DK141757B - Fremgangsmåde til fremstilling af et immunostimulerende glycopeptid fra Corynebacterium parvum. - Google Patents

Description

\RR/ OD FREMLÆGGELSESSKRIFT 1U1 757 ΠΔ NMARK (51) Int. Cl.3 C 07 G 7/00 // A 61 K 39/05 c 12 p 21/00 //a 61 κ 39/39 (21) Ansøgning nr. 9^1/Τ^ (22) Indleveret den 22. feb. 1974 f(23) Løbedag 22. feb. 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 9 · JVIXl · 1 9^0

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET i30) P"0*«4 begæret fra den

23. feb. 1973a 91^9/73, GB

(71) THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, 183-193 Euston Road, London N.W. 1, GB.

(72) Opfinder: Christopher Adlam, 4a Starts Hill Road, Farnborough, Kent, GB: David Eric Reid, gU Queensway, West Wickham, Kent, GB.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Internationalt Patent-Bureau.________ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af et imraunostiraulerende glycopeptid fra Corynebacterium parvum.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt immunostimulerende glycopeptid, der egner sig til i pattedyr eller fugle at frembringe modstandskraft mod tumorer og forskellige pathogener, hvilket glycopeptid, der fås fra cellevæggen af en immunostimulerende bakterie hørende til slægten Corynebacterium ifølge Prevot's klassifikation, er i det væsentlige uopløseligt i vand, fysiologisk saltvand, methanol, ethanol, phenol, chloroform, dioxan, pyridin, dimethylformamid, diethylenglycol og hexan, har en absorption i det infrarøde spektrum ved 1550 og 1660 cm * på grund af tilstedeværelsen af peptid, har en absorption i det infrarøde spektrum mellem 950 og 1100 cm ^ med maksimal absorption ved 1050 til 1070 cm ^ på grund af tilstedeværelsen af carbonhydrat, har ringe eller ingen absorption i det infrarøde spektrum for lipider ved 2850 til 2950 cm og hvilket glycopeptid efter intravenøs administrering forøger lever- og miltvægten hos mus og forøger levetiden for mus med tumorer.

2 141757

Det er kendt, at visse bakterier hørende til Actinomycetaceae familien efter Prevot's klassifikation (se ref.l) har immunostimulerende egenskaber. I den foreliggende beskrivelse med krav betyder "immunostimulerende" i stand til stimulering af en ikke-specifik immunreaktion i pattedyr og fulge, dvs. i stand til at bibringe pattedyr og fugle modstandskraft mod tumorer og forskellige pathogener, såsom vira, bakterier (se ref.12) og parasitter (se ref.13) uden antigen-affinitet mellem pathogeneme og immunostimuleringsprodukterne, samt med virkning som hjælpemiddel i pattedyr og fugle.

Før den foreliggende opfindelse er de omtalte immunostimulerende egenskaber blevet undersøgt i en vis udstrækning, og der er blevet fremsat forslag til en teknisk fremstilling af immunostimmulerende præparater af eksempelvis cellevægsbestanddele af levedygtige mycobåkterier, af protoplasmabestanddele af gramnegative bakterier, eller af lipopolysaccharider udvundet af gramnegative bakterier. Hvad angår bakterier af familien Actinomycetaceae (Prevot's klassifica-tion), der er grampositive, har der såvidt vides ikke været fremsat forslag til en teknisk fremstilling af immunostimulerende præparater ud fra disse, og end mindre har det været kendt eller foreslået, hvori det for de immunostimulerende egenskaber af sådanne bakterier ansvarlige princip kunne bestå, og hvordan dette kunne isoleres.

Ved de undersøgelser, der har ført til den foreliggende opfindelse, har det imidlertid vist sig muligt af immunostimulerende bakterier af arten Coryne-bacterium parvum at isolere et glycopeptid svarende til den indledningsvis angivne karakteristik og med særdeles gode immunostimulerende egenskaber.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af dette glycopeptid er kendetegnet ved, at man dyrker immunostimulerende bakterieceller af arten Corynebacterium parvum, udvinder dyrkede bakterieceller fra kulturen, lyserer de dyrkede bakterieceller og underkaster disse ekstraktion med et to-faset opløsningsmiddel indeholdende vand og phenol, centrifugerer den opnåede blanding og fjerner den vandige og den phenoliske fase til dannelse af et sediment, hvor det immunoi-stimulerende glycopeptid er til stede foroven som et hvidt lag.

