JP2522945B2

JP2522945B2 - 抗レトロウィルス剤

Info

Publication number: JP2522945B2
Application number: JP62152089A
Authority: JP
Inventors: 義春小口; 謙一松永; 国孝広瀬; 淳二角地; 教文杉田; 孝雄古荘; 成明武藤; 浩一新村; 稔大原; 親雄吉汲; 正明高橋
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1987-06-18
Filing date: 1987-06-18
Publication date: 1996-08-07
Anticipated expiration: 2011-08-07
Also published as: JPS63316726A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は原核菌類（Procaryomycota）に属する細菌、
粘液細菌及び放線菌等から抽出される多糖体又は蛋白多
糖体（以下、本物質と略記する）を有効成分とする抗レ
トロウイルス剤に関するものである。因みに、本発明に
おける菌の分類は「岩波生物学辞典」第３版（昭和58年
３月10日岩波書店発行）に拠る。エンテロコッカス属、
ビフィドバクテリウム属、ラクトバシリウム属が好まし
い。

Ｂ型肝炎、成人Ｔ細胞白血病さらにはAIDS（Acquired
Immunodeficiency Syndrome）と、近年次々にウイルス
病が話題の焦点となっている。ウイルス病に対してはこ
れまでワクチンによる予防接種で対応し、天然痘根絶を
はじめ、黄熱、ポリオの制圧がなされてきた。しかしAI
DSなどのように持続感染や潜伏感染が問題となる病気に
対してはワクチンだけでは対抗できず、安全ですぐれた
効果を示す抗ウイルス剤の開発が期待されているのが現
状である。そこで、本発明者らは各種の薬剤を鋭意検討
したところ驚くべきことに、本物質が抗レトロウイルス
作用の薬理効果を有していることを知見し、本発明に至
ったものである。

本発明の原核菌類から人工培養菌体を得るには、該菌
を母菌として培地に接種して適温にて培養を行う事によ
り得られるものである。通常は液体培地を用いる方が取
扱い及び生産性の面からして好ましいものである。

培養のための培地組成としては、通常の培養に用いら
れる処方で十分であり、上記の菌の発育に必要な諸栄養
が含有されておればよい。即ち、炭素源としては例えば
ブドウ糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、デンプン、廃糖蜜糖、
窒素源としては例えば各種ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、酵母、コーンスティープリカー、アンモニウム塩
類、尿素等の有機、無機の窒素化合物を使用することが
出来る。又、ミネラル成分としては燐酸塩、マグネシウ
ム塩、鉄塩、カルシウム塩などの無機塩類を添加しても
よい。この他に生長に必要なビタミン類その他の成分を
適宜添加しても良い。

培養条件としては初発pH2〜7,20℃〜35℃で通常２〜3
0日間培養を行う。この内培養中のpH4〜５、温度25〜30
℃の条件が特に好ましい。通気撹拌培養を行なう場合に
は、培養タンクの形状により若干の変化はあるが、通気
量0.1〜2.0l/l/min、撹拌速度30〜800r.p.m.の範囲で実
施するのが適当である。

本物質の菌体からの抽出に際して用いる水系溶媒とは
水又は水に可溶な有機溶媒、酸、塩基又は塩のいずれか
を少量、例えば10％程度以下含有する水溶液から選択さ
れる１種又は２種以上の組合せよりなるものである。有
機溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピル
アルコールなどが主として用いられる。酸としては、塩
酸、硫酸、酢酸などである。塩基としてはアンモニヤ、
苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソーダなどである。抽出は
菌体原料（乾燥基準）に対して５倍乃至200倍量の抽出
液を使用し、通常は４℃乃至120℃で20分乃至20時間処
理するものである。

精製処理工程とは、塩析、透析、限外濾過、逆滲透処
理、ゲル濾過、有機溶媒による沈殿処理などの１種又は
２種以上の方法の適用により低分子物質を除去すること
を意味するものである。工学的には加圧による膜分離法
である限外過法、逆滲透処理法の単独又は組合せが特
に好ましい。又場合により塩析工程後これらの処理を行
ってもよい。

