FI59024C - Foerfarande foer framstaellning och rening av en antigen till c-gruppen hoerande meningokockpolysackarid som har hoeg molekylvikt och aer aktiv mot av c-gruppens meningokocker orsakad meningit - Google Patents

Description

raSFH Γβ] (11)kuulutusjulkaisu con 9 λ flgljft lJ 1' UTLÄGGNI NGSSKIIIFT 3 ? U ά 4 C Patentti my'Jnnotty 10 06 1931

Patent meddelat ^ ^ (51) K».ik.3/h«.ci.3 A 61 K 39/095 SUOMI—FINLAND pi) hw«ih^-p>t»Mwiknta| 782201+ (22) H»k«mlip»lvt — AmBknlnftdic 10.07.78 * * (23) AlkupUvt — Giltlgh«tsdag 10.07.78 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offantllg Q2 q£ jg

Patentti· ja rekisterihallitut .... ......... . . .....

_ 1 (44) Nlhttvikslpanon j» kuuL|ulk*hun pvm. —

Patent· och regletentyrelaen Amekan uth*d och uti.*krtft*n pubikand 27.02.81 (32)(33)(31) Pretty «*ιιοΙΙι·ιι» —Begird priorltet Q1.08.77 usa(us) 820665 (71) Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey 07065, USA(US) (72) Arpi Hagopian, Sayreville, N.J., Dennis John Carlo, South Amboy, N.J., Thomas Henry Stoudt, Westfield, N.J., USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5M Menetelmä antigeenisen suurimolekyylipainoisen ryhmän C meningokokki-polysakkaridin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi, joka vaikuttaa ryhmän C meningokokkien aiheuttamaa aivo-selkäydinkalvon tulehdusta vastaan - Förfarande för framställning och rening av en antigen till C-gruppen hörande meningokockpolysackarid, som har hög molekylvikt och är aktiv mot av C-gruppens meningokocker orsakad meningit

Keksinnön kohteena on menetelmä antigeenisen suurimolekyylipainoisen ryhmän C meningokokki-polysakkaridin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi, joka vaikuttaa ryhmän C meningokokkien aiheuttamaa aivo-selkäydinkalvon tulehdusta vastaan ja jossa ainakin 80 paino-%:lla polysakkaridista on molekyylipaino yli 1 000 000 daltonia. Erityisesti menetelmän mukaan valmistettu polysakkaridi on tehokas aikaansaamaan immuniteetin ryhmän C meningokokkien aiheuttamaa aivo-selkäydinkalvon tulehdusta vastaan alle 2 vuotiailla lapsilla. Tämä alempi ikäryhmä on erityisen altis tartunnalle erityisesti epidemioiden aikana.

Meningokokkien aiheuttama aivo-selkäydinkalvon tulehdus on tauti, jossa aivoja ja selkäydintä ympäröivät kalvot tulehtuvat. Aikaisemmin useimmat bakteerien aiheuttamat aivo-selkäydinkalvon 59024 tulehdustapaukset olivat äkillisiä ja johtivat kuolemaan. Antibioottihoito on alentanut kuolleisuusmäärää tapauksissa, jotka todetaan aikaisessa vaiheessa. Tästä huolimatta tunnistamatonta aivo-selkäydinkalvon tulehdusta esiintyy patologisena sairautena. Antibiooteista huolimatta paranemistoiveet ovat vähäiset varsinkin nuoremmilla potilailla. Tämä negatiivinen ennuste johtuu osittain siitä, että 3 kuukaudesta 2 vuoden ikäisiksi lapset harvoin osoittavat taudille tyypillisiä oireita. Siten antibioottihoito, joka täytyy aloittaa aikaisin, myöhästyy siksi kunnes lapsi on auttamattomasti ja selvästi sairas tai taudin läsnäolo on todettu laboratorio-löydöksistä .

