CN113151389B - 一种人参糖肽及制备方法和医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人参糖肽及制备方法和医药用途，属于医药领域。以人参为原料，经过煎煮法提取、乙醇沉淀法分离、双酶酶解法水解、透析、冷冻干燥等步骤获得人参糖肽，其产率14％以上，纯度90％以上。本发明进行了动物模型实验，结果表明人参糖肽能够增强免疫低下小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核‑巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性。本发明的人参糖肽制备方法新颖，产率和纯度较高，适于工业化生产，同时作为药物活性成分，有望开发为用于预防和治疗免疫力低下疾病以的新型药物以及肿瘤、癌症等引起免疫力低下疾病的辅助药物，为免疫力低下疾病的预防和治疗提供临床指导与用药依据，进而减轻患者痛苦，改善患者生活质量。

Description

一种人参糖肽及制备方法和医药用途
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及人参糖肽及制备方法和医药用途。
背景技术
人参为五加科植物人参(panax ginseng C.A.Mey.)的干燥根和根茎，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智的功效。人参发挥多重药理作用的物质基础主要有皂苷、多糖、多肽、糖肽、蛋白质、挥发油等成分。近年来，肽类成分以其独特的生物活性和极高的生物利用度受到国内外学者的广泛关注，随着提取分离技术以及分析技术的提高，具有较好生物活性的人参糖肽类成分逐渐走进人们视野，逐渐应用到药品、食品、保健食品及化妆品等领域。人参糖肽是一类非皂苷类水溶性大分子化合物的混合物，同时具备糖类和肽类的双重特性。
至今，有关人参糖肽制备方法的研究较少。经文献检索，罗浩铭等(吉林大学学报(医学版)2016 42(03)439-445页)，采用醇提水沉法结合透析法以80％乙醇回流提取，除去人参中的大多数皂苷类成分，药渣再加水煎煮获得水溶性成分，过滤煎煮液合并滤液，浓缩到适当的体积后超滤(截留相对分子质量10000Da)，取分离液，浓缩，冻干，从而获得人参糖肽，其收率为相对于原药材的7％。而后，其采用先煎煮后过D101大孔吸附树脂洗脱、超滤、透析法得到人参糖蛋白，收率为人参药材的0.45％(中国老年学杂志2016 36(24)6077-6080页)；杨明等(中国专利CN1931874 2007-03-21)采用50％乙醇回流提取法结合分级沉淀法用4～6倍量的95％乙醇静置得沉淀，水溶后过滤再活性炭脱色纯化，得到人参糖肽；王颖等(林产化学与工业2013 33(02)37-40页)通过将人参水提液直接透析制备人参糖肽，在此条件下得到的总糖肽纯度为79.26％；南敏伦等(中国实验方剂学杂志2015 21(03)51-54页)采用50％乙醇回流提取，95％乙醇沉淀，过滤，活性炭脱色的方法制备人参糖肽。以上制备方法，主要采用低浓度乙醇提取法，高浓度乙醇沉淀分离，过滤和活性炭纯化，且提取率较低，约为0.45％～7％。
经文献检索，有关人参糖肽生物活性的报道主要有降血糖、降血脂、降胆固醇、增强记忆力、保护神经细胞、抗炎镇痛等方面。
发明内容
本发明提供一种人参糖肽及制备方法和医药用途，目的是提供人参有效部位人参糖肽及其药物用途。
本发明采取的技术方案是，是由下列步骤得到的：
(1)提取：取干燥生晒参，粉碎后过20目筛，加入14～20倍量的蒸馏水于100℃煎煮提取2～4次，每次1～3小时，过滤，合并滤液，浓缩，得人参水提取物浓缩液；
(2)分离：向人参水提取物浓缩液中加入高浓度乙醇，边加边搅拌，达到所需醇浓度后，静置24～48小时，过滤，得滤液和沉淀两部分，滤液部分，减压回收乙醇溶液得人参总皂苷粗提物；沉淀部分即为人参糖蛋白粗提物；
(3)酶解：取人参糖蛋白粗提物加入蒸馏水溶解，采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶酶解，酶解液离心，取上清液，干燥，得人参糖肽粗提物；
(4)纯化：取人参糖肽粗提物加水复溶，滤去水不溶性成分，使用截留分子量为1kDa透析袋透析除去单糖和无机盐等小分子化合物，收集透析内液，干燥，得人参糖肽。
本发明所述步骤(1)人参水提取物浓缩液的溶液比重为1.04～1.06。
本发明所述步骤(2)所需醇浓度为70％～75％。
本发明所述步骤(3)酶解条件包括：底物浓度为10％～15％，双酶比例为1:1，加酶量为1％～5％，酶解液pH为6，酶解温度50℃，酶解时间4～6小时，而后90℃灭活10分钟。
本发明所述步骤(3)和(4)干燥方法为冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明所述人参糖肽在制备提高免疫力药物中的应用。