塩析工程に用いる塩析剤は硫安、食塩、塩化カリ、炭
酸バリウム等であるが、硫安の使用が最も好ましい。又
塩析工程の後処理として透析、限外濾過、ゲル濾過、逆
滲透処理等のいずれか１つ又はこれらの２以上の工程の
組合せが必要である。

透析は通常セロファン膜、コロジオン膜などの半透膜
を用いて実施されるものである。ゲル濾過はデキストラ
ン又はポリアクリルアミドゲルなどを充填したカラムを
用いて実施する。セファデックス、バイオゲルの名称で
販売せられている充填剤が通常用いられる。

限外濾過、逆滲透圧法はいずれも加圧下で膜を用いて
分画する方法である。前者は0.5〜5kg/cm²、後者は20〜
35kg/cm²で行うのが通常である。

有機溶媒による沈澱法はメタノール、エタノール、イ
ソプロパノール、アセトンなどを用いるのが一般的であ
る。又、上記操作に加えて必要に応じイオン交換処理を
行っても良い。

上記精製操作が終った後は噴霧乾燥、凍結乾燥などで
水分を除去した後製品化するものである。

培養済培地を用いる場合は精製工程のみを用いてもよ
い。

尚、本物質をアルカリ性水溶液を処理すると驚くべき
ことには抗レトロウィルス効果が増強されるので更に好
ましい。

本物質を５倍乃至200倍量の0.01N乃至5N、好ましくは
0.1N乃至2Nのアルカリ性水溶液で40℃乃至250℃、好ま
しくは60℃乃至200℃、最も好ましくは100℃乃至150℃
で５分乃至２時間、好ましくは10分乃至１時間処理す
る。次に、該処理液を中和し精製処理工程を行なう。精
製処理工程は前記の塩析、透析、限外過、逆滲透処
理、ゲル過、有機溶媒による沈澱処理などの１種又は
２種以上の方法の適用により行なうことが出来る。条件
は前記と同じである。

上記精製操作が終った後は、噴霧乾燥、凍結乾燥など
で水分を除去した後製品化する。

又、本物質をジエチルアミノエチル（DEAE）−セルロ
ース等のイオン交換セルロース等を用いたクロマトグラ
フィーで更に精製を行い、その吸着物質を塩、アルカリ
等で溶出させると、抗レトロウィルス効果が強いものが
得られるのでより好ましい。

本物質は、α−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸
反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応及び又
はローリィーフォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒド
リン反応で陽性又は微陽性を示す。元素分析の結果、炭
素20〜55％、水素３〜９％、窒素16.0％未満を主成分と
して含有する。

pHは6.0〜7.5を示す。

赤外線吸収スペクトルを測定すると、3600〜3200cm^-1
付近に水酸基の吸収及び又は1700〜1600cm^-1付近には、
アミド基に由来する吸収を認めることが出来た。

本物質は水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶である。
水系溶媒は水又は水を主体として水に可溶のアルコー
ル、酸、塩基等を含むものであり、有機溶媒はクロロホ
ルム、ベンゼン、エーテル等を言う。

本物質は白色又は褐色で分子量はゲル過クロマトグ
ラフィーにより10³〜３×10⁶である。

ラット（呑竜系）４〜５週令、体重100〜150gのもの
を用い、本物質を1000mg/kg経口投与し、７日間観察を
行ったが全匹生存していた。

本物質はその毒性が極めて低く且つ副作用も殆んど生
起しないなど安全な物質である。

一般にウイルスは、標的細胞に吸着し、ウイルスの核
酸が、細胞内に注入され、さらに細胞のゲノムにインテ
グレートされる過程を経てウイルスが複製されることが
知られている。また、特にレトロウイルスについては、
細胞のゲノムにインテグレートされる前に、ウイルス由
来の核酸であるRNAから、逆転写酵素の作用によってDNA
に転写される過程が必要である。

本発明者等は、本物質がHIV（Human Immunodeficienc
y Virus）のヒト由来リンパ系細胞への吸着およびそれ
に引き続く感染を阻害すること、および、逆転写酵素活
性を阻害することを見出した。すなわち、HIVを400μg/
mlの濃度の本物質で０℃にて２時間処理した後HIVを洗
浄し、MT−４細胞に加えて吸着させ、３日間培養後のHI
V抗原陽性細胞を測定する方法にて、本物質の効果を検
討したところ、本物質による前処理により、いずれもHI
V抗原陽性細胞がほとんど消失し、HIVのヒト由来リンパ
系細胞に対する強い吸着阻害効果が認められた。一方、
本物質の逆転写酵素活性に及ぼす影響をラット肝臓全メ
ッセンジャーRNAを鋳型として測定したところ、本物質5
00μg/mlの濃度で強い逆転写酵素活性の阻害がみられ
た。

これらのことは本物質がウイルスの感染を阻害する作
用をもつこと、特に逆転写酵素をもつレトロウイルスの
感染を阻害すること、就中、HIV感染にによって引き起
こされるAIDSに有効であることを示すものである。

抗ウイルス剤としてすでに使用されているアジド−
３′−デオキシチミジン（AZT）の場合、正常細胞に対
しても分裂阻害作用を示す副作用がみられるが、本物質
は急性毒性も極めて低く、安全な物質であり、ウイルス
感染、特にレトロウイルス感染を阻害する作用を示すこ
とより抗ウイルス剤として有用である。即ち、ウイルス
感染症、特にレトロウイルス感染症、就中AIDSに有効で
ある。

本物質は、抗レトロウイルス剤として用いる場合、任
意の剤型にすることができる。又、投与も各経路で行な
われる。更に、本発明の薬剤は、抗ウイルス剤として用
いられている前記のAZTなどとの併用においても効力を
減ずることがなく、これら他の薬剤との併用は有効な手
段として使用し得る。

経口投与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤などは、それらの組成物中に製剤
上一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、潤滑剤、
崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有していてもよく、
又経口用液体製剤として用いる場合は、内用水剤、振盪
合剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよ
く、又使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であ
ってもよい。さらに、このような液体製剤は普通用いら
れる添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。注射用
の場合には、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存剤、等
張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、単位投与量ア
ンプル、又は多投与量容器中で提供される。なお、上記
組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒク
ル中の乳剤のような形態であってもよく、一方活性成分
は使用する前に適当なビヒクルたとえば発熱物質不含の
滅菌した水で再溶解させる粉末であってもよい。

本発明の抗レトロウイルス剤は人間及び動物に経口的
または非経口的に投与される。経口的投与は舌下投与を
包含する。非経口的投与は注射例えば皮下、筋肉、静脈
注射、点滴などを含む。本発明の抗レトロウイルス剤の
投与量は動物か人間により、また年齢、個人差、病状な
どに影響されるので、場合によっては下記範囲外の量を
投与する場合も生ずるが、一般に人間を対象とする場
合、本物質の経口投与量は体重1kg、１日当り0.1〜1000
mg、好ましくは１〜100mgを１回から３回に分けて投与
する。

以下、実施例を示す。

実施例１ Enterococcus faecalis（IAM−1262）を肉エキス0.1
％，塩化ナトリウム0.5％，ペプトン１％の培地10lを用
いて培養し、培養液を4000×ｇ′,30分間遠心分離を行
い、上澄液と菌体を分離した。

上澄液は減圧濃縮し、ヴィスキングセルロースチュー
ブで透析し低分子を除いたのち、凍結乾燥して褐色の乾
燥物30gを得た。

実施例２実施例１で分離した菌体を５倍容量の生理的食塩水に
撹拌しつつ、できるだけ均一に浮遊させた。この浮遊液
は4000×ｇ′,30分間遠心分離を行い、上澄液を捨て、
沈澱を生理食塩水に浮遊させ、フレンチプレスを用い細
胞を破壊した。ほとんどの細胞が空になったことを確か
めたのち、懸濁液を4000×ｇ′,30分間遠心分離し、残
渣を水に懸濁し、くり返し操作を３回行った。

