DK147766B - Fremgangsmaade til fremstilling af antitumorstoffer bestaaende af et nitrogenholdigt polysaccharid ved ekstraktion af en svamp af basidiomycet-kla ssen hoerende til slaegten coriolus af familien polyporaceae - Google Patents

Description

147766

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af antitumorstoffer bestående af et nitrogenholdigt polysaccharid ved ekstraktion af en svamp af basidiomycet-klassen hørende til slægten Coriolus af familien Polyporaceae med vand eller et vandigt, alkalisk opløsningsmiddel og rensning af den fremkomne ekstrakt.

Det er velkendt, at antitumorstoffer bestående af poly-saccharider kan fremstilles ved rensning af den ekstrakt, som fås ved ekstraktion af basidiomycet-svampe med et vandigt opløsningsmiddel under normalt tryk.

Pra GB patentskrift nr. 1.331.513 kendes således en fremgangsmåde til fremstilling af et antitumorstof bestående af et nitrogenholdigt polysaccharid (polysaccharid-protein), ved hvilken en svamp fra klassen basidiomyceter, specielt fra slægten Coriolus af familien Polyporaceae, ekstraheres med vand eller en alkalisk 147766 2 opløsning og efterfølges af en rensning af den fremkomne ekstrakt.

Denne kendte fremgangsmåde har imidlertid den alvorlig ulempe, at den har en alt for ringe ekstraktionseffekt hvad angår de aktive bestanddele i svampen. Den ringe ekstraktionseffekt resulterer i et betydeligt tab af de aktive bestanddele som følge af, at de bliver tilbage i stor mængde i ekstraktionsresten. Dette er uønsket, ikke blot ud fra et produktivitetsmæssigt synspunkt med hensyn til tilvejebringelse af antitumor -stoffer men også ud fra et in dustrielt synspunkt, eftersom tabene fører til spild af værdifulde materialer og tillige frembringer et problem hvad angår bortskaffelse af affaldsstoffer.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af de antitumor-stoffer, som forekommer i basidiomyceter, i højt udbytte, således at ovennævnte ulemper undgås, og uden at stoffernes antitumorvirkning går tabt.

Dette formål opnås ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde af den i indledningen omhandlede art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at svampen ekstraheres under et tryk på 2 mellem 1,8 og 20 kg/cm og ved en temperatur på mellem 120 og 200°C, og at den fremkomne ekstrakt renses på i og for sig kendt måde således, at lavmolekylære stoffer med en molekylvægt under 5000 fjernes.

Betegnelsen "basidiomycet-svamp (eller simpelthen basidiomyceter) tilhørende Coriolus-slægten" anvendes her til at betegne en svamp af klassen basidiomyceter, som tilhører Coriolus-slægten af Poly-poraceae-familien i planteklassifikationssystemet, og sådanne basidiomyceter er kendte og indbefatter f.eks. følgende: Coriolus versicolor (Fr.) Quel. Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. Coriolus consors (Berk.)

Imaz . Coriolus conchifer (Schw.) Pat. Coriolus pubescens (Fr.) Quel. Coriolus pargamenus (Fr.) Pat.og Coriolus biformis (Klo.tz.) Pat. (Se COLOURED ILLUSTRATIONS OF FUNGI OF JAPAN af Rokuya Imazeki og Tsuguo Hongo, bind I (1974) og II (1975) ). j ovenanførte benæynelser er den i parentesen efter svampens slægtsnavn anførte forkortelse en forkortelse af navnet på den forfatter, scm gav svampen sit ældre latinske navn, medens forkortelsen efter parentesen er en forkortelse af navnet på den forfatter, som gav svampen sit nuværende latinske navn. Denne skrivemåde er almindeligt anvendt indenfor den videnskabelige litteratur på området. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udvælges svampen fortrinsvis fra gruppen bestående af ovennævnte seks førstnævnte stammer.

3 147766

Betegnelsen "basidiomyceter tilhørende Coriolus-slægten" skal, når den anvendes heri, også fortolkes som omfattende mycelier og frugtlegemer af svampeklassen.

Det har været en almindelig antagelse, at hvis basidiomyceter ekstraheres ved høj temperatur, såsom ved 120-200°C, dekomponeres de aktive bestanddele af svampen, således at selv om det kunne være muligt at forøge den totale ekstraktionshastighed vil det næppe være muligt at forbedre udbyttet af de ønskede antitumorstoffer.

Den foreliggende opfindelse har imidlertid vist, at det ønskede antitumor-stof, helt i modstrid med den almindelige an tagelse, kan fås i højt udbytte, hvis ekstraktionen under ovennævnte temperaturforhold gennemføres under tryk.

