FI60235B - Foerfarande foer framstaellning av tumoercelltillvaext inhiberande ks-2-a substans - Google Patents

Description

Γ55?Π ΓΒΐ ^ICUULUTUSJULKAISU r Λ o7C

jffjk lBJ (11) UTLAGGNINGSSKKIFT oU^^D

raft C(4$) Γ a ten t ti U/ 1,) 1C 1901

Patent .ne-l-lelat —/ (Si) fCv.ik.Va.3 C 12 P 19/04·, 21/00 // A 61 K 45/Ο5 SUOM I —FI N LAN D (21) Pmnttlh>k«mu«—PumnunAkntoi 780947 (22) Hakwnltpllvl — AmMcnlnfidaf 29-03.78 'Pl* (23) Alkup«M—GIMgh«tad«g 29-03-78 (41) Tullut IvNcMcal — Bllvh offuntlig 01.10.78

Patentti- ja rekisterihallitut ............. , , ,, „ . „ „ . . , , . , (44) NihrtvSIwIpwo J» kutiL)ulkaltun pvm. — 31.08.8l

Patent- och registerstyrelaen v ' AmMtan utfegd och utLakrMtm pubMund -3 (32)(33)(31) Pnrfattjr atuolkaua-Baginl prlorltac 30*03 *77 06.09-77 Japani-Japan(JP) 52-35944, 52-106321 Tot eennäyt etty-Styrkt (71) Kirin -Seagram Limited., 1-2, 1-chome, Kyobashi, Chuo-ku, Tokyo,

Japani-Japan(JP) (72) Nakao Ishida, Miyagi-ken, Hiroshi Maeda, Kumamoto-ken, Fujio Suzuki,

Miyagi-ken, Toshikatsu Fujii, Shizuoka-ken, Ituro Mizutani, Shizuoka-ken, Japani-Japan(JP) (7*0 Ruska & Co (54) Menetelmä kasvain solujen kasvua ehkäisevän K9-2-A nimisen aineen valmistamiseksi - Förfarande för framställning av tumörcelltillväxt inhibe-rande KS-2-A sub st an s KS-ainetta saadaan raaka-aineena Daedalea dickinsii KSDD 6 (FERM-P no 3993):n, Lentinus edodes KSLE-7 (FERM-P no 3994):n tai Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P no 4196):n viljellystä huovastosta. Jalostamalla tätä ainetta edelleen saadaan uusi aine KS-2-A. Tällä aineella KS-2-A ja myöskin KS-aineella raaka-aineena on voimakas kasvainta vastustava vaikutus ja niillä on myöskin ennalta ehkäiseviä ja kemoterapeuttisia vaikutuksia moniin infektioihin, joita tietyt mikro-organismit ja virukset aiheuttavat.

Ennalta tunnetaan Lentinus-lajeja, jotka tuottavat tumorinvastai-sia aineita (Cancer Res. 30:2776-2781, 1970). On tunnettua, että Lentinus edodes*ista saadun valmisteen antaminen koe-eläimille estää kasvaimien kasvua ja lisää henkiinjääneiden eläimien lukumäärää. Yhdisteen tumorinvastaisen vaikutuksen uskotaan perustuvan pikemminkin koe-eläimen puolustusmekanismin aktivoimiseen kuin välittömään kasvainsolujen kasvun estoon.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uuden aineen KS-2-A valmistamiseksi

Laajoja kokeita ja tutkimuksia on tehty kasvainsolujen kasvun es tämiseksi käyttämällä elävässä kehossa mekanismia, jolla ei ole oi- 2 60235 lut välitöntä soluja myrkyttävää vaikutusta kasvainsoluihin, mutta joka lisää kehon puolustustoimintaa.

Keksijät ovat suorittaneet tutkimuksia sellaisen syöpää vastustavien kemcterapeuttisten aineiden aikaansaamiseksi, jotka ovat vaarattomia tavalliselle solulle, ja tuloksena on keksitty uusi aine, nimittäin KS-2-A-aine, joka pystyy hyvin edistämään kehon puolustustoimintaa. Lisäksi on havaittu, että KS-2-A:lla ei ole välitöntä vaikutusta kasvainsoluihin in vitro, mutta sillä on voimakas kasvainta vastustava vaikutus in vivo. Lisäksi on näytetty toteen, että KS-2-A:lla on ennalta ehkäiseviä ja kemoterapeuttisia vaikutuksia moniin infektioihin, joita tietyt mikro-organismit ja virukset aiheuttavat.

' KS-2-A:ta voidaan valmistaa mikro-organismien viljellystä huovas-tosta.

Esimerkiksi Daedalea dickinsii KSDD 6 (FERM-P no 3993)» Lentinus edodes KSLE 7 (FERM-P no 399*0 ja Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P ne 4196) käytetään KS-2-A:n saamiseksi. Nämä viljelmät on talletettu laitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ulkomaankauppa- ja teollisuusministeriö, Japani, missä niille on annettu edellä mainitut tunnukset ja mistä niitä on pyynnöstä saatavissa.

Viljelyväliaineena voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista väliainetta, joka sisältää glukoosia, tärkkelystä, orgaanisia happoja jne hiililähteenä; polypeptonia, hiivauutetta, virtsa-ainetta jne typ-pilähteenä; vitamiinia ja epäorgaanisia suoloja. Edelleen on tehokasta lisätä viljanliotuslientä tai "distiller's solubles" -aineita. Näitä saadaan sivutuotteena valmistettaessa viljaviskiä happa-malla mäskimenetelmällä (Kirk Othmer,"Encyclopedia of Chemical Technology", 2. painos, osa 1 sivut 501-531, (1963)).

Viljelty liemi suodatetaan tai sentrifugoidaan. Saatu huovasto uutetaan. Haluttaessa saatu huovasto uutetaan käyttäen kuumaa vettä tai laimeaa vesipitoista suolaliuosta, sopivasti 60-130° Ctssa, sopivimmin 80-100°C:ssa, joka suolaliuos sisältää noin 5 % NaCl. Uuttaminen suoritetaan sekoittaen noin 5 min - 3 h ajan, sopivimmin 30-60 min.

