FR2480604A1 - Fractions nouvelles extraites de bacteries aerobies, douees de proprietes antitumorales, antibacteriennes et inductrices d'interferon et leur procede de preparation - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION EST RELATIVE A DES NOUVELLES FRACTIONS EXTRAITES DE BACTERIES AEROBIES. CES FRACTIONS OBTENUES A PARTIR D'UNE SOUCHE DE BACTERIES AEROBIES SOUMISES A UN TRAITEMENT DE DELIPIDATION SONT DOUEES DE PROPRIETES ADJUVANTES, IMMUNOSTIMULANTES ET ANTIBACTERIENNES. APPLICATION AUX TRAITEMENTS ANTITUMORAUX.

Description

La présente invention est relative à des fractions nouvelles ,extraites de bactéries aérobies, douées de propriétés antitumorales; antibacteriennes et inductrices d'interféron et à leur procédé de préparation.

Des travaux de recherches ont mis en évidence le pouvoir immunostimulant et antitumoral des corps microbiens tués de certaines espèces de Corynebacterium anaérobies /cf.

notamment A.R. PREVOT, B.N. HALPERN, F. BIOZZI, C. STIFFEL,
D. MOUTON, J.C. MORARD, Y. BOUTHILLIER, C. DECREUSEFOND,
C.R. Acad. Sci. (PARIS), 1963, 257 (Série D), 137. Des travaux ont ensuite été consacrés à l'isolement de fractions actives à partir de germes entiers Lcf. notamment M. RAYNAUD,
B. KOUZNETZOVA, B. BIZZINI et J.C. CHERMANN : "Etude de l'ef- fet immunostimulant de diverses espèces de Corynebacteries anaérobies et de leurs fractions" Ann. Inst. PASTEUR, 1972, 122, 695-700 ; A,R. PREVOT, M. RAYNAUD, B. BIZZINI, j.C. CHERMANN, B. KOUZNETZOVA et F. SINOUSSI : "Activité réticulostimulante des parois de Corynebacteries anaérobies "C.R. Acad. Sci.PARIS, t. 274 (10 Avril 1972)?; "B.KOUZNETZOVA et B. BIZZINI, J.C. CHERMANN, F. DEGRAND, A. PREVOT et
M. RAYNAUD :"Recent results in cancer research"l974, 47, 275-293 (Immunostimulating activity of whole cells, cell-walls and fractions of anaerobie corynebacteria)". D. MIGLIORE-SAMOUR et P. JOLLES ZFebs Letters 25 n 2 (1972) 301/ ont décrit l'isolement à partir de Corynebacteries anaérobies, d'une fraction hydrosoluble ayant conservé le pouvoir adjuvant des bactéries entières. Puis P. LALLOUETTE, B. BIZZINI et
M.RAYNAUD lN.G.M. 25/1975) 137, en appliquant le procédé de MIGLIORE-SAMOUR et JOLLES au fractionnement de Corynebacterium granulosum, ont trouvé que l'activité adjuvante et immunostimulante est associée non pas à la fraction hydrosoluble S70, mais à la fraction particulaire P40. La fraction P40 isolée à partir de C. granulosum a été caractérisée sur le plan chimique et biologique par B. BIZZINI, B. MARO et
J. LALLOUETTE, tdans Médecine et maladies infectieuses 78, n 9, tome VIII, pages 408-414 (isolement et caractérisation d'une fraction dite fraction P 40 à partir de Corynebacterium granulosum) ]. Ils ont mis en évidence l'activité curative particulièrement intéressante de la fraction P40 sur la tumeur
P815 chez la souris. D'autre part, P. LALLOUETTE, B. MARO,
A. SCHWARTZ, B.BIZZINI (cf, C.R. Acad. Sci. (PARIS), 1976), ont montré que la fraction P40 est capable de restaurer et même d'augmenter la capacité immunogénique de formation d'anticorps anti-globules rouges de mouton chez des souris déprimées par l'injection de cyclophosphamide,
Il existe par ailleurs, un-certain nombre de travaux concernant l'obtention d'inducteurs d'interférons, et notamment le Brevet français MAES 2 092 875 relatif à des complexes inducteurs de la formation d'interféron et à leur procédé de préparation.Ces complexes sont obtenus en faisant réagir un acide nucléique mono-, bi- ou tricaténaire avec un dialcoylaminoalcoyldextrane suivant un rapport pondéral alcoylaminoalcoyldextrane/acide nucléique inférieur à 1/1 ou avec un polymère synthétique d'acides aminés tels que la polylysine ou la polyornithine ou bien avec des protéines naturelles basiques telles que l'histone ou le lysozyme, ou bien encore avec un polyélectrolyte cationique synthétique tel que le bromure d'hexadiméthrine. Le Brevet français nO 2 130 533 au nom de
The Kitasato Institute décrit également un inducteur d'inter féron faiblement toxique et dépourvu d'effets secondaires, obtenu à partir du surnageant d'un milieu de culture liquide d'un organisme de phase III, de phase II ou de phase I de
Bordetella pertussîs, ou à partir d'une fraction obtenue par désintégration du protoplasme d'un organisme de phase III, de phase II ou de phase I de Bordetella pertussis et séparation ultérieure de l'endotoxine lipopolysaccharidique et de l'antigène O- des composants somatiques des bactéries. Ce Brevet fait en outre état de publications antérieures zJulius S.