Por at udøve ekstraktionen under tryk ifølge den foreliggende opfindelse anbringes udgangsmaterialet, mycelium og/eller frugtlegemer af basidiomyceter tilhørende Coriolus-slægten i en trykbeholder, såsom f.eks. en autoklave af batchtype eller en rørformet ekstraktør med gennemstrømning,sammen med et vandigt opløsningsmiddel, og materialet ekstraheres ved en temperatur på fra 120 til 200°C. Det tryk, som påsættes ved denne behandling, er af en størrelsesorden svarende til det totale damptryk af det i beholderen tilstedeværende vandige op-

O

løsningsmiddel. Sasdvanligvis er det ikke over 20 kg/cm , fortrinsvis mindre end 16 kg/cm , men det bør ikke være lavere end 1,8 kg/cm . Ekstraktionstiden kan afpasses efter den anvendte tenperatur, men ligger ifølge opfindelsen fortrinsvis mellem 5 og 360 minutter. Det vil sige, at en passende ekstraktionstid vælges i ovennævnte område i forhold til den anvendte temperatur, som ligger mellem 120 og 200°C. Hvis ekstraktionstempera-turen er lavere end 120°C, fås ingen tilfredsstillende ekstraktionsvirkning, medens dekomponering af det aktive princip kan forekomme, hvis temperaturen overstiger 200°C, hvorved processen i praksis gøres uigennemførlig. Det bør også bemærkes, at ekstraktionstider på mindre end 5 minutter resulterer i ringe ekstraktionsvirkning, medens en ekstraktionstid på over 360 minutter kan forårsage dekomponering af det aktive princip.

Ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan ekstraktionsoperationen gennemføres gentagne gange under førnævnte forhold, eller udgangsmaterialet kan neddykkes i et vandigt opløsningsmiddel ved en temperatur på mindre end 100°C før ekstraktionsoperationen, eller også kan den opnåede ekstrakt vaskes med et vandigt opløsningsmiddel ved en temperatur på mindre end 100°C efter ekstraktionen.

4 147766

Det ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte vandige opløsningsmiddel kan være f.eks. rent vand eller en alkalisk opløsning, men kan derudover indeholde urinstof eller aminosyrer. Det vandige opløsningsmiddel anvendes sædvanligvis i en mængde på fra 5 til 100 gange, fortrinsvis fra 10 til 50 gange vægten af udgangsmaterialet. Et særligt foretrukket opløsningsmiddel er en fortyndet alkalisk opløsning med en normalitet på under 1.

Den således fremkomne ekstrakt renses derefter ved hjælp af ultrafiltrering, udsaltning, dialyse, omvendt osmose eller andre midler, som kan anvendes enten alene eller i kombination for at fjerne stoffer med lav molekylvægt (stoffer med molekylvægt under 5000) fra ekstrakten. Denne rensningsbehandling giver et nitrogen-holdigt poly-saccharid med særdeles god antitumor-aktivitet.

Stofferne bestående af nitrogen-holdige polysaccharider tilvejebragt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udviser en særdeles god antitumor-aktivitet med særlig høj inhiberende virkning over for alvorlig Sarcoma-180-cancer (eng.: Sarcoma-180 solid cancer) ikke blot ved intraperitoneal indgivelse men også ved oral indgivelse i mus. Dette betyder, at det nitrogenholdige polysaccharid fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringer et godt middel mod cancer, og hvis virkning er blevet bekræftet af mange forsøg. Brugen af de tilvejebragte stoffer er ikke begrænset til de orale anvendelser til frembringelse af antitumor-virkningerne, de stimulerer også immunreaktioner. Nærmere bestemt konstateredes det, at disse stoffer ikke blot var effektive med hensyn til at hindre bivirkningerne ved de kemiske behandlinger af svulstpatienter og til at give forøget modtagelighed overfor røntgenbehandling, men også med hensyn til at standse et fald i patientens immunitet eller fysiske styrke som følge af en operation eller blodtransfusion, eller at give modstandsdygtighed mod virus- eller bakterieinfektioner, når patientens immunitet eller fysiske styrke var ringe.

Det viste sig også, at oral indgivelse af de foreliggende stoffer gav en særdeles god virkning, idet leverfunktionen bedredes, appetitten forøgedes, tarmbesvær blev afhjulpet og urinering fremmet.

Som beskrevet ovenfor, kan det nitrogenholdige polysaccharid, som udover de ovenfor angivne virkninger giver den særdeles gode antitumor-virkning ikke blot ved intraperitoneal indgivelse men også ved oral indgivelse, fås i højt udbytte og ved en for- 147766 5 holdsvis simpel fremgangsmåde, som beskrevet i nedenstående udførelsesformer for opfindelsen. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således et betydningsfuldt teknisk bidrag til den industrielle fremstilling af anticancer-stoffer fra basidiomy-ceter.

Opfindelsen vil nu blive beskrevet mere detaljeret ved hjælp af nogle foretrukne udførelsesformer.