本发明用于制备提高免疫力药物时,其口服或非口服给药均是安全的。在口服情况下,其可以是任何常规形式给药,如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、漂浮剂、口服液、悬浮液、糖浆、口腔含片、喷雾剂或气雾剂等当该药物非口服给药时,可采用任何常规形式,如栓剂、注射剂静脉注射、肌肉注射、软膏剂、吸入剂等。
本发明制备提高免疫力药物时，是与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体赋形剂在本领域是众所周知的,下面举几个具体例子,固体制剂的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氯化镁、硬脂酸镁,碳酸氢钠、干燥酵母等液体制剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等软膏剂的赋形剂可以使用脂油,含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。
本发明所制得的人参糖肽采用水提取，更有利于水溶性糖肽成分的溶出，最终提取率可达14％以上，大大提高了产率，节省了生产成本；采用双酶酶解糖蛋白获得更纯粹的糖肽，并用透析法纯化，获得的糖肽纯度高于90％，与文献报道的非酶解方法有其本质差异。
本发明所述的人参糖肽能够增强免疫活性验证试验，采用环磷酰胺致免疫力低下动物模型，以不同剂量人参糖肽进行干预治疗。实验结果显示人参糖肽能够增强免疫低下小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性，从而提高其免疫功能。
本发明的有益效果在于，人参糖肽可用于制备提高免疫力药物，具有疗效显著的特点。有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变，口服量为0.25～0.5g/次，每日二次；注射0.25～0.5g/次，每日一次。
附图说明
图1是人参糖肽对免疫低下小鼠外周血白细胞总数的影响图，数据以
Figure BDA0003036589360000034
表示，经单因素方差分析(ANOVA)检验，与正常对照组比较#p<0.05、##p<0.01；与模型组比较*p<0.05、**p<0.01；
图2是人参糖肽对迟发型变态反应模型免疫低下小鼠耳肿胀的影响图，数据以
Figure BDA0003036589360000033
表示，经单因素方差分析(ANOVA)检验，与正常对照组比较#p<0.05、##p<0.01；与模型组比较*p<0.05、**p<0.01；
图3是人参糖肽对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力的影响图，数据以
Figure BDA0003036589360000032
表示，经单因素方差分析(ANOVA)检验，与正常对照组比较#p<0.05、##p<0.01；与模型组比较*p<0.05、**p<0.01；
图4是人参糖肽对免疫低下小鼠NK细胞活性的影响图，数据以
Figure BDA0003036589360000031
表示。经单因素方差分析(ANOVA)检验，与正常对照组比较#p<0.05、##p<0.01；与模型组比较*p<0.05、**p<0.01。
具体实施方式
实施例1
提取：取干燥生晒参，粉碎后过20目筛，加入14倍量的蒸馏水于100℃煎煮提取2次，每次3小时，过滤，合并滤液，浓缩至溶液比重为1.04，得人参水提取物浓缩液；
分离：向人参水提取物浓缩液中加入高浓度乙醇，边加边搅拌，待溶液醇浓度到70％后停止搅拌，静置48小时，过滤，得滤液和沉淀两部分，滤液部分，减压回收乙醇溶液得人参总皂苷粗提物；沉淀部分即为人参糖蛋白粗提物；
酶解：取人参糖蛋白粗提物加入蒸馏水使底物浓度为10％，按1:1加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶使加酶量为5％，用1mol/LNaOH调节pH6，置50℃水浴锅水浴5小时，90℃灭酶活性10分钟，酶解液离心，取上清液，冷冻干燥，得人参糖肽粗提物；
纯化：取人参糖肽粗提物加水复溶，滤去水不溶性成分，使用截留分子量为1kDa透析袋透析除去单糖和无机盐等小分子化合物，收集透析内液，冷冻干燥，得人参糖肽。
通过该方法制备的人参糖肽收率>14％，纯度>90％。
实施例2
提取：取干燥生晒参，粉碎后过20目筛，加入16倍量的蒸馏水于100℃煎煮提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，浓缩至溶液比重为1.06，得人参水提取物浓缩液；