YOUNGER, Journal General Physiology, 56 (1), Part 2, pages 25-40 (1970) et J. VILCEK, Virology Monograph, Vol. 6, Interferon, Editions SPRINGER, 1969, p. 21-22/ qui décrivent des inducteurs d'interférons pour la prévention des maladies infectieuses virales, tels que divers virus, des bactéries (en particulier des bactéries Gram négatives), les endotoxines lipopolysaccharidiques de ces bactéries, des produits métaboliques de moisissures, des polysaccharides et acides ribonucléiques en double-hélice, tous considérés comme toxiques et induisant des effets secondaires indésirables.Le Brevet américain
UPJOHN 4 007 086 décrit, pour sa part, un procédé de production d'interféron in vitro qui consiste à soumettre des cellules humaines ou animales productrices d'interféron à un rayonnement ultra-violet de 50 ergs/mm à 2 500 ergs/mm, avant, en même temps ou après l'addition à ces cellules d'un
inducteur d'interféron non viral. L'inducteur d'interféron mis en oeuvre selon ce Brevet peut être une endotoxine, une bactérie, un agent de conjonctivite trachomateuse, un mycoplasme, un protozoaire, un rickettsia, un polymère synthétique, un mitogène, un polysaccharide, un antibiotique, un inducteur d'interféron de bas poids moléculaire tel que le chlorhydrate de tilorone, les acides nucléiques naturels et synthétiques et notamment les acides ribonucléiques mono- ou di- caténaires et leurs complexes avec des polysaccharides et d'autres substances.

La possibilité de disposer d'un inducteur d'inter féron non toxique et dépourvu d'effets secondaires est d'autant plus importante qu'il ne se produit d'interféron qu'en présence d'inducteurs d'interféron. Or, l'interféron, qui est une protéine qui apparait dans le sang ou les organes des animaux ou dans les milieux de cultures de tissus lorsque ceuxci sont soumis à l'action d'un inducteur d'interféron, empêche ou atténue les maladies virales.

La présente invention a pour but de pourvoir à un nouvel agent présentant à.la fois, des propriétés adjuvantes, des propriétés immunostimulantes, des propriétés antibactérien- nes, et des propriétés d'induction d'interféron.

Comme on l'a montré plus haut, le pouvoir adjuvant et immunostimulant des Corynébactéries anaérobies est amplement démontré. Par contre, les essais effectués sur les Corynebacteries aérobies connues ont montré que ces dernières sont dépourvues de propriétés adjuvantes et immunostimulantes
(Comptes-rendus de l'Académie des Sciences Paris 1964, tome
258, p. 4619-4621).

Les Inventeurs ont isolé des crachats d'un malade
atteint d'un cancer généralisé avec des métastases pulmonaires
et mésentériques étendues, un nouveau Corynebacterium aérobie,
en culture pure d'emblée.

La culture de ce Corybbacteriun aérobie a été effectuée suivant les techniques usuelles, soit en flacon de verre de 5 litres de capacité, soit en fermenteur agité de 50 litres de capacité, soit encore sur milieu solide.

La bactérie a été cultivée sur différents milieux: bouillon ordinaire, gélose ordinaire, bouillon ordinaire enrichi de Bactopeptone et d'extrait de levure.

Les caractéristiques de la bactérie isolée sont celles du genre Corynebacterium aérobie, à savoir
Morphologie : bacilles grêles en forme de bâtonnets, rares
formes en massues orientées en V, ou en amas,
ou en peigne. Gram +, présentant des corpus
cules métachromatiques.

Culture
a) Sur bouillon ordinaire, trouble, puis dépôt et
formation d'un voile en surface après quelques jours
b) Sur gélose ordinaire : colonies opaques appa
raissant en 24 heures, s'élargissant au-delà
en prenant une teinte jaunatre.