洗滌後の残渣はエタノールに入れて遠心分離し、100
％エタノール，アセトンに置き換えたのち減圧で乾燥
し、23gの粉末を得た。

実施例３「Lactobacillus casei（IAM−1118）（乳酸菌）培養
液の4000×ｇ′,30分間の遠心分離によって得られた菌
体を５倍容量の生理的食塩水に撹拌しつつ、できるだけ
均一に浮遊させた。この浮遊液は4000×ｇ′,30分間遠
心分離を行い、上澄液を捨て、沈澱を生理食塩水に浮遊
させ、フレンチプレスを用い細胞を破壊した。ほとんど
の細胞が空になったことを確かめたのち、懸濁液を4000
×ｇ′,30分間遠心分離し、残渣を水に懸濁し、くり返
し操作を３回行った。

洗滌後の残渣はエタノールに入れて遠心し、100％エ
タノール，アセトンに置き換えたのち減圧で乾燥し、粉
末を得た。

洗滌後の沈渣は0.5N−NaOH水溶液により80℃,2時間加
熱抽出を行った。抽出液は室温まで冷却し、2N−HClでp
Hを7.0に調整し限外濾過により脱塩したのち凍結乾燥し
22gを得た。

尚、使用した培地組成の詳細は下記の通りである。

ペプトン１％ダイズペプトン 0.3 ％フロテオースペプトンＷ１％消化血清末 1.35％酵母エキス 0.5 ％牛肉エキス末 0.22％肝臓エキス末 0.12％ブドウ糖 0.3 ％リン酸二水素カリウム 0.25％塩化ナトリウム 0.3 ％デン粉 0.5 ％Ｌ−システイン塩酸塩 0.03％チオグリコール酸ナトリウム 0.03％実施例４実施例２の菌体抽出物10gを1N−水酸化ナトリウム水
溶液200mlに加え、オートクレーブ中120℃,20分間熱処
理を行なった。混合物をpH7に調節したのち、ヴィスキ
ングセルロースチューブで透析し、塩などの低分子物を
除去した。

内容物を凍結乾燥して、8.4gの乾燥物を得た。

実施例５実施例３と同様の操作法により、Bifidobacterium in
fantis（ATCC 15697）から17gの菌体抽出物を得た。

実施例１〜５で得られた化合物の物理化学的性質を表
１にまとめて示した。本表において、フェノール硫酸呈
色反応は糖類の存在を示し、ローリィーフォーリン法
は、ペプチド結合の存在を示している。分子量について
はゲル過法によって平均的に多く存在する画分を記載
した。

実施例６実施例１〜５で得られた物質について、レトロウイル
スが特異的に保持する逆転写酵素の阻害度を以下の方法
により測定した。

本物質はすべて凍結乾燥品10mgを滅菌蒸留水10mlに溶
解した（濃度:1mg/ml）。

１μｌの20mM D.T.T.（ジチオスレイトール：シグマ
社製）、５μｌの５倍濃度酵素反応液（250mM Tris−HC
l（pH8.3）−250mM KCl−40mM MgCl₂）、１μｌの3d NT
P溶液（1mM dATP−1mM dGTP−1mM dTTP:シグマ社製）、
２μｌの100μg/mlオリゴ(dT)_12〜18（PL−biochemical
s社製）、１μｌのメッセンジャーRNA（正常ラット肝臓
由来:1μg/μｌ）、0.5μｌのRNase Inhibitor（16 un
it/μl:宝酒造社製）と１μｌの［α−³²P］dCTP（約80
0ci/mmol,10μCi/μl:アマシャムジャパン社製）を1.5m
l容量のエッペンドルフチューブに加え、37℃ウォータ
ーバス中においた。

５分後、先に調製した1mg/ml濃度の本物質12.5μｌを
反応チューブに添加し、更に１μｌの逆転写酵素（７ユ
ニット／μl:宝酒造社製、Rous associated virus由
来）を加え、最終反応液量を25μｌとして、37℃で反応
させた。

１時間後５μｌの反応液を2cm×2cmのDEAE紙（東洋濾
紙社製）にしみこませ、風乾後、濾紙１枚あたり10mlの
0.5M−Na₂HPO₄水溶液に浸し振盪しながら、濾紙上のDNA
合成に使用されなかった［α−³²P］dCTPを洗浄した
（この操作を５分間おきに５回実施した）。

