CN1105238A - 抗aids病毒的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗艾滋病毒的青蒿素类药物，例如青 蒿琥酯等，是抗艾滋病毒的高效药物，毒性低，治疗指 数大，安全可靠，价廉。青蒿素类药物是我国首创的 药物，具有新型结构，本类药物原仅用于抗疟疾。因 此本发明是使本类药在治疗艾滋病上有突破性的进 展。

Description

本发明涉及碳环化合物领域，特别涉及倍半萜内酯的青蒿素类药物。

艾滋病（AIDS）即获得性免疫缺损综合症（Acquired immune deficiency syndrome）1981年在美国发现第一个病倒，1983年法国巴士德研究所Montagnier教授首先从病人血液中分离出病毒，以后命名为HIV，从而证明艾滋病是以后天获得性免疫缺损为特征的病毒性传染病，由于艾滋病毒（HIV）亲嗜T淋巴细胞，它一方面在该细胞内不断繁殖、释放，释放出的病毒又侵入新的T淋巴细胞;另一方面被病毒侵入的T₄淋巴细胞可与其他T₄淋巴细胞融合形成巨型核合胞体，合胞体本身不稳定易引起死亡。病毒繁殖、释放，合胞体形成、死亡，如此反复因此造成机体深度的细胞免疫缺损，最终摧毁人体免疫功能导致死亡。艾滋病毒除对T淋巴细胞外还可侵犯巨噬细胞、B淋巴细胞等，尤其是在巨噬细胞内形成慢性感染，病毒可长期存在。本病发展可分带毒者，ARC期及AIDS病三阶段，一旦发展到AIDS病期，发病迅速，三年存活率不到10%。目前世界上约有2000万人感染了艾滋病毒，AIDS病期患者达600万，约有一半人已经死亡。我国也不例外，艾滋病已于1984年传入我国，目前我国已发现的HIV感染者890例，其中中国人带毒者740例，AIDS期病人5例，艾滋病毒感染者仍在不断地增加。

抗艾滋病毒药物，第一个被报导的是苏拉明（Suramin），1985年发现AZT（叠氮胸腺嘧啶脱氧核苷）等具有体外抗艾滋病毒的活性，1986年进行了临床研究，1987 AZT作为第一个被美国FDA批准用于治疗艾滋病的药。到目前为止，被美国FDA批准用于治疗艾滋病的药仅AZT、DDI（二脱氧肌苷）、DDC（二脱氧胞苷）;天然药物和中药中天花粉蛋白（GLQ₂₃）被FDA批准进行临床观察，但是这几种药都存在着不同类型的毒性，如AZT应用4-6周后，病人出现骨髓抑制，继而发展成严重贫血;单独应用6个月后可产生耐药性;而且AZT并不能对巨噬细胞内感染的病毒有抑制作用，因而不能消除隐患，同时价格昂贵。DDC及DDI存在对外周神经的毒性，服药6周后即出现，应用较大剂量，既使停药一年仍然有后遗症。天花粉蛋白在临床试用中发现了神经毒，严重者出现一时性痴呆，甚至昏迷，实验研究表明天花粉蛋白处理感染HIV的巨噬细胞，产生和释放可溶性毒性物质，对人脑细胞有严重的破坏作用。

到目前为止在世界范围内被实验研究和评价的有几百种药物及其配方、天然药物、单味中药及复方中药中除很少数已分离了有效成分，如：日本报导甘草甜素、香菇多糖等，美国加州大学报导的紫花地丁有效成分等，而大多数均以粗提取物进行实验，化合物中多为核苷，腺苷或肽类衍生物。及至1992年在荷兰阿姆斯特丹（Amsterdam）举办的世界艾滋病大会上，仍未见药物研究有突破性进展。

本发明目的在于：提供一种从中药中提取的化学有效成分及其衍生物，它们是毒性低、价廉的抗艾滋病类药物。克服AZT、DDI、DDC药物的缺点。本发明的另一个目的是用式Ⅰ化合物制备抗AIDS病毒的组合物。本发明还有一个目的是用式Ⅰ化合物或含该化合物的药物治疗AIDS病的应用。

本发明的目的是这样达到的：采用了我国具有丰富资源的中药青蒿，即植物黄花蒿（Artemisia    annua    L.）中提取的青蒿素（artemisinin），其系列衍生物特别是青蒿琥酯等在抗艾滋病毒的作用上取得突破性进展，从而本发明目的就完全达到了。

以下对本发明进行详细说明。

青蒿素（Artemisinin）是我国首次从植物黄花蒿（Artemisia    annua    L）中提出的一种新型结构的抗疟有效成分，它是一种带有过氧桥的倍半萜内酯，化学结构如下：