Métabolisme énergétique
Nitrate + (NO3 - NO2+1)
Uréase +
Catalase +
Rouge de méthyle +
Caractères biochimiques
Dextrine : 1,2 - 3
Glucose +
Lévulose +
Ce germe, qui n'a pu être identifié avec aucune espèce connue, a été désigné sous le nom de Corynebacteriun catarrhalis par les Inventeurs et a fait l'objet d'un dépôt dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 21 Février 1980, sous le numéro I-116,
La présente invention a pour objet des fractions adjuvantes, immunostimulantes et douées d'activité antibactérienne, obtenues à partir de souches de bactéries aérobies soumises à un traitement de délipidation.

L'invention a également pour objet des fractions adjuvantes, immunostimulantes, antibactériennes et/ou inductrices d'interféron dépourvues de toxicité, obtenues à partir de souches de bactéries aérobies soumises à un traitement de délipidation suivi d'une extraction douce des cellules délipidées, par broyage et homogénéisation en milieu aqueux, en présence ou non d'un détergent non-ionique.

Egalement conformément à l'invention, lesdites fractions adjuvantes, immunostimulantes et douées d'activité antibactérienne sont constituées par des cellules entières de bactéries aérobies délipidées.

Conformément à l'invention, lesdites fractions douées de propriétés adjuvantes, immunostimulantes, antibactériennes et inductrices d'interféron sont constituées par une fraction particulaire insoluble extraite de cellules bactériennes entières de bactéries aérobies délipidées.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites fractions sont douées de propriétés adjuvantes, immunostimulantes et antibactériennes, et sont constituées par des cellules entières délipidées d'une souche de
Corynebactérium aérobie nouvellement isolée, dénommée
Corynebacterium catarrhalis, déposée auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 21 Février 1980, sous le numéro I-116.

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdites fractions sont douées de propriétés adjuvantes, immunostimulantes, antibactériennes et inductrices d'interféron, et sot constituées par une fraction particulaire insoluble extraite de cellules bactériennes entières, délipidées, de Corynebacterium catarrhalis.

Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdites fractions sont douées de propriétés inductrices d'interféron et sont constituées par une fraction hydrosoluble extraite de cellules entières, délipidées, de Corynebacterium catarrhalis.

La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de fractions adjuvantes, immunostimulantes et douées d'activité antibactérienne , d 'obtention de fractions adjuvantes, iuuuno- stimulantes , antibactériennes et inductrices d'interféron et d'obtention de fractions inductrices d'interféron.Ce procédé est essentiellement caractérisé en ce que l'on soumet des cellules entières de bactéries aéro bies,notamment de Corynebacterium aérobies,et plus particulièrement de
Corynebacterium catarrhalis,à un traitement de délipidation,par exemple en mettant en oeuvre la méthode de délipidation décrite par A. AEBI et
Alia l, Soc. Chtn, Biol. 35, 661 (1953)7,1equel traitement est éventuellement suivi d'un traitement d'extraction douce appliquée aux cellules délipidées, tel que celui décrit dans le Brevet ANVAR n 74 15570 du 6 Mai 1974 par P. JOLLES et D. MISLIORErS2DER, qui permet de recueillir une fraction particulaire insoluble et une fraction particulaire soluble.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui-ressortiront de la description qui va suivre.

La présente invention vise plus particulièrement les fractions douées de propriétés adjuvantes, immunostimulantes, antibactériennes, et inductrices d'interféron conformes aux dispositions qui précèdent, ainsi que leurs procédés d'obtention, et les compostions pharmaceutiques les contenant, lesquelles sont avantageusement constituées par une fraction particulaire insoluble extraite de cellules bactériennes, délipidées, de Corynebacterium catarrhalis associée à un véhicule d'administration approprié usuel, ainsi qu'éventuellement à un autre constituant actif, tel qu'un vaccin.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère d'une part à un exemple de préparation de fractions actives conformes à l'invention, et d'autre part à des compte-rendus d'expérimentations pharmacologiques destinées à démontrer le pouvoir adjuvant, immunostimulant et antihactérien et l'activité inductrice d'interféron des fractions actives conformes à l'invention
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemple et compte-rendus d'expérimentations sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple de preparati-on de fractions actives conformes à l'invention
A. Des cellules d'une culture d'un Corynebacterium aérobie dé
nommé Corynebacterium catarrhalis, déposé dans la Collec
tion Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par
1'INSTITUT PASTEUR,en date du 21 Février 1980 sous le
numéro I-116, sont soumises à un processus de délipidation
conformément à la méthode décrite par A. AEBI et Coll.,
Bull. Soc. Chim. Biol. 35, 661 (1953).

B. 50 g des cellules délipidées obtenues en A ci-dessus sont
broyés et homogénéisés dans 250 cm3 d'eau contenant un dé
tergent non-ionique du type du "NP-40", dans unbroyeur de
type "OMNI MIXER FORVALL".