分离：向人参水提取物浓缩液中加入高浓度乙醇，边加边搅拌，待溶液醇浓度到75％后停止搅拌，静置24小时，过滤，得滤液和沉淀两部分，滤液部分，减压回收乙醇溶液得人参总皂苷粗提物；沉淀部分即为人参糖蛋白粗提物；
酶解：取人参糖蛋白粗提物加入蒸馏水使底物浓度为13％，按1:1加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶使加酶量为1％，用1mol/LNaOH调节pH至pH6，置50℃水浴锅水浴4小时，90℃灭酶活性10分钟，酶解液离心，取上清液，喷雾干燥，得人参糖肽粗提物；
纯化：取人参糖肽粗提物加水复溶，滤去水不溶性成分，使用截留分子量为1kDa透析袋透析除去单糖和无机盐等小分子化合物，收集透析内液，喷雾干燥，得人参糖肽。
通过该方法制备的人参糖肽收率>14％，纯度>90％。
实施例3
提取：取干燥生晒参，粉碎后过20目筛，加入20倍量的蒸馏水于100℃煎煮提取4次，每次2小时，过滤，合并滤液，浓缩至溶液比重为1.05，得人参水提取物浓缩液；
分离：向人参水提取物浓缩液中加入高浓度乙醇，边加边搅拌，待溶液醇浓度到72％后停止搅拌，静置36小时，过滤，得滤液和沉淀两部分，滤液部分，减压回收乙醇溶液得人参总皂苷粗提物；沉淀部分即为人参糖蛋白粗提物；
酶解：取人参糖蛋白粗提物加入蒸馏水使底物浓度为15％，按1:1加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶使加酶量为2％，用1mol/L NaOH调节pH至pH6，置50℃水浴锅水浴6小时，90℃灭酶活性10分钟，酶解液离心，取上清液，喷雾干燥，得人参糖肽粗提物；
纯化：取人参糖肽粗提物加水复溶，滤去水不溶性成分，使用截留分子量为1kDa透析袋透析除去单糖和无机盐等小分子化合物，收集透析内液，喷雾干燥，得人参糖肽。
通过该方法制备的人参糖肽收率>14％，纯度>90％。
本发明人参糖肽在制备提高免疫力药物中的应用。
下边通过试验例来进一步说明本发明效果。
试验例1
通过单因素实验设计，分别考察提取时间(1、2、3、4、5h)、提取次数(1、2、3、4、5次)、料液比(8∶1、14∶1、20∶1、26∶1、32∶1)、醇沉浓度(50％、60％、70％、80％、90％)、溶液比重(1.0、1.02、1.04、1.06、1.08、1.1、1.2、1.3)对人参糖蛋白中多糖和蛋白质含量的影响。在单因素实验的基础上，通过响应面设计，以提取时间、提取次数、料液比、醇沉浓度四个因素为自变量，应用Design-Expert 8.0.6软件进行4因素3水平的Box-Behnken响应面分析实验设计，平行实验3次，考察人参糖蛋白中多糖和蛋白质含量。
通过此实验确定人参糖蛋白的提取分离工艺参数为：提取时间1～3h、提取次数2～4次、料液比为1:(14～20)(g:mL)、醇沉浓度70～75％，溶液比重为1.04～1.06，此条件下，人参糖蛋白的提取率可大于20％，纯度大于80％。
采用单因素结合正交的方法，以人参糖肽提取率和其中多糖与蛋白质含量为指标，考察添加酶的种类和比例、酶解pH值、酶解时间、酶解温度、底物浓度。
通过此实验，筛选出酶解条件为：底物浓度为10％～15％，双酶比例为1:1，加酶量为1％～5％，酶解液pH为6，酶解温度50℃，酶解时间4～6小时，而后90℃灭活10分钟。此条件下，人参糖肽的提取率可大于14％(按原药材投料计算)，纯度大于90％。
试验例2：人参糖肽对免疫低下小鼠外周血白细胞总数的影响
采用对BALB/c小鼠注射环磷酰胺致免疫低下模型。将适应性饲养一周的60只BALB/c雌性小鼠，随机分为6组(n＝10)，分别为：正常对照组、阳性药香菇菌多糖片组(20mg/kg)、模型组、人参糖肽低、中、高剂量组(70mg/kg；140mg/kg；210mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积蒸馏水，阳性药和人参糖肽各剂量组分别灌胃给予相应药物，每日一次，连续给药30天。在开始给药的第21天后模型组以50mg/kg的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。实验结束后，以摘除小鼠眼球的方法采集全血，24小时内以全血细胞分析仪检测白细胞总数。
结果：如图1所示，模型组白细胞计数明显低于正常对照组(p<0.01)。与模型组相比，人参糖肽复合物3个剂量组的小鼠外周血白细胞数均显著或极显著提高(p<0.05，p<0.01)。
结论：环磷酰胺可使小鼠的白细胞计数显著降低，使小鼠免疫功能下降。人参糖肽能够能促进环磷酰胺引起的免疫抑制小鼠白细胞的形成，提高机体免疫力作用，且具有剂量依赖性。
试验例3：人参糖肽对迟发型变态反应模型免疫低下小鼠耳肿胀的影响