Eksempel 1

Mycelium af Coriolus versicolor (Fr.) Quel. fremkommet ved dyrkning i et kunstigt fremstillet medium og under styrede betingelser tørredes til et vandindhold på 10% og deltes i fem portioner, og derefter blandedes hver portion med 12,5 gange så meget vand (på vægtbasisi og indførtes i en autoklav, hvorefter der ekstraheredes under de i nedenstående Tabel II viste ekstraktionsbetingelser. Den fra hver portion tilvejebragte ekstrakt filtreredes derefter for at fraskille ekstraktopløsningen, og den fremkomne ekstraktopløsning underkastedes en 72 timers dialyse mod strømmende vand ved 5°C under anvendelse af en dialyseslange af regenereret cellulose, såkaldt cellofan, (Visking ®Tube fremstil-let af Union Carbide ^ Corp.) på normal måde. Denne dialysebehandling fjerner stofferne med lav molekylvægt (molekylvægt under 5000) fra ekstrakten. Dialysatopløsningen koncentreredes yderligere, hvorved der fremkom et leverbrunt pulver med et vandindhold på 7%. Dette pulveragtige materiale havde en middelmolekylvægt på over 10.000, og resultaterne af elementaranalyse og forskellige farvereaktionsprøver, som er anført i nedenstående Tabel I, bekræftede, at dette materiale er et nitrogenholdigt polysaccharid.

6 U7766

Tabel I

Farvereaktionsprøver.

Farvereaktion Farve Bemærkninger α-naphto1-svovlsyrereaktion (Molish reaktion) violet Saccharid bekræftet

Indo1-svovlsyrereaktion (Dish reaktion) brun -"-

Anthron-svovlsyrereaktion grønblå

Phenol-svovlsyrereaktion brun -"-

Tryptofan-svovlsyrereaktion purpurbrun

Lowry-folinproces blå Peptid-binding bekræftet

Ninhydrinreaktion efter saltsyrehydrolyse purpurblå α-aminosyre bekræftet

Det vil forstås af resultaterne af ovenstående prøver, at produkterne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er et polysaccharid indeholdende primært peptidbundet nitrogen.

For at bestemme antitumor-virkningen af det nitro-genholdige polysaccharid fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse gennemførtes følgende prøve:

Prøvemetode

Sarcoma-180-tumorceller transplanteredes ind i bughulen på mus, og 7 dage senere (efter tilstrækkelig formering af cellerne) g transplanteredes 10 celler videre til de subcutane områder af axillae hos en anden gruppe mus med henblik på udvikling af faste tumorer.

Indgivelse af stoffet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen påbegyndtes fra den 24. time efter transplantationen. Stoffet blev opløst i en fysiologisk saltvandsopløsning i en koncentration på 1 mg/ml, og opløsningen blev intraperitonealt injiceret i gruppen af mus, som havde fået indtransplanteret tumorcellerne, én gang hver anden dag i alt 10 gange i en dosis på 10 mg stof/kg muselegemsvagt/inj ektion.

Da den gennemsnitlige legemsvægt af de i forsøget anvendte mus var 20 g, var det injicerede volumen opløsning 0,2 ml/mus/injek-tion.

147766 7

Den 25. dag efter transplantation udskrælledes tumoren i hver mus, og dens vægt måltes. Den inhiberende virkning af stoffet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse på tumorvækst beregnedes ud fra middelvægten af tumorer i den gruppe mus, som havde fået indgivet stoffet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og den gennemsnitlige vægt af tumorer i kontrolgruppen.

Resultaterne af målingerne er vist i summarisk form i nedenstående tabel II. De nærmere enkeltheder ved fremstillingen af de respektive prøver, som er anvendt ved denne undersøgelse, d.v.s. anvendt mængde vandigt opløsningsmiddel (vand), ekstraktionstemperatur og -tid, ekstraktionshastighed, selektivitet og udbytte, er også vist i tabel II.

h 8 147766 ® ό

S1 H

0 o« M^jdP rH n μ η η h 4-* 13 — r- r- r- t> r- Ή k K K V «. *.

fl -H O O O O O O

nS

6 Φ

10 g I I

I 34 O g to fl μΦΚ/> nsDio o

fl) > tb dP to β β Η I &> -P

Λ οω-' «3 <U nJ >1 O <U

•Η σι σι o o o oo mtn -η η ΜΌ .fl Gi 34 O ----- - lOSO) 34 O +» fl fl 0 co m λ η η "ΐ c\ 0&> <l) ft H r4 Η Ή 44 H OD 00 ΟΙ σι σι ΟΟ 0) 3| r4 +J β -Η —- tO 4-1 Όι (t) ti) · 4-> «> η 44 g Cn C tu _ -- QJ Ό -H to ·Η (ϋ 43 Ό

03 ft idOCoO-PH

Hg β>·ΜΑΗ^44θ fl) O (0 0) >i (t5 O fl (tJ .fl U J) > > +J M tr> Æ! M J-l -Pura ctu+j'dd+'tuo >i o Η Η ·<3* VO O -Ν' (OrH fl 0)10+)44

Λ 44 H - - - - - - H+) ijiAJ+J

03 H co r- cn o r- o α -η h g o fl) >i H

D H +> r4 CN 'tf -tf in H Q)+)(tJ 0 34 Λ rcftog to +)Π3ΌΟ fl g 34 η 34 fl o

1 — fl 0) O fl A 4-) O

-H dP fl fl fl) 0)