Après agitation pendant 5 heures à la température du laboratoire, suivie d'une centrifugation pendant 15 minu- tes à 40C (2 000 g), on chauffe la couche surnageante à 800C, puis l'on ajoute de la solution saturée de sulfate d'ammonium de façon à obtenir une solution à 40 % de saturation.

On maintient pendant 12 heures à 40C, puis on centrifuge pendant 15 minutes à 40C (à 4 000 g), et on recueille un précipité constitué par la fraction CBAp40.

La fraction hydrosoluble présente dans le surnageant de précipitation de la fraction CBAp40 est désignée sous le nom de fraction LS.

Le précipité contenant la fraction CBAp40, ainsi que le surnageant de centrifugation, sont dialysés pour éliminer toute trace de sulfate d'ammonium. Les produits sont finalement lyophilisés.

Compte-rendus d'expérimentations pharmacologiques 1. Le pouvoir adjuvant et immunostimulant des fractions cellu
laires délipidées et des fractions CBAp40 a été démontré
en procédant comme suit
Animaux : pour cette étude, on a utilisé des souris B6 D2
F1, mâles, de 18-20 g, provenant de chez IFFA-CREDO.

Tumeur : une tumeur de Lewis (3LL) a été greffée par in
jection intramusculaire de 105 ou 106 cellules viables,
suivant les expériences, sous un volume de 0,2 ml dans la
patte postérieure droite. L'évolution de la tumeur et la mortalité ont été suivies quotidiennement.

Traitement : il a été effectué par injection intraveineuse unique de 250 g de la fraction CBAp40, sous un volume de 0,5 ml, soit 2, 3 ou 4 jours avant, soit le même jour, soit 3, 6, 9 ou 10 jours après la greffe tumorale. A titre de comparaison, des lots de souris ont reçu 250 g ou 500 g de cellules entières délipidées ou de fraction LS, suivant les mêmes modalités.

Analyse statistique des résultats : les résultats ont été analysés soit par le test de Student lorsque la mortalité était de 100 % des.animaux à la fin de l'expérience 2 (Tableau 1), sqit par le test du x2, , lorsqu'un certain pourcentage d'animaux ont survécu à la fin de l'expérience (Tableaux 2, 3 et 4 ? .

RESULTATS
Les résultats des expériences sont rapportés dans les Tableaux 1, 2, 3 et 4. En plus, dans le Tableau 1 figurent également le pourcentage d'augmentation de l'intervalle de vie des animaux (ILS%), et le temps moyen de survie (MST).

I1 faut distinguer deux types d'expériences : celles résumées dans les Tableaux 1 et 4 dans lesquelles on observe 100 % de mortalité chez les animaux témoins, et celles résumées dans les Tableaux 2 et 3 dans lesquelles un certain pourcentage d'animaux témoins ont survécu. Dans ce dernier cas, il est justifié de supposer que l'on se trouve dans la situation de maladie résiduelle.

TABLEAU 1
Effet sur le développement de la tumeur de Lewis chez la souris de la fraction CBAP40 injectée avant, en même temps ou après la greffe tumorale avec 106 cellules par la voie intramusculaire

<SEP> Nombre <SEP> Mortali
Immuno- <SEP> voie <SEP> dose <SEP> Jour <SEP> nombre <SEP> aurvivants <SEP> té <SEP> sou- <SEP> Interval <SEP> IIS% <SEP> NST <SEP> Test
<tb> stimulat <SEP> d'inocu- <SEP> Eg <SEP> inocu- <SEP> d'eni- <SEP> au <SEP> 60ème <SEP> ris <SEP> le <SEP> de <SEP> t
<tb> <SEP> lation <SEP> lation <SEP> maux <SEP> jour <SEP> jour <SEP> mort
<tb> CABP40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> -2 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 24,28,28 <SEP> 24 <SEP> - <SEP> 39 <SEP> 3,5 <SEP> 29,8 <SEP> 9,0 <SEP> > p <SEP> > 8,5
<tb> <SEP> 28,32,39
<tb> CABp40 <SEP> I.V.<SEP> 250 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 17,24,27, <SEP> 17 <SEP> - <SEP> 38 <SEP> - <SEP> 27,2 <SEP> 0,9 <SEP> > p <SEP> > <SEP> 0,5
<tb> <SEP> 27,30,38,
<tb> CABp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 26,26,30 <SEP> 26 <SEP> - <SEP> 38 <SEP> 5.9 <SEP> 30,5 <SEP> 0,5 <SEP> > p <SEP> > <SEP> 0,3
<tb> <SEP> 31,32,38
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 34,35,36 <SEP> 34 <SEP> - <SEP> 39 <SEP> 25 <SEP> 36 <SEP> 0,01 <SEP> > p <SEP> > 0,001
<tb> <SEP> 39
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 28,28,30 <SEP> 28 <SEP> - <SEP> 39 <SEP> 12,8 <SEP> 23,5 <SEP> 0,05 <SEP> > p <SEP> > 0,02
<tb> <SEP> 34,36,39
<tb> PBS <SEP> I.V.<SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 26,28,28 <SEP> 26 <SEP> - <SEP> 33 <SEP> - <SEP> 28,8 <SEP> TABLEAU 2
Effet sur le développement de la tumeur le Lewis chez la souris de la fraction CBAp40 injectée avant, en même temps ou après la greffe tumorale avec 105 ceilules par voie intramusculaire