60只BALB/c雌性小鼠，随机分为6组(n＝10)，分别为：正常对照组、阳性药香菇菌多糖片组(20mg/kg)、模型组、人参糖肽低、中、高剂量组(70mg/kg；140mg/kg；210mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积蒸馏水，阳性药和人参糖肽各剂量组分别灌胃给予相应药物，每日一次，连续给药30天。在开始给药的第21天后模型组以50mg/kg的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。变态反应造模方法：于试验结束前6天，用脱毛膏将每只小鼠腹部皮肤脱毛约2cm×2cm，用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏，5天后用DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳耳廓两面进行攻击，放回笼子，24小时后，颈椎脱臼法处死小鼠，用打孔器(8mm)在小鼠左右两耳同一部位打下耳片并称重，以左右耳片差作为肿胀度。
结果：根据迟发型变态反应(DTH)耳肿胀试验的结果(图2)，模型组与正常对照组相比，模型组DTH程度极显著降低(p<0.01)。与模型组相比，人参糖肽3个剂量组的小鼠DTH程度均显著或极显著增加(p<0.05，p<0.01)，且呈一定的剂量依赖性。
结论：人参糖肽能够在一定程度上改善环磷酰胺对DTH反应的抑制作用，增强环磷酰胺处理的小鼠细胞介导的免疫功能。
试验例4：人参糖肽对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬能力的影响
60只BALB/c雌性小鼠，随机分为6组(n＝10)，分别为：正常对照组、阳性药香菇菌多糖片组(20mg/kg)、模型组、人参糖肽低、中、高剂量组(70mg/kg；140mg/kg；210mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积蒸馏水，阳性药和人参糖肽各剂量组分别灌胃给予相应药物，每日一次，连续给药30天。在开始给药的第21天后模型组以50mg/kg的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。试验结束后，称量小鼠体重，从小鼠尾静脉，以0.1mL/10g的注射量注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁。注入墨汁后，立刻计时，在2分钟和l0分钟分别从内眦静脉丛取血20μL，立即加至2mL Na2CO3溶液中，在酶标仪600nm波长处测吸光度，以Na2CO3溶液为空白对照。用颈椎脱臼法处死小鼠，取肝脏、脾脏和胸腺，用滤纸吸干脏器表面血污，称量。一般以校正的吞噬指数a表示小鼠碳廓清能力。
Figure BDA0003036589360000061
Figure BDA0003036589360000062
式中：a，吞噬指数；K，廓清指数；A1，2分钟的吸光度；A2，10分钟的吸光度；t1＝2，分钟；t2＝10，分钟。
结果：从图3可以看出，与正常对照组相比，模型组免疫抑制小鼠碳廓清吞噬指数显著降低(p<0.05)。与模型组相比，人参糖肽3个剂量组的小鼠碳廓清的吞噬指数均显著或极显著提高(p<0.05，p<0.01)，且随着给药剂量的增大吞噬指数呈现一定的剂量依赖性。
结论：人参糖肽能够一定程度上增强小鼠单核-巨噬细胞功能，提高小鼠的非特异性免疫应答水平，且人参糖肽的吞噬能力与其剂量有关，高剂量的人参糖肽对改善巨噬细胞吞噬功能的作用更好。
试验例5：人参糖肽对免疫低下小鼠NK细胞活性的影响
60只BALB/c雌性小鼠，随机分为6组(n＝10)，分别为：正常对照组、阳性药香菇菌多糖片组(20mg/kg)、模型组、人参糖肽低、中、高剂量组(70mg/kg；140mg/kg；210mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积蒸馏水，阳性药和人参糖肽各剂量组分别灌胃给予相应药物，每日一次，连续给药30天。在开始给药的第21天后模型组以50mg/kg的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。实验前24小时将新鲜的且存活率应大于95％的靶细胞(YAC-1细胞)进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RpMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。将每只小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank's液洗2次，1000rpm离心10分钟弃上清。细胞沉淀加入红细胞裂解液，再加入Hank's液，1000rpm离心10分钟，用1mL含10％小牛血清的RpMI1640完全培养液重悬，最后用RpMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μL；上述各项均设3个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，然后将96孔培养板1500rpm离心5分钟，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3分钟，每孔加入30μL 1mol/L的HCL，在酶标仪490nm处测定吸光度。NK细胞活性计算公式如下：