その後10mlの液体シンチレーションカクテル（アマシ
ャムジャパン社製）の入っているガラスバイヤル瓶に上
記DEAE紙を入れ、シンチレーションカウンター（アロカ
社製）にて１分間放射活性（c.p.m）をカウントした。

逆転写酵素活性阻害率（％）は以下の式により求め
た。

Co:本物質非添加の放射活性 Cs:本物質添加の放射活性各本物質の逆転写酵素（RTase）活性阻害率を表２に
示す。

実施例７本物質によるHIV（AIDSウイルス）のヒトリンパ球へ
の吸着阻害は以下の方法により実施した（尚、すべての
操作は無菌条件下に行なった）。

HIV浮遊液1mlと本物質溶液（800μg/ml）1mlを試験管
に入れ、氷中に静置した。２時間後試験管から1mlのウ
イルス浮遊液をとり、ヒトリンパ球由来細胞株MT−４
［Jpn.J.Cancer Res.（Gann），28,219−229（1982）］
に多量感染度（M.O.I）≒２でウイルスを吸着させた。
遠心（毎分2,000回転,10分間）後、上澄液をすて、沈澱
したMT−４細胞を20％FCSを含むRPMI1640（Gibco Labor
atories,NY）中に、細胞濃度２×10⁵/mlになるように浮
遊させた。

96穴プレートに上記MT−４細胞浮遊液を100μｌずつ
分注して、空気中５％CO₂、37℃の条件下で培養した。
培養３日目に間接蛍光抗体法によりHIV吸着細胞と非吸
着細胞を算出した。

すなわち、MT−４細胞をメタノール処理により固定化
し、抗HIV感染患者血清と37℃で反応させた。30分後PBS
で細胞を洗浄し、フルオレッセインイソチオシアネート
結合ウサギ抗ヒトIgG（免疫グロブリン）と37℃で反応
させた。

蛍光顕微鏡下で500個のMT−４細胞を観察し、蛍光陽
性細胞をHIV吸着細胞として算出した。

HIV吸着阻害率（％）を次式で求めた。

その結果を表３に示す。

実施例８圧力式自動充填機を用い、０号硬カプセルに実施例１
の本物質を330mg充填し、カプセルを作成した。

フロントページの続き (72)発明者古荘孝雄町田市旭町１−６−13 (72)発明者武藤成明東京都葛飾区東堀切３の23の２ (72)発明者新村浩一狭山市青柳63 新狭山ハイツ６−104 (72)発明者大原稔東京都板橋区富士見町19−25 (72)発明者吉汲親雄国立市東２−19−46 (72)発明者高橋正明東京都港区高輪１−５−33−314 (56)参考文献特開昭58−43790（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−82322（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−14533（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−34694（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−11795（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−22793（ＪＰ，Ａ) 特開昭52−38017（ＪＰ，Ａ) 特開昭51−32794（ＪＰ，Ａ) 特開昭50−126888（ＪＰ，Ａ) 特開昭50−101585（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】原核菌類に属するエンテロコッカス属、ビ
フィドバクテリウム属、ラクトバシリウス属より生産し
た多糖体又は蛋白多糖体を有効成分とする抗レトロウイ
ルス剤。
【請求項２】α−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸
反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応及び又
はローリィ−フォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒド
リン反応で陽性又は微陽性を示し、元素分析値として炭
素20〜55％、水素３〜９％、窒素16.0％未満を主成分と
して含有し、pHは6.0〜7.5を示し、3600〜3200cm^-1付近
に水酸基の赤外線吸収スペクトルの吸収及び又は1700〜
1600cm^-1付近にアミド基に由来する赤外線吸収スペクト
ルの吸収を有し、水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶で
あり、白色又は褐色で分子量はゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより10³〜３×10⁶である特許請求の範囲第１項に
記載の抗レトロウイルス剤。
【請求項３】抗エイズウイルス剤であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の抗レトロウイルス剤。