CN1037903A

CN1037903A - 治疗逆病毒感染的方法

Info

Publication number: CN1037903A
Application number: CN89101876A
Authority: CN
Inventors: 皮奈尔·S·文卡塔斯瓦恩; 欧文·米利门; 巴鲁克·S·布鲁姆伯格
Original assignee: Fox Chase Cancer Center
Current assignee: Fox Chase Cancer Center
Priority date: 1988-03-29
Filing date: 1989-03-29
Publication date: 1989-12-13
Also published as: AU617068B2; DK234590A; US4937074A; AU3413389A; IL89793A; DK234590D0; EP0407452B1; DE68908701D1; WO1989009059A1; JPH03505325A; IL89793A0; EP0407452A4; EP0407452A1; ZA892308B

Abstract

通过服用phyllanthus niruri提取物治疗逆病毒感染的方法。

Description

本发明涉及逆病毒感染的治疗法。具体地说，就是通过服用具有体内逆病毒抑制活性的Phyllanthus niruri的成分来治疗这种感染。

在印度中部及南部地区，Phyllanthus niruri是一种常用草药，在印度草药学中它可用于治疗各种疾病。例如，“Doctos.K.M.Nadkarni′s lndian Materia Medica”（3rd Ed.;rivised and enlarged by A.K.Nadkarni，p.948）第一卷就指出，该植物不仅可治疗某些类型的水肿、淋病、经痛及其类似的生殖泌尿器疾病，而且可用作止泻药，利尿药，收敛药，降温以及治疗黄疸的配方。该书也提到将其茎液与油混合可用于治疗眼炎，将带根的整个植物捣碎后再与米水混合可制备出一种泥敷剂，用于治疗溃疡、疮及肿胀，将其叶子与盐混合制备的泥敷剂可用于治疗痒病及其它皮肤病。从该植物中已分离出一种叫做叶下珠苦素（Phyllanthin）的具有苦味的中性物质，它可用于治疗消化不良一类胃病。据说该植物还可用于治疗糖尿病。

在历史上，对P.niruri这一名称曾有某种混淆。例如，Muller（Argoviensis，DC.Prodr.，15（2）：406，1866）就认为P.niruri是由六个不同的变种组成。Webster（J.Arnold Arboretun，38（4）：300，1956）对Phyllanthus属作了很大改动，将P.niruri分成许多不同的种，而这些不同的种又同属于一个也叫做Phyllanthus的亚属。这些种今天已得到普遍承认。但是，印度草药学方面的医生至今仍使用P.niruri这一名称来代表Phyllanthus的一些类似的种。

在本说明书的上下文中，P.niruri是指任何一个Phyllan-thus种，它在经过下面所述的提取后产生一个由药理活性成分组成的馏分，该馏分具有内源性逆转录酶抑制活性。这些植物种连同其它种一起包括P.niruri L.，P.amarus，P.fraternus，P.asperulatus。

在1985，4，26申请的美国专利申请序列号727，452，现为4，673，575中介绍了由提取P.niruri得到的组合物，含该组合物的药物制剂和用该药物制剂治疗慢性肝炎病毒感染的方法。

现已发现在我们上述的美国专利4，673，575号中所述的P.niruri提取物能够有效地治疗逆病毒感染。乙型肝炎病毒、相关的土拔鼠肝炎病毒（WHV）及鸭肝炎病毒（DHBV）都具有类似的复制过程，在该过程的一个阶段需要内源性逆转录酶。我们在体外组织培养研究中对P.niruri提取物的各馏分抑制DHBV复制的机制进行了详细分析，结果发现该提取物是一种逆转录酶的强制抑制剂。因此，它能够有效地抵抗逆病毒，因为这种病毒的复制依赖于逆转录，就是由于这些发现以及后来的研究而导致了本发明。

因此，本发明提供了一种治疗逆病毒感染的方法，即给病人服用抑制逆病毒生长的有效剂量的一种药剂，该药剂的活性成分是具有内源性逆转录酶抑制活性的P.niruri成分。该活性成分可利用常规提取技术回收，也可通过对该植物进行甲醇提取及水提取而被分离。

在此，术语“逆病毒”是指其遗传物质是RNA而非DNA的一类脊椎动物病毒。这类病毒具有一种已知为“逆转录酶”的聚合酶，它能够催化病毒RNA转录为双链DNA。产生的DNA可能以潜伏状态在被感染的细胞保留一个不定的时期，也可插入到细胞基因组中，从而有效地引起新病毒体的形成。逆病毒可能是致癌的。

在逆转录酶的控制下由RNA模板合成互补DNA与病毒复制的通常机制刚好相反，通常是从DNA转录出RNA拷贝。因此将这种酶名命为逆转录酶。

利用本发明的方法可以治疗的各种病毒包括罗氏肉瘤病毒、Moloney氏鼠白血病病毒、人T细胞白血病病毒（HTLV Ⅰ和HTLV Ⅱ）以及人免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ和HIV-Ⅱ），最后的这种病毒是获得免疫缺陷综合症（AIDS）的病因。但本发明能够治疗的病毒不仅限于这些。

虽然人们正作出共同努力，以求获得对于逆病毒感染尤其是艾滋病的有效药物疗治，但至今进展很小。一些已知有效的选择药物如叠氮胸苷（AZT）和foscarnet（膦酰甲酸三钠）具有许多患者难以忍受的毒副作用。与此相反，用上述P.niruri提取物进行的抗逆病毒感染试验表明，该提取物能够有效地延长被感染动物的存活时间，而无证据表明它对所治疗的动物或组织培养的人淋巴细胞有毒性。

参照附图，附图1显示了用蒸馏水对Sephaotex G-10柱进行洗脱而得到的P.niruri（整个植物）水提物洗脱分布图（吸收波长为280nm），它用实线代表。虚线表示由G-10柱的每一馏分产生的WHV-DNA聚合酶抑制百分数;

图2是通过对得自Sephadex G-10（如图所示）对WHV-DNA聚合酶具有最大抑制活性的馏分对鸭肝炎病毒（DHBV）-DNA聚合酶抑制作用进行分析而得到放射自显影图;

图3表示了体外测得的罗氏肉瘤病毒的抑制百分数（纵座标）与P.niruri提取物的浓度（μg/ml）（横座标）的函数关系;

图4表示了体外测得的Moloney鼠白血病病毒的抑制百分数（纵座标）与P.niruri提取物的浓度（μ/）的关系。

按照我们的美国专利4，673，575号所述的方法可得到具有抗逆病毒活性的提取物。该专利所公开的整个内容均加到本发明中以作参考。按照其中所述的提取方法，将干燥的、粉末状的植物材料（最好得自整个植物，即茎、叶和根）用己烷提取，将己烷提取物与其残渣分离。浓缩己烷提取物以促进可结晶成分的结晶。从上清液中分离出已结晶的产物后用层析法分离上清液中的可溶性部分。己烷提取物的残渣用苯提取，分离苯提取物及其残渣，然后用层析法分离提取物的可溶性部分。

苯提取后的残渣再用甲醇提取，从其残渣中分离出甲醇提取物。按与己烷提取物相同的废水处理甲醇提取物，产生结晶的产物及馏分，然后通过层析将它们从上清液中分离。甲醇提取后的残渣进行水提，分离水提物。甲醇提取物显示了明显的HBV-DNA聚合酶抑制活性。根据需要，也可以利用新鲜植物材料制备P.niruri提取物。

或者采用层析技术对整个植物的水提物进行分级分离。例如，用Sephadex G-10柱对P.niruri（整个植物）的水提物进行分级分离。这种分级分离的结果示于图1。连续实线代表水提物的洗脱分布图。虚线代表由各馏分产生的对土拔鼠肝炎病毒WHVDNA聚合酶抑制百分数。从图1可见，在39（其分子量大于1，000道尔顿）、45（分子量大约为700道尔顿）以及61（分子量大约为350道尔顿）等馏分其DNA聚合酶抑制活性最大。

图2为一放射自显影图，显示了从Sephadex G-10柱获得的39、45、53和61等馏分以及未被分级分离的整个植物提取物对鸭肝炎病毒（DHBV）DNA聚合酶的抑制作用。该图表明61馏分相对具有最大的DNA聚合酶抑制活性，这可从3.02kb带处的稀薄看出，它代表DHBV DNA。

通过色谱分离P.niruri水提物回收的馏分可采用本领域技术人员熟悉的那些步骤，如高压液相色谱，进一步提纯。

虽然对于所观察的抗逆病毒活性的机理还不能阐明，但确信是P.niruri提取液中存在的活性剂通过抑制逆转录酶而抑制了逆病毒的复制。

含具有抗逆病毒活性的P.niruri馏分的药物制剂可与生物用介质如水，缓冲盐水，多元醇（如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等）或它们的适宜混合物按常规组配用于给药。在选择的介质中活性成分的浓度从约15mg/ml到约50mg/ml。这里的“生物用介质”包括任何和所有溶剂，分散介质等，这些介质应适于药物制剂所需要的给药途径。任何常规介质或试剂应与P.niruri的活性成分相容，这样它们就可用于药物制剂。

如必需或需要，也可将补充的活性成分，如其它抗病毒药或免疫调节剂或二者一起加入到药物制剂中。这些补充的活性成分包括叠氮胸苷（AZT），foscarnet，trimetrexate，2′，3′-二脱氧胞苷（DDC），ganciclovir，α-干扰素，白细胞介素-2，ampli-gen，异丙肌苷等。

最好以剂量单位形式组配药物制剂以便给药简便和剂量统一。这里使用的剂量单位形式指的是适于患者治疗的药物制剂的物理分散单位。每种剂量应含有经计算的与所选择药物载体结合的活性成分量以便产生所需要的治疗效果。

测定用于抑制或压制逆病毒感染患者的适宜剂量单位的步骤对于本领域技术人员是已知的。

通常逆病毒感染患者所服的剂量为每天每公斤体重给含活性成分P.niruri提取液5至20mg的剂量。该剂量范围对于人体所产生的所需抗逆病毒作用是令人满意的，这可通过病毒滴度的明显降低表明。

药物制剂最好以剂量单位形式非肠道给药，如静脉或腹膜内给药。其它给药形式也是有效的，如口服。

药物制剂可按适宜的时间间隔给药，如一天一次直到病毒滴度降低（大约2个数量级），然后把剂量降低到保持一星期给药一次水平。在具体情况中，适宜的时间间隔通常取决于患者的情况。这里使用的术语“患者”包括人和动物。

当然在给患者服药前，可将甲醇从活性成分中除去。常规采用的方法是真空蒸除甲醇，然后把无甲醇的残余物重溶于生物介质中，如PBS。

下面给出的实例是为了更详细说明本发明。这些实例是为了说明，并不意味着限制本发明。

实例1

用P.niruri水提物在体外抑制罗氏肉瘤病毒逆转录酶

P.niruri提取液（馏分61，见图1和2）对罗氏肉瘤病毒（RSV）的逆转录酶抑制作用是通过下面的分析步骤测定的，即将放射性同位素标记的核苷酸（³H-dTTP）插入到TCA-可沉淀的DNA中以测量逆转录酶活性。

含RSV逆转录酶活性的组织培养液用50m M Tris-Hcl1，PH8.3稀释10倍，然后取20μl稀释的培养液用作酶源，往其中加入20μl P.niruri提取物，接着加入由Tris-Hcl（50mM），KCl（80m M），Mg Cl₂（6m M），DTT（100m M），dATP，dGTP，dCTP（每种2mM），dTTP（60mci/mmole;20mM），TriX100（0.5% 20μl）和寡聚（rA）n（dT）₁₀（0.5μg/10μl）组成的100μl混合物。样品在37℃培养30分钟。加入2.5ml 5%TCA（含2%焦磷酸盐）终止反应。然后将40μl 2.5%BSA和100μl 0.5%牛胸腺DNA加入作为载体，混合物通过玻璃纤维滤纸（Whatman）过滤。滤液用含焦磷酸盐的5%TCA洗三次，然后用95%乙醇洗三次，在热灯下干燥，用闪烁计数器测定保留在滤纸上的放性性同位素活性。用含Tris-Hel PH8.3的分析管代替含逆转录酶活性的培养液用作酶反应的对照，该分析管仅不加提取物以用作抑制剂的对照。

P.niruri（P.amarus）水提取物对RSV RT的抑制作用见图3。由图3可看到抑制作用的增加与提取物浓度增加到60μg/ml这一段呈线性关系，在该点抑制率达到超过80%。

实例2

P.niruri水提取液在体外对Moloney氏鼠白血病病毒逆转录酶的抑制作用

用实例1所述同样分析方法测定P.niruri提取液（馏分61;见图1和2）对Moloney氏鼠白血病病毒（Mo MLV）RT的抑制作用。Mo MLV需要的金属离子是锰。因此在分析中用Mn Cl₂（或一价）代替MgCl₂。

P.niruri提取液对MOMLV RT的抑制作用见图4。

由图4可见MOMLV RT比RSV RT对提取液更敏感。抑制作用与提取液浓度达到6μ/ml这一段内呈线性关系，在该点抑制率超过80%。

实例3

P.niruri水提物在体外对人体免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制作用

用聚乙烯甘油浓缩的HIV（HTLV-Ⅲ）的Triton X100活化的溶胞产物来测定对HIV逆转录酶活性的抑制作用。分析步骤与对RSV RT和Mo MLV RT的分析步骤相同。P.niruri（P.amarus）提取液对HIV RT的抑制率见下面给出的表1。

表1

Phyllanthus提取液浓度 CPM RT活性抑制率%

0（对照） 57，900 -

0.5μg/ml 49，940 14

5.0μg/ml 51，270 11

50.0μg/ml 23，885 59

500.0μg/ml 2，570 96

实例4

在感染分析中的抗HIV活性

用HIV感染CEM细胞株（ATCC CCL119）的培养液来制备HIV。该细胞株见18 Cancer 522（1965）中所述;也可见：19 Cancer 1725（1966）和40Exp.Cell Res.197（1965）。该培养液通过低速离心（900 Xg）变为澄清的细胞，然后用0.45μ滤器过滤，在P.niruri（P.amarus）提取液以50μg/ml和500μg/ml浓度存在下，将该过滤的细胞液用来感染C3淋巴细胞培养液。预先测定表明提取液在这些浓度下对这些细胞是没毒性的。由Sephadex G-10得到的馏分61以30μg/ml浓度检测其对HIV感染的C3淋巴细胞的作用。C3淋巴细胞靶细胞在病毒和抑制剂存在下培养24小时。然后将抑制剂和未吸收的病毒通过用新鲜介质取代旧介质并培养该培养液而除去。通过间接免疫荧光法检测感染。分析结果见下面表2。

表2

在HIV感染分析中P.niruri提取液的作用

抑制剂浓度 IIF＊阳性细胞%

3天 5天 8天 10天

无 - 100 - - -

P.niruri提取液 500μg/ml 0 0 0 ＜1

P.niruri提取液 50μg/ml ＜1 ＜1 1 30

P.niruri提取液 30μg/ml 0 0 0 0

Sephadex

G10馏分61

＊ⅡF＝间接免疫荧光法

实例5

P.niruri水提物在体内对病毒Mo MLV的抑制作用

选6窝Long-Evans鼠作实验并在出生24小时内给它们腹膜内注射0.2ml含5×10⁵个斑形成单位的Moloney氏鼠白血病病毒。

出生五天后，将每窝鼠分成治疗组和对照组。如果每窝的鼠数为奇数的话，将该多龅氖匝槭蠓旁谥瘟谱橹小Ｖ瘟剖笤谒堑奈?部都切去一小部分（不超过1/2），以便在每窝中将治疗鼠与对照鼠区分开。

治疗组和对照组中的试验鼠每星期称重两次。

每星期腹膜内给对照鼠0.1ml 0.02MKPO₄缓冲盐水（PH7.4）两次。每星期腹膜内给治疗组的试验鼠0.1ml稀释1-8倍的P.niruri（18mg/ml溶液）稀释液两次，给一星期。第二星期，给治疗组中的鼠注射稀释1-4倍的P.niruri作为它们的第二次剂量。由于在新生试验鼠中涉及到毒性问题，因此剂量要有所变化。一旦没有观察到毒性，剂量就可以增加。到第三星期，给治疗组中鼠每星期注射两次没稀释的P.niruri。

将试验鼠与其母鼠放在一起，并对治疗组和对照组中的鼠继续每星期称重两次和注射两次，直到它们长到6星期。到这时，根据性别和同窝将试验鼠脚捆住以便鉴定和分离。雄性鼠每只笼子放两只，雌性鼠每只笼子不超过4只。继续每星期注射两次，但体重每星期只量一次，记录每只鼠的体重。

待整个研究过程完成后，每天检查试验鼠。任何死亡的鼠经检验标上肿瘤记号。到第28星期，60只试验鼠中有31只仍活性，其中19只是治疗组中的，12只是对照组中的。

30星期后，还有13只活的试验鼠，其中11只是治疗组中的。只有两只是对照组中的。

治疗鼠平均寿命比未治疗鼠的长，这表明P.niruri提取液（P＝0.02）有明显的治疗效果（P＝0.02）。

本发明一些优选的具体实例上面已介绍了，它并不意味着本发明限于这些具体实例，但在不背离本发明的范围和精神，即下面所述的权利要求下，也可此做各种改动。

Claims

1、一种对逆病毒感染患者进行治疗的方法，它包括给该患者服用能够有效抑制该逆病毒感染性的剂量的一种药剂，其有效成分是具有内源性逆转录酶抑制活性的phyllanthus niruri的一个成分。

2、如权利要求1所述方法，其中该药剂是按约5-20mg该活性成分/kg患者体重/天的剂量服用。

3、如权利要求1所述的方法，其中该药剂是与可接受的生物学介质结合服用。

4、如权利要求3所述的方法，其中该药剂是以约15-50mg该活性成分/毫升介质的浓度与可接受的生物学介质结合服用。

5、如权利要求1所述的方法，其中该药剂是通过非肠道给药。

6、如权利要求5所述的方法，其中该药剂是通过静脉给药。

7、如权利要求5所述的方法，其中该药剂是通过腹膜内给药。

8、如权利要求1所述的方法，其中该药剂可口服。

9、如权利要求1所述的方法，其中所说逆病毒选自罗氏肉瘤病毒、Moloney氏鼠白血病病毒及人免疫缺陷病毒。

10、如权利要求1所述的方法，其中所说的药剂是与一种补充的抗病毒剂或免疫调节剂结合服用，或者是将三种药剂结合服用。

11、通过给被人免疫缺陷病毒感染的患者服用能够有效抑制该病毒感染的剂量的一种药剂从而延长患者生存的方法，该药剂的有效成分是phyllanthus niruri的一种成分，它可通过甲醇或水提取而获茫揖哂心谠葱阅孀济敢种苹钚浴?

12、如权利要求11所述的方法，其中所说的药剂是以含约5-20mg所说活性成分/kg患者体重/天的剂量服用。

13、如权利要求11所述的方法，其中所说的药剂是与一种补充的抗病毒剂或免疫调节剂结合服用，或者是将这三种药剂结合服用。

14、将具有内源性逆转录酶抑制活性的phyllanthus niruri成分用于制造治疗逆病毒感染的药剂。

15、如权利要求14所述的用途，其特征在于该药剂给治疗的每公斤体重患者服含上述成份约5-20mg的剂量单位。

16、如权利要求14或15所述的用途，其特征在于该药剂的活性成分存在于一种可接受的生物学介质中。

17、如权利要求16所述的用途，其特征在于该成分是以15～50mg/ml的浓度存在于所说介质中。

18、如权利要求16或17所述的用途，其特征在于该药剂适用于非肠道给药。

19、如权利要求16或17所述的用途，其特征在于该药剂适用静脉给药。

20、如权利要求16或17给药的用途，其特征在于该药剂适用于腹膜内给药。

21、如权利要求16或17所述的用途，其特征在于该药剂适用于口服。

22、如权利要求14～21中任一项所述的用途，其特征在于该药剂包括一种补加的抗病毒剂，免疫调节剂或这两种药剂的结合。

23、利用phyllanthus niruri的具有内源性逆转录酶抑制活性且可被甲醇或水提取的成分制备一种药剂，以用于治疗人免疫缺陷病毒（HIV）。

24、如权利要求10所述的用途，其特征在于该药剂是给治疗的每公斤体重患者服含约5-20mg所述甲醇或水提取成分的剂量单位。

25、如权利要求23或24所述的用途，其特征在于该药剂包括一种补充的抗病毒剂，免疫调节剂，或二者的结合物。