Figure BDA0003036589360000071
结果：如图4所示，与正常对照组相比，模型组NK细胞活性极显著降低(p<0.01)。与模型组相比，人参糖肽低剂量组无显着性差异(p>0.05)，中、高剂量组的小鼠NK细胞活性均极显著增加(p<0.01)，且呈一定的剂量依赖性。
结论：人参糖肽能够在一定程度上增加NK细胞的活力，且效果与临床常用免疫促进剂药香菇菌多糖相似。因此，人参糖肽可能通过促进环磷酰胺诱导免疫低下小鼠体内NK细胞活性来调节免疫反应。
试验例6：人参糖肽对免疫低下小鼠体重及脏器指数的影响
采用对BALB/c小鼠注射环磷酰胺致免疫低下模型。将适应性饲养一周的60只BALB/c雌性小鼠，随机分为6组(n＝10)，分别为：正常对照组、阳性药香菇菌多糖片组(20mg/kg)、模型组、人参糖肽低、中、高剂量组(70mg/kg；140mg/kg；210mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积蒸馏水，阳性药和人参糖肽各剂量组分别灌胃给予相应药物，每日一次，连续给药30天。在开始给药的第21天后模型组以50mg/kg的剂量隔天腹腔注射环磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。实验结束后，称取小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏和胸腺分别称重，计算脏器指数。
结果：如表1所示，灌胃给予不同剂量的人参糖肽30天，与正常对照组相比体重无显著降低，且实际操作中无小鼠死亡现象，表明人参糖肽不会对小鼠产生毒性作用；与正常对照组相比，模型组脾脏和胸腺指数均有显著或极显著下降(p<0.05，p<0.01)；给药组与模型组相比，免疫器官指数均有明显的提高(p<0.05，p<0.01)。
表1小鼠体重及免疫器官指数实验结果(
Figure BDA0003036589360000081
n＝10)
Figure BDA0003036589360000082
注：脏器指数：脏器重/体重。数据以
Figure BDA0003036589360000083
表示。经单因素方差分析(ANOVA)检验，与正常对照组比较#p<0.05、##p<0.01；与模型组比较*p<0.05、**p<0.01。
结论：人参糖肽能够在一定程度上逆转环磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指数的下降，可逆转环磷酰胺诱导的免疫器官萎缩，提示人参糖肽对两大免疫器官具有保护作用。

Claims (5)

1.一种人参糖肽制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）提取：取干燥生晒参，粉碎后过20目筛，加入14~20倍量的蒸馏水于100℃煎煮提取2~4次，每次1~3小时，过滤，合并滤液，得人参水提取物浓缩液；
（2）分离：向人参水提取物浓缩液中加入乙醇，边加边搅拌，达到所需醇浓度后，停止搅拌，静置24~48小时，过滤，得滤液和沉淀两部分，滤液部分，减压回收乙醇溶液得人参总皂苷粗提物；沉淀部分即为人参糖蛋白粗提物；
（3）酶解：取人参糖蛋白粗提物加入蒸馏水溶解，采用风味蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶酶解，酶解条件包括：酶解液pH为6，酶解温度50℃，酶解时间4~6小时，而后90 ℃灭活10分钟，酶解液离心，取上清液，干燥，得人参糖肽粗提物；
（4）纯化：取人参糖肽粗提物加水复溶，滤去水不溶性成分，使用截留分子量为1 kDa透析袋透析，除去单糖和无机盐，收集透析内液，冷冻或喷雾干燥，得人参糖肽。
2.根据权利要求1所述的人参糖肽制备方法，其特征在于：所述步骤（1）人参水提取物浓缩液的溶液比重为1.04~1.06。
3.根据权利要求1所述的人参糖肽制备方法，其特征在于：所述步骤（3）干燥方法为冷冻干燥或喷雾干燥。
4.如权利要求1或2或3所述方法制备的人参糖肽。
5.如权利要求4所述的人参糖肽在制备提高免疫力药物中的应用。
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