, что примесь именно этого антигена в основном определяет реактогенность получаемого препарата. Полимерная структура ВИ-антигена связана с присутствием адгезинов, выполняющих роль "сшивки", а количество адгезина определяет иммуногенность ВИ-антигена. Дезинтеграция ВИ-антигена при гидролизе происходит медленнее, чем O-антигена, за счет того, что сшивающий компонент закрыт полисахаридом (Э.Г. Кравцов и др. "Роль адгезина в полимерном строении VI-антигена", там же, N 2, 1989, с. 29-31).

В лабораторной практике известен способ разделения O и ВИ-антигенов путем гель-хроматографии на сефадексе G-200, предложенный фирмой Farmacia, в колоночном варианте оказался технически малопригодным и не нашел дальнейшего развития (В.С.Самсонова и др. "Фракционирование препаратов Vl-антигена S.Tuphi методом гель-фильтрации на сефадексе Г-200", там же, N 10, 1973, с.3-7). В производстве оказалось нерентабельным и использование сефарозы 4В (В.С.Самсонова и др. "Фракционирование препаратов Vl-антигена S.Typhi методом гель-фильтрации на сефарозе 4В", сб.научных трудов МНИИЭиМ "Микробные антигены", том XX, М., 1978, с. 75-78). Упомянутые способы не пригодны для получения больших количеств препарата. Поскольку оба антигена имеют большую молекулярную массу, то использование других высокопроизводительных способов разделения оказывается затруднительным.

В изобретении (RU 2080875 C1, ГОРБУНОВА и др., A 61 К 39/112, 39/116, 1997) при изготовлении вакцины, использующей, в частности, ВИ-антиген, раздельно обрабатывают компоненты бактерий водно-солевым раствором с одновременной дезинтеграцией при помощи шуттелирования в присутствии антибиотика гентамицина и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч и центрифугирования. Далее проводят диализ и лиофилизацию. Однако при таком способе выделения антигена трудно обеспечивать последующую стандартизацию тех компонентов, которые выделены на предшествующих технологических этапах.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ВИ-антигена (RU 2088244 C1, ЛЬВОВ и др., A 61 К 35/66, 1997). Способ заключается в том, что микроорганизмы Salmonella typhi штамм Ту2 4446 культивируют на питательной среде, отделяют супернатант и стерилизуют его микрофильтрацией путем использования мембран с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат центрифугируют при 105000 g в течение 16 час, обрабатывают нуклеазами, проводят обработку проназой. Очистку антигена осуществляют на колонке с сефарозой 4B-CZ в Трис-HCl буфере при pH 8,0. Однако хотя упомянутый способ позволяет за счет энзиматической деградации снизить общее количество примесей в полупродукте, колоночному варианту его обработки присущи те же технологические недостатки, о которых упомянуто выше со ссылками на работы (Самсонова B.C. и др.,1973, 1978). Кроме того, полученный по данному способу ВИ-антиген не стандартизуется на содержание активного адгезина: на этапе обработки полупродукта проназой возможно разрушение адгезивных сшивок и изменение полимерной структуры конечного продукта. Поэтому конформационная структура остается нестабильной, что в итоге не гарантирует стандартной иммуногенной активности препарата.

Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание способа получения ВИ-антигена брюшнотифозных микробов, в котором максимально сохранен адгезин, минимизировано содержание O-гаптена, а также иных мелкомолекулярных примесей.

Технический результат изобретения состоит в обеспечении стабильной конформационной структуры, гарантирующей, в свою очередь, высокую протективную активность препарата.

Технический результат обеспечивается за счет того, что способ получения ВИ-антигена включает культивирование микроорганизмов Salmonella typhi штамм Ту2 4446 на питательной среде, разделение жидкой фазы и микробной массы.

Микробную массу суспендируют в дистиллированной воде до концентрации (0,5 -2,5)•10¹¹ кл/мл, насыщают суспензию поваренной солью, переосаждают микробную массу спиртом в интервале 27,3 - 71,5% насыщения, ресуспендируют осадок и диализируют полученную суспензию против дистиллированной воды.

