SU1692580A1

SU1692580A1 - Способ получени тул ремийного антигена

Info

Publication number: SU1692580A1
Application number: SU894676656A
Authority: SU
Inventors: Людмила Петровна Шишкина; Евгений Юрьевич Марков; Любовь Викторовна Меринова; Николай Андреевич Суханов
Original assignee: Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
Priority date: 1989-04-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1991-11-23

Abstract

Изобретение относитс к медицине, а именно к получению диагностических препаратов . Цель изобретени -повышение антигенной активности и специфичности препарата. Способ включает выращивание вирулентного штамма тул ремийного микроба на твердой питательной среде, экстрагирование антигена неионным детергентом Твин-80, отделение микробной массы центрифугированием и дополнительную очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием с последующей гель-хроматографией раствора полученного осадка в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере, содержащем додецилсульфат натри , на колонке с сефакрилом S-300, диализом антиген содержащих фракций, осаждением продукта этанолом и лиофилизацией. (Л С о. о ю ел 00 о

Description

Изобретение относитс к медицине, а именно к получению диагностических препаратов , и может быть использовано дл конструировани иммунохимических тест- систем дл обнаружени специфических противотул ремийных антител и дл постановки аллергической пробы.

Известны способы приготовлени антигенных препаратов из убитых формалином микробных клеток 1, из разрушенных ультразвуков микробных клеток 2 и из препаратов наружных мембран 3.

Известны способы получени разной степени очистки препаратов специфических антигенов водно-фенольной 4, водно- ацетоновой 5, и солевой 6 экстракции.

Недостатком указанных способов вл етс использование токсических дл человека веществ (фенола, эфира, ацетона), обработка которыми микробной массы может измен ть нативные свойства и экстра- гируемость бактериальных антигенов. Использование цельных микробных клеток или их фрагментов (наружные мембраны) или водно-солевых экстрактов в качестве специфического антигена нежелательно из-за возможности ложноположительных реакций, св занных с наличием неспецифических антигенов.

Известен способ получени тул ремий- ного антигена (тул ринлизата), включающий получение микробной массы, обработку ее детергентом в течение 2 ч при 37°С дл обеспечени лизиса и экстракции поверхностных антигенов тул ремийного микроба с последующим прогреванием в течение 10 мин при 90°С дл обеззараживани микробной массы и центрифугированием при ЮОООхд в течение 30 мин 7.

Недостатком способа вл етс низка степень очистки препарата специфического антигена от детергента, балластных бактериальных антигенов и нековалентно-св - занных липидов, не обеспечиваетс выход стандартизованного высокоактивного препарата .

Целью изобретени вл етс повышение антигенной активности и специфичности препарата.

В качестве исходного продукта дл получени специфического белково-липопо- лисахаридного антигена тул ремийного микроба используют взвесь вирулентных клеток возбудител тул ремии штамма Tr. tularensis 777. Культуру выращивают на желточном агаре Анциферова в течение 48 ч при 37°С. Затем после проверки на чистоту, путем микроскопировани , культуру смывают стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрир рН 7,2 и готов т микробную

взвесь в концентрации 20 млрд микробных клеток по ОСО мутности ГИСК имени Л.А,Тарасовича. К полученной взвеси стерильно добавл ют 1 % твина-80 до конечной

концентрации, выдерживают 2 ч при 37°С и прогревают 10 мин при 90°С на вод ной бане при периодическом перемешивании. Полученную микробную массу провер ют на стерильность и при отсутствии специфического роста провод т центрифугирование при ЮОООхд в течение 30 мин дл освобождени от неразрушенной микробной массы. Супернатант, содержащий экстрагированные антигены тул ремийного микроба,

подвергают ультрацентрифугированию при 105000хд в течение 2 ч при 4°С дл осаждени белково-липополисахаридного комплекса тул ремийного микроба, освобождени от детергента и низкомолекул рных соединений, Образовавшийс осадок ресуспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем провод т окончательную очистку препарата, предварительно растворенного в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,5 с добавлением 2% додецилсульфата натри , дл полного растворени антигенного осадка , гельфильтрацией на колонке с севакри- лом S-300, уравновешенной 0,01 М

аммоний-ацетатным буфером в присутствии 0,1% додецилсульфата натри . Препарат элюируетс этим же буфером под контролем проточного спектрофотометра и самописца и собираетс в пробирки по 2 мл. Объедин ют фракции, содержащие целевой продукт, диализуют в течение суток против проточной воды и осаждают антиген добавлением к раствору дес ти объемов охлажденного до 4°С этанола, Выдерживают смесь в холодильнике в течение суток и центрифугируют в течение 40 мин при бОООхд. Осадок раствор ют в небольшом количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Полученный препарат вл етс комплексным белково-липополисахаридным антигеном . В его состав входит около 7% белка, 20% эквивалентов глюкозы (реакци с фенолом и концентрированной серной кислотой). Препарат дает положительную

качественную реакцию с Суданом черным на наличие липидов, практически свободен от примесей нуклеиновых кислот, Препарат вызывает сдвиг максимума поглощени карбоцианинового красител Stains all

5 (Serva, ФРГ) (метахроматический эффект) в коротковолновую часть спектра (472 нм), что характерно дл липополисзхаридов грамот- рицательных бактерий. Препарат иммуно- химически идентичен ЛПС, выделенному

водно-фенольной экстракцией, что следует

из сли ний полос преципитации антигена, полученного предлагаемым способом и известным 4.

По своей специфической активности в иммуноферментном анализе полученный очищенный препарат превосходит препарат , полученный по известному способу 7 в 16-32 раза.

Эритроцитарный диагностикум, приго- товленный сенсибилизацией предлагаемого антигена, также пригоден дл иммунохимических исследований.

При изучении биологических свойств отмечено, что полученный белково-липопо- лисахаридный антиген нетоксичен дл белых мышей, стимулирует выработку антител у кроликов до титра 1:1000000 - 1:8000000, при иммунизации неочищенным тул рин- лизатом 1:6400 - 1:512000, при иммунизации водно-фенольным ЛПС - до титра 1:6400 в иммуноферментном анализе. Кроме того, препарат при изучении In vivo обладает аллергенными свойствами (накожна аллергическа реакци до 15 мм по сравнению с реакцией на введение эквивалентной дозы коммерческого тул рин-ли- зата - 7 мм).

Claims

Формула изобретени Способ получени тул ремийного антигена , включающий культивирование тул ремийного микроба, отделение бактериальных клеток, обработку детергентом, стерилизацию прогреванием с последующим низкоскоростным центрифугированием и выделением надосадочной жидкости, содержащей целевой продукт, отличающийс тем, что, с целью повышени антигенной активности и специфичности препарата, провод т дополнительную очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием при 105000хд в течение 2 ч, полученный осадок раствор ют в 0,01 М ам- моний-бикарбонатном буфере, содержащем додецилсульфат натри , затем очищают гельхроматографией на колонке с сефакрилом S-300, собирают фракции, содержащие античен, диализуют их, далее осаждают целевой продукт этанолом, отдел ют осадок центрифугированием, раствор ют его в дистиллированной воде и лиофилизуют.