3 60235

Kiinteän aineen erottamisen jälkeen, mikäli se on tarpeellista, uute saatetaan saostuskäsittelyyn käyttäen hydrofiilistä liuotinta, esimerkiksi metanolia tai etanolia. Saatu sakka kootaan suodattamalla tai linkoamalla, mitä seuraa lyofilisoiminen KS-aineen saamiseksi.

Tämä KS-aine liuotetaan veteen, lisätään saatuun liuokseen sama tilavuus vedellä kyllästettyä fenolia ja saatua liuosta ravistetaan voimakkaasti kylmänä, jolloin saadaan vesikerros. Tähän ve-sikerrokseen lisätään vedellä kyllästettyä fenolia, ja ravistus sekä linkoaminen toistetaan kahdesti. Tällä tavalla saadut vesi-kerrokset yhdistetään ja lisätään etyylieetteriä. Seosta ravistetaan ja vesikerros kootaan. Vesikerroksessa oleva jäännöseetteri poistetaan kuplittamalla ^-kaasulla.

Neljä tilavuutta puhdasta etanolia lisätään yhtä tilavuutta kohti saatua vesikerrosta. Näin saatu sakka liuotetaan puskuriin (pH 6,95) 0,01 M Tris-HCl ja saatu liuos johdetaan Ecteola-selluloosa-kolonniin, joka aikaisemmin on aktivoitu ja puskuroitu edellä mainitulla puskurilla. Ecteola-selluloosa on anioninvaihtoaine, jota valmistetaan selluloosasta,epikloorihydriinistä ja trietanoliamii-nista (Merck Index, 19· painos, 463 (1976)). Kolonni eluoidaan puskurilla. Jakeet, joilla on KS-2-A:n ominaisuuksia, kootaan ja dialysoimisen sekä lyofilisoimisen jälkeen saadaan KS-2-A:ta valkoisena amorfisena jauheena.

Piirustusten selitykset: kuva 1 esittää KS-2-A:n ultraviolettispektriä, kuva 2 esittää KS-2-A:n infrapunaspektriä, kuva 3 esittää KS-2-A:n ultrasentrifugaatiokäyrää, kuva 4 esittää KS-2-A:n elektroforeettista käyrää (A: KS-2-A, 3: kondroitiinisulfaatti tarkistuksena), kuva 5 esittää KS-2-A:n sokerianalyysiä (kaasukromatografia) (C: mannoosi, D: galaktoosi, E: glukoosi, F: arabinoosi ja G: ksyloosi), kuva 6 esittää Ecteola-selluloosakolonnin eluutiokäyrää kokeessa, (näyte: etanolisakka, joka saatiin kyllästetyllä fenolilla suoritetun proteiinien poistamisen jälkeenjkolonni: 5x70 cm; eluointiliuos: 0,01 M Tris-HCL puskuri, pH 6,95; fraktiointi: 5,5 ml:n tasaosa; kokonaissokeri: arviot fenoli-H2S0^ menetelmällä), 4 60235 kuva 7 esittää graafisesti KS-2-A annoksen ja sarkooma 180 kiinteän kasvaimen painon välistä suhdetta, kuva 8 esittää FM-3A:n kasvua kokeessa (a: viljelty lisäämättä mak-rofaagia, b: viljelty normaalin hiiren vatsakalvon sisäisellä mak-rofaagilla, c: viljelty KS-2-A:ta saaneen hiiren vatsakalvon sisäisellä makrofaagilla, ja kuva 9 esittää KS-2-A:n antamisen jälkeisen ajan ja kiertävän interferonin määrän välistä suhdetta (J: vatsakalvon sisäinen annos 200 mg/kg, K: suun kautta annettu annos 500 mg/kg).

Tämän keksinnön mukaisella KS-2-A:lla on seuraavat fysikokemialli-set ominaisuudet: 1. Alkuaineanalyysi C: -39,5 %, H: 6,5 $, N: 1,1 %, tuhka: jälkiä (0,4 %) 2. Molekyylipaino 9000 ± 3000 (ultrasuodattamalla) 7000 - 9000 (tasapainotiheysgradienttisentrifugoimalla) 8000 ± 3000 (fluoreseiinipolaroimismenetelmällä) 3. Ulkonäkö amorfinen valkoinen jauhe 4. Hajoamispiste l85°C (perustuu ruskistumislämpötilan mittaukseen kapil-laarimenetelmällä käyttäen "Silicone Oil WF-30", Toray Silicon Co., Ltd., Tokio) 5. UV-spektri

Erityistä maksimiabsorptiota ei todettu, kuten havaitaan kuvasta 1.

6. IR-spektri

Spektri on esitetty kuvassa 2.

7. Aineen vesiliuoksen pH on 7,25- ^ 5 60235 8. Liukoisuus

Liukoinen veteen, liukenematon etanoliin, asetoniin, n-heksaaniin, n-butanoliin, fenoliin ja muihin orgaanisiin liuottimiin.

9. Optinen kiertyminen [a] 2d5 = +67,5 ± 2,0° (H20:ssa), (C = 0,452 %) 10. Homogeenisuus a. KS-2-A:n sentrifugoiminen suoritettiin CsCl:n 5-20 ϊ:η lineaarisella gradientilla 0,1 M Tris-HCl puskurissa kierrosluvulla 38.000 kierr./min 4°C:ssa 15 tunnin aikana. Tulos on esitetty kuvassa 3· Kuten tästä kuvasta käy ilmi, aine on homogeenista. Vertailevat sedimentaatiokokeet virus-nukleiinihapolla osoittivat, että aine ei sisällä virusosasia, RNA:ta tai DNA:ta.

b. Elektroforeesi tehtiin selluloosa-asetaatilla käyttäen 0,1 M etikkahappo/pyridiini puskuria (pH 3>5). Kondroitiinisulfaattia käytettiin tarkistuksena. Elektroforeesin jälkeen, joka kesti 30 min, arvoissa 0,6 mA/cm ja 160 V, kondroitiinisulfaatti siirtyi katodille antaen liikkuvuudeksi 4 cm/30 min, kun taas KS-2-A:ta siirtyi vähäisessä määrin anodille 90 min aikana (liikkuvuus 1 cm/90 min). Tulokset on esitetty kuvassa 4. Kuvasta käy selville, että aine on elektroforeettisesti homogeenista.