Далее добавляют к диализованной суспензии уксусную кислоту до 0,1 М конечной концентрации и проводят повторное переосаждение спиртом в интервале 27,3 - 71,5% насыщения, полученный осадок вновь ресуспендируют в дистиллированной воде, добавляют уксусную кислоту до 1 М концентрации и проводят гидролиз при 100^oC, гидролизат нейтрализуют, снова диализуют против дистиллированной воды, а интервал заключительного переосаждения спиртом устанавливают в диапазоне 27,3 - 52,0% насыщения. Выделенный осадок растворяют в дистиллированной воде, подвергают полученный раствор ультрафильтрации на мембранах, отделяют фракцию биополимера с молекулярной массой более 300 КдН.

В качестве антигена отбирают продукт, полностью блокирующий реакцию торможения прямой агглютинации эритроцитов морской свинки суспензией микроорганизмов культурой Escherichia coli штамм 815 в дозе не более 5-10 мкг/мл.

Способ может характеризоваться тем, что гидролиз проводят в течение 2,0 - 3,0 часов.

В основе изобретения лежат следующие предпосылки. При получении ВИ-антигена и обеспечении его высокой иммуногенности, как следует из уровня техники, необходимо обеспечить максимальное сохранение адгезина. Это возможно достигнуть за счет оптимизации длительности гидролиза и соответствующего контроля за содержанием адгезина. Установлено, что при гидролизе полупродукта в интервале 2,0 - 3,0 часа, O-антиген переходит в низкомолекулярную форму O-гаптена, а адгезин при этом еще не разрушается. Его деструкция наблюдается при более длительном времени гидролиза 3,5-4 часа и выше. Указанное обстоятельство дает возможность далее провести процесс разделения компонентов путем ультрафильтрации на мембранах с заданным размером пор. Контроль конечного продукта осуществляется по приведенным критериям.

Патентуемый процесс получения ВИ-антигена, таким образом, предусматривает:
- перевод O-антигена в форму O-гаптена путем гидролиза в течение не более 2,5-3 часов;
- отделение низкомолекулярных фрагментов O-гаптена ультрафильтрацией и сбор высокомолекулярного содержащего адгезин полимера с молекулярной массой более 300 КдН над мембраной;
- отбору в качестве конечного продукта подлежит полимер, удовлетворяющий установленному критерию в реакции агглютинации эритроцитов морской свинки в присутствии референс-штамма кишечной палочки: реакция торможения прямой агглютинации эритроцитов морской свинки культурой Escherichia coil должна полностью блокироваться в дозе не более 5-10 мкг/мл по сухому весу.

Предложенные приемы позволяют дезинтегрировать O-антиген до такой степени, что становится возможным его отделение ультрафильтрацией. При этом ВИ-антиген остается в высокомолекулярной форме и сохраняются его протективные и иммуногенные свойства.

Лучший вариант осуществления изобретения
Выращенные в реакторе брюшнотифозные микробы S.typhi Ту2 4446 убивают спиртом, высушивают, суспендируют в воде до концентрации 1•10¹¹ кл/мл, экстрагируют последовательно водой и переосаждают спиртом в интервале 27,3 - 71,5% его концентрации сначала в насыщенном растворе NaCl, а затем в 0,1-молярном растворе уксусной кислоты. Последний осадок растворяют и гидролизуют в 1 М уксусной кислоте при температуре 100^oC.

После окончания гидролиза нейтрализуют уксусную кислоту, проводят диализ и осаждают спиртом при 27,3-52,0% насыщения. Осадок растворяют до концентрации 12,5 мг/мл, осветляют центрифугованием, разводят в 10-15 раз и вносят в ячейку для ультрафильтрации через мембрану ХМ-300 "Diaflo". Концентрируют раствор в 15 раз и отмывают концентрат путем добавления в ячейку воды до исходного объема. Степень отмывки контролируют по оптической плотности выходящего из-под мембраны диализата.