En for den omhandlede fremstilling egnet bakteriestamme er stammen Wellcome Culture Collection no. CN 6134, hvilken stamme er opnået fra Pasteur Insti-tutet og har Pasteur Institute's Culture no. 4685 og hidtil er blevet beskrevet som C. anaerobium (se f.eks. Ref. 9).

Sammensætningen af glycopeptider fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan variere noget på grund af sådanne faktorer som genetisk variation afhængig af den specielle stamme, der anvendes som kilde for bakterieceller, og de specielle metoder, der anvendes ved dyrkning af disse celler. Variationer kan også skyldes den grad af renhed, der opnås ved den anvendte isoleringsproces, f.eks. på grund af ufuldstændig fjernelse af externt protein knyttet til glycopeptiderne.

141757 3

Fortrinsvis omfatter glycopeptider fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fra 3o~45%, fortrinsvis ca. 40%, efter vægt af carbonhydrat.

Fortrinsvis omfatter disse glycopeptider ifølge mikroanalyse fra 38-43% carbon, fra 7-10% nitrogen og fra 5-7% hydrogen, idet disse procentdele er beregnet på vægten af det tørre glycopeptid.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte bakterieceller kan fås fra en vilkårlig kendt kilde. Generelt kan de oprindelig fås fra pattedyr eller fugle, som er inficeret med den ønskede bakterie, f.eks. fra blodet fra patienter, der lider af septicaemia, eller fra huden af nogle normale mennesker.

De Corynebacterium parvum-bakterieceller, der har immunostimulerende egenskaber (fra hvilke glycopeptiderne kan fås), kan let identificeres ved deres evne til at forøge vægten af milten og leveren i mus og/eller deres adjuvantvirkning i mus (se ref.9) og deres evne til at frembringe modstandskraft mod tumorer i mus (se ref.14).

Enhver kultur af Corynebacterium parvum-bakterieceller fremstillet ved allerede kendte metoder kan anvendes som materiale til ekstraktion af glycopeptider. Fortrinsvis opbevares frisk isolerede stammer i frysetørret tilstand, før de dyrkes i et næringsmedium, såsan Robertson's kogte kødmedium (se ref.3) tilsat 1% v/v hesteserum.

Kulturen holdes fortrinsvis ved en temperatur over stuetemperatur, f.eks. ca. 37° i flere dage, hensigtsmæssigt 5-7 dage og fortrinsvis uden forstyrrelse af dyrkningsmediet. Til forøgelse af dyrkningsudbyttet kan produkterne fra den oprindelige kultur anvendes til podning af yderligere mængder af vadestmedium, f.eks. et medium indeholdende 1 % w/v glucose, hvor vadesten finder sted på lignende betingelser. Andre egnede vækstmedier omfatter Todd-Hewitt broth (se ref.4) og Thioglycolat broth (se ref.5). For at opnå maksimalt udbytte af celler på minimal tid kræves successive subkulturer af cellerne, og hver subkultur frembringes fortrinsvis under den logaritmiske vækstfase, og i hvert tilfælde er inoculet fortrinsvis ca. 10 rumfangs% af den følgende kultur, idet sidste trins inoculum hensigtsmæssigt er 2-3 rumfangs% af den følgende kultur.

De* dyrkede bakterieceller kan udvindes fra dyrkningsmediet ved en vilkårlig konventionel fremgangsmåde til opnåelse af udbytte fra sådanne medier, f.eks. ved centrifugering. Fortrinsvis vaskes de dyrkede bakterieceller så flere gange, f.eks. med vandig 0,85 % w/v natriumchlorid eller med destilleret vand, før ekstraktion.

Lyse af de dyrkede bakterieceller kan udføres ved vilkårlig konventionel teknik til lyse af celler, f.eks. ved anvendelse af fysisk-kemisk virkende midler, såsom hypertoniske puffere under mekanisk omrøring af det viskose lysat, eller mekanisk lyse, f.eks. ved anvendelse af ultrasoniske lydbølger, ved intracellulær cavitation, ved gennemledning ved lav temperatur og højt tryk gennem en snæver åb- 4 141757 ning som i thé Hughes press (se ref.6), eller ved mekanisk omrøring i en homogeni-sator eller et formalingsapparatur (se ref.7). Det opnåede lysat kan underkastes ekstraktion med det to-fasede opløsningsmiddel men fortrinsvis separeres de brudte cellevægge fra andre bestanddele i lysatet, og det er ifølge opfindelsen fordelagtigt at gå frem på den måde, at man før ekstraktion centrifugerer lysatet til dannelse af et sediment indeholdende brudte cellevægge, således at man undgår u-nødvendig ekstraktion af andre materialer. Centrifugering kan udføres ved 15000 -25000, f.eks. 20000 g, i ca. 30-90 minutter, f.eks. 1 time. hensigtsmæssigt udføres en preliminær centrifugering ved lav hastighed, f.eks. ca. 300 g i 3 minutter, idet den overflydende væske fra dette trin anvendes til hovedcentrifugeringen ved en højere hastighed, idet intakte celler forbliver i bundfaldet.

Ekstraktionen med det to-fasede opløsningsmiddel indeholdende phenol og vand udføres fortrinsvis ved en temperatur fra 0 - 100PG, fortrinsvis fra 15-70°C, hensigtsmæssigt under omrøring. Et passende tidsrum er fra nogle få minutter til nogle få timer afhængig af den anvendte temperatur. En passende temperatur er 68°C, ved hvilken der kan omrøres i 15 minutter.

Koncentrationen af phenol i phenol-vand-blandingen kan variere noget, idet det ma erindres, at man skal opnå et to-fasesystem, hvor hver fase er fuldt mættet med den anden. Phenolkoncentrationen i phenol-vand-blandingen kan være fra 10-90% v/v, men er fortrinsvis fra 40-55% v/v.

Blandingen centrifugeres så ved ca. 5000—10000 g i 45—15 minutter, f.eks. ved 8000g i 30 minutter, til dannelse af fire lag: et fast grynet lag indeholdende cellerester, hvorover der findes den phenoliske fase, et hvidt mellemliggende område og den vandige fase.

Den vandige fase og den phenåliske fase fjernes og fortrinsvis gentages den tofasede opløsningsmiddelekstraktion på det resterende materiale, indtil den vandige og den phenoliske; fase efter centrifugering er farveløse . Alternativt fjernes kun den vandige fase, idet det resterende materiale omfattende den pheno-- liske fase om ønsket reekstraheres.

Det materiale, der er tilbage, efter at den vandige fase (og om ønsket den .phenoliske fase) er blevet fjernet, dialyseres så fortrinsvis mod vand til fjernelse af .phenol. Dialysen udføres i flere dage, fortrinsvis ved en temperatur-under stuetemperatur, f.eks. ved ca. 4°C.

Efter dialyse fås et bundfald omfattende følgende lag: et mørkfarvet lag (som ikke er tilstede, når den phen.oliske fase er blevet fjernet efter centrifugering) , et cremebrunt lag med olieagtig konsistens og et øvre lag omfattende en hvid findelt suspension, hvilket hvide lag så kan opsamles til dannelse af de immunos timulerende glycopeptider, som fortrinsvis vaskes med destilleret vand eller fysiologisk saltvand (0,85% v/v vandig natriumchlorid).

5 141757

Glycopeptiderne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes terapeutisk eller profylaktisk til i pattedyr og fugle at frembringe modstandskraft mod tumorer og forskellige pathogener, hæmning af vækst af sådanne tumorer og pathogener og/eller formindskelse af deres udstrækning, ved administrering af en effektiv terapeutisk eller profylaktisk dosis af glycopeptideme. Tumorer, der kan nævnes i denne forbindelse, omfatter leukæmi, Hodgkin's syge, carcinoma i lunge, blære og bryst, melanoma og Burkitt's lymphoma. Bakterielle pathogener, der kan nævnes, omfatter Bordetella pertussis og Brucella abortus. Parasitiske pathogener omfatter protozoelle pathogener, såsom malaria.

Størrelsen af den terapeutiske eller profylaktiske dosis af glycopeptidet vil naturligvis afhænge af beskaffenheden og sværhedsgraden af den pågældende tumor eller pathogene infektion og af det specielle glycopeptid og administreringsmåden. I almindelighed ligger dosisområdet fra 0,1-20, fortrinsvis 0,5-10, og især fra 0,7-2 mg glycopeptid pr. kg legemsvægt af det pattedyr eller den fugl, i hvilken glycopeptidet skal admindstreres.

Enhver konventionel administreringsmåde kan anvendes efter den behandlende læges skøn og afhængigt af beskaffenheden og beliggenheden af den pågældende tumor eller pathogene infektion. Således kan administreringen ske af den orale eller pul-monære vej, selvom administreringen sædvanligvis sker ved injektion subkutant, in-tramuskulært, intraperitonealt eller fortrinsvis intravenøst. Om ønsket kan "injektion” omfatte infusion over et udstrakt tidsrum, f.eks. flere timer.

Glycopeptideme kan forarbejdes til et farmaceutisk præparat til anvendelse ved en behandlingsmetode eller profylakse som beskrevet i det foregående ved vilkårlig konventional farmaceutisk teknik, der bl.a. omfatter blanding af glycopeptideme med en eller flere farmaceutisk acceptable bærere. Beskaffenheden af præparatet vil naturligvis afhænge af den til administrering valgte måde. Til oral administrering kan således fremstilles et præparat af glycopeptid i form af en diskret enhed, såsom en kapsel, cachet eller tablet, der hver indeholder en forud bestemt mængde af glycopeptidet, i form af et pulver eller granulat, eller som en suspension i en vandig væske, en ikke-vandig væske, en olie-i-vand-emulsion eller en vand-i-olie-emulsion. Til pulraonær administrering kan et præparat med glycopeptid være et inhaleringspræparat.

Et farmaceutisk pnæparat til administrering ved injektion kan omfatte et glycopeptid suspenderet i en indifferent, farmaceutisk acceptabel flydende fortynder. Præparater til injektion må naturligvis være sterile og isotoniske med blodet hos det pattedyr eller den fugl, i hvilken det skal indgives. Et passende fortyndingsmiddel er vand, og et passende injektionspræparat til anvendelse i mennesker er en suspension af glycopeptid i fy- 6 141757 siologisk saltvand (0,85 % w/v vandig natriumchlorid). Fortrinsvis suspenderes glycopeptidet i en steril fortynder under aseptiske betingelser. Sterilisering af injektionspræparater kan udføres ved konventionel teknik, f.eks. ved tilsætning af formalin i eii koncentration på ca. 0,5 7. v/v. Fortrinsvis inkorporeres et konserveringsmiddel, f.eks. thiomersalat hensigtsmæssigt ved en koncentration på 0,01 % w/v i injektionspræparater.

Injektionspræparater kan gøres isotoniske ved vilkårlig konventionel teknik, f.eks. ved dialyse mod en saltopløsning, der er isotonisk med blodet hos det pattedyr eller den fugl, i hvilken det skal injiceres. Enhver saltopløsning, der egner sig som injektionsmedium, f.eks. fysiologisk saltvand (0,85 7o w/.v vandig natriumchlorid) eller isotonisk phosphatpuffer kan anvendes.

Injektionspræparater kan fremstilles enten som et koncentreret injektionspræparat til fortynding før anvendelse eller som et færdigt injektionspræparat.

I sidstnævnte tilfælde er koncentrationen af det immunostimulerende glycopeptid fortrinsvis fra 20-2 mg/ml, helst 7 mg/ml. Hensigtsmæssigt kan injektionspræparater frysetørres, f.eks. fra 5 % w/v vandig sucrose, til genfremstilling med vand lige før anvendelse.

Endnu en anvendelse af glycopeptidet -er som hjælpestof (adjuvant) eller som bestanddel i en vaccine, der har en anden aktiv bestanddel.

Et eksempel på en sådan anvendelse er anvendelse af glycopeptidet i stedet for den varmedræbte bakterielle bestanddel i Freund's complete Adjuvant (en vand-i-olie-emulsion af en aktiv bestanddel i en mineralolie, der også indeholder varme-dræbt bakterie), og et eksempel på en vaccine indeholdende glycopeptidet som adjuvant er en vaccine til immunisering over for Brucella.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af følgende eksempler.

Eksempel 1

Isolering af immunostimulerende glycopeptid af C. parvum celler.

A, Fremstilling af dyrkede G. parvum celler.

Frysetørrede celler af C. parvum (0,2-0,5 mg) (Wellcome Culture No. CN 6134) blev podet i en flaske med skruelåg indeholdende Robertson's kogte kødmedium (20 ml) (3) tilsat glucose (1 % w/v) og hesteserum (5 % v/v). Efter statisk inkubation ved 37°G i 6 dage blev inkubationen fortsat i 6 dage i flasker på 2 liter (1800 ml dyrkningsmedium) og så i 7 dage i 15 liter flasker. I hvert tilfælde var rumfanget af den anvendte podeblanding ca. 10 rumfangs% af dyrkningsmediet, undtagen ved sidste trin, hvor der blev anvendt 2 1/2 7. inoculum.

De dyrkede celler blev så opsamlet ved centrifugering af den sluttelige dyrkningsblanding ved 2000 g i 2 timer. Den overflydende væske blev fjernet, og cellerne vasket gentagne gange ved resuspension af de sedimenterede celler i fysiologisk saltvand og centrifugering af suspensionen som angivet i det foregående.

7 141757 B. CelXelyse.

De vaskede celler (10 g våd vægt) blev blandet med "Ballotini"glasperler, som er meget små glasperler, der er tilgængelige i handelen, (35 g af nr. 14) og en lille mængde fysiologisk saltvand (ca. 1 ml).

Blandingen blev så mekanisk omrørt i en Novotny disintegrator (8) i 15 minutter med bladet roterende med 2000 omdrejninger i minuttet· Den resulterende op-slemning blev så fortyndet med endnu en mængde fysiologisk saltvand (ca. 10 ml) og filtreret i en separator af groft sintret glas til fjernelse af glas-Ballotini. Resten blev resuspenderet i fysiologisk saltvand (ca. 10 ml) og centrifugeret ved 20000 g i 1 time til sedimentering af de brudte cellevægge.

C. Ekstraktion af C· parvum cellevægge.

Til de brudte cellevægge af C. parvum (20 g våd vægt) blev sat destilleret vand (350 ml) og vandig phenol (90%, w/v, 350 ml) begge dele ved 68°G. Blandingen blev inkuberet ved 68°C i 15 minutter under konstant omrøring, afkølet i et isbad, og blandingen blev så centrifugeret ved 8000g i 30 minutter ved 4°C. Man kunne se fire adskilte lag i centrifugebeholderep, et grynet, en lavere phenolisk fase, et hvidt mellemliggende lag og en vandig øverste fase. Den vandige fase blev fjernet, og de resterende lag resuspenderet i endnu en mængde destilleret vand (350 ral) ved 68°C og reekstraheret som før. Igen blev den øverste vandige fase fjernet, og de tilbageværende lag blev så samlet og dialyseret mod løbende postevand i 4 dage efterfulgt af destilleret vand ved 4°C i yderligere 3 dage til fjernelse af phenolet.

Efter 1 uge var et bundfald med tre lag tilstede i dialyserøret. Et neder-ste mørkfarvet lag omfattende brudte celler raed DNA. Et andet cremebrunt lag med olieagtig konsistens (begge disse lag havde ingen eller ringe lnmunostiraulerende virkning). Det øverste hvide lag blev opsamlet efter fjernelse af vand fra dialyserøret til dannelse af glycopeptidet (som herefter betegnes glycopeptid A), for hvilket egenskaber er beskrevet i det følgende.

Fysiske egenskaber.

Glycopeptidet havde følgende egenskaber: a) Det var kun lidt opløseligt i dimethylsulfoxid. Det var uopløseligt i vand, phenol, ethanol, methanol, chloroform, dioxan, pyridfn, dimethylformamid, diethy-lenglycol, hexan, acetone, ether og fysiologisk saltvand.

b) Det var i det væsentlige lipidfrit (J. Falch et al J. Biol. Chem. 226 497 (1957)).

c) Suspenderet i en phenol-vand blanding samlede det sig i méllerafaseområdet.

d) Det havde en kemisk sammensætning bestemt ved mikroanalyse med følgende vægt-procentdeles carbon 39,03, hydrogen 6,24, nitrogen 9,03, phosphorspor, aske 5,4, siliciumoxid 1,48, svovl under 0,2 og oxygen, bestemt som differens, omkring 40. Carbon, hydrogen og nitrogen blev bestemt i en Perkin-Elmer 240 semiautomatisk analyser.

8 141757 e) Det havde en infrarød analyse af det faste materiale (1,5 mg) fordelt i en standard kaliumchloridskive med diameter 16 mm med følgende værdier pr.

mg fast glycopeptid: binding bølgelængde cm~^ absorption- /mg CO-NH 1660 0,78 C-OH . 1050-1070 0,29 * C-H 2850-2950 0,004 * fit forhold til albumin)*

Detaljer for det aktuelt opnåede infrarøde spektrum er givet i det følgende.

f) Chromatografisk fraktionering af et hydrolysat af glycopeptidet viste tilstedeværelsen af visse aminosyrer og carbonhydrater som angivet.i det følgende: Aminosyrer.

Alanin, leucin og asparaginsyre, idet hydrolysen udførtes i 6N HCL i lukkede ampuller i 18 timer ved 100°C, hvor resten blev opløst i vand, og chromatografien blev udført på Whatman 3MM- papir under anvendelse af opadstigende ehromatografi i 18-24 timer med et opløsningsmiddel omfattende butanol(60 ml), eddikesyre (15 ml) og vand (25 ml) efterfulgt af fremkaldelse med ninhydrinspray for aminosyrer, og Garbonhydrater.

Galactose, glucose, mannose og spor af arabinose, hvor hydrolysen blev udført i 2N HC1 i lukkede ampuller i 3 timer ved 100°C, idet resten blev opløst i pyridin,og chromatografien blev udført på Whatman 3MM- papir under anvendelse af nedadgående ehromatografi i 18-24 timer i et opløsningsmiddel omfattende butanol (60 ml), pyridin (40 ml) og vand (30 ml) efterfulgt af fremkaldelse med en anilin- oxalatspray for carbonhydrater (P. Novotny, J. Med. Microbiol. 2 81 (1969)).

g) Der blev udført en biuret prøve for protein (Ref. 10) på glycopeptidet, der fik en blå farve, der ikke blev vasket af.

h) Glycopeptidet gav positivt svar på anthronprøven (Ref. 11), idet reaktionsopløsningen blev blågrøn.

Eksempel 2 og 3

Isolering af et immunostimulerende glycopeptid af G. parvum celler.

Yderligere to glycopeptidpræparater (som herefter kaldes glycopeptid B og C) blev opnået ved den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, idet der anvendtes samme C. parvum stamme.

9 141757

Eksempel 4

Isolering af et immunostimulerende glycopeptid af C. parvum celler.

Endnu et glycopeptidpræparat (som herefter kaldes glycopeptid D) blev opnået fra C. parvum celler ved anvendelse af den 1 eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, men med følgende forskel: blandingen af lysat, vand og phenol blev centrifugeret ved 1500g i 1 time (i stedet for 8000g i 3G minutter).

Eksempel 5

Egenskaber af glycopeptider ifølge eksempel 1 og 2.

1. Infrarød analyse af glycopeptider A og B fordelt i standard kaliumhalogenid-plader med diameter 16 mm gav følgende resultater:

bølgelængde Glycopeptid A Glycopeptid B

. (1,57 mg i KCl-skiver) 1,50 mg i pr-skiver)

cni~ A %Abs A A 7° Ab s A

850 min 0,12 22 0,02 5 *1055 max 0,68 79 0,58 0,31 50 0,66 1152 infl. 0,37 58 0,19 36 j 1200 min 0,20 36 0,10 20 1380) doublet 1405) max 0,49 67 0,42 0,26 45 0,55

1480 min 0,26 45 0,15 29 jI

1545 max 0,72 81 0,62 0,35 55 0,74 1575 min 0,64 77 0,32 52 1605 infl. 0,78 83 - 1660 max 1,17 93 1,00 0,47 66 1,00 1900 base 0,03 5 0,07 14 2920 max 0,37 57 0,32 0,24 42 0,51 3400 max 1,10 92 0,94 0,50 70 1*06 , *Max. næsten flad, 1045-1070 cm-^ min = minimum A = absorption max ** maximum %Abs “ % absorption 1 infl= bøjning A° » absorption i forhold tijl peptidbånd ved 1660 cm~ 2. Mikroanalyse af glycopeptid B (under samme betingelser som i eksempel 1 (d)) gav følgende sammensætning: carbon 39,77 7«, hydrogen 6,40 %, nitrogen 8,15 7», aske 2,8 7«, siliciumoxid 0,84 7. og mindre end 0,2 % af hver af bestanddelene phospho^ og svovl, idet de procentvise værdier er angivet p& tør vægt af glycopeptidet.

141757 ίο

Eksempel 6

Farmaceutisk prsparat til injektion.

Det- ifølge eksempel 1 fremstillede glycopeptid (70 mg) blev suspenderet i en opløsning af fysiologisk saltvand (0,85 %w/v vandig natriumchlorid, 10 ml) indeholdende 0,01 % w/v thiomersalat. Suspensionen blev steriliseret ved tilsætning af 0. 1 % w/v formalin i 24 timer, hvorpå formalinet blev fjernet ved centrifugering ved 38000g i 30 minutter· Efter 2 gange vask i fysiologisk saltvand blev glycopep-tidet resuspenderet i fysiologisk saltvand (10 ml) indeholdende 0,1 % w/v thiomersalat og fordelt i 1 ml glasampuller, som så blev lukket.

Eksempel 7

Egenskaber af de ifølge eksempel 2 og 3 fremstillede glycopeptider.

1. Infrarød analyse af glycopeptid B og C fordelt i standard kaliumchlorid-skiver med diameter 16 mm gav følgende resultater:

bølgelængde Glycopeptid C bølgelængde Glycopeptid B

, (1,45 mg) . (1,54 mg)

cm~ A %Abs A° cnT A %Abs A

925 0,16 31 860 min 0,145 28 1063 max 0,55 72 0,44 1061 max 0,66 78 0,66 1155 max 0,33 53 1152 infl 0,36 56,5 1202 min 0,195 36 1200 min 0,19 35 1382) doublet 0,425 62,5 0,34 1382) doublet 0,48 67 0,48 1412) max 0,47 66 1410) max 0,47 66 1482 min 0,26 45 1480 min 0,25 44 1557 max 0,86 86 0,69 1570 max 0,74 82 0,74 1605 min 0,74 82 1900 0,035 8 0,33 1900 base 0,035 8 2940 max * 0,41 61 2940 max .·: 0,38 58 0,38 3400 max 1,25 94 1,00 3400 max 0,96 89 0,96 1660 max 1,25 94 1,00 1650 max 1,00 90 1,00 min - minimum A = absorption max =» maximum %Abs = %'s absorption infl * bøjning A° = absorption i forhold til peptidbånd ved 1660 cm-·*· 2· Mikroanalyse af glycopeptid G (som i eksempel 1 (d)) gav følgende sammensætning: carbon 38,51 %, hydrogen 5,81 %, nitrogen 8,22 %, phosphor 0,23 %, svovl <0,3 %, aske 4,2 % og siliciumoxid 1,81 %, idet de procentvise værdier er angivet på tør vægt af ekstrakten.

1A17 5 7 11

Eksempel 8

Biologiske egenskaber af glycopeptid fra C. parvum celler.

1. Lymfo-recticulær stimulerende virkning, 10 Olac mus (vilkårligt opdrættede» W-svejtsiske hunmus med legemsvægt 16-20 g) fik hver en enkelt intravenøs injektion indeholdende det ifølge eksempel 3 fremstillede glycopeptid (1,4 mg) i 0,85 % w/v vandig natriumchlorid (0,2 ml). Efter 10 dage blev musene aflivet, og deres milt og lever udtaget og vejet. 10 lignende kontrolmus fik hver en enkelt intravenøs injektion af vandig natriumchlorid (0,85 % w/v) og blev efter 10 dage aflivet, og deres milt og lever udtaget og vejet. Resultaterne er vist i tabel 1 som middelorganvægten i mg korrigétet for legemsvægt 20 g.

Tabel 1

Virkning af glycopeptid til forøgelse af milt- og levervægten i mus.

Miltvægt (mg) Levervægt (mg)

Kontrolmus 102 1060

Prøvemus 250 1741 2. Anti-tumorvirkning.

20 Olac mus (hunmus med legemsvægt 16-20 g) fik hver en intraperitoneal injektion med allogenisk musesarcama 180 T/G (10"* celler), hvilket er en speciel tumor, tilvejebragt ved Sartorelli's metode (se Ref. 15), 24 timer senere fik 10 prøvemus hver en enkelt intravenøs injektion indeholdende det ifølge eksempel • ‘i ' ", " 3 fremstillede glycopeptid (1,4 mg) i vandig natriumchlorid (0,85% w/v). De resterende 10 kontrolmus fik hver en enkelt intravenøs injektion af vandig natriumchlorid (0,85% w/v).

Tabel 2

Virkning af glycopeptid ekstraheret fra C. parvum på tumorer 180 T/G i mus.

Dage fra glycopeptid- Antal overlevende mus injektionsdagen Kontrolmus Prøvemus 15 10 10 16 10 9 17 9 9 18 6 9 19 4 9 20 4 8 21 3 7 12 141757

Dage fra glycopeptid- Antal overlevende mus injektionsdagen Kontrolmus Prøvemus 22 2 7 23 2 7 24 2 7 25 2 5 26 1 5 27 1 5 28 1 5 29 1 5 30 15

Muéedødeligheden blev så målt over et tidsrum på 30 dage.

Resultater.

Tabel 2 viser virkningen af glycopeptidet til forbedring af levetiden af mus, som intraperitonealt er injiceret med musesarcoma.

Eksempel 9

Isolering af immunostimulerende glycopeptid fra C. parvum celler.

Et glycopeptidpræparat (som herefter kaldes glycopeptid E) blev isoleret fra lyserede celler fremstillet som angivet i eksempel 1. Isoleringsfremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev fulgt med den undtagelse, at den phenoliske fase blev fjernet sammen med den vandige fase. Dialyse blev udført til fjernelse af resterende phenol og gav et sediment med kun to lag: et nederste mørkfar-vet lag og et øverste hvidt lag. Sidstnævnte blev opsamlet til dannelse af glycopeptid E.

Eksempel 10

Isolering af immunostimulerende glycopeptid fra G. parvum celler.

Endnu *.t glycopeptidpræparat (som herefter kaldes glycopeptid F) blev opnået ved anvendelse af den i eksempel 1 beskrevne C. parvum stamme og den i eksempel 1 beskrevne proces.

Eksempel 11

Biologiske egenskaber af glycopeptid fremstillet ifølge eksempel 9 og 10.

Den lymfo-recticulære stimulerende virkning af glycopeptid E og F blev studeret ved anvendelse af den i eksempel 8.1 angivne fremgangsmåde, og man fik følgende resultater: 13 14175?

Miltvagt (mg) Levervægt (mg)

Kontrol (5) 88 1155

Mus,som har f&et 1,0 mg glycopeptid E (5) 227 1724

Kontrol (5) 91 1098

Mus, som har fået 1,4 mg glycopeptid F (10) 185 1481

Milt- og levervægtværdierne er angivet som middelværdier. De i parentes angivne tal er antallet af testede mus.

Referencer 1. Prevot, A.-R., & Fredette, V., (1966) ’'Manual for the classification and determination of the anaerobic bacteria", Lea and Febiger, Philadelphia, U. S.A.

2. Prevot, A.-R., J. Retie. Soc. 1 115 (1964) 3. Mackie fie McCartney's Handbook of Bacteriology p. 233 Edited by R. Cruick-shank, 10th Ed., Livingstone, Edinburgh fie London, 1960.

4. ibid p. 192 5. ibid p. 234 6. ibid p. 309 7. ibid p. 308 8. Nature 202 (4930) p. 364-6, 25th April 1966.

9. Adlam, C. & M.T. Scott, J. Med. Microbiol. 6 261 (1973).

10. Data for Biochemical Research Ed. Dawson, R.M.C., Daphne C. Elliott, W.H. Elliott fie K.M. Jones, 2nd Edn. O.U.P., Oxford 1969 p. 618.

11. Spiro, R.G. Methods in Enzymology i5 3 (1966) (Ed. Neufeld, E.F. fie Ginsberg, V. , pub. Academic Press New York fie London.

12. Adlam, C., Broughton, E.S. fie Scott, M.T., Nature, New Biol. 235, 219 (1972).

13. Nussenzweig, Ruth S. Expl. Parasitol., 21, 224 (1967).

14. Woodruff, M.F.A. fie Boak, J.L., Brit. J. Cancer 20 345 (1966).

15. Sartorelli A.C., Fischer D.S. fie Downs W.G., J. Immunology 96 676 (1966).

16. Westphal, 0. fie Jann, K., Methods in Carbohydrate Chemistry 5 83 (1966),

Ed. Whistler, pub. Academic Press, New York fie London.