基本结构：式（Ⅰ）

本发明的青蒿素及其衍生物是已知的化合物其制备方法已在文献中记录，这些文献均引入本发明作为参考（见附件）

在本发明组合物中，式（Ⅰ）化合物占该组合物重量的0.1-5%，优选1-2%。

各衍生物均由二氢青蒿素衍化而成。如二氢青蒿素及青蒿琥酯合成制备方法如下：

1.二氢青蒿素：青蒿素溶于甲醇，加入钠硼氢，反应完后，以酸中和，反应液加入饱和盐水析出结晶，分离干燥粗结晶，再重结晶，收率约80%。

2.青蒿琥酯：二氢青蒿素溶于氯仿，在有吡啶存在下与丁二酸酐反应，以稀酸中和，氯仿层回收溶剂，得青蒿琥酯粗品，重结晶，收率约68%。

本发明以此青蒿素类化合物对体外抗艾滋病毒作用进行了评价。

一、抗HIV病毒的实验

实验采用国际上公认的评价抗HIV药物的方法：

1.实验材料

病毒为HIV-1，该病毒是法国巴斯德研究所Montagnier教授所赠送，实验中所用病毒量滴度为10⁴TCID₅₀/ml;

细胞用CEM细胞以保存HIV-1病毒，由本实验室传代培养：

药物用青蒿素、二氢青蒿素和青蒿琥酯。阳性对照药AZT，各种药液原液浓度均为1mg/ml。

2.实验方法

a.将新鲜培养的MT4细胞或U937细胞（5′×10⁵ml）与病毒液（10⁴TCID₅₀/ml）共同培育，CO₂培养箱中37℃作用1-1.5小时，以RPMI1640完全培基（含10%小牛血清及抗菌素）洗去未与细胞结合的病毒，以完全培基校正浓度备用。

实验于96孔板中进行，每孔中加入0.1ml上述感染病毒的MT4细胞悬液，然后加入0.1ml不同浓度的药液。另设阳性药AZT对照组，同时还设无药液的病毒对照（仅有病毒感染的MT4细胞），每个浓度的药液设两孔。试验组和对照组于37℃下CO₂培养箱中培养，三天后换药液六天后进行下列实验观察;

b.细胞生长情况观察：以胎芬兰染色法（Trypan    blue    dye）观察各组活细胞量;

c.病毒P24抗原表达的测定：以免疫酶法检查病毒抗原表达，即用带圆孔的载玻片各组细胞分别涂于孔内，每个药物浓度涂两孔，冷丙酮固定，并滴加抗HIV阳性血清，在37℃下CO₂培养箱中培养30分钟后，以PBS洗三次，再滴加酶标SPA与上述同样条件培育30分钟，以PBS洗三次，然后置于底物液中染色2-3分钟，蒸馏水洗清玻片，在显微镜下观察，正常细胞为无色带有病毒的细胞呈棕红色。

3.结果判定

病毒对照组涂片见许多明显的棕红色细胞。

AZT 1×10^-11×10^-21×10^-3各组完全不见桃红色细胞，表明方法可靠，所用记号如下：

“-”表示全孔未见阳性细胞;

“±”表示全孔仅有1-2个可疑阳性细胞;

“+”表示全孔有2-3个阳性细胞;

实验重复两至三次。

对青蒿素琥酯在MT4感染HIV-1及U937感染HIV-1的实验并进行了逆转录酶的测定。

结果表明青蒿素及上述系列衍生物均有不同程度的杀灭艾滋病毒的作用，而青蒿琥酯最低有效浓度可达0.5ug/ml结果如表，特别是对U937（巨噬细胞株）感染的HIV-1病毒有明显抑制作用而AZT则无作用。各药物原液为1mg/1ml实验取0.1ml加入0.1ml带病毒的细胞悬液，故作用浓度如下：原液组组为0.1mg/0.2ml即0.5mg/ml，1×10^-1组为0.05mg/ml，1×10^-2组为0.005mg/ml，1×10^-3为0.0005mg/ml亦0.5ug/ml以此类推。

表一    比较几种青蒿素化合物对HIV-1的作用（MT4细胞）

药物/浓度 1×10^-11×10^-21×10^-31×10^-4

(50ug/ml)        (5ug/ml)        (0.5ug/ml)        (0.05ug/ml)

青蒿素        -        -        +        +

二氢青蒿素        -        -        ±        +

青蒿琥酯        -        -        -        +

蒿甲醚        -        -        ±        +

AZT        -        -        -        /

故青蒿琥酯最低有效浓度为1×10^-3即作用浓度为0.5ug/ml。在青蒿琥酯各浓度组细胞生长良好，与细胞对照组比较无明显差异。

表二    青蒿琥酯对MT4及U937感染的HIV-1的抑制作用

药物及        细胞株及病毒        抗原测定        逆转录酶活性

剂量        (IE)        (CPM)

青蒿琥酯        MT4    HIV-1        -        -(3013)

(50ug/ml)

AZT        MT4        HIV-1        -        -(1343)

(1ug/ml)

空白对照        MT4        HIV-1        +        +(16995)

青蒿琥酯        U937        HIV-1        -        -(4846)

(500ug/ml)

AZT        U937        HIV-1        +        +(10865)

(10ug/ml)

空白对照        U937        HIV-1        +        +(24502)

二、急性毒性：本系列化合物毒性小，青蒿素，蒿甲醚，青蒿琥酯在临床治疗疟疾病人表明毒性很低，以青蒿琥酯为例：实验用青蒿琥酯以NaHCO₃溶解成青蒿琥酯钠，动物毒性实验结果如下：

1.小鼠IV的急性毒性实验：LD50为769mg/kg

2.大鼠IV的急性毒性实验：LD50为553.1mg/kg

按化学物质毒力分级属低毒级。

3.狗IV急性毒性实验，经临床行为表现，心电图检查，多项血液生化指标检查及主要脏器病理组织学检查表明，安全界量为33mg/kg此化合物临床用于抢救脑型疟，一次用药最大剂量为4mg/kg，故狗安全解量为其8倍，说明有较大安全范围。

4.本实验结果表明青蒿琥酯，有明显的抗HIV病毒的作用，体外实验最低有效浓度为1×10^-3即0.5ug/ml而小鼠体重20g，全身血液为1.6ml只需0.8ug（1.6×0.5ug）可达到抗艾滋病毒的作用，亦即40ug/kg而本药小鼠LD50为769mg/kg亦说明治疗指数大，安全。

本发明的活性成分可以配制成任何常规的制剂形式，包括固体形式和液体形式，固体形式可以是例如片剂，胶囊剂，栓剂，微型胶囊，粉剂，颗粒散，透皮软膏，脐敷膏等，液体制剂如口服液、合液、注射用油针剂，粉针，水针，肌肉注射或点滴输液等。例如青蒿素栓剂的制作如下：

基质为新型水溶性栓剂基质名聚氧乙烯（40）单硬酸脂代号S40    100mg药量的栓剂配方采用青蒿素14克    S40    128.9克    吐温-80    2.9克，将S-40与吐温-80置容器中60-70℃水浴加中加热熔化，再将青蒿素粉分次加入混匀注模即成，放肛门中应用：

青蒿琥酯制成无菌粉针，临用时加无菌的5%或7.5%碳酸氢钠溶解成可溶性青蒿琥酯钠盐，肌肉注射或静脉点滴。

Claims (8)

1、药物组合物，该组合物含通式(Ⅰ)化合物

其中～代表单健或双键，当～代表双键时，R是0，当～代表单键时，R是OR₁，R₁可以是H，C₁-C₈烷基，C₅-C₆环烷基，烯丙基，羟乙基，甲氧苯甲基，对甲氧基苯甲基，卤代乙烷，间氟苯甲基；或R₁是R₂C=0，R₂可以C₁-C₂₁烷基，乙烯基，丙烯基，乙氧基甲基，环己基，苯基，邻甲苯基，对甲苯基，苯甲基，苯乙烯基，对甲氧苯基，邻二甲氧基苯基，三甲氧基苯基，乙氧基苯基，萘基，联苯基，萘甲基，联苯氧甲基，

甲苯基，氯苯基，三氟甲苯基，氟苯基，溴苯基或者以下的基因：

或者R₂是OR₃其中R₃可以是C₁-C₄烷基，苯甲苯，苯基，其中R₄或R₄是以下结构：

2、如权利要求1的药物组合物，其中式（Ⅰ）化合物为：

当～为双键时，R为O，当～为单键时，R为OH、OCH₃或 。

3、如权利要求1的药物组合物，其中式（Ⅰ）化合物占组合物总重量的0.1-5%。

4、如权利要求1的药物组合物，用于防治艾滋病。

5、如权利要求1的药物组合物，该组合物是固体制剂。

6、如权利要求1的药物组合物，该组合物是液体制剂。

7、如权利要求1的药物组合物，还含有适量中药免疫促进剂。说明书有相应记载，并举例。

8、用式（Ⅰ）化合物制备防治艾滋病的药物组合物。