Edelleen elektroforeesi, joka suoritettiin muuten samoissa olosuhteissa kuin edellä, paitsi että käytettiin 1 M pyri-diini/etikkahappo puskuria (pH 7,0) osoitti, että aine on homogeenista.

11. Värireaktio fenoli-H2S0jj reaktio positiivinen antroni reaktio positiivinen

Molischin reaktio positiivinen

Elson-Morgen reaktio negatiivinen 6 60235 karbatsoli-HjSO,, reaktio positiivinen reaktio Folin-Ciocalteau-reagenssilla positiivinen biuret reaktio positiivinen reaktio FITC:llä (fluoreseiini isotiosyaniitti) positiivinen värjäys toluidiini sininen 0:11a negatiivinen ninhydriini reaktio positiivinen 12. Sokerikoostumus KS-2-A saatettiin happohydrolyysin alaiseksi, mitä seurasi pelkistys natriumboorihydridillä ja sen jälkeen muuntaminen asetyylijohdannaisiksi. Tuotteesta analysoitiin sen sokerikoostumus kaasukromatograafisesti. Tulokset on esitetty kuvassa 5. Aine koostuu pääasiallisesti mannoo-sista ja sisältää pieniä määriä glukoosia ja galaktoosia sekä myöskin hyvin pieniä määriä arabinoosia ja ksyloosia, jolloin komponenttien painosuhteet ovat 74 : 12 : 12 : 1 : 1.

13. Aminohappokoostumus 10 mg KS-2-A:ta suljettiin tyhjiöön yhdessä 3 ml 6 N HC1 kanssa sekä saatettiin happohydrolyysin alaiseksi 110° C:ssa 22 tunnin aikana. Sen jälkeen HC1 poistettiin pyörivällä haihduttimella ja aminohappoanalyysi tehtiin automaattisessa aminohappoanalysaattorissa (HITACHI KLA-3).

Aineen sisältämät aminohapot ovat pääasiallisesti treonii-nia, seriiniä, glutamiinihappoa ja alaniinia sekä lisäksi pieniä määriä asparagiinihappoa, proliinia, glysiiniä, valiinia ja lysiiniä.

Edelleen joskus hivenmääriä metioniinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiiniä, fenyylialaniinia, histidiiniä, ar-giniinia ja kysteiiniä.

KS-2-A:lla ei ole välitöntä solumyrkkyvaikutusta kasvainsoluihin.

Kun KS-2-A:ta annetaan elävään kehoon, se lisää tämän puolustustoi-mintaa ja rajoittaa epäsuorasti kasvainsolujen kasvua, poistaen siten lopulta kasvainsolut.

7 60235 KS-2-A:lla ei ole mitään bakteereja tai viruksia tuhoavaa aktiivisuutta. Kun KS-2-A:ta annetaan kehoon, se edistää tämän puolustus-toimintaa ja estää epäsuorasti bakteereiden ja virusten kasvua siinä.

Edelleen KS-2-A voi tehokkaasti parantaa ihmisissä ja eläimissä monia tartuntatauteja, kuten nuhaa, influenssaa, herpestä,lehmärokkoa, enkefalomyokarditiaa, maksatulehdusta, vesikauhua ja sairauksia, jotka ovat aiheuttaneet Pseudomonas, Candida, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Diplococcus, Neisseria, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Spirochaetales ja Protozoa. Enkefalo-myokardiitti on virustauti, jolle on tunnusomaista rappeuttavat ja inflammatoriset muutokset sydänlihaksessa ja vammat keskushermostossa, jotka muistuttavat poliomyelitisin vammoja (Dorland, Medical Dictionary, 25. painos, 51^ (197*0). KS-2-A:lla on sekä ennalta ehkäisevä että kemoterapeuttinen vaikutus, kuten nähdään kokeista 8, 9, 10 ja 12.

Seuraavassa esitetään esimerkkejä ja kokeita, joissa on sovellettu keksintöä.

Esimerkki 1

Daedalea dickinsii KSDD 6 (FERM-P no 3993) viljeltiin 10 l:ssa väliainetta, joka sisälsi viljaviskiä valmistettaessa saatuja tislauksen sivutuotteita (distillers solubles), aerobisissa olosuhteissa (1,8 vvm) 2*J°C:ssa 11 vuorokautta. Sen jälkeen viljelty liemi sentrifugoitiin, jolloin saatiin 38 g huovastoa. Näin saatu huo-vasto sekoitettiin 10 l:n kanssa kuumaa 5-ί: sta NaCl liuosta ja keitettiin 60 min, minkä jälkeen erotettiin päällä oleva neste ja sakka. Näin saatu neste sekoitettiin etyylialkoholin kanssa siten, että lopullinen etyylialkoholiväkevyys oli 70 %, ja annettiin seisoa yön yli kylmässä pimeässä huoneessa. Sakka koottiin ja lyofi-lisoitiin.

Lyofilisoitu jauhe liuotettiin veteen ja liuokseen lisättiin sama tilavuus vedellä kyllästettyä fenolia. Seosta ravistettiin kylmänä ja sen jälkeen se sentrifugoitiin, jolloin saatiin vesikerros. Tähän vesikerrokseen lisättiin vedellä kyllästettyä fenolia, ja ravistus sekä sentrifugoiminen toistettiin kaksi kertaa. Tällä tavalla saadut vesikerrokset yhdistettiin, minkä jälkeen lisättiin etyylieetteriä. Saatua seosta ravistettiin ja vesikerros koottiin.