44--- 4J 44 03 · (1) Μ M O

Λί+) 0)34 — OJ S Μ H

0)0) n tn <ί o ό σι iHtno) 44 <jp 4-1 -h pH + - - - - - - ,-4 1¾ 03—44 g 4-> 54

0) -H « m o) <Jt O C- -ri r4 fl (tf g fl <U

M> in tn to tn r- -tf 4j 3 0)4-) too)>

to fl) 'd tn 0) O O

— gfl+>Oig+>-0 1 Λ> 0)β0)ε!>+>θ!44-> X — 34 0) 34 g >iOOitJi <tf I <U 44>0) gg+30 g 3410¾ ^θ- .fl O ¾ · +> >

+) fl &> in in o co to to 0)S4<t3 tutodotUH

to O C - - ' - - - >0)34 +) H ¾ >1 H .g -H g «tf H CN 00 O Η 4J tOtQO) Λ! H H +> g ΓΟ ID tO to CO CN fl H tO -& <D ,¾ 34 34 fl) ft --4 ,¾ 4 3! tJ (3 01 4 H —. 4-) 0) O t Ai Ή > Q · 0) 04 fl O >1 4-) O = g 0) λ g α)4->β ^ p· B* _ d m o ¾α)C4-)fl)4-)g¾(t3 E4 , ^¢36.0)¾^^¾¾^ >) tJI O O CO 04 CN a)(D..(D¾βOg>g3^ 3i ,g - - - - - > fl ¾ fl > to fl) E4 — N in to h O 4) fl fl) oftf 34 4-1 fl) 4 A4-) h a)n3toga)Q) >1 h a> m . r4 t-4 tO ,^4-)44¾¾^ — ftfltlltJi: 4d)®+4t0 • εa)¾βfl)·H¾HS4tτ> C 0) fl U 03 > O fl ί fl

00000 o tog-4CnOifl3tgHfloJ

•Η S tD tD tO 00 CN vo ,i4 o 44 g fl 0) O t) tD

E4— CO cn Q) to &, fl) g - ¾Γflϋ¾ to O 34 g ft = 0) 5-4 Π3 flj tn - 44tOg4-)gOtofl) I— flJJfl) CHO) Ή>ιίι (tf U r4d)t7>HO>-P3|Hg 340 fl[)40)4tll4Q)4Oe 0)— bi >1 «1 fl +) >O ft >

ft ·Η g 44 O Λ! 0) ·Η Ή 0) tO

gfl O O O IT) O CO ,-4 OH-r4 034-)4-) 344-) 0) 0)3 cn in to to co σι fl-H 4-)34¾,M(t3+)&^a)

£4 -P r4r4r4Hi-l (D'OflH-PfltD.ASNHH

ε-Hfl)¾tna)HϋΛ¾^^J ¾ gto¾(tJ^:>a)ϋ¾H+)

(tf(tf°(d34HfltQ(tf!DOO (DOft· cn+3g4J=(t3=ta=+;-P

o3i! S

to fl Π5 — — — ^ C O > · H cn η -tf g 44 to — g +> ¾ oih tn in in in m in fl g -fl - - - - - - (tf > +> CN CN CN CN CN CN fl J> '—- i—I i—I i—I i—1 i—I I I 0) . 01 • I fl

fl to Η -H

fl I Cn® C

fl fl ft £ ® ® H S 34 > gfl® g « i 5Ί2 g fl <0 Η X 0) Οι HCNoo'tfinwHfl) pq 147766 9

Det vil forstås af de i Tabel II viste resultater, at i de prøver, som er gennemført på mus, som subcutant har fået transplanteret Sarcoma-180-tumorceller, udviser hver af de nitrogenhol-dige polysaccharider, som er fremstillet under ekstraktionsbetingelserne ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, en ligeså stor eller højere antitumoraktivitet som tilsvarende præparationer fremstillet under de sædvanlige ekstraktionsbetingelser, og det skal specielt bemærkes, at udbyttet i forhold til den anvendte svampemængde er markant forbedret.

Eksempel 2

Mycelium af Coriolus versicolor (Fr.) Quel., som også anvendtes i Eksempel 1, opdeltes i 8 grupper, og hver gruppe indførtes i en autoklav sammen med 12,5 gange så meget (i forhold til mycelievægten) af en alkalisk eller stort set neutral vandig opløsning som angivet i nedenstående Tabel III, hvorefter der ekstrahe-redes under de tryk- og temperaturbetingelser, som også er angivet i Tabel III. Efter ekstraktion neutraliseredes materialet i autoklaven og filtreredes til adskillelse af ekstraktopløsningen ved at fraskille de uopløselige stoffer som ekstraktionsrest. Denne ekstraktopløsning underkastedes en dialysebehandling ifølge den i Eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde for at udvinde stoffer med en middelmolekylvægt på over 10.000. Ved at undersøge disse stoffer ved hjælp af forskellige farvereaktioner, som vist i Tabel I, bekræftedes det, at de er nitrogenholdige polysaccharider. For at bestemme antitumorvirkningen af de således fremstillede nitrogenholdige polysaccharider blev prøverne 1-8 af disse stoffer indgivet mus, som havde fået Sarcoma-180 subcutant transplanteret. Resultaterne viste, at disse stoffer giver samme eller større antitumorvirkning som de nitrogenholdige polysaccharider, der er fremstillet ved den traditionelle varmtvandsekstraktionsmetode under normalt tryk.

§rd 10 147766

tJl r—I

O o —

+i x! <jp (MoiinNinmmoi 1-1 I

+)^- CD 03 Φ

•r| β — — — — — — — —— — ^ CD

3 -w '»'jnrjHMinn -¾1 d)> (1)0)+1 Η Ό 0)

H G H 1)5H

II G ri $-i nj.—« O tn+> o) o-ι s«3 -r-t o ω

Λ (d ow +1 S

ij O -r+ fM 0)

Xi Iji μΟ Td >1 )H

C c! nJOO (SOMNOOH^P) O li ΜΉ Η -H oiH mmmmmmijiffl σι M +>

<D U dP +! °? J

4J Ow G "j Γ-i H

+J ιμ ft 0) (d H

>i M S wooco-^hocd in ’dSjy Λ 0) (d **·*·*·**·'*· - Μ π h τ3>> ΗΓ^'ϊσιΜοοΗΐί) oo fl) O $ Q) □ o ID ΜΟΙΝΝ'ϋ'ηΝ'ί tTi G > Λ Η -0. (d I •©•'d y Bi A# «Η J Λ _ jj *H > _j ’ΰ

M 4* -ri <D

ød) οιοοοσ>ηοιΠΗ H +)^-:-1 S

Η +1 -------- - (DG,, 0) ri COVOOHOOOLO OO ι-H (d ±ί 0) cq> liin^inuiinnin n r-ι > g w

-ri φ H

— +1 -P > 0) k s §g s g Μ η>ϋ S > tø Λ jj G D> CO Ή m 03 o G -------- - m S o ,54 -H g o^or-^cMcom cm 0) (d £ · ^

H + S n'r-ininoor''xoo co > -G

R -0 <D +» 0) ri ^ M 03 0) 03 C\j &H O Η +1 g 0) >. 0) 0)

X u G ^ s 'd M

>i\ ocnrocNincNom <l> c O s ro f—{ J_j WWVWKKWIk D *!"i *H i—1 H EniS c-jvovooinocom M>'dly+i

M ' i—! r-t r-t 1—I i—1 0) G rt £3* M

Id tfl O O

r-t ~ -H (d u-1 0) · β ft Λ & ΰ

Λ ΰ G οοοοοοοο ο ftQjoiS

Id ri ri (OlSUNOtlOODrI ΙΟ g 'd 0) Η o gt Eng H <D G g i© 03 -5- to d g m M id -η m | 0) 0) 03 0)

id u 03 'd G

un οι o ή o) 'd

Q)'-' G +J Id Td H

p, ri 0) °ld O

g !μ ΟΟΟΟΟΟΟΟ OO G g <D E -G

0) G CMIOIOCOOOOCOO O tD03 03 03 H

Eh+) Hr-tr-trHtMrlrtN ri G H D> O

r-f o (!) G >+) G -H nd id G 0) +> G fcn 0)

•ri i X 0) g M

I ro ro ro ro g g id > 0) >d

03 OOOO Id idMGMG

Di U nuuUKtd+i ffi cn +) id u-ι C

G tdoffiKKOOd o •H id u id ιί id uf ίή id — r-- g r+ sasssstudi 3 h ™ 03 0) I id i i i I 13 i i — ~ -θι^ 3 3 3 3 :s 3 h) 3 ri d i—1 | i—I i—I i—I i—I éP i—1

Qjrl — J21— — — — ^ OP — ·· OS OMOOOOi-lrH O S-l Q)

Dl

• I G

+1 03 Η ri

G I D> fl) G

G G Dt d4

0) 0) ·+ g U

> g G S | «. § tr> 03 g

Id Ή X 0)

Ot HcNfo-^mor-oo cqh 0) ffl 147766 11

Til yderligere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er de nedenfor anførte forsøg blevet udført.

Eksempel 3

Mycelium af hver af de i Tabel IV anførte svampe blev opnået ved dyrkning i et kunstigt fremstillet medium og blev tørret til et vandindhold på 10%, hvorefter det blev blandet med 12,5 gange så meget vand (på vægtbasis). Blandingen blev underkastet ekstraktion i en autoklav under et tryk på 6,3 kg/cm og ved en temperatur på 160°C i 60 minutter. Den opnåede ekstrakt blev behandlet efter samme procedure, som blev anvendt til ekstrakten i Eksempel 1. Herved fremkom en pulverformig substans med samme udseende som den af det pulverformige materiale, som blev opnået i Eksempel 1.

Den pulverformige substans havde en middelmolekylvægt på mere end 10.000, havde samme grundstofsammensætning og frembragte samme farvereaktioner som det pulverformige materiale ifølge eksempel 1. Afprøvet som antitumormiddel mod Sarcoma-180 i mus udviste det en tilsvarende antitumoraktivitet som produkterne ifølge eksempel 1. De opnåede data er anført i Tabel IV. Det fremgår af de opnåede resultater, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke blot er anvendelig til Coriolus versicolor-stammen men også til andre stammer hørende til Coriolus-slægten.