Aivo-selkäydinkalvon meningokokki-tulehdus aiheutuu Neisseria meningitidis-lajista. Tämä laji on luokiteltu serologisiin ryhmiin; A, B, C ja D jne. Jokainen näistä ryhmistä luokitellaan luonteenomaisen kapselipolysakkaridin perusteella, joka liittyy nimenomaisen ryhmän soluseinään. On todettu, että tätä polysakkaridia käsittävä solukomponentti, kun sitä annetaan imettäväiselle, tuottaa vasta-ainetta ja antaa siten suojan myöhempää tarttumista varten.

Nyt on keksitty meningokokki-polysakkaridien valmistamiseksi menetelmä, jossa käytetään fenoli-uutosvaihetta polysakkaridin puhdistamiseksi ja proteiinien poistamiseksi ja jolla saadaan rokotteeseen sopiva tuote, jolla on suurempi molekyylipaino. Tämä on edullista, koska on yleisesti myönnetty, että suurempimolekyylipai-noiset polysakkaridi-tuotteet aikaansaavat korkeamman immuniteetin verrattuna pienempimolekyylipainoiseen aineeseen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä mainitun meningokokki-poly-sakkaridin valmistamiseksi polysakkaridi eristetään viljelmästä seostamalla kvaternäärisellä ammoniumhalidisuolalla, saatu sakka liuotetaan vesipitoiseen kalsiumkloridiliuokseen ja polysakkaridi saostetaan uudelleen etanolilla, ja menetelmälle on tällöin tunnusomaista se, että (a) liuotetaan uudelleensaostettu polysakkaridi vesipitoiseen puskuriliuokseen pH-alueella 6,8 - 7,2; (b) uutetaan polysakkaridia sisältävä puskuriliuos vesipitoisella puskuri-fenoliliuoksella; (c) vaiheessa (b) saatu seos ultrasentrifugoidaan supernatan-tin erottamiseksi fenolikerroksesta; (d) puhdistettu polysakkaridi saostetaan laimentamalla mainittu supernatantti etanolilla väkevyyteen 40-50 % tilav./tilav. etanolissa; ja * 3 59024 (e) puhdistettu polysakkaridi otetaan talteen.

Menetelmiä, jotka liittyvät meningitidis-kannan viljelyyn sekä polysakkaridin eristämiseen ja puhdistamiseen, on yleisesti kuvattu Gotschlich'in US-patentissa 3.636.192, erityisesti sarakkeissa 3-5.

Mainitussa patentissa on kuvattu serologisen ryhmän A ja ryhmän C meningokokkien antigeenisten ryhmä-spesifisten polysakkaridien valmistus ja eristäminen. Julkaisussa Liu et ai., Journal of Biological Chemistry, Voi 246, n:o 15 s. 4703-4712 (1971) on kuvattu ryhmän B ja ryhmän C meningokokki-polysakkaridien koostumus ja kemialliset ominaisuudet. Molempien on todettu olevan siaali-hapon puhtaita homopolymeerejä. Edelleen on julkaisussa Bhattacharjee et ai., Journal of Biological Chemistry, Voi. 250, n:o 5, s. 1926-1932 (1975) kuvattu siaalihapporyhmän B ja C polysakkaridien rakenteen määrääminen.

Aikaisemmin on tunnettua valmistaa rokotteita ryhmien A ja C kapselipolysakkarideista ^CA 61 (1964) 12524 h; C.A. William -M.W. Chase: Methods in Immunology and Immunochemistry, Voi. I, 1967, s. 52-60; ATCC Catalogue of Strains I, 1978 s. 148; Lääketieteellinen mikrobiologia 1975, s. 235-236; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos, 1974, s. 490-500; ja Microbiology Abstracts 11B, 1976, n:o 10638^. Keksinnön mukaisessa menetelmässä uuttaminen fenolilla, mikä vaihe ei sisälly aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin ryhmän C meningokokki-polysakkaridin eristämiseksi ja puhdistamiseksi, käsittää parannuksen, koska sen avulla voidaan selektiivisesti eristää polysakkarideja, joilla on suurempi molekyylipaino kuin niillä polysakkarideilla, jotka on aikaisemmin uutettu kloroformilla (katso esim. C.A. Williams -M.W. Chase: Methods in Immunology and Immunochemistry, Voi 1/ 1967, s. 52-60).