Immuno- <SEP> Voie <SEP> d'ino- <SEP> Dose <SEP> Jour <SEP> Nombre <SEP> surstimulant <SEP> culation <SEP> g <SEP> incoula- <SEP> Nombre <SEP> vivants <SEP> au <SEP> mortalité <SEP> Test
<tb> <SEP> tion <SEP> d'animaux <SEP> 60ème <SEP> jour <SEP> souris <SEP> X2
<tb> <SEP> jour
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> -4 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 31,45,55 <SEP> 0,1 <SEP> > p <SEP> > <SEP> 0,05
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 29,43,48 <SEP> 0,1 <SEP> > p <SEP> > <SEP> 0,05
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 3 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 45,48 <SEP> 0,05 <SEP> > <SEP> p <SEP> > <SEP> 0,02
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> - <SEP> p <SEP> = <SEP> 0.001
<tb> CBAp40 <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 31,32 <SEP> 0,05 <SEP> > <SEP> p <SEP> > <SEP> 0,02
<tb> PBS <SEP> I.V. <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 29,31,34,
<tb> <SEP> 34,35,36.<SEP> 52 <SEP> TABLEAU 3
Effet sur le développement de la tumeur de Lewis chez la souris des germes délipidés (GD) injectés 3, 6 et 9 jours après la greffe tumorale avec 105 cellules par voie intramusculaire

Immuno- <SEP> Vie <SEP> d'ino- <SEP> Dose <SEP> Jour <SEP> Nombre <SEP> Nombre
<tb> stimulant <SEP> culation <SEP> g <SEP> inocule- <SEP> d'animaux <SEP> survivants <SEP> Mortalité <SEP> Test
<tb> <SEP> tion <SEP> au <SEP> 60ème <SEP> souris <SEP> X2
<tb> <SEP> jour <SEP> jour
<tb> GD <SEP> I.V. <SEP> 500 <SEP> 3 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 38,45,59 <SEP> 0,1 > p > 0,05
<tb> GD <SEP> I.V. <SEP> 500 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 31 <SEP> 0,01 > <SEP> p <SEP> > 0,001
<tb> GD <SEP> I.V. <SEP> 500 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 38,41,43 <SEP> 0,1 > <SEP> p <SEP> > 0,05
<tb> PBS <SEP> I.V.<SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 29,31,34 <SEP>
<SEP> 34,35,36
<tb> <SEP> 52
<tb> TABLBAU 4
Effet comparé sur le dévaloppement de la tumeur de Lewis chez la souris, des germes délipidés (GD) et du surnageant (LS) de la précipitation de la fraction CBAp40 injectée 6 jours après la greffe tumorale avec 106 cellules par voie intramusculaire

Immuno- <SEP> Voie <SEP> Jour <SEP> Mombre
<tb> stimulant <SEP> d'inocu- <SEP> Dose <SEP> inocula- <SEP> Nombra <SEP> survivants <SEP> Mortalité <SEP> test
<tb> <SEP> lation <SEP> g <SEP> tion <SEP> d'animaux <SEP> au <SEP> 60ème <SEP> souris <SEP> X2
<tb> <SEP> jour <SEP> jour
<tb> GD <SEP> I.V. <SEP> 500 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 28,32 <SEP> p <SEP> < 0,001
<tb> GD <SEP> I.V.<SEP> 250 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 32,37,40, <SEP> 0,1 <SEP> > p > 0,05
<tb> <SEP> 40,40,41,
<tb> <SEP> 44
<tb> LS <SEP> I.V. <SEP> 250 <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 27,30,30, <SEP> 0,2 <SEP> > p <SEP> > 0,1
<tb> <SEP> 31,32,34,
<tb> <SEP> 40,41
<tb> PBS <SEP> I.V. <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> 6 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 21,23,26,
<tb> <SEP> 27,30,30 <SEP>
<SEP> 30,32,34,31
<tb>
I1 ressort des Tableaux 1 et 2 ci-deasus que la fraction CBAp40 injectée quatre jours ou deux jours avant, le même jour ou trois jours après la greffe tumorale n'influence pas de façon signiìcative le développement de la tumeur. A l'inverse, injectée six jours ou dix jours après la greffe tumorale, la fraction CBAp40 exerce un net effet inhibiteur sur la croissance de la tumeur.Cet effet est le plus prononcé lorsque le traitement est institué six jours après la greffe de la tumeur.

Dans la situation de maladie résiduelle (Tableau 2), la fraction CBAp40 injectée six jours après a greffe tumorale conduit à la survie définitive de tous les animaux traités.

Dans des essais comparatifs (Tableau 4), les cellules entieres délipidées (GD), administrées à la dose de 500 pg par souris, six jours après la greffe tumorale, ont exercé un effet antitumoral hautement significatif. L'effet inhibiteur sur le développement tumoral n'est pas majoré (Tableau 3), contrairement à ce que l'on observe avec la fraction CBAp40 (Tableau 2), dans la situation de maladie rési- duelle.

Enfin, à la dose de 250 pg par souris, la fraction
LS, administrée six jours après la greffe tumorale, n'exerce pas d'effet inhibiteur significatif sur la croissance de la tumeur (Tableau 4).

En conclusion, les résultats rapportés dans ce qui précède démontrent que le Corynebacterium aérobie utilisé dans l'expérimentation résumée ci-dessus, a exercé un net effet inhibiteur sur le développement de la tumeur de Lewis.

D'autre part, la fraction CBAp40, isolée à partir de C. catarrhalis par le procédé JOLLES & MIGLIORE-SAMOUR utilisé pour t l'obtention de la fraction P40 à partir de C. granulosum, s'est révélée être douée, comme cette dernière fraction, de pouvoir antitumoral.

Le pouvoir immunostimulant de Corynebacterium catarrhalis a été démontré en utilisant les bactéries entières tuees par chauffage. Les bactéries ont été administrées à la souris (SWISS de 18 g) par voie sous-cutanée ou intraveineuse à une dose de 200 à 400 pg. L'infection a été réalisée en injectant à chaque souris une dose 5 ou 10 DL50 de bactéries E. coli, K. pneumoniae ou L. monocytogenes. Lorsqu'une dose de 5 DL50 de bactéries infectantes a été utilisée, 95 à 100 % de souris ont été protégées par Corynebacterium catarrhalis. La protection est de l'ordre de 80 à 100 % lorsque l'infection a été réalisée avec 10 DL50.

2. Détermination de l'activité inductrice d'interféron dans
deux fractions isolées de Corynebacterium catarrhalis
(CBAp40 et CEA LS).

Matériels et méthodes
Fractions : deux fractions de C. catarrhalis ont été es
sayées, à savoir la fraction insoluble CBAp40 et la frac
tion soluble CBA LS (représentant le produit résiduel de la
préparation de la fraction CBAp40) et les germes délipidés
ont été utilisés comme référence.

Animaux : Souris SWISS (Rennemoulin) de 20 g de poids cor
porel. Des lots de 10 souris ont été utilisés pour chaque
détermination.

Doses et voies d'inoculation : les produits ont été injec
tés à la dose de 250 pg, (produits lyophilisés remis en
suspension ou en solution dans PBS sous le volume de 0,5ml)
soit par la voie intraveineuse (I.V.). soit par la voie
intrapéritonéale (I.P.).

Les souris témoins ont reçu 0,5 ml de PBS par la
voie I.V. ou I.P.

Titrage : des prélèvements sanguins ont été effectués par
voie rétro-orbitaire, 1, 2,4, 8, 24 et 48 heures, après
l'injection des fractions.

Un sérum-étalon titrant 60 000 U.I. a été utilisé
comme référence pour le calcul de l'activité en U.I.

La lignée continue de cellules de testicules de sou
ris L929 a été utilisée pour le titrage. Les cellules ont
été cultivées en milieu GLASGOW modifié, contenant 10 % de
sérum foetal de veau (SVF). Le titrage a été effectué sur
plaques en plastique (NUNCLON Microtest). Chaque cupule a
reçu 0,05 ml de sérum à tester dilué du 1/5 au 1/360 ou le
sérum de référence dilué du 1/400 au 1/12600. Dans chaque
cupule, on distribue alors 3.104 cellules sous un volume
de 0,05 mi. Les cellules sont cultivées pendant 24 heures
à 37 C en présence d'air contenant 5 % de CO2. Le milieu contenu dans les cupules est alors rejeté et il est remplacé par du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) (une particule par cellule, soit 3,104 particules virales) sous un volume de 0,1 ml.Après une nouvelle incubation de 18 heures, la DCT50 est établie pour le témoin virus, le sérum-étalon et pour le sérum à tester (des animaux traités par les fractions ou le PBS). Le nombre d'unités est calculé par comparaison avec le serum de réf érence.