Eksempel 4

Mycelium af hver i de i Tabel V anførte svampe blev opnået ved dyrkning i et kunstigt fremstillet medium på samme måde som i Eksempel 1. Myceliet blev tørret til et vandindhold på 10% og derefter blandet med 12,5 gange så meget vandig 0,1N natriumhydrogencarbonat (på vægtbasis). Blandingen blev under-kastet ekstraktion i en autoklav under et tryk på 6 kg/cm ved en temperatur på 165°C i 60 minutter. Den opnåede ekstrakt blev behandlet efter samme procedure som den, der blev anvendt til ekstrakten i Eksempel 2. Der fremkom herved en pulverformig substans med samme udseende som de substanser, der blev opnået i Eksempel 2.

De opnåede substanser havde en middelmolekylvægt på mere end 10.000, og grundstofsammensætningen og de forskellige farvereaktioner svarede ganske til dem for substanserne ifølge eksempel 3. Også antitumoraktiviteten var fuldstændig sammenligenlig med den for substanserne ifølge eksempel 3. De opnåede afprøvnings- 147766 12 resultater for substanserne ifølge dette eksempel er vist i Tabel V.

Det fremgår af de opnåede resultater i dette eksempel i forbindelse med de opnåede resultater i eksempel 3, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen er anvendelig i sit fulde omfang ikke blot til stammer af Coriolus versicolor (Fr.)Quél. men også til andre stammer af svampe, der hører til Coriolus-slæqten.

13 U7766 i 2 ^cMorni/iMiooocnoc'iinocDt^voinvoc'iHvovovooo in

S | Jj Q HHHiHOHOOOHrHOHOOOOOHHOOOO O

*J fi •Η « β 2 60-.-1

/~N

I H-i cd ajnigv^ coiDinr'CNiDnioiflinr'inr'iDLnfric\jmiDiDn'3,'q,io m •H 6000 O'OlfllO'O'O'OlO'O'O'OlCI'lI'O'II'lJlO'OlCIlO'OlO'OlOl σι ΐ C noo β Ή li t- H h cn | ®J § vD'^'i'OæcNOCOiO’i’OlOOOCNCOOOO'i'O-lflOlflOO o ϋ u_. SO m'tfcNicNcomcncNi^ifl^t'LnminiflcocriæinLniflLnirjc'j m jj’jj § w *3- Ό > !n co sj'vO'S'GOcNOcNiincN'a’LnocNCD'tfcocnoooc'jt^coa)'^ o L, MDNcomiDn'iOiniDcoini^t^Lnr^iflin^inroin'^Ln'a’ ιο ^ IflkOlCuJlDiXJlQvØlOlO'-OlOyjlOlOlOiOlOr^r^lOiOlOiD 10 i-l > 4-1 r-v «Ι·Η ΦΝ M 4J 4J w "rtiw ^njo^æio^iomcMiococMæon'^cMOM'O'ii'cMco cn ij S tiC? mincN'^i-Hmin^J'CNr’O^O'a’i-iiNin'i'cNioHocO'fl’io m 0) O j~iO ιΟίΟΌΌιΟιΟιΟιΟιΟιΟιΟΌ'ΛΌίΟιρί^Γ'ΐΟΌΙ^νΟιΟιΟ ιΟ ^ ·Η T3 IS +J 3 .o, njnD'incoi^coiyiO r-icMro^i'inco h cn

i. C t—I r—I r-4 r-H i—Ir-li—Ir-HojC^lCNC'ilC'iimCNijCO^J'—I +J '—i 4J 4_) JJ -P

5 g ^p'd,'>i,'a,^,^f,^,'d,'>r^i’'si,^i,,a,'ci,^,,Sje0 <u f"· qj r~- qj ωω u

H § CNCN<M(-MCNC\JCMCNrMnjCMCN(MCN<N2cn!jCN)jCMViJj^ P

CO *J <u _ <D _ <U _ <U (U 0) g .s ” fl i å i i m i i i i å é é k i i | i I ί I é I I i a

^<Uaj „„ a)„ cu„ <u_ cuaja) OJ

m>ij 0^0(010401^11010101^1101010^^11011^3(¾^¾^¾^^^ ^3

ri h u I I I I I I I I I I I I I I I I I I

o 3 ssssasssSESSasSojStuÉiuHajajaja) Q.1J κ2κο;οίαοί«κκοίθίθίοίοί_2κ^δο<!αοι!θίΐθί!ι3 §0 <H HMDQWHHHOqWHHWMMH2HO<!WO<!H^SSii ΡΉΙβ Β1ίι&ιΙχιϋι(ιιΙΐι|ϊι|ίιΙϊιΡΐι&ιϋι|ίιΡΐι.Η&ι·ιΗ&ι·Η|ίι·ι-Ι·Η·Η.Η rHi—|i—li—li—I rH r—IrHrHrHi—1 rH i—li—li—li—I · * i—l rH · * '0) tø tø '0 'di tø '0 '0 '0 '0 '0 tø '0 '0 *0 \0 NN * · '0 tø Η H 4 q i 3 q q p q q.q q qq q q q q fd id *—1 1—1 q p tø \ø h oicxoicxoiaoioicxoicxcxotcxcxa s e '« n a a p p >a>

