CH641204A5

CH641204A5 - Substance antitumorale obtenue par culture de mycelium.

Info

Publication number: CH641204A5
Application number: CH339178A
Authority: CH
Inventors: Nakao Ishida; Hiroshi Maeda; Fujio Suzuki; Toshikatsu Fujii; Ituro Mizutani
Original assignee: Kirin Seagram Ltd
Priority date: 1977-03-30
Filing date: 1978-03-30
Publication date: 1984-02-15
Also published as: US4163780A; FI780947A; FI60235C; FI60235B; FR2385734A1; FR2385734B1; GB1572074A; DE2813353A1

Description

La présente invention concerne une nouvelle substance selon le préambule de la revendication 1, appelée KS dans la description qui suit, et plus particulièrement sa forme purifiée KS-2-A, obtenue par culture de certains mycéliums, en particulier de Daedalea dickinsii KSDD 6 (FERM-P N° 3993), Lentinus edodes KSLE 7 (FERM-P N° 3994) et Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P N° 4196).

Des investigations et recherches extensives ont été menées, afin d'inhiber la croissance des cellules tumorales par utilisation, dans le corps vivant, de mécanismes n'ayant pas d'effet cytotoxique direct sur cellules tumorales, mais qui augmentent la fonction de défense de l'organisme envahi, sans danger pour les cellules normales.

La présente invention est basée sur la constatation que l'on peut obtenir une nouvelle substance KS, capable de hautement favoriser la fonction de défense de l'organisme face aux cancers, en cultivant le mycélium de certains micro-organismes comme Daedalea dickinsii KSDD 6 (FERM-P No 3993), Lentinus edodes KSLE 7 (FERM-P N° 3994) et Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P N° 4196) dans un milieu contenant des produits solubles de distillation. On a constaté que la forme purifiée, KS-2-A, de cette substance KS n'a pas d'action directe in vitro sur les cellules tumorales, mais exerce une forte action antitumeur in vivo. De plus, il a été prouvé que KS-2-A a des effets prophylactiques et chimiothérapeutiques sur plusieurs maladies infectieuses qui peuvent être provoquées par des virus et des micro-organismes pathogènes.

La substance KS mentionnée ci-devant est caractérisée selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1.

Les souches microbiennes ont été déposées au Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Mi-nistry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305, Japon.

Les souches déposées ont les identifications suivantes:

Nom du micro-organisme Numéro de dépôt Date de dépôt

Daedalea dickinsii KSDD 6 FERM-P No 3993 19.12.1977

Lentinus edodes KSLE 7 FERM-P No 3994 19.12.1977

Lentinus edodes KSLE 28 FERM-P No 4196 25.12.1977

L'invention concerne en plus un procédé de fabrication de la substance KS. Ce procédé est défini selon l'invention par la revendication 7.

L'invention concerne également un médicament antitumeur défini par la revendication 10.

On peut utiliser comme milieu de culture tout milieu contenant comme source de carbone: glucose, amidon, acides organiques, etc.; en tant que source d'azote: polypeptone, extrait de levure, urée, etc., ainsi que vitamines et sels minéraux. De plus, il se révèle efficace d'ajouter de la liqueur d'infusion de maïs ou des produits solubles de distillation. Ces derniers sont des produits secondaires dans la fabrication de l'eau-de-vie de céréales, par le procédé de brassage acide (Kirk Othmer, «Encyclopedia of Chemical Technology», seconde édition, vol. 1, pp. 501 à 531).

Le bouillon de culture est filtré ou centrifugé, et le mycélium obtenu est extrait. Eventuellement, le mycélium étant finement divisé, l'extraction est réalisée à l'eau chaude ou à l'aide d'une solution aqueuse diluée de sel, à environ 5% de NaCl, habituellement entre 60 et 130°C, de préférence de 80 à 100°C. Il suffît pour cette extraction, sous agitation, de 5 min à 3 h, de préférence 30 à 60 min.

L'extrait est soumis, après séparation si nécessaire de la matière solide, à un traitement de précipitation au moyen d'un solvant hydrophile, par exemple le méthanol ou l'éthanol. Le précipité obtenu est recueilli par filtration ou centrifugation, suivie d'une lyophilisation, pour donner la substance KS.

Cette substance est dissoute dans l'eau, additionnée d'un égal volume de phénol saturé d'eau, et le tout est soumis à une violente agitation sous refroidissement, provoquant la formation d'une couche aqueuse. On ajoute à cette couche aqueuse du phénol saturé d'eau, et l'agitation et la séparation par centrifugation sont répétées deux fois. Les couches aqueuses obtenues de cette manière sont rassemblées, puis additionnées d'éther éthylique. Le liquide résultant est agité et la couche aqueuse recueillie. L'éther résiduaire se trouvant dans cette couche est éliminé par barbotage de N2 gazeux.

4 volumes d'éthanol pur sont ajoutés à la couche aqueuse, et le précipité ainsi obtenu est dissous dans du tampon tris-HCl 0,01M (pH 6,95); la solution résultante est appliquée à une colonne de cellulose Ecteola, qui a été préalablement activée et tamponnée avec le tampon susmentionné. Cette colonne est éluée avec le tampon. Des fractions présentant le caractère de KS-2-A sont recueillies, et on obtient, après dialyse et lyophilisation, KS-2-A sous la forme d'une poudre blanche amorphe.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

641 204

Dans les dessins annexés, les figures représentent respectivement: fig. 1, le spectre ultraviolet de KS-2-A;

fig. 2, le spectre infrarouge de KS-2-A;

fig. 3, un schéma d'ultracentrifugation de KS-2-A;

fig. 4, un schéma électrophorétique de KS-2-A (A correspond à KS-2-A et B au sulfate de chondroïtine utilisé comme témoin);

fig. 5, l'analyse de la composition en sucres, par Chromatographie gazeuse, de KS-2-A: C correspond au mannose, D au galactose, E au glucose, F à l'arabinose et G au xylose;

fig. 6, le spectre infrarouge de la substance KS;

fig. 7, l'analyse de la composition en sucres, par Chromatographie gazeuse, de la substance KS;

fig. 8, le diagramme d'élution de la colonne de cellulose Ecteola dont il est question dans l'exemple 3 ;

fig. 9, un graphique montrant la relation entre la dose de KS-2-A (abscisses) et le poids de la tumeur (ordonnées);

fig. 10, la croissance de FM-3A en fonction du nombre d'heures dans la cinquième expérimentation: a correspond au témoin, b à la culture en présence de macrophage non activé et c à la culture en présence de macrophage activé par KS-2-A;

fig. 11, la relation entre le temps après l'administration de KS-2-A et la quantité d'interféron induite en circulation: J correspond à l'administration par voie intrapéritonéale de 200 mg/kg et K par voie orale de 500 mg/kg.

La substance KS-2-A selon l'invention présente les propriétés physico-chimiques suivantes:

1. Analyse élémentaire: C 39,5%; H 6,5%; N 1,1%; cendres traces (0,4%).

2. Poids moléculaire: 9000 + 3000 par ultracentrifugation; 7000 à 9000 par le gradient de densité à l'équilibre de centrifugation; 8000 + 3000 par la méthode de polarisation à la fluorescéine.

3. Aspect: poudre blanche amorphe.

4. Température de décomposition: 185°C d'après la mesure de la température de brunissement par le procédé capillaire, utilisant l'huile de silicone WF-30.

5. Spectre ultraviolet: aucun maximum d'absorption particulier, comme on peut le constater d'après la fig. 1.

6. Spectre infrarouge: voir la fig. 2.

7. pH: en solution aqueuse il est de 7,25.

8. Solubilité: soluble dans l'eau, insoluble dans l'éthanol, l'acétone, les n-hexane, n-butanol, phénol et autres solvants organiques.

9. Pouvoir rotatoire optique spécifique [a]^= +67,5+2° (dans H20) (C=0,452%).

10. Homogénéité:

a) La centrifugation de KS-2-A est réalisée dans un gradient linéaire de 5 à 20% de CsCl dans un tampon tris-HCl 0,1 M (pH 7,2) à 38 000 tr/min, à 4°C pendant 15 h. Le résultat est indiqué dans la fig. 3. Il en ressort que la substance est homogène. Des expérimentations de sédimentation comparative avec des acides nucléiques d'origine virale montrent que cette substance ne contient pas de particules virales ARN ou ADN.

b) L'électrophorèse est réalisée sur acétate de cellulose au moyen d'un tampon pyridine/acide acétique 0,1M (pH 3,5). On utilise le sulfate de chondroïtine comme témoin. Au bout de 30 min d'électro-phorèse à 0,6 mA/cm et 160 V, le sulfate de chondroïtine se déplace vers la cathode avec une mobilité de 4 cm en 30 min, tandis que KS-2-A se déplace légèrement vers l'anode en 90 min (mobilité de 1 cm en 90 min), les résultats étant indiqués dans la fig. 4. Il ressort de cette figure que la substance est électrophorétiquement homogène. En outre, une électrophorèse, conduite de manière identique mais avec un tampon pyridine/acide acétique IM (pH 7), prouve que cette substance est homogène.

11. Réactions colorées:

réaction phénol-S04H2 positive réaction à l'anthrone positive réaction de Molisch positive réaction d'Elson-Morgen négative réaction carbazole-S04H2 positive réaction avec réactif de Folin-Ciocarteau positive réaction du biuret positive réaction avec isothiocyanate de fluorescéine (FITC) positive coloration au bleu de toluidine 0 négative

5 réaction à la ninhydrine positive 12. Composition en sucres:

KS-2-A est soumis à une hydrolyse acide, suivie d'alditolation puis d'acétylation; la composition en sucres est alors déterminée par Chromatographie gazeuse. Les résultats sont indiqués dans la fig. 5. io Cette substance est principalement composée de mannose et contient de petites quantités de glucose et de galactose, et également de très petites quantités d'arabinose et de xylose, les proportions pondérales de ces constituants étant 74/12/12/1/1.

13. Composition en aminoacides:

15 10 mg de KS-2-A sont placés sous vide avec 3 ml de HCl 6N, et on les soumet à une hydrolyse acide à 110°C pendant 22 h. Puis HCl est éliminé par un évaporateur rotatif, et l'analyse des aminoacides est effectuée par un analyseur automatique (Hitachi KLA-3). Les aminoacides obtenus sont principalement: thréonine, sérine, acide 20 glutamique, alanine, à côté de NH3 ; on trouve également de légères quantités de: acide aspartique, proline, glycine, valine et lysine, ainsi que parfois des traces de: méthionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine, histidine, arginine et cystine.

KS-2-A n'a pas d'action cytotoxique directe sur les cellules tu-25 morales. Lorsqu'il est administré à un organisme vivant, il augmente la fonction de défense et, indirectement, limite la croissance des cellules tumorales; ainsi, finalement, il les élimine. De plus, KS-2-A n'a pas d'activité bactéricide ou viricide; mais, administré à un organisme vivant, il stimule la fonction de défense de celui-ci et inhibe 30 indirectement la croissance des bactéries ou des virus dans cet organisme.

En outre, KS-2-A agit efficacement sur plusieurs maladies infectieuses de l'homme et des animaux, telles que refroidissement, influenza, herpès, vaccine, encéphalomyocardite, hépatite infectieuse, 35 rage, et maladies provoquées par des Pseudomonas, Candida, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Diplococcus, Neisseria, Escheri-• chia coli, Mycobacterium tuberculosis, spirochètes et protozoaires. Dans tous les cas, KS-2-A a une action à la fois prophylactique et chimiothérapeutique.

40 Les exemples non limitatifs suivants sont une illustration de la présente invention.

Exemple 1:

On cultive le Daedalea dickinsii KSDD (FERM-P N° 3993) dans 45 101 de milieu contenant des produits solubles de distillation, dans des conditions aérobies de 1,8 vvm, à 24° C pendant 11 d. Le bouillon de culture est ensuite soumis à une centrifugation qui permet d'obtenir 38 g de mycélium. Ce mycélium est mélangé avec 101 de solution chaude à 5% de NaCl; il est porté à ébullition pendant 50 60 min, puis la partie surnageante est séparée du précipité. La partie surnageante ainsi obtenue est mélangée avec de l'éthanol, de telle façon que la concentration finale en celui-ci soit de 70%, et on laisse reposer une nuit durant dans une pièce sombre et fraîche. Le précipité est recueilli et lyophilisé, pour obtenir 4 g de substance KS, qui 55 a les propriétés physico-chimiques suivantes:

1. Analyse élémentaire: C 18,6 + 2,3%; H 2,8+0,4%; N 1,3+0,2%; cendres: 10,5+1,3%.

2. Poids moléculaire: environ 70 000 déterminé dans une colonne Biogel série P et par ultrafiltration Amicon.

60 3. Température de décomposition: J: 300°C.

4. Spectre infrarouge: indiqué dans la fig. 6.

5. Soluble dans l'eau; insoluble dans l'éthanol, le n-butanol, l'acétone et l'hexane.

6. Réactions colorées d'une solution aqueuse à 1 % de substance

65 KS:

à l'anthrone positive

Morgan-Elson négative carbazole-S04H2 positive

641 204

7. pH: celui de la solution aqueuse de substance KS est de 6 à 7.

8. Aspect: poudre blanche amorphe.

9. Composition en aminoacides (en g/100 g):

Arginine: 0,4+0,05 Histidine: 0,4+0,05 Tyrosine: 0,2+0,03 Isoleucine: 0,3 ±0,04 Valine: 0,4±0,05 Glycine: 0,8±0,1 Acide glutamique: 1,2 ±0,2 Thréonine: 0,8+0,1 Tryptophane: 0,06±0,01

Lysine: 0,5+0,06 Phénylalanine: 0,2+0,03 Leucine: 0,3 + 0,04 Méthionine: 0,1 ±0,01 Alanine: 0,6 ±0,08 Proline: 0,6±0,08 Sérine: 1 ±0,1 Acide aspartique: 1 ±0,1 Cystine: 0,3 ±0,04

10. Composition en sucres déterminée par Chromatographie gazeuse: glucose: 57±6%; galactose: 5±0,5%; mannose: 26±3%; xylose: 8 + 0,8%; arabinose: 5±0,3%.

Exemple 2:

La substance KS obtenue dans l'exemple 1 est dissoute dans l'eau, et un égal volume de phénol, saturé d'eau, est ajouté à cette solution. Ce mélange est secoué sous refroidissement, puis soumis à centrifugation pour donner une couche aqueuse; celle-ci est additionnée de phénol saturé d'eau, après quoi agitation par secousses et séparation centrifuge sont répétées à deux reprises. Les couches aqueuses obtenues de cette manière sont rassemblées, puis additionnées d'éther éthylique. Le produit résultant est secoué et la couche aqueuse recueillie. L'éther résiduaire se trouvant dans l'eau est éliminé par barbotage de N2 gazeux. On ajoute 4 volumes d'éthanol pur à la couche aqueuse obtenue. Le mélange est abandonné une nuit durant dans une pièce sombre, fraîche. Le précipité obtenu ainsi est dissous dans un tampon tris-HCl 0,01M (pH 6,95), et la solution résultante est appliquée à une colonne de cellulose Ecteola, préalablement activée et tamponnée avec le tampon susmentionné. Cette, colonne est ensuite éluée avec le même tampon. Des fractions présentant le caractère de KS-2-A sont recueillies, et après dialyse et lyophilisation on obtient 0,7 g de KS-2-A.

Exemple 3:

On cultive du Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P N° 4196) par agitation dans un milieu contenant des produits solubles de distillation, à 24° C, pendant 14 d, et le bouillon de culture résultant est ensemencé dans un milieu de 101, obtenu par dilution des produits solubles de distillation jusqu'à une densité de 1,012 à 1,020 et cultivé à 24"'C, dans des conditions aérobies (1,8 vvm) pendant 11 d. Le bouillon résultant est alors soumis à une centrifugation, ce qui donne 38 g de mycélium.

Le mycélium ainsi obtenu est mélangé avec 101 de solution chaude de NaCl à 5%, et on porte à ébullition pendant 60 min, puis on sépare le précipité de la partie surnageante. Celle-ci est mélangée avec de l'éthanol en quantité telle que la concentration finale en alcool soit égale à 70%, et on laisse reposer une nuit durant dans une pièce sombre et fraîche. On obtient ainsi le précipité de substance KS.

Ce précipité de substance KS est dissous dans de l'eau, et on ajoute à cette solution un volume égal de phénol saturé d'eau. Le produit résultant est agité sous refroidissement, puis soumis à une centrifugation. La couche aqueuse obtenue est additionnée de phénol saturé d'eau, et l'on agite et sépare par centrifugation à deux reprises. Les couches aqueuses obtenues de cette manière sont réunies, et ensuite additionnées d'éther éthylique. On agite le tout et recueille la couche aqueuse; l'éther résiduaire se trouvant dans cette couche est éliminé par barbotage de gaz N2.

4 volumes d'éthanol pur sont ajoutés à la couche aqueuse résultante, et on laisse reposer une nuit durant dans un local sombre et frais. Le précipité ainsi obtenu est dissous dans du tampon tris-HCl 0,01M (pH 6,95), et la solution résultante est passée par une colonne de cellulose Ecteola préalablement activée et tamponnée avec le tampon susmentionné. La colonne est éluée avec ce tampon. Des fractions présentant le caractère de KS-2-A sont recueillies, dialysées et lyophilisées. On obtient ainsi 0,7 g de KS-2-A.

Première expérimentation:

5 Des cellules de tumeurs ascites de sarcome 180 sont prélevées au moyen d'une seringue et diluées 10 fois avec une solution salée. La suspension ainsi préparée est injectée par voie intramusculaire dans la cuisse gauche de 40 souris DDI (cJ9) à raison de 0,1 ml, soit 107 cellules pour 0,1 ml, par souris. Au bout de 24 h, le KS-2-A io obtenu dans l'exemple 3 est dissous dans une solution saline, et administré oralement à 12 reprises, à des intervalles de 24 h, à 4 groupes composés de 8 souris chacun, chaque souris recevant chaque fois, selon le groupe auquel elle appartient, 100, 10, 1 ou 0,1 mg/kg. Les souris du groupe témoin reçoivent oralement de la 15 solution saline seule, de la même manière et selon le même programme. 7 semaines après la première administration de KS-2-A, les souris sont tuées et l'on pèse les parties tumorales enlevées. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1.

Tableau 1

Poids

Dose

Poids de la tumeur moyen de la tumeur

Mortalité

Indice*

25

(mg/kg)

(g)

(%)

(g)

100

1,0; 0,3; 0,2; 0,15 traces dans les 4 autres

0,21

50

0,09

30

souris

10

0,05; 0,4; traces dans les 6 autres souris

0,05

25

0,02

1

traces dans les 8 souris

0

0,1

3,4; 2,6; 4,8; 6,8; traces dans les 4 autres

2,20

50

1,01

35

souris

Témoin

1,8; 3,0; 0,7; 3,4

2,17

100

1,00

(solution saline)

1,8; 2,3; 2,0; 2,5

inulte. iiipjjui i au puius IHUVCII ues luuigui poids moyen des tumeurs du groupe témoin.

Les résultats ci-dessus sont reportés dans la fig. 9 avec en ordonnée le poids des tumeurs en grammes et en abscisse la dose de KS-2-A 45 administré en milligrammes par kilo. A représente le poids des tumeurs chez les témoins.

On obtient des résultats similaires avec la substance KS.

Deuxième expérimentation:

so 24 h après l'administration en une fois à des souris, par voie intra-péritonéale ou orale, de 200 mg/kg de KS-2-A, on injecte à chaque souris par voie intrapéritonéale 103 cellules tumorales d'ascites d'Ehrlich. On observe le nombre de jours de survie. On utilise pour cette expérience des souris DDI (<JÇ) pesant 20 g et âgées de 6 semai-55 nés environ.

Les résultats sont indiqués dans le tableau 2.

(Tableau en tête de la colonne suivante)

On obtient des résultats similaires avec la substance KS.

60

Troisième expérimentation:

Des cellules tumorales d'ascites d'Ehrlich, prélevées sur la souris, sont lavées à plusieurs reprises pendant 5 min à 1800 tr/min avec un milieu RPMI-1640 exempt de sérum, et la concentration en cellules 65 est ajustée à 104/ml au moyen de ce même milieu.

Pendant ce temps, on dissout du KS-2-A dans le même milieu pour préparer des solutions à 10, 2 et 0,4 mg/ml. 1 ml de chaque solution de KS-2-A, ainsi préparée, est ajouté à 1 ml de la suspension

5

641 204

Tableau 2

Nombre

de

Mode d'administration

Nombre de souris

Nombre de jours de survie

Moyenne des jours de survie survies/ nombre de traitées (%)

Intrapérito-

10

23, 27, 28, 29,

>56,6

4/10 (40)

néal

29, 30, >100, >100, >100, >100

per os

10

26, 26, 27, 27, 28, 30, 30, >100, >100, >100

>49,4

3/10 (30)

Témoin

10

22, 23, 24, 25,

24,7

0/10(0)

(solution

25, 25, 25, 26,

saline)

26, 26

de cellules d'Ehrlich susmentionnée, et on réalise la culture pendant 2 h à 37° C dans un incubateur à C02. Au cours de cette culture, les tubes à essai sont agités à plusieurs reprises.

Chaque culture est ensuite centrifugée à 1800 tr/min pendant 5 min, puis lavée avec le milieu RPMI-1640. Les pastilles de cellules obtenues de cette manière sont mises en suspension dans 2 ml du milieu. On administre par voie intrapéritonéale 0,2 ml de chacune de ces suspensions à 5 souris DDI âgées de 6 semaines, dans chaque groupe. On observe le nombre de jours de survie: les résultats sont reportés dans le tableau 3. On constate que les durées de survie dans les différents groupes sont pratiquement identiques à celles du groupe témoin, ce qui indique que la substance KS-2-A n'a pas d'action cytotoxique directe sur les cellules cancéreuses.

Tableau 3

Traitement

Nombre de souris

Nombre de jours de survie

Moyenne des jours de survie

Nombre de survies/ nombre de traitées

KS-2-A

5

24, 24, 25, 26, 30

25,8

0/5

10 mg/ml

KS-2-A

5

26, 26, 27, 28, 31

27,6

0/5

2 mg/ml

KS-2-A

5

25, 25, 25, 30, 30

27,0

0/5

0,400 mg/ml

RPMI-1640

5

24, 25, 26, 28, 32

27,0

0/5

(Témoin)

Quatrième expérimentation:

On administre par voie intrapéritonéale à des souris DDI, pesant 20 g et âgées de 6 semaines, 200 mg/kg de KS-2-A; 24 h plus tard, les cellules de l'exsudat péritonéal sont rincées avec du milieu RPMI-1640 exempt de sérum. Ces cellules lavées de l'exsudat sont cultivées pendant 2 h dans une étuve à incubation à C02. Puis les cellules non adhérentes sont rejetées, et les cellules adhérentes sont lavées à 2 ou 3 reprises avec le milieu RPMI-1640 à 37°C. Les cellules adhérant de façon persistante à la boîte de Pétri sont recueillies au moyen de trypsine et d'EDTA (acide éthylènediaminetétra-acétique), et l'on obtient le macrophage dérivé de la souris traitée par KS-2-A.

Pendant ce temps, on ensemence avec une tumeur ascitique d'Ehrlich, par voie intrapéritonéale, d'autres souris DDI âgées de 6 semaines, à raison de 103 cellules par souris. Au préalable, 24 h avant l'inoculation de la tumeur, on avait injecté à ces souris, par voie intrapéritonéale, le macrophage susmentionné, puis on continue cette injection à des intervalles de 3 d, en 10 fois au total, à raison de 5105 à MO6 cellules par inoculation. On observe le nombre de jours de survie de ces souris. Les résultats sont reportés dans le tableau 4.

Tableau 4

Traitement des souris porteuses de tumeur

Nombre de souris

Nombre de jours de survie

Moyenne des jours de survie

Survie (%)

Macrophage de

10

26,40,43,45,

>70,0

5/10

souris traitées par

46, > 100,

(50)

KS-2-A

>100, >100,

>100, >100

Macrophage de

10

24, 26, 27, 28,

29,6

0/10

souris non traitées

29, 30,31,32,

(0)

34,35

Milieu RPMI-1640

10

26, 26, 27, 28,

28,2

0/10

seul

28, 28,29, 29,

(0)

30,31

Cinquième expérimentation:

Une lignée de cellules de FM-3A transformées, établies, préparées à raison de 1105 cellules/ml de milieu MEM d'Eagle additionné avec 10% de FCS (sérum fœtal de veau), est chargée dans 3 ballons de culture différents a, b et c.

La culture dans le ballon a s'effectue sans addition de macrophage.

Celle du ballon b a lieu en présence de MO6 cellules/ml de macrophage non activé, obtenu dans la quatrième expérimentation. La culture dans le ballon c s'effectue en présence de MO6 cellules/ml de macrophage provenant de la souris traitée par KS-2-A dans la quatrième expérimentation.

La culture est réalisée à 37°C, sous 5% de C02, pendant 72 h. Au bout de 24, 48 et 72 h, le nombre des cellules FM-3A est compté à l'aide d'un hémocytomètre. Les résultats sont indiqués dans la fig. 10, où le nombre d'heures est reporté en abscisse, et le nombre de cellules FM-3A/ml en ordonnée; on constate que le macrophage, activé par KS-2-A (courbe c), exerce une action inhibitrice sur la croissance des cellules cancéreuses.

Sixième expérimentation:

40 souris DDI, pesant en moyenne 22 g, reçoivent par voie intrapéritonéale 200 mg/kg de KS-2-A (groupe I).

40 autres souris DDI reçoivent oralement 500 mg/kg de KS-2-A (groupe II).

Au bout de 4, 8, 12,16, 20, 24, 28 et 32 h, 5 souris sont prélevées sur chaque groupe et sacrifiées, pour en extraire le sang. Ce sang est centrifugé à 3000 tr/min pendant 10 min pour récolter le sérum.

Le taux d'interféron est mesuré dans la cellule de souris L-1D de souche dépourvue de thymidinekinase; le virus est celui de la stomatite vésiculaire (VSV). Le taux d'interféron est obtenu par la protection marquée de l'effet viral cytopathique (CPE), provoquée par le sérum sanguin dilué. Le taux indiqué d'interféron est étalonné par référence à l'unité internationale déterminée par le National Institute of Health (NIH) aux U.S. A. Les résultats sont présentés dans la fig. 11. On constate que l'interféron, qui circule, est induit environ 20 h après l'administration de KS-2-A.

Septième expérimentation:

Quatre groupes de souris DDI, pesant en moyenne 20 g et âgées d'environ 6 semaines, reçoivent par voie intrapéritonéale respective5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

641 204

6

ment 200, 100, 50 et 25 mg/kg de KS-2-A. Chaque groupe est composé de 5 souris. 24 h après cette administration, on extrait le sang de chaque groupe de souris, pour déterminer le taux d'interféron en circulation. Les résultats sont indiqués dans le tableau 5.

Tableau 5

Dose de KS-2-A

administrée par

Taux d'interféron/ml voie I.P.

200

800

100

800

50

800

25

800

Ces échantillons d'interféron présentent les propriétés générales de l'interféron, par exemple sensibilité à la trypsine, spécificité à l'espèce d'hôte, etc.

Huitième expérimentation:

Listeria monocytogenes, isolé d'un patient à infection listériale, est mis en suspension dans de l'eau distillée à raison de 108 virus/ml, et on l'injecte dans la veine de la queue de souris, pour provoquer l'infection, à la dose de 0,1 ml/souris. 24 h avant cette injection de Listeria, on avait administré, par voie intrapéritonéale, 0,5 ml de solution de KS-2-A. La dose ainsi administrée représente de 5 à 425 mg/kg d'individu, selon les groupes. Les souris d'un groupe témoin reçoivent par voie intrapéritonéale 0,5 ml de solution saline. On observe le nombre de souris survivant 20 d après l'infection, et l'on détermine le pourcentage de survie. Les résultats sont reportés dans le tableau 6.

Tableau 6

Dose intrapéritonéale de KS-2-A (mg/kg)

Nombre de souris

Nombre de survivants au bout de 20 d

Survie (%)

425

7

100

141

7

100

47

8

100

16

8

7

87,5

5

8

100

0

19

5

26,3

(témoin)

Neuvième expérimentation:

On opère comme dans la huitième expérimentation, mais le KS-2-A est administré oralement. Le nombre de souris survivant 20 d après l'infection est observé, et le pourcentage de survie déterminé. Ces résultats sont indiqués dans le tableau 7.

Tableau 7

Dose orale de K-2-A (mg/kg)

Nombre de souris

Nombre de survivants après 20 d

Survie (%)

425

7

100

141

8

7

87,5

47

8

7

87,5

16

8

100

5

8

7

87,5

0

19

5

26,3

(témoin)

Dixième expérimentation:

On cultive du Pseudomonas aeruginosa provenant de l'urine d'un leucémique, pendant 24 h à 37° C, et on le met en suspension dans de l'eau distillée à raison de 108 virus/ml, puis on injecte 0,1 ml/souris de cette suspension dans la veine de la queue de 26 souris DDI (femelles pesant en moyenne 20 g et âgées de 6 semaines environ) afin de les infecter.

24 h avant cette injection, on avait administré aux souris du groupe traité, par voie intrapéritonéale, 0,5 ml de solution aqueuse de KS-2-A représentant 150 mg/kg de ce produit, tandis que celles du groupe témoin recevaient par voie intrapéritonéale 0,5 mg de solution saline.

D'après le nombre de souris survivant au bout de 20 d après l'infection, on détermine le pourcentage de survie. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 8.

Tableau 8

Dose de KS-2-A (mg/kg)

Nombre de souris

Nombre de jours de survie

Moyenne des jours de survie

Nombre de survivants après 20 d

Survie (%)

150

14

2, 2, 3, 3,

>10,7

10

71

>14, >14,

>14, >14

0

12

1,1,1, 1,2, 2,

2,3

0

(témoin)

3, 3, 3, 3, 4, 4

Onzième expérimentation:

Les activités antibactériennes directes de KS-2-A sont étudiées par la méthode de diffusion de rondelle de pulpe utilisée avec différentes bactéries et solution aqueuse à 1 mg/ml de KS-2-A. Ainsi que le montre le tableau 9, KS-2-A ne possède pas d'activité antibactérienne directe.

Tableau 9

MIC

Microbes étudiés

(concentration inhibitrice

minimale)

Pseudomonas aeruginosa

>1,000 mg/ml

Klebsiella pneumoniae

>1,000 mg/ml

Listeria monocytogenes

>1,000 mg/ml

Escherichia coli

>1,000 mg/ml

Staphylococcus aureus 209-P

>1,000 mg/ml

Candida albicans

>1,000 mg/ml

Candida tropicalis

>1,000 mg/ml

Candida pseudotropicalis

>1,000 mg/ml

Candida utilis

>1,000 mg/ml

Saccharomyces cerevisiae Br-60

>1,000 mg/ml

Hansenula anomala

>1,000 mg/ml

Proteus OX-19

>1,000 mg/ml

Bacillus subtilis

>1,000 mg/ml

Shigella sonnei

> 1,000 mg/ml

Sorcina lutea

>1,000 mg/ml

Douzième expérimentation:

Des souris DDI pesant de 14 à 16 g, infectées par piqûre avec le virus de l'influenza, reçoivent oralement ou par voie intraveineuse 200 mg/kg de KS-2-A. Au groupe témoin, on administre 50 mg/kg de virazole ou 0,5 ml de solution saline, par voie intrapéritonéale. On détermine le nombre de jours et le pourcentage de survie chez ces souris. Virazole et KS-2-A sont tous les deux administrés sous forme de solutions salines au total 15 fois, à savoir 1 h avant l'infection par

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

le virus, au moment de l'infection, 1, 3 et 6 h après celle-ci, puis 2 fois par jour pendant 4 d. Le virus d'influenza en question est une souche adaptée à la souris du virus d'influenza A2/Kumamoto/ Y5(H2N2) à une dose égale à 10 fois la DL50. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 10. 5

Tableau 10

Produit

Voie d'administration

Nombre de souris

Moyenne des jours de survie

Survie (%)

KS-2-A, 200 mg/kg

Intrapérito

25

>20

52

néale

KS-2-A, 200 mg/kg

Orale

25

>19

32

Virazole, 50 mg/kg

Intrapérito

20

>16,9

30

néale

Témoin

Intrapérito

50

9,2

0

néale

641 204

Treizième expérimentation

On étudie la toxicité de KS-2-A. Les résultats sont indiqués dans le tableau 11.

Tableau 11

Animal essayé

Administration intrapéritonéale

Administration orale

Administration intraveineuse

Souris LD50

(mg/kg)

2083

>12 500

875

Rat LD50 (mg/kg)

—

> 2000

—

Cobaye

LDS0 (mg/kg)

>600

> 2000

—

R

2 feuilles dessins

Claims

641 204

1. Substance (désignée par KS) obtenue à partir de cultures de différents mycéliums, favorisant les réactions de défense des organismes vivants vis-à-vis de cellules tumorales et de virus ou micro-orga-nismes pathogènes, caractérisée par les propriétés physico-chimiques suivantes: poudre blanche amorphe; carbone 39,5%; hydrogène 6,5% ; azote 1,1%; cendres : traces de l'ordre de 0,4% ; masse moléculaire 9000 ±3000 par Ultrafiltration, 7000 à 9000 par gradient de densité à l'équilibre de centrifugation, et 8000 ±3000 par polarisation à la fluorescéine; décomposition vers 185°C; pas de maximum particulier d'absorption en ultraviolet; spectre infrarouge suivant fig. 2; pH 7,25 de la solution aqueuse; solubilité dans l'eau et insolubilité dans l'éthanol, l'acétone, les n-hexane, n-butanol, phénol et autres solvants organiques, homogénéité tant à la centrifugation qu'à l'électrophorèse.

2. Substance suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente un pouvoir rotatoire [a]y= +67,5 ±2° dans l'eau à une concentration de 0,452%.

2

REVENDICATIONS

3. Substance suivant l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle donne une réaction positive aux phénol-S04H2, anth-rone, Molisch, carbazol-S04H2, Folin-Ciocalteau, biuret, isothio-cyanate de fluorescéine et à la ninhydrine.

4. Substance suivant l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle donne une réaction négative d'Elson-Morgen et au bleu de toluidine.

5. Substance suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'après hydrolyse acide elle contient les sucres manose, glucose, galactose, arabinose et xylose dans les proportions respectives, pondérales, de 74:12:12:1:1.

6. Substance suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'à la suite d'une hydrolyse acide à 110° C elle donne principalement les thréonine, sérine, acide glutamique, alanine et ammoniaque.

7. Procédé de fabrication de la substance KS telle que définie dans l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on cultive un ou plusieurs des champignons Daedalea dickinsii KSDD 6 (FERM-P N° 3993), Lentinus edodes KSLE 7 (FERM-P N° 3994) ou Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P N° 4196) dans un milieu contenant des produits solubles de la distillation de l'eau-de-vie de céréales, on extrait le mycélium obtenu à l'eau ou avec une solution saline, puis on précipite la substance au moyen d'un solvant hydrophile.

8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le solvant hydrophile est le méthanol ou l'éthanol.

9. Procédé suivant l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la substance est redissoute dans l'eau, traitée au phénol, centrifugée puis extraite à l'éther pour obtenir un produit désigné par KS-2-A.

10. Médicament antitumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, comme matière active, la substance suivant l'une des revendications 1 à 6.