RESULTATS
Les résultats sont rapportés dans le Tableau 5 ciaprès et, sous forme de graphiques, dans les figures 1, 2 et 3 annexées.

Les résultats reproduits dans les figures 1 et 2 ont été obtenus avec le lot nO 1 de CBAp40, alors que ceux reproduits dans la figure 3 l'ont été avec le lot nO 2.

La figure 1 représente graphiquement l'activité inductrice d'interféron de la fraction CBAp40 et de cellules délipidées, administrées par voie I V. à la dose de 200 îjg par souris.

La figure 2 représente graphiquement l'activité inductrice d'interféron de la fraction CBA LS administrée par voies I.V. et I.P. à la dose de 250 pg par souris, et
La figure 3 représente graphiquement l'activité inductrice d'interféron de la fraction CBAp40 et de la fraction CBA LS administrées par voie I.P. à la dose de 250 pg par souris.

La figure 1 montre que la production d'interféron est induite à la 2ème heure par le CBAp40 et à un taux plus faible par les germes délipidés. Pour le CBAp40, on observe une forte décroissance dès la 4ème heure, alors qu'avec les germes délipidés le taux varie peu.

La figure 2 résume les résultats obtenus avec la fraction soluble CBA LS. On observe la production d'un taux élevé d'interféron dès la 1ère heure si le produit est ad ministré par voie I.V., et à partir de la 2ème heure si le produit est injecté par la voie I.P. On observe une chute importante du taux d'interféron à partir de la 4ème heure.

Les résultats de la comparaison de l'activité inductrice d'interféron du CBAp40 et de CBA LS sont résumés dans la figure 3. La fraction CBA LS est inductrice d'in- interféron à la 1ère heure avec un maximum d'activité atteint à la 2ème heure (400 U.I.). En revanche, la fraction
CBAp40 ne permet la production d'interféron qu'à un taux faible à la 2ème heure, mais à un taux élevé à la 24ème heure (400 U.I.).

Chez les souris témoins (PS), on n'a pas constaté la présence d'interféron.

Les résultats rapportés ci-dessus indiquent que les cellules bactériennes entières délipidées de C. catarrhalis sont pratiquement depourvues d'activité inductrice d'inter féron (cf. figure 1). En revanche, tant la fraction CBAp40 que la fraction CBA LS, sont capables d'induire la formation d'interféron. Cependant, ces deux fractions doivent agir de façons différentes, puisque la cinétique d'apparition de I'interféron est différente. Avec la fraction
CBAp40, le maximum d'activité est atteint à la 24ème heure (cf. figure 3), alors que pour la fraction CBA LS, le maximum d'activité s'observe vers la lère-2ème heure (cf. figures 2 et 3).

D'autre part, on note avec la fraction CBA LS une différence d'activité en fonction de la voie d'administra tion,- la voie I.P. étant plus efficace que la voie I.V., et une différence d'activité d'un lot à l'autre, lot I (figure 2) et lot II (figure 3).

TABLEAC 5
Activité inductrice d'interféron de la fraction CBAp40. CBA Ls et genmes délipidés administrés par voie I.V. ou I.P. à des souris des souris de 20 g.

<SEP> Interféron <SEP> Unitée <SEP> Internationales
<tb> <SEP> Dose <SEP> Voie
<tb> Figures <SEP> produits <SEP> g <SEP> administra- <SEP> H <SEP> E <SEP> U <SEP> R <SEP> E <SEP> S
<tb> N <SEP> tion
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 24 <SEP> 48
<tb> 1 <SEP> CBAp40 <SEP> 200 <SEP> I.V. <SEP> 8 <SEP> 38,4 <SEP> 12,8 <SEP> 9,6 <SEP> 6,4
<tb> <SEP> genmes <SEP> délipidés <SEP> 200 <SEP> I.V. <SEP> 6,4 <SEP> 12,8 <SEP> 9,6 <SEP> 12,8 <SEP> 12,8
<tb> <SEP> P.B.S. <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> I.V. <SEP> 3,2 <SEP> 3,2 <SEP> 3,2 <SEP> 3,2 <SEP> 3,2
<tb> 2 <SEP> CBA <SEP> LS <SEP> 250 <SEP> I.V. <SEP> 1400 <SEP> 1200 <SEP> 800 <SEP> 80
<tb> <SEP> CBA <SEP> LS <SEP> 250 <SEP> I.P. <SEP> 50 <SEP> 400 <SEP> 300 <SEP> 100
<tb> <SEP> P.B.S. <SEP> 0,5 <SEP> ml <SEP> I.P. <SEP> 3.2 <SEP> 3,2 <SEP> 3,2 <SEP> 3,2
<tb> 3 <SEP> CBAp40 <SEP> 250 <SEP> I.P. <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 400 <SEP> 100
<tb> <SEP> CBA <SEP> LS <SEP> 250 <SEP> I.P. <SEP> 100 <SEP> 400 <SEP> 300 <SEP> 100 <SEP> 40
<tb> <SEP> P.B.S <SEP> 0,50 <SEP> ml <SEP> I.P. <SEP> 3,2 <SEP> 3,2 <SEP> 3,2 <SEP> 3.2 <SEP> 3,2
<tb>

Claims (10)

REVENDICATIONS 1 ) Nouvelle fraction douée de propriétés adjuvantes, immunostimulantes et antibactériennes, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'une souche de bactéries aérobies soumise à un traitement de délipidation.
1. 20) Nouvelle fraction douée d'activité adjuvante, immunostimulante, antibactérienne et inductrice d'interféron, dépourvue de toxicité, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'une souche de bactéries aérobies soumise à un traitement de délipidation suivi d'une extraction douce des cellules délipidées, par broyage et homogénéisation en milieu aqueux, en présence ou non d'un détergent nonionique.
2. 30) Nouvelle fraction douée de propriétés adjuvantes, immunostimulantes et antibactériennes selon la

   Revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par des cellules entières de bactéries aérobies délipidées.

   40) Nouvelle fraction adjuvante, immunostimulante, antibactérienné et inductrice d'interféron, dépourvue de toxicité, selon la Revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une fraction particulaire insoluble extraite de cellules bactériennes entières de bactéries aérobies délipidées.
3. 50) Nouvelle fraction adjuvante, immunostimulante et antibacterienne selon la Revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est constituée par des cellules entières délipidées d'une souche de Corynebacterium aérobie nouvellement isolée, dénommée Corynebacterium catarrhalis, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR, en date du 21 Février 1980, sous le numéro I-116.
4. 60) Nouvelle fraction adjuvante, immunostimulante, douée d'activité antibactérienne et inductrice d'interféron, dépourvue de toxicité, selon la Revendication 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une fraction particulaire insoluble extraite de cellules bactériennes, délipidées, de Corynebacterium catarrhalis.
5. 70) Nouvelle fraction inductrice d'interféron, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une fraction hydrosoluble extraite de cellules entières, dé-lipidées, d'une souche de Corynebacterium aérobie nouvellement isolée, dénommée Corynebacterium catarrhalis, déposée en date du 21 Février 1980 sous le numéro I-116, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Nicroorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR.
6. 80) Nouvelle composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient en tant que constituant actif, une fraction thérapeutiquement active de bactéries aérobies selon l'une quelconque des Revendications 1 à 7, associée à un véhicule d'administration approprié.
7. 90) Nouvelle composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient en tant que constituants actifs la fraction particulaire insoluble selon la Revendication 6 seule ou associée à un autre constituant actif, tel qu'un vaccin, notamment, ainsi qu'à un.véhicule d'administration approprié.
8. 100) Procédé de préparation de fractions adjuvantes, immunostimulantes et douées d'activité antibactérienne, selon la Revendication 1, caractérisé en ce que l'on obtient lesdites fractions en soumettant des cellules entières de bactéries aérobies à un traitement de délipidation approprié.

   11 ) Procédé selon la Revendication 10, caractérisé en ce que les cellules délipidées sont soumises à un traitement d'extraction douce par broyage et homogénéisation en milieu aqueux, en présence ou non d'un détergent non-ionique, pour recueillier une fraction particulaire insoluble douée de propriétés adjuvantes, immunostimulantes, antibactériennes et inductrices d'interféron, et une fraction hydrosoluble.
9. 120) Procédé selon la Revendication 1O, caractérisé en ce qu'il est appliqué au traitement du Corynebacterium aérobie dénommé Corynebacterium catarrhalis, déposé en date du 21 Février 1980 sous leruméro I-116 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR.
10. 130) Procédé selon les Revendications 10 et 1f, caractérisé en ce qu'il est appliqué au traitement du

    Corynebacterium catarrhalis pour recueillir une fraction particulaire insoluble douée de propriétés adjuvantes, immunostimulantes, antibacteriennes et inductrices d9interfé- ron, et une fraction hydrosoluble douée de propriétés inductrices d'interféron.