Контроль качества осуществляют следующим образом.

Делают последовательные разведения полученного продукта в 25 мкл забуферного физиологического раствора pH 7,2, вносят по 25 мкл культуры E.coli, содержащей адгезин, в концентрации 4•10⁹ микробных клеток в 1 мл, и 25 мкл 1% взвеси эритроцитов морской свинки. Через 2 часа проводят учет реакции агглютинации. Полученный продукт полностью блокировал реакцию торможения прямой агглютинации в дозе 6 мкг/мл по сухому весу.

Отмытый концентрат собирают и лиофилизируют. Он представляет собой высокомолекулярную форму ВИ-антигена, содержащую адгезин, и, как показали исследования, не содержит O-антигена в форме O-гаптена.

Использование предлагаемого способа получения ВИ-антигена повышает специфичность препарата, увеличивает его иммуногенность и серологическую активность благодаря удалению низкомолекулярных дериватов, обладающих иммунодепрессивным действием. Высокая специфичность ВИ-антигена делает его более перспективным при использовании в производстве эритроцитарного ВИ-диагностикума, применяемого для диагностики брюшного тифа и выявления бактерионосителей.

В таблице приведены данные сравнительного изучения иммунологической эффективности двух препаратов ВИ-антигена. Первый - препарат фирмы "Мерье",- коммерческая вакцина, полученная по способу (World Health Organization, Technical Report Series, N 840, 1994) с показанной эпидемиологической эффективностью. Второй препарат получен нами по патентуемому способу. Видно, что иммунологическая эффективность второго препарата превышает таковую для препарата фирмы "Мерье". Поскольку тест протективности для мышей коррелирует с иммунологической эффективностью препаратов ВИ-антигена для людей, прогнозируется более высокая клиническая эффективность ВИ-антигена по патентуемому способу.

Промышленная применимость
Приведенное описание описывает весь технологический процесс получения ВИ-антигена, позволяющий реализовать способ без дополнительного изобретательства. Используемые реактивы общедоступны, а мембраны для диафильтрации выпускаются рядом предприятий. При реализации патентуемого процесса можно использовать мембраны марки МВ-100 фирмы "Мемтекс" (г. Мытищи, Россия), марки ХМ-300 "Diaflo" фирмы "Amicon" (USA) или другие подобные.

Claims

1. Способ получения ВИ-антигена, включающий культивирование микроорганизмов Salmonella typhi штамм Ty2 4446 на питательной среде, разделение жидкой фазы и микробной массы с последующей ее обработкой реагентами, ультрафильтрацию и отбор антигена, отличающийся тем, что микробную массу суспендируют в дистиллированной воде до концентрации (0,5 - 2,5) • 10¹¹ кл/мл, насыщают суспензию поваренной солью, переосаждают микробную массу спиртом в интервале 27,3 - 71,5% насыщения, ресуспендируют осадок и диализируют полученную суспензию против дистиллированной воды, добавляют к диализованной суспензии уксусную кислоту до 0,1 М конечной концентрации и проводят повторное переосаждение спиртом в интервале 27,3 - 71,5% насыщения, полученный осадок вновь ресуспендируют в дистиллированной воде, добавляют уксусную кислоту до 1 М концентрации и проводят гидролиз при 100^oC, гидролизат нейтрализуют, снова диализуют против дистиллированной воды, а интервал заключительного переосаждения спиртом устанавливают в диапазоне 27,3 - 52,0% насыщения, выделенный осадок растворяют в дистиллированной воде, подвергают полученный раствор ультрафильтрации на мембранах, отделяют фракцию биополимера с мол. м. более 300 КдН, а в качестве антигена отбирают продукт, полностью блокирующий реакцию торможения прямой агглютинации эритроцитов морской свинки суспензией микроорганизмов культурой Escherichia coli штамм 815 в дозе не более 5 - 10 мкг/мл по сухому весу.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидролиз проводят в течение 2,0 - 3,0 ч.