8 60235

Vesikerroksessa oleva jäännöseetteri poistettiin kuplittamalla typpikaasua sen läpi. Neljä tilavuutta puhdasta etanolia lisättiin yhtä tilavuutta kohti saatua vesikerrosta. Seoksen annettiin seisoa yön yli kylmässä pimeässä huoneessa. Näin saatu sakka liuotettiin 0,01 M Tris-HCl puskuriin (pH 6,95) ja saatu liuos johdettiin Ecteola-selluloosakolonniin, joka aikaisemmin oli aktivoitu ja puskuroitu edellä mainitulla puskurilla. Sitten kolonni eluoi-tiin samalla puskurilla. Jakeet, joillaoli KS-2-A:n ominaisuuksia, koottiin ja dialysoimisen sekä lyofilisoimisen jälkeen saatiin 0,7 g KS-2-A:ta.

Esimerkki 2

Lentinus edodes KSLE 28 (FERM-P no 4196) viljeltiin ravistamalla väliaineessa, joka sisälsi viljaviskiä valmistettaessa saatuja tislauksen sivutuotteita (distillers solubles) 24°C:ssa 14 vuorokautta ja saatu viljelyliemi lisättiin 10 l:aan väliainetta, joka oli saatu laimentamalla viljaviskiä valmistettaessa saatuja sivutuotteita ominaispainoon 1,012-1,020 , ja viljeltiin 24°C:ssa aerobisissa olosuhteissa (1,8 vvm) 11 vuorokautta. Sitten saatu liemi sentrifugoitiin, jolloin saatiin 38 g huovastoa.

Näin saatu huovasto sekoitettiin 10 l:n kanssa kuumaa 5"i:sta NaCl liuosta ja keitettiin 60 min, minkä jälkeen erotettiin päällä oleva neste ja sakka. Näin saatu neste sekoitettiin etyylialkoholin kanssa siten, että lopullinen etyylialkoholiväkevyys oli 70 ί, ja annettiin seisoa yön yli kylmässä pimeässä huoneessa. Näin saatiin KS-aineen sakkaa.

Edellä saatu KS-aine liuotettiin veteen ja liuokseen lisättiin sama tilavuus vedellä kyllästettyä fenolia. Seosta ravistettiin kylmässä ja sen jälkeen sentrifugoitiin vesikerroksen saamiseksi. Tähän vesikerrokseen lisättiin vedellä kyllästettyä fenolia, ja ravistus sekä sentrifugoiminen toistettiin kaksi kertaa. Tällä tavalla saadut vesikerrokset yhdistettiin ja sen jälkeen lisättiin etyylieetteriä. Seosta ravistettiin ja vesikerros koottiin. Vesi-kerroksessa jäljellä oleva eetteri poistettiin kuplittamalla typpikaasua sen läpi.

Saatuun vesikerrokseen lisättiin sen yhtä tilavuutta kohti neljä tilavuutta puhdasta etanolia. Seoksen annettiin seisoa yön yli kylmässä pimeässä huoneessa.

60235 9 Näin saatu sakka liuotettiin 0,01 M Tris-HCl puskuriin (ph 6,95) ja saatu liuos johdettiin Ecteola-selluloosakolonniin, joka aikaisemmin oli aktivoitu ja puskuroitu edellä mainitulla puskurilla.

Kolonni eluoitiin samalla puskurilla. Jakeet, joilla·oli KS-2-A:n ominaisuuksia, koottiin,dialysoitiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 0,7 g KS-2-A:ta.

Esimerkki 3

Lentinus edodes KSLE 7 (FERM-P no 399*0 viljeltiin ravistamalla väliaineessa, joka sisälsi viljaviskiä valmistettaessa saatuja tislauksen sivutuotteita 25°C:ssa 1*1 vuorokautta ja saatu viljelyliemi lisättiin 10 l:aan väliainetta, joka oli saatu laimentamalla viljaviskiä valmistettaessa saatuja tislauksen sivutuotteita ominaispainoon 1,012-1,020,ja viljeltiin 25°C:ssa aerobisissa olosuhteissa (1,8 vvm) 11 vuorokautta. Sitten saatu liemi sentrifugoitiin, jolloin saatiin 40 g huovastoa.

Näin saatu huovasto sekoitettiin 10 l:n kanssa kuumaa vettä (95°C) ja keitettiin 60 min, minkä jälkeen erotettiin päällä oleva neste ja sakka. Näin saatu neste sekoitettiin etyylialkoholin kanssa siten, että lopullinen etyylialkoholiväkevyys oli 7Q ί, ja annettiin seisoa yön yli kylmässä pimeässä huoneessa. Näin saatiin KS-aineen sakkaa.

Edellä saatu KS-aine liuotettiin veteen ja liuokseen lisättiin sama tilavuus vedellä kyllästettyä fenolia. Seosta ravisteltiin kylmässä ja sen jälkeen sentrifugoitiin vesikerroksen saamiseksi. Tähän vesi-kerrokseen lisättiin vedellä kyllästettyä fenolia, ja ravistus sekä sentrifugoiminen toistettiin kaksi kertaa. Tällä tavalla saadut vesi-kerrokset yhdistettiin ja sen jälkeen lisättiin etyylieetteriä. Seosta ravistettiin ja vesikerros koottiin. Vesikerroksessa jäljellä oleva eetteri poistettiin kuplittamalla typpikaasua sen läpi. Saatuun vesi-kerrokseen lisättiin sen yhtä tilavuutta kohti neljä tilavuutta pandasta etanolia. Seoksen . annettiin seisoa yön yli kylmässä pimeässä^ huoneessa.

Näin saatu sakka liuotettiin 0,01 M Tris-HCl puskuriin (ph 6,95) ja saatu liuos johdettiin Ecteola-selluloosakolonniin, joka aikaisemmin oli aktivoitu ja puskuroitu edellä mainitulla puskurilla. Kolonni eluoitiin puskurilla. Jakeet, joilla oli KS-2-A:n ominaisuuksia,koottiin, 10 60235 dialysoitiin ja lyofilisoitiin. Saatiin 0,7 g KS-2-A:ta.