3 P r-, ^ Oi CH P

................o< a · · ~ ~ o) 01¾¾¾¾¾^¾¾ ¾¾¾¾¾¾¾¾^^ · » titiMO) .

oooooooooooooooocara^'^PPw^'-

*—I t—I —I i—li—li—I t—I·—Ir-li—li—li—li—li—li—li—I v— tø Kl c 03 3 (U M

w oooooooooooooooOtøtøPPoiuoit-io

μ OUUOUUUOOUUUUUOOMiH+JiPESO-HH

<j1 -r-l T-i 1 ·Η ‘Η Ή -ri ·ι-| Ή ·Η *W ·Η ·Η -H *H *H O O P P td 10 tø ,3 O

tøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøMtøtøtømmtøtøntJ'trtDOo ΟιΜΜ^ΟιΟ)ΟιΟιΜΜΟιΚΟ(ΟιΜΜΡβΙμ^Μ!ΜΛβ·Η (ua)øa)(Uii)<D(i)(ua)a)(i)(i)(u<i)(Uoo-H-H tdidPoc >>>>>>>>>>>>>>>>οϋΛΛθιθιθιθα tøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøtøWtøWtø

PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP

rHi—Ir-li—Ir-li—li—li—li—IrHr—li—IrPrHrHr—Ir—I τ—I r-H i—I r—I r—Ir—Ir—li—I

000000000000 0000000000000 -ι-l -r-l -i—| -r-| -r-l -ι-l -rH -H -ri -ri -ri -r-| -r| -r| -r*| -ri -r-| -ri -r-| *r-| -rH -r-| -r-| -H -r|

H lnMMI-lM>HMHM!H|r|M}-iS-i!-i|r|i-ll-i!-ll-iMMSHh>H

0000000000000000000000000 p uauuuauuouauuuuuuuuuoucjuo

H

pg <] μ 1.11.(11,.11111111111111.

H 2 rHcNm^i’Lncor'GOtyiOi-ic'jtnii'inior^æaiOHiNn-^ir)

i-iiHi-HrHiHHi-li-li-IHCMCNCNCNCNCM

147766 14 0 ^cMOnr'CNr^ocriOiHO'aær'covoiDi-icNi^'ÆvDco co J-i 1 I -O i-* i J-> p T3 ι-in ^Ηγ-Ι^ΙΗΟ^ΟΗΟγΗ^γΗΟΟΟΟΟΟ'-ΙΗΟΟΟΟ o •H 0) C 0^ (3 60-rl p Λ (1)6-1 60 S'-'

1 C O

*.-) ··-( OCoOcflint— ^FCDi£>lOCDr-~'Ol/ir'-l£)iOu'>mmi£)i£)3|''d''d'cQ -O

rfl o μ-i moc (jioitrioicncno'icr'oicriO'cricriOioioiaioioio'OiiTiocn o-, ρ p o) cflt- H CO 1 P P „ o o CTiorocMr'iocNHocMHr'-oioouicor-'aicyicocriO'io r*· U IH Ol·^ — »*-**»····-·“·»··*··> — ·.

>1 Λ g κ (ηνο^ρ^οΜ'ΐίιη^ίιοιη'ί'ΌΐηΓΝ'-ΓίησιοοιοιΟΓ-'ΐη/ο'ί ^ ,Ρ Π] ^ Ό* 'a· ^ -^14 -ΐί· -ΐΐ· "^J* ·ΐί· ^l* *3» *3" Ό > p o> ocv0'i,ooOæHoooHvoco--t,Hn'iimincotNCNtNæ tf

Hl VOr'OOLninVOlrtlrtinCOinVOVDWP'VOin'i'd'C'Jin^i'inm lo 0)-1-1 ^ ιοιΟΌιΟΐΟ ΌΡνΟΌίΟιΟΌΐΟΌΌιοιΟΌ/'/'ΐΟΌιΟΌ ίο r-) f> -P 6-0 0) -H 0)

CO JJ JJ

H 0) α r j-i n 5*)/! cDiOr-iiocoa3r'Docj)'vrro'H'S’0)ior--Hcooio':i'iO'3,P -o* 05 o ,£ w locotor-^fiooor'oiiof'or'^'ioajioiofo^rror-ir^cj) oo Η Ή *0 vovoioiOOCOOiOPOiOl^iOlOiOior^t^tOiOI-'t-'lCO i^>

W J-) P

ognil'iOiOr'COOlOHoJ/OO'iOiO H 01

,*2 1—li—li—Ιι—Ιι—li—li—Ir-JCNJCOCOCOcaCdCM JJ CO jj r-l JJ. H 4JJJJJ JJ

j § p co p r-~ /ur-- p p p a)

Eb /Ί/Μ/ΜΟαΓΜΟίοΙΓΜΟΙΟΙΟΙΟΜΟΙΟΙ/Ν ί^σίμ/Ν )j N S-l dj dl i-i to™ 0).0) g , <0 <0 OJ 0»

SfO) ^ )4 M di Μ Μ Μ di M di dJ dJ M M J4 ouo&OdiOOO O

3 222222222222222 p< 2 p, 2 fl· 2 p. p, o, p, 7 ; S 0)0)0)0)0)0)0) S Ϊ S QiOifijCijaiPiPiaiCijCuaiaiOjAPj'OPM'di^'EOi'a'p'a'a ® i i r i i i i i i i i i i i i i ι i i s* S 222222322222222 P 2 p 2 0) 2 0)0)0) 0)

o ™ piggpiKpipiSggoJDigOiK AiKHKHKH'M'^H

srou-· HHB5HHHMHpq«WWHWW JiW^iWHWHHH H

Q1H/0 ϊχι(ί4|χιί)4ΐ)4ί/4()4()4Ρ4ΐ)4[)4Ρ4&ι()4[)4·ι-Ιί)4*Η&ιΉΙχι*ι-Ι-Γ·Ι·ι-Ι -H

1—I 1—I 1—I 1—I 1—I 1—I 1—I 1—I 1—I i—I 1—I 1—1 1—I 1—I 1—I 1—I · · * - - 4-1 ία) ία) Ό) kl1 'p <p Ό) <p 'P -*p ip '<d 'P -·ρ 'p ’p n n - . jj jj i-i p pppppOPPPDPPPPPpUjiOi-ti-IPoi'PCiii-l οιαααοιοιαοιαααοιαασοιε ε 'p 'p λ & p ^ hd

^ ^ ^ „hh P 3 /- λ oi J P

................^ a a · · ''So djMdJdJdldldidJdldJdJdididididj · - - - d d *C ~ frifciki&lCLtEilliiEilliiDjixipLiDjfcl&i&iHH · - titidlU .

--- — 'dl dl dl (I — — 6i (/] dl

dldldldjdldldldldldJdldtdldldldlPP[l.i|j|Min'-'^'k, OOOOOOOOOO0OOOOOiK01^'"-'PPtndi'-' rH I—I I—I !—| I—1 i-1 1—I r—I 1—I I-’ 1—I r*l Γ—I 1—II—li—I " (Π (Π O P P P M

OOO'OOOOOOCOOOOOOHIPPPPPPIHO ooououooououuooodidi-PJJggO rJi-i •ι-l *r-| -i-) *i-| -i-| *r-| *r| -ι-l *r-| *r| *r-| *H *r-| -ri *i*J *H O 0 P P P P P -P 0

tnppptnppmpwinppinppincnwp&'tr'po o didididididjdJdididididididi!-idiCPdldidjdi,QP*H

r ppppppppppppppppoo-i-ItjppPoc ^ >>·>>>>>>ί>>>>>>>>υϋΡο:ά|θιθιϋρ ωωιηωωωιηω-’ωιηωιηιηωΐΛΐηωωίηιηιηίηΜαίιη ρρρ-ρρρρρ-ρρρρρρρρρρρρρρρρ p

I-1 1-1 l-J 1-1 1 1 1 1 1 1 1-1 1 1 1—I 1 1 ι—I 1 1 l—l 1—1 1—I 1—1 1—1 1 1 1—1 1—I i—l I**J i—I r—I

0 0*0 0000 O'OOOOOOOOOOOOOOOO O

*H -ri *1-1 -Ι-J *H *rl -Η -H -H *H *1-1 *H *r*l -I-I *1*I *rl *rl *rl -I-I *Γ-| -Η Ή -H -H -H

dldJdldldldl dldldldldldldJdldldldldldldldldldldldl

> OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

,j υυυυυυυυυυυυυυυυουυυυυυυυ w PQ · .......................

2 i-icMn-ditncor'cocri Oi-icMroO'tncø^'CocDOi-icvinO'in

^ Λ ι—Ι r—I ι—I l—l i—( i—11—Ir-li—IrHCNJCNJCOC-JCO C-J

15 147768

Note. 1) resultaterne for nr. 1-16 i omstående Tabel IV og V blev opnået under anvendelse af forskellige stammer af Coriolus versicolor, som er deponeret under de anførte deponeringsnumre i Fermentation Research Institut e, Japan, som af den japanske patentmyndighed er udpeget som deponeringssted for mikroorganismer. Nr.

17-25 blev udført på forskellige stammer af forskellige svampearter hørende til Coriolus-slægten, hvoraf nogle er deponeret sammesteds under de anførte deponeringsnumre, medens andre ikke er deponeret.

2) Ekstraktionsudbytte i % angiver vægtforholdet mellem den tørrede ekstrakt med et vandindhold på 10% og det tørrede mycelium med et vandindhold på 10% og multipliceret med 100.

3) Selektiviteten i % angiver vægtforholdet mellem udbyttet af nitrogenholdigt polysaccharid med en middelmolekylvægt på mere end 10.000 og det tørrede ekstrakt med et vandindhold på 10% multipliceret med 100.

4) Udbytte af svampen i % angiver vægtforholdet mellem udbyttet af nitrogenholdigt polysaccharid med en middelmolekylvægt på mere end 10.000 og det tørrede svampemycelium.