Tämä suurempimolekyylipainoinen polysakkaridi valmistettiin Neisseria meningitidis-viljelmästä, joka oli saatu Dr. Emil C. Gotschlich'in, Rockefeller-yliopisto, suosiollisella avustuksella. Viljelmä osoittautui olevan gram-negatiivinen Diplococcus, joka on katalaasi-positiivinen, oksidaasi-positiivinen ja tyyppiä C Neisseria meningitidis-tyypin C vastaseerumien mukaan. Kanta on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852 ja deponointitunnuksella ATCC 31275. Juuri tätä kantaa, johon edellä viitattiin, käytetään valmistavissa vaiheissa, jotka esite- 4 59024 tään tämän esityksen myöhemmissä osissa, joissa esitetään tämän keksinnön edullinen toteuttamistapa yksityiskohtaisesti. Sentähden se on edullinen kanta rokotteen tuottamista varten, vaikkakin muut voivat olla yhtä tehokkaita.

N. meningitidiksen viljelmää kasvatetaan sopivalla tavalla, mutta edullisesti tässä selityksessä menetelmän mukaisesti. Käyminen lopetetaan ja haluttu kiinteä aine, joka sisältää polysakkaridia, seostetaan koko viljelmästä sopivalla kationilla, esimerkiksi kvaternäärisellä ammoniumsuolalla. Edullisesti tämä suola toimii myös bakteerimyrkkynä N. meningitidistä vastaan. Valittu suola on heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidi. Tämän suolan käyttö poistaa pastöroimisvaiheen tarpeen. Saostetut kiinteät käymistuotteet kootaan linkoamalla ja polysakkaridi uutetaan linkoamisjäänteestä vesipitoisella kalsiumkloridillä.

Yhdistettyihin uutteisiin lisätään etyylialkoholia kunnes uutosliuos sisältää 25-35 tilav.-% etanolia. Uutosliuos suodatetaan ja suodokseen lisätään etanolia kunnes sen lopullinen pitoisuus on 75-85 tilav./tilav.-%. Raaka polysakkaridisakka kootaan suodattamalla tai linkoamalla.

Saatua tuotetta joko käsitellään välittömästi tai valinnaisesti polysakkaridisakka kuivataan asetonilla tai muulla ei-sekoit-tuvalla nesteellä varastointia varten.

Raaka välituote-polysakkaridi liuotetaan sitten pieneen määrään puskuroitua vesipitoista liuosta. On tärkeää pitää polysakka-ridiliuos pH-välillä 6,8-7,2 ja mitä tahansa tälle alueelle sopivaa puskuria voidaan käyttää. Edullinen puskuri on kuitenkin nat-riumasetaatti, erityisesti 0,4-0,6 molaarinen natriumasetaatti-liuos. Puskuroitu polysakkaridiliuos uutetaan sitten puskuroidulla fenoliliuoksella ainakin kahdesti, edullisesti neljä kertaa. Hyvä puskuroitu fenoliliuos sisältää 70-80 % paino/tilav. fenolia vesipitoisessa puskurissa, joka pitää pH:n välillä 6,8-7,2.

Vesipitoinen polysakkaridi/fenoli-seos on emulsio, joka ha-joitettaessa muodostaa orgaanisen fenolia runsaasti sisältävän kerroksen, jossa on proteiinia ja muuta orgaanista jätettä, väli-kerroksen pinnan ja vesipitoisen runsaasti polysakkaridia sisältävän kerroksen. Fenolikerros heitetään pois ja vesipitoisen faasin uuttaminen toistetaan riittävän monta kertaa polysakkaridin vapauttamiseksi proteiiniepäpuhtaudesta.

Lopuksi saadaan kirkas vesipitoinen, runsaasti polysakkaridia sisältävä faasi. Tämä laimennetaan 0,1-0,01 molaarisella kalsium- 5 59024 kloridilla kunnes fenoli-pitoisuus on alle 1 tilav-/tilav..

Liuos saatetaan sitten 30-33 tilav./tilav.-% etanolia sisältäväksi ja ultrasentrifugoidaan 100.000 x g:ssä. Sakan päällä oleva kirkas neste saostetaan sitten saattamalla liuos 40-50 tilav./ tilav.-% etanolia sisältäväksi.

Sakan annetaan laskeutua, edullisesti ainakin 8 tuntia 5°C:ssa. Sakka kootaan, pestään sekoittumattomalla liuottimena ja kuivataan tyhjössä jolloin saadaan aine, josta ainakin 80 %:lla on molekyyli-paino 1.000.000.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edullista menetelmää tämän keksinnön toteuttamiseksi.

Esimerkki 1

Ympin valmistaminen

Vaihe 1

Esiymppäysvaihe

Neisseria meningitidis ATCC 31275:n lyofilisoitu viljelmä-putki avataan ja suspendoidaan 0,5 ml:aan modifioitua Frantz-väli-ainetta. Tämän ja kaikkien muiden väliaineiden, joihin tässä viitataan, koostumus on esitetty luettelossa I, joka seuraa näitä esimerkkejä. Suspensio levitetään Miiller-Hinton-väliaineagarle-vyille (0,1 ml/levy) ja levyjä inkuboidaan 18 tuntia 37°C:ssa kynt-tilätölkissä. Näiden levyjen kasvu suspendoidaan uudelleen 3 ml:aan (levyä kohti) modifioitua Frantz-väliainetta ja levitetään Miiller-Hinton-levyille (0,1 ml/levy). Levyjä inkuboidaan 18 tuntia 37°C:ssa kynttilätölkissä. Toisen levysarjan sato suspendoidaan uudelleen modifioituun Frantz-väliaineeseen (5 ml/levy). Yhteen-koottu suspensio jaetaan 2 ml:n tasaosina kierrekannella varustettuihin pulloihin ja pakastetaan -70°C:ssa esiymppiaineeksi. Yhteen-koottu suspensio tutkitaan mikroskooppisesti ja sivellään Miiller-Hinton-levyille (25°C ja 37°C) puhtauden toteamiseksi. Myös serologinen testaus suoritetaan.

Vaihe 2

Ymppäysvaihe

Pakastettu esiymppipullo vaiheesta 1 sulatetaan ja 0,1 ml levitetään Miiller-Hinton-levyille ja inkuboidaan 16 tuntia 37°C:ssa kynttilätölkissä. Levyjen kasvu suspendoidaan (5 ml/levy) modifioituun Frantz-väliaineeseen. Yhteenkoottu suspensio tutkitaan puhtauden suhteen sivelemällä sitä Miiller-Hinton-levyille (25°C ja 37°C), mikroskooppitutkimuksella ja serologisella tunnistamisella. Suspensio jaetaan (2 ml:n tasaosiin) kierrekannella varustettuihin 6 59024 pulloihin ja jäähdytetään -70°C:ssa ymppiaineeksi.

Vaihe 3

Kasvukausi (2 1) Jäähdytetty pullo vaiheessa 2 valmistetusta ymppiaineesta sulatetaan ja levitetään neljälle Muller-Hinton-levylle (0,1 ml -0,15 ml/levy). Levyjä inkuboidaan 16 tuntia 37°C:ssa kynttilätöl-kissä. Jokaisen levyn kasvu suspendoidaan 5 ml:aan modifioitua Frantz-väliainetta ja 4 levyä käytetään ymppäämään 2 l:n Erlen-meyer-pullo (joka sisältää 1 1 modifioitua Frantz-väliainetta).

2 l:n pulloa inkuboidaan 5 tuntia 37°C:ssa täristimellä nopeudella 200 r/min. Tämän yhden litran ympin O.D. on käyttöhetkellä 0,5 ja pH 6,4. 2 litran pullo tutkitaan mikroskooppisesti puhtauden suhteen. Ymppi sivellään Muller-Hinton-levyille, inkuboidaan 24 tuntia (25°C ja 37°C) ja tutkitaan puhtauden suhteen.

Vaihe 4

Ymppitila

Yksi litra ymppiä vaiheesta 3 käytetään ymppäämään 14 l:n New Brunswick Scientific-käymislaite (malli MA-100), joka sisältää 9 1 käymisväliainetta. Käymisen annetaan jatkua 14 tuntia 37°C:ssa, 1,5 l:n/min. keskimääräisellä ilmavirralla ja sekoitusnopeudella 200 r/min. Tänä ajankohtana ympin O.D. on 0,84 ja pH 5,3. Ymppi tutkitaan mikroskooppisesti puhtauden suhteen ja sivellään Miiller-Hinton-agar-levyille, joita inkuboidaan 24 tuntia (25°C ja 37°C) ja tutkitaan senjälkeen puhtauden suhteen.

Vaihe 5

Tuotantovaihe 10 1 ymppiä vaiheesta 4 käytetään ymppäämään New Brunswick

Scientific-käymislaite (malli FM 250), joka sisältää 190 1 tuotanto- väliainetta (ks. luetteloa I). Käymislaitetta säädellään 0,0283 2 kuutiometrin ilmavirralla minuutissa 0,07 kg/cm paineessa keskimääräisen lämpötilan ollessa 37°C ja sekoittaen nopeudella 200 r/min. Käymistä jatketaan 12 tuntia. Lopullinen O.D. on 1,6 ja loppu-pH on 5,5. Kun käyminen on lopetettu tutkitaan viljelynäyte mikroskooppisesti märällä aluslasilla ja gram-väritäplällä puhtauden vahvistamiseksi. Se tunnistetaan myös serologisesti. Näyte sivellään myös Muller-Hinton-agarlevyille, joita inkuboidaan (25°C:ssa ja 37°C:ssa) 24 tuntia ja tutkitaan puhtauden suhteen.

Vaihe 6

Korjuu- ja inaktivoimisvaihe

Panos vaiheesta 5 korjataan talteen 19 litran tölkkeihin, 7 59024 jotka sisältävät 10 ml 10-%:sta Cetavlon1 ia (heksadekyylitrimetyyli-ammoniumbromidia) litraa kohti lientä, ja sekoitetaan perusteellisesti. Inaktivoimisen jälkeen panos testataan steriiliyden suhteen. Ennen linkoamista panoksen annetaan olla vähintäin 2 tuntia Cetavlon'in kanssa hyvän saostumisen varmistamiseksi. Käymisväliaineiden luettelo Ymppäysväliaine a. Muller-Hinton-agar 1. Dehydratoitua Difco-Miiller-Hinton-väliaine-agaria 40 g/1.

b. Modifioitu Frantz-väliaine - 2 litran pullot

Kasamino-happoja 300 g dekstroosia 150 g vedetöntä Na2HP04 82,5 g

MgS04 . 7H20 19,5 g KC1 2,75 g L-kysteiini-HCl-monohydraattia 605 mg fenolipunaista 99 mg tislattua 1^0 30 1 Tämä väliaine steriloidaan suodattamalla Millipore-suodattimen (0,22 mikronia) läpi ja jaetaan 1 1 aseptisesti 2 l:n Erlenmeyer-pulloon.

c. Ymppäysväliaine - 14 litran käymislaite

Seuraavat aineet lisättiin käymislaitteeseen ja steriloitiin 60 minuuttia 121°C:ssa: UCON LB625 voiteluainetta 8 % (veteen liukenematon metallivoiteluaine; mol.paino = 625; valmistaja Union Carbide, U.S.A.) 10 ml fenolipunaista 30 mg

Na2HP04 27,5 g tislattua t^O 8 1 LB625-voiteluainetta esisteriloitiin 60 minuuttia 121°C:ssa ennen käymislaitteeseen lisäämistä.

Seuraava väkevöite suodatus-steriloitiin steriiliin käymislaitteeseen :

Kasamino-happoja (teknisiä) 100 g dekstroosia 50 g

MgS04 . 17H2o 6,5 g KC1 917 mg L-kysteiini-HCl-monohydraattia 201,8 mg tislattua H20 1 1 β 59024

Suodattimena käytettiin 293 mm:n (0,22 mikronin) Millipore-suodatinta.

Käymisväliaine

Seuraava seos lisättiin käymislaitteeseen ja steriloitiin 30 minuuttia 121°C:ssa: 400 ml 8-%:sta UCON LB625 voiteluainetta 634 mg fenolipunaista 530 g Na2HP04 170 1 tislattua H20.

LB625 voiteluainetta esisteriloitiin 60 minuuttia 121°C:ssa ennen käymislaitteeseen lisäämistä.

Seuraava väkevöite suodatus-steriloitiin steriiliin käymislaitteeseen:

Kasamino-happoja (teknisiä) 2700 g glukoosia 1080 g

MgSO4.7H20 140,4 g KC1 19,8 g L-kysteiini-HCl-monohydraattia 4,4 g tislattua H20 20 1

Esisuodattimena käytettiin Horm-puristinta ja D-8 suodatin- tyynyjä (painesuodatuksessa käytetty puristin ja suodatintyyny; valmistaja F.R. Hermann Co., Hilldale, CT, U.S.A.) ja lopullisena suodattimena 293 mm:n (0,22 mikronin) Millipore-suodatinta.

Luettelo II Inaktivoimismenetelmä

Cetavlon-käsittelyn vähimmäisaika oli 2 tuntia. Panos tutkittiin sitten steriiliyden suhteen kuten luettelossa III on kuvattu.

Luettelo III

Sterilliystestl inaktivolntia varten 0,5 ml:n tasaosa-annos testattavaa liuosta levitettiin jlilLer-Hinton-levylle ja inkuboitiin kynttilätölkissä 37°C:ssa 18 tuntia. Positiivinen steriiliystesti saatiin, kun levyjä tutkittiin mikroskooppisesti 10-kertaisella suurennuksella eikä mikrobikasvua havaittu.

Luettelo IV

Agglutinaatiotesti mikroskoopin kohdelasilla (serologinen testi)

Pisara uudelleenhydratoitua Bacto-Meningococcus-vastaseeru- 9 59024 mia (tyyppiä C) pantiin kohdelasille. Silmukallinen N. meningo-coccusviljelmää tuotiin sitten vastaseerumipisaraan ja sekoitettiin vastaseerumin kanssa. Positiivinen testi saatiin, kun tapahtui solujen agglomeroitumista.

Esimerkki II

Suurimolekyylipainoisen polysakkaridin valmistus käytettäväksi rokotteessa

Cetavlon'ia (heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidia) lisätään pitoisuuteen 0,1 % tilav./tilav. ja lingotaan 10 cm:n läpimittaisessa Sharples-putkikorilingossa, jolloin saadaan 2,24 kg märkää kiinteätä käymismassaa 600 l:sta N.meningitidis-ryhmän C pastö-roimatonta viljelmää.

Kiinteät käymistuotteet pestään homogenoimalla 30,3 litran hajotussekoittimessa 20 litran kanssa pyrogeenitöntä vettä. Pesty kiinteä aine kootaan linkoamalla 10 cm:n läpimittaisessa Sharples-putkikorilingossa .

Polysakkaridi uutetaan saadusta 2,0 kg:sta pestyä tahnaa homogenoimalla 30 litran hajoitussekoittimessa 15 litran kanssa ionista kalsiumkloridiliuosta. Vedetöntä etyylialkoholia lisätään tähän lietteeseen 33 tilav./tilav.-% määrään etanolia ja kirkas supernatantti saadaan linkoamalla 12 000 g:ssa jäähdytetyissä sai-raalalingoissa 30 minuuttia -5°C - -10°C:ssa. Supernatanttia kirkastetaan edelleen suodattamalla se huokoisuudeltaan keskinkertaisen 2 670 cm painesuodattimen läpi.

Suodos lisätään sellaiseen määrään etanolia, että saadaan etanolin loppupitoisuudeksi 80 tilav./tilav., samalla sekoittaen 113 litran ruostumattomassa teräskattilassa. Saatu raaka poly-sakkaridisakka kootaan käyttäen 50 mm:n läpimittaista Sharples-linkoa. Kiinteä aine homogenoidaan 0,9 litran Waring-sekoittimessa 500 ml:n kanssa asetonia ja kootaan linkoamalla sairaalasentri-fugissa 12 000 g:ssa 10 minuuttia. Saadaan 500,4 g asetonin kostuttamaa sakkaa.

250,2 g tätä raakaa välituotetta liuotetaan 12,8 litraan 0,48 M natriumasetaattipuskuria pH 6,9, käyttäen 30 litran hajoi-tussekotinta. Tämä liuos sekoitetaan 4,48 litran kanssa fenoli-liuosta, joka on tehty lisäämällä 900 ml natriumasetaatti-puskuria 2,27 kg:aan kiteistä fenolia. Emulsio syötetään sitten jatkuvaan Elektronukleonics "K2"-ultrasentrifugiin (ultrasentrifugi, malli K2; valmistaja Electronucleonics) virtausnopeudella 300 ml/min. ja kierrosnopeudella 30 000 r/min. Liukenematon fenoli ja välikerros- 59024 10 ainetta jää pyörivään maljaan/ kun taas supernatantti/ josta proteiini on poistettu, virtaa yli ja kootaan. Fenolikerros heitetään pois ja fenolilla kyllästetty supernatantti sekoitetaan 3,2 litran kanssa fenoliliuosta uutta uuttoa varten. Yhteensä suoritetaan neljä fenoliuuttoa polysakkaridiliuokselle, jolloin saadaan 15,2 1 kirkasta vesipitoista faasia. Jäljellejäävää 250,2 g raakaa välituotetta uutetaan fenolilla kuten edellä, jolloin saadaan 15,6 1 kirkasta vesipitoista faasia.

Jokainen vesipitoinen faasi laimennetaan 20-kertaiseksi (300 litraksi) 0,05 M kalsiumkloridiliuoksella alle 0,5 tilav./ti-lav.-%:n fenolipitoisuuteen. Jokainen liuos väkevöidään 15 litraksi käyttäen Amicon onttokuitu-suodatuslaitetta käyttäen membraani-kalvoja, joiden molekyylipaino on 10 000. Fenolia ja pienimolekyy-lipainoista ainetta poistetaan vielä ultrasuodattamalla muuttumattomalla pidätystilavuudella (diasuodattamalla) 30 litran permeaatin kokoamiseksi.

Pidätetyt jakeet kummastakin puolikkaasta yhdistetään 113 litran ruostumattomassa teräskattilassa ja saatetaan 30 tilav./tilav.-%:seksi lisäämällä vedetöntä etanolia sekoittaen. Liuos ultra-sentrifugoidaan syöttämällä se Elektronukleonics I^-ultrasentri-fugiin nopeudella 200 ml/min. ja kierrosluvulla 30 000 r/min. Supernatantti pannaan 113 litran ruostumattomaan teräskattilaan ja siihen lisätään sekoittaen etanolia kunnes väkevyydeksi tulee 40-45 tilav./tilav.-% etanolia. Sakan annetaan laskeutua 18 tuntia 5°C:ssa.

Tahmea takertuva sakka liuotetaan kattilan seinistä 2 litralla 0,02M kalsiumkloridia. Tämä liuos lisätään 4 litraan vedetöntä etanolia ja sakka kootaan linkoamalla 12 000 g:ssa 10 minuuttia. Kiinteä aines pestään kahdesti 500 ml:ssa asetonia homogenoimalla Waring-sekoittimessa, mitä seuraa kokoaminen linkoamalla 12 000 g:ssa 10 minuuttia. Lopullinen puhdistettu polysakkaridi kuivataan tyhjössä 5°C:ssa 72 tuntia, jolloin saadaan 32,9 g tuotetta. Lopullinen analyysi on: proteiinia % 0,33 nukleiinihappoa % 0,08 siaalihappoa % 85,2 kosteus-% 15,2 O-asetyyliryhmiä 2,21 ^um/mg kaneissa osoitettu lämpötilan nousu 0,025 mikrogrammalla/kg kehon painoa, vastaavasti 0,0, 0,0, 0,2 11 59024

Sepharose 4B Kd X^ 0,2 talteenotettu % siaalihappoa ennen Kd 0,40 XX) 86,1 hemagglutinaation esto 400 x) Kd on jakaantumiskerroin, joka osoittaa molekyylipainon ja hydrodynaamisen tilavuuden suhteen. Sitä käytetään kapselipolysakkaridi-antigeenien molekyylikoon määräämiseksi (käyttäen Sepharose 4B kromatografiaa) xx) Kd 0,40 osoittaa kuinka paljon siaalihappoa (polysakkaridia) eluoituu kolonnista ennen Kd-arvoa 0,40.

Rokote voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla lisäämällä puhdistettu kapselipolysakkaridi sopivaan fysiologisesti hyväksyttävään väliaineeseen, kuten suolaliuokseen, veteen tai fosfaatilla puskuroituin suolaliuokseen. Monitehoiset rokotteet voidaan valmistaa lisäämällä kaksi tai useampi puhdistettu kapselipolysakkaridi sopivaan väliaineeseen.

Yksitehoisen rokotteen annosmäärä ja annostelun tiheys vaih-telee potilaan iästä ja fysikaalisesta tilasta riippuen. Tavallisesti annos on noin 25-200 ^ug polysakkaridia noin 0,2-1,0 ml:ssa steriiliä suolaliuosta. Yleensä yksi tai kaksi ihonalaista annosta on riittävä suojan saamiseksi bakteerin aiheuttamaa keuhkokuumetta vastaan.

Claims (4)

1. Menetelmä antigeenisen suurimolekyylipainoisen ryhmän C meningokokki-polysakkaridin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi, joka vaikuttaa ryhmän C meningokokkien aiheuttamaa aivo-selkäydin-kalvon tulehdusta vastaan ja jossa ainakin 80 paino-%:lla polysakkaridista on molekyylipaino yli 1 000 000 daltonia, minkä menetelmän mukaan polysakkaridi eristetään viljelmästä saostamalla kvaternää-risellä ammoniumhalidisuolalla, saatu sakka liuotetaan vesipitoiseen kalsiumkloridiliuokseen ja polysakkaridi saostetaan uudelleen etanolilla, tunnettu siitä, että (a) liuotetaan uudelleensaostettu polysakkaridi vesipitoiseen puskuriliuokseen pH-alueella 6,8 - 7,2; (b) uutetaan polysakkaridia sisältävä puskuriliuos vesipitoisella puskuri-fenoliliuoksella; (c) vaiheessa (b) saatu seos ultrasentrifugoidaan supernatantin erottamiseksi fenolikerroksesta; (d) puhdistettu polysakkaridi saostetaan laimentamalla mainittu supernatantti etanolilla väkevyyteen 40 - 50 % tilav./tilav. etanolissa; ja (e) puhdistettu polysakkaridi otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheet (a) - (c) toistetaan useita kertoja ja saatu supernatantti laimennetaan etanolilla väkevyyteen 30 - 33 % tilav./ tilav. etanolissa epäpuhtauksien saostamiseksi ennen vaiheen (d) suorittamista.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuri on vesipitoinen 0,4 - 0,6 molaarinen natrium-asetaatti.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen fenoliliuos on 70 - 80 tilav./tilav.nen vesipitoisessa puskurissa.