Terapeuttiset kokeet:

Xoe 1

Sarkooma 180 kasvainsoluja, joita oli pidetty jatkuvasti hiiren as-kiites'issa,otettiin siitä injektioruiskulla ja laimennettiin kymmenkertaiseksi suolavedellä. Näin valmistettua suspensiota ruiskutettiin lihaksensisäisesti 40 DDI hiiren (o?) vasempaan reiteen 0,1 7 ml (10 solua/0,1 ml) kullekin hiirelle. DDI hiirilajia on selostettu julkaisussa Cancer Research _£6, 4333“^3T7 (1976). 24 tunnin kuluttua esimerkissä 2 saatua KS-2-A:ta liuotettiin suolaveteen ja annettiin suun kautta 12 kertaa 24 tunnin välein neljälle ryhmälle hiiriä, joista jokaiseen ryhmään kuului 8 hiirtä, 100 mg/kg, 10 mg/kg, 1 mg/kg ja 0,1 mg/kg kerralla vastaavan ryhmän jokaiselle hiirelle. Tarkistusryhmän hiirille annettiin suun kautta yksinomaan suolaliuosta saman aikataulun mukaan ja samalla tavalla. Seitsemän viikkoa ensimmäisen KS-2-A:n antamisen jälkeen hiiret tapettiin ja mitattiin poistettujen kasvannaisosien paino.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Annos Kasvaimen paino (g) Keskimääräi- Kuol- Indeksi (mg/kg) nen kasvai- leisuus _ ___ men paino (g) % ____ 100 1,0, 0,3, 0,2, 0,15, 0,21 50 0,09 jälkiä 4 muussa hiiressä 10 0,05, 0,4, jälkiä 6 0,05 25 0,02 muussa hiiressä 1 jälkiä kaikissa 8 hii- 0 00 ressä 0,1 3,4, 2,6, 4,8, 6,8 2,20 50 1,01 jälkiä 4 muussa hiiressä

Tarkistus 1,8, 3,0, 0,7, 3,4 2,17 100 1,00 (suola- 1,8, 2,3, 2,0, 2,5 liuos) 11 602 3 5 x Indeksi = käsitellyn ryhmän keskimääräinen kasvannaisen paino/ tarkistusryhmän keskimääräinen kasvannaisen paino.

Edellä esitetyt tulokset on esitetty kuvassa 7.

Koe 2 24 tuntia sen jälkeen, kun 200 mg/kg KS-2-A:ta oli annettu kerran vatsakalvon sisäisesti tai suun kautta hiirille, 10·^ Ehrlich ascites kasvannaissoluja istutettiin vatsakalvon sisäisesti jokaiseen hiireen. Niiden eloonjäämisvuorokausien lukumäärä huomioitiin.

Tässä kokeessa käytettiin DDI hiiriä (S?), joiden paino oli 20 g ja ikä noin 6 viikkoa.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2

Antomuoto Hiirien Eloonjäämisaika vuo- KeskiÄäär. Eloonjää- luku- rokausina eloonjäämis- neet/kä- määrä aika vuoro- sitellyt _ _ _ kausina_ {%)

Vatsakal- 10 23, 27, 28, 29, 29, >56,6 4/10 (40) von si- 30,>100,>100,>100, säinen >100

Suun/kaut- 10 26, 26, 27, 27, 28, >49,4 3/10 (30) ta 30, 30,>100,>100,>100

Tarkistus 10 22, 23, 24, 25, 25, 24,7 0/10 (0) (suola- 25, 25, 26, 26, 26 liuos)

Koe 3

Hiirestä otettuja Ehrlich ascites kasvannaissoluja pestiin useita kertoja seerumi vapaalla RPMI-1640 väliaineella 5 min kierrosluvulla 1800 kierr./min ja solujen pitoisuus säädettiin arvoon 1 x 10** so-lua/ml käyttäen samaa väliainetta. RPMI-1640 on suspensioviljely-väliaine, jonka on kehittänyt Moore, O.E., Roswell Park Memorial Institute (RPMI) nimisen laitoksen johtaja (Moore, G.E., J.A.M.A., 199, 519 (1967)).

Sillä välin KS-2-A:ta liuotettiin samaan väliaineeseen liuosten 10 mg/ml, 2 mg/ml ja 400 mikrogrammaa/ml valmistamiseksi. 1 ml kutakin näin valmistettua KS-2-A liuosta lisättiin 1 ml:an edellä mainittua i2 602 35

Ehrlich solususpensiota ja viljeltiin CC^cssa inkubaattorissa 2 tuntia 37°C:ssa. Viljelyn aikana koeputkea ravistettiin useita kertoja.

Sen jälkeen jokaista viljelmää sentrifugoitiin 5 min kierrosluvulla 1800 kierr./min, mitä seurasi pesu RPMI-1640 väliaineella. Tällä tavalla saadut solupallot suspendoitiin 2 ml:an väliainetta. 0,2 ml kutakin näin saatua suspensiota annettiin vatsakalvon sisäisesti jokaisen ryhmän viidelle kuuden viikon ikäiselle DDI hiirelle.

Huomioitiin hiirien eloonjäämisvuorokausien lukumäärä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 3·

Taulukosta 3 käy selville, että eloonjäämisvuorokaudet eri ryhmissä ovat käytännöllisesti katsoen samat kuin tarkistusryhmässä, mikä osoittaa, että KS-2-A:lla ei ole mitään välitöntä solumyrkky-vaikutusta syöpäsoluun.

Taulukko 3

Hoidot Hiirien Eloonjäämisaika vuo- Keskimäär. Eloonjää- luku- rokausina eloonjäämis- neet/kä- määrä aika vuoro- sitellyt _ _ _ kausina_ (%) KS-2-A 5 24, 24, 25, 26, 30 25,8 0/5 10 mg/ml KS-2-A 5 26, 26, 27, 28, 31 27,6 0/5 2 mg/ml XS-2-A 5 25, 25, 25, 30, 30 27,0 0/5 400 mcg/ml RPMI-1640 5 24, 25, 26, 28, 32 27,0 0/5 (Tarkistus)

Koe 4 DDI hiirille, joiden paino oli 20 g ja ikä 6 viikkoa, annettiin vatsakalvon sisäisesti 200 mg/kg KS-2-A:ta. 24 tuntia sen jälkeen vatsakalvosta tihkuvat solut pestiin pois seerumi-vapaalla RPMI-1640 väliaineella. Pestyjä vatsakalvosta tihkuneita soluja viljeltiin CC^tssa inkubaattorissa 2 tuntia. Sen jälkeen kiinnittymättömät solut heitettiin pois ja kiinnittyneet solut pestiin kaksi tai kolme kertaa RPMI-1640 väliaineella lämpötilassa 37°C. Solut, jotka jatkuvasti kiinnittyivät petrimaljaan, koottiin käyttämällä trypsiiniä ja 13 60235 SOTA:ta, ja saatiin makrofaagi, joka oli peräisin KS-2-A:lla käsitellystä hiirestä.

Toiseen ryhmään 6 viikon ikäisiä DDI hiiriä injektoitiin vatsakalvon sisäisesti Ehrlich ascites kasvainsoluja 10^ solua/hiiri. Tähän ryhmään istutettiin vatsakalvon sisäisesti edellä mainittua makrofaagia, joka oli saatu KS-2-A:llä käsitellyistä hiiristä, 2*4 tuntia ennen kasvaimen istutusta, minkä jälkeen 3 vuorokauden välein yhteensä 10 kertaa istutettiin 5 x 10^ - 1 x 10^ makrofaagia istutusta kohti. Näiden hiirien eloonjäämisaika vuorokausina huomioitiin.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 4.

Taulukko 4

Kasvaimen Hiirien Eloonjäämisaika vuo- Keskimäär. Eloonjää- omaavien luku- rokausina eloonjäämis- neet kä- hiirien määrä aika vuoro- §itellyt käsittely _ _ kausina (%) KS-2-A:11a 10 26, 40, 43, 45, 46, >70,0 5/10 käsitelty >100,>100,>100,>100, (50) hiiren >100 makrofaagi Käsittele- 10 24, 26, 27, 28, 29, 29,6 0/10 mättömän 30, 31, 32, 34, 35 (0) hiiren makrofaagi RPMI-1640 10 26, 26, 27, 28, 28, 28,2 0/10 väliaine 28, 29, 29, 30, 31 (0) yksinään

Koe 5

Muunnettuja FM-3A soluja, jotka oli valmistettu 1 x 10^ solua/ml Eaglen MEM väliaineessa, johon oli lisätty 10 % FCS (vasikan sikiö-seerumi), pantiin kolmeen erilaiseen viljelypulloon a, b ja c.

FM-3A soluilla tarkoitetaan C3H hiirilajin nisäsyövästä otettuja kasvainsoluja.

Pulloa a .viljeltiin lisäämättä makrofaagia.

Pulloa b viljeltiin lisäämällä 1 x 10^ solua/ml vatsakalvonsi3äistä makrofaagia, joka oli saatu normaalista hiirestä.

14 60235

Pulloa e viljeltiin lisäämällä 1 x 10” solua/ml vatsakalvon sisäis-tä makrofaagia, joka oli peräisin KS-2-A -käsitellystä hiirestä kokeen 4 mukaan.

Viljely suoritettiin 37°C:ssa 5 % COg alaisena 72 tunnin aikana.

24, 48 ja 72 tunnin kuluttua laskettiin FM-3A solujen lukumäärät hemosytometrillä.

Tulokset on esitetty kuvassa 8 ja huomataan, että makrofaagi, joka on aktivoitu KS-2-A:lla, vaikuttaa syöpäsolujen kasvua ehkäisevästi .

Koe 6 40 DDI hiirelle, joiden keskimääräinen paino oli 22 g, annettiin vatsakalvon sisäisesti 200 mg/kg KS-2A:ta (ryhmä I).

Toiselle 40 DDI hiirelle annettiin suun kautta 500 mg/kg KS-2-A:ta (ryhmä II).

4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ja 32 tunnin kuluttua otettiin 5 hiirtä kummastakin ryhmästä ja otettiin niistä verta. Näin saatu veri sentrifugoitiin kierrosluvulla 3000 kierr./min 10 min ajan seerumin saamiseksi.

Interferonitiitteri mitattiin tymidiinikinaasia sisältämättömällä L-lD-hiirisolun ja vesikulaaristomatiittiviruksen (VSV) kannalla. L-1D on hiiren L-solujen subkloonija sen ovat eristäneet Dubbs, D.R. ja Kit, S. Tämä klooni, joka häviää tymidiinikinaasissa, kestää 30 mcg/ml 5-bromidesoksiuridiinia (Dubbs, D.R. ja Kit, S., Exptl. Cell. Res., 33, 19 (1964)). Interferonitiitteri saatiin laimennetun veriseerumin aikaansaamana ratkaisevana suojavaikutuksena virussolusairauksia vastaan (CPE). Osoitettu interferonitiitteri kalibroitiin kansainvälisiksi interferoniyksiköiksi National Institute of Health (NIH), USA, käytännön mukaisesti. Tulokset on esitetty kuvassa 9· (J = vatsakalvon sisäinen annostus 200 mg/kg, K = suun kautta suoritettu annostus 500 mg/kg).

Havaitaan, että interferoni indusoituu seerumissa noin 24 tuntia KS-2-A:n antamisen jälkeen.

15 60235

Koe 7

Neljälle ryhmälle DDI hiiriä, joiden keskimääräinen paino oli 20 g ja ikä noin 6 viikkoa, annettiin vatsakalvon sisäisesti 200, 100, 50 ja 25 mg/kg KS-2-A:ta. Jokaisessa ryhmässä oli viisi hiirtä.

24 tuntia antamisen jälkeen verta otettiin jokaisesta hiiriryhmäs-tä interferonitiitterin määräämiseksi. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

Taulukko 5

Vatsakalvon sisäinen Interferonitiitteri/ml annos KS-2~A:ta (mg/kg) 200 800 100 800 50 800 25 800

Koe 8

Listerioosipotilaasta eristetty Listeria monocytogenesis suspendoi-

O

tiin tislattuun veteen 10 virusta/ml ja injektoitiin tartunnan aikaansaamiseksi hiirien häntäsuoneen 0,1 ml/hiiri. 24 tuntia ennen Listerian injektointia annettiin 0,5 ml KS-2-A liuosta vatsakalvon sisäisesti. KS-2-A annostus oli 5-425 mg/kg hiirille eri ryhmissä. Tarkistushiirille annettiin vatsakalvon sisäisesti 0,5 ml suolaliuosta. Tartunnan jälkeen 20 vuorokautta eläneiden hiirien lukumäärä huomioitiin ja eloonjäämis-% laskettiin.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 6.

Taulukko 6 KS-2-A:n vatsa- Hiirien Eloonjääneiden Eloon- kalvon sisäinen lukumäärä lukumäärä 20 jäämis-56 annos (mg/kg) vuorokauden _ _ jälkeen_ _ 425 7 7 100 141 7 7 100 47 8 8 100 16 8 7 87,5 5 8 8 100 0 19 5 26,3 (Tarkistus) 16 60235

Koe 9

Tehtiin muuten sama käsittely kuin kokeessa 8, paitsi että annettiin suun kautta 5-425 mg/kg KS-2-A:ta. Huomioitiin 20 vuorokautta tartunnan jälkeen eloonjääneiden hiirien lukumäärä ja laskettiin eloonjäämis-Ji.

Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 7·

Taulukko 7 KS-2-A:n suun Hiirien Eloonjääneiden Eloon-

kautta annettu lukumäärä lukumäärä 20 jäämis-JC

annos (mg/kg) vuorokauden _ _ jälkeen_ _ 4 25 7 7 100 141 8 7 87,5 47 8 7 87,5 16 8 8 100 5 87 87,5 0 19 5 26,3 (Tarkistus)

Koe 10

Pseudomonas aeruginosaa, joka oli eristetty leukemiapotilaan virtsasta, viljeltiin 37°C:ssa 24 tuntia ja suspendoitiin sen jälkeen

O

tislattuun veteen 10 virusta/ml sekä injektoitiin tartuntaa varten 26 DDI hiireen (naaraspuolisia hiiriä, joiden paino oli 20 g ja ikä 6 viikkoa) niiden häntäsuoneen 0,1 ml/hiiri.

24 tuntia ennen injektiota annettiin käsitellylle ryhmälle vatsa-kalvon sisäisesti 150 mg/kg KS-2-A:ta 0,5 ml:ssa vesiliuosta, samalla kun tarkistusryhmälle annettiin vatsakalvon sisäisesti 0,5 mg suolaliuosta.

20 vuorokautta tartunnan jälkeen huomioitiin eloonjääneiden hiirien lukumäärä ja laskettiin eloonjäämis-ί. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 8.

v.

60235

Taulukko 8 KS-2-A:n Hiirien Eloonjäämisaika Keskimäär. Eloonjää- Eloon-annos lukumäärä vuorokausina eloonjää- neiden jäämis-$ (mg/kg) misaika lukumäärä vuorokau- 20 vrk _ _ _ sinä_ jälkeen _ 150 14 2, 2, 3, 3, >10,7 10 71 >14,>14,>14,>14, >14,>14,>14,>14, >14,>14 0 12 1, 1, 1, 2, 2, 2,3 00 3, 3, 3, 3, 4, 4

Koe 11 KS-2-A:n välitöntä bakteerinvastaista aktiivisuutta tutkittiin sel-luloosalevydiffuusiomenetelmällä käyttäen erilaisia bakteereita ja 1000 mcg/ml KS-2-A:n vesiliuosta. Kuten taulukosta 9 käy selville, KS-2-A:lla ei ollut välitöntä bakteerinvastaista aktiviteettia.

Taulukko 9

Mikrobi MIC

(pienin estoväkevyys)

Pseudomonas aeruginosa >1,000 mcg/ml

Klebsilla pneumoniae >1,000 mcg/ml

Listeria monocytogenes >1,000 mcg/ml

Escherichia coli >1,000 mcg/ml

Staphylococcus aureus 209-P >1,000 mcg/ml

Candida albicans >1,000 mcg/ml

Candida tropicalis >1,000 mcg/ml

Candida pseudotropicalis >1,000 mcg/ml

Candida utilis >1,000 mcg/ml

Saccharomyces cerevisiae Br-60 >1,000 mcg/ml

Hansenula anomala >1,000 mcg/ml

Proteus OX-19 >1,000 mcg/ml

Bacillus subtilis >1,000 mcg/ml

Shigella sonnei >1,000 mcg/ml

Sareina lutea >1,000 mcg/ml

Koe 12 DDI hiirille, joiden paino oli 14-16 g, ja jotka oli tartutettu v»‘' ’ is 60235 sieraimensisäisesti influenssaviruksella, annettiin laskimonsisäisesti tai suun kautta 200 mg/kg KS-2-A:ta. Tarkistusta varten annettiin 50 mg/kg viratsolia tai 0,5 ml suolaliuosta vatsakalvon sisäisesti. Hiirien eloonjäämisvuorokaudet ja eloonjäämis-ϊ huomioitiin. Sekä KS-2-A:ta että viratsolia annettiin vastaavina suolaliuoksina yhteensä 15 kertaa, nimittäin tunti ennen virustartuntaa, sen aikana, 1, 3 ja 6 tuntia tartunnan jälkeen ja sen jälkeen kahdesti päivässä neljän päivän aikana. Hiiriin soveltuvana influenssaviruksena käytettiin viruskantaa A2/Kumato/Y^(H2N2) annoksena 10 LD^Q. Tulokset on esitetty yhteenvetona seuraavassa taulukossa 10.

Taulukko 10 Lääke Annosmuoto Hiirien Keskimäär. Eloon- lukumäärä eloonjäämis- jäämis-% aika vuoro- _ _ _ kausina___ KS-2-A, Vatsakalvon 20 >20 52 200 mg/kg sisäisesti KS-2-A Suun kautta 25 >19 52 200 mg/kg

Virazole, Vatsakalvon 20 >16,9 50 50 mg/kg sisäisesti

Tarkistus Vatsakalvon 50 9,2 0 sisäisesti

Koe 13

Tutkittiin KS-2-A:n myrkyllisyys. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 11.

Taulukko 11

Koe-eläin Vatsakalvon Suun kautta Lfs£fmon,.

sisäisesti sisäisesti

Hiiri 2.083 >12.500 875 LD50 (mg/kg)

Rotta --- >2.000 LD50 (mg/kg)

Marsu >600 >2.000 - \ « 1 1 r

Claims (13)

19 60235 Patenttivaatimus Menetelmä kasvainsolujen kasvua ehkäisevän KS-2-A nimisen aineen valmistamiseksi, jolla on seuraavat fysikokemial-liset ominaisuudet: 1. alkuaineanalyysi C: 39,5 %, H: 6,5 %, N: 1,1 %, tuhka: jälkiä (0,4 *); 2. molekyylipaino 9000 ± 3000 (ultrasuodattamalla) 7000 - 9000 (tasapainotiheysgradienttisentrifugoimalla) 8000 ± 3000 (fluoreseiinipolaroimismenetelmällä); 3. ulkonäkö amorfinen valkoinen jauhe; 4. hajoamispiste 185°C (perustuu ruskistumislämpötilan mittaukseen kapil-laarimenetelmällä silikoniöljyä käyttäen); 20 60235 10. homogeenisuus a. sentrifugointi, joka suoritettiin CsCl:n 5-20 % lineaarisella gradientilla 0,1 M Tris-HCl puskurissa (pH 7,2) kierrosluvulla 38.000 kierr./min 4°C:ssa 15 tunnin aikana, osoittaa aineen olevan homogeenista (kuva 3); vertailevat sedimentaatiokokeet virus-nukleiinihapoilla osoittavat, että aine ei sisällä virusosasia, RNA:ta tai DNA:ta; b. aine on elektroforeettisesti homogeenista, minkä osoittaa elektroforeesi, joka tehtiin selluloosa-asetaa-tilla käyttäen 0,1 M etikkahappo/pyridiini puskuria (pH 3,5) (kuva 4), kondroitiinisulfaattia käytettiin kontrollina; 30 min elektroforeesin jälkeen arvoissa 0,6 mA/cm ja 160 V, kondroitiinisulfaatti siirtyi katodille antaen liikkuvuudeksi H cm/30 min, kun taas KS-2-A:ta siirtyi vähäisessä määrin anodille 90 min aikana (liikkuvuus 1 cm/90 min); aineen osoittaa homogeeniseksi myös elektroforeesi, joka suoritettiin samoissa olosuhteissa kuin edellä, paitsi että käytettiin 1 M pyridiini/etikka-happo puskuria (pH 7,0). 11. värireaktio fenoli-^SO^ reaktio positiivinen antroni reaktio positiivinen Molischin reaktio positiivinen Elson-Morgen reaktio negatiivinen karbatsoli-^SO^ reaktio positiivinen reaktio Folin-Ciocalteau reagenssilla positiivinen biuret reaktio positiivinen reaktio FITC:llä (fluoreseiini isotio- syanaatti) positiivinen värjäys toluidiini sininen 0:11a negatiivinen ninhydriini reaktio positiivinen 12. sokerikoostumus aine saatettiin happohydrolyysin alaiseksi, mitä seurasi pelkistys natriumbooritiydridillä,sitten asetylaatio, minkä jälkeen sokeri-koostumus määrättiin kaasukromatograafisesti (kuva 5)*, aine koostuu pääasiallisesti mannoosista ja sisältää pieniä määriä glukoosia ja galaktoosia sekä myöskin hyvin 21 60235 pieniä määriä arabinoosia ja ksyloosia, jolloin komponenttien painosuhteet ovat 74 : 12 : 12 : 1 : 1; 13. aminohappokoostumus aminohappoanalyysi, joka tehtiin automaattisessa amino-happoanalysaattorissa, jolloin 10 mg ainetta suljettiin tyhjiöön yhdessä 3 ml 6 N HC1 kanssa sekä saatettiin hap-pohydrolyysin alaiseksi 110°C:ssa 22 tunnin aikana, minkä jälkeen HC1 poistettiin pyörivällä haihduttimella, osoittaa, että aineen sisältämät aminohapot ovat pääasiallisesti treoniinia, seriiniä, glutamiinihappoa ja alaniinia sekä lisäksi pieniä määriä asparagiinihappoa, proliinia, glysiiniä, valiinia ja lysiiniä; edelleen joskus hivenraääriä metioniinia, isoleusiinia, leusiinia, ty-rosiiniä, fenyylialaniinia, histidiiniä, arginiinia ja kysteiiniä; tunnett u siitä, että viljellään jotakin seuraavista kannoista: Daedalea dickinsii KSDD 6 (PERM-P no 3993), Lentinus edo-des KSLE 7 (PERM-P no 3994) tai Lentinus edodes KSLE 28 (PERM-P no 4196), väliaineessa, joka sisältää viljaviskiä valmistettaessa saatuja tislauksen sivutuotteita, uutetaan saatua huovastoa käyttäen kuumaa vettä tai laimeaa suolaliuosta ja käsitellään näin saatua uutetta hydrofiilisellä liuottimena, jolloin saatu saostuma liuotetaan veteen ja liuosta uutetaan vedellä kyllästetyllä fenolilla, jonka jälkeen erotetusta vesikerroksesta saostetaan tuote käyttäen etanolia sekä puhdistetaan edelleen ioninvaihtokolonnikromatografiällä. 60235 22 Förfarande för framställning av tumörcelltillväxt inhiberande KS-2-A substans, vars fysikalisk-kemiska